CZ303980B6 - Expresi regulující sekvence nukleové kyseliny a produkty exprese v oblasti vláknitých plísní - Google Patents

Abstract

Expresi regulující sekvence nukleové kyseliny mající v celé délce alespon 70% identitu s úsekem nukleotidu 1 az 1799 ze sekvence SEQ ID císlo 1 pocházející z mikroorganismu Chrysosporium. Konstrukt nukleové kyseliny, obsahující uvedenou expresi regulující sekvenci provozne spojenou se sekvencí kódující polypeptid, a rekombinantní mikrobiální kmen obsahující tento konstrukt. Zpusob produkce kódovaného polypeptidu.

Description

Expresi regulující sekvence nukleové kyseliny a produkty exprese v oblasti vláknitých plísní

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká enzymů odvozených od plísní, obzvláště od kmene rodu Chrysosporium a sekvencí regulujících expresi pro tyto enzymy.

Dosavadní stav techniky

Mnoho hostitelů pro expresi genu a způsobů transformace bylo dříve uvedeno v oboru. Často jsou uváděny bakterie, například Escherichia Coli. E. Coli je však mikroorganismus neschopný sekrece mnoha proteinů nebo polypeptidů a proto je nežádoucí jako hostitelská buňka pro pro15 dukci proteinu nebo polypeptidů na průmyslové úrovni. Další nevýhodou E. Coli, která platná pro bakterie obecně, je prokaryota nemohou poskytovat další modifikace, požadované pro mnoho eukaryotických proteinů nebo polypeptidů produkovaných v aktivní formě. Glykosylace proteinů a správné skládání proteinů jsou příklady procesů požadovaných k zajištění produkce aktivního proteinu nebo polypeptidů. K zajištění této produkce je možno použít savčích buněk, avšak nevý20 hodou takových buněk je, že se rozdílně uchovávají a požadují drahá prostředí. Takové transformační systémy jsou proti nepraktické pro produkci proteinů nebo polypeptidů na průmyslové úrovni. Mohly by být nákladově efektivní pro přípravu drahých farmaceutických sloučenin, které jsou požadovány v relativně malých množstvích, ale rozhodně ne pro průmyslové enzymy.

Bylo vyvinuto mnoho expresních systémů plísní: například Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei. Řada dalších byla navržena, ale z různých důvodů nebyl nalezen souhlas nebo použití. Obecně musí hostitel splňovat velké množství kritérií:

- Ideální hostitel musí snadno fermentovat za použití levného prostředí.

- Ideální hostitel by měl využívat prostředí účinně.

- Ideální hostitel musí produkovat polypeptid nebo protein ve vysokém výtěžku, tj. musí vykazovat vysoký poměr proteinu k biomase.

- Ideální hostitel by měl být schopen účinné sekrece proteinu nebo polypeptidů.

- Ideální hostitel musí umožnit snadnou izolaci a přečištění požadovaného proteinu nebo polypeptidu.

- Ideální hostitel musí produkovat požadovaný protein nebo polypeptid tak, aby byl produkován v aktivní formě nepožadující další aktivaci nebo modifikační kroky.

- Ideální hostitel by měl být snadno transformovatelný.

- Ideální hostitel by měl umožnit použití širokého rozsahu elementů pro regulaci exprese k zajištění snadné aplikovatelnosti a univerzálnosti.

- Ideální hostitel by měl dovolit snadné použití levných selekčních markérů.

- Ideální hostitel by měl produkovat stabilní produkty transformací.

- Ideální hostitel by měl dovolit kultivaci za podmínek neškodch proteinu nebo polypeptidů (například nízká viskozita).

WO 96/02563 a US Patenty 5 602 004, 5 604 129 a 5 695 958, Novo Nordisk popisují nevýhody systémů Aspergillus a Trichoderma a navrhují kultivační podmínky pro ostatní plísně, které mohou být vhodnější pro produkci proteinů v širokém měřítku. Jediné příklady poskytující jakoukoliv transformovanou kulturu zahrnují kmeny Myceliophthora thermophila, Acremonium alabamense, Thielavia terrestris a Sporotrichum cellulophilum. Kmen Sporotrichum byl označen jako lyžující a produkující zelený pigment za fermentačních podmínek, které nevedou u ostatních kmenů ke stejným výsledkům. Výtrusy netvoř mutant Thielavia terrestris byl popsán jako vybraný organismus kvůli své morfologii. Bylo také uvedeno, že Thielavia a Acremonium (přičemž

- 1 CZ 303980 B6 použitý kmen Acremonium byl imperfektním stádiem použitého kmene Thielavia) jsou kmeny s nízkou protoplastickou účinností a že hydromycin byl jako selekční markér neúspěšný. Mnoho dalších bylo navrženo jako potenciálně vhodných kvůli své morfologii, ale jejich transformace nebyla popsána. Navržené kmeny zahrnovaly Corynascus, Thermoascus, Chaetomium, Ctenomyces, Scytalidium a Talaromyces. Transformovaní hostitelé jsou označováni jako jediní producenti pouze nízké úrovně zavedené xylanázy Humicola s kmenem Thielavia produkujícím nejnižší množství; avšak tato informace je víceznačná a může ve skutečnosti vyvozovat, že Thielavia byla nejlepším provedením. Nomenklatura tohoto odkazu je založena na ATCC jménech Průmyslových hub 1994. Je zřejmé, že nebylo dosaženo vyššího stupně heterologní exprese a ve skutečnosti nemůže být odvozena pozitivní korelace mezi postulovanou morfologií a stupněm exprese. Pokud by měla být provedena jakákoliv korelace, mnohem více je pravděpodobné, že bude negativní. Podle 1996 ATCC klasifikace hub Sporotrichum thermophilum ATCC 20493 je kmen Myceliophthora thermophila. V současnosti je kmen stále definován jako Myceliophthora thermophila. Nepředvídatelnost v oboru je zřejmá z těchto nedávných zveřejnění.

WO 97/26330 Novo Nordisk navrhuje způsob získání mutantů rodičovských buněk plísní, které mají vylepšenou vlastnost pro produkci heterolognich polypeptidů. Způsob zahrnuje nejprve nalezení specifické pozměněné morfologie následované posouzením, zda transformant produkuje více heterologního polypeptidů než původní. Způsob je ilustrován pouze pro kmeny Fusarium A3/5 a Aspergillus oryzae. Navržený způsob je aplikovatelný pro kmeny Aspergillus, Trichoderma, Thielavia, Neurospora, Acremonium, Tolyplocadium, Humicola, Scytalidium, Myceliophthora nebo Mucor. Jak je výše uvedeno, nepředvídatelnost v oboru a také nepředvídatelnost způsobu citovaných aplikací neposkytuje obecně aplikovatelnou nauku s rozumnými nadějemi na úspěch.

V WO 00/20555, jsme popsali alternativní expresní systém plísní s jednoduchým použitím výše uvedených Aspergilli a Trichoderma splňujících výše uvedené požadavky. Nový systém poskytuje přídavné výhody, jako například: transformační rychlosti jsou vyšší než pro rychlosti u obvykle používaného systému Trichoderma reesei. K tomu kultivační podmínky nabízejí další bonus, neboť jsou výhodné pro polypeptidické produkty.

Detailní popis vynálezu

V následující sekci bude popsán nový aktivační systém odvozený od kmene Chrysosporium, který je vhodný pro expresi heterolognich a homologních genů.

Předkládaný vynález se týká expresi regulující sekvence nukleové kyseliny mají v celé délce alespoň 70% identitu s úsekem nukleotidů 1 až 1779 ze sekvence SEQ ID číslo 1.

Dále se vynález týká konstruktu nukleové kyseliny obsahující expresi regulující sekvenci výše uvedené nukleové kyseliny provozně spojenou se sekvencí nukleové kyseliny kódující polypeptid.

Dále se vynález týká rekombinantního mikrobiálního kmene, který obsahuje konstrukt nukleové kyseliny uvedený výše, kde mikrobiální kmen je schopný exprese polypeptidů kódovaného sekvencí kódující nukleové kyseliny.

Dále se vynález týká způsobu produkce polypeptidů vycházejícího z použití konstruktu nukleové kyseliny uvedeného výše nebo mikrobiálního kmene uvedeného výše, kdy způsob obsahuje kultivaci hostitelského kmenu za podmínek umožňujících expresi polypeptidů a následnou regeneraci polypeptidů.

Dále se vynález týká použití sekvence nukleové kyseliny uvedené výše nebo konstruktu uvedeného výše pro expresi polypeptidů v hostitelském organismu, kdy hostitelský organismus je houbový nebo jiný mikrobiální hostitelský organismus.

Dále jsou popsány glykosylhydrolázy rodiny 7 (například cellobiohydroláza) a 10 (například xylanáza) a glyceraldehydfosfátdehydrogenázy, jak bylo identifikováno z jejich aminokyselinové sekvence, stejně tak jako peptidů odvozených od těchto enzymatických proteinů a s nukleovými kyselinami kódujícími tyto peptidy a proteiny, stejně tak jako a obzvláště s řídicími regulačními sekvencemi spojenými s těmito geny.

Dále jsou popsány izolované nebo rekombinantní proteiny tří skupin výše uvedených nebo jejich aktivních částí, zahrnující jejich mutanty obsahující alespoň jistý stupeň sekvenční identity, jak bude dále upřesněno a uvedeno v nárocích, stejně tak jako sekvence nukleových kyselin kódující tyto proteiny nebo jejich části a/nebo sekvence nukleových kyselin regulujících jejich expresi. Tyto enzymy jsou obzvláště: (1) glykosylhydrolázy rodiny 7 (cellobiohydrolázy, CBH1) vykazující alespoň 75 %, výhodně 80 % nebo dokonce 85 % identity aminokyselin se sekvencí SEQ ID číslo 2; (2) glykosylhydrolázy rodiny 10 (endoxylanázy XYL1) vykazující alespoň 70 %, výhodně 75 % nebo dokonce 80 % identity aminokyselin se sekvencí SEQ ID číslo 4; a (3) glyceraldehydfosfátdehydrogenázy (GPD1) vykazující alespoň 86 %, výhodně 90 % nebo dokonce alespoň 93 % identity aminokyselin se sekvencí SEQ ID číslo 6. Polypeptidy a nukleotidové sekvence kódující tyto polypeptidy mají alespoň 20, výhodně alespoň 30 sousedících aminokyselin sekvencí SEQ ID číslo 2 a 4 a 6 a jsou upřednostněným provedením tohoto vynálezu. Odpovídající nukleotidové sekvence jsou popsány v EQ ID číslo 1 (cbhl), 3 (xyl 1), a 5 (gpdl).

Rekombinantní enzymy mohou obsahovat v podstatě kompletní protein nebo zkrácený protein obsahující alespoň část enzymatické aktivity. Takové zkrácené části mohou být katalytickými oblastmi nebo oblastmi s alespoň 75 % jejich aminokyselin. Katalytická oblast CBH1 obsahuje aminokyseliny 20 až 495 aminokyselinové sekvence SEQ ID číslo 2 a katalytická oblast XYL1 obsahuje aminokyseliny 54 až 384 aminokyselinové sekvence SEQ ID číslo 4. Katalytická oblast může, ale nemusí být kombinována se signální sekvencí pocházející zjiného proteinu a/nebo s uhlohydráty vázající oblastí jiného enzymatického proteinu. Případně může být celulózu vázající oblast enzymů (CBEI1 a XYLl) kondenzována ke katalytické oblasti jiného enzymatického proteinu.

Sekvence nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu mohou být kompletní protein kódující oblasti nebo oligonukleotidy a nebo, což je upřednostněno, expresi regulující sekvence. Oligonukleotidy mohou být také použity jako sondy pro identifikaci genů odpovídajících, ale ne identických ke genům SEQ ID číslo 1, 3 a 5; tyto geny, pokud vykazují kriterium úplné procentuelní identity výše definované, stejně tak jako jejich kódující a nekódující části a jejich produkty exprese jsou také částí předkládaného vynálezu. Oligonukleotidy obsahují výhodně 15 až 75 a nejvýhodněji 20 až 50 nukleotidů na délku.

Dále jsou popsány expresní systémy (kazety) obsahujících jak expresi regulující oblast (zahrnující promotor) a glykosylhydrolázy rodiny 7 ke kódovacímu genu jiného proteinu. Expresi regulující oblast obsahuje alespoň 60 %, výhodně 70 %, výhodněji 75 % nebo dokonce 80 % z 5'nekódujících oblastí SEQ ID číslo 1, 3, a 5 a/nebo alespoň 20, konkrétně alespoň 40 sousedících nukleotidů z těchto 5' nekódujících oblastí. Koncové sekvence stejně odvozené od 3' nekódujících oblastí genů předkládaného vynálezu jsou také použitelné ve expresních kazetách, kombinované s homologními nebo heterologními geny.

Polynukleotidy nebo oligonukleotidy zde popsané mohou obsahovat minimální sekvence identity s odpovídajícími sekvencemi SEQ ID 1, 3 nebo 5, případně hybridizovat za striktních podmínek s těmito danými sekvencemi. Striktní hybridizační podmínky jsou podmínky známé v oboru, například hybridizace v 6 x SSC (20 x SSC na 1000 ml: 175,3 g NaCl, 107,1 g citrátu sodného pentahydrátu, pH 7,0), 0,1% SDS, 0,05% pyrofosfát sodný, 5* Denhardtův roztok a 20 gg/ml DNA denaturovaného spermatu sledě při 56 °C během 18 až 24 hodin následovaná 2x promytím po dobu 30 minut v 5x SSC, 0,1 % SDS pří 56 °C a promytím 2x SSC, 0,1% SSC při 56 °C.

-3 CZ 303980 B6

Tyto expresní systémy mohou být obsaženy v Chrysosporium hostiteli, jako je Chrysosporium lucknowense hostitel nebo jiný nehoubový nebo výhodně houbový hostitel. Příklady ostatních houbových hostitelů jsou ostatní druhy nebo kmeny Chrysosporium, druhy Aspergillus atd. Tyto hostitelé by měly být výhodně hostiteli, kteří nemohou samostatně, vnitřně nebo jako výsledek kultivačních podmínek produkovat protein odpovídající proteinu, o který se zajímáme, stejně tak jako jednoduše regenerovat tento protein.

Pokud reference a připojené nároky obsahují termín „polypeptidy“ nebo „peptidy“ nebo „polypeptidy, o které se zajímáme“ nebo „peptidy, o které se zajímáme“ jako produkty expresního systému předkládaného vynálezu, může tento termín obsahovat proteiny, tj. polypeptidy vykazující zvláštní funkci a/nebo sekundární a/nebo terciární strukturu. Pokud je reference odkazem na procentuální aminokyselinovou identitu, je tato identita spojena s kompletním proteinem nebo se specifickou částí definovanou počátečním a koncovým číslem aminokyseliny, jak je definováno obvykle používaným BLAST algoritmem.

V expresním systému hub popsaném v WO 00/20555, může být pH kultivačního prostředí neutrální nebo alkalické, tudíž nedochází k inaktivaci produkovaného proteinu nebo polypeptidu díky pH. Je také možné kultivovat při kyselém pH jako je pH 4 pro případy, kde protein nebo polypeptid je lépe situován do kyselého prostředí. Vhodné prostředí může vykazovat pH mezi 4,0 až 10,0. Upřednostnění pro neutrální až alkalické pH existuje, například pokud hostitelský kmen roste lépe při pH 6 až 9. Růst při alkalickém pH, které může být od pH 8 výše a může být dokonce vysoké až pH 10, je také dobrá alternativa pro některé případy. Také kultivace při teplotě, která je výhodná pro stabilitu hostitele je vhodná pro některé typy polypeptidů. Kultivační teplota je vhodná při teplotě 23 až 43 °C. Takové podmínky jsou obzvláště vhodné pro produkci savčích polypeptidů. Vybrané teploty budou záviset na efektivnosti kultivace a citlivosti polypeptidu nebo kultivačního kmene.

Bylo také pozorováno, že vztah biomasy k viskozitě a množství proteinu je nesmírně favorizující pro hostitele Chrysosporium. Porovnání bylo provedeno s Trichoderma longibrachiatum (dříve také známý jako Trichoderma reesei) a s Aspergillus niger. Trichoderma longibrachiatum poskytuje 2,5 až 5 g/1 biomasy, Aspergillus niger poskytuje 5 až 10 g/1 biomasy a hostitel Chrysosporium poskytuje 0,5 až 1 g/1 biomasy za optimalizovaných podmínek. Což poskytuje 5 až 10 násobné vylepšení oproti komerčně používaným kmenům. Předmět předkládaného vynálezu je směřován na expresní systémy obsahující kódujících sekvence nukleových kyselin heterologních proteinů nebo polypeptidů, tyto sekvence nukleových kyselin jsou spojeny s expresí regulující oblastí popsanou níže a případně se sekrečním signálem kódující sekvence a/nebo nosičem proteinové kódující sekvence. Výhodně rekombinovaný kmen podle předkládaného vynálezu bude vyměšovat polypeptidy, o které se zajímáme. Nebude proto nutné roztrhat buňky za účelem izolovat polypeptidy a také bude minimalizováno nebezpečí degradace produktu exprese ostatními složkami hostitelské buňky.

Kmen Chyrososporium může být definován morfologií v souladu s tou, která byla uvedena ve známost v Bamett a Hunter 1972, Illustrated Genera of Imperfect Funghi, 3^rd Edition of Burgess Publishing Company. Ostatní zdroje poskytující detaily týkající se klasifikace hub kmene Chrysosporium jsou známé, například Sutton Classification (Van Oorschot, C. A. N. (1980) „A Revision of Chrysosporium a allied genera“ ve studii Mycology číslo 20 CBS v Baam, Nizozemí, strana 1 až 36. CBS je jedna z úložných institucí Budapest Treaty. Podle těchto nauk kmen Chrysosporium spadá do rodiny Moniliaceae, která náleží k řádu Hyphomycetales. Následující kmeny jsou definovány jako Chrysosporium, ale definice Chrysosporia není limitována těmito kmeny: C. botryoides, C. carmichaelii, C. crassitunicatum, C. europae, C. evolcceannui, C. farinicola, C. fastidium, C. filiforme, C. georgiae, C. globiferum, C. globiferum var. articulatm, C. globiferum var. niveum. C hirundo, C. hispanicum, C. holmii, C. indicum, C. inops, C. keratinophilum, C. kreiselii, C. kuzurovianum, C. lignorum, C. lobatum, C. lucknowense, C. lucknowense Garg 27K, C. medium, C. medium var. spissescens, C. mephiticum, C. merdarium, C. merdarium var. roseum, C. minor, C. pannicola, C. parvum, C. parvum var. crescens, C. pilosum, C. pseudomer-4CZ 303980 B6 darium, C. pyriformis, C. queenslandicum, C. sigleri, C. sulfureum, C. synchronům, C. tropičům, C. ondulatum, C. vallenarense, C. vespertilium. C. zonatum.

C. lucknowense tvoří jednu skupinu kmene Chrysosporium, která pozvedla zájem tím, že poskytuje přírodní vyšší produkci cellulázových proteinů (WO 98/15633 a související US Patent 5 811 381). Charakteristika Chrysosporium lucknowense zahrnuje:

Kolonie dosahují 55 mm v průměru v Sabouraud glukózovém agaru po 14 dnech jsou krémově zabarvené a nadýchané; husté a 3 až 5 mm dlouhé; okraje jsou definované, pravidelné a třásnité; reverzní barva je světle žlutá až krémová. Hyfa je sklovitá, hladká a tenkostěnná, málo větvená. Vzdušná hyfa je nejvíce plodná a těsně přepažená, 1 až 3,5 μιη široká. Hloubková hyfa je neplodná, 1 až 4,5 pm široká, s tenkou hyfou často zakřivenou. Konidia jsou koncová a postranní, většinou přilehlé a v krátkých, často kónických výčnělcích nebo na krátkých stranách jsou větvené. Konidia jsou samovolně rostoucí, ale v blízkosti jedna ke druhé, 1 až 4 konidia se vyvíjejí v buňce hyfy, často tenko a hladkostěnné, většinou subglobulámí, také kyjovité, jednobuněčné, 2,5 až 11 x 1,5 až 6 pm, se širokými základními zákružemi. Interkalámí konidia nejsou přítomna. Chlamydospory jsou nepřítomny. ATCC 44006, CBS 251,72, CBS 143,77 a CBS 272,77 jsou příklady Chrysosporium lucknowense kmenů a ostatní příklady jsou uvedeny v WO 98/15633 (US Patent 5 811 381).

Další kmen byl izolován z tohoto druhu s ještě vyšší produkční kapacitou pro cellulázy. Kmen je nazván Cl podle interní notace aje uložen v Mezinárodním depozitáři všech ruských kolekcí mikroorganismů v Ruské akademii věd, Bukrushina Street 8, Moskva, Rusko 113184, 29.8.1996, podle Budapest Treaty a byl označen přístupovým číslem VKM Number F-3500D. Je nazván Chrysosporium lucknowense Garg 27K. Charakteristika C1 kmene je následuj:

Kolonie rostou 55 až 66 mm v průměru v potato-dextrose agaru během 7 dní; jsou zabarveny do světle krémové barvy a jsou 2 až 3 pm vysoké v prostředku; okraje jsou definované, pravidelné, řasovité, reversní barva je světle krémová. Hyfa je sklovitá, hladká a tenkostěnná, málo větvená. Vzdušná hyfa je plodná, přepažená, 2 až 3 mm široká. Hloubková hyfa je infertilní. Konidia jsou koncová a postranní, přisedlá nebo na krátké straně větvená; samostatně rostoucí, ale v blízkosti k dalším, sklovitá, tenko a hladkostěnná, subglobulámí, kyjovitá, jednobuněčná, 4 až 10 pm. Chlamydospory nejsou přítomny. Interkalámí konidia nejsou přítomna.

Způsob izolace Cl kmene je popsán v WO 98/15633, US Patentu 5 811 381 a US Patentu 6 015 707. Tyto publikace také zahrnují definici, která říká, že Chrysosporium jsou kmeny odvozené od předchůdce Chrysosporia, zahrnující předchůdce, který mutoval přírodně nebo indukovanou mutagenezí. Mutanty Chrysosporia mohou být získány indukovanou mutagenezí, obzvláště kombinací iradiace a chemické mutageneze.

Například kmen Cl byl mutován ultrafialovým světlem za produkce kmene UV13-6. Tento kmen byl později dále mutován N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidinem za produkce kmene NG7C-19. Posledně jmenovaný kmen byl předložen mutaci ultrafialovým světlem za vzniku kmene UV18-25. Během mutačního procesu se měnila morfologická charakteristika v prostředí jak kapalném tak na deskách a stejně tak jako pod mikroskopem. S každou za sebou jdoucí mutagenezí ukazuje prostředí méně načechraný vzhled na deskách, jak je popsáno pro charakteristiku Chrysosporia, dokud kolonie nedosáhnou hladký a matový vzhled. Hnědý pigment pozorovaný u přírodních typů kmene v některých prostředích byl také méně rozšířen u mutovaných kmenů. V kapalném prostředí byl mutant UV 18-25 pozorován jako méně viskózní než přírodní typ kmene Cl a mutanty UV 13-6 a NG7C-19. Pokud všechny kmeny zachovávají celkovou mikroskopickou charakteristiku Chrysosporia, mycelia budou užší s každou další mutací a u UV 18-25 může být pozorována odlišná fragmentace mycelie. Tato micelámí fragmentace je obvykle způsobena nízkou viskozitou spojenou s kulturou UV 18-25. Schopnost kmene tvořit výtrusy klesá s každým mutačním krokem. Výše uvedené ilustruje, že pro kmen nálež k druhu Chryso-5CZ 303980 Β6 sporium existuje určitá svoboda u výše definované morfologické charakteristiky. V každém mutačním kroku produkce cellulázy a extracelulárních proteinů má v podstatě také zvyšující se tendenci, zatímco několik mutací vyúsťuje ve snížení tvorby proteáz. Kriteria podle kterých je stanovena systematika hub je dostupná například od CBS, VKMF a ATCC. Kmeny interně označené jako Chrysosporium kmene Cl, kmen UV 13-6, kmen NG7C-19 a kmen UV 18-25 jsou uloženy v souladu s Budapest Treaty v All Russian Collection (VKM) depozitomím institutu v Moskvě. Přírodní typ Cl kmene byl uložen pod číslem VKM F-3500 D, dne 29. 8. 1996, Cl UV 13-6 mutant byl uložen jako VKM F-3632 D (2. 9. 1998), Cl NG7C-19 mutant byl uložen jako VKM F-3633 D (2. 9. 1998) a Cl UV18-25 mutant byl uložen jako VKM F-3631 D (2. 9. 1998).

Je výhodné použít netoxické kmeny Chrysosporium, kterých je známo v oboru mnoho, čímž bude sníženo nebezpečí ohrožení prostředí při výrobě ve velkém měřítku a budou zjednodušeny procedury výroby s průvodním snížením cen.

Exprese je regulována hostitelským kmenem Chrysosporium v regulační oblasti DNA. Zahrnuje aktivační sekvenci spojenou se sekvencí nukleových kyselin kódující polypeptidy, které jsou exprimovány. Aktivační část promotoru je spojena v pozici vis a vis k iniciaci sekvence kodonu, který umožní expresi. Promotorova sekvence může být konstitutivní nebo indukovatelná. Jakákoliv expresi regulující sekvence nebo její kombinace schopná povolit expresi polypeptidu z Chrysosporia kmene je předvídatelná. Expresi regulující sekvence je vhodně expresi regulující oblast houby, například regulující oblast ascomycet. Vhodné expresi regulující oblasti hub jsou regulující oblasti kterékoliv z následujících druhů hub: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Rhizomucor, Fusarium, Penicillium, Saccharomyces, Talaromyces nebo případně jejich pohlavní formy jako je například Emericella, Hypocrea.

Expresi regulující sekvence od stejného kmenu jako je hostitelský kmen je velice vhodná, neboť je nejvíce adaptabilní ke specifickému hostiteli. Takže výhodně expresi regulující sekvence je jednou z kmene Chrysosporium.

Výhodně je použita expresi regulující oblast umožňující vysokou expresi ve vybraném hostiteli. Je to výhodně expresi regulující oblast odvozená od Chrysosporium kmene podle předkládaného vynálezu. Expresi regulující oblast může být také odvozená od heterologního hostitele, který je velice dobře známý v oboru. Konkrétní příklady známých proteinů vylučovaných ve velkých množstvích a poskytujících vhodné expresní regulační sekvence pro předkládaný vynález jsou, ale nejsou limitovány, hydrophobin, proteázy, amylázy, xylanázy, pektinázy, esterázy, betagalaktosidázy, cellulázy (například endo-glukanázy, cellobiohydrolázy) a polygalakturonázy. Vysoká produkce byla zjištěna jak v pevném stavu, tak za kapalných fermentacních podmínek. Kvalitativní rozbory pro stanovení přítomnosti nebo výše produkce těchto proteinů jsou velmi dobře známé v oboru. Katalogy Sigma a Megazyme obsahují mnoho příkladů. Megazyme se nachází v Bray Bussines Park, Bray, County Wicklow v Irsku. Sigma Aldrich má mnoho poboček po celém světě, například USA P. O. Box 14508 St. Louis Missouri. Pro cellulázy odkazujeme na komerčně dostupné zdroje jako jsou CMCase kvalitativní analýzy, endoviskomerické analýzy, Avicelase analýzy, beta-glukanázové analýzy, RBBCMCase analýzy, Cellazyme C analýzy. Xylanázové analýzy jsou také komerčně dostupné (například DNS a Megazymy). Alternativy jsou dobře známé odborníkům a je možné je snadno nalézt v literatuře týkající se této problematiky a tyto informace je požadováno inkorporovat do referencí. Příkladem může být „Methods in Enzymatodology“ Volume 1, 1955 a volumy 297 až 299 z roku 1999. Vhodná promotor sekvence Chrysosporium je použita k zajištění dobrého rozpoznání hostitelem.

Bylo zjištěno, že heterologní expresi regulující sekvence pracují stejně účinně v Chrysosporium jako přírodní Chrysosporium sekvence. To umožňuje použít dobře známé konstrukty a vektory k transformaci Chrysosporium stejně tak jako se nabízí mnoho dalších možností pro konstrukci vektorů umožňujících dobré rychlosti exprese v tomto novém expresním a sekrečním hostiteli. Například standardní Aspergillus transformační techniky mohou být použity jak je popsáno

-6CZ 303980 B6 například v Christiansen a kol., Bio/Technol. 6:1490 až 1422 (1988). Ostatní dokumenty poskytující detaily transformačních vektorů Aspergillus jsou například US Patenty 4 816 405, 5 198 345, 5 503 991, 5 364 770 a 5 578 463, EP-B-215 594 (také pro kmen Trichodermá). Protože byly zjištěny extrémně vysoké expresní rychlosti pro cellulázu u Chrysosporium kmenů, byly upřednostněny expresí regulující oblasti toho proteinu. Pro konkrétní příklady odkazujeme na dříve popsané a uložené Chrysosporium kmeny.

Konstrukt nukleových kyselin obsahující expresi regulující oblast nukleových kyselin z Chrysosporium kmene, výhodně z Chrysosporium lucknowense nebo jeho derivátů a konstrukty s těmito sekvencemi představují upřednostněné provedení předkládaného vynálezu, stejně tak jako exprese mutantu kmene Chrysosporium, který obsahuje operativně spojené geny kódující polypeptidy. Tento konstrukt nukleových kyselin bude expresi regulující oblastí od Chrysosporium spojený s cellulázami, výhodně s expresí cellobiohydroláz, jak bude detailně uvedeno níže. Sekvence nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu může vhodně být získána z kmene Chrysosporium, který byl dostatečně definován v popisu. Způsobů ke stanovení promotorových sekvencí je mnoho a jsou dobře známy v oboru. Experimenty s vypuštěním nukleových kyselin v oblasti upstream od ATG kodonu na začátku náležitého genu poskytnou požadovanou sekvenci. Také například analýza shody sekvencí může být pro nalezení genu zajímavá. Použitím hybridizace a amplifikačních technik může odborník snadno nalézt odpovídající promotorové sekvence.

Promotorové sekvence Cl endoglukanáz byly definovány tímto způsobem, klonováním odpovídajících genů. Výhodně popsanými jsou promotory: 55 kDa cellobiohydroláza (CBH1) promotor, 30 kDa xylanáza (Xyll) promotor a glyceraldehydrofosfátdehydrogenáza promotor, protože tyto enzymy jsou vlastními promotory exprimovány ve velkém množství. Odpovídající promotorové sekvence jsou identifikovány přímým způsobem klonováním, jak je popsáno v WO 00/20555, za použití sekvenční informace dané v SEQ ID číslo 1 (pro CBH 1) a SEQ ID číslo 3 (pro Xyll). Promotory karbohydrát degradujících enzymů Chrysosporia, konkrétně Cl promotory, mohou být výhodně použity pro expresi požadovaných polypeptidů v hostitelském organismu, obzvláště houbových nebo ostatních mikrobiálních hostitelských organismech. Sekvence promotoru, které vykazují alespoň 65 %, výhodně alespoň 70 %, nejvýhodněji alespoň 75 % identity nukleotidové sekvence se sekvencí danou v SEQ ID číslo 1, 3 a 5 nebo se sekvencí nalezenou pro ostatní Chrysosporium geny.

Pro jednotlivé provedení rekombinantních kmenů a sekvencí nukleových kyselin podle předkládaného vynálezu také odkazujeme na příklady. Také odkazujeme pro rekombinantní kmeny na dříve uvedené vysoce expresní sekvence promotorů, obzvláště ty, které poskytují vysokou expresi u hub, například jak je uvedeno pro kmen Aspergillus nebo Trichodermá. Dříve bylo uvedeno mnoho expresi regulujících oblastí pro použití v Aspergillus například US Patenty 5 252 726 Novo a US 5 705 358 Unilever.

Hydrofobinový gen je gen hub, který má vysokou expresi. Bylo navrženo, že promotorové sekvence hydrofobinového genu, výhodně z kmene Chrysosporium, může být vhodně aplikována jako expresi regulující sekvence. Trichodermá reesei a Trichodermá harzianum genové sekvence pro hydrofobinové geny byly uvedeny již dříve, stejně jako genová sekvence pro Aspergillus fumigaťus a Aspergillus nidulants. (Munoz a kol., Curr. Genet. 1997, 32(3):225 až 230; NakariSetala T. a kol., Eur. J. Biochem. 1996 15:235 (1 až 2): 248 až 255, M. Parta a kol., Infect. Immun. 1994, 62 (10):4389 až 4395 a Stringer M. A. a kol., Mol. Microbiol. 1995 16(1):33 až 44. Použitím této sekvenční informace může odborník získat expresi regulující sekvenci hydrofobinových genů Chrysosporia bez nutnosti mnoha experimentů následujících standardní techniky, jak je doporučeno výše. Rekombinantní kmen Chrysosporium může obsahovat hydrofobinovou regulační oblast operativně spojenou se sekvencí kódující polypeptidy.

Expresi regulující sekvence může také případně obsahovat zlepšovač nebo tlumič. Oba jsou již dříve dobře známé v oboru a jsou obvykle umístěny v určité vzdálenosti od promotoru. Expresi regulující sekvence také obsahuje promotory s aktivátor vázajícími místy a represor vázajícími

-7CZ 303980 B6 místy. V některých případech může být také sekvence modifikovaná k eliminaci tohoto typu regulace. Vláknité houby, ve kterých jsou creA místa přítomna již byly popsány. Taková creA místa mohou být mutována pro zajištění eliminace glukózové represe, která plyne z přítomnosti nemutovaných míst. Gist-brocades WO 94/13820 popisuje tento princip. Použití takového promotoru umožňuje produkci polypeptidu kódujícího sekvence nukleových kyselin regulující promotor v přítomnosti glukózy. Ten samý princip je také viditelný v WO 97/09738. Tyto promotory mohou být použity jak s tak bez creA míst. Mutanty, ve kterých creA místa byla mutována, byly použity jako expresně regulační sekvence v rekombinantních kmenech a sekvence nukleových kyselin, které regulují, mohou vykazovat expresi v přítomnosti glukózy. Takové Chrysosporium promotory zajišťují expresi v analogickém množství k ilustrovanému v WO 97/09438. Identita creA míst je známá v oboru. Případně je možné použít promotor s creA vaznými místy, která nebyly mutovány v hostitelském kmeni s mutací jinde v represním systému například ve vlastním genu creA, tak že kmen může, navzdory přítomnosti creA vazných míst, produkovat protein nebo polypeptid v přítomnosti glukózy.

Terminační sekvence jsou také sekvencemi regulujícími expresi, které jsou vázány ke 3' koncovému bodu sekvence, která produkuje expresi. Jakýkoliv terminátor hub bude pravděpodobně funkční v hostitelském kmeni Chrysosporium podle předkládaného vynálezu. Příkladem jsou A. nidulans trpC terminátor (1), A. niger alfa-glukosidásový terminátor (2), A. niger glukoamylázový terminátor (3), Mucor miehei karboxyl proteázový terminátor (US Patent 5 578 463) a Trichoderma reesei cellobiohydrolázový terminátor. Přírodní Chrysosporium terminační sekvence budou fungovat v Chrysosporium a jsou vhodné, například CBH1 terminátor.

Vhodný rekombinant kmene Chrysosporium použitý podle předkládaného vynálezu má sekvenci nukleové kyseliny, která má být podrobena expresi, spojenou se sekvencí kódující aminokyselinovou sekvenci definované jako signální sekvence. Signální sekvence je sekvence aminokyselin, která pokud je operativně vázána k sekvenci aminokyselin exprimovaného polypeptidu, dovoluje jeho sekreci z hostitelské houby. Taková signální sekvence může být normálně spojena s heterologním polypeptidem nebo může být integrována v hostiteli. Může být také cizí pro oba, jak pro hostitele, tak pro polypeptid. Sekvence nukleové kyseliny kódující signální sekvenci musí být umístěna v rámci dovolujícím translaci signální sekvence a heterologního polypeptidu. Každá signální sekvence schopná umožnit sekreci polypeptidu z Chrysosporia kmene je předvídatelná. Taková signální sekvence je vhodná signální sekvence hub, výhodně signální sekvence ascomycet.

Vhodné příklady signálních sekvencí mohou být odvozeny obecně od kvasnic nebo kterýchkoli následujících konkrétních kmenů hub: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Pichia, Neurospora, Rhizomucor, Hansenula, Humicola, Mucor, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium, Saccharomyces, Talaromyces nebo případně jejich pohlavní formy jako Emericella, Hypocrea. Signální sekvence, které jsou obzvláště použitelné jsou často přirozeně spojeny s následujícími proteiny zahrnujícími cellobiohydrolázy, andoglukanázy, beta-galaktosidázy, xylanázy, pektinázy, esterázy, hydrofobinázy, proteinázy nebo amylázy. Příklady zahrnují amylázy nebo glukoamylázy Aspergillus nebo Humicola (4), TAKA amylázu Aspergillus oryzae, alfa-amylázu Aspergillus niger, karboxylpeptidásu Mucor (US Patent 5 578 463), lipasu nebo proteinásu Rhizomucor miehei, cellobiohydrolázu Trichoderma (5), beta-galaktosidásu Penicillium canescens a alfa spáruj ící faktor Saccharomyces.

Případné mohou být signální sekvence tvořeny od amylázy nebo genu subtilisinu kmene Bacillus. Signální sekvence od stejného genu jako je hostitelský kmen je extrémně vhodná, protože je nejlépe specificky adaptabilní ke specifickému hostiteli, takže výhodná signální sekvence je signální sekvence Chrysosporia, obzvláště Chrysosporia kmene Cl, kmene UV13-6, kmene NG7C-19 a kmene UV 18-25, výše uvedených. Signální sekvence od vláknitých hub, kvasnic a bakterií jsou použitelné. Signální sekvence nehoubového původu jsou také považovány za použitelné, obzvláště bakterielní, rostlinné a savčí.

-8CZ 303980 B6

Rekombinantní hostitel použitý podle jakéhokoliv provedení předkládaného vynálezu může dále obsahovat selekční markér. Takový selekční markér bude umožňovat snadný výběr transformovaných nebo transfekovaných buněk. Selekční markér obvykle kóduje genový produkt poskytující konkrétní typ odolnosti cizí netransformovanému kmeni. Resistence může být obecně proti těžkým kovům, antibiotikům a biocidům. Prototrofie je také použitelným selekčním markérem neantibiotického druhu. Neantibiotický selekční markér může být upřednostněn pokud protein nebo polypeptid zájmu je použit v potravině nebo farmaceutikách s vyhlídkou na spedici nebo méně komplikované regulační schválení takového produktu. Často je pro tyto markéry použita GRAS indikace. Mnoho těchto markérů je dostupných odborníkům z oboru. Například FDA poskytuje jejich seznam. Nejčastěji použité jsou selekční markéry vybrané ze skupiny týkající se odolnosti vůči léčivu nebo uvolnění vyživovacího defektu, například skupina zahrnující amdS (acetamidázy), hph (hydromycin fosfotransferázy), pyrG (orotidin-5'-fosfát dekarboxylásy), trpC (anthranilát synthásy), argB (omithin karbamoyltransferázy), sC (sulfát adenyltransferázy), bar (fosfinotricin acetytransferázy), glufosinate resistence, niaD (nitrát reduktázy) bleomycin resistenční gen, konkrétněji Sh ble, sulfonylmočovinová resistence například acetolaktát syntháza mutace ilvl. Výběr může být také proveden virtuální ko-transformací, kde je selekční markér v odděleném vektoru nebo kde je selekční markér na stejném fragmentu nukleové kyseliny jako je polypeptid kódující sekvence pro polypeptid našeho zájmu.

Jak je zde použito, termín „heterologní polypeptid“ je protein nebo polypeptid, který není exprimován a vylučován hostitelským kmenem Chrysosporium použitým pro expresi podle předkládaného vynálezu. Polypeptid může být rostlinného nebo živočišného původu (obratlovci nebo bezobratlí), například savčí, rybí, hmyzí původu nebo mikroorganického původu s podmínkou, že se nevyskytuje v hostitelském kmeni. Savčí polypeptid může zahrnovat také lidský polypeptid. Mikroorganický může zahrnovat viry, bakterie, archaebakterie a houby, například plísně a kvasinky. Bergey's Manual pro stanovení bakterií poskytuje odpovídající seznam bakterií a archaebakterii. Pro farmaceutické účely existuje často preference pro lidské proteiny, proto rekombinantní hostitel podle předkládaného vynálezu tvoř upřednostněné provedení produkce potravin budou vhodné heterologní polypeptidy živočišné, rostlinné nebo řasy. Tyto provedení jsou také uváženými vhodnými příklady předkládaného vynálezu. Další provedení, které jsou použitelné, zahrnující heterologní polypeptidy jsou jakékoliv bakterie, kvasinky, viry, archaebakterie nebo houby. Heterologní polypeptidy houbového původu jsou obzvláště upřednostněné.

Vhodná provedení budou zahrnovat sekvenci nukleových kyselin s přizpůsobeným kodonovým použitím. Taková sekvence kóduje přirozené sekvence aminokyselin hostitele, od kterého jsou odvozeny, ale mají rozdílnou sekvenci nukleových kyselin, tj. sekvenci nukleových kyselin, ve kterých je jistý kodon nahrazen jiným kodonem kódujícím stejné aminokyseliny, ale který je snadněji použitelný hostitelským kmenem pro expresi. To může vést ke snadnější expresi heterologní sekvence nukleových kyselin. Toto je hlavní dovedností odborníka v oboru. Použití tohoto přizpůsobeného kodonu může být provedeno na základě použití známého houbového visa-vis nehoubového kodonu. Může být dokonce konkrétněji přizpůsobený k použití kodonu samotného Chrysosporia. Podobnosti jsou takové, že použití kodonu, jak bylo pozorováno u Trichoderma, Humicola a Aspergillus by mělo umožnit výměnu sekvencí takových organismů bez adaptace použití kodonu. Detaily jsou dostupné odborníkovi, který pracuje v oblasti použití kodonů těchto hub.

Výše uvedený vynález není omezen jen na výše uvedené rekombinace kmenů Chrysosporium, ale také zahrnuje rekombinace kmenů Chrysosporium, které zahrnují sekvence nukleových kyseliny kódující heterogenní protein pro kmen Chrysosporium. Tato sekvence nukleové kyseliny je operativně spojena s oblastí regulující expresi a tento rekombinantní kmen exprimuje více uvedený protein než odpovídající nerekombinovaný kmen za stejných podmínek. V případě homologního polypeptidu našeho zájmu, který je výhodně neutrální nebo alkalický enzym jako je hydroláza, proteáza nebo karbohydrát degradující enzymy, jak je již zde uvedeno. Polypeptid může být také kyselý. Výhodně bude rekombinantní kmen exprimovat polypeptid ve větším

-9CZ 303980 B6 množství než nerekombinovaný kmen. Všechny připomínky uvedené k heterolognímu polypeptidu jsou také platné pro homologní polypeptidovou celulázu.

Tento vynález také zahrnuje geneticky konstruované mikrobiální kmeny, kde zabudovaná sekvence může být původu Chrysosporium. Takový kmen může být však odlišný od přírodně se vyskytujících kmenů, například výhodnou přítomností heterologní sekvence v sekvenci nukleové kyseliny použité pro transformaci nebo transfekci Chrysosporia a faktem, že násobné kopie sekvence kódující polypeptid zájmu jsou přítomny nebojsou vylučovány v množství převyšujícím ne-konstruovaný kmen za stejných podmínek nebo z důvodu, že exprese probíhá za normálních ne-vylučovacích podmínek. Později uvedené může být případem, kdy vyvolací promotor reguluje sekvenci našeho zájmu v protikladu k nerekombinantnímu případu nebo pokud jiný faktor indukuje expresi, která je případem ne-konstruovaného kmene. Předkládaný vynález také směřuje ke kmenům odvozených konstruováním buď za použití klasických genetických technologií nebo genetických inženýrských metodologií.

Expresní systémy a hostitelské kmeny je zahrnující podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat sekvenci nukleové kyseliny kódující heterogenní protein vybraný ze skupiny zahrnující karbohydrát degradující enzymy (cellulázy, xylanázy, mananázy, manosidázy, pektinázy, amylázy, například glukoamylázy, alfa-amylázy, alfa- a beta-glukosidázy, beta-glukanázy, chitinázy, chitanázy), proteázy (amino-proteázy, amino a karboxypeptidázy, keratinázy), ostatní hydrolázy (lipázy, esterázy, íytázy), oxidoreduktázy (katalázy, glukoseoxidázy a transferázy (transgiykosydázy, transglutaminázy, izomerázy a invertázy).

Nejzajímavější popsané vytvořené produkty jsou cellulázy, xylanázy, pektinázy a proteázy, přičemž celulázy a xylanázy štěpí beta-l,4-vazby a cellulázy obsahují endoglukanázy, cellobiohydrolázy a beta-glukosidázy. Tyto proteiny jsou nesmírně použitelné v různých průmyslových procesech známých v oboru. Obzvláště pro cellulázy odkazujeme na WO 98/15633 popisující použití cellobihydroláz a endoglukanáz.

Rekombinant podle předkládaného vynálezu může obsahovat sekvenci nukleové kyseliny kódující polypeptid našeho zájmu a polypeptid, který je neaktivovaný nebo nestálý při kyselém pH, tj. pH pod 6, dokonce pod 5,5, výhodněji pod pH 5 a dokonce tak nízký jako pH 4. Toto je obzvláště upřednostněné provedení, protože obecně uvedené expresní systémy hub nejsou kultivované za neutrálních až alkalických podmínek, ale jsou kultivovány při kyselém pH. Takže systémy podle předkládaného vynálezu poskytují bezpečné expresní systémy pro proteiny nebo polypeptidy, které snadno podléhají inaktivaci nebojsou nestálé za kyselého pH.

Zcela specificky rekombinantní kmen definovaný v každém provedení předkládaného vynálezu, přičemž sekvence nukleové kyseliny kódující polypeptid našeho zájmu kódují protein nebo polypeptid vykazující optimální aktivitu a/nebo stabilitu při pH 5, výhodně při pH neutrálním nebo alkalickém pH (tj. nad 7) a/nebo při pH vyšším než 6, je považován za upřednostněné provedení předkládaného vynálezu. Více než 50 %, více než 70 % a dokonce více než 90 % optimální aktivity při těchto pH hodnotách je očekáváno v obzvláště použitelném provedení předkládaného vynálezu. Polypeptid vylučovaný během kultivačních podmínek nemusí být nutně aktivní za kultivačních podmínek, ve skutečnosti může být pro kultivaci výhodné, aby byla provedena za podmínek, během kterých je polypeptid inaktivní, protože jeho aktivní forma může být škodlivá pro hostitele. Co je ale pro protein nebo polypeptid požadováno, je stabilita za kultivačních podmínek. Stabilita může být termální stabilita. Může to být také stabilita proti specifickým směsím nebo chemikáliím, které jsou přítomny například ve směsích nebo procesech produkce nebo aplikace polypeptidu nebo proteinu našeho zájmu. LAS v detergentní směsi obsahuje cellulázy nebo lipázy, které jsou příkladem chemikálie, která je škodlivá proteinům. Doba použití v aplikacích se může lišit od krátké do dlouhé expozice, takže stabilita může být různě dlouhá při různých aplikacích. Odborník je schopen zjistit vhodné podmínky případ od případu. Mohou být také použity komerční dostupné analýzy k stanovení optimální aktivity různých enzymatických produktů.

- 10CZ 303980 B6

Například katalogy Sigma a Megazyme to ukazují. Specifické příklady testů jsou zmíněny v popisu. Výrobci poskytují poučení pro použití.

Chrysosporium kmen může být vhodně použit k transformaci nebo transfekci sekvencí, která má být podrobena expresi, a který vykazuje relativně nízkou biomasu. Bylo nalezeno, že Chrysosporium kmen má dvakrát až pětkrát nižší biomasu než Trichoderma reesei, pokud byl kultivován na viskozitu 200 až 600 cP na konci fermentace a vykazuje biomasu lOx až 20x nižší než Aspergillus niger, pokud byl kultivován na viskozitu 1500 až 2000 cP za odpovídajících podmínek, tj. jejich optimálních kultivačních podmínek, kdy může poskytovat vyšší úroveň exprese. Tato io úroveň exprese daleko převyšuje dva komerčně odkazované kmeny při nižší biomase a nižší viskozitě. To znamená, že výtěžek exprese kmene Chrysosporium bude zjevně vyšší než od Aspergillus niger nebo Trichoderma reesei. Takto transformovaný nebo transfekovaný Chrysosporium kmen tvoří vhodné provedení předkládaného vynálezu.

Byla nalezena biomasa 0,5 až 1,0 g/1 pro kmen Chrysosporium C 1(18-25) oproti 2,5 až 5,0 g/1 pro Trichoderma reesei a 5 až 10 g/1 pro Aspergillus niger za výše uvedených podmínek. V Příkladech budou uvedeny detaily k tomuto postupu.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu rekombinantní kmen Chrysosporium produkuje protein nebo polypeptid v množství alespoň ekvivalentním produkci v molech na litr cellulázy kmene UV13-6 nebo C-19 a nejvýhodněji alespoň ekvivalent nebo více než kmen UV18-25 za odpovídajících nebo identických podmínek, tj. jejich optimálních kultivačních podmínek.

Bylo také nalezeno, že rychlost exprese a sekrece jsou neobyčejně vysoké za použití kmene

Chrysosporium vykazující morfologii kmene UV18-25 tj. malou fragmentovanou mycelu. Rekombinantní kmen bude výhodně vykazovat tuto morfologii. Dále jsou popsány nerekombinantní kmeny nebo ostatní konstruované kmeny Chrysosporium vykazující tyto nové vynálezecké charakteristiky. Také se popisují rekombinantní kmeny Chrysosporia v každém provedení a dále vykazující redukované tvoření výtrusů ve srovnání sCl, výhodně pod kmene UV13-6, výhodněji pod kmenem NG7C-19, výhodně pod kmenem UV18-25 za stejných fermentačních podmínek. Také je zde popsán rekombinantní kmen Chrysosporium v každém provedení a dále vykazující alespoň rychlost produkce proteinu k biomase ve srovnání s Cl, výhodně ve srovnání s kterýmkoli v kmenem UV13-6, NG7C-19 a UV 18-25 za stejných fermentačních podmínek. Dále jsou popsány nerekombinantní kmeny nebo jinak konstruované kmeny Chrysosporium vykazující novou nebo vynálezeckou charakteristiku jako takovou nebo v kombinaci skterýmkoliv dalším provedením.

Další velmi atraktivní popsané provedení také zahrnuje rekombinantní kmen Chrysosporium vykazující viskozitu nižší než kmen NG7C-19, výhodněji nižší než UV 18-25 za odpovídajících nebo identických fermentačních podmínek. Popsané jsou také nerekombinantní kmeny nebo jinak konstruované kmeny Chrysosporium vykazující nové nebo vynálezecké charakteristiky stejně tak jako kombinace kterýchkoli ostatních provedení. Byla stanovena viskozita kultury UV18-25, která je pod 10 cP oproti kmenu Trichoderma reesei, která je řádově 200 až 600 cP, a pro kmeny Aspergillus niger v řádu 1500 až 2000 cP za optimálních kultivačních podmínek na konci fermentace. Provedení použité pro toto stanovení bude poskytnuto v Příkladech.

Viskozita může být posouzena v mnoha případech vizuálně. Tekutost substance se může lišit, může být blízká pevné látce nebo kapalině. Viskozita může být také stanovena Brookfield rotačním viskozimetrem, za použití kinematických viskozitních trubiček, spouštěním kulovitého vis50 kozimetru nebo košíčkovým viskozimetrem. Výtěžky u těchto nízko viskozitních kultur jsou vyšší než u komerčně známých vysoce viskozitních kultur za jednotku času a na buňku.

Zpracování těchto nízko viskozitních kultur podle předkládaného vynálezu je výhodné obzvláště pokud jsou kultury zvětšeny v měřítku. Kmen Chrysosporium s nízkou viskositou poskytuje veli55 ce dobře kultury o velikosti 150 000 litrů. Jakákoliv velikost kultury větší než 150 000 litrů

- 11 CZ 303980 B6 poskytuje použitelné provedení předkládaného vynálezu. Jakákoliv jiná konvenční velikost fermentace by měla být provedena s kmeny podle předkládaného vynálezu. Problém může vzniknout ve velké produkci, protože vznikají agregáty, které mají mycelia, která jsou příliš hustá nebo nerovnoměrně distribuovaná. Médium ve výsledku nemůže být efektivně použito během kultivace, což vede k neúčinnému procesu fermentace ve velké měřítku tj. nad 150 000 litrů. Provzdušnění a mixování se stává problematickým vzhledem k zavádění kyslíku a živin a redukovaná koncentrace produktivní biomasy a redukovaný výtěžek polypeptidu během kultivace může vést k delší fermentační době. Navíc vysoká viskozita a vysoká smyková rychlost nejsou vhodné v komerčních fermentačních procesech a v současných komerčních procesech jsou tyto limitujícími faktory. Všechny tyto negativní aspekty mohou být zdolány popsaným hostitelem Chrysosporium, který vykazuje mnohem lepší vlastnosti než kmen Trichoderma reesei, Aspergillus niger a Aspergillus oryzae, které jsou komerčně dostupné vzhledem k tomu, že vykazují lepší produkční úroveň a viskozitní vlastnosti a hodnoty biomasy.

Kmen Chrysosporium je obsažen v kterémkoliv z výše uvedených provedení a dále vykazuje produkci jednoho nebo více houbových enzymů vybraných ze skupiny zahrnující karbohydrát degradujících enzymy, proteázy, ostatní hydrolázy, oxidoreduktázy, a výše zmíněné transferázy. Tento kmen je požadován v zejména upřednostněných provedeních předkládaného vynálezu. Nejvíce zajímavé produkty jsou konkrétně cellulázy, xylanázy, pektinázy, lipázy a proteázy. Také použitelný pro provedení je kmen Chrysosporium vykazující produkci jednoho nebo více houbových enzymů, které vykazují neutrální nebo alkalickou optimální stabilitu a/nebo aktivitu, výhodně alkalickou optimální stabilitu a/nebo aktivitu. Tento enzym je vybrán ze skupiny zahrnující karbohydrát degradující enzymy, hydrolázy a proteázy, výhodně hydrolázy a karbohydrát degradující enzymy. V případě nerekombinantního kmene Chrysosporium, jsou vhodné enzymy jiné než hydrolázy jak je uvedeno v WO 98/15633. Enzymy zvláštního zájmu jsou xylanázy, proteázy, esterázy, alfa-galaktosidázy, beta-galaktosidázy, beta-glukanázy a pektinázy. Enzymy nejsou omezeny těmito uvedenými enzymy. Připomínky ke stabilitě a aktivitě popsané v popisné části jsou platné také pro tyto enzymy.

Vynález se také týká způsobů produkce polypeptidu našeho zájmu. Popsány jsou způsoby obsahující kultivaci hostitelského kmenu (tj. kmenu druhu Chrysosporium, Aspergillus, Trichoderma, Hansenula, Mucor, Pichia, Neurospora, Tolypocladium, Rhizomucor, Fusarium, Penicillium nebo bakteriálního nebo jiného mikrobiálního kmenu) ve kterémkoliv provedení za podmínek umožňujících expresi a výhodně sekreci polypeptidu a regeneraci produkovaného polypeptidu našeho zájmu.

Pokud je zmíněn polypeptid nebo protein jsou do popisu zahrnuty také varianty a mutanty například substituční, inserční nebo vypouštěcí z přírodně se vyskytujících enzymů, které vykazují aktivitu nemutovaného kmene. Toto je platné pro odpovídající sekvence nukleových kyselin. Procesy, které zahrnují genové přemísťování článků, proteinovou konstrukci a řízenou evoluci, místy řízenou mutagenezi a náhodnou mutagenezi jsou procesy, kteiými tyto polypeptidy, varianty a nebo mutanty mohou být získány. US Patent 5 223 409, 5 780 279 a US Patent 5 770 356 poskytují ukázky řízené evoluce. Za použití tohoto procesu byly vytvořeny knihovny náhodně mutovaných genových sekvencí, například přemísťováním genů náchylných k chybám PCR vyskytující se v každé buňce. Každý gen má sekreční oblast a imobilizační oblast, které sousedí tak, aby se výsledný protein vyměšoval a setrvával fixovaný k povrchu hostitele. Podmínky byly přizpůsobeny tak, aby byla vyžadována biologická aktivita polypeptidu. Tento požadavek se vyskytuje pro mnoho cyklů konečně vedoucích ke konečnému genu s požadovanou charakteristikou. Jinými slovy to urychluje přímý proces evoluce. US Patent 5 763 192 také popisuje způsob získání DNA, RNA, peptidů, polypeptidů nebo proteinů cestou syntetického polynukleotidového spojení náhodně generovaných sekvencí, jejich zavedením do hostitele následovaným výběrem hostitelských buněk s odpovídající předem definovanou charakteristikou.

Další aplikací je proces „přímé evoluce“ přičemž jsou generovány nové protein kódující DNA sekvence, kódující proteiny jsou exprimovány v hostitelské buňce a tyto sekvence kódující pro- 12 μΜΜΊ teiny, mající požadovanou charakteristiku, jsou mutovány a znovu podrobeny expresi. Proces je opakován v mnoha cyklech dokud není získán protein s požadovanou charakteristikou. Přemísťování genů, proteinové inženýrství, PCR náchylná k chybám, místem řízená mutace a kombinované nebo náhodná mutageneze jsou příklady procesů, kterými jsou generovány nové sekvence DNA kódující exogenní proteiny. US patenty 5 223 409 a 5 780 279 a 5 770 356 poskytují dostatek informací o řízené evoluci. Viz také Kuchner a Arnold, Trends in Biotechnology, 15:523 až 530 (1997); Schmidt-Dannert a Arnold, Trends in Biotech, 17:135 až 136 (1999); Arnold a Volkov, Curr. Opin. Chem. Biol., 3:54 až 59 (1999); Zhao a kol., Manual of Industrial Microbiology a Biotechnology, 2^nd Ed., (Demain a Davies, eds.) místa 597 až 604, ASM Press, Washington DC 1999; Arnold a Winrode, Encyklopedia of Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation, (Flickinger a Drew, eds.) místa 971 až 987, John Willey & Sons, New York, 1999; a Minshull a Stemmer, Curr. Opin. Chem. Biol. 3:284 až 290.

Použití kombinatomí mutageneze je uvedeno v Hu a kol., Biochemistry. 1998 37:10006 až 10015. US Patent 5 763 192 popisuje způsob získání nových protein kódujících DNA sekvencí stochasticky generovanými syntetickými sekvencemi, jejich zavedením do hostitele a vybráním hostitelských buněk s požadovanými vlastnostmi. Způsoby pro provedení rekombinace umělých genů (DNA přemisťování) zahrnuje náhodnou prvotní rekombinaci (Z. Shao a kol., Nucleic Acid Res., 26:681 až 683 (1998), stupňovitý extenzní proces (H. Zhao a kol., Nátuře Biotech. 16:258 až 262 (1998)) a heteroduplexní rekombinaci (A. Volkov a kol., Nucleic Acids Res., 27:18 (1999)). K chybám náchylná PCR je nyní jiným přiblížením (Song a Rhee, Appl. Environ. Microbiol. 66:890 až 894 (2000)).

Existují dvě široce používané metody provedení výběrového kroku v přímém evolučním procesu. V jedné metodě je aktivita proteinu našeho zájmu připravena, aby byla nezbytná k přežití hostitelských buněk. Například pokud je požadována cellulázová aktivita při pH 8, cellulázový gen může být mutován a zaveden do hostitelských buněk. Transformanty jsou ponechány růst s cellulázou jako výhradním uhlíkovým zdrojem a pH se graduálně zvyšuje až zůstává pouze několik žijících buněk. Mutovaný cellulázový gen ze Zachovalých buněk, které pravděpodobně kóduje cellulázovou aktivitu při relativně vysokém pH, je vystaven druhému cyklu mutace a proces je opakován dokud jsou získávány transformanty, které mohou růst na cellulóze při pH 8. Termostabilní varianty enzymů mohou být také vyvinuty, mutačními genovými cykly a vysokoteplotní kultivací hostitelských buněk (Liao a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:576 až 580 (1986); Giver a kol., Proč. Nati. Acad Sci. USA 95:12809 až 12813 (1998).

Alternativa k paralelnímu přístupu „přirozeného výběru“ je sériový screening. V tomto přístupu jsou individuální transformanty tříděny tradičními způsoby, jako je pozorování čištěných nebo zabarvených zón kolem kolonií rostoucích v indikačním prostředí, kalorimetrické nebo fluorometrické enzymové analýzy, imunoanalýzy, vazbová analýza atd. Například v Joo a kol., Nátuře 399:670 až 673 (1999), kde byl vyvinut cytochrom P450 monooxygenáza nepožadující NADH jako kofaktor cyklu mutací a screeningu; May a kol., Nátuře Biotech. 18:317 až 320 (2000), kde byla stejně vyvinuta hydantoináza s reverzní selektivitou; a Miyazaki a kol., J. Mol. Biol. 297:1015 až 1026 (2000), kde je zveřejněn termostabilní subtilisin.

Standardní klonovací a izolační techniky pro syntézu peptidů a polypeptidů byly použity k získání požadované sekvenční informace. Části známých sekvencí byly použity jako zjišťování k izolaci ostatních druhů a kmenů. Sekvence nukleových kyselin kódující konkrétní enzymatickou aktivitu mohou být použity ke screeningu Chrysosporium knihoven. Odborník v oboru může sám posoudit, které jsou vhodné podmínky pro hybridizaci. Obvyklé metody pro tvorbu knihoven hybridizace nukleové kyseliny a klonovacích technik jsou popsány v Sambrook a kol., (Eeds) (1989) v „Molecular cloning. A Laboratory Manual“ Cold Spring Harbor, Press Plainview, New York a Ausubel a kol. (Eds) „Current Protocols in Molecular Biology“ (1987) John Wiley a Sons, New York. Důležité informace můžou být také získány z pozdějších příruček nebo patentů, stejně tak jako z ostatních komerčně dostupných publikací v oboru.

- 13 CZ 303980 B6

V případném provedení, uvedená metoda obsahuje kultivaci kmene podle předkládaného vynálezu za podmínek umožňujících expresi a výhodně sekreci proteinu nebo polypeptidu nebo jeho prekurzoru a regeneraci následně produkovaného polypeptidu a případně vystavení prekurzoru dodatečné izolaci a přečištění za získání polypeptidu našeho zájmu. Takové metody mohou případně obsahovat krok štěpení prekurzoru na polypeptid nebo prekurzor, o který se zajímáme. Štěp krok může být štěpení s Kex-2 podobnou proteázou, jakoukoliv s bazickou aminokyselinou párovanou proteázou nebo K.ex-2 například, pokud proteáza štěpí místo spojení dobře vylučovaného proteinového nosiče a polypeptidu našeho zájmu. Odborník v oboru může snadno najít Kex-2, jako proteázová sekvence, jako shodné sekvenční detaily, pro které jsou dostupné a počet možností byl již popsán, například furin.

Vhodná metoda k produkci polypeptidu našeho zájmu podle kteréhokoliv provedení předkládaného vynálezu je kultivace při pH vyšším než 5, výhodně 5 až 10, výhodněji 6 až 9. Výhodně se kultivace při této metodě provádí při teplotě mezi 25 až 43 °C, výhodně 30 až 40 °C. Kmen použitý ve způsobu podle předkládaného vynálezu je zcela vhodný pro rekombinant kmene Chrysosporium nebo ostatní kmeny hub nebo nehoubovité kmeny. Způsob může v takových případech dále předcházet kroku produkce rekombinantního kmene. Výběr odpovídajících podmínek bude záviset na povaze exprimovaného polypeptidu a tento výběr spočívá v oblasti normální aktivity odborníka v oboru.

Způsob produkce rekombinantu kmene je také částí předmětu vynálezu. Způsob zahrnuje stabilní zavedení sekvence nukleové kyseliny kódující heterologní nebo homologní polypeptid do vhodného hostitelského kmene, daná sekvence nukleové kyseliny je operativně spojena s oblastí regulující expresi, dané zavedení se provádí způsobem známým pro transformující vláknité plísně. Jak uvedeno výše množství odkazů je dostupných a pouze malá část je citována. Informace poskytnutá je dostatečná k umožnění odborníkovi provést metodu bez přehnaného experimentálního zatížení. Způsob obsahuje zavedení sekvence nukleové kyseliny obsahující jakékoliv elementy nukleové kyseliny popsané v různých provedeních rekombinantního kmene podle předkládaného vynálezu jako takové nebo jeho kombinaci.

Ve smyslu uvedení příkladu zavedení může probíhat použitím protoplastového transformačního způsobu. Způsob je popsán v Příkladech. Případné protoplastové nebo sferoplastové transformační způsoby jsou známé a mohou být použity, jak bylo již dříve popsáno ve stavu techniky pro ostatní vláknité plísně. Detaily těchto způsobů mohou být nalezeny v mnoha citovaných odkazech ajsou zde zahrnuty do referencí. Způsob popsaný zde vhodně obsahuje použití nerekombinantního kmene jako výchozí látky pro zavedení požadované sekvence kódující polypeptid našeho zájmu.

Popsaný předmět se také týká způsobu produkce Chrysosporium enzymu, způsobu zahrnujícího kultivaci kmene Chrysosporium nebo jiného kmene v nebo na kultivačním prostředí při pH vyšším než 5, výhodně 5 až 10, výhodněji 6 až 9. Vhodné příklady neutrálního a alkalického rozmezí pH jsou 6 až 7,5 a 7,5 až 9.

Mnohem obecněji je dále popsán způsob produkce enzymů vykazujících neutrální nebo alkalickou optimální aktivitu a/nebo stabilitu, výhodně alkalickou optimální aktivitu a/nebo stabilitu. Upřednostněné rozmezí pH a optimální aktivity stejně tak jako analýz, se kterými můžeme toto stanovit, byly poskytnuty v popisu. Enzym může být vybrán ze skupiny zahrnující karbohydrát degradující enzymy, proteázy, ostatní hydrolázy, oxidoreduktázy a transferázy. Jak je popsáno výše, způsob zahrnuje kultivaci hostitelských buněk transformovaných nebo transfekovaných odpovídající enzym kódující sekvencí nukleové kyseliny. Vhodný enzym je enzym Chrysosporium. Vhodná metoda je metoda obsahující produkci konkrétně cellulázy, xylanázy, lipázy a proteázy, přičemž celluláza a xylanáza štěpí (3-1,4-vazby a cellulázy obsahují endoglukanázy, cellobiohydrolázy a β-glukosidázy. Způsob zde popsaný může obsahovat kultivaci jakéhokoliv hostitele Chrysosporium, který obsahuje nukleové kyseliny kódující výše zmíněné enzymy. Vhodná, zde popsaná, produkce nerekombinantního hostitele Chrysosporium je směřována

- 14CZ 303980 Β6 k produkci karbohydrát degradujících enzymů, hydroláz a proteáz. V takovém případě je vhodný jiný enzym než celluláza. Způsoby izolace jsou analogické způsobům popsaným v WO 98/15633.

Jsou zde popsané také další produkované enzymy. Enzymy Chrysosporium původu mohou být izolovány z nerekombinantního kmene Chrysosporium podle předkládaného vynálezu a jsou do vynálezu také zahrnuty. Vykazují již dříve zmíněnou stabilitu a aktivitu. Vhodně jsou stabilní při přítomnosti LAS. Obzvláště proteázy s pH 4 až 9,5, proteázy s molekulovou váhou 25 až 95 kD, xylanázy s pH 4,0 až 9,5, xylanázy s molekulovou váhou mezi 25 až 65 kD, endoglukanázy s pH mezi 3,5 až 6,5, endoglukanázy s molekulovou váhou 25 až 55 kD, β-glukosidázy, α,β-galaktosidázy s pH 4 až 4,5, β-glukosidázy, α,β-galaktosidázy s molekulovou váhou 45 až 50 kD, cellobiohydrolázy s pH 4 až 5, cellobiohydrolázy s molekulovou váhou 45 až 75 kD například molekulová váha 55 kD a pH 4,4, polygalakturonázy s pH 4,0 až 5,0, polygalakturonázy s 60 až 70 kDa, například 65 kDa, esterázy s pH 4 až 5, esterázy s molekulovou váhou 95 až 105 kDa s výše uvedenou stabilitou a aktivitou. Molekulová hmotnosti jsou stanoveny pomocí SDSPAGE. Nerekombinantní tj. přírodně se vyskytující enzym je jiný než celluláza, jak je uvedeno v WO 98/15633. Enzymy s kombinací pí hodnot a molekulových hmotností výše zmíněných jsou také zahrnuty.

Dále je popsána nadprodukce neproteinových produktů mutovanými (rekombinantními) kmeny. Takové neproteinové produkty zahrnují primární metabolity jako jsou organické kyseliny, aminokyseliny a sekundární jako antibiotika, například peniciliny a cefalosporiny a ostatní terapeutika. Tyto produkty jsou výsledkem kombinací biochemických cest, zahrnující několik genů hub. Houbové primární a sekundární metabolity a způsoby produkce těchto metabolitů v houbových organismech jsou velice dobře známy ze stavu techniky. Příklady produkce primárních metabolitů byly popsány v Mattey M., The production of Organic acid, Current Reviews in Biotechnology, 12, 87 až 132 (1992). Příklady produkce sekundárních metabolitů byly popsány v Penalva a kol. The Optimalization of Penicillin Biosynthesis in Funghi, Trends in Biotechnlogy 16, 483 až 489 (1998).

Příklady provedení vynálezu

Příklady transformace srovnávající kmeny Chrysosporium, Trichoderma a Tolypocladium geodes

Dva netransformované kmeny Chrysosporium Cl a jeden Trichoderma reesei referenční kmen byly testovány ve dvou prostředích (Gs pH 6,8 a Pridham agar, PA, pH 6,8). K. testování antibiotické úrovně odolnosti spory byly shromážděny během 7 dní na PDA destičkách. Vybrané destičky byly inkubovány při 32 °C a byly rýhovány po 2,4 a 5 dnech. Bylo zjištěno, že Cl kmeny NG7C-19 a UV18—25 poskytovaly čistě základní nízkou úroveň odolnosti jak k phleomycinu tak hygromycinu. Tato úroveň je srovnatelná s úrovní pro referenční T. reesei, nejběžněji používaný laboratorní kmen. Byla nalezena jasná indikace, že tyto dva standardní selekční markéry pro houby mohou být dobře použity u kmene Chrysosporium. Problémy s ostatními selekčními markéry pro houby nejsou očekávány.

Výběr Sh-ble (phleomycin odolných) transformovaných Chrysosporium kmenů bylo úspěšně provedeno při 50 pg/ml. Tato selekční úroveň byla také použitá pro T. reesei, což ukazuje, že rozdílná selekce může být dosažena u kmene Chrysosporium. Stejné poznámky jsou platné i pro transformované kmeny s hydromycinovou resistencí na úrovni 150 pg/ml.

Transformační techniky protoplastů založené na nejvíce používané plísňové transformační technologii byly použity u kmene Chrysosporium. Všechny spory zjedná 90mm PDA destičky byly pokryty 8 ml IC1 a převedeny do třepací baňky s 50 ml IC1 médiem pro inkubaci po dobu 15 h při 35 °C a 200 ot./min. Poté byly kultury centrifugované, destička byla promyta MnP a vrácena do roztoku s 10 ml MnP a 10 mg/ml Caylase C₃ a inkubovány po dobu 30 minut při 35 °C s rotací (150 ot./min).

- 15 CZ 303980 B6

Roztok byl filtrován a filtrát byl podroben centrifugaci po dobu 10 min při 3500 rot./min. Destička byla promyta 10 ml MnPCa²⁴. Roztok byl centrifugován 10 min při 25 °C. Poté bylo přidáno 50 μΙ chladného MPC. Směs byla držena na ledu a poté bylo přidáno 2,5 ml PMC. Po 15 minutách při pokojové teplotě bylo mixováno 500 μΙ upravených protoplastů s 3 ml MnR Soft, a byly bezprostředně umístěny na MnP destičku obsahující phleomycin nebo hydromycin jako selekční markér. Po inkubaci po dobu 5 dní při teplotě 30 °C byly transformanty analyzovány (klony byly viditelné po 48 hodinách). Transformační účinnost byla stanovena za použití 10 pg referenčního plasmidu pAN8-l¹⁹. Výsledky jsou uvedeny v následující Tabulce 1.

Tabulka 1 Transformační účinnost (za použití 10 pg referenčního plasmidu pNA8-l

	T. reesei	NG7C-19	UV18-25
Životaschopnost	106/200 μΐ	5.106/200 μΐ	5.10β/200 μΐ
Transformanty (per 200 μΐ)	2500	10*	10*
Transfromanty (na 10s životaschopných buněk)	2500	2500	2000

Životaschopnost Chrysosporium transformantů je nadřazena životaschopnosti kmene Trichoderma. Transformovatelnost kmenů je srovnatelná a tím počet transformantů získaných v jednom experimentuje 4 krát vyšší pro Chrysosporium než pro T. reesei. Tudíž Chrysosporium transformační systém není stejný jako obvykle používaný T. reesei systém, ale dokonce ho překonává. Toto vylepšení může být specielně použitelné pro vektory, které jsou méně transformované účinné než pAN8-l. Příklady těchto méně účinných transformačních vektorů jsou protein přenášecí vektory pro produkce neplísňových proteinů, které obvykle poskytují 10 krát méně transformantů.

Mnoho dalších transformačních a expresních vektorů bylo konstruováno s homologními sekvencemi kódujícími proteiny kmene Chrysosporium a také s heterologními sekvencemi kódujícími proteiny pro použití v transformačních experimentech s kmenem Chrysosporium.

Příklady expresních systémů zahrnují Chrysosporium xylanázu Xyll promotorový fragment spojený s xylanázovou signální sekvencí v rámci s xylanázovým otevřeným čtecím rámcem následovaným xylanázovou terminační sekvencí. Výběr transformantů byl proveden za použití kontransformace s vybraným vektorem.

Dalším příkladem je cellobiohydrolázový promotor Chrysosporium lucknowese spojený s endoglukanázovou 3 signální sekvencí Penicillium v rámci s endoglukanázou 3 Penicillium otevřeným čtecím rámcem následovaným cellobiohydrolázou terminační sekvencí Chrysosporium. K tomu tento vektor nese druhou expresní kazetu se selekčním markérem tj. genem acetamidázy S (AmdS gen).

Další příklad obsahuje glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenovaný 1 promotor Chrysosporium spojený s glukoamylázovou signální sekvencí Aspergillus niger a glykoamylázovým otevřeným čtecím rámcem kondenzovaným k lidskému Interleukinu 6 otevřenému čtecímu rámci. Tento vektor navíc nese druhou expresní kazetu se selekčním markérem tj. AdmS genem.

- 16ΜϋΜΜΙΗΜΜΗ

ΜΜνΜΜ

Další příklad obsahuje glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenovaný A promotor Aspergillus nidulans spojený s endoglukanázou 5 otevřeným čtecím rámcem následovaným terminační sekvencí Aspergillus nidulans.

Příklady exprese (heterologních a homologních) Chrysosporium transformantů.

Cl kmeny (NG7C-19 a/nebo UV18-25) byly testovány na jejich schopnost vyměšovat různé heterologní proteiny: bakteriální protein Streptoallotechnicus hindustanus phleomycin odolný protein, Sk ble), plísňový protein {Trichoderma reesei xynaláza II, XYN2) a lidský protein (lidský lysozym, HLZ).

Cl sekrece Trichoderma reesei xylanázy II (XYN2).

Cl kmen UV18-25 byl transformován plasmidem pUT1064 a pUT1065. p(JT1064 představuje dvě následující plísňové expresní kazety:

První kazeta dovoluje výběr transformantů odolných phleomycinu:

- Neurospora crassa kontrolní gen křížové cesty 1 (cpc-1) promotor¹⁴

- gen Sh ble⁴ odolný phleomycinu Streptoalloteichus hindustanus

- Aspergillus nidulans tiyptofan syntáza (trpC) terminátor⁵

Druhá kazeta je xylanázová produkční kazeta:

- T. reesei kmen TR2 cbhl promotor¹⁵

- T. reesei kmen RT2 xyn 2 gen (zahrnující jeho signální sekvenci)¹⁶

- T. reesei kmen TR2 cbhl terminátor¹⁵

Vektor také nese replikační počátek E. coli pocházející z plasmidu pUC19⁶. Na Obr. 1 je detailní mapa plasmidu.

PUT 1065 představuje následující plísňové expresní kazety:

- glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázový {gpdA) promotor² A. nidulans

- Syntetickou cellobiohydrolázovou I {cbhl) signální sekvenci^1,3 T. reesei

- gen Sh ble* resistentní phleomycinu S. hindustanus použitý jako proteinový nosič¹⁰

- Spojovací peptid (SGERK) obsahující štěp místo pro proteázu podobnu KEX2¹

- T. reesei kmen TR2jty«2 gen (bez signální sekvence)¹⁶

- terminátor⁵ tryptofan syntházy {A. nidulans (trpC)

Vektor také nese gen pro beta-laktamázu {bia) a E. coli replikační počátek pocházející z plasmidu pUC18⁶. Plasmid je detailněji popsán na Obr. 2.

Cl protoplasty byly transformovány plasmidem pUT1064 nebo pUT1065 podle stejné procedury již popsané ve výše uvedeném příkladu. Fúze proteinu v plasmidu pUT1065 (Sh ble :: XYN2) je funkční vzhledem k odolnosti vůči phleomycinu, která dovoluje snadné odlišné od Cl transformantů. Kromě toho, úroveň odolnosti vůči phleomycinu zhruba odpovídá úrovni xyn2 exprese. V pUT1064, xyn2 byl klonován s jeho vlastní signální sekvencí.

Produkce xylanázy Cl transformanty (klony odolné phleomycinu) byla analyzována kvalitativními testy na xylanázovou aktivitu následovně: Primární transformanty byly zavedeny do GS+phleomycin (5μg/ml) destiček (ověření odolnosti) a také na XYLAN destičky (detekce xylanázové aktivity byla jasnou vizualizační zónou¹⁷). Destičky byly ponechány růst 5 dní při 32 °C. Každý platný klon byl subklonován do XYLAN destičky. Dva subklony na transformant byly

- 17CZ 303980 B6 použity k naočkování PDA destiček ve smyslu získat spory pro kapalnou iniciaci kultury. Kapalné kultuty v ICI+ 5 g/1 Kphtalátu byly ponechány růst 5 dní při 27 °C (třepáno při 180 ot./min.). Poté byly kultury centrifugovány (5000 g, 10 min.). Pro tyto vzorky byla změřena xylanázová aktivita DNS technikou podle Miller a kol.¹⁸.

Tabulka 2: Úroveň aktivní produkce XYN2 v Cl (nejlepší provedení)

	Aktivní koncentrace xylanázy II v kultivačním prostředí	Specifická aktivita xylanázy II v kultivačním prostředí
Netransformovaný UV18-25	3,9 U./ml	3,8 U./mg celkové prot.
UV18-25::1064 klon 7-1	4,7 U./ml	4,7 U./mg celkové prot.
UV18-25::1064 klon 7-2	4,4 U./ml	4,3 U./mg celkové prot.
UV18-25::1065 klon 1-1	29,7 U./ml	25,6 U./mg celkové prot.
UV18-25::1065 klon 1-2	30,8 U./ml	39,4 U./mg celkové prot.

Tyto data ukazují, že:

1) Body 1 až 4 z Příkladu 2 byly potvrzeny

2) Cl může být použit jako hostitel pro sekreci heterologního plísňového proteinu.

Dodatek k Příkladům: Prostředí Transformační prostředí:

Mendelova báze: KH2PO4 (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O CaCl2 Oligoelementy	MnP prostředí 2,0 g/1 1,4 g/1 0,3 g/1 0,3 g/1 1,0 g/1	Mendelova báze s Pepton 1 g/1 MES 2 g/1 Sacharóza 100 g/1 Úprava pH na 5
MnR	MnP CA2+
MnP+ sacharóza	130 g/1	MnP Prostředí+
Kvasnicový extrakt	2,5 g/1	CaCl2.2H2O 50mM
Glukóza	2,5 g/1	Úprava pH na 6,5
MnR Soft:	MnR pouze s 7,5 g/1 agaru
MPC:
CaCl2	50 mM	pH 5,8
MOPS	10 mM
PEG	40%
Pro výběr a kultury:
GS:
Glukóza	10 g/1
Biosyáza	5 g/1	Merieux
Agar	15 g/1	pH by mělo být 6,8

- 18CZ 303980 B6

0^-· - :

PDA:

Potato dextrose agar 39 g/1 Difco, pH by mělo být 5,5

MPG:

Mandelova báze s K. Phtalátem 5 g/1

Glukóza 30 g/1

Kvasnicový extrakt 5 g/1

Regenerační médium (MnR) bylo obohaceno 50 pg/ml phleomycinu nebo 100 až 150 pg/ml hydromycinu k oddělení transformantů. GS prostředí, obohacené o 5 pg/ml phleomycinu bylo použito k potvrzení odolnosti vůči antibiotikům.

PDA je kompletní prostředí pro rychlý růst a dobrou tvorbu spor. Kapalné prostředí (médium) bylo naočkováno 1/20 objemovým dílem suspenze spor (všechny spory z jedné PDA destičky v 5 ml 0,1% Tween). Takové kultury byly ponechány růst při 27 °C v třepací baňce (200 ot./min). Izolace a charakterizace Cl genů a sekvence regulující expresi CBH1, XYL1, a GPD Konstrukce BlueSTAR genové knihovny UV 18-25

Chromozomální DNA UV 18-25 byla částečně zpracována Sau3A, části s 12 až 15 kb byly izolovány a ligovány do baumHI místa klonovacího vektoru BlueSTAR. Sbalení 20 % ligační směsi poskytlo knihovnu genů 4,6 x 10⁴ nezávislých klonů. Tato knihovna byla násobena a uchována při 4 °C a -80 °C. Zbytek ligační směsi byl také skladován při 4 °C.

Třídění knihovny genů UV18-25 pro izolaci genů cbhl, xyll a gpdl

Pro izolaci různých genů, celkem ±7,5 x 10⁴ jednotlivých BlueSTAR bakteriofágů na vzorek bylo dvakrát hybridizováno. Hybridizace byla provedena s PCR fragmenty cbhl a xyll (jak je popsáno v WO 00/20555) při homologních podmínkách (65 °C; 0,2xSSC) a s gpdl A. niger za heterologních podmínek (53 °C; 0,5 x SSC). Počet pozitivních signálů je uveden v Tabulce 3. Pozitivní klony byly roztříděny a pro každý klon byly použity individuálně dva bakteriofágy pro další experimenty. DNA různých klonů byly analyzovány restrikční analýzou k určení počtu různých klonů izolovaných z každého genu (výsledky jsou uvedeny v Tabulce 3).

Pro každý ze tří genů bylo izolováno 4 až 6 klonů. Z toho usuzujeme, že primární knihovna genů (±4 až 5 xlO⁴ klonů) představovala 5x genom UV18-25. Z tohoto výsledku usuzujeme, že kompletní genom UV 18-25 by představovalo 9 x 10³ klonů. Založeno na průměrné genomické vsuvce 13kb by to indikovalo genom velikosti ±120 Mb, který je třikrát tak velký jako velikost genomu Aspergillus.

PCR reakcemi s konkrétními primery pro geny přítomné na plasmidu (založeno na předchozích sekvenčních stanoveních z izolovaných PCR fragmentů) a T7 a T3 primery přítomnými v polylinkeru pBlueSTAR jsme byli schopni stanovit umístění genů v množství klonů. Z každého genu byl použit plasmid pro určení sekvence genu.

Gen	pozitivních v prvním screeningu	pozitivních v rescreeningu	různých klonů	klony použité pro řazení
cbhl	8	7	4	pCBH7
xyll	9	6	5	pXyl5
gpdl	12	12	6	pGPD4

- 19CZ 303980 B6

Tabulka 3: Screening 7,5 x 10⁴ bakteriofágů knihovny genů UV 18-25 s CPR fragmenty UV1825 pro cbhl a xyll gen (homologní podmínky) a s gpdA geny A. niger (heterologní podmínky). Izolace DNA a restrikční analýzy byly použity ke stanovení počtu různých klonů.

Sekvenční analýza klonovaných genů

Pro cbhl, xyll a gpdl geny byly výsledky stanovení sekvence uvedeny v SEQ ID číslo 1, 3 a 5. Také vyvozené sekvence aminokyselin proteinů jsou uvedeny v SEQ ID číslo 2, 4 a 6. Některé vlastnosti proteinů jsou udány v Tabulce 4. Mělo by být poznamenáno, že pozice startu translace a intronu je založena na homologii s geny stejné rodiny (tj. papírová genetika).

CBH1

Ze sekvence aminokyselin CBH1 bylo vyvozeno, že protein je 63 kD velký a že vazba celulózové domény (CBD) je přítomna v C-terminální části proteinu. Zajímavé je, že nebyl nalezen důkaz přítomnosti CBD v izolovaném 55 kD majoritním proteinu. Avšak přítomnost izolovaných peptidů z tohoto 55 kD majoritního proteinu v kódovaném CBH1 proteinu (SEQ ID číslo 1, 2) potvrzuje, že 55 kD protein je kódován klonovaným genem. Možné vysvětlení těchto výsledků je, že 55 kD protein je zkrácenou verzí CBH1 proteinu, který neobsahuje CBD.

Cellobiohydroláza CBH1 vykazuje aktivitu proti MUF-cellobiosidu, MUF lactosidu, FP a avocelu a také proti p-nitrofenyl-|3-glukosidu, celobióze a p-nitrofenyllaktosidu. Tato aktivita proti MUF cellobiosidu je inhibována cellobiózou s inhibiční konstantou 0,4mM. Michaelisova konstanta proti MUF cellobiosidu byla 0,14mM, proti MUF laktosidu 4mM a proti CMC 3,6 g/1. Optimální pH bylo 4,5 až 7. 50% maximální aktivita proti CMC a 80% aktivita proti RBB-CMC byla udržena při pH 8. 70 až 80% aktivita během pH 5 až 8 byla udržena během 25 hodin inkubace. Teplotní optimum bylo 60 až 70 °C. CBH1 je člen cellobiohydrolázové rodiny 7. Odpovídající CBH promotor, který je upřednostněným provedením předkládaného vynálezu, je udán v SEQ ID číslo 1.

Xyll

Ze sekvence aminokyselin Xyll usuzuje, že také zde je CBD přítomna a to v tomto proteinu na N-koncové místě (tj. přímo atakuje alespoň 5 aminokyselin vzdálených od signální sekvence). V literatuře je známo pouze několik xylanáz s CBD (Fusarium oxysporum, Humicola grisea a Neocallimastix patriciarum). Odhadnutá velikost Xyll proteinu je 43 kD a několik peptidů izolovaných z 30 kD xylanázy pochází z tohoto proteinu (SEQ ID 3 a 4). Několik izolovaných peptidů nemohlo být nalezeno v kódované sekvenci. To může znamenat, že jsou případně přítomny xylanázové proteiny v UV 18-25. V předešlých, analýzách nebyl nalezen důkaz přítomnosti CBD v 30 kD proteinu. Také z těchto výsledků předpokládáme, že CBD proteinu je odštěpeno proteolýzou. Tato hypotéza byla dále analyzována (stanovením činnosti, N-koncových sekvencí a velikostí různých proteinů v různých Cl kmenech: Cl přírodní typ, NG7C, UV13-6, UV18-25 a proteázové mutanty UV 18-25). Také efekt přítomnosti nebo absence CBD na enzymatickou aktivitu byl mnohem důkladněji zkoumán. Exprese plné délky genů v různých Cl hostitelích byla předpokládána.

Přítomnost cellulázové vazné domény (CBD) je specifickou vlastností. Pouze jeden glykolytický enzym známé rodiny 7 (xylanázy) obsahuje N-koncovou CBD: Fusarium oxysporium XylF. CBD v Chrysosporium lucknowense Xyll proteinu má proteinovou sekvenci: WGQCG CQGWT GPTTC VSGAV CQFVN DWYSQ CV (aminokyseliny 22 až 53 SEQ ID číslo 4). Tato sekvence nevyhovuje CBD shodné sekvenci popsané v US Patentu 5 763 254 (Novo).

Shodná sekvence US 5 763 254 je: W/Y-G/A-Q-C-D G-Q/I/N-G/N-W/F/Y-S/T/N/Q GP/A/C-T/R/K-T/C/N-C X-X-G/P-S/T/F/L/A-T/K C-V/T/R/E/K-K/Q/A-Q/I-N Q/D/AW/F/Y-Y-Y/S/H/A-Q C-L/I/Q/V/T, kde W/Y znamená buď W nebo Υ, X znamená jakoukoliv aminokyselinu a - znamená nepřítomen, v Xyll byly nalezeny čtyři odlišnosti s nej shodnější

-20CZ 303980 B6 sekvencí, kteréjsou podtrženy v sekvenci 7 nahoře. Popsány jsou příklady xylanáz, které mají Nkoncovou CBD odlišnou od této shodné CBD a jsou jiné než Fusarium oxysporum xylanázy. Konkrétněji obsahuje xylanáza zde popsaná CBD s alespoň 55 %, konkrétně alespoň 65 %, výhodně alespoň 75 % sekvenční shody se sekvencí 7 výše. Výhodně CBD obsahuje jednu z aminokyselin zahrnujících Phe, Tyr a Trp v pozici 23 nebo alespoň jednu ze čtyř aminokyselin Val v pozici 20, Gin v pozici 22, Phe v pozici 23 a Val v pozici 24. Upřednostňované sekvence zahrnují: Cys-Xaa-Phe, Xaa-Phe-Val, Cys-Xaa-Phe-Val, Cys-Gln-Phe, Val-Cys-Xaa-Phe, Gln-Phe-Val, Gln-Trp-Val, Gln-Tyr-Val, Val-Cys-Gln, Val-Cys-Gln-Phe a Val-cys-Xaa— Phe-Val, kde Xaa je jakákoliv aminokyselina výhodně vybrána ze skupiny zahrnující Val, Thr, Arg, Glu, Gin nebo Lys, nej výhodněji Gin nebo Glu.

Xylanáza neobsahuje MUF cellobiázovou aktivitu a je tedy opravdovou xylanázou. Vykazuje vysokou aktivitu v široké oblasti pH 5 až 8 udržuje 65 % maximální aktivity při pH 9 až 10; je členem xylanázové rodiny F. Odpovídající xylanázový promotor, který je upřednostněným provedením předkládaného vynálezu je uveden jako SEQ ID číslo 3. Michaelisova konstanta proti xylanu je 4,2 g/1 pro 30 kD xylanázy. Teplotní optimum je vyšší nebo rovno 70 °C pro xylanázu. Gpdl

DNA sekvence C-koncové části gpdl genu nebyla stanovena. Promotor sekvence genu je jedním z výhodných provedení zde popsaným a je uveden v SEQ ID číslo 5.

Úroveň exprese čtyř genů Chrysosporium byla studována Northern analýzou. Různé kmeny C. lucknowense byly ponechány růst v bohatém prostředí obsahujícím pharmedium s celulósou a laktózou (prostředí 1) nebo bohaté prostředí obsahující pharmedium a glukózu (prostředí 2) při 33 °C. Po 48 h bylo mycelium sklizeno a RNA byla izolována. RNA byla hybridizována 4 rozdílnými vzorky: EG5, EG6, Xyll a CBH. Po expozici byly Northemovy skvrny zavedeny a znovu hybridizovány se vzorky ribosomální L3 pro kontrolu množství mRNA ve vzorku. Mnoho kmenů vykázalo vysokou odpověď na CBH a vysokou odpověď na Xyll vprostřed! 1; v prostředí 2 polovina kmenů vykázala vysokou odpověď pro všechny geny a druhá polovina vykázala nízkou odpověď. Úroveň síly exprese byla dedukována z těchto dat jako CBH>Xyl>EG5>EG6.

Protein Xyll C. lucknowense je 67 % identický (72 % homologní) knejbližšímu homologu v Genebank DATABASE (Tabulka 4). Silná homologie CBH1 proteinu kněmu spojenému homologu Humicola grisea (74 % identický/ 82 % homologní) je pozoruhodná. Je také poznamenáno, že ve všech případech je nejbližší homolog původu Fusarium, Humicola nebo jiného Pyrenomycetous (Sordariamycetous) kmene houby (Tabulka 4), přičemž Chrysosporium náleží k Pleoctomycetous (Eurotiomycetous) houbám podle NCBI databáze (Tabulka 4). Předkládaný vynález také zahrnuje glykanolytické enzymy, obzvláště cellibiohydrolázy a xylanázy obsahující CBD, odvozené od plectomycetous hub.

-21 CZ 303980 B6

	Rodina glykosidáz	Izolát d z Cl	Počet amino- kyselin	Introny	Pozn.	Příbuzné sekvence (% identity/* homologie)
CBH1	7	70 kD 55 kD	526 (63 kD)	1	C3D	Humicola grisea (74/82) (CBH1:P15828) Fusarium oxysporum (58/68) (CBH: P46238) Neurospora Crassa (60/69) CBH1: P38676)
XYL1	10	30 kD	333 (43 kD)	3	CBD	Fusarium oxysporum (67/72) (XylF: P46239) Penicillium simplissicum (63/72) (XylF: P56588) Aspergillus aculeatus (61/70) (XylF: 059859)
GPD1			Nekom- pletní	2?		Podospora anserina (85/89) (CPD: P32637) Naurospora crassa (80/86) (GPD: U67457) Cryphonextria parasitica (80/85) (GPD; P19089)

Tabulka 4: Strukturní a srovnávací data CBH1, Xyll a GPD1 předkládaného vynálezu

Popis obrázků

Obr. 1 je pUT1064 zobrazení.

Obr. 2 je pUT1065 zobrazení.

Odkazy (jejichž obsah je do předkládaného vynálezu zahrnut)

1. Calmels T. P., Martin F., Durand H. a Tiraby G. (1991) Proteolytic events in the processing of secretedproteins in fungi. J. Biotechnol 17(1): strana 51 až 66.

2. Punt P. D., Dingemanse M. A., Jacobs-Meising B. J., Pouwels P. H. a van den Hondel C. A. (1988) Isolation and Characterization of the glyceraldehyd-3-phosphate dehydrogenase gene of Aspergillus nidulants. Gene 69(1): strana 49 až 57.

3. Shoemarker S:, Schweickart V., Ladner M., Gelfand D., Kwok S., Myambo K. a Innis M. (1983) Molecular cloning of exo-cellobiohydrolase I derived from Trichoderma reesei strain L27. Bio/Technology Oct.: 691 až 696.

4. Drocourt D., Calmels T., Raynes J. P., Baron M. a Tiraby G. (1990) Casettes of the Streptoalloteichus hindustanus ble gene for transformation of lower and higher eukaryotes to phleomycin reistance. Nucleic Acids. Res 18(13) strana 4009.

5. Mullaney E. J., Hamer J. E., Roberti K. A. a Timberlake W. E. (1985) Primary structure of the trpC gene from Aspergillus nidulants. Mol Gen Genet 199(1) strana 37 až 45.

6. Yannisch-Perron C., Vieira J.a Messing J. (1987) Improved MI3 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequence of the M13mpl8 a pUC19 vectors. Gene 33:103 až 119.

7. Durant H., Baron M., Calmels T. a Tiraby G. (1988) Classical and molecular genetics applied to Trichoderma reesei for the selection of improved cellulolytic industrial strains, in Biochemistry and genetics of cellulose degradation. J. P. Aubert, Editor. Academie Press strana 13 5 až 151.

-22CZ 303980 B6

8. Lowry O. H., Rosebouth N. J., Farr A. L. a Randall R. J. (1951) Protein Measurments in the folinphenolreagent. J. Biol. Chem. 193:265 až 275.

9. Parriche M., Bousson J. C., Baron M. a iraby G. Developement of heterologous protein secretion systems in filamentous fungi. In 3^rd European Conference on Fungi Genetics. 1996. Munster, Germany.

10. Baron M., Tiraby G., Calmels T., Parriche M a Durand H. (1992) Efficient secretion of human lysozyme fused to the Sh ble phleomycin resistance protein by the fungus Tolypocladium geodes. J. Biotechnol 24(3): strana 253 až 266.

11. Jeenes D. J., Marczinke B., MaccKenzie D. A. a Archer D. B. (1993) A truncated glucoamylase gene fusion for heterologous protein secretion from Aspergillus niger. FEMS Microbiol. Lett. 107(2 až 3): strana 267 až 271.

12. Stone P. J., Makoff A. J., Parish J. H. a Radford A. (1993) Cloning and sequence-analysis of the glukoamylase gene of neurospora-crassa. Current Genetics 24 (3): strana 205 až 211.

13. Mořsky P. (1983) Turbidimetric determination of lysozyme with Micrococcus lysodeicticus cells: Reexamination ofreactin conditions. Analytical Biochem. 128: 77 až 85.

14. Paluh J. L., Orbách M. J., Legerton T. L. a Yanofsky C. (1988) The cross-pathway control gene of Neurospora crassa, cpc-1, encodes a protein similar to GCN4 of yeast and the DNAbinding domain of the oncogene v-jun-encoded protein. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85(11): strana 3728 až 32.

15. Nakari T., Onnela M. L., Ilmen L., Nevalainen K. a Penttila M. (1994) Fungal promoters active in the presence of glukose. WO 94/04673, Alko.

16. Torronen A., Mach R. L., Messner M., Gonzales R., Kalkkinen N., Harkki A. a Kubíček C. P. (1992) The two major xylanases from Trichoderma reesei: characterization of bouth enzymes nad genes. Biotechnoloy (N Y) 10(11): strana 1461 až 5.

17. Farkas V. (1985) Novel media for detection of microbial procedures of cellulase and xylanase. FEMS Microbiol. Letters 28:137 až 140.

18. Miller G. L. (1959) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31:426 až 428.

19. Punt P. J., Mattem I. E. van den Hondel C. A. M. J. J. (1988) A vector for Aspergillus transformation conferringphleomycin resistance. Fungal genetics Newsletter 35, 25 až 30.

-23 CZ 303980 B6

SEQ ID číslo 1:

DNA sekvence a aminokyseliny kompletního genu Chrysosporium CBH1, který zahrnuje pro5 motor a terminátor sekvence. Promotor sekvence (1-1779), terminátor sekvence (3427 až 4451) a intron sekvence (2179 až 2256) jsou uvedeny v malými písmeny.

aaggtatccgatttggggaacgtcgatgaaagtattgcaaaagtgacgagagttgcgcaa 60 ctaactcgctgccgaagaagctgcggaagaaagagaacaccgaaagtggaataacgttac 120 ggatgtcctgacctcaaagttgaaaccagcccttcctgctctatttgggaaagcggcttg 180 cccttgaatgcgctgcactgtggcacgactaccagtgatcgggaggagcaaactaccctg 240 gtccgttccttggtggggcggcactaggcccaacttagggtgatcggaggtcgatgccgc 300 ggtcctcgttggtctgggctcttctcatttcccggtttgcaccccccgttgcacctgctg 360 atcgcccgccaacgccgatgaggttgcgcccagaccgacaatcaccgcggctgcattccc 420 aagtatattgaagatggcaccaggtacccggttttgcgtcccagtcgtttggtgccaaat 480 ttgggagtttttgagcctcaagatctggggaaatcgacctcaacttccatacaagttaaa 540 gtcgcacacacggcgagttccacgaagagacacatttttttctgaaggcctctctccccg 600 cacatcagaaaccaccaaataccaagactgcagaagccggggtaagtgggccaccgggac 660 tacactaaaatgcggggagaagcgagatccgttgcgaagggaagggatggggtgtgctgc 720 ggctttctccgctctcgtgcgccttttgcttgaatctagtgtacaccagggtaggctccg 780 aaggagtatctacggcagcgctgttcgtgctgcgttgagagtcagggcggagacgagcag 840 gcgacaggagcctcgcaccggcacttcggatcgcatttgcgcggagcgtcaaatacgctc 900 ttctgcggtcatcagagagcatcgtgaaccaaggttcttccgcagggcggcctgggcttc 960 gcagagtcgcactcggcggacgccttccgtgtcacccctgataacctggctgccgcgccc 1020 agactcctccaatgaggtgtgtggttgccctcgccgacccttcagcaaccttaatcgctt 1080 ccatcgcacggctccacgtcctcgaacgatgccctcagtccgtgcccggccgtggcaacc 1140 ataacgtgacatcgccgcccagcctactagccgctatcgaccggttaggcttgtcaccgc 1200 agcgcccattctccatcgggcctctactctgatccacctcacccaccgcaagcactagcg 1260 agcctcaccagagtgcaagcgacacgacccgcttggcccttcgtccttgactatctccca 1320 gacctcttgccatcttgccgacgccgcccccttttttttctcctccccctgccggcaggt 1380 cggtggccccagtcccgagatggcattgctccgttgtccatgacgacccatcattcgatg 1440 gctgactggcacactcgtcttgtttgagcatcgacggcccgcggcccgtctcccacggta 1500 cggaacctcgttgtacagtacctctcgtaatgatacccaacaccggggccgagcgctggg 1560 agggcggcgttcccgagaagccgggaaggcggctggccggctgacctttgtgacttggcg 1620 atggatgcggccatggagaatgtccgtccgaagcgacgcgacaattagcctggctaccat 1680

-24CZ 303980 B6 cgatataaattgggtgattcccagctcttgatgggcgtgtcttctgcctggcagccctcg 1740 tcttcagatcaagcaactgtgtgctgatcctcttccgccATGTACGCCAAGTTCGCGACC 1800 Μ Y A K F A T

CTCGCCGCCCTTGTGGCTGGCGCCGCTGCTCAGAACGCCTGCACTCTGACCGCTGAGAAC 1860 LAALVAGAAAQNACTLTAEN

CACCCCTCGCTGACGTGGTCCAAGTGCACGTCTGGCGGCAGCTGCACCAGCGTCCAGGGT 1920 HPSLTWSKCTSGGSCTSVQG

TCCATCACCATCGACGCCAACTGGCGGTGGACTCACCGGACCGATAGCGCCACCAACTGC 1980 SÍTI DANW RWTHRTDSATNC

TACGAGGGCAACAAGTGGGATACTTCGTACTGCAGCGATGGTCCTTCTTGCGCCTCCAAG 2040 YEGNKWDTSYCSDGPSCASK

TGCTGCATCGACGGCGCTGACTACTCGAGCACCTATGGCATCACCACGAGCGGTAACTCC 2100 CCIDGADYSSTYGITTSGNS

CTGAACCTCAAGTTCGTCACCAAGGGCCAGTACTCGACCAACATCGGCTCGCGTACCTAC 2160

LNLKFVTKGQYSTNIGSRTY

CTGATGGAGAGCGACACCAAGTACCAGAgtaagttcctctcgcacccggccgccgggaga 2220 LMESDTKYQM tgatggcgcccagcccgctgacgcgaatgacacaGTGTTCCAGCTCCTCGGCAACGAGTT 2280 FQLLGNEF

CACCTTCGATGTCGACGTCTCCAACCTCGGCTGCGGCCTCAATGGCGCCCTCTACTTCGT 2340 TFDVDVSNLGCGLNGALYFV

GTCCATGGATGCCGATGGTGGCATGTCCAAGTACTCGGGCAACAAGGCAGGTGCCAAGTA 2400 SMDADGGMSKYSGNKAGAKY

CGGTACCGGCTACTGTGATTCTCAGTGCCCCCGCGACCTCAAGTTCATCAACGGCGAGGC 2460 GTGYCDSQCPRDLKFINGEA

CAACGTAGAGAACTGGCAGAGCTCGACCAACGATGCCAACGCCGGCACGGGCAAGTACGG 2520 NVENWQSSTNDANAGTGKYG

CAGCTGCTGCTCCGAGATGGACGTCTGGGAGGCCAACAACATGGCCGCCGCCTTCACTCC 2580 SCCSEMDVWEANNMAAAFTP

CCACCCTTGCACCGTGATCGGCCAGTCGCGCTGCGAGGGCGACTCGTGCGGCGGTACCTA 2640 HPCWVIGQSRCEGDSCGGTY

CAGCACCGACCGCTATGCCGGCATCTGCGACCCCGACGGATGCGACTTCAACTCGTACCG 2700 STDRYAGICDPDGCDFNSYR

CCAGGGCAACAAGACCTTCTACGGCAAGGGCATGACGGTCGACACGACCAAGAAGATCAC 2760 QGNKTFYGKGMTVDTTKKIT

GGTCGTCACCCAGTTCCTCAAGAACTCGGCCGGCGAGCTCTCCGAGATCAAGCGGTTCTA 2820 VVTQFLKNSAGELSEIKRFY

CGTCCAGAACGGCAAGGTCATCCCCAACTCCGAGTCCACCATCCCGGGCGTCGAGGGCAA 2880 VQNGKVIPNSESTIPGVEGN

CTCCATCACCCAGGACTGGTGCGACCGCCAGAAGGCCGCCTTCGGCGACGTGACCGACTT 2940 SITQDWCDRQKAAFGDVTD?

-25CZ 303980 B6

NCAGGACAAGGGCGGCATGGTCCAGATGGGCAAGGCCCTCGCGGGGCCCATGGTCCTCGT 3000 QDKGGMVQMGKALAG PMVLV

CATGTCCATCTGGGACGACCACGCCGTCAACATGCTCTGGCTCGACTCCACCTGGCCCAT 3060 MSIWDDHAVNMLWLDSTWPI

CGACGGCGCCGGCAAGCCGGGCGCCGAGCGCGGTGCCTGCCCCACCACCTCGGGCGTCCC 3120 DGAGKPGAERGACPTTSGVP

CGCTGAGGTCGAGGCCGAGGCCCCCAACTCCAACGTCATCTTCTCCAACATCCGCTTCGG 3180 AEVEAEAPNSNVI FSNIRFG

CCCCATCGGCTCCACCGTCTCCGGCCTGCCCGACGGCGGCAGCGGCAACCCCAACCCGCC 324 0 PIGSTVSG. LPDGGSGNPNPP

CGTCAGCTCGTCCACCCCGGTCCCCTCCTCGTCCACCACATCCTCCGGTTCCTCCGGCCC 3300 VSSSTPVPSSSTTSSGSSGP

GACTGGCGGCACGGGTGTCGCTAAGCACTATGAGCAATGCGGAGGAATCGGGTTCACTGG 3360 TGGTGVAKHYEQCGG I GFTG

CCCTACCCAGTGCGAGAGCCCCTACACTTGCACCAAGCTGAATGACTGGTACTCGCAGTG 3420 PTQCESPYTCTKLNDWYSQC

CCTGTAAacgaacctctctgaaggaggttctgagacacgcgcgattcttctgtatatagt 3480 L * tttatttttcactctggagtgcttcgctccaccagtacataaaccttttttttcacgtaa 3540 caaaatggcttcttttcagaccatgtgaaccatcttgatgccttgacctcttcagttctc 3600 actttaacgtagttcgcgttagtctgtatgtcccagttgcatgtagttgagataaatacc 3660 cctggaagtgggtctgggcctttgtgggacggagccctctttctgtggtctggagagccc 3720 gctctctaccgcctaccttcttaccacagtacactactcacacattgctgaactgaccca 3780 tcataccgtactttatcctgttaattcgtggtgctgtcgactattctatttgctcaaatg 3840' gagagcacattcatcggcgcagggatacacggtttatggaccccaagagtgtaaggacta 3900 ttartagtaatattatatgcctctaggcgccttaacttcaacaggcgagcactactaatc 3960 aacttttggtagacccaattacaaacgaccatacgtgccggaaattttgggattccgtcc 4020 gctctccccaaccaagctagaagaggcaacgaacagccaatcccggtgctaattaaatta 4080 tatggttcattttttttaaaaaaattttttcttcccattttcctctcgcttttctttttc 4140 gcatcgtagttgatcaaagtccaagtcaagcgagctatttgtgctatagctcggtggcta 4200 taatcagtacagcttagagaggctgtaaaggtatgataccacagcagtattcgcgctata 4260 agcggcactcctagactaattgttacggtctacagaagtaggtaataaaagcgttaattg 4320 ttctaaatactagaggcacttagagaagctatctaaatatatattgaccctagcttatta 4380 tccctattagtaagttagttagctctaacctatagatagccaaatgctataataggtacc 4440 agggttcaaaa 4451

-26CZ 303980 B6

SEQ ID číslo 2:

Aminokyseliny kompletního genu Chrysosporium CBH1 proteinu. Domnělý signální peptid (1 až 5 19) je uveden italikou a cellulózová vazná doména (496 až 526) je uvedena tučnými podtrženými písmeny.

MYAKFATLAA	LVAGAAAQNA	CTLTAENHPS	LTWSKCTSGG	SCTSVQGSIT	50
IDANWRWTHR	TDSATNCYEG	NKWDTSYCSD	GPSCASKCCI	DGADYSSTYG	100
ITTSGNSLNL	KFVTKGQYST	NIGSRTYLME	SDTKYQMFQL	LGNEFTFDVD	150
VSNLGCGLNG	ALYFVSMDAD	GGMSKYSGNK	AGAKYGTGYC	DSQCPRDLKF	200
INGEANVENW	QSSTNDANAG	TGKYGSCCSE	MDVWEANNMA	AAFTPHPC7V	250
IGQSRCEGDS	CGGTYSTDRY	AGICDPDGCD	FNSYRQGNKT	FYGKGMTVDT	300
TKKITWTQF	LKNSAGELSE	IKRFYVQNGK	VIPNSESTIP	GVEGNSITQD	350
WCDRQKAAFG	DVTD7QDKGG	MVQMGKALAG	PMVLVMSIWD	DHAVNMLWLD	400
STWPIDGAGK	PGAERGACPT	TSGVPAEVEA	EAPNSNVIFS	NIRFGPIGST	450
VSGLPDGGSG	NPNPPVSSST	PVPSSSTTSS	GSSGPTGGTG	VAKHYEQCGG	500
XGFTGPTQCE	SPYTCTKLND	WYSQCL *	526

ío SEQ ID číslo 3:

DNA sekvence a aminokyseliny kompletního genu Chrysosporium Xyll, který zahrnuje promotor a terminátor sekvence. Promotor sekvence (1—969), terminátor sekvence (2428 až 3030 (3028)) a intron sekvence (1043 až 1116, 1181 až 1332 (1331), 1596 (1595) až 1674 (1672)) jsou uvedeny v malými písmeny.

tcatcaacttggcgtttggatgtactaatattacacgtcgtttgcnnagcggagtctgtg 60 tcatctccgtggggtcgggtgctccagacgacgcttcgggccgatcctgaattcgggaag 120 gaaacggttcggctaatcaggtcctctaaaatataacgaagcactacagagggagttcct 180 cagaggacatcgtatcaaccgaagaacgaagcgccgaaaggactgatcaaaacaggagta 240 ggtagggatgtgtgagtacetaaactttccatacctgacataaaatcatcatggtgcttc 300 agacctgtttgatgaggcgagggcggaggccgcattgtattttcgttccttccttctttt 360 tgttagtatatctnagggttccatcgtaaaatggaatcttccagctctactagtaattag 420 aacaatagttctgatgtcgtgcgccaagctttttcagatgactgccaaaaacccatcatg 480 ggtatggacaaaagcagtaatcggagtcacaacgccgcattttccttcatgatttccgtc 540 aaccggagaggtcggaggaggactccggccacatgtgatgcgaagaagtacatggcgcca 600 tggttctaacctcttatagtctgaaaatgcgcggaggccagcgaagccaagcccgggaac 660 cgttcttgtcatggtttcagtattgtttcgctaaacattctatccgactcgcgataggtg 720 cggctgccaccgaaggttgtatccttaaag.ctttggtaagtacggagtacggaaatggaa 780

-27CZ 303980 B6 acgcgccgcagtcctggttccatcggtatcctccgcatgctccgccaaaaaaagaaaacc 840 cgggtatgtttacaaaggatataagagacaagatgcaccacccgcccccttcccatctgc 900 cggttgcccacgtcgccgtcgactgcttgtccgcttcctacctgcagcctctttcagaga 960 ccatcaaacATGCGTACTCTTACGTTCGTGCTGGCAGCCGCCCCGGTGGCTGTGCTTGCC 1020 MRTLTFVLAAAPVAVLA

CAATCTCCTCTGTGGGGCCAGTgtatgtaattgccttactcggaaaatagtcaccactag 1080 QSPLWGQC agggacttaagctcactacttcctgtttcacaatagGCGGCGGTCAAGGCTGGACAGGTC 1140 G G Q G W T G

CCACGACCTGCGTTTCtGGCGCAGTATGCCAATTCGTCAAgtcagtaactgcttttatt 1200 PTTCVSGAVCQFVN tcttttctctctgggattacgatttcgttttgcacttagcttggttctgcatttcattgt 1260 tgtattgttctctttttgtgtgtgagaggttttattaccacctaaaggccatttgctaac 1320 aaatctccccagTGACTGGTACTCCCAATGCGTGCCCGGATCGAGCAACCCTCCTACGGG 1380 DWYSQCVPGSSNPPTG

CACCACCAGCAGCACCACTGGAAGCACCCCGGCTCCTACTGGCGGCGGCGGCAGCGGAAC 1440 TTSSTTGSTPAPTGGGGSGT

CGGCCTCCACGACAAATTCAAGGCCAAGGGCAAGCTCTACTTCGGAACCGAGATCGATCA 1500 GLHDKFKAKGKLYFGTEI DH

CTACCATCTCAACAACAATGCCTTGACCAACATTGTCAAGAAAGACTTTGGTCAAGTCAC 15 60 YHLNNNALTNIVKKDFGQVT

TCACGAGAACAGCTTGAAGTGGGATGCTACTGAGCgtgagtgacctctcctccttctccc 1620 HENSLKWDATEP gacaataatagataattacgagccggttcgaggctgacattgcgcgattctagCGAGCC 1680

S R

GCAATCAATTCAACTTTGCCAACGCCGACGCGGTTGTCAACTTTGCCCAGGCCAACGGCA 1740 NQFNFANADAVVNFAQANGK

AGCTCATCCGCGGCCACACCCTCCTCTGGCACTCTCAGCTGCCGCAGTGGGTGCAGAACA 1800 LIRGHTLLWHSQLPQWVQNI

TCAACGACCGCAACACCTTGACCCAGGTCATCGAGAACCACGTCACCACCCTTGTCACTC 1860 NDRNTLTQVIENHVTTLVTR

GCTACAAGGGCAAGATCCTCCACTGGGACGTCGTTAACGAGATCTTTGCCGAGGACGGCT 1920 YKGKILHWDVVNEIFAEDGS

CGCTCCGCGACAGCGTCTTCAGCCGCGTCCTCGGCGAGGACTTTGTCGGCATCGCCTTCC 1980 LRDSVFSRVLGEDFVGIAFR

GCGCCGCCCGCGCCGCCGATCCCAACGCCAAGCTCTACATCAACGACTACAACCTCGACA 2040 AARAADPNAKLYI NDYNLDI

TTGCCAACTACGCCAAGGTGACCCGGGGCATGGTCGAGAAGGTCAACAAGTGGATCGCCC 2100 ANYAKVTRGMVEKVNKWIAQ

-28CZ 303980 B6

AGGGCATCCCGATCGACGGCATCGGCACCCAGTGCCACCTGGCCGGGCCCGGCGGGTGGA 2160 GIPIDGIGTQCHLAGPGGWN

ACACGGCCGCCGGCGTCCCCGACGCCCTCAAGGCCCTCGCCGCGGCCAACGTCAAGGAGA 2220 TAAGVPDALKALAAANVKE I

TCGCCATCACCGAGCTCGACATCGCCGGCGCCTCCGCCAACGACTACCTCACCGTCATGA 2280 AITELDIAGASANDYLTVMN

ACGCCTGCCTCCAGGTCTCCAAGTGCGTCGGCATCACCGTCTGGGGCGTCTCTGACAAGG 2340 ACLQVSKCVGITVWGVSDKD

ACAGCTGGAGGTCGAGCAGCAACCCGCTCCTCTTCGACAGCAACTACCAGCCAAAGGCGG 2400 SWRSSSNPLLFDSNYQPKAA

CATACAATGCTCTGATTAATGCCTTGTAAgaggaggtatattatttttagaggcaatgaa 24 60 YNALINAL* gctaggaggaaagaggggaagtgaggtaattagctaggacaggcaaatctagcagcaatt 2520 ataagtcaacactatataaaatattcctataatggcttgtgcttcggtgtgcaaaaaaaa 2580 aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaactcaaaaacaaaaatgatccaacatgatt 2640 cgaaatggcgaccttgcaaatgcacacctcagataataccactatacaatacaccttaaa 2700 tggcacctaaatccatttgtctgcggtcatagacggggcttaagaagcctgggatgcagg 2760 tgtcgatgcaagggttacgtcagtgtatgatatgagtatgaaccatgctgtctgggtaat 2820 tctccactttccctccccttacgactcttcgggtgtgcctctctagaaagtcgactcctg 2880 gcgcctcagatcgccctttggctctgttcggtacaatgacgtccgctggtttcttccaaa 2940 gaccaggtatttctcccgtggcaacaaagaataccaaatacctatatcgaaccgtagtct 3000 tctgataattagatgtctctcaaggcgcgg 3030

SEQ ID číslo 4:

Aminokyselinová sekvence kompletního genu Chrysosporium Xyll proteinu. Signální peptid (1 až 20) je uveden italikou a cellulózová vazná doména (22 až 53) je uvedena tučnými podtrženými písmeny.

1	MRTLTFVLAA	APVAVLAOSP LWGQCGGQGW	TGPTTCVSGA	VCQFVNDWYS
51	qcvpgssnpp	TGTTSSTTGS	TPAPTGGGGS	GTGLHDKFKA	KGKLYFGTEI
101	DHYHLNNNAL	TNIVKKDFGQ	VTENSLKWDA	TEPSRNQFNF	ANADAVVNFA
151	QANGKLIRGH	TLLWHSQLPQ	WVQNINDRNT	LTQVIENHVT	TLVTRYKGKI
201	LHWDVVNEIF	AEDGSLRDSV	FSRVLGEDFV	GIAFRAARAA	DPNAKLYIND
251	YNLDIANYAK	VTRGMVEKVN	KWIAQGIPID	GIGTQCHLAG	PGGWNTAAGV
301	PDALKALAAA	NVKEIAITEL	DIAGASANDY	LTVMNACLQV	SKCVGITVWG
351	VSDKDSWRSS	SNPLLFDSNY	QPKAAYNALI	NAL*

-29CZ 303980 B6

SEQ ID číslo 5:

DNA sekvence částečného genu Chrysosporium GPD1, který zahrnuje promotor sekvenci. Promotor sekvence (1-1555) a intron sekvence (1682 až 1781) jsou udány v malými písmeny. 3' konec genu chybí.

tgagcagcaatgagcagcaatgagcattcctgggccaccgagtctgagtgccagtacgga 60 gtatcgtacttcgtaccggggtttgatttggtgacggtgcttttcacctctcgatgcccg 120 aaatcgggtctaagctgagtttgatcaaatatgtgactccaacatcgcccccttcggcaa 180 accccgtcgacacgtgtgtcatccttccattgcaagcgatcactcgcagggcgtgacgat 240 gaacgagatttttgcccggaccgattcgcggatatagcggcagccgaccagccctaccac 300 actgatggccgtgtcactagtgtatgctcccagaaccgcaagcatacactgggcaatgct 360 tggtatgcagttgaggcagctttatgtttccatacccttccacttcggctcggggactcg 420 gcggggtcgcggaagtttgacggcagccgtcgggccttaggccgagattaccgtggttgt 480 ggcccagttttagccgttcccgtccgtttcctaccggaccatgattttcgtgaaccattg 540 caatcccgaagcgcatttccgacgttaaggagttacctccgctgcccagaattcatgatc 600 gtggccggctcaaggcagcgtggcggggcatccgtgtcaagctcccaggaggaggtgcgc 660 gatttcaaatccgggccaaaacaggccaagactggctggccaaaaaaaggagcgtagacg 720 gcccgggacatcggacgtcagctcgcagccacccaaaaccggtccgatctactcgcttac 780 tgtggtagttcaggtacttttgagtagtaaaaacgctacggcagggccggggggttcccc 840 ggtgacggaggtgcctctgcggtggcgaacatcccacgcactctcgagctacggtgacac 900 ctcgtgtcctgttggtcttgcaatgctggggcggcaggaaatgcgtcgcgctcctcccgg 960 ccaagacctaaaacagacagcgccgcaaagtcgctcactagcaccgcgaaacgaagatgc 1020 cccacctcaacgcaatctgtgatgcaagcaattgggaaggctcaccceacctcagcgagg 1080 ggctcaaccatttttattatcagctcatgccaccacaacatgactgttttctttccttgc 1140 tcatcccacatttgacaaaaatcgtcgattaatctctttccatacaggccgtccgcgctc 1200 tgataaccacataaaagtctcttcagtcaacagctcaaagctccctcatccctccaggta 1260 agcagccaaagagctcccccacggaccccgcactgcctcatcccgcctgtatcggacctg 1320 cgcgacccagcagagaatcccaaacctttgctgcttgctgcccggttccggactgagctg 1380 caacccaagcctttaaaaagcttttcccttctcccacggtgtcaactctgtcctatccct 1440 ccgacatccgttgagctcaacaactccccgaaccttttaccccgcgccgagctacccctc 1500 catcaaaccaccctgacagctcgctcactcacctccccacatcacagaaatcaaaATGAC 1560 Μ T TATCAAGGTCGGCATCAACGGTTTCGGCCGTATCGGCCGTATCGTCTTCCGCAACTCCAT 1620

IKVGINGFGRIGRIVFRNSICGAGCACTCGGATGTCGAGATCGTTGCCGTCAACGACCCCTTCATTGAGCCCAAGTACGC 1680

-30CZ 303980 B6

EHS-DVE I VAVNDPFI Ε P KYATgtaagtagttttttttttccttcctcgcgttctttcctgttccatcgacagtacgagat 1740

GatcttgcaggcggatcggagctaaccgcgattgtcgtacagGAGTACATGCTCAAGTAT 1800 Ε Y M L K Y

GACTCGACCCACGGTATCTTCAACGGCACCATCGCCGTCGAGGGCAACGACCTCATTGTC 1860 DSTHGIFNGTIAVEGNDLIV

AACGGCAAGAGGGTCAAGTTCTACACTGAGCGGGMCCCCGCCAACATTCCCTGGARGGAA 1920 NG KRVKFYTER?PANIPW?E

ACTGGTGCCGAGTACATMRTCGAGTCGACCGGTGTGTTCACCAMCACCSAGAAGGCTAGC 1980 TGAEYI?E STGVFT?T?KAS

GCCCACCTCAAGGGCGGCGCCAAGCGCGTCATCATCTCTGCTCCCTCGGCCGATGCCCCC 2040 AHLKGGAKRVIISAPSADAP

ATGTACGTCATGGGCGTCAACGAGAAGACCTACGACGGCAAGGCCCAGGTCATCTCTAAC 2100 MYVMGVNEKTYDGKAQVISN

GCCTCGTGCACCACCAACTGCCTGGCTCCCCTCGCCAAGGTCATCCACGACAAGTTCGGC 2160 ASCTTNCLAPLAKVIHDKFG

CTCGTTGAGGGTCTCATGACCACCGTCCACTCCTACACTGCCACCCAGAAGACCGTCGAT 2220 LVEGLMTTVHSYTATQKTVD

GGTCCCTCTGCCAAGGACTGGCGTGGTGGCCGTGGTGCTGCTCAGAACATCATCCCCAGC 2280 GPSAKDWRGGRGAAQNIIPS

AGCACTGGCGCCGCCAAGGCCGTCGGCAAGGTCATCCCTGAGCTCAACGGCAAGCTCACC 2340 STGAAKAVGKVIPELNGKLT

GGCATGTCCCTCCGTGTCCCCACCCCCAACGTTTCCGTTGTCGACCTCACCTGCCGCCTC 2400 GMSLRVPTPNVSV VDLTCRL

GAGAAGGAGGCTACCTACGACGACATCAAGGCCGCCATCAAGGAGGCCGCCGCCGGCCCC 24 60 EKEATYD DIKAAIKEAAAGP

CTCAAGGgtgagttatctggttcctttttttttttttggagaacgacacatgctgataaa 2520 L K G acccagGCATCCTCGACTACACTGAGG 2547 I L D Y T E

SEQ ID číslo 6:

Aminokyseliny částečného Chrysosporium GPD1 proteinu (C-konec chybí v dostupné sekvenci).

MTIKVGINGF GRIGRIVFRN SIEHSDVEIV AVNDPFIEPK YAEYMLKYDS THGIFNGTIA VEGNDLIVNG KRVKFYTER? PANIPW7ETG AEYI7ESTGV FT?T?KASAH LKGGAKRVII SAPSADAPMY VMGVNEKTYD GKAQVISNAS CTTNCLAPLA KVIHDKFGLV EGLMTTVHSY TATQKTVDGP SAKDWRGGRG AAQNIIPSST GAAKAVGKVI PELNGKLTGM SLRVPTPNVS VVDLTCRLEK EATYDDIKAA IKEAAAGPLK GILDYTE

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Expresi regulující sekvence nukleové kyseliny mající v celé délce alespoň 70% identitu s úsekem nukleotidů 1 až 1779 ze sekvence SEQ ID číslo 1.
2. 2. Konstrukt nukleové kyseliny obsahující expresi regulující sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 1 provozně spojenou se sekvencí nukleové kyseliny kódující polypeptid.
3. 3. Rekombinantní mikrobiální kmen obsahující konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 2, kde mikrobiální kmen je schopný exprese polypeptidu kódovaného sekvencí kódující nukleové kyseliny.
4. 4. Způsob produkce polypeptidu vyznačující se tím, že se použije konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 2 nebo mikrobiální kmen podle nároku 3, kdy způsob obsahuje kultivaci hostitelského kmenu za podmínek umožňujících expresi polypeptidu a následnou regeneraci polypeptidu.
5. 5. Použití sekvence nukleové kyseliny podle nároku 1 nebo konstruktu podle nároku 2 pro expresi polypeptidu v hostitelském organismu, kdy hostitelský organismus je houbový nebo jiný mikrobiální hostitelský organismus.
6. 6. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 2, kde polypeptid je vybrán ze skupiny obsahující enzym degradující glycid, proteázu, hydrolázu, oxidoreduktázu a transferázu.
7. 7. Konstrukt nukleové kyseliny podle nároku 6, kde enzym degradující glycid je celuláza, xylanáza, mannáza, mannosidáza, pectináza nebo amyláza.
8. 8. Rekombinantní mikrobiální kmen podle nároku 3, kde kmen je rodu Chrysosporium.