CN109750008B

CN109750008B - 陆地棉光信号途径调节因子GhCOP1及其应用

Info

Publication number: CN109750008B
Application number: CN201711065133.7A
Authority: CN
Inventors: 李建平; 刘海峰; 郝晓燕; 足木热木; 黄全生; 宋武; 高升旗; 罗城; 常晓春; 何志刚; 陈文钢; 汤寿伍
Original assignee: China Colored Cotton Group Co ltd; Xinjiang Color Cotton Engineering Technology Research Institute Co ltd; Institute Of Nuclear Technology And Biotechnology Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: China Colored Cotton Group Co ltd; Xinjiang Color Cotton Engineering Technology Research Institute Co ltd; Institute Of Nuclear Technology And Biotechnology Xinjiang Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-11-02
Filing date: 2017-11-02
Publication date: 2023-12-19
Anticipated expiration: 2037-11-02
Also published as: CN109750008A

Abstract

本发明提供了一种陆地棉光信号途径调节因子GhCOP1及其应用，具体地，本发明通过抑制GhCOP1基因或其编码蛋白的表达或活性，植物(如棉属植物)下胚轴和/或主茎伸长生长受到明显抑制，表现为下胚轴和/或主茎长度变短。

Description

陆地棉光信号途径调节因子GhCOP1及其应用

技术领域

本发明涉及植物学领域，具体地，涉及陆地棉光信号途径调节因子GhCOP1及其应用。

背景技术

植物在长期进化的过程中形成了精细、完善的光信号转导***，通过这套***，植物可以感受光的有无、方向、光质、光强以及光周期节律，以便植物更好地适应环境。植物接收光信号主要是由光受体(photoreceptor)来实现的。目前已知至少存在4类光受体：光敏色素(phytochrome，PHY)、隐花色素(cryptochrome，CRY)、向光素(phototropin，PHOTO)及UV-B光受体(UV-B photoreceptor)。其中，光敏色素主要吸收红光以及远红光；隐花色素主要吸收蓝光和UV-A；UV-B光受体主要吸收UV-B。通过光受体，光信号参与调节植物生长发育的各个过程。

在光受体介导的光信号转导途径中存在一个非常重要的光形态建成负向调节因子---COP1(Constitutively photomorphogenic 1)。COP1是调控光调控植物发育的一个分子开关。作为一个E3连接酶，它通过调控光信号途径中的正向因子的降解来负向调控光形态建成。COP1蛋白由三个结构域组成：N端的RING-finger、中间的coiled-coil和C端的WD-repeat，其中WD-repeat是COP1的关键功能部位，对其功能有重大影响。

已有的研究表明，COP1可以泛素化PHYA、PHYB、CRY2这些光受体来抑制光形态建成，此外，COP1也可以泛素化光信号转导的下游转录因子HY5，HYH，HFR1和LAF1，来抑制光形态建成。同时COP1在黑暗下可以稳定光形态建成的负向调控因子PIF3，因此，在植物的光形态建成过程中起重要作用。

本领域迫切需要开发促进植物下胚轴和/或主茎长度缩短的方法，并研究下胚轴和/或主茎长度缩短与植物(如棉花)产量和品质的相关性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进植物下胚轴和/或主茎长度缩短的方法，并研究下胚轴和/或主茎长度缩短与植物(如棉花)产量和品质的相关性。

本发明第一方面提供了一种GhCOP1基因或其编码蛋白抑制剂的用途，所述GhCOP1基因或其编码蛋白的抑制剂用于选自下组的一种或多种用途：

(a)用于制备促进植物下胚轴缩短的试剂或组合物；

(b)用于促进植物下胚轴缩短；

(c)用于制备促进植物主茎长度缩短的试剂或组合物；

(d)用于促进植物主茎长度缩短。

在另一优选例中，所述GhCOP1基因或其编码蛋白抑制剂为促进GhCOP1基因沉默或抑制其GhCOP1基因或其编码蛋白表达的抑制剂。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：锦葵科、十字花科植物、或其组合。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：棉花、拟南芥、或其组合。

在另一优选例中，所述GhCOP1基因包括GhCOP1蛋白编码基因和GhCOP1基因保守区序列。

在另一优选例中，所述GhCOP1基因包括野生型GhCOP1基因和突变型GhCOP1基因。

在另一优选例中，所述的突变型包括突变后编码蛋白的功能未发生改变的突变形式(即功能与野生型编码蛋白相同或基本相同)。

在另一优选例中，所述的突变型GhCOP1基因编码的多肽与野生型GhCOP1基因所编码的多肽相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的突变型GhCOP1基因包括与野生型GhCOP1基因相比，同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％)的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的突变型GhCOP1基因包括在野生型GhCOP1基因的5＇端和/或3＇端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的基因包括基因组DNA、cDNA、和/或mRNA。

在另一优选例中，所述GhCOP1基因的氨基酸序列选自下组：

(i)具有SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述缩短植物下胚轴、和/或促进植物主茎长度缩短功能的、由(i)衍生的多肽；或(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％，更佳地，＞99％)，具有所述GhCOP1活性的多肽。

在另一优选例中，所述GhCOP1基因的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO.:2所示多肽的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示序列的同源性≥80％(较佳地≥85％，更佳地≥90％，更佳地，≥95％，更佳地，≥98％，更佳地，≥99％)的多核苷酸；

(d)在SEQ ID NO.:1所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的GhCOP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述的GhCOP1基因的编码蛋白如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述的GhCOP1基因来源于植物，较佳地来源于锦葵科植物，更佳地来源于棉花，最佳地来源于陆地棉。

在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：cDNA、dsRNA、siRNA、RISC(RNA-inducedsilencing complex，RNA诱导的沉默复合体)、小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、shRNA、Crispr试剂、或其组合。

在另一优选例中，所述的组合物包括农用组合物。

本发明第二方面提供了一种促进植物下胚轴缩短的方法，所述方法包括以下步骤：抑制GhCOP1基因或其编码蛋白的表达或活性。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：锦葵科植物、十字花科植物、或其组合。

在另一优选例中，所述方法包括给予植物GhCOP1基因或其编码蛋白的抑制剂。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(a)提供携带GhCOP1基因表达载体的农杆菌；

(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使GhCOP1的基因序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(c)选择已转入GhCOP1基因序列的植物细胞或组织或器官；(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生为植株。

本发明第三方面提供了一种促进植物主茎长度缩短的方法，所述方法包括以下步骤：抑制GhCOP1基因或其编码蛋白的表达或活性。

在另一优选例中，所述抑制GhCOP1基因或其编码蛋白的表达或活性包括促进GhCOP1基因沉默或抑制其GhCOP1基因或其编码蛋白表达。

在另一优选例中，所述方法包括给予。植物GhCOP1基因或其编码的多肽的抑制剂。

在另一优选例中，所述方法包括给予促进GhCOP1基因沉默或抑制其编码蛋白表达的试剂或组合物。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(a)提供携带GhCOP1基因序列的表达载体的农杆菌；

(c)选择已转入GhCOP1基因序列的植物细胞或组织或器官；-

(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生为植株。

本发明第四方面提供了一种改良植物性状的方法，包括步骤：

(a)将外源的构建物导入植物细胞，其中所述的构建物含有抑制GhCOP1编码蛋白的核苷酸序列，从而获得导入外源构建物的植物细胞；

(b)将上一步骤获得的所述导入外源构建物的植物细胞，再生成植株：

(c)任选地对所述再生的植株进行性状鉴定，从而获得性状改良的植物。

在另一优选例中，所述的性状改良包括选自下组的一种或多种改良的性状：

(1)下胚轴缩短；

(2)主茎长度缩短。

本发明第五方面提供了一种改良植物性状的方法，包括步骤：

降低所述植物中GhCOP1基因或其编码蛋白的表达量或活性，从而改良植物的性状。

在另一优选例中，所述的改良植物的性状包括选自下组的一种或多种改良的性状：

(1)下胚轴缩短；

(2)主茎长度缩短。

本发明第六方面提供了一种筛选植物下胚轴和/或主茎长度缩短促进剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a)将待测物质给予某植物；

b)检测该植物中GhCOP1基因或其编码蛋白的活性或表达情况；

如果与未给予待测物质的对照植物相比，所述GhCOP1基因或其编码蛋白的活性或表达下调，则所述待测物质是下胚轴和/或主茎长度缩短促进剂。

本发明第七方面提供了一种分离的植物光信号途径相关蛋白，所述蛋白具有促进植物下胚轴和/主茎长度的功能，并且所述的蛋白选自下组：

(i)SEQ ID NO.:2所示的多肽；

(ii)将如SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有促进植物下胚轴和/主茎长度的功能的，由(i)衍生的多肽；或

(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的同源性＞99％，具有促进植物下胚轴和/主茎长度的功能的多肽。

在另一优选例中，所述的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

本发明第八方面提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含一核苷酸序列，所述核苷酸序列编码本发明第七方面所述的蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸的序列选自下组的一种:

(A)编码如SEQ ID NO.:2所示蛋白的多核苷酸；

(B)序列如SEQ ID NO.:1所示的多核苷酸；

(E)与(A)-(D)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的多核苷酸为基因组序列或cDNA序列。

本发明第九方面提供了一种载体，所述载体含有本发明第八方面所述的多核苷酸。

本发明第十发面提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第九方面所述的载体或基因组中整合有本发明第八方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：植物细胞、原核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括锦葵科植物细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括棉属植物细胞。

本发明第十一方面提供了一种制备本发明第七方面所述蛋白的方法，所述方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明第十发面所述的宿主细胞；和

(b)从培养物中分离出本发明第七方面所述的蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A为转化植株和野生型拟南芥在白光下生长7天后的光形态建成表型，图1B为转化植株和野生型拟南芥下胚轴长度统计结果。

图2A为利用VIGS技术诱导陆地棉TM-1内源GhCOP1基因沉默后，基因沉默植株与正常植株表型；图2B为TM-1正常对照与GhCOP1基因沉默植株mRNA转录水平表达分析结果。

图3陆地棉幼苗下胚轴和成株主茎长度测量数据统计结果。

具体实施方式

经过广泛而深入的研究，本发明人意外的发现，抑制GhCOP1基因或其编码蛋白的表达或活性，可显著缩短植物(如棉属植物)下胚轴和/或主茎长度。在此基础上，本发明人完成了本发明。

GhCOP1基因

如本文所用，术语“GhCOP1基因”、“光信号途径相关基因”、“本发明基因”可以互换使用，都是指本发明的具有缩短植物(如棉属植物)下胚轴和/或主茎长度的基因。

COP1蛋白是调控光调控植物发育的一个分子开关。作为一个E3连接酶，它通过调控光信号途径中的正向因子的降解来负向调控光形态建成。

本发明从陆地棉TM-1(Gossypium hirsutum TM-1)分离克隆一个光受体途径调节因子的cDNA片段，将其构建至植物表达载体，通过农杆菌浸花法转化至拟南芥中过表达，转基因拟南芥相对于野生型对照光形态建成表型减弱；通过序列分析选取该基因保守区序列构建VIGS载体，通过VIGS技术体系转化陆地棉后引发陆地棉内源GhCOP1基因发生基因沉默，基因沉默陆地棉幼苗下胚轴及成株主茎长度与对照相比显著降低。发明人将该基因命名为GhCOP1基因。

针对棉花GhCOP1基因，发明人进行了如下研究：

GhCOP1基因的克隆：可以采用RT-PCR扩增法、RACE-PCR或探针法等多种方法来获得GhCOP1基因核苷酸全长序列或其部分片段。比如，基于其他物种COP1基因保守序列设计多核苷酸引物使用RACE-PCR方法直接从cDNA或基因组中扩增出序列，将扩增得到的cDNA序列连接至克隆载体并测序，得到正确的GhCOP1基因。

以GhCOP1基因为目的基因，可以构建至任何植物双源表达载体中。比如pEarleyGate203上，其中包含花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，N-末端myc标签序列，C-末端为polyA nos终止子，及能够在真核生物中作为筛选标记使用的卡那霉素编码序列。植物表达载体中启动子可以是任何一种组成型启动子、组织特异性启动子或环境诱导型启动子，如35S启动子或GhCOP1本源启动子等。载体中应具有特定标签序列如GUS、GFP或Myc基因等用于区别内源和外源基因的蛋白标签编码序列；还应具有作为筛选标记的抗生素基因如卡那霉素、除草剂等编码序列。

含有GhCOP1基因片段的植物双元表达载体可以转入到一种细胞或生物体内，如细菌、酵母或植物细胞中并进行鉴定，如可将本发明得到的基因构建至植物表达载体pEarleyGate203中，利用该领域常用方法如农杆菌浸花法或基因枪法将目的基因转化至拟南芥、烟草、水稻等物种中，将转化后得到的后代种子进行抗性压力筛选如直接对转基因后代幼苗喷施抗生素溶液或播种在含有抗生素如卡那霉素的MS固体培养基上，筛选能够存活并生长的幼苗，筛选得到转基因阳性植株，通过不断地抗性压力筛选及DNA PCR鉴定，最终得到转基因纯合体并鉴定转基因后代表型。转化受体可以是单子叶植物也可以是双子叶植物，如：拟南芥、烟草、水稻、棉花、大豆等。本发明的基因对于定向培育植物新品种，改善植物生长状态，调节开花期，植物株型、提高农作物产量等具有很重要的意义。

病毒诱导的基因沉默(Virus-Induced gene si lencing，VIGS)是通过特异性核酸序列抑制目的基因的表达。当病毒载体携带目的基因片段进入植物体内目的基因的mRNA就会被降解，植物就会表现出功能缺失症状，从而便于研究和了解基因的功能。

本发明所得重组载体可作基因工程资源用于科研、农业、商业领域，进行辅助其他基因资源发掘或培育优良农艺性状的农作物新品种。

本发明的GhCOP1基因可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。本发明的DNA可以是单链的或是双链的，DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:2的蛋白质，但与SEQ ID NO.:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO.:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码棉纤维/植物细胞长度相关多肽的多聚核苷酸。

GhCOP1基因编码的多肽

如本文所用，术语“GhCOP1多肽”、“GhCOP1蛋白”、“光信号途径相关蛋白”、“本发明蛋白”、“GhCOP1基因编码的蛋白”可以互换使用，都是指本发明的具有促进植物下胚轴和/或主茎长度缩短的蛋白。

在一优选例中，本发明蛋白来源于棉花(如陆地棉)。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括GhCOP1多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然GhCOP1多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在优选例中，本发明多肽指具有调控棉纤维/植物细胞长度功能的SEQ ID NO.:2序列的多肽。还包括具有与GhCOP1多肽相同功能的、SEQ ID NO.:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括GhCOP1多肽的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与GhCOP1多肽的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗GhCOP1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含GhCOP1多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了GhCOP1多肽的可溶性片段。通常，该片段具有GhCOP1多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供GhCOP1多肽或其类似物。这些类似物与天然GhCOP1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“GhCOP1多肽保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异多肽最好根据下表进行氨基酸替换而产生。

棉花

棉花是锦葵目(Malvales)锦葵科(Malvaceae)棉属(Gossypium)植物的种子纤维，原产于亚热带。植株灌木状，在热带地区栽培可长到6米高，一般为1到2米。花朵乳白色，开花后不久转成深红色然后凋谢，留下绿色小型的蒴果，称为棉铃。棉铃内有棉籽，棉籽上的茸毛从棉籽表皮长出，塞满棉铃内部。

下胚轴为高等植物的胚性器官，从子叶着生处以下生出的最初茎的部分，下边经过茎根过渡区与幼根相连。下胚轴的生长对棉花种子的子叶出土有很大的帮助。下胚轴的长短暗示着棉花在早期生长发育时期光形态建成的强弱，下胚轴短而粗壮有利于子叶出土从而进行光形态建成，提高棉花的成活率，进而促进棉花真叶及主茎的生长。当棉花长出真叶及主茎后，子叶迅速老化丧失功能，下胚发育为主茎，成为联系植物根、叶，输导水分、无机盐和有机物的营养器官。棉花的生长发育包括茎的生长发育受光、温、水、肥等的影响，当上述条件不利于棉花生长时，主茎表现主茎发育迟缓，为直径较小，主茎长度过短或过长，引起棉花株形改变，最终导致棉花发育期和产量发生改变。同时，主茎的生长受不同地理位置例如经纬度、种植地区的气候条件影响其长度有较大差异，进而造成不同地区的棉花品种在株形、发育期长短、棉铃数量、棉花产量存在较大差异。例如，长江流域地区的棉花多为中晚熟，主茎高，株形分散，产量较低。而作为棉花主产区的新疆，受地理及气候条件的影响，种植模式适宜矮、密、早(主茎及侧枝较短、种植密度较高、棉花以早熟品种为主)，有利于提高棉花产量。

陆地棉(Gossypium hirsutum L.)因最早在美洲大陆种植而得名，是世界上最重要的棉花栽培品种，占全球棉花种植面积的90％以上。陆地棉为异源四倍体，包括两个亚基因组，A亚组和D亚组。

重组技术和植物改良

本发明基因的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的本发明多肽。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明的多核苷酸序列可***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多核苷酸和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞(如农作物和林业植物的细胞)。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中***增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得下胚轴和/或主茎长度等性状变化的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超滤处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的本发明多肽有多方面的用途。例如用于筛选具有促进下胚轴和/或主茎长度缩短的化合物、多肽或其它配体。用表达的重组本发明多肽的筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制、或促进下胚轴和/或主茎长度缩短的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对本发明多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的本发明多肽的基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。本发明的各类抗体可以利用棉纤维长度相关基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与棉纤维长度相关基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗本发明多肽的抗体可用于检测样品中的光信号途径相关多肽。

本发明还涉及定量和定位检测光信号途径相关多肽水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的光信号途径相关多肽水平，可用于解释光信号途径相关多肽促进下胚轴和/或主茎长度缩短的功能。

一种检测样品中是否存在光信号途径相关多肽的方法是利用本发明多肽的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与本发明多肽特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在光信号途径相关多肽。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用本发明多肽特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测本发明多肽的转录产物。

本发明多肽及其编码序列的应用

本发明提供了光信号途径相关多肽及其编码序列的用途，用于促进下胚轴和/或主茎长度缩短。在本发明中，所述的光信号途径相关多肽及其编码序列还可用于制备促进下胚轴和/或主茎长度缩短的组合物。本发明还涉及光信号途径相关多肽及其编码序列的拮抗剂(或抑制剂)的用途。

任何可降低GhCOP1蛋白的活性、降低GhCOP1蛋白的表达的物质可用于本发明，作为GhCOP1的抑制剂。在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达的干扰分子的方法是本领域人员熟知的。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明首次筛到一种光信号途径相关蛋白及其编码基因。

(b)本发明首次发现，抑制光信号途径相关蛋白GhCOP1的表达或活性，可显著促进植物(如棉属植物)下胚轴和/或主茎长度的缩短，从而可潜在的提高产量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

如无特别说明，则实施例中的试剂和材料均为市售产品。

实施例1陆地棉GhCOP1基因克隆及序列分析

TRizol法提取陆地棉标准系TM-1总RNA，以总RNA为模板合成cDNA。以cDNA为模板，用含有attB位点的GhCOP1基因全长引物PCR扩增得到目的基因片段，引物序列为

5`GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGCGTGGTCTGTTTTTACCCTCA 3'(SEQ IDNO.:3)

和5'GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAGCCGCAAGGACTAGCACTTTTAT 3'(SEQ IDNO.:4)(下划线部分为attB位点序列)。PCR反应体系为50μL：cDNA 1μL，引物各1μL，2×PrimSTAR PCR Mix(大连宝生物)25μL，加ddH₂O补至50μL。扩增程序：98℃预变性1min；98℃15s，58℃15s，72℃4min，35个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳观察后用DNA凝胶回收试剂盒回收目标片段。将含有attB位点的GhCOP1目的片段与Gateway入门载体pDONR221共同建立BP反应体系：attB‐PCR product(20-60ng/μL)1‐3μL；pDONR(150ng/μL)0.5μL；BP Clonase^TM II 0.5μL,用TE buffer(PH8.0)补足至5μL；25度反应1小时，转化DH5α菌株(购自全式金生物科技有限责任公司)，根据pDONR221质粒上携带的抗生素进行筛选阳性克隆并测序。

实施例2将GhCOP1基因构建至植物表达载体

利用含有GhCOP1基因的pDONR221入门克隆与Gateway目标载体pEarleyGate203(购自Invitrogen In.Ltd)建立Gateway LR反应：GhPHYB entry clone(50‐150ng/reaction)1‐3μL，Destination vector pEarleyGate203(150ng/μL 0.5μL，LR Clonase^TM II 1μL，TE Buffer,pH 8.0补足至5μL，25度反应1小时。转化DH5α菌株，根据pEarleyGate203质粒上携带的抗生素进行筛选阳性克隆并命名为pEarleyGate203-Myc-GhCOP1。将pEarleyGate203-Myc-GhCOP1质粒通过冻融法转化至农杆菌菌株GV3101(获自中国彩棉(集团)股份有限公司)，用于转化拟南芥。

实施例3含pEarleyGate203-Myc-GhCOP1重组质粒农杆菌转化拟南芥

以目前分子克隆实验室通用的农杆菌浸花法利用双元植物表达载体将GhCOP1基因转化至拟南芥，使其整合至拟南芥基因组。转化后所得后代种子播种在含卡那霉素(50mg/L)的MS固体培养基上，白光下培养7-10天，筛选能够在具有筛选压力培养基上存活并生长的拟南芥幼苗，转移至营养钵中继续生长并采样进行PCR鉴定，转基因植株后代种子继续进行抗生素筛选及PCR鉴定，获得转基因纯合体。

实施例4转基因植株表型鉴定

拟南芥种子首先用30％的消毒液(龙安84)灭菌10分钟后，用无菌水清洗5-10遍。洗好的种子用玻璃滴管均匀点播于MS培养基上，4℃春化3天。然后白光诱导萌发12-24小时，22℃白光光照处理4天后，观察和统计表型，结果如图1A和图1B所示。转基因植株的下胚轴显著高于野生型和拟南芥COP1缺失突变体cop1-1下胚轴，表明陆地棉GhCOP1基因在拟南芥中过表达后抑制了转基因拟南芥的光形态建成生长。

实施例5基因沉默目的片段的克隆及序列鉴定

根据陆地棉GhCOP1基因序列，选取保守区域其中一段500bp的序列设计引物，并在正向引物5’端引入EcoRⅠ酶切位点，反向引物5’端引入KpnⅠ酶切位点，引物序列如下：

GhCOP1Vi-F：5`-CCGGAATTC AAGGTGAAAGTTTGGTGC-3`(SEQ ID NO.:5)(下划线部分为EcoRⅠ酶切位点)，GhCOP1Vi-R：5`-CGGGGTACCCAACACACCGCACTTATG-3`(SEQ ID NO.:6)(下划线部分为KpnⅠ酶切位点)。用已构建好的GhCOP1克隆质粒为模板，PCR扩增VIGS片段。PCR反应体系为50μL：质粒1μL，引物各1μL，2×PrimSTAR PCR Mix(大连宝生物)25μL，加ddH₂O补至50μL。扩增程序：98℃预变性1min；98℃15s，56℃15s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳观察后用DNA凝胶回收试剂盒回收目标片段。将目标片段连接至pEASY blunt可隆载体上，转化DH5α菌株，根据质粒上携带的抗生素进行筛选阳性克隆并测序。

实施例6目的基因的VIGS载体构建

测序结果完全正确的克隆质粒用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切，与同样经过EcoRI和KpnI酶切的pYL156载体连接，转化DH5α菌株，根据质粒上携带的抗生素进行筛选，阳性克隆用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切鉴定，重组质粒命名为TRV::GhCOP1。鉴定后的重组质粒冻融法转化农杆菌菌株GV3101。

实施例7利用VIGS技术创制GhCOP1基因沉默的陆地棉植株

(1)、接种前三天，将用甘油冷冻保存的农杆菌TRV::RNA1、TRV::pYL156空载体、TRV::GhCLA1及TRV::GhCOP1在含有50μg/ml卡那霉素和25μg/ml庆大霉素的LB固体培养基上划线。将平板置于28℃下培养24小时。(2)、VIGS侵染前两天，在每个平板上挑选单菌落接种于含有50μg/ml卡那霉素和25μg/ml庆大霉素的LB液体培养基中，置于28℃、50rpm摇床过夜培养。(3)、将含有目的载体的农杆菌在含有50μg/ml卡那霉素，25μg/ml庆大霉素，10MmEMS，20μM乙酰丁香酮的50ml LB培养基中过夜培养，28℃、50rpm。(4)、第二天，4000rpm离心5分钟收集农杆菌细胞，弃上清，将沉淀悬浮于含有10mM MgCl₂，10mM MES,200μM乙酰丁香酮的液体中，调整OD₆₀₀至1.5。(5)、在室温放置3小时。(6)、将TRV::RNA1分别和TRV::pYL156空载体、TRV::GhCLA1及TRV::GhCOP1的菌悬液按照1:1的比例混合，用针头在棉花子叶下方刺破一至两个小洞，去掉针头，用注射器将菌液渗透至棉花子叶。(7)、将注射后的棉花在室温避光环境下培养过夜。(8)、将棉花转移至23℃，120μE m^-2S^-1光强度的培养室，以12h光照,12h黑暗为周期。(9)、渗透7-8天后观察TRV::GhCOP1沉默表型，以TRV::GhCLA1注射的棉花真叶表型开始出现白化现象作为参照，TRV::pYL156空载体注射的棉花作为阴性对照(CK)。(10)取对照与基因沉默植株叶片，Trizol法提取总RNA，进行mRNA转录水平的表达分析，结果如图2B所示,TRV::GhCOP1基因沉默植株中GhCOP1基因的转录水平下降明显，表明GhCOP1基因的表达收到抑制。以TRV::pYL156空载体与TRV::RNA1共侵染的棉花作为阴性对照(CK)，观察TRV::GhCOP1干涉后的棉花生长表型与阴性对照之间的差异，结果如图2A，图3所示，棉花中的GhCOP1基因受到病毒诱导发生沉默后，棉花幼苗的下胚轴及成株主茎长度要显著小于对照。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 新疆农业科学院核技术生物技术研究所

中国彩棉（集团）股份有限公司

新疆彩色棉工程技术研究院有限公司

<120> 陆地棉光信号途径调节因子GhCOP1及其应用

<130> P2017-1020

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2172

<212> DNA

<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum TM-1)

<400> 1

atggcgtggt ctgtttttac cctcagaaag gaaaaccgct catttggttc tctctctctc 60

tttctctcta aattttattt tattctaagc agaaattttg tttatttatc gctgcacacg 120

tcaaatccaa aaactgtaac taaaaacatt gaagaattct caactggcac cgaccctcgt 180

gtgccggcgg tcaagccgga ctctaagcca tcttccttgg aggaagttcc actcgaagct 240

gcctccgctg ctgtttcaga agatgccgag gtggataagg acttgctgtg tccgatttgt 300

atgcagataa ttaaggacgc cttcctcacg tcttgcggtc acagcttttg ctacatgtgt 360

ataattaccc atcttcgaaa caagagcgat tgcccttgtt gctctcaatt tctcactaat 420

aatcagcttt tccccaatat tttgctcgat aagcttttga agaagacttc agctcgtcaa 480

atatcaaaaa ctgcatcccc tgtggaacag tttcgtcagg cgttacaaca gggttatgag 540

gttacaatca aggagctgga caaccttttg tccctccttg cagagaagaa gagaaaaatg 600

gaacaggaag aagctgagag aaatatgcaa atactgctgg atttcttaca gtgcttaagg 660

aagcaaaaag ttgatgaact aaatgagata caaactgatc ttcagtttat taaagaggac 720

ataaattctg tggagagaca tagagtggat ttgtatcgtg caagagatag atactctgtg 780

aaattgcgga tgcttggaga tgattctagc acaagaaagc catggtcttc atccatggac 840

aagaacaata gtggaattgt ctctagttct ctaaatatca gaggagggat gcctgcaggg 900

aatcttcaaa acaagaaaat agatggaaag acacagttga gtggccatgt tagtcagaga 960

aaagatgcct taagtggagc ggactcacaa gggttcaatc aatctggtct ctctgttgca 1020

agaaaaaagc ggattcatgc ccagtttaat gacctacaag agtgttacct gcaaaagcga 1080

cgtcagttgg caaaccagct gcatattaag caagaaagtg ataaaaatgt cattcataga 1140

gagggttata atgcgggtct tgcagatttt cagtctgtgc taagtacttt tactcaatac 1200

agtcgactaa gagtcattgc tgaagtgagg cttggagatc tctttcattc agccaatata 1260

gtatcaagca tagaatttga ccgtgatgat gagttgttcg ctacagctgg agtgtctcgg 1320

cgcattaaag tttttgatct ctcaatggtc ctaaatgaac tagcagatgt acactgtcct 1380

gttgtggaga tgtccacgcg ttctaaacta agttgcttga gttggaacaa gcattggaag 1440

aatcatatag ctagtagtga ctatgagggg atagtaaccg tgtgggatgt aacaacacgt 1500

cagagtctaa tggaatatga agaacatgaa aaacgagcat ggagtgttga tttctcacgg 1560

acagacccct caatgcttgt atctggtagt gatgattgca aggtgaaagt ttggtgcaca 1620

aagcaggagg ccagtgttat taatattgac atgaaagcaa atatatgttg tgtcaagtat 1680

aatcctggat ctagcaattt cattgcggtt ggttcagcaa atcatcacat ccactattat 1740

gatttaagaa acatcagtag tccacttcat gtgttcagtg ggcacaagaa agcggtctca 1800

tatgtgaaat tcttgtctga aaatgaactt gcttctgcat ctacagatag cacactaagg 1860

ttatgggatg tgaaggagaa tctgccgctt cgaactttta aaggccatac aaatgagaag 1920

aatttcgtag gcctcactgt aaacagtgaa tatattgcat gcggcagcga aacaaatgaa 1980

gtgtacgtgt accacaagga aatatcgaaa ccggtaacat ggcatagatt tggttcacaa 2040

gagatggagg atgcagatga agatgggggt ggatcgcact tcataagtgc ggtgtgttgg 2100

aagagcgata gccctaccat gctaactgct aacagtcagg gaaccataaa agtgctagtc 2160

cttgcggctt ga 2172

<210> 2

<211> 723

<212> PRT

<213> 陆地棉(Gossypium hirsutum TM-1)

<400> 2

Met Ala Trp Ser Val Phe Thr Leu Arg Lys Glu Asn Arg Ser Phe Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Phe Leu Ser Lys Phe Tyr Phe Ile Leu Ser Arg Asn

20 25 30

Phe Val Tyr Leu Ser Leu His Thr Ser Asn Pro Lys Thr Val Thr Lys

35 40 45

Asn Ile Glu Glu Phe Ser Thr Gly Thr Asp Pro Arg Val Pro Ala Val

50 55 60

Lys Pro Asp Ser Lys Pro Ser Ser Leu Glu Glu Val Pro Leu Glu Ala

65 70 75 80

Ala Ser Ala Ala Val Ser Glu Asp Ala Glu Val Asp Lys Asp Leu Leu

85 90 95

Cys Pro Ile Cys Met Gln Ile Ile Lys Asp Ala Phe Leu Thr Ser Cys

100 105 110

Gly His Ser Phe Cys Tyr Met Cys Ile Ile Thr His Leu Arg Asn Lys

115 120 125

Ser Asp Cys Pro Cys Cys Ser Gln Phe Leu Thr Asn Asn Gln Leu Phe

130 135 140

Pro Asn Ile Leu Leu Asp Lys Leu Leu Lys Lys Thr Ser Ala Arg Gln

145 150 155 160

Ile Ser Lys Thr Ala Ser Pro Val Glu Gln Phe Arg Gln Ala Leu Gln

165 170 175

Gln Gly Tyr Glu Val Thr Ile Lys Glu Leu Asp Asn Leu Leu Ser Leu

180 185 190

Leu Ala Glu Lys Lys Arg Lys Met Glu Gln Glu Glu Ala Glu Arg Asn

195 200 205

Met Gln Ile Leu Leu Asp Phe Leu Gln Cys Leu Arg Lys Gln Lys Val

210 215 220

Asp Glu Leu Asn Glu Ile Gln Thr Asp Leu Gln Phe Ile Lys Glu Asp

225 230 235 240

Ile Asn Ser Val Glu Arg His Arg Val Asp Leu Tyr Arg Ala Arg Asp

245 250 255

Arg Tyr Ser Val Lys Leu Arg Met Leu Gly Asp Asp Ser Ser Thr Arg

260 265 270

Lys Pro Trp Ser Ser Ser Met Asp Lys Asn Asn Ser Gly Ile Val Ser

275 280 285

Ser Ser Leu Asn Ile Arg Gly Gly Met Pro Ala Gly Asn Leu Gln Asn

290 295 300

Lys Lys Ile Asp Gly Lys Thr Gln Leu Ser Gly His Val Ser Gln Arg

305 310 315 320

Lys Asp Ala Leu Ser Gly Ala Asp Ser Gln Gly Phe Asn Gln Ser Gly

325 330 335

Leu Ser Val Ala Arg Lys Lys Arg Ile His Ala Gln Phe Asn Asp Leu

340 345 350

Gln Glu Cys Tyr Leu Gln Lys Arg Arg Gln Leu Ala Asn Gln Leu His

355 360 365

Ile Lys Gln Glu Ser Asp Lys Asn Val Ile His Arg Glu Gly Tyr Asn

370 375 380

Ala Gly Leu Ala Asp Phe Gln Ser Val Leu Ser Thr Phe Thr Gln Tyr

385 390 395 400

Ser Arg Leu Arg Val Ile Ala Glu Val Arg Leu Gly Asp Leu Phe His

405 410 415

Ser Ala Asn Ile Val Ser Ser Ile Glu Phe Asp Arg Asp Asp Glu Leu

420 425 430

Phe Ala Thr Ala Gly Val Ser Arg Arg Ile Lys Val Phe Asp Leu Ser

435 440 445

Met Val Leu Asn Glu Leu Ala Asp Val His Cys Pro Val Val Glu Met

450 455 460

Ser Thr Arg Ser Lys Leu Ser Cys Leu Ser Trp Asn Lys His Trp Lys

465 470 475 480

Asn His Ile Ala Ser Ser Asp Tyr Glu Gly Ile Val Thr Val Trp Asp

485 490 495

Val Thr Thr Arg Gln Ser Leu Met Glu Tyr Glu Glu His Glu Lys Arg

500 505 510

Ala Trp Ser Val Asp Phe Ser Arg Thr Asp Pro Ser Met Leu Val Ser

515 520 525

Gly Ser Asp Asp Cys Lys Val Lys Val Trp Cys Thr Lys Gln Glu Ala

530 535 540

Ser Val Ile Asn Ile Asp Met Lys Ala Asn Ile Cys Cys Val Lys Tyr

545 550 555 560

Asn Pro Gly Ser Ser Asn Phe Ile Ala Val Gly Ser Ala Asn His His

565 570 575

Ile His Tyr Tyr Asp Leu Arg Asn Ile Ser Ser Pro Leu His Val Phe

580 585 590

Ser Gly His Lys Lys Ala Val Ser Tyr Val Lys Phe Leu Ser Glu Asn

595 600 605

Glu Leu Ala Ser Ala Ser Thr Asp Ser Thr Leu Arg Leu Trp Asp Val

610 615 620

Lys Glu Asn Leu Pro Leu Arg Thr Phe Lys Gly His Thr Asn Glu Lys

625 630 635 640

Asn Phe Val Gly Leu Thr Val Asn Ser Glu Tyr Ile Ala Cys Gly Ser

645 650 655

Glu Thr Asn Glu Val Tyr Val Tyr His Lys Glu Ile Ser Lys Pro Val

660 665 670

Thr Trp His Arg Phe Gly Ser Gln Glu Met Glu Asp Ala Asp Glu Asp

675 680 685

Gly Gly Gly Ser His Phe Ile Ser Ala Val Cys Trp Lys Ser Asp Ser

690 695 700

Pro Thr Met Leu Thr Ala Asn Ser Gln Gly Thr Ile Lys Val Leu Val

705 710 715 720

Leu Ala Ala

<210> 3

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg catggcgtgg tctgttttta ccctca 56

<210> 4

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc agccgcaagg actagcactt ttat 54

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

ccggaattca aggtgaaagt ttggtgc 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

cggggtaccc aacacaccgc acttatg 27

Claims

1.一种GhCOP1基因的抑制剂的用途，其特征在于，所述GhCOP1基因或其编码蛋白的抑制剂用于选自下组的一种或多种用途：

(a) 用于制备促进植物下胚轴缩短的试剂或组合物；

(b) 用于促进植物下胚轴缩短；

(c) 用于制备促进植物主茎长度缩短的试剂或组合物；

(d) 用于促进植物主茎长度缩短；

所述的植物选自下组：棉花、拟南芥、或其组合，所述GhCOP1基因的抑制剂为抑制所述GhCOP1基因表达的外源核苷酸序列，所述GhCOP1基因具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述GhCOP1基因的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.一种促进植物下胚轴缩短的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：抑制GhCOP1基因的表达，所述的植物选自下组：棉花、拟南芥、或其组合，所述GhCOP1基因具有SEQ IDNO: 1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

所述抑制GhCOP1基因的表达为导入抑制所述GhCOP1基因表达的外源核苷酸序列。

4.一种促进植物主茎长度缩短的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：抑制GhCOP1基因的表达，所述的植物选自下组：棉花、拟南芥、或其组合，所述GhCOP1基因具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

5.一种改良植物性状的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将外源的构建物导入植物细胞，其中所述的构建物含有抑制GhCOP1基因表达的外源核苷酸序列，从而获得导入外源构建物的植物细胞；

(b)将上一步骤获得的所述导入外源构建物的植物细胞，再生成植株，从而获得性状改良的植物；所述的植物选自下组：棉花、拟南芥、或其组合，所述的性状改良包括选自下组的一种或多种改良的性状：

(1) 下胚轴缩短；

(2) 主茎长度缩短，所述GhCOP1基因具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，或与SEQID NO: 1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

6.一种改良植物性状的方法，其特征在于，包括步骤：

(b)将上一步骤获得的所述导入外源构建物的植物细胞，再生成植株；

(c)对所述再生的植株进行性状鉴定，从而获得性状改良的植物；所述的植物选自下组：棉花、拟南芥、或其组合，所述的性状改良包括选自下组的一种或多种改良的性状：

(1) 下胚轴缩短；

7.一种改良植物性状的方法，其特征在于，包括步骤：

降低所述植物中GhCOP1基因的表达量，从而改良植物的性状，所述的植物选自下组：棉花、拟南芥、或其组合，所述的性状改良包括选自下组的一种或多种改良的性状：

(1) 下胚轴缩短；

(2) 主茎长度缩短；

所述GhCOP1基因具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

所述降低所述植物中GhCOP1基因的表达量为导入抑制GhCOP1基因表达的外源核苷酸序列。