CZ299068B6

CZ299068B6 - Substituovaný bisindolylmaleinimid a farmaceutický prostredek s jeho obsahem

Info

Publication number: CZ299068B6
Application number: CZ20003384A
Authority: CZ
Inventors: Hooda Dhingra@Urvashi; Mary Huryn@Donna; Ke@June; Federico Weber@Giuseppe
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 1998-03-17
Filing date: 1999-03-10
Publication date: 2008-04-16
Also published as: PE20000340A1; ATE243693T1; MY121046A; ID26353A; DE69909068D1; AU755673B2; DK1064279T3; NO20004579D0; JP5026633B2; HUP0101258A2; TR200002580T2; NO320306B1; CN1127500C; AU3409999A; EP1064279B1; AR018162A1; BR9908882A; MA26613A1; IL138247A; PT1064279E

Abstract

Substituovaný bisindolylmaleinimid obecného vzorce I, kde R.sup.1.n. je vodík a R.sup.2.n. je methyl nebo R.sup.1.n. je methyl a R.sup.2.n. je vodík nebo R.sup.1.n. je hydroxymethyl a R.sup.2.n. je methyl a jeho farmaceuticky prijatelné soli. Tato sloucenina pro použití jako protinádorové lécivo a její použití pro výrobu léciva pro lécení pevných nádoru nebo pro výrobu odpovídajících farmaceutických prostredku. Farmaceutický prostredek s obsahemtéto slouceniny.

Description

Substituovaný bisindolylmaleinimid a farmaceutický prostředek s jeho obsahem

Oblast techniky

Vynález se týká substituovaných bisindolylmaleinimidů, které inhibují buněčnou proliferaci. Také se týká jejich použití pro výrobu léčiv a farmaceutických prostředků s obsahem těchto sloučenin.

Dosavadní stav techniky

Substituované bisindolylmaleinimidy podle vynálezu genericky spadají do rozsahu sloučenin obecného vzorce I popsaných ve spisu US 5 057 614. Nejsou však v tomto patentu popsány ani jako skupina, ani jednotlivě a také zde není uvedeno, že by měly vykazovat antiproliferativní účinnost. Tuto účinnost sloučenin podle vynálezu je tedy nutno považovat za překvapivou.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je substituovaný bisindolylmaleinimid obecného vzorce I

kde

R¹ je vodík a R² je methyl nebo R¹ je methyl a R² je vodík nebo

R¹ je hydroxymethyl a R² je methyl a jeho farmaceuticky přijatelné soli.

Sloučeniny obecného vzorce I mají antiproliferační účinnost, zejména inhibují buněčné dělení v G2/M fázi buněčného cyklu a obecně jsou nazývány jako inhibitory „G2/M fáze buněčného cyklu“ (G2/M phase cell-cycle“ inhibitors).

-1 CZ 299068 B6

Obecný vzorec I shora zahrnuje následující sloučeniny:

Sloučeniny obecného vzorce I ajejich farmaceuticky přijatelné soli se připraví reakcemi uvede5 nými v následujících schématech. Příprava každé z těchto sloučenin je rovněž popsána v příkladech 1 až 3.

Sloučenina vzorce 1-1 se může připravit reakcí (l-methyl-6-nitro-lH-indol-3-yl)oxoacetylchloridu vzorce 3 s 1-methylethylesterhydrochloridem [l-{2,2-dimethylpropionyl)-lH-indol-310 yl]-3-ethanimidové kyseliny vzorce 7 a zpracováním reakčního produktu bází.

Sloučenina vzorce 1-2 se může připravit reakcí (l-methyl-lH-indol-3-yl)oxoacetylchloridu vzorce 17 s 1-methylethylesterhydrochloridem [l-{2,2-dimethylpropionyl)-6-nitro-lH-infol3-yl]-3-ethanimidové kyseliny vzorce 19 a zpracováním produktu s bází.

-2CZ 299068 B6

Sloučenina 1-3 se může připravit reakcí (l-methoxymethyl-lH-indol-3-yl)oxoacetylchloridu vzorce 10 s 1-methylethylesterhydrochloridem (l-methyl-6-nitro-lH-indol-3-yl)-3-ethanimidové kyseliny vzorce 15 a zpracováním reakčního produktu s kyselinou.

Schéma 1

-3 Schéma 2 /^ZX'N(CH₃)₂

-4CZ 299068 B6

Schéma 3

Antiproliferační účinnost sloučenin podle vynálezu je demonstrována dále. Účinky indikují, že sloučeniny podle vynálezu jsou užitečné při léčbě rakoviny, zejména pevných nádorů.

-5CZ 299068 B6

Estrogenová receptorová negativní epiteliální linie rakoviny prsu (MDA-MB^135) ze získala od American Type Cell Culture Collection (ATCC; Rockville, MD) a byla pěstována v prostředí doporučeném ATCC. Pro analýzu účinku testovaných sloučenin na růst těchto buněk se buňky očkovaly 2000 buňkami na jamku v 96jamkové kultivační plotně („testovací plotna“) a inkubova5 ly se přes noc při 37 °C s 5% CO₂. Příští den se testované sloučeniny rozpustily ve 100% dimethylsulfoxidu (DMSO), aby se získal lOmM zásobní roztok. Každá sloučenina se zředila sterilní destilovanou vodou na 1 mM a potom se vložila do trojitých jamek 96jamkové matriční plotny, která obsahovala médium v dostatečném množství k zajištění konečné koncentrace 40 μΜ. Sloučeniny byly postupně zředěny v médiu v matriční plotně. Jedna čtvrtina konečného ío objemu zředěných sloučenin byla přinesena do duplikačních testovacích ploten. Do řady kontrolních buněk se přidal DMSO, tak, aby konečná koncentrace v každé jamce byla 0,1%. Zkušební plotny se vrátily do inkubátoru a 3 dny po přidání testované sloučeniny se jedna testovací plotna analyzovala, jak je popsáno dále. Podobně se pátý den po přidání testované sloučeniny také analyzovala druhá testovací plotna, jak je popsáno dále.

Do každé jamky se přidal 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromid (thioazolylová modř; MTT) tak, aby konečná koncentrace byla 1 mg/ml. Plotna se potom inkubovala při 37 °C po dobu 3 hodin. Médium obsahující MTT se potom odstranilo a do každé jamky se přidalo 50 μΐ 100% ethanolu, aby se rozpustil vznikající formazanový metabolit.

K dosažení úplného rozpouštění se plotny třepaly při teplotě místnosti po dobu 15 minut. Pak byla zjišťována absorbance za použití analyzátoru ploten (Molecular Dynamics) při vlnových délkách 579 nm s 650 nm referencí. Procenta inhibice se počítala odečtením slepého pokusu od všech jamek a potom odečtením od jedné podílu průměrné absorbance každé testovací trojité jamky a průměru kontrolních jamek. Inhibiční koncentrace se stanovily z lineární regrese grafu závislosti logaritmu koncentrace na procenta inhibice.

Buněčná linie střevního adenokarcinomů SW480 a karcinom linie HCT-116 byly rovněž získány z ATCC a byly zkoušeny podle stejného protokolu uvedeného shora s následujícími modifikacemi. Buněčná linie SW480 byla očkována 1000 buňkami na jamku a byla analyzována 6 dnů po přidání testované sloučeniny. Buněčná linie HCT-116 byla očkována 750 buňkami na jamku a byla analyzována 4 dny po přidání testované sloučeniny. Pro analýzu MTT byly plotny odstřeďovány při 1000 ot./min po dobu 5 minut před nasátím média obsahujícího MTT a k rozpouštění formazanu se použilo 100 μΐ 100% ethanolu.

Výsledky shora uvedených testů in vitro jsou uvedeny v tabulkách I—III.

Tabulka I

Antiproliferační účinnost v buněčné linii MDA-MB^135

Sloučenina	ICsoJpMl
Sloučenina i-1	0,03*
Sloučenina i-3	0,05*
Sloučenina l-2	0,6*

* Průměr alespoň tří oddělených pokusů.

-6CZ 299068 B6

Tabulka II

Antiproliferační účinnost v buněčné linii HCT-116

Sloučenina	IC50 íuM)
Sloučenina 1-1	0,17*
Sloučenina I-3	0,23*
Sloučenina I-2	1,66*

* Průměr alespoň tří oddělených pokusů.

Tabulka III

Antiproliferační účinnost v buněčné linii SW480

Sloučenina	IC50 (μΜ)
Sloučenina 1-1	0,20*
Sloučenina I-3	0,22*
Sloučenina l-2	1,86*

* Průměr alespoň tří oddělených pokusů.

Pro analýzu účinku sloučenin na postup buněčného cyklu se buňky MDA-MB-435 (ATCC; Rockville, MD) očkovaly 1 χ 10⁶ buňkami/lOml na 10 cm misku v následujícím růstovém médiu: RMPI 1640 + 10% Heat-Inactivated Fetal Bovine sérum, 2 mM L-glutamin a 50 U/ml pen-strep (vše od GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD). Buňky se inkubovaly přes noc při teplotě 37 °C s 5% CO2. Příští den se testovalo 10 μΐ každé sloučeniny přidáním do 100% DMSO rozto20 ku v jednotlivých miskách tak, aby se získala l/1000x konečná koncentrace zásobního roztoku. Dále, do kontrolní misky se přidalo 10 μΐ 100% DMSO. Konečná koncentrace DMSO ve všech plotnách, včetně kontroly, byla 0,1 %. Plotny se vrátily do inkubátoru.

Potom se v různých časových periodách médium každé plotny přeneslo do 50ml odstřeďovací zkumavky. Buněčná vrstva zůstávající v misce se potom promyla 5 ml fosfátového pufrového fyziologického roztoku (PBS: GIBCO/BRL). PBS se odstranily a spojily se s médiem ve vhodné zkumavce. Buňky se trypsinizovaly po dobu 5 minut při 37 °C a roztok se sebral a spojil se s médiem a PBS ve vhodných zkumavkách. Zkumavky se potom odstřeďovaly po dobu 5 minut při 1200 otáčkách/minutu. Supematant se odstranil a ke zbylým peletám se přidalo 5 ml studené30 ho 70% ethanolu za jemného víření. Buňky se potom skladovaly při -20 °C po dobu >24 hodin.

Zkumavky obsahující buňky se potom vyjmuly z mrazáku a nechaly se stát při teplotě místnosti 20 až 30 minut. Zkumavky se centrifugovaly při 3000 otáčkách/minutu. Supematant se odstranil, buňky se promyly 5 ml PBS a zkumavky se centrifugovaly, jak je uvedeno shora. Následně se supematant odstranil a pelety se resuspendovaly v 0,5 ml PBS. Potom se přidalo do každé zkumavky 0,5 ml RNAzy A (1 mg/ml v PBS) a buňky se inkubovaly při 37 °C po dobu 15 minut. Do každé zkumavky se přidalo 100 μΐ propidiumjodidu (Sigma, St. Louis, MO) (1 mg/ml v PBS) a zkumavky se potom inkubovaly při teplotě místnosti po dobu 2 až 3 minut. Každý vzniklý roztok se převedl přes uzavřenou filtrační zkumavku (Becton Dickinson, San Jose, CA, #2235).

-7CZ 299068 B6

Vzorky se odečítaly v zařízení FACSort (Becton-Dickinson) za použití programu CellQUEST a analyzovaly se pomocí software ModFIT. Toto měření poskytlo indikaci procenta buněk v každé z následujících fází: G0/G1, syntéza DNA (S) a fázi G2/M.

Výsledky experimentu postupu buněčného cyklu analyzované 1 den po přidání testovaných sloučenin I—1,1-2 a 1-3 jsou shrnuty dále v tabulce IV.

Tabulka IV

Sloučenina Koncentrace	% buněk v každé	^:ázi buněčného cy	du
G1	S	G2/M
DMSO	0,1 %	43,93 %	41,08%	14,99 %
Sloučenina 1	0,1 μΜ	8,27 %	25,21 %	66,52 %
Sloučenina 1	0,03 μΜ	45,30 %	34,67 %	20,03 %
Sloučenina 1	0,01 μΜ	44,95 %	41,04%	14,00 %
Sloučenina 1-3	0,3 μΜ	1,11 %	24,99 %	73,90 %
Sloučenina 1-3	0,1 μΜ	15,54 %	24,06 %	60,40 %
Sloučenina 1-3	0,03 μΜ	45,45 %	38,06 %	16,50 %
Sloučenina 1-2	10 μΜ	10,41 %	35,25 %	54,34 %
Sloučenina 1-2	3 μΜ	3,26 %	48,75 %	47,99 %
Sloučenina 1-2	1 μΜ	27,21 %	30,19 %	42,60 %

Účinek testovaných sloučenin na buněčný cyklus

Výsledky shrnuté v tabulkách I-IV demonstrují, že sloučeniny 1-1,1-2 a 1-3 mají antiproliferační účinek; zejména způsobují akumulaci buněk ve fázi G2/m buněčného cyklu.

Pyrroly obecného vzorce I shora ajejich shora uvedené soli se mohou použít jako léčiva, například ve formě farmaceutických prostředků, které mohou být podány orálně, například ve formě tablet, povlečených tablet, dražé, želatinových tobolek, roztoků, emulzí nebo suspenzí. Mohou být podány rektálně, například ve formě čípků nebo parenterálně, například ve formě injekčních roztoků.

Pro přípravu farmaceutických prostředků mohou být tyto sloučeniny formulovány s terapeuticky inertními anorganickými nebo organickými nosiči. Tak pro tablety, povlečené tablety, dražé a tvrdé želatinové tobolky může být použita například laktóza, kukuřičný škrob nebo jeho deri25 váty, talek, kyselina stearová nebo její soli. Vhodné nosiče pro měkké želatinové tobolky jsou například rostlinné oleje, vosky, tuky a polopevné kapalné polyoly. V závislosti na povaze aktivní látky nejsou však požadovány žádné nosiče v případě měkkých želatinových tobolek. Vhodné nosiče pro přípravu roztoků a sirupů jsou například voda, polyoly, sacharóza, invertní cukr a glukóza. Vhodné nosiče pro injekce jsou voda, alkoholy, polyoly, glycerin, rostlinné oleje, fosfolipi30 dy a povrchově aktivní látky, vhodné nosiče pro čípky jsou přírodní nebo ztužené oleje, vosky, tuky a polopevné polyoly.

Farmaceutické prostředky mohou také obsahovat konzervační látky, solubilizátory, stabilizátory, smáčedla, emulgátory, sladidla, barviva, ochucovadla, soli pro změnu osmotického tlaku, pufru, povlakové prostředky nebo antioxidanty. Mohou také obsahovat další terapeutické cenné substance.

Jak bylo uvedeno shora, pyrroly obecného vzorce I ajejich shora uvedené soli se mohou použít při léčbě nebo regulaci onkologických chorob. Dávka se může pohybovat v širokém rozmezí, nicméně bude upravena podle individuálních požadavků v každém jednotlivém případě. Obecně, v případě orálního nebo parenterálního podání činí tato dávka u dospělých osob o hmotnosti

-8CZ 299068 B6 okolo 70 kg denně od okolo 10 do okolo 10 000 mg, výhodně od okolo 200 do okolo 5000 mg, výhodněji do okolo 1000 mg, ačkoliv může být překročena. Denní dávka může být podána jako jednotlivá dávka nebo může být rozdělena do několika dávek, nebo v případě parenterálního podání může být podána jako kontinuální infuze.

Následující příklady ilustrují předkládaný vynález.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava 3-(lH-indol-3-yl)-4-(l-methyl-6-nitro-lH-indol-3-yl)pyrrol-2,5-dionu (1-1)

A. l-Methyl-6-nitro-lH-indol (2)

Ke kaši 0,33 (8,3 mmol) NaH (60% disperze v oleji) v 30 ml žádaného dimethylformamidu („DMF“) se přidá 0,973 g (6,00 mmol) komerčně dostupného 6-nitro-lH-indolu (1) při teplotě

0 až 5 °C v průběhu 10 minut. Po jednohodinovém míchání při stejné teplotě se přidá 0,75 ml (12,1 mmol) methyljodidu a směs se míchá při stejné teplotě 30 minut a potom při teplotě místnosti 1 hodinu, vlije se do ledové vody a extrahuje se etylacetátem. Organická fáze se promyje solankou, suší se nad MgSO₄ a koncentruje se a získá se 0,814 g (77,5 %) l-methyl-6-nitro-lHindolu (2) jako žlutá pevná látka. Materiál se použije bez dalšího čištění.

B. (l-Methyl-6-nitro-lH-indol-3-yl)oxoacetylchlorid (3)

K roztoku 1,33 g (7,55 mmol) l-methyl-6-nitro-lH-indolu (2) v 40 ml etheru se přidá při teplotě 0 až 5 °C a pod argonem 1,5 ml (17,2 mmol) oxalylchloridu. Vznikne sraženina. Po 3 hodi30 nách míchání se vzniklá pevná látka odfiltruje, promyje se malým množstvím etheru a suší se a získá se 1,9 g (95 %) (l-methyl-6-nitro-lH-indol-3-yl)oxoacetylchloridu (3) jako žlutá pevná látka. Tento materiál se použije bez dalšího čištění.

C. [l-(2,2-Dimethylpropionyl)-lH-indol-3-yl]acetonitril (6)

Za použití postupu uvedeného pod A shora se provede N-alkylační reakce 10,2 g (65 mmol) komerčně dostupného (lH-indol-3-yl)acetonitrilu (5) s 8,7 ml (71 mmol) trimethylacetylchloridu a 3,4 g (85 mmol) NaH (60% disperze v oleji) jako báze v 115 ml DMF a po čištění chromatografií se získá 6,6 g (38,7 %) [l-(2,2-dimethylpropionyl)-lH-indol-3-yl]acetonitrilu (6) jako žlutý olej.

D. Hydrochlorid 1-methylethylesteru [l-(2,2-dimethylpropionyl)-lH-indol-3-yl]-3-ethanimidové kyseliny (7)

Ke kaši 6,6 g (27,5 mmol) [l-(2,2dimethylpropionyl)-lH-indol-3-yl]acetonitrilu (6) ze stupně C shora ve 105 ml 2-propanolu se přidá po kapkách při teplotě 0 až 5°C v průběhu 20 minut 40 ml (0,563 mmol) acetylchloridu. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti přes noc, koncentruje se a zbytek se zředí přibližně 75 ml ethylacetát, zahřívá se 15 minut v parní lázni, ochladí se a uloží se do mrazáku. Sraženina se odfiltruje a suší a získá se 6,0 g (65,0 %) hydro50 chloridu 1-methylethylesteru [l-(2,2-dimethylpropionyl)-lH-indol-3-yl]-3-ethanimidové kyseliny (7) jako bílá pevná látka.

-9CZ 299068 B6

Ε. 3-[ 1 -(2,2-Dimethylpropionyl)-l H-indol-3-yl]-4-( 1-methy 1-6-nitro-l H-indol-3-yl)pyrrol-2,5-dion (4)

K roztoku 1,25 g (4,69 mmol) (l-methyl-6-nitro-lH-indol-3-yl)oxoacetylchloridu (3) ze stup5 ně B shora a 1,6 g (4,75 mmol) hydrochloridu 1-methylethylesteru [l-(2,2-dimethylpropionyl)lH-indol-3-yl]-3-ethanimidové kyseliny (7) ze stupně D shora v 80 ml methylenchloridu se přidá při 0 °C a pod argonem 2,6 ml (18,65 mmol) triethylaminu. Směs se míchá při stejné teplotě 30 minut, reakční směs se potom míchá při teplotě místnosti 3,5 hodiny a zředí s methylenchloridem. Organická fáze se promyje vodou, 0,5 N roztokem HC1, solankou, suší se nad MgSO₄ a koncentruje se a získá se 3,01 g pěny. Tento materiál se rozpustí v 50 ml toluenu a zpracuje se při 0 °C 987,9 mg (5,19 mmol) kyseliny p-toluensulfonové. Po 3 hodinách míchání při teplotě místnosti se reakční směs extrahuje methylenchloridem. Organická fáze se promyje nasyceným roztokem NaHCO₃, solankou, suší se nad MgSO₄ a koncentruje se a získá se 3,9 g surového materiálu. Chromatografickým čištěním na silikagelové koloně se získá 1,7 g (77 %)

3-[l-(2,2-dimethylpropionyl)-l H-indol-3-yl]^l-(l-methy 1-6-nitro-l H-indol-3-yl)pyrrol2,5-dionu (4) jako oranžová pevná látka, teploty tání >146 °C (rozklad). MS: (M⁺), m/z 470:

F. 3-( 1 H-Indol-3-yl)-4-(l-methyl-6-nitro-l H-indol-3-yl)-pyrrol-2,5-dion (1-1)

1,7 g (3,61 mmol) 3-[l-(2,2-dimethylpropionyl)-lH-indol-3-yl]^l-(l-methyl-6-nitro-l 11indol-3-yl)pyrrol-2,5-dionu (4) ze stupně E shora v 60ml methanolu se zpracuje 5,6 (8,96 mmol) 1,6 molámího roztoku NaOCH₃ v methanolu. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti 1 hodinu, vlije se do směsi 2N HCl/led a extrahuje se ethylacetátem. Organické extrakty se suší na bezvodém MgSO₄ a koncentrují a po chromatografickém čištění se získá 394,7 mg (28 %) 3-(lH-indol-3-yl)-4-(l-methyl-6-nitro-lH-indol-3-yl)pyrrol-2,5-dionu (I—1) jako červená pevná látka, t.t. >280 °C. MS: (M⁺), m/z 386.

Příklad 2

Příprava 3-( l-hydroxymethyl)-l H-indol-3-yl)-4-( 1 -methyl-6-nitro-l H-indol-3-yl)pyrrol2,5-dionu (1-3)

A. 1-Methoxymethyl-lH-indol (9)

Za použití postupu popsaného v příkladu 1, stupni A, se provede N-alkylační reakce 1,17 g (10 mmol) komerčně dostupného indolu (8) s 1 ml (13,1 mmol) chlormethylmethyletheru a 0,48 g (12 mmol) NaH (60% disperze v oleji) jako báze v 22 ml DMF a po chromatografickém čištění se získá 1,4 g (86,9 %) 1-methoxymethyl-lH-indolu jako bezbarvý olej (9).

B. (l-Methoxymethyl-lH-indol-3-yl)oxoacetylchlorid (10)

Za použití postupu příkladu 1, stupně B reaguje 0,23 g (1,43 mmol) 1-methoxymethyl-lHindolu (9) ze stupně A shora s 0,25 ml (2,86 mmol) oxalylchloridu v 3,5 ml etheru a získá se

0,174 g (48,5%) (l-methoxymethyl-lH-indol-3-yl)oxoacetylchloridu (10) jako žlutá pevná látka. Tento materiál se použije bez dalšího čištění.

C. (6-Nitro-lH-indol-3-yl)acetonitril (13)

K míchanému roztoku 44,27 g (0,204 mol) 6-nitrograminu (12) [Jackson B. Hester J. Org. Chem. 29: 1158 (1964) v 450 ml acetonitrilu se přidá při 0 až 5 °C během 1 hodiny 44,59 g (0,31 mol) methyljodidu. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti tři hodiny, a potom se najednou přidá roztok 26,6 g (0,543 mol) kyanidu sodného v 225 ml vody. Reakční směs se zahřívá přes noc na 32 °C, ochladí se na teplotu místnosti a produkt se extrahuje třikrát celkovým

-10CZ 299068 B6 množstvím 800 ml ethylacetátu a 300 ml vody. Spojené extrakty se promyjí vodou, 1 N roztokem HC1, nasyceným hydrogenuhličitanem sodným, suší se nad MgSO₄ a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Oranžově hnědý zbytek (41,3 g) se rozpustí v 200 ml horkého ethylacetátu a nechá se projít přes polštářek silikagelu a po odpaření rozpouštědla se získá 28,9 g (70,4 %) (6-nitro-lH5 indolyl-3-yl)acetonitrilu (13) jako žlutá pevná látka.

D. (l-Methyl-6-nitro-l H-indol-3-yl)acetonitril

65,5 g (0,474 mol) práškového uhličitanu draselného se přidá při teplotě místnosti k roztoku ío 28,9 g (0,143 mol) (6-nitro-lH-indol-3-yl)acetonitrilu (13) ze stupně C shora ve 230 ml dimethylformamidu. Suspenze se míchá 40 minut a potom se přidá po kapkách během 65 minut

25,48 g (0,179 mol) methyjodidu. Směs se míchá při teplotě místnosti přes noc a reakční směs se ochladí a vlije se do 600 ml vody. Sraženina se filtruje, promyje se trochou vody a suší se nad oxidem fosforečným, dokud se nedosáhne konstantní hmotnosti. Tak se získá 30,4 g (95,4 %) (l-methyl-6-nitro-lH-indol-3-yl)acetonitrilu (14), který se použije bez dalšího čištění.

E. Hydrochlorid 1-methylethylesteru (l-methyl-6-nitro-lH-indol-3-yl)-3-ethanimidové kyseliny (15)

Proud plynného HC1 se probublává míchanou suspenzí 82 g (0,382 mol) (1-methy 1-6-nitro-lHindol-3-yl)acetonitrilu (14) ze stupně D shora v 1000 ml 2-propanolu při teplotě 0 až 10 °C. Po přidání přibližně 350 g HC1 se k reakční směsi přidává ether dokud se tvoří sraženina. Pevná látka se sebere, promyje se etherem a suší se ve vakuu a získá se 102 g (85,7 %) hydrochloridu 1-methylethylesteru (l-methyl-6-nitro-lH-indol-3-yl)-3-ethanimidové kyseliny (15).

F. 3-( 1 -Methoxymethyl-1 H-indol-3-yl)-4-( 1 -methyl-6-nitro-l H-indol-3-yl)pyrrol-2,5dion (11)

Za použití postupu 1, stupeň E se provede kondenzační reakce 1,3 g (5,17 mmol) oxoacetyl30 chloridu (10) ze stupně B shora s 1,7 g (5,45 mmol) hydrochloridu 1-methylethylesteru (l-methyl-6-nitro-lH-indol)-3-ethanimidové kyseliny (15) ze stupně E shora v 95 ml methylenchloridu a získá se 1,08 g (48,5%) 3-(l-methoxymethyl-lH-indol-3-yl)-4-(l-methyl-6nitro-lH-indol-3-yl)pyrrol-2,5-dionu (11) jako oranžová pevná látka, teploty tání >250 °C (rozklad). MS: (M⁺), m/z 430.

G. 3-(l-Hydroxymethyl-lH-indol-3-yl)-4-(l-methyl-6-nitro-lH-indol-3-yl)pyrrol-2,5dion (1-3)

Roztok 727,5 mg 3-[l-(methoxymethyl)-lH-indol-3-yl)-4-(l-methyl-6-nitro-lH-indol-3⁴⁰ yl)pyrrol-2,5-dionu (11) ze stupně F shora v 65 ml THF se zpracuje přibližně 40 ml 2N HC1. Reakční směs se zahřívá při zpětném toku 5 hodin, ochladí se a produkt se extrahuje ethylacetátem. Organická fáze se suší nad MgSO₄ a rozpouštědlo se odpaří a získá se oranžová pevná látka. Chromatografickým čištěním tohoto materiálu se získá 123,3 mg 3-(l-hydroxymethyl-lHindo 1—3—yl^>—4—(1 -methyl-6-nitro-lH-indol-3-yl)pyrrol-2,5-dionu (1-3) jako červená pevná látka, teploty tání 210 až 213 °C. MS: (M⁺), m/z 16.

Příklad 3

Příprava 3-(l-methyl-lH-indol-3-yl)-4-(6-nitro-l H-indol-3-yl)pyrrol-2,5-dionu (1-2)

A. (l-Methyl-lH-indol-3-yl)oxoacetylchlorid (17)

Za použití postupu příkladu 1, stupeň B reaguje 6 ml (47 ml) komerčně dostupného 1-methyl55 lH-indolu (16) s 8 ml (92 mmol) oxalylchloridu ve 120 ml etheru a získá se 7,6 g (73,2%)

-11 CZ 299068 B6 (l-methyl-lH-indol-3-yl)oxoacetylchloridu (17) jako žlutá pevná látka. Tento materiál se použije bez čištění.

B. [l-(2,2-Dimethylpropionyl)-6-nitro-lH-indol-3-yl]acetonitril

Za použití postupu příkladu 1, stupně A se provede N-alkylační reakce 346,6 mg (1,72 mmol) 6-nitro-lH-indol-3-acetonitrilu (13) z příkladu 2, stupně C s 0,3 ml (2,44 mmol) trimethylacetylchloridu a 70,8 mg (1,77 mmol) NaH (60% disperze v oleji) jako báze v 8 ml DMF a po chromatografíckém čištění se získá 287,7 mg (43,2 %) [l-(2,2-dimethylpropionyl)-6-nitro-lHio indol-3-yl]acetonitrilu (18) jako žlutý olej.

C. Hydrochlorid 1-methylethylesteru [l-(2,2-dimethyl-propionyl)-6-nitro-lH-indol-3-yl]3-ethanimidové kyseliny (19)

Proud plynného HCl se probublává 3 minuty do konstantně míchané suspenze 1,45 g (5,08 mmol) l-[(2,2-dimethyl)propionyl)-6-nitro-lH-indolyl]-6-nitro-lH-indolyl]-3-acetonitrilu (18) ze stupně B shora v 90 ml 2-propanolu při teplotě 0 až 5 °C. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 21 hodin. Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a získá se 1,95 g (100 %) žluté pevné látky (19). Tento materiál se použije bez dalšího čištění.

D. 3-[l-(2,2-Dimethylpropionyl)-6-nitro-lH-indol-3-yl]-4-(l-methyl-lH-indol-3-yl)pyrrol-2,5-dion (20)

Za použití postupu příkladu 1, stupně E, reaguje 1,1 g (4,96 mmol) oxoacetylchloridu (17) ze stupně A shora s 1,95 g (5,08 mmol) hydrochloridu 1-methylethylesteru [l-(2,2-dimethylpropionyl)-6-nitro-lH-indol-3-yl]-3-ethanimidové kyseliny (19) ze stupně C shora a 2,1 ml (17,94 mmol) triethylaminu ve 120 ml methylenchloridu a vzniklý produkt se zpracuje s 1,1 g (5,78 mmol) monohydrátu p-toluensulfonové kyseliny v 80 ml toluenu a získá se 1,3 g (62,1 %) 3-[ 1 -(2,2-dimethylpropionyl)-6-n itro-1 H-indol-3-yl]-4-( 1 -methyl-1 H-indol-3-yl)pyrrol30 2,5-dionu (20) jako oranžová pevná látka; t.t. >245 °C (rozklad). MS: (M⁺), m/z 470.

E. 3-( 1 -Methyl-1 H-indol-3-yl)-4-(6-nitro-l H-indol-3-yl)-pyrrol-2,5-dion (1-2)

Za použití postupu popsaného v příkladu 1, stupeň F, se N-deprotekční reakcí 1,3 g (2,76 mmol)

3-[l-(2,2-dimethylpropionyl)-6-nitro-l H-indol-3-yl]^l-(l-methyl-1 H-indol-3-yl)pyrrol2,5-dionu (20) shora ze stupně D se 4,3 ml (6,88 mmol) 1,6 molámího roztoku NaOCH₃ v 65 ml methanolu získá po krystalizaci z ethylacetátu a hexanu 300,6 mg (28,1 %) 3-(l-methyl-lHindo-3-yl)-4-(6-nitro-l H-indol-3-yl)pyrrol-2,5-dionu (1-2) jako červená pevná látka; teplota tání >260 °C. MS: (M⁺), m/z 386.

Příklad 4

Formulace tablet

Položka	Složky	mg/tabletu
1	Sloučenina A*	5	25	100	250	500	750
2	Bezvodá laktóza	103	83	35	19	38	57
3	Kroskarmelóza sodná	6	6	8	16	32	48
4	Povidon K30	5	5	6	12	24	36
5	Stearát hořečnatý	1	1	1	3	6	9
	Celková hmotnost	120	120	150	300	600	900

* Sloučenina A představuje sloučeninu podle vynálezu .

-12CZ 299068 B6

Postup přípravy:

1. Položky 1, 2 a 3 se mísí ve vhodném mixéru 15 minut.

2. Prášková směs ze stupně 1 se granuluje s 20% roztokem Povidonu K30 (položka 4).

3. Granulát ze stupně 2 se suší při 50 °C.

4. Granulát ze stupně 3 se mele na vhodném mlecím zařízení.

5. Položka 5 se přidá k rozemletému granulátu ze stupně 4 a směs se mísí 3 minuty.

6. Granulát ze stupně 5 se lisuje na vhodném lisu. o

Příklad 5

Formulace kapslí

Položka	Složky	mg/tabletu
1	Sloučenina A*	5	25	100	250	500
2	Vodná laktóza	159	123	148	-	-
3	Kukuřičný škrob	25	35	40	35	70
4	Talek	10	15	10	12	24
5	Stearát hořečnatý	1	2	2	3	6
	Celková hmotnost po naplnění	200	200	300	300	600

* Sloučenina A představuje sloučeninu podle vynálezu.

Postup přípravy:

1. Položka 1, 2 a 3 se mísí na vhodném mixéru 15 minut.

2. Přidají se položky 4 & 5 a směs se mísí 3 minuty.

3. Směs se plní do vhodných kapslí.

Příklad 6

Příprava injekčního roztoku/emulze

Položka	Složka	Mg/ml
1	Sloučenina A*	1 mg
2	PEG 400	10-50 mg
3	Lecithin	20-50 mg
4	Sojový olej	1-5 mg
5	Glycerol	8-12 mg
6	Voda q.s.	1 ml

Sloučenina A představuje sloučeninu podle vynálezu.

- 13CZ 299068 B6

Postup přípravy:

1. Rozpustí se položka 1 v položce 2.

2. Položka 3, 4 a 5 se přidají k položce 6 a směs se mísí, dokud není disperzní a potom se homogenizuje.

3. Roztok ze stupně 1 se přidá ke směsi ze stupně 2 a směs se homogenizuje, dokud není průsvitná.

4. Směs se sterilně filtruje přes 0,2 pm filtr a plní do lahviček.

Příklad 7

Příprava injekčního roztoku/emulze

Položka	Složka	Mg/ml
1	Sloučenina A*	1 mg
2	Glykofurol	10-50 mg
3	Lecithin	20-50 mg
4	Sojový olej	1-5 mg
5	Glycerol	8-12 mg
6	Voda q.s.	1 ml

* Sloučenina A představuje sloučeninu podle vynálezu.

Postup přípravy:

1. Rozpustí se položka 1 v položce 2.

2. Položky 3, 4 a 5 se přidají k položce 6 a směs se mísí, dokud není disperzní a potom se homogenizuje.

4. Směs se sterilně filtruje přes 0,2pm filtr a plní do lahviček.

Claims

1. Substituovaný bisindolylmaleinimid obecného vzorce I

14CZ 299068 B6 kde

R¹ je vodík a R² je methyl nebo 5 R¹ je methyl a R² je vodík nebo

R¹ je hydroxymethyl a R² je methyl ajeho farmaceuticky přijatelné soli.

o

2. Substituovaný bisindolylmaleinimid vzorce 1-1 (1-1) ajeho farmaceuticky přijatelné soli.

15

3. Substituovaný bisindolylmaleinimid vzorce 1-2 (1-2) ajeho farmaceuticky přijatelné soli.

4. Substituovaný bisindolylmaleinimid vzorce 1-3 (1-3) a jeho farmaceuticky přijatelné soli.

- 15CZ 299068 B6

5. Farmaceutický prostředek, v y z n a č e n ý tím, že obsahuje substituovaný bisindolylmaleinimid obecného vzorce I

5 kde

R¹ je vodík a R² je methyl nebo R¹ je methyl a R² je vodík nebo

R¹ je hydroxymethyl a R² je methyl nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl a farmaceuticky přijatelný nosič.

15

6. Substituovaný bisindolylmaleinimid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro použití jako protinádorové léčivo.

7. Použití substituovaného bisindolylmaleinimidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro výrobu léčiva pro léčení pevných nádorů nebo pro výrobu farmaceutických prostředků.