CZ300145B6 - Zpusob regulace tvorby biomasy v rostlinách - Google Patents

Zpusob regulace tvorby biomasy v rostlinách Download PDF

Info

Publication number
CZ300145B6
CZ300145B6 CZ20070454A CZ2007454A CZ300145B6 CZ 300145 B6 CZ300145 B6 CZ 300145B6 CZ 20070454 A CZ20070454 A CZ 20070454A CZ 2007454 A CZ2007454 A CZ 2007454A CZ 300145 B6 CZ300145 B6 CZ 300145B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
gene
sequence
ser
ortholog
leu
Prior art date
Application number
CZ20070454A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2007454A3 (cs
Inventor
Hejátko@Jan
Hwang@Ildoo
Dobešová@Romana
Ryu@Hojin
Dubová@Jaroslava
Original Assignee
Masarykova Univerzita
Postech Academy Industry Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Masarykova Univerzita, Postech Academy Industry Foundation filed Critical Masarykova Univerzita
Priority to CZ20070454A priority Critical patent/CZ300145B6/cs
Priority to KR1020080038610A priority patent/KR20090004459A/ko
Priority to PCT/CZ2008/000075 priority patent/WO2009003429A2/en
Publication of CZ2007454A3 publication Critical patent/CZ2007454A3/cs
Publication of CZ300145B6 publication Critical patent/CZ300145B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/13—Protein-histidine kinases (2.7.13)
    • C12Y207/13003—Histidine kinase (2.7.13.3)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Rešení se týká zpusobu regulace tvorby biomasy v rostline, jehož podstata spocívá v tom, že se v rostline identifikuje gen CKI1 nebo jeho homolog nebo ortolog a sníží nebo zcela eliminuje se exprese genu CKI1 nebo jeho homologu nebo ortologu nebo aktivita genového produktu. Identifiace homologu nebo ortologu genu CKI1 v rostlinném druhu zahrnuje následující kroky: i) zjištení sekvencní homologie na úrovni nukleotidu nebo aminokyselin, ii) prokázání histidinkinázové aktivity genového produktu zkoumaného genu, iii) zjištení exprese ve vaskulárních pletivech daného rostlinného druhu. Modifikaci exprese genu lze provést pomocí RNA interference, modifikaci aktivity genového produktu inzercní mutagenezí nebo místne rízenou mutagenezí.

Description

Způsob regulace tvorby biomasy v rostlinách
Oblast techniky s
Vynález se týká způsobu regulace tvorby biomasy v rostlinách pomocí úpravy aktivity genu nebo produktu genu.
i o Dosavadní stav techniky
V současné ekonomice EU i jiných zemí existuje značná závislost na ropných produktech. Tato závislost jc negativní svým časovým omezením a nutností hledat další, alternativní zdroje energie a materiálové zdroje pro chemický průmysl. Další nevýhoda spočívá v negativní bilanci CCT, která zásadním způsobem přispívá ke zhoršování životního prostředí díky tzv. skleníkovému efektu. Zásadním zájmem nejen pro ekonomiku CR a dalších států EU je tedy využití biotechnologií s vyrovnanou bilancí CO2 jako zdroje biomasy v konceptu ekonomik s trvale udržitelným rozvojem.
2() Evropská unie si stanovila cíle ve zvyšování užití obnovitelných zdrojů energie (OZE) ve dvou základních dokumentech: „White páper stanovil základní cíl ve zvýšení podílu OZE na spotřebě primárních energetických zdrojů za Evropskou unii jako celek z cca 6 % v roce 1995 na 12 % v roce 2010 a Direktiva 2001/77/EC určuje cíl EU ve zvýšení OZE pro výrobu elektrické energie, a to ze 13,9 % v roce 1997 na 22,1 % v roce 2010, Ke splnění výše uvedených cílů má zásadně přispět biomasa, a to jak odpadní, tak cíleně pěstovaná. Bilancováním celkového potenciálu energetické biomasy v ČR bylo navíc zjištěno, že téměř celá jedna polovina polřebná pro zajištěni stanovených cílů (8 % elektřiny a 6% tepelné energie z celkové potřeby ČR do r. 2010) se musí získat přímým pěstováním energetických plodin - tzv. zbytková biomasa (dřevní a lesní odpady, sláma apod.) nestačí pokrýt tento naléhavý požadavek.
?()
Nejběžnějším způsobem pro zajišťování větší tvorby biomasy je pěstování plodin doporučených pro energetické využití (např, kotnonice bílá, krmný sléz, různé druhy vysokých trav), přičemž nejvíce propracovanou energetickou plodinou je krmný šťovík. Pěstování však vyžaduje patřičnou péči, aby např. nedocházelo k zaplevelování a napadání škůdci, a nejde o způsob zvětšování biomasy rostliny jako takové (Petříková V.: Energetické plodiny nová šance pro zemědělce. Biom. cz [oniine]. 2004 04 21).
Pro samotné zvětšování tvorby biomasy u rostlin se používají různá hnojivá, která mají nahradit odčerpané živiny z půdy, Minerální hnojení se ale ve výsledku na ekonomické efektivnosti
4« zemědělské výroby projeví negativně, současně může ohrozit životní prostředí a vysoká koncentrace minerálních živin v půdním roztoku neodpovídá ani ekologickým požadavkům rostlin. Výnosy hnojených plodin neodpovídají ani vynaloženým prostředkům a postupně klesá i kvalita skiizne. A přestože bylo zjištěno, že důvodem poklesu účinnosti minerálních hnojiv nejsou prvky samotné, ale narušení poměru mezi minerálními živinami a organickými látkami, snaha o eo nej45 optimálnější zvýšení účinnosti minerálních hnojiv neřeší rizika související s používáním hnojiv (Vrba V., Huleš L.: Humus - půda rostlina (15) Minerální hnojivá. Biom.cz [oniine], 2007-0406).
Nejrychlejší cestou přípravy nových výkonných a energetických rostlin je bezpochyby genetická so modifikace rostlin (Váňa I: Nové cíle v energetickém využití biomasy a příprava high-teehnologií kjejich zabezpečování. Biom.cz [oniine]. 2001 11-29). Metod pro cílený zásah do dědičné informace rostlin existuje celá řada. K nej používanějším patří metody založené na přirozené schopnosti bakterie Agrobacterium tumcfaciens vnášet část vlastní dědičné informace (tzv. TDNA) do genomu rostlin, přičemž je lze upravit tak, že si plně uchovají schopnost přenosu genů do rostlinného genomu, ale přenášejí i další vložené geny. 7 dalších metod lze zmínit přímé
CZ 3UU145 B6 „nastrčíování“ genu do rostlinných buněk pomocí zařízení označovaného jako „gene gun, tj.
nastřelení mikroskopické částečky zlata nebo wolframu potažené genem, jenž má být vnesen do genomu rostliny. V současné době převažují mezi geny používanými pro genetické modifikace rostlin geny zajištující rezistenci rostlin k herbicidům, rezistenci ke hmyzím škůdcům a rezistenci k virovým chorobám (Miloš Ondřej, Jaroslav Drobník; Transgenoze rostlin, Academia. Praha, 2002) první geneticky modifikovaná rostlina vstoupila do České republiky oficiálně 14, května roku 2001, kdy byla povolena ke zpracování (nikoli pro pěstování) geneticky modifikovaná sója odolná vůči herbicidu Roundup (sója linie GTS 40-3-2 a veškeré potomstvo odvozené od této linie tradičními šlechtitelskými postupy). Genetických postupů vedoucích čistě ke zvětšování io objemu biomasy je málo, některé byly prováděny pouze u podzemních částí rostlin.
Vodivá pletiva jsou místem produkce buněk xylému, neboli dřeva, kde dochází k lignifikaci buněčných stěn a ukládání celulózy. Tyto procesy jsou kritické pro tvorbu využitelné biomasy a mohou mít tedy ekonomický dopad.
Gen CYTOK1N1N INDEPENDENT 1 (CKH) byl identifikován v roce 1996 pomocí aktivační mutageneze jako dominantní regulátor cytokininové odpovědi u Arabidopsis thaliana (Kakimoto T., Science 274, 982-985 (1996)). Zvýšená exprese genu CKH (CK11 pod kontrolou silného konstitutivního promotoru, tetrameru zesilovačů pro motoru viru tabákové mozaiky pro 35S
RNA [CaMV 35S RNA pro motoru]) vedla na růstovém médiu bez cytokininů k fenotypovým projevům, které jsou závislé na přítomnosti cytokininů v kultivačním mediu (zelenání a tvorba prýtů). Na základě podobnosti aminokyselinové sekvence CKI1 s receptorovými histidinkinázami bakterií byla předpovězena funkce CKI1 jako reeeptoru cytokininů. Nicméně další experimenty neprokázaly vazbu cytokininů na CKI1. Později byly identifikovány homology CKH, geny
AHK2, AHK3 a AHK4ICRE1IWOL, u kterých byla zjištěna jejich funkce ve vnímání cytokininů u rostlin jako pravých receptorů (Inoue et al., Nátuře 409, 1060-1063 (2001); Yamada ct al., Plant Cell Physiol 42, 1017-1023 (2001)). V případě CKI1 byla zjištěna jeho konstitutivní aktivita, nezávislá na přítomnosti nebo absenci cytokininů, a proto byl vysloven předpoklad, že se nejedná o pravý eytokininový receptor (Yamada etal., Plant Cell Physiol 42, 1017-1023 (2001)). Byla prokázána role genu CKH ve vývoji samičího gametoťytu (Hejátko et al.. Mol Genet Genomics 269, 443-453 (2003); Pisehke etal., Proč Nati Acad Sci USA 99, 15 800-15 805 (2002)) a také bylo zjištěno, že CK11 jc exprimován nejen během celého vývoje samičího gametofytu, ale je aktivní také později ve sporo fytu.
Exprese hornologů CKH, genů AHK2, AHK3 a ΑΠΚ4, byla identifikována ve vaskulámích pletivech A. thalia na a byla prokázána jejich funkce v odpovědi na ex o gen ní cytokin iny, růstu kořene, prodlužování hypokotylu, počtu buněk v listu a velikosti listové čepele u A. thaliana (Higuchi etal., Proč Nati Acad Sci USA HH, 8 821-8 826 (2004); Nishímura etal., Plant Cell 16, 13651377 (2004)). Vliv AHK2, AHK3 a AHK4 na tvorbu vaskulámích pletiv v nadzemní části není
-tu znám, byly publikovány pouze výsledky fenotypu ve vaskulámích pletivech kořene (Mahonen et al., Genes Dev 14, 2938-2943 (2000); Seheres et al., Development 121, 53-62 (1995)).
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je způsob regulace tvorby biomasy v rostlině, vyznačený tím, žc se v rostlině identifikuje gen CKH (sekvence 1) nebo jeho homolog nebo ortolog a sníží nebo zcela eliminuje se exprese genu CKH nebo jeho bomologu nebo ortologu nebo aktivita genového produktu (kódovaného proteinu). Homologem je míněn gen podobný svou sekvencí genu CKH 50 podobnost na úrovni sekvence nukleotidů nebo gen. jehož produkt je podobný proteinu CKI1 podobnost na úrovni sekvence aminokyselin -, který se v minulosti vyvinul ze stejné sekvence.
Ortologem je míněn gen, který plní stejnou nebo podobnou funkci v jiném druhu, tj. v tomto případě gen svou funkcí v jiném rostlinném druhu odpovídající funkci genu ('Kil v A. thaliana.
CZ 300145 R6
Identifikace homologu nebo ortologú se provádí na základě následujících kriterií:
/) sekvenční homologie na úrovni nukleotidů nebo aminokyselin, obsahující zejména konzervované oblasti receptorových histidinkináz. Pokud se jedná o druh, jehož genom je již znám. lze identifikovat homologní geny pomocí srovnávání těchto sekvencí s genomovou databází tohoto druhu a identifikací homologní sekvence pomocí vhodných počítačových programů, např, RI.AST. Pokud se jedná o druh, jehož genom ještě není znám, pak lze postupovat např. tak, že sc provede identifikace konzervovaných oblastí srovnáváním sekvencí dosud identifikovaných homologůCKll (nejlépe pomocí srovnávání identifikovaných nebo předpokládaných aminoio kyselinových sekvencí), navrhnou se degenerované primery, pokrývající tyto konzervované nebo částečně konzervované oblasti a provede se identifikace sekvence hledaného genu amplifikací konzervované oblasti s využitím genomové DNA nebo cDNA knihovny příslušného druhu jako tcmplátu a následnou izolací jeho cDNA nebo genomové DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) nebo podobnými metodami. Konzervované oblasti receptorových histidinkináz je is možno také vyhledat vc veřejně přístupných databázích (např. databáze PRINTS, http://www.bio i nf.manchester.ae.uk/dbbrowser/PRlNTS/). Alternativně je možné identifikovat cDNA homologních genů např. pomocí hybridizace scDNA knihovnou nebo genomovou knihovnou daného druhu s využitím sondy získané z genomové DNA nebo cDNA CKll nebo některého z jeho již identifikovaných homologu, např. genů AHK2, ΑΠΚ3 nebo AHK4/CRE1/WOL nebo podobnými metodami.
ii) prokázání a analýza histidinkinázové aktivity genového produktu příslušného homologu, např. pomocí exprese genu v heterologním nebo homologním expresním systému, nejlépe jako rekombinantního proteinu a následné analýzy jeho aktivity (Mahonen et al., Curr Biol 16, 1116-1122 (2006)) nebo pomocí komplementace bakteriálních, kvasinkových nebo rostlinných mutantů v genech pro receptorové histidinkinázy (např M2, ahk3, ahk4 nebo ckil) pomocí kódující sekvence homologu, vložené pod kontrolu pro motoru příslušného genu a v příslušném mutantní rn pozadí pomocí všeobecně známých metod nebo prostřednictvím analýzy aktivity genového produktu v přenosu cytokininovčho signálu pomocí analýzy v rostlinných protop lastech jak bylo popsáno (Hwang a Sheen, Nátuře 413, 383-389 (2001)) a iii) exprese homologu nebo ortologú ve vaskulámích pletivech nebo pletivech sousedících s vaskulámí mi pletivy daného rostlinného druhu.
Význakern vynálezu je, že se exprese genu gen CKíl nebo jeho homologu nebo ortologú změní tak, že se buď sníží, nebo úplně eliminuje, např. pomocí RNA interference, inzerční mutagenezí nebo podobnými metodami. Alternativně lze měnit aktivitu genového produktu homologu nebo ortologú pomocí metod místně řízené mutageneze ve vybraných aminokyselinách, s výhodou v aminokyselinách podílejících se na přenosu fosfátu příslušnou receptorovou histidinkinázou, na
4D potenciálních interakcích s dalšími, např. regulačními, proteiny nebo aminokyselinách s regulační funkcí. Takto upravená DNA pod kontrolou konstitutivně nebo kondicionálně aktivního promotoru se pak použije pro přípravu stabilních transformantů příslušného rostlinného druhu pomocí obecně známých přístupů a metod.
V případě použití RNA interference ke snížení aktivity homologu nebo ortologú je nutně připravit obecně známými metodami molekulární biologie rekombinantní DNA, obsahující části sekvence cDNA homologu nebo ortologú v obrácené repetici, oddělené sekvencí jiné DNA, např. částí kódující sekvence uidA (sekvence 5; ěást (HJSp, sekvence 6) nebo přirozeného íntronu homologu nebo ortologú Pro snížení aktivity homologu nebo ortologú je možné zvolit různé
5(i oblasti jeho cDNA a to pravděpodobné s ilizným výsledkem na pokles exprese homologu nebo ortologú: toto je nutno testoval metodami průměrnému odborníkovi v dané oblasti známými (např. analýza množství proteinu kódovaného homologem nebo ort o logem pomocí westernového přenosu nebo in šitu imunolokalízací na řezech stonku květenství nebo jiných pletiv). Vhodnou částí sekvence cDNA je sekvence nukleotidů, jejichž pořadí odpovídá nejméně z 20 % sekvenci nukleotidů CKlp2, sekvence 4. Tento konstrukt jc pak vložen pod kontrolu konstitutivně aktiv- 3 CZ 30(1145 B6 ního pro motoru (např. CaMV 35S RNA pro motoru) nebo kondieionálně aktivního promotoru (např. dexametbasonem indukovatelného pro motoru) a ukončen terminátorem transkripce. Výsledný konstrukt je pak klonován do binárního vektoru, který je použit pro transformaci vhodného kmene Agrobacterium tumcfaciens (např. GV3013::pMP90; kmen s rezistencí k rifampicinu, nesoucí pomocný plasmid pMP90 s rezistencí ke gentamícinu jako selekčním markérem [Koncz and Schell, Mol Gen Genet 204, 383-396 (1986)] nebo podobný). Následuje příprava transgenních rostlin daného druhu obecně známými metodami, buď infiltrací květenství pomocí transgenního Agrobacterium, nesoucím binární vektor, jehož součástí je zmíněný genový konstrukt, nebo jinou metodou, vhodnou pro daný rostlinný druh, např. prostřednictvím infiltrace tkáňových io explantátů bakteriemi Agrobacterium, nesoucím binární vektor, jehož součástí je zmíněný genový konstrukt, a in vitro regenerací transgenníeh rostlin nebo podobnými metodami. Po selekci několika nezávislých linií primárních tran sfo rmantů na základě přítomnosti selekčního markéru, který je součástí vloženého konstruktu, je nutné identifikovat v jejich potomstvu homozygotní linie a analyzovat jejich fenotyp, vše pomocí obecně známých metod molekulární biologie rost15 lín. Pro analýzu fenotypu vývoje vaskulárních pletiv je možno použít specifického barvení, např. směsí oranže GG a anilinové modři na ručně připravených řezech nebo morfologické a histologické analýzy na tenkých řezech připravených pomocí obecně známých metod.
Význakem vynálezu je také to, že dále zahrnuje histologické barvení řezů živých rostlin směsí oranže GG a anilinové modří, vhodné pro analýzu fenotypu vývoje vaskulárních pletiv v rostlinách s modifikovanou expresí genu CKli nebo jeho homologu nebo ortologu nebo s modifikovanou aktivitou jeho genového produktu. Barvení touto metodou umožňuje rozlišit mezi zdřevnatělými buněčnými stěnami, které se bani spolu s cytoplazmou žlutě až oranžově, a živými, tedy ještě ne zcela zdřevnatělými buněčnými stěnami, které se barví modře. Při použití fluorescence je pak možno identifikovat zdřevnatělé a ligniOkované buňky. Tato metoda takc umožňuje barevně odlišit jednotlivé buněčné složky vaskulárních pletiv u rostlin při použití mikroskopického pozorování v procházejícím světle, zejména diferenčního interferenčního kontrastu (D1C mikroskopie): Floém se barví modře, metaxylém oranžově a protoxylém tmavě modře až fialově.
au Předmětem vynálezu je také způsob přípravy rekombinantní DNA pro regulaci exprese genu prostřednictvím RNA interference, jehož podstata spočívá v tom, že se ampl i fíku je specifická část cDNA nebo kódující oblasti daného genu pomocí přímení, obsahujících kromě sekvence 1821 nukleotidů specifických pro cDNA nebo kódující sekvenci daného genu i oblasti vložené na 5' konec těchto primeru, označené RNAi up a RNAi down,
RNAi up:
BamHI Hinclttl
5' - TAT AGG ATC CAA GCT T - 3'
RNAi_down:
\h;il
5' - CAC TTC TAG A - 3' dále se ampli Ukuje spojovací sekvence, s výhodou část kódující sekvence genu uidA (sekvence 5; část GUSp, sekvence 6), která se ampl i fi kuje pomocí primeru Bgus a Hgus,
Bgus:
BamHI
5' - CAG CGG ATC CCT CTA CAC CAC GCC GAA CAC C - 3' roopjip Hgus:
líinillll
5' - TTC CAA GCT TTT CTC TGC CGT TTC CAA ATG G - 3'
LUUP doMti- 4 C’Z 300145 B6 a prostřednictvím štěpení restríkčním i endonukleázami BamHi. Hindlll, Xbal a Sáli a spojením výsledných fragmentů ligázou se tyto tří části spojí do jednoho výsledného konstruktu, který se pak vloží pod kontrolu vhodného promotoru. Takto připravená sekvence se pak použije pro pří5 právu transgenního organismu daného druhu.
Jako spojovací sekvenci lze v případě nutnosti použít i jiné sekvence než uidA, a v tom případě se amplitlkují pomocí primerů sestávajících z 1 S -21 nukleotidů specifických pro danou sekvenci a dále sekvencí, vložených na 5' konec těchto primerů, označených jako LOOP up a LOOP down.
io LOOP up:
5f — CAG Cuu v_, — 3f
LOOPdown:
5' - TTC C - 3'
Sekvence 4 nukleotidů na 5' konci sekvencí RNAiup, RNAi_down, LOOP up a LOOP_down byla optimalizována pro amplifikaee sekvencí CKIp2, resp. GUSp. Tyto sekvence 4 nukleotidů mohou býl případně modifikovány tak, aby docházelo ke zlepšení amplifikaee dané sekvence (zlepšení termodynamických vlastností daného primerů po vložení 18 21 nukleotidu specifických pro sekvenci homo logu nebo ort o logu, resp. dané spojovací sekvence, zamezení tvorby sekundárních struktur a vzájemných podobností atd.), případně mohou být tyto 4 nukleotidy zcela vypuštěny.
2(1
Regulovat aktivitu genového produktu (kódovaného proteinu) homologu nebo ortologu je možno pomocí přípravy rekombinantní DNA, která sestává z modifikované cDNA nebo genomové DNA homologu nebo ortologu pod kontrolou vhodného promotoru (konstitutivně nebo kondicionálně aktivního pro motoru). Modifikace cDNA nebo kódující oblasti genomové DNA spočívá ve výměně části nukleotidové sekvence obecně známými technikami (místně řízená mutageneze) a to tak, aby při překladu mRNA do proteinu došlo k záměně vybraných aminokyselin homologu nebo ortologu na jiné, zvolené aminokyseliny. Lze modifikovat aminokyseliny podílející se na přenosu fosfátu příslušnou reeeptorovou histidinkinázou, kódovanou homo logem nebo orto logem, resp. je možno modifikovat další aminokyseliny, které se mohou podílet jak na vlastním ?o přenosu fosfátu, tak na potenciálních interakcích s dalšími, např. regulačními proteiny nebo aminokyseliny s regulační funkcí. Tyto aminokyseliny je nutno identifikovat obecně známými metodami, zejména srovnáváním aminokyselinové sekvence homologu nebo ortologu s aminokyselinovými sekvencemi podobných proteinů a experimentálně. Výsledný konstrukt je vložen do binárního vektoru a výše popsanými a obecně známými metodami jsou připraveny stabilní transformantní linie příslušného rostlinného druhu, exprimující modifikovanou alelu homologu nebo ortologu. Následuje selekce několika nezávislých linií primárních transformantu na základě přítomnosti selekčního markéru, který je součástí vloženého konstruktu, identifikace homozygolní linie v jejich potomstvu a analýza jejich fenotypu, vše pomocí obecně známých metod molekulární biologie rostlin. Pro analýzu fenotypu vývoje vaskulárních pletiv je možno použít specifického barvení, např. směsí oranže GG a anilinové modři na ručně připravených řezech nebo morťologieké a histologické analýzy na tenkých řezech připravených pomocí obecně známých metod.
Cytokininové signální dráhy j sou mezi rostlinami poměrně konzervované a lze předpokládat, že
4^ tvorbu cévních svazků u ostatních rostlinných druhů budou řídit podobné (homologní) geny jako v případě modelové rostliny A. thaliana. Jako modelové rostliny se v případě výzkumu hospodářské využitelnosti v produkci dřeva používají zejména topol (Popidas trichocarpa) a bříza (Benda sp.}. V případě topolu, jehož genom je v současnosti již. znám, byly identifikovány homo- 5 CZ 300145 Bft logy genu CKII, podílející se na osmoregulaci (Chefdor etal., FEBS Lett 580, 77-81 (2006)).
Naše výsledky vyhledávání homologní ch sekvencí ukazují, žc se v genomu topolu vyskytují geny homologní genu CKH (vlastní nepublikované výsledky). Ilomology genu CKÍI a dalších rcccptorových histidinkináz byly identifikovány již v celé řadě dalších, hospodářsky velice význam5 ných druhů (např, rýže, kukuřice, pšenice).
Vynález je dále osvětlen na následujících příkladech, aniž je jimi jakkoliv omezen.
Přehled obrázků na výkresech io Obr. 1 znázorňuje analýzu produkce biomasy v transgenních liniích nesoucích konstrukt pro snížení exprese CKI! podle příkladu 3. DM SOI 0,0001 %; DMS02=0,001 % a DMS03=0,01 % (vždy v/v) odpovídá rostoucí koncentraci DMSO (dimethylsulfoxid) v kultivačním médiu.
Obr. 2 ukazuje porovnání několika nezávislých transgenních linií se sníženou expresí CK11 (linie
CJH4T3) s mutanty v genech homologních kCA7/ a rostlin s nadměrnou expresí genu pro CYTOKININOXIDAZUIDEEIYDROGENAZU3, vedoucí ke snížené hladině endogenních cytokininu (35S::AtCKX3) s rostlinami standardního typu (wt Col-0). Jsou uvedeny průměry rozet a počet listů v rozetě během růstu rostlin (A, 8 týdnů; B, 10 týdnů; C, 12 týdnů a D, 14 týdnů staré rostliny kultivované za podmínek krátkého dne).
Obr. 3 ukazuje lěnotypovou analýzu podle příkladu 3: Rychlejší vývoj cévních svazků a zvýšené ukládání celulózy během sekundárního tloustnutí u A. thaliana následkem represe genové aktivity CKIL Cévní svazky v bočních větvích květenství standardního typu (a-d), 35S::CK/i rostlin (transgenní rostliny nesoucí konstrukt 35S::CKli2::pA, způsobující umlčení genu CA//, linie
CJH4 I 3, 5-3, [e—h]), u dvojnásobných mutantů v genech homologních genu CKII, ahk2 ahk3, (i-I) a ahk2 ahk4 (q-t) a u transgenní linie s nadměrnou expresí genu pro CYTOKININOXIDÁZCIDEHYDROGENÁZU3 (35S::AtCKX3) vedoucí ke snížené hladině endogenních eytokininů (m-p). Ruční řezy byly barveny směsí anilinové modři a oranže GG a pozorovány pomocí DIC optiky (a, c, e, g, i, k, m, o, q, s) nebo fluorescence (b, d, f, h, j, 1, n, p, r, t), s použitím triple filtru (U-M61000, DAPI/FITC/TRIIC triple filter block, Olympus), if, vlákna interfaseikulámích oblouků; mx, metaxylém; p, floém; px, protoxylém. Měřítko 100 pm (a, b, e, f, i, j, m, n, q, r) a 50 pm (c, d, g, h, k, I, o, p, s, t). Šipkami jsou označené oblasti vláken interfasckulárních oblouků, kótovaeími šipkami pak oblast metaxylému.
Obr. 4 znázorňuje kvantifikaci a porovnání tloušťky vrstvy lign i Okovaných buněk vláken interfaseikulámích oblouku u dvou nezávislých transgenních linií se sníženou expresí CKÍI, 35S::CKlli. 15a 5-3 (zkrácené označení linií CJH4T3. 1 5 a CJH4T3, 5-3), u dvojnásobných mutantů atik2 ahk4, ahk3 M4 a ahk2 ahk3 a v transgenní linii s nadměrnou expresí genu AtCKX3 (35S::AtCKX3) pro CYTOKININOXIDÁZU/DFI IYDROGF.NÁZU3 se sníženou to endogenní hladinou eytokininů v porovnání slinil standardního typu wt <?ol—0. Uvedeny jsou rozměry v pm.
Obr. 5 znázorňuje analýzu vlivu CKII na přenos eytokininového signálu v protoplasteeh A. thaliana podle příkladu 5.
Obr. 6 ukazuje lěnotypovou analýzu transgenních linií se zvýšenou expresí standardní formy genu CKÍI a dominantně negativního mutanta CKIIH4(hQ, A. B. Ektopieká exprese CKÍI vede ke sterilitě, zvýšené tvorbě trichornů (A) a ztloustlého stonku květenství (B). C. Změny v architektuře cévních svazků v rostlinách se zvýšenou expresí CKII (transgenní linie 35S::CKII). Příčné so řezy (a, b, d a e) a podélné řezy (c a f) stonku květenství u rostlin standardního typu (a-c) a transgenních linií 35S/CKH (d 1). Šipky ukazují tvorbu ektopických pletiv, které se podobají cévním svazkům. D, E. Ektopieká a nadměrná exprese CA// vede k tvorbě nadbytečných vegetativních pletiv z laterálních meristémů. Nodální struktura standardního typu a transgenních
- 6 CZ 300145 B6 linií 35S::CKH (D), příčné a podélné řezy z rostlin standardního typu (E.a) a transgenních linií
35S::CKI1 (E.b). Šipka ukazuje na ektopický úžlabní pupen vytvořený u transgenních linií
35S::CKH. Měřítko 100 μηι. F. Ektopická nadměrná exprese CKll vede k poruchám normálního vývoje cévních svazku u A. thalianu. Příčné řezy stonku květenství transgenních linií s nad5 měrnou expresí čvč//114^ (35S::CK.I1H40?0, a, b a c), standardního typu (d) a dvojitého mutanta ahk2 ahk3 (e). Měřítko 100 pm, (f) Expresní analýza transgenních linií 35S\:CKIIlW'. Celkový protein z 6 týdnů starých transgenních rostlin byl analyzován pomocí imunoblotování (westernového přenosu) s použitím protilátek proti HA epitopu a aktinu.
Obr. 7 znázorňuje sekvenci rekombinantní DNA 35S::CKIi2::pA (sekvence 7). i o Přehled sekvencí
Sekvence 1 - genomová sekvence CKH Sekvence 2 ~ aminokyselinová sekvence CKll Sekvence 3 - sekvence cDNA CKll
Sekvence 4 - sekvence CKlp2 (ěást sekvence cDNA CKH)
Sekvence 5 - sekvence uidA Sekvence 6 sekvence GUSp (část uidA)
Sekvence 7 - sekvence rekombinantní DNA 35S::CK/i2::pA
Příklady provedení vynálezu
2o Připravili jsme několik nezávislých transgenních linií A. lhaliana, Col-0, nesoucích rekombinantní DNA pro represi genové aktivity genu CKH mechanismem RNA interference.
Příklad 1
Příprava konstruktu pro RNA interferenci
Pomocí PCR jsme ampliťikovali oblast cDNA genu CKH ohraničenou sekvencemi primerů
CKIp2_up a CKlp2 down, kterou jsme nazvali CKlp2. Obdobně pomocí primerů Bgus a Hgus jsme ampliťikovali část kódující sekvence genu uidA (sekvence 5), kterou jsme označili jako GUSp (sekvence 6). Použité primery mají kromě nukleotidů odvozených od sekvence CKH, resp, uidA, vložená místa, rozpoznávaná specifickými restrikčními endonukleázami, viz sekvence jednotlivých primerů, podtržená jsou vložená místa (nespecifická k sekvenci templátu, použitého ?o pro amplifikaci) a barevně jsou označená místa rozpoznávaná restrikčními endonukleázami. V případě primerů CKlp2 up jsou to BamHI a HindlII, v případě příměru CKip2 down místa pro Xbal a Sall, primer Hgus obsahuje místo pro 1 lindlll, primer Bgus obsahuje rozpoznávací sekvenci pro BamHI.
Sekvence použitých primerů:
CKIp2 up;
5' - TAT Aw GC AGT TGT GCT TTT GGT GAT T - 3'
CKlp2jJown:
5' - CAC ,T _ ' TG ATG CGA TTA TCC TCT TAC C - 3'
Bgus.
5' - CAG CCG ATC GCT CTA CAC CAC GCC GAA CAC C - 3'
Hgus b' - TTC C TT CTC TGC CGT TTC CAA ATC G - 3' ΐΛ/vr oown
- 7 (/. 300145 B6
Amplifikace pomocí takto upravených primerů a cDNA genu CK11, resp, DNA genu uidA jako teniplátu vedla k produkci DNA, která obsahovala zmíněná restrikční místa. Pomocí vnesených míst pro restrikční endonukleázy jsme klonovali všechny tyto fragmenty najednou, a to následujícím způsobem: DNA fragment CKIp2 (sekvence 4) jsme rozdělili na poloviny, jednu polovinu jsme štěpili pomocí BamHI a Xbal (tedy enzymu, rozpoznávajících vnější restrikční místa), druhou pak pomocí Hindlll a Sáli (tedy enzymů, rozpoznávajících vnitřní restrikční místa). DNA získanou amplifikaci pomocí primerů Hgus a Bgus jsme štěpili pomocí Hindlll a BamHI. Po purifikaci pomocí QlAquick PCR Purification Kit (Qiagen) jsme smíchali všechny tři různé fragmenty v ekvimolámím množství a přidali vektor pBluescript (Stratagene), štěpený enzymy io Xbal a Sáli a defosfo rylo váný pomocí teplem inaktivovatelné alkalické fosfatázy (Alkaline Phosphatasc, shrimp, Roche, dle přiloženého návodu) tak, aby výsledný molární poměr mezi vkládanými fragmenty a plazmidovou DNA byl mezi 1:1 až 3:1. Následovala ligace pomocí T4 DNA ligázy (T4 DNA Ligase, Roche), 12 h při 16 °C, transformace do Escherichia coli, kmen DHlOp, a kontrolní štěpení DNA (pomocí Sáli), vyizolované z pozitivně selektovaných bakteriálních kolonií na selekčním médiu (ampicilin). Všechny uvedené postupy byly provedeny buď podle návodů udaných dodavatelem jednotlivých chemikálií a enzymu, nebo podle obecně známých metod molekulární biologie (Ausubel el al., Current protocois in molecular biology. John Wiley and Sons, New York (2003)). Výsledný konstrukt byl pak označen jako pBsc::CKlp2i. V našem případě jsme dosáhli více než 50% efektivnosti (13 pozitivních vzorků
2o z celkových 20 testovaných DNA izolátú z pozitivně selektovaných bakteriálních klonů), což je nadprůměrná hodnota a ukazuje na relativně vysokou efektivitu tohoto způsobu přípravy rekombinantní DNA. S podobným výsledkem byly klonovány i jiné úseky genu CK11 pro účely jeho umlčení pomocí RNA interference, což ukazuje na univerzalitu tohoto postupu i pro jiné sekvence. Následovala kontrola vybraných klonů sekvencováním, která prokázala úspěšné naklono25 vání všech tří fragmentů (CKIp2 v proti směrné (antisense) orientaci, uidA fragment a CKlp2 v po směrné (sense) orientaci), které jsme dohromady označili jako CKIp2i. Výše popsaný postup je možno použít univerzálně pro přípravu konstruktů pro umlčování genů pomocí RNA interference s tím, Že je třeba zvolit takové úseky cDNA umlčovaného genu, které neobsahují rozpoznávací místo pro restrikční enzymy BamHI, Hindlll, Xbal a Sall. Dále je třeba navrhnout prime3o ry obsahující cca 18 21 nukleotidů specifických pro vybraný úsek cDNA a na jejich 5'konec přidat sekvenci RNAiup na „leťt (forward) primer, resp. RNAidown na „right (reverse)“ primer (viz část sekvence primerů CKlp2 up a CKIp2_down zvýrazněná podtržením). V případě, že se jako spojovací sekvence nedá použít sekvence genu uidA, je možno obdobným způsobem (vložením sekvencí LOOP up a LOOP_down, obsahujícím místa rozpoznávaná restrikčními enzymy BamHI a Hindlll) modifikovat primery, obsahující specifickou sekvenci vybrané DNA, která ovšem nesmí obsahovat rozpoznávací místa pro restrikční enzymy BamHI a Hindlll.
Příklad 2
Příprava transgenních linií
Pomocí štěpení restrikčními enzymy BamHI a Hindlll. zatupením konců pomocí Klenowova enzymu (Roche) a následnou religací pomocí T4 DNA polymerázy (všechny enzymy Roche) jsme upravili binární vektor pVKHJáXf/CŠS/xJ (Reintantz etal.. Plant Cell /3. 351-367 (2001)). Výsledný vektor, který jsme označili pVKH-.-.(35S-.:pA), obsahoval 35S expresní kazetu (CaMV 35S RNA promotor a terminátor transkripce). Následně jsme z vektoru pBsc:;CKIp2i vyštěpili konstrukt CKlp2i pomocí Sáli a klonovali jej do binárního vektoru plrKH\:(355::pA), štěpeného Sall. Výsledný konstrukt jsme pak označili jako ρΙ'ΚΠ;Α355:Ε’ΚΙΐ2'.:ρΑ) (sekvence 7), zkráceně pJH_006. Konstrukt jsme ověřili sekvencováním (viz sekvence 7) a transformovali jsme jej elektroporací do Agrobacterium tumefíwiens, kmen GV3013:.pMP90 (Koncz and Schell. Mol Gen
Genet 204, 383-396 (1986)). Pomocí infiltrace květenství standardního typu A. thaliana, Col fi (Clough a Bent, Plant J /6, 735- 743 (1998)) a následnou selekcí na médiu s hygromyeinem (iti vitro na MS médiu, bez saeharózy, 15 mg/l hygromyein. 400 mg/I tiearciIlin/klax ulanát draselný,
15:1) jsme získali primární transformanty (TI generace, linie označené jako CJH4T1, 1 až
- 8 CZ 31)0145 B6
CJH4TI, 58), / jejichž potomstva jsme pak za základě segregačních poměru (frekvence rezistence, resp. citlivosti k selekčnímu markéru hygromycinu) vybrali předpokládané jednozásahové linie. V potomstvu předpokládaných jednozásahových linií jsme identifikovali linie homozygotní pro daný trans gen (T2 generace, linie označené jako CJH4T2). Semena z těchto linií pak byla sebrána a použita pro další analýzy (T3 generace, linie označené jako CJH4T3, 1 až CJH4T3, 16).
Příklad 3
IU
Fenotypová analýza linií se sníženou expresí CK11
U několika nezávislých homozygotních linií jsme zjistili přítomnost zajímavého ťenotypového projevu. Vybrané transgenní linie (viz Obr. 1 a Obr. 2) jsme kultivovali in vitro ve čtvercových
Petriho miskách (12x12 cm) 21 dní na MS médiu obohaceném 1 % sacharózou a zpevněném 1,5% fytagelem, obsahujícím různou koncentraci dimethylsulfoxidu (DMSO), ve vertikální poloze v kultivačních komorách s regulovatelnými růstovými podmínkami (Pere i val Scientific, Ltd., relativní vzdušná vlhkost 70%, podmínky krátkého dne [světlo 8 hodin, tma 16 hodin], teplota při světle fázi 21 °C, teplota při temné fázi 19 °C). DMS01“0,0001%; DMS02-0,001% a
DMSO3-0,O1% (vždy v/v) odpovídá rostoucí koncentraci DMSO v kultivačním médiu. Po sklizni byly odděleny kořeny a nadzemní část. Hmotnost vytvořené biomasy kořenů a nadzemní části byla změřena vážením. Zjistili jsme, že nejméně u 4 zc 6 testovaných linií dochází ve srovnání s liniemi standardního typu ke zvýšené tvorbě biomasy a to jak v kořeni, tak v nadzemní části rostliny (prýtu, Obr. 1). Při kultivaci v půdě za podmínek krátkého dne rostly transgenní linie v porovnání s rostlinami standardního typu rychleji a tvořily větší vegetativní část rostliny (tzv. listovou rozetu, Obr. 2).
Dále jsme provedli podrobnější analýzu fenotypu ve vývoji vaskulámích pletiv. Ručně jsme připravili řezy z živých rostlin (bez fixace) a provedli barvení pomocí směsi anilinové modři a
5o oranže GG. Řezy byly připraveny žiletkou z bazálních nodů latcrálních větví květenství, vyrůstajících z bazálního nodu hlavního stonku květenství A. thalianu a okamžitě byly 15 minut barveny v barvícím roztoku, který obsahoval 0,25% anilinovou modř a 1 % oranž GG, 10 až 15 min. odbarveny ve vodě a montovány do 50% glycerolu. Barvicí roztok byl připraven následujícím způsobem: Ve 100 ml vody bylo rozpuštěno 0,25 g ve vodě rozpustné anilinové modři a 1 g oranži GG. Tato směs byla uvedena do varu a po vychlazení bylo přidáno 5 ml kyseliny octové a směs byla přefiltrována (Braune, Leman, faubert, Pílanzenanatoniisches Praktikum 11, str. 401, VLB Gustav Fischer Verlag, Jena (1982)). Barvení touto metodou umožňuje rozlišil mezi zdřevnatčlými buněčnými stěnami, které se barví spolu s cytoplazmou žlutě až oranžově, a živými, tedy ještě ne zcela zdřevnatělými buněčnými stěnami, které se barví modře. Při použití tluores4u cenee je pak možno identifikovat zdřevnatělé a ligni 1 ikované buňky. Fato metoda také umožňuje barevně odlišit jednotlivé buněčné a funkční složky vaskulámích pletiv u rostlin: Floém se barví modře, inctaxylém oranžově a protoxylém tmavě modře až fialově (viz Obr. 3). Řezy byly ještě týž den pozorovány a dokumentace byla provedena pomocí motorizovaného mikroskopu (BX 61, Olympus) vybaveného digitální kamerou (DP50. Olympus) a řízeného speciálním programem (AnalySIS, Soft Imaging System, GmbH). Na řezech jsme zjistili, že u transgenních linií dochází k odchylkám ve vývoji vaskulámích (vodivých, cévních) pletiv stonku květenství. Zjistili jsme, žc u transgenních linií s předpokládanou sníženou expresí genu CKU dochází k tvorbě širších vláken interfascikulárních oblouků mezi cévními svazky (Obr. 3). Šířka oblouků byla měřena a vyhodnocena pomocí speciálního programu (AnalySIS, Soft Imaging System, GmbH) na inikro50 fotografiích získaných pomocí pozorování fluorescence u výše zmíněných řezů živých rostlin, barvených směsí oranže GG a anilinové modře, viz Obr. 3. Na Obr. 3 je viděl fenotyp cévních svazků v bočních větvích květenství standardního typu (a d), 35S..CKH rostlin (transgenní rostliny nesoucí konstrukt způsobující umlčení genu CKU 35S-.:CKfi2::pA, linie CJI14T3. 5-3 [e-h]) a u mutanta v genech homologních genu CKH. genech AHK2, ΑΠΚ3 a AHK4\ ahk2 ahk3, (i 4) a ahk2 ohk4 (q t). Na obrázcích (m-p) je fenotyp transgenní linie s nadměrnou expresí genu pro
- 9CZ 300145 B6
CYTOK1NINOXIDÁZU/DEHYDROGENÁZU3 (35S::AtCKX3) vedoucí ke snížené hladině endogenních eytokininú. Ruční řezy byly barveny směsí anilinové modři a oranže GG a pozorovány pomocí DIC1 optiky (a, c, e, g, i. k, rn. o, q, s). Eloém se barví modře, metaxylém oranžově a protoxylém tmavě modře až fialově. Buňky vláken interfascikulárních oblouku {if) byly pozoro5 vany na týchž řezech s použitím fluorescence a s pomocí triple filtru (U M61000, DAPI/FITC/TRITC triple filter block, Olympus; [b, d, f, h, j, 1, n, p, r, t]). Preparáty byly získány z rostlin starých cca 16 týdnů, 7 týdnů po přenesení do podmínek dlouhého dne a cca 5 týdnů po indukci kvetení. Při porovnání obrázků a-d s obrázky e—h je vidět u linií se sníženou expresí CKH zvýšené ukládání celulózy zejména v oblasti metaxylému (intenzivnější zbarvení oranží κι GG a ztloustlé buněčné stěny, kóto vací šipka). V liniích se sníženou aktivitou CK11 a v dvojnásobném mutantovi M2 ahk4 je znatelná radiální expanze vrstvy buněk interfascikulárních oblouků (ilj. Tento rozdíl je statisticky významný (P<0.05, viz Obr.4). Částečně ligni fikované buňky na vnějším okraji centrálního jádra dřeně, kótovací šipky na obrázcích d, h, 1 a t) nebyly do měření zahrnuty. U linií 35S::CKÍi a ahk2 ahk4 mutantů bylo pozorováno zvýšené ukládání celulózy během sekundárního tloustnutí v podobě intenzivního barvení oranží GG (porovnej obrázky c, g a s, kótovací šipka ukazuje na stěny buněk v xylému, šipka pak na stěny buněk v interfascikulárních obloucích; šipky ukazující na tyto rozdíly v obrazcích a, e, i, m a q jsou ve stejných pozicích jako v odpovídajících obrázcích z fluorescenčního mikroskopu b, f, j, n a r). Zvýšená intenzita barvení pomocí oranže GG v if oblasti u 35S::CKHi linií (e a g) ukazuje na
2(i zvýšenou depozici celulózy a dřevnatění oproti liniím standardního typu, které jsou v těchto oblastech zbarvené modře (a a c). if, vlákna interfascikulárních oblouků; mx, metaxylém; p, tloém; px, protoxylém. Měřítko 100 pm (a, b, e, f, i, j, m, n, q, r) a 50 pm (e, d, g, h, k, I, o, p, s, t).
Výsledky hislochcmického barvení ukazují, že u těchto linií dochází v důsledku snížené exprese genu CKH ke zvýšenému ukládání celulózy a dřevnatění během tzv. sekundárního tloustnutí stonku, a to jak v xylému, tak v interfascikulárních obloucích. Znamená to tedy, žc CKI 1 je negativním regulátorem uvedených procesů (tedy především vývoje a diferenciace cévních svazků, tvorby (lignifikaee) vláken interfascikulárních oblouků a sekundárního tloustnutí). Tohoto faktu je možno potenciálně využít v biotechnologických aplikacích spojených s produkcí biomasy.
Příklad 4
Fenotypu vá analýza mutantů v genech homologních s CKI 1
Podobným způsobem jako v případě linií se sníženou expresí CKll jsme provedli analýzu fenotypu vaskulárních pletiv u linií s inzerčními mutacemi v genech homologních genu CKll, AHK2, AHK3 a AHK4. Výsledky fenotypových analýz u dvojnásobných mutantů v genech homologních genu CKll, genech AHK2, AHK3 a AHK4, potvrdily účast homologů genu CKll vc vývoji vas40 kulárních pletiv u A. ihaliana. V případě dvojnásobných mutantů ahk2, uhk3 (dvojnásobných homozygotů pro danou mutaci, Nishimura et al., Plant Cell 16, 1365 1377 (2004)) jsme pomocí analýzy fenotypu vaskulárních pletiv stonku květenství (viz výše) identifikovali fenotyp ve vaskulárních pletivech opačný než v případě linií se sníženou expresí CKH, tedy v porovnání se standardním typem opožděnou a neúplnou diferenciaci proloxylému i metaxylému, tvorbu užších vláken interfascikulárních oblouků mezí cévními svazky a menší ukládání celulózy jak v xylému, tak v oblasti vláken interfascikulárních oblouků; porovnej intenzitu barvení oranží GG v oblasti interfascikulárních oblouků na Obr. 3: U dvojnásobných mutantů M2 M3 (i a k) sc oblast vláken interíáseikulárníeh oblouků (šipky) v porovnání s linií standardního typu (a a c) a zejména 35S::CK/i linií (e a g) barví více modře. Podobný fenotyp jsme také zaznamenali v případě trans5(i geimich linií s nadměrnou expresí genu pro CYTOKININOXIDÁZU/DEHYDROGENÁZU3 AtCKX3 (Obr. 3. in o). Jak jsme zjistili, dochází v květenství těchto linií kc snížení endogenní hladiny eytokininú zeatínového typu až na úroveň cca 1 % hladiny v liniích standardního typu (vlastní nepublikované výsledky). Naopak v případě dvojnásobných mutantů v genech ahk3, M4 (Nishimura cl al.. Plant Cell /6, 1365 -1377 (2004)) a zejména M2, uhk4 (Higuchi etal.,
Proč Nati Acad Sci USA /0/, 8 821-8 826 (2004)) jsme identifikovali fenotyp podobný fenotypu
- 10CZ 3(Η)Ϊ45 B6 u transgenních linií se sníženou expresí CKÍ1, kdy v porovnání s liniemi standardního typu dochází k tvorbě širších vláken interfascikulámíeh oblouků mezi cévními svazky (Obr. 3 a 4) a zvýšenému ukládání celulózy jak v oblasti vláken interfascikulámíeh oblouků, lak v případě xylému (porovnej Obr. 3, a, c vs. q, s). Tyto výsledky tedy ukázaly, že pozorované efekty jsou genově specifické pro danou cytokininovou signální dráhu a že je možno pro účel modulace vývoje vaskulárníeh pletiv nadzemních částí u rostlin využít i regulace exprese genů, resp. modifikace aktivity genových produktů genů homologních nebo ortologních genu CKIl.
io Příklad 5
Příprava rekombinantní DNA kódující ('ΚΙ 1 se změněnou aktivitou pomocí metod místně řízené mutageneze i? Připravili jsme rekombinantní DNA, kódující ('Kil se změněnou aktivitou. Změna aktivity CKI 1 byla testována pomocí exprese v rostlinných protoplastech a pomocí genetických a biochemických analýz. Následně jsme připravili transgenní linie, exprimující CKI! se změněnou aktivitou. Fcnotypová analýza těchto transgenních linií prokázala změny v tvorbě vaskulárníeh pletiv. Tyto výsledky ukázaly, že pomocí modulace aktivity CKI 1 a pravděpodobně i jeho ortologů lze ovliv2o nit tvorbu vaskulárníeh pletiv u rostlin.
Cíenomová DNA pro CKI1 byla atnplifikována pomocí primerů CKI 1 gen fwd a CKI 1 gen re v.
CKIlgen_fwd:
ICC ATG ATG GTG AAA GTT ACA AAG C-3'
CKIlgenrev:
’í!: 1
5'-AGC CCC GTG ACG TTT GCT TTC GAT TTC-3'
Výsledná DNA (CKI/gen) byla štěpena pomocí BamHI a Stul a klonována do vektoru pCB302ES, který byl získán úpravou vektoru pCB3O2 2 (Xiang etal., Plant Mol Biol 40, 711 717 (1999)) a to tak. že kódující oblast CK11 se dostala pod kontrolu promotoru 35SC4PPDK (Hwang a Shecn, Nátuře 413, 383 389 (2001)). Výsledný vektor byl označen jako
2o pCB302ES::(35S::C'KI 1 gen). Pomocí soupravy pro místně řízenou mutagenezi (QuiekChange site directed mutagenesis, Stratagene) a primerů His405_CAA byla sekvence CKI 1 gen modifikována tak, že vzniklá DNA kódovala mutantu CKllH4tbQ se záměnou histidinu v poloze 405 (nukleotidová sekvence ('AC) na glutamin (CAA). Vzniklý konstrukt byl označen jako pCB302ES::(35S::CKHgenH405Q).
His405_CAA:
5'-GCA AAT GCT AGC GAT ATT AGA GGT GCC-3'
Podobně byla s využitím primerů Asp 1050 AAC připravena genomové DNA kódující mutanta ^^jlDio.Mix se 7áni£nou kyseiiny asparagové v poloze 1050 (CAC) na asparagin (AAC) a výs40 ledný konstrukt byl označen jako pCB302ES::(35S::CKf/genD1050Q).
A$pl050_AAC
5'-GAC TAC ATA TTC ATG
TGC CAA ATG CCA G-3'
CY JUUI45 B6
Tato DNA pak byla použita pro transformaci protoplastů A. thaliana a byla analyzována aktivita kódovaných proteinů ve smyslu jejich vlivu na přenos signálu v cytokinovc signální dráze popsanými metodami (Hwang a Sheen, Nátuře 413, 383-389 (2001)). Přenos signálu v cytokininové signální dráze je v protoplastech A. thaliana kvantifikován pomocí měření aktivity lueiferázy, jejíž exprese je kontrolována cytokininem indukovatclným pro motorem genu ARR6. Jako kontrola konstitutivní (na cytokininu nezávislé) aktivity CKI1 byly pro transformaci kromě protoplastů izolovaných ze standardní linie A. thaliana, Col-0 (wl) použity i protoplasty izolované z transgenní linie A. thaliana s nadměrnou expresí genu AtCKX2, kódujícího CYTOKININOXIDÁZU/DRHYDROGENÁZU2 (35S;:CKX2 9). U těchto transgenních linií io došlo v důsledku nadměrné exprese AK3KX2 ke snížení endogenní hladiny aktivních forem cytokininu (isopentenyladeninu a zealinu) na přibližně 45 % oproti standardnímu typu (Werner et al., Plant Gel 1 /5, 2532 -2550 (2003)). Touto analýzou bylo zjištěno, že v případě nadměrné exprese standardní alely CKll dochází ke konstitutivní, tedy na přítomnosti cytokininu nezávislé, aktivaci cytokininové signální dráhy A. thaliana. Naopak v případě nadměrné exprese genů pro mutantní i? formy CKll, CKIlll4tbQ a CKI]I),050\ dochází k dominantně negativnímu efektu na přenos signálu v cytokininové signální dráze A. thaliana (viz Obr. 5).
DNA pCB302ES::CKIIgen a pCB3B2ES.:CKllgenH405Q byla transformována do Agrobacterium tumefaciens, kmen GV3101, a pomocí infiltrace květenství (Clough a Bent, Plant J 16, 7352i) 743 (1998)) byly získány transgenní rostliny, produkující ve zvýšeném množství CKll, resp.
CKI l1 N,,5Q ve formě rekombinantních proteinů (luzní protein, obsahující kromě aminokyselinové sekvence CKll. resp. CKIl4(btJ také sekvenci dvou kopií tzv. epitopu HA (hemaglutininu), umožňující detekci fúzního proteinu pomocí protilátek proti epitopu HA, viz Obr. 6Flj. Byly analyzovány tři nezávislé transgenní linie nesoucí konstrukt 35S::CKf Igen, označené jako 2-2,
2-13, 1-13 a čtyři nezávislé transgenní linie, nesoucí konstrukt 35S::CKllgenll405Q, označené jako 2, 6, 7 a 9.
Analýzou fenotypu výše uvedených transgenních linii bylo zjištěno, že došlo ke změnám vývoje vaskulárních pletiv u transgenních linií, a to jak u linií s nadměrnou (zvýšenou) expresí stan?o dardní alely CKll (linie 2-2. 2-13, 1 13 a 4), tak v případě linií s nadměrnou expresí mutantní alely CKri,wfí> (linie 2, 6. 7 a 9).
V případě linií se zvýšenou expresí standardní alely CKll došlo (kromě dalších fcnolypových projevů, jako např. různé míry sterility transgenních rostlin nebo zkrácení šešulí, zobrazených na
Obr. 6), také k tvorbě ektopiekýeh cévních svazků a poruchám v jejich diferenciaci. V případě linií se zvýšenou expresí CKll jsme identifikovali oproti liniím standardního typu absenci nebo podstatné snížení lignifikace. Na příčných řezech stonků transgenních linií byly identifikovatelné depozity celulózy v rozích buněk, což je stadium, které předchází ligniílkaci těchto pletiv u A. thaliana (Altamura et al., New Phytologist 151, 381-389 (2001)). Stonky květenství transgen40 nich linií se zvýšenou expresí CKll také obsahovaly oproti standardnímu typu zvýšené množství buněk (Obr. 6).
Obr, 6 ukazuje výsledky fenoly po vé analýzy transgenních linií se zvýšenou expresí standardní formy genu CKll a dominantně negativního mutanta CKI l11411'^, A, B. Ektopická exprese CKll vede ke sterilitě, zvýšené tvorbě trichomů (A) a ztloustlého stonku květenství (B). C. Změny v architektuře cévních svazků v rostlinách se zvýšenou expresí CKll (transgenní linie 35S::CKll). Příčné řezy (a, b, d a e) a podélné řezy (c a tj stonku květenství u rostlin standardního typu (a-c) a transgenních linií 35S::CKll (d-tj. Šipky ukazují tvorbu ektopiekýeh pletiv, které se podobají cévním svazkům. D, E. Ektopická a nadměrná exprese CKll vede k tvorbě nad byso tečných vegetativních pletiv z laterálních meristémú. Nodální struktura standardního typu a transgenních linií 35S::CK11 (D), příčné a podélné řezy z rostlin standardního typu (E.a) a transgenníeh linií 35S::CKI1 (E.b). Šipka ukazuje na ektopieký úžiabní pupen vytvořený u transgennich linií 35S::CKll. Měřítko 100 pm. F. Ektopická nadměrná exprese CKlf44^ vede k poruchám normálního vývoje cévních svazků li A. thaliana. Příčné řezy stonku květenství
5^ transgenních linií 35S..CKI(ll4l>X (a-cy standardního typu (d) a dvojitého mutanta ahk2 ahk3 (e).
Měřítko 100 pm. (f) Expresní analýza transgenních linií 35S::CKI1IÍ411^. Celkový protein z 6 týdnu starých transgenních rostlin byl analyzován pomocí imunobl oto ván i (westernového přenosu) s použitím protilátek proti HA epitopu a aktinu. Aktin sloužil jako vnitřní kontrola.
V případě linií s nadměrnou expresí mutantní alelv CKIl jsme identifikovali ve vaskulámích pletivech fenotyp do značné míry opačný než v případě nadměrné exprese standardní aíely CKIl. Ve stoncích květenství jsme oproti liniím standardního typu identifikovali menší množství buněčných vrstev, zejména v případě buněk kambia a nepravidelnou velikost buněk jak v xylému, tak ve flocmu (viz Obr. 6). Podobný fenotyp byl také identifikován u dvojnásobných io mutantů M2 ahk3.
Tyto výsledky tedy ukazují, že jak kvantitativní změna exprese standardní alely CKIl (tedy jak snížení tak zvýšení), tak exprese mutantní alely, kódující CKIl se změnou aktivity, vedou ke změně fenotypu vaskulárních pletiv. Tohoto faktu je možno potenciálně využít k regulaci pro15 dukěních vlastností rostlin s ekonomickým efektem. Zároveň výsledky analýzy linií s mutacemi v genech homologních genu CKIl ukázaly, že je možné využít metod genového inženýrství k regulaci vývoje vodivých pletiv u rostlin prostřednictvím genových manipulací u genů z rodiny reeeptorových histidinkináz, tedy homologů a ortologů CKIL
21)
Průmyslová využitelnost
Předkládaný vynález, genetické manipulace aktivity CKli a jeho homologů nebo ortologů, umožňuje cílené získání rostlin se zvýšenou produkcí biomasy. Další využití je možné např. v bio25 technologických aplikacích umožňujících dekontaminaci zasažených půd prostřednictvím tzv. iytoremediací. Při vývoji těchto technologií se uvažuje o využití transgenních rostlin produkujících enzymy, které umožňují dekontaminaci rozkladem polutantů, např. ropných produktů u jimi zasažených pud a zvýšená produkce biomasy u takových rostlin může zvýšit efektivitu jejich využití, Zvýšené ukládání celulózy, pozorované u transgenních linií, je vhodné pro využití v papírenském a dřevozpracujícím průmyslu, kde by mohlo usnadnit a především zlevnit časově náročné získávání dřevní hmoty. Zvýšení biomasy v některých druzích rostlin bude výhodné i pro potravinářský a farmaceutický průmysl. Důležitou oblastí využitelnosti je produkce tzv. energetických plodin, např. šfovíku Uteuša, kde může podobná genetická modifikace zlepšit energetickou bilanci těchto rostlin. Potenciálně možné je také využití ve šlechtění rostlin, kdy regulace tvorby ligniUkovaných pletiva dřevnatění ve vaskulárních pletivech a vláknech interfascikulárníeh oblouků muže být potenciálně využito při šlechtění odrůd se s níženou poléhavostí (např. o obilovin nebo řepky olejky).
sekvencePatentln 03072007.ST25 SEQUENCE LISTINO < 11 ()> Masarykova univerzita v Brně <120> Způsob regulace tvorby biomasy v rostlinách, sekvence DNA a způsob jejich přípravy <13()> plOS3cz()O <16O>7 < 170> Patentin version 3.3 <2I()> 1
i) <211> 9490 <212> DNA <213> Arabidopsis <400> 1
gaggaggcac aaaatgacga atatacaaaa tgatcttaaa cagctaaact atattggaca 60
ttttttcgat ctcagatata aaagatttca ttcaatataa tacttggata aatactctta 120
ttatttttct ttagtttatt aaaaaaaacc tctaataaat acgagtttaa gtccacaaaa 180
tcgcttagac taaaatacac catataattt caaacgataa agtttacaaa agtaatatcc 240
aagtatctca tagtcaacat atatatagta ataattagtt gacgtataag aaaataaaaa 300
taaataaatt agtatcttat tttgggtggt gctgactggt gactggtgac tgcagaatgc 360
tcggcaaatg gaaccatatc ccaagacatg ggttttagat agaacaaaat aagtgtccga 420
aggaatgata ttaaaagtca aatagaataa ttataaatat tgtaattagc aaataaaaac 480
gtcatgattt tgttgtttag tcgaaaccaa aaaaatatta acgttgggca tcaaaacaag 540
catcgagcta gttgctcaaa ttcacacaat ttagacctct ttgaattttg aaattgctgg 600
aacttgaaac taatcaaaaa aagtcagaga gacctctgcg gaaaggcacg tgttctcgga 660
ttagatttca cgtgggaatg agttatccat gtgctattcc acacaaaaaa aatccctaat 720
ttttcaaaca ctaataatat taaattctca gtttcttctt tttactctgt tattgtatag 780
ctttttgatc catacgttaa gcaatatatg ccttgtttta ttcgttttta ttttattttt 840
tgaaatagat agttgttgct tatgaaaacg aggtagttag atttgattta gaattattat 900
aaaaaaatac attcggactc tgacgttgaa tgattatatt agaatgaaga catgaattca 960
ccaaacctca ttcaaaaaaa gaaaaaaaat cttaaaccga atgataattt gtttcgtcgt 1020
catttaaaat cgtcatcaat ttatttttaa gaaaagaaat taaaagaaag catcggaaaa 1080
agagggccag acaccagctt ggcaatgctt tgctgaaaag ttgtgaataa tgcaattaaa 1140
aacgaacgaa aataaataaa caaatattaa agaaattcga atgggaatat caacaaaatt 1200
atttattttt tagttatgga gacaagaatc gatccaaagg ttgtactctg gacttgaaag 1260
taaaaataaa aagggaatga caataattgg gaaaacatgt gataaaagtc tgaattcaca 1320
gactttgaca gtagtttata gtttcatggg cttttttttt tcctctctca caggacacag 1380
aatcttatct aataggagca gccgctaata tgcactgtgt ttggcatgtt acgattagcg 1440
ttttagagaa ttagagtttg attgaagtgt gttttatata ttgatagtgg gacattactt 1500
. u CZ 300145 Β6 sekvencePatentin 03072^.,
ataaaaagca caaggataca acaatagaga cagtcacatg tatatcacat aagtggatgg 1560
tcctcaatgt gttgcttgta ggacatttgt gagtatgtca aaaacttatt tcacatggta 1620
cactcataga ttagccccac ttaggagtgt ctagaaaaag attgggacta aagtcttgtt 1680
ggatcgaata tgattccaaa cacgttaata tttccctaaa acccatttcg aaaagtatgg 1740
aatgatgaac acattataaa tattttggtt gtgcgaaata ggggtcaaat gtaaaggtta 1800
actttgtatt agttgatgga tagtaaaagg tcaaatttag aagtattggg ccaaatagaa 1860
aacataatgg gccaaacaga ccaaaagaaa gacaacggtg aacgggtcag aacattaaaa 1920
catacatttt ctcgctacaa ttaacgctat caatatattt ataaaaccat ttgtcatttc 1980
acttccttaa etaatcacat aaatgatttt tttttgtgtg tccctacttt ttttatataa 2040
aatttaaacc ggaaagttac attggataaa gctttaacaa tcaaaaacgt gttggatata 2100
tatataagta acaaatttac ttcttttaat aattataata atattacatt aaaatataat 2160
aaagcatatg ttacttttga agaaaactaa ttttggatta aaaatttcac ttttattata 2220
tttaatatgt gatctcaaaa tttataaaag attatcgtca aacaagttta tatcataatt 2280
ttatggtata tatatttatc gtgtgaccat tataatctaa tctatggtgt atatggtata 2340
tatgactaaa ttaccgtatt tggagaagtg aaaatgttgc atcgtcccac gactcttaga 2400
aaatttgtta gtcaaatcat tcttttaatt aaaaatttag atgtaagttt aagtcgtgaa 2460
tttacatcta aaattttaga tttaagtggc gaatttcgca gccaaactat tattttacca 2520
cagacatgca gtgttgaaat ctaaggtagt atgtggattt tttttttggc agcaaaacgt 2580
aaagttaatt tatctttata tatattaaaa tgtaatttat ctttttatac atatatattt 2640
atacacatca tatcataaga catacataca taaatctcta aatatgtaag gggtgtcatc 2700
agttttgcct tctgtttatg gttcactcga tttcacatta attattcact caaattcaca 2760
aaggttattt cgttttcatt agcgcccttt ctctcgactt tcttgatgaa tctttatttc 2820
ttctatgtga aatctaatta agactatttt cgtgttatat tgatgtttaa aaatgaaaat 2880
cttttggttt ttatgtttaa tcattttcat gagtattaaa tgtaatagat ttaagttaaa 2940
actaatatcc gaatgcctga gatattgttt cctaaaatga gatgattgtt tttatttatt 3000
accatgattt gtttgtacta agcttccttt cccctttgca atacatagga tataaattca 3060
tacatgttcc taattttatt tttgcacttg agtttatggt tttctttggt ggaagatcta 3120
tatgtatcta tatctatatt attttactct tttcttcgtc gtcatttata gtatattata 3180
tatatgcaca cacacacaca cctatatgta tagctcaatt ctagataaaa tatatagaaa 3240
tggatcttga gaatcatttt ttttgtattc ttttgttatc aaagggtttc gactttgctc 3300
cgaggaagaa gataatatga aaagagcttt ttagggttta tcattctcct tgactttgca 3360
aaacgtgaaa tgtaaggcac tttgatcgtt gtactttgtt gctttttata cgtatcgctt 3420
cctacaataa gttaacaatg cttcctcgta gaattgcaaa acatttgtgg accgtgattt 3480
acatgactga gctcttttca gtggcttctt tgcagcagct tcttccttgg aggactaatc 3540
= 15.
sekvencepatentln 03072007,ST25
aagacagaaa tctgttcctc taaaaacgat cgccgttcta ggtaatcttg ccattcttga 3600
cgagtcttga tctttagaat caaatttata agggatcacg agatacacgt attaattatt 3660
attttttttt tttttgcttt ttgtggttat acaagttcac tcaaatgatg gtgaaagtta 3720
caaagcttgt ggcttcacgt ccaattgtgg tcttttgcgt cctggtaatt ctgctttctt 3780
tcttctaaat tatacgatga ttctacattt ctactcatct cgttcttgtt tttcaaatga 3840
tataattatt gtgtgtatat cacccattca tgtatattta ttgaaaaata taggcattcc 3900
tggtggttgt tttcgagtgc atttggatct caaattggcg aacaacaacg gagaacctag 3960
tcaaagaggt cgcttcattt accgaagatc tccggacaag tctagtttcg gagattgaaa 4020
acatcggaaa atttacatat gccaagacaa acttatctac gatcggttta gcgagagtta 4080
tagattctta tatcaccaac aacgacactg gttttacaga gattcaaaca caggttgtta 4140
aaactaatta cataaattca attattctta gttattatct taggattagt ttgagttata 4200
taacattaac tataatttta tgttgttgtt gttgttgtta ttattgttct tcagatcgca 4260
ccattgttgt ttgtagctta ttcaacgatc cttcaagtct cacaagtttc gtacatcagt 4320
agggacggtc tcatgttttc ttacattgca gaatcaaaca caagtgtcgc tgtttttgcc 4380
aattcctcgt cgaattcaag tcgtggagac tacacttggt acactcaaac cgtggatcag 4440
ttaactggtc gtcttaacgg gaactcaacg aaatctcagt cgttagatgt aacccataca 4500
gattggttcc aagcagcaca gagtaataac tacactacag cctttgtagg aacgagcttg 4560
ggaggagaag ataacgagac tctaatacag agcgtggtta gcttgtacag caagaaaggt 4620
cttgtttctt tagggtttcc ggttaagact ttaaccgaag ttttgaacag tttgaatcta 4680
cacggcgaag agctttacat gtggacaaag gacgggacgg tgcttgttcg tgaaggttca 4740
ctgaatgatt etttcttcat ctccaatggc tcgatttgct tcggtagaga atcgaactcc 4800
ctctggtctc aatgcatccc tgaaaattgc agttccagtg gctacgaggt ggagatcaaa 4860
agattaagat accaagcttt ttgctctgtt attgaagttt cgggcgttcc tctggtaaat 4920
actgaaacat atttcacttt gatgcagtaa aaatgcatcg acttgttgtt tctcagcttc 4980
ttccaatggt tttttttttg ccagagatac acactcatgt ttcccaacaa aggaggagca 5040
acacgcatca agcaccaagc ggaaaaggca aaatatcaac ttattgtggt tatgatattt 5100
cttggcttcg gttggcctgt atggtttgtg tggtttatga tgcaagcaac aaggagagag 5160
atgcatatgc gtgcaacgct gataaaccaa atggaagcga cacaacaagc tgagagaaag 5220
agcatgaaea agagtcaagc atttgcaaat gctagccacg atattagagg tgcccttgca 5280
gggatgaaag gtctgattga tatatgtcgt gatggagtta aacctggctc cgacgtagac 5340
accactctca accaagtgaa tgtttgcgcc aaggatttgg ttggtaagac tctgtttctt 5400
tagctttctc ttatgcgttt tcttcacttt ctctctaaca gaaaattctt cctcatgttg 5460
ttaaaattac agctctgctc aactctgttt tggacatgag caaaatcgaa agcgggaaga 5520
tgcagttagt ggaagaagat ttcaacttgt cgaaacttct tgaagacgtc atcgattttt 5580
sekvencePatentin 03072007.ST25
accatcccgt tgcgatgaag aaaggggttg atgtagtttt ggatccgcac gatggctcgg 5640
ttttcaaatt ctcgaatgta cgaggggata gtggcagact gaagcagatt ctgaacaatc 5700
ttgttagcaa tgctgtcaag ttcaccgtcg acgggcacat tgcggtaaga gcttgggctc 5760
agaggccagg ttccaatagc tctgtggtcc ttgcatcata tcctaaaggt gtgtccaagt 5820
ttgtaaagag tatgttctgc aagaataaag aagagtcatc aacctacgag acagaaatat 5880
cgaattccat aagaaacaat gcaaacacga tggagtttgt gtttgaagtg gatgatactg 5940
gtaaagggat acctatggag atgcgtaagt cggtatttga aaactatgtt caagtaagag 6000
aaacagctca aggacaccaa ggaactggtt tagggctcgg gattgtgcag tctttggtaa 6060
gctactaaaa cagaacacgt tctttctctt cacaagtaaa tctagatggt tttcatttgt 6120
ggtctattat tataggtaag attaatggga ggggagataa gaatcaccga caaggccatg 6180
ggagagaaag gaacatgttt ccaattcaat gttttattga caacattaga gtctcctcca 6240
gtgagtgaca tgaaagtgag acaggagatc gaagcaggag gcgattatgt atccacgcca 6300
aacctcgggc tgactataaa cacttcactt ggaggtagca tgaatatacg taacctgagt 6360
cctagattca acaactgtct cagctcaagt ccaaagcaag aaggttctag agtggttctt 6420
ctattgaaaa atgaagaacg cagaagagtt acagagaaat acataaagaa tcttgggatt 6480
aaagttacag tggtggagaa atgggagcat ttgagttatg ctttggagag actttttgga 6540
ttttcacctc agagttccat gggaagagca gagtgtagtt tgtcatgtcc gagctcaagg 6600
gagttacctt tcattggcat ggacggtatt gattcaagaa gccaacttcc taaaaggaga 6660
agcatcagtt tctctgcagt tgtccttttg gtgattgatg caaaaactgg accatttttt 6720
gagctgtgcg atattgtcaa acagtttcgt agaggcttgc cccatggaat atcctgtaaa 6780
gttgtttggc ttaacgaatc gagcaetcgt gtaagtgaga gaggggacat tagttgttcg 6840
agacctttgc acggatcgcg tcttatggaa gtcttgaaga tgttgcctga atttggagga 6900
actgtgctaa aagaaccacc tactgagctg caaagggaat cattgctgag acattctttt 6960
gttgcagaga gatcaccaaa acataaagtc caagaagagg ggccaagctc aatgtttaac 7020
aaaaaattag gtaagaggat aatggcatca acagattcag agagtgagac tagggtcaag 7080
tcagtgcgta ccggtcgaaa gcctattggg aacccagagg acgagcaaga gacttccaag 7140
ccgagtgacg atgaattctt aagaggaaag agagttcttg tggtcgatga taactttata 7200
tcacgtaaag ttgcaacagg aaagctgaag aagatgggag tctcagaggt cgaacaatgc 7260
gacagtggga aagaagcttt gagattagtc actgaagggc ttacacaaag agaagaacaa 7320
ggttcagtag ataaacttcc gtttgactac atattcatgg actgccaagt aagtttaatt 7380
gattaacaac ctttcataac acaaaaacaa atagttgagt cctaataagt attaatgttc 7440
tgcacagatg ccagaaatgg atggctatga agcaactaga gagattagga aagtggagaa 7500
aagttatggg gtgcgtacac caattatagc tgtatctggt catgatcctg gttcagagga 7560
agcaagagaa accattcaag ctggaatgga cgccttctta gataaaagct tgaatcaact 7620
- 17 CZ 300145 Β6 sekvencePatentin 03072007,ST25
tgcaaacgtc attagagaaa tcgaaagcaa acgtcactag tattgtataa gtagacagca 7680
cgcagctttg tgctactacc attagtgttt tagacaatac ttttttagta tgacgatgtc 7740
atagcagttt tcttctaagt ttatttaaag tccatttcag atacagaaca catgcactag 7800
tcttaagtcc caaaagatgt aggcaaatga aaccagtgca tcttttatgg gcaacgacac 7860
tgcattgagc taagagaaca aaatggttag atgaactcaa acttcacaga aaaaactgat 7920
tcattatagt tatgagcaga agaaagggtt gcgtcagtaa ctcaaagact ttgattgatt 7980
ttcacttcca aatgttaaaa cttgaacaat agtaataagt aaggacaaaa ctttcacacc 8040
acaaaacgat tatgtgaagt gaataccaga cttgttgaac aaggaaagaa gatacaaaaa 8100
ctcttgttgt gatagctttg aagatctctt ctcctcgaaa ccaccttcct tcaagacatt 8160
cataactttc tccttgaact ctgatgtttc tcctccgtct ccttctccct catccatctc 8220
catatcatcg tcatccattt cgttgtcgtc atcttccatt cccatgctct ggtcaccaag 8280
atccatggag gtggtgttca aagcaggttc tccattgttc tgcaacgaag ctagtacggc 8340
ctgaagagtc ttgaagttct tctccagcat ggaaagaaca gacttttgct tgaaaatgga 8400
tcccaaggtt ttgttctttc tgatgaaaca gactcttaag aacccatccc actccttctt 8460
gttaacctga gggccaggcc tccttggttc gatcctgaca acggaagaat ccacctttgg 8520
aggagggcgg aaattgttct tgccgacttt gaggaggtgg gagactctgg cataaagctg 8580
agtgttgaca gagagacggc agtagagatt gtcaccaggc tgggcaacga gtctcatggc 8640
gaattccctc tggtacatga tgacagcaca tctgaagctt gttggatgga agagaagttt 8700
gaatgtgaga ggagatgata tctgatacgg aatgtttgcc acacatatgt caaacctggg 8760
aagctccgtc ttgagcacat ccccttgaat tacctttaaa agagacaaag tagaacagtc 8820
agcatatgtt ccagtaacca agacacaaga atctatattc caagacaaag ataaatgaat 8880
catcacaatg aatagataga tgctcgaatt caataacaat cgagcagtag agtaccttca 8940
agcggttaga gaagggagtt ccttgaaaac ggcgctgaag ctcgagaacc atacgagagt 9000
caagttcgac ggcgataact tctttgccag cttctagaag cttcttggtc aagtttccag 9060
taccgggacc gatctcgaga atcacatcgg tactcttgat accagctttc tgaacgatcg 9120
aatccacaag cagagggttc ttaaggatat gttgcccttt cgatttgtgg aacgatattc 9180
ctccttggta atggttcgat ggtgctctat tcgaagcctt gggcttctcc ttcctgatct 9240
tgcctcccgc cattgttgct cactttgctt cttcgaaacc tcttacggcc gacggcggga 9300
gaagatgaag atgaagatta gggtttttct ctttactttc tctcagccgt gttttctatt 9360
caacctactc tgtttttatt ttattctttt ctctggtcgg ttttcattta atttaatttt 9420
attacatttc atctcaagta atgtttgttt tcgatttcac aaacctttta aacgaaaata 9480
aaatgttaat 9490
- 18 C/. Jínili ttt) <210> 2 <211> 1122 <212> PRT <213> Arabidopsts ? <400> 2
Met Met 1 Val Lys val 5 Thr Lys Leu Val Ala 10 Ser Arg Pro lle val 15 val
Phe Cys val Leu Ala Phe Leu val Val Val Phe Glu Cys lle Trp Ile
20 25 30
Ser Asn Trp Arg Thr Thr Thr Gl u Asn Leu Val Lys Glu Val Ala Ser
35 40 45
Phe Thr Glu Asp Leu Arg Thr Ser Leu Val Ser Glu Ile Glu Asn Ile
50 55 60
Gly Lys Phe Thr Tyr Ala Lys Thr Asn Leu Ser Thr Ile Gly Leu Ala
65 70 75 80
Arg val ile Asp Ser Tyr ile Thr Asn Asn Asp Thr Gly Phe Thr Glu
85 90 95
ile Gin Thr Gin Ile Ala Pro Leu Leu Phe val Ala Tyr Ser Thr Ile
100 105 110
Leu Gin Val Ser Gin Val Ser Tyr Ile Ser Arg Asp Gly Leu Met Phe
115 120 125
Ser Tyr Ile Ala Gl u Ser Asn Thr Ser val Ala Val Phe Al a Asn Ser
130 135 140
Ser Ser Asn Ser Ser Arg Gly Asp Tyr Thr Trp Tyr Thr Gl n Thr val
145 150 155 160
ASp Gin Leu Thr Gly Arg Leu Asn Gly Asn Ser Thr Lys Ser Gin Ser
165 170 175
Leu Asp val Thr His Thr Asp Trp Phe Gin Ala Ala Gin Ser Asn Asn
180 185 190
Tyr Thr Thr Ala Phe val Gly Thr Ser Leu Gly Gly Glu Asp Asn Glu
195 200 205
Thr Leu Ile Gin Ser Val Val Ser Leu Tyr Ser Lys Lys Gly Leu val
210 215 220
Ser Leu Gly Phe Pro val Lys Thr Leu Thr Glu Val Leu Α5Π Ser Leu
225 230 235 240
Asn Leu His Gly Gl u Glu Leu Tyr Met Trp Thr Lys Asp Gly Thr val
245 250 255 y ν/ >υυι<4> Hh sekvencePatentln 03072007.ST25
Leu Val Arg Glu Gly Ser Leu Asn Asp Ser Phe Phe ile Ser Asn Gly
260 265 270
Ser Ile cys Phe Gly Arg Glu Ser Asn Ser Leu Trp Ser Gin cys Ile
275 280 285
Pro Glu Asn cys ser ser Ser Gly Tyr Glu val Glu ile Lys Arg Leu
290 295 300
Arg Tyr Gin Ala Phe Cys ser Val Ile Glu Val Ser Gly val Pro Leu
305 310 315 320
Arg Tyr Thr Leu Met phe Pro Asn Lys Gly Gly Ala Thr Arg ile Lys
325 330 335
His Gin Ala Glu Lys Ala Lys Tyr Gin Leu Tle val val Met Ile Phe
340 345 350
Leu Gly phe Gly Trp pro val Trp Phe val Trp Phe Met Met Gin Ala
355 360 365
Thr Arg Arg Glu Met His Met Arg Ala Thr Leu Ile Asn Gin Met Glu
370 375 380
Ala Thr Gin Gin Ala Glu Arg Lys Ser Met Asn Lys Ser Gin Ala Phe
385 390 395 400
Ala Asn Ala Ser His Asp ile Arg Gly Ala Leu Ala Gly Met Lys Gly
405 410 415
Leu Ile Asp Ile cys Arg Asp Gly val Lys Pro Gly ser Asp Val Asp
420 425 430
Thr Thr Leu Asn Gin val Asn val Cys Ala Lys Asp Leu Val Ala Leu
435 440 445
Leu Asn Ser val Leu ASp Met Ser Lys Ile Glu Ser Gly Lys Met Gin
450 455 460
Leu Val Glu Gl u A$p Phe Asn Leu ser Lys Leu Leu Glu ASP Val Ile
465 470 475 480
ASp Phe Tyr HiS Pro Val Ala Met Lys Lys Gly val Asp val Val Leu
485 490 495
ASP Pro HIS ASp Gly ser val Phe Lys Phe Ser Asn Val Arg Gly Asp
500 505 510
Ser Gly Arg Leu Lys Gin ile Leu Asn Asn Leu val Ser Asn Ala val
515 520 525
- 20 CZ J(IU145> B6
Lys Phe Thr Val 530 Asp Gly sekvencePatentln 03072007.ST25
His 535 ile Ala val Arg Ala 540 Trp Ala Gin Arg
Pro Gly Ser Asn ser Ser val val Leu Ala Ser Tyr pro Lys Gly Val
545 550 555 560
Ser Lys phe val Lys Ser Met Phe cys Lys Asn Lys Glu Glu ser Ser
565 570 575
Thr Tyr Glu Thr Glu Ile Ser Asn Ser Ile Arg Asn Asn Ala Asn Thr
580 585 590
Met Glu phe val Phe Glu val Asp Asp Thr Gly Lys Gly Ile Pro Met
595 600 605
Glu Met Arg Lys Ser val Phe Glu Asn Tyr val Gin Val Arg Glu Thr
610 615 620
Ala Gin Gly Hi 5 Gin Gly Thr Gl y Leu Gly Leu Gly Ile Val Gl n ser
625 630 635 640
Leu val Arg Leu Met Gly Gly Glu Ile Arg Ile Thr Asp Lys Ala Met
645 650 655
Gly Glu Lys Gly Thr cys Phe Gin Phe Asn Val Leu Leu Thr Thr Leu
660 665 670
Glu Ser Pro pro val Ser ASp Met Lys Val Arg Gin Glu Ile Glu Ala
675 680 685
Gly Gly ASp Tyr Val Ser Thr Pro Asn Leu Gly Leu Thr Ile Asn Thr
690 695 700
Ser Leu Gly Gly Ser Met Asn Ile Arg Asn Leu Ser Pro Arg Phe Asn
705 710 715 720
Α5Π cys Leu Ser Ser Ser Pro Lys Gin Gl u Gly ser Arg val val Leu
725 730 735
Leu Leu Lys Asn Glu Glu Arg Arg Arg val Thr Glu Lys Tyr ile Lys
740 745 750
Asn Leu Gly Ile Lys val Thr Val val Glu Lys Trp Glu Hl S Leu Ser
755 760 765
Tyr Ala Leu Gl u Arg Leu Phe Gly Phe Ser pro Gin Ser Ser Met Gly
770 775 780
Arg Ala Glu cys Ser Leu Ser Cys pro Ser Ser Arg Glu Leu Pro Phe
785 790 795 800
-21 (’Ζ 300145 Β6 sekvencePatentln 03072007.ST25
ile Gly Met Asp Gly Ile Asp Ser Arg Ser Gin Leu Pro Lys Arg Arg
805 810 815
ser ile ser Phe Ser Ala val val Leu Leu val Ile ASp Ala Lys Thr
820 825 830
Gly pro phe Phe Gl u Leu Cys Asp He val Lys Gin Phe Arg Arg Gly
835 840 845
Leu Pro His Gly Ile Ser Cys Lys val Val Trp Leu Asn Glu Ser Ser
850 855 860
Thr Arg Val Ser Glu Arg Gly Asp Ile Ser cys ser Arg Pro Leu His
865 870 875 880
Gly ser Arg Leu Met Glu val Leu Lys Met Leu pro Glu Phe Gly Gly
885 890 895
Thr val Leu Lys Glu Pro Pro Thr Glu Leu Gl n Arg Glu Ser Leu Leu
900 905 910
Arg Hl S Ser Phe Val Al a Glu Arg Ser Pro Lys His Lys val Gin Glu
915 920 925
Glu Gly Pro Ser Ser Met phe Asn Lys Lys Leu Gly Lys Arg ile Met
930 935 940
Ala Ser Thr ASp Ser Gl u Ser Glu Thr Arg val Lys ser val Arg Thr
945 950 955 960
Gly Arg Lys pro Ile Gly Asn Pro Glu ASp Glu Gl n Gl u Thr Ser Lys
965 970 975
Pro ser ASp Asp Glu Phe Leu Arg Gly Lys Arg val Leu Val val Asp
980 985 990
Asp Asn Phe Ile Ser Arg Lys Val Ala Thr Gly Lys Leu Lys Lys Met 995 1000 1005
Gly Val Ser Glu Val Glu Gin Cys Asp Ser Gly Lys Glu Ala Leu 1010 1015 1020
Arg Leu val Thr Glu Gly Leu Thr Gin Arg Glu Glu Gin Gly Ser 1025 1030 1035 val Asp Lys Leu Pro Phe Asp Tyr Ile Phe Met Asp Cys Gin Met 1040 1045 1050
Pro Glu Met Asp Gly Tyr Glu Ala Thr Arg Glu ile Arg Lys Val 1055 1060 1065
sekvencePatentm 03072007 . ST25
Glu Lys Ser Tyr Gly val Arg Thr Pro ile Ile Al a Val ser Gly
1070 1075 1080
HIS ASp pro Gly Ser Glu Glu Al a Arg Glu Thr Ile Gin Al a Gly
1085 1090 1095
Met Asp Ala Phe Leu Asp Lys Ser Leu Asn Gin Leu Ala Asn val
1100 1105 1110
Ile Arg Glu Ile Glu Ser Lys Arg His
1115 1120
<210>3 <211> 3677 <212>DNA <213> Arabidopsis <400>3
aattattcac tcaaattcac aaagggtttc gactttgctc cgaggaagaa gataatatga 60
aaagagcttt ttagggttta tcattctcct tgactttgca aaacgtgaaa taagcttctt 120
ccttggagga ctaatcaaga cagaaatctg ttcctctaaa aacgatcgcc gttctagttc 180
actcaaatga tggtgaaagt tacaaagctt gtggcttcac gtccaattgt ggtcttttgc 240
gtcctggcat tcctggtggt tgttttcgag tgcatttgga tctcaaattg gcgaacaaca 300
acggagaacc tagtcaaaga ggtcgcttca tttaccgaag atctccggac aagtctagtt 360
tcggagattg aaaacatcgg aaaatttaca tatgctaaga caaacttatc tacgatcggt 420
ttagcgagag ttatagattc ttatatcacc aacaacgaca ctggttttac agagattcaa 480
acacagatcg caccattgtt gtttgtagct tattcaacga tccttcaagt ctcaeaagtt 540
tcgtacatca gtagggacgg tctcatgttt tcttacattg cagaatcaaa cacaagtgtc 600
gctgtttttg ccaattcctc gtcgaattca agtcgtggag actacacttg gtacactcaa 660
accgtggatc agttaactgg tcgtcttaac gggaactcaa cgaaatctca gtcgttagat 720
gtaacccata cagattggtt ccaagcagca cagagtaata actacactac agcctttgta 780
ggaacgagct tgggaggaga agataacgag actctaatac agagcgtggt tagcttgtac 840
agcaagaaag gtcttgtttc tttagggttt ccggttaaga ctttaaccga agttttgaac 900
agtttgaatc tacacggcga agagctttac atgtggacaa aggacgggac ggtgcttgtt 960
cgtgaaggtt cactgaatga ttctttcttc atctccaatg gctcgatttg cttcggtaga 1020
gaatcgaact ccctctggtc tcaatgcatc cctgaaaatt gcagttccag tggctacgag 1080
gtggagatca aaagattaag ataccaagct ttttgctctg ttattgaagt ttcgggcgtt 1140
cctctgagat acacactcat gtttcccaac aaaggaggag caacacgcat caagcaccaa 1200
gcggaaaagg caaaatatca acttattgtg gttatgatat ttcttggctt cggttggcct 1260
gtatggtttg tgtggtttat gatgcaagca acaaggagag agatgcatat gcgtgcaacg 1320
ctgataaacc aaatggaagc gacacaacaa gctgagagaa agagcatgaa caagagtcaa 1380
- 73 CZ 300145 B6 sekvencePatentln 03072007.ST25
gcatttgcaa atgctagcca cgatattaga ggtgcccttg cagggatgaa aggtctgatt 1440
gatatatgtc gtgatggagt taaacctggc tccgacgtag acaccactct caaccaagtg 1500
aatgtttgcg ccaaggattt ggttgctctg ctcaactctg ttttggacat gagcaaaatc 1560
gaaagcggga agatgcagtt agtggaagaa gatttcaact tgtcgaaact tcttgaagac 1620
gtcatcgatt tttaccatcc cgttgcgatg aagaaagggg ttgatgtagt tttggatccg 1680
cacgatggct cggttttcaa attctcgaat gtacgagggg atagtggcag actgaagcag 1740
attctgaaca atcttgttag caatgctgtc aagttcaccg tcgacgggca cattgcggta 1800
agagcttggg ctcagaggcc aggttccaat agctctgtgg tccttgcatc atatcctaaa 1860
ggtgtgtcca agtttgtaaa gagtatgttc tgcaagaata aagaagagtc atcaacctac 1920
gagacagaaa tatcgaattc cataagaaac aatgcaaaca cgatggagtt tgtgtttgaa 1980
grggatgata ctggtaaagg gatacctatg gagatgcgta agtcggtatt tgaaaactat 2040
gttcaagtaa gagaaacagc tcaaggacac caaggaactg gtttagggct cgggattgtg 2100
cagtctttgg taagattaat gggaggggag ataagaatca ccgacaaggc catgggagag 2160
aaaggaacat gtttccaatt caatgtttta ttgacaacat tagagtctcc tccagtgagt 2220
gacatgaaag tgagacagga gatcgaagca ggaggcgatt atgtatccac gccaaacctc 2280
gggctgacta taaacacttc acttggaggt agcatgaata tacgtaacct gagtcctaga 2340
ttcaacaact gtctcagctc aagtccaaag caagaaggtt ctagagtggt tcttctattg 2400
aaaaatgaag aacgcagaag agttacagag aaatacataa agaatcttgg gattaaagtt 2460
acagtggtgg agaaatggga gcatttgagt tatgctttgg agagactttt tggattttca 2520
cctcagagtt ccatgggaag agcagagtgt agtttgtcat gtccgagctc aagggagtta 2580
cctttcattg gcatggacgg tattgattca agaagccaac ttcctaaaag gagaagcatc 2640
agtttctctg cagttgtcct tttggtgatt gatgcaaaaa ctggaccatt ttttgagctg 2700
tgcgatattg tcaaacagtt tcgtagaggc ttgccccatg gaatatcctg taaagttgtt 2760
tggcttaacg aatcgagcac tcgtgtaagt gagagagggg acattagttg ttcgagacct 2820
ttgcacggat cgcgtcttat ggaagtcttg aagatgttgc ctgaatttgg aggaactgtg 2880
ctaaaagaac cacctactga gctgcaaagg gaatcattgc tgagacattc ttttgttgca 2940
gagagatcac caaaacataa agtccaagaa gaggggccaa gctcaatgtt taacaaaaaa 3000
ttaggtaaga ggataatggc atcaacagat tcagagagtg agactagggt caagtcagtg 3060
cgtaccggtc gaaagcctat tgggaaccca gaggacgagc aagagacttc caagccgagt 3120
gacgatgaat tcttaagagg aaagagagtt cttgtggtcg atgataactt tatatcacgt 3180
aaagttgcaa caggaaagct gaagaagatg ggagtctcag aggtcgaaca atgcgacagt 3240
gggaaagaag ctttgagatt agtcactgaa gggcttacac aaagagaaga acaaggttca 3300
gtagataaac ttccgtttga ctacatattc atggactgcc aaatgccaga aatggatggc 3360
tatgaagcaa ctagagagat taggaaagtg gagaaaagtt atggggtgcg tacaccaatt 3420
- 24 CZ 41MH4S BC sekvencePatentln 03072007.ST25 atagctgtat ctggtcatga tcctggttca gaggaagcaa gagaaaccat tcaagctgga 3480 atggacgcct tcttagataa aagcttgaat caacttgcaa acgtcattag agaaatcgaa 3540 agcaaacgtc actagtattg tataagtaga cagcacgcag ctttgtgcta ctaccattag 3600 tgttttagac aatacttttt tagtatgacg atgtcatagc agttttcttc taagtttatt 3660
taaagtccat ttcagat 3677
<210> 4 <211> 375 <212> DNA <213> Arabidopsis <400> 4 gcagttgtcc ttttggtgat tgatgcaaaa actggaccat tttttgagct gtgcgatatt 60
gtcaaacagt ttcgtagagg cttgccccat ggaatatcct gtaaagttgt ttggcttaac 120
gaatcgagca ctcgtgtaag tgagagaggg gacattagtt gttcgagacc tttgcacgga 180
tcgcgtctta tggaagtctt gaagatgttg cctgaatttg gaggaactgt gctaaaagaa 240
ccacctactg agctgcaaag ggaatcattg ctgagacatt cttttgttgc agagagatca 300
ccaaaacata aagtccaaga agaggggcca agctcaatgt ttaacaaaaa attaggtaag 360
aggataatgg catca 375
io <2lO>5 <211> 1809 <212> DNA <213> Arabidopsis <400>5
atgttacgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60
ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120
gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180
cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240
ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300
aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 360
tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg 420
cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac 480
ttccatgatt tctttaacta tgccgggatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg 540
aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg 600
tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg tgatgcggat 660
caacaggtgg ttgcaactgg acaaggcact agcgggactt tgcaagtggt gaatccgcac 720
ctctggcaac cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa aagccagaca 780
gagtgtgata tctacccgct tcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag 840
ttcctgatta accacaaacc gttctacttt actggctttg gtcgtcatga agatgcggac 900
CZ 5»υΐ4ϊ» B6 sekvencePatentln 03072007.ST25
ttacgtggca aaggattcga taacgtgctg atggtgcacg accacgcatt aatggactgg 960
atrggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat gctcgactgg 1020
gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt taacctctct 1080
ttaggcattg gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac tgtacagcga agaggcagtc 1140
aacggggaaa ctcagcaagc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc gcgtgacaaa 1200
aaccacccaa gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg tccgcaagtg 1260
cacgggaata tttcgccact ggcggaagca acgcgtaaac tcgacccgac gcgtccgatc 1320
acctgcgtca atgtaatgtt ctgcgacgct cacaccgata ccatcagcga tctctttgat 1380
gtgctgtgcc tgaaccgtta ttacggatgg tatgtccaaa gcggcgattt ggaaacggca 1440
gagaaggtac tggaaaaaga acttctggcc tggcaggaga aactgcatca gccgattatc 1500
atcaccgaat acggcgtgga tacgttagcc gggctgcact caatgtacac cgacatgtgg 1560
agtgaagagt atcagtgtgc atggctggat atgtatcacc gcgtctttga tcgcgtcagc 1620
gccgtcgtcg gtgaacaggt atggaatttc gccgattttg cgacctcgca aggcatattg 1680
cgcgttggcg gtaacaagaa agggatcttc actcgcgacc gcaaaccgaa gtcggcggct 1740
tttctgctgc aaaaacgctg gactggcatg aacttcggtg aaaaaccgca gcagggaggc 1800
aaacaatga 1809
<210> 6 <211> 920 <212> DNA <213> Arabidopsis <400>6
ctctacacca cgccgaacac ctgggtggac gatatcaccg tggtgacgca tgtcgcgcaa 60
gactgtaacc acgcgtctgt tgactggcag gtggtggcca atggtgatgt cagcgttgaa 120
ctgcgtgatg cggatcaaca ggtggttgca actggacaag gcactagcgg gactttgcaa 180
gtggtgaatc cgcacctctg gcaaccgggt gaaggttatc tctatgaact gtgcgtcaca 240
gccaaaagcc agacagagtg tgatatctac ccgcttcgcg tcggcatccg gtcagtggca 300
gtgaagggcg aacagttcct gattaaccac aaaccgttct actttactgg ctttggtcgt 360
catgaagatg cggacttacg tggcaaagga ttcgataacg tgctgatggt gcacgaccac 420
gcattaatgg actggattgg ggccaactcc taccgtacct cgcattaccc ttacgctgaa 480
gagatgctcg actgggcaga tgaacatggc atcgtggtga ttgatgaaac tgctgctgtc 540
ggctttaacc tctctttagg cattggtttc gaagcgggca acaagccgaa agaactgtac 600
agcgaagagg cagtcaaegg ggaaactcag caagcgcact tacaggcgat taaagagctg 660
atagcgcgtg acaaaaacca cccaagcgtg gtgatgtgga gtattgccaa cgaaccggat 720
acccgtccgc aagtgcacgg gaatatttcg ccactggcgg aagcaacgcg taaactcgac 780
ccgacgcgtc cgatcacctg cgtcaatgta atgttctgcg acgctcacac cgataccatc 840
-26CZ 300145 B6 sekvencePatentln 03072007.ST25 agcgatctct ttgatgtgct gtgcctgaac cgttattacg gatggtatgt ccaaagcggc 900 gatttggaaa cggcagagaa 920 <210> 7 <211> 2636 <212> DNA <213> modified <400>7
gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag 60
ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgaattcga 120
gctcggtacc caacatggtg gagcacgaca ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata 180
cagtctcaga agaccagagg gctattgaga cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc 240
tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc acttcatcga aaggacagta gaaaaggaag 300
atggcttcta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctcta 360
ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggaa catcgtggaa aaagaagacg 420
ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg 480
acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 540
tggagaggac ctcgagggga tcagcttatc gataccgtcg actgatgcca ttatcctctt 600
acctaatttt ttgttaaaca ttgagcttgg cccctcttct tggactttat gttttggtga 660
tctctctgca acaaaagaat gtctcagcaa tgattccctt tgcagctcag taggtggttc 720
ttttagcaca gttcctccaa attcaggcaa catcttcaag acttccataa gacgcgatcc 780
gtgcaaaggt ctcgaacaac taatgtcccc tctctcactt acacgagtgc tcgattcgtt 840
aagccaaaca actttacagg atattccatg gggcaagcct ctacgaaact gtttgacaat 900
atcgcacagc tcaaaaaatg gtccagtttt tgcatcaatc accaaaagga caactgcaag 960
cttggatccc tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt ggtgacgcat 1020
gtcgcgcaag actgtaacca cgcgtctgtt gactggcagg tggtggccaa tggtgatgtc 1080
agcgttgaac tgcgtgatgc ggatcaacag gtggttgcaa ctggacaagg cactagcggg 1140
actttgcaag tggtgaatcc gcacctctgg caaccgggtg aaggttatct ctatgaactg 1200
tgcgtcacag ccaaaagcca gacagagtgt gatatctacc cgcttcgcgt cggcatccgg 1260
tcagtggcag tgaagggcga acagttcctg attaaccaca aaccgttcta ctttactggc 1320
tttggtcgtc atgaagatgc ggacttacgt ggcaaaggat tcgataacgt gctgatggtg 1380
cacgaccacg cattaatgga ctggattggg gccaactcct accgtacctc gcattaccct 1440
tacgctgaag agatgctcga ctgggcagat gaacatggca tcgtggtgat tgatgaaact 1500
gctgctgtcg gctttaacct ctctttaggc attggtttcg aagcgggcaa caagccgaaa 1560
gaactgtaca gcgaagaggc agtcaacggg gaaactcagc aagcgcactt acaggcgatt 1620
aaagagctga tagcgcgtga caaaaaccac ccaagcgtgg tgatgtggag tattgccaac 1680
gaaccggata cccgtccgca agtgcacggg aatatttcgc cactggcgga agcaacgcgt 1740
-27CZ 51HJI45 Bft sekvencePatentln 03072007.ST25
aaactcgacc cgacgcgtcc gatcacctgc gtcaatgtaa tgttctgcga cgctcacacc 1800
gataccatca gegatetett tgatgtgctg tgcctgaacc gttattacgg atggtatgtc 1860
caaagcggcg atttggaaac ggcagagaaa agettgeagt tgtccttttg gtgattgatg 1920
caaaaactgg accatttttt gagctgtgcg atattgtcaa acagtttcgt agaggcttgc 1980
cccatggaat atcctgtaaa gttgtttggc ttaacgaatc gagcactcgt gtaagtgaga 2040
gaggggacat tagttgttcg agacctttgc acggatcgcg tcttatggaa gtcttgaaga 2100
tgttgcctga atttggagga actgtgctaa aagaaccacc tactgagctg caaagggaat 2160
cattgctgag acattctttt gttgeagaga gatcaccaaa acataaagtc caagaagagg 2220
ggccaagctc aatgtttaac aaaaaattag gtaagaggat aatggcatca gtcgactaga 2280
gtccgcaaaa atcaccagtc tctctctaca aatetatete tctctatttt tctccagaat 2340
aatgtgtgag tagttcccag ataagggaat tagggttctt atagggtttc gctcatgtgt 2400
tgageatata agaaaccctt agtatgtatt tgtatttgta aaatacttct atcaataaaa 2460
tttctaattc ctaaaaccaa aatccagtga cctcgacctc gagggggggc cccgagcttg 2520
gatcagattg tccgtttccc gccttcggtt taaactatca gtggtttgac aggatatatt 2580
ggccgggtaa acctaaaaga aagagcgttt attagaataa tccggatatt ttaaaa 2636
S

Claims (15)

1. Způsob regulace tvorby biomasy v rostlině, vyznačený t í m . že se v rostlině identilili) kuje gen CKíl nebo jeho homolog nebo ortolog a sníží nebo zcela eliminuje se exprese genu
CKli nebo jeho homologu nebo ortologu nebo aktivita genového produktu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačený t í ni. že identifikace homologu nebo ortologu genu CKli v rostlinném druhu zahrnuje následující kroky:
iš i) zjištění sekvenční homologie na úrovni nukleotidu nebo aminokyselin, ii) prokázání histidinkinázové aktivity genového produktu zkoumaného genu, iii) zjištění exprese homologu nebo ortologu ve vaskulámích pletivech nebo pletivech sousedících s vaskulárními pletivy daného rostlinného druhu,
20
3. Způsob podle nároku 2, vyznačený t í m , že krok i) se provádí vyhledáváním v genomovýeh databázích sekvencí podobných konzervovaným oblastem reeeptorových hislidinkináz, získaných srovnáváním dosud identifikovaných homologu CKli nebo experimentálně pomocí hybridizace genomové knihovny nebo cDNA knihovny příslušného druhu se sondou získanou z genomové DNA nebo cDNA CKli nebo některého z jeho již identifikovaných homologu, např.
25 genů AllK2, AHK3 nebozíΗK4C'KK//íVOL.
4. Způsob podle nároku 2, vyznačeny tím, že krok ii) se provádí prostřednictvím exprese genu v heterologním nebo homologním expresním systému a následnou analýzou jeho aktivity.
V)
- 28 CZ 300145 B6
5 pak vloží pod kontrolu vhodného promotoru.
5' - TTC CAA GCT T - 3' a prostřednictvím štěpení restrikčními cndonuklázami BamHI, H indií I, Xbal a Sall a spojením výsledných fragmentů ligázou se tyto tři části spojí do jednoho výsledného konstruktu, který se
5' “ CAG CGG ATC C - 3'
LOOPdown:
IlindlH
5' konec těchto primerů.
- CZ 300145 B6
LOOPup:
BamHI
5' ~ CAC TTC TAG A - 3' dále se amplifikuje spojovací sekvence pomocí primeru sestávajících z 18 21 nukleotidu specifických pro danou spojovací sekvenci a sekvencí LOOPup a LOOP down, vložených na
5' - TAT AGG ATC CAA GCT T - 3'
RNAi down:
\lml
5, Způsob podle nároku 2, vyznačený t í m , že krok ii) se provádí prostřednictvím komplementace bakteriálních, kvasinkových nebo rostlinných mutantú v genech pro receptorové histidinkinázy pomocí kódující sekvence homo logu nebo ortologu, vložené pod kontrolu promotoru příslušného genu a v příslušném mutantním pozadí.
6. Způsob podle nároku 2, vyznačený t í m , že krok ii) se provádí prostřednictvím analýzy aktivity genového produktu v přenosu eytokininového signálu v rostlinných protoplastech.
7* Způsob podle nároku 1, vyznačený t í m , že se exprese genu CKH nebo jeho homoio logu nebo ortologu sníží RNA interferencí.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačený t í m , že se konstrukt pro RNA interferenci připraví vložením rekombinantní DNA, obsahující části sekvence cDNA homologu nebo ortologu v obrácené repetici, oddělené sekvencí jiné DNA, s výhodou částí kódující sekvence uidA nebo
15 přirozeného inlronu homologu nebo ortologu CKfl, pod kontrolu konstitutivně aktivního promotoru nebo kondicionálně aktivního promotoru a ukončí terminátorem transkripce.
9. Způsob podle nároku 1, vyznačený t í m , že se exprese genu CKl 1 nebo jeho homologu nebo ortologu sníží inzerční mutagenezí.
10. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se aktivita genového produktu změní místně řízenou mutagenezí.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačený t í ni, že se mutace provede v tripletu kódujícím
25 vybranou aminokyselinu, s výhodou aminokyselinu podílející se na přenosu fosfátu příslušnou receptorovou hislidinkinázou, na potenciálních interakcích s regulačními proteiny nebo aminokyselinu s regulační funkcí.
12. Způsob podle nároku 11, vyznačený t í m , že se mutací provede záměna v tripletu
3o kódujícím aminokyselinu histidin v poloze odpovídající poloze 405 vCKIl (H405) nebo kyselinu asparagovou v poloze odpovídající poloze 1050 (Dl050) v CKI1.
13. Způsob podle nároku 1, vy zna éený t í m , že navíc zahrnuje krok analýzy fenotypu vývoje vaskulámích pletiv, zahrnující histologieké barvení řezů živých rostlin směsí oranže GG a
35 anilinové modři a analýzu barvených řezů DIC nebo fluorescenční mikroskopií.
14. Způsob přípravy rekombinantní DNA pro regulaci exprese genu prostřednictvím RNA interference, vyznačený t í ni, že se amplifikuje specifická část cDNA nebo kódující oblasti daného umlčovaného genu pomocí primeru, obsahujících kromě sekvence 18 až 21 nukleotidů
4o specifických pro cDNA nebo kódující sekvenci daného genu i oblasti vložené na 5' konec těchto primerů, označené RNA i up a RNAi down,
RNAi up:
BamHl Ihndlll
15. Způsob podle nároku 14. kde spojovací sekvencí je část GUSp (sekvence 6) kódující sekvence genu uidA (sekvence 5), která se amplitlkuje pomocí primerň Bgus a Hgus.
CZ20070454A 2007-07-04 2007-07-04 Zpusob regulace tvorby biomasy v rostlinách CZ300145B6 (cs)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20070454A CZ300145B6 (cs) 2007-07-04 2007-07-04 Zpusob regulace tvorby biomasy v rostlinách
KR1020080038610A KR20090004459A (ko) 2007-07-04 2008-04-25 식물에서의 바이오매스 생산 조절 방법
PCT/CZ2008/000075 WO2009003429A2 (en) 2007-07-04 2008-07-02 Method of regulation of biomass production in plants, dna sequences and method of preparation thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20070454A CZ300145B6 (cs) 2007-07-04 2007-07-04 Zpusob regulace tvorby biomasy v rostlinách

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2007454A3 CZ2007454A3 (cs) 2009-01-14
CZ300145B6 true CZ300145B6 (cs) 2009-02-25

Family

ID=40227451

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20070454A CZ300145B6 (cs) 2007-07-04 2007-07-04 Zpusob regulace tvorby biomasy v rostlinách

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20090004459A (cs)
CZ (1) CZ300145B6 (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ306073B6 (cs) * 2013-12-27 2016-07-27 Masarykova Univerzita Způsob ovlivnění lignifikace v rostlinách

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002099079A2 (en) * 2001-06-06 2002-12-12 The General Hospital Corporation Cytokinin response regulators and uses thereof
WO2007003317A2 (en) * 2005-07-06 2007-01-11 Freie Universität Berlin Transgenic plant with tissue-selectively reduced cytokinin-receptor activity

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002099079A2 (en) * 2001-06-06 2002-12-12 The General Hospital Corporation Cytokinin response regulators and uses thereof
WO2007003317A2 (en) * 2005-07-06 2007-01-11 Freie Universität Berlin Transgenic plant with tissue-selectively reduced cytokinin-receptor activity

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Higuchi M. et al.: "In planta functions of the Arabidopsis cytokinin receptor family", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 101(23), 8821û8826, 2004 *
Nishimura C. et al.: "Histidine Kinase Homologs That Act as Cytokinin Receptors Possess Overlapping Functions in the Regulation of Shoot and Root Growth in Arabidopsis", The Plant Cell Vol. 16, 1365-1377, 2004 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ306073B6 (cs) * 2013-12-27 2016-07-27 Masarykova Univerzita Způsob ovlivnění lignifikace v rostlinách

Also Published As

Publication number Publication date
CZ2007454A3 (cs) 2009-01-14
KR20090004459A (ko) 2009-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107827964B (zh) 一种与植物耐逆性相关的转录因子PwNAC2及其编码基因与应用
CN110904071B (zh) Raf49蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用
CN111206041A (zh) OsBAK1P基因在控制水稻抗旱性中的应用
CN102485897A (zh) 利用棉花基因GbF3H改变花瓣颜色
CN112779234B (zh) 毛竹PeAPX5基因及应用
EP2044201B1 (en) A mutant histidine kinase that confers spontaneous nodulation in plants
CN114231539B (zh) 柳枝稷SBP-box类转录因子PvSPL6的应用及其重组载体
CN114214358B (zh) 一种诱导型表达载体及其在培育哨兵作物上的应用
CN108795943A (zh) 一种植物特异表达启动子POssalt2及其应用
KR20130141261A (ko) 유전자를 이용하여 벼의 분얼과 뿌리생장을 조절하는 방법
KR100860199B1 (ko) ＭＡＤＳ―Ｂｏｘ 유전자를 이용한 수형이 변형된과수작물의 제조
CN114085854B (zh) 一种水稻抗旱、耐盐基因OsSKL2及其应用
CN109748960A (zh) 调控抗铝毒转录因子stop1蛋白的基因及其应用
CN111499712B (zh) 烟草NtDREB-1BL2转录因子及其应用
CN114292862A (zh) OsCEN2基因在调控水稻种子萌发速率中的应用
CZ300145B6 (cs) Zpusob regulace tvorby biomasy v rostlinách
WO2009003429A2 (en) Method of regulation of biomass production in plants, dna sequences and method of preparation thereof
CN107384953B (zh) 拟南芥糖基转移酶ugt84a2在调节植物开花时间中的应用
CN112813097A (zh) 一种调控水稻耐盐性的方法
CN109750008B (zh) 陆地棉光信号途径调节因子GhCOP1及其应用
CN113416747B (zh) 一种创建温度敏感型雄性不育植物的方法
CN114015666B (zh) OsPARP3基因在调控植物耐旱性中的应用
CN112501147B (zh) 一种普通野生稻粒型相关编码基因及其应用
CN116536286B (zh) 水稻OsCTK1蛋白及其编码基因的应用
CN117210490B (zh) 一种调控苹果属植物自花结实的pchr基因及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20150704