CZ286550B6

CZ286550B6 - Kombinovaný farmaceutický prostředek pro léčbu lidských nádorových buněk, použití inhibitoru ATasy a temozolomidu pro jeho přípravu a souprava

Info

Publication number: CZ286550B6
Application number: CZ19951797A
Authority: CZ
Inventors: John Colin Baer; Azadeh Alison Freeman; Edward Stuart Newlands; Amanda Jean Watson; Joseph Anthony Rafferty; Geoffrey Paul Margison
Original assignee: Cancer Research Campaign Technology Ltd.
Priority date: 1993-01-14
Filing date: 1994-01-13
Publication date: 2000-05-17
Also published as: UA29466C2; SK282452B6; IL108328A0; CZ179795A3; MX9400434A; CN1277541C; CA2153775C; ZA94248B; PL175842B1; FI953423A; TW414710B; RU2148401C1; MY116474A; PL309915A1; WO1994015615A1; NO952781L; HUT72665A; EP0679086A1; AU5838494A; CN1117711A

Abstract

Kombinovaný farmaceutický prostředek pro léčbu lidských nádorových buněk obsahující účinné množství O.sup.6.n.-benzylguaninu a účinné množství temozolomidu, použití O.sup.6.n.-benzylguaninu a temozolomidu pro jeho přípravu a kit obsahující oddělenou farmaceutickou dávkovou formu temozolomidu a oddělenou farmaceutickou dávkovou formu O.sup.6.n.-benzylguaninu pro použití při léčbě lidských nádorových buněk.ŕ

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týku kombinovaného farmaceutického prostředku pro léčbu lidských nádorových buněk, použití inhibitoru O⁶-alkylguanin DNA alkyltransferázy (Atasy) a temozolomidu pro jeho přípravu a soupravy.

Dosavadní stav techniky

U temozolomidu, neboli 8-karbamoyl-3-methylimidazo[5,l-d]-l,2,3,5-tetrazin-4-(3H}-onu, (CCRG 81045, NSC 362856) byly nalezeny cenné protinádorové vlastnosti, viz Newlands et al., Br. J. Cancer, 65-287 (1992). V klinické praxi vykazoval temozolomid aktivitu proti astrocytomům, gliomům, zhoubným melanomům a mycosis fungoides. Lék je nejužitečnější, když se podává podle rozvrhu opakovaných dávek.

Methylovaný O⁶-alkylguanin, např. z reakce MTIC (aktivní methylující species temozolomidu), je nahražen bílkovinou O⁶-alkylguanin DNA alkyltransferázou (ATasou). Pro předchozí působení methylačním činidlem (např. Zlotogoski et al., Carcinogenesis, 5:83, 1984; Gibson et al., Cancer Res., 46:4995, 1986), O⁶-methylguaninem (např. O⁶-benzylguaninem (O⁶-BG, Dolan et al., Proč. Nati. Acad., Sci. U.S.A., 87:5368, 1990) na ATasu-exprimující buňky bylo takto ukázáno, že zvyšuje cytotoxický účinek chlorethylačních činidel, zatímco u buněk, které ATasu neexprimují bylo pozorováno jen malé nebo žádné zcitlivění.

Moschel, Dolan a Pegg v U.S. patentu 5 091 430 zaznamenávají, že přechodný pokles v ATasové aktivitě je vše, co je zapotřebí ke zvýšení účinnosti chlorothylačních činidel. Publikovaná PCT přihláška WO 91/13898 zaznamenává například 3,8 násobný pokles ED₅₀ pro Me CCNU, když je kombinován s O⁶-benzylguaninem v buňkách SF767. Takto Moshel et al. Ukazují obecné zesílení protinádorové aktivity alkylačního činidla při použití s depletorem alkyltransferázy.

Podstata vynálezu

Předložený vynález, překvapivý a ne samozřejmý z hlediska předchozích prací, spočívá v tom, že chemoterapeutické účinky temozolomidu mohou být dramaticky potencovány (až 300-krát pro buněčnou linii MAWI) použitím určitého dávkovacího režimu, který obsahuje podávání inhibitoru ATasy. Takto mohou být lidské nádorové buňky, které jsou jinak nepřístupné nebo jen málo přístupné temozolomidové terapie, léčeny kombinací temozolomidu s inhibitorem ATasy.

V souladu s tím je předmětem předkládaného vynálezu kombinovaný farmaceutický prostředek, který obsahuje účinné množství inhibitoru O⁶-alkylguanin DNA alkyltransferázy (ATasy) a účinné množství temozolomidu.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je použití O⁶-benzylguaninu a temozolomidu pro přípravu farmaceutického prostředku pro léčbu lidských nádorových buněk.

-1 CZ 286550 B6

Stručný popis obrázků

Obrázek 1 je graf cytotoxicity (IC₅₀) temozolomidu () a CCNU (x) vynesené proti hladinám buněčné ATasy v buněčných liniích lidských nádorů (v pořadí rostoucí hladiny ATasy): ZR-751, U87MG, U373, LS174T, LOVO, MCF-7 a MAWI.

Obrázek 2 je graf cytotoxicity temozolomidu v pZipneoSV(X)l-transfekovaných (o,·) nebo phAT-transfekovaných (▼,Α) XP-odvozených buněčných liniích v přítomnosti (·,Α) nebo nepřítomnosti (o,V) 10 μΜ GB. Úsečky chyb ukazují +/- 1 s.d.

Obrázek 3 je graf poměru cytotoxicity opakovaných denních dávek temozolomidu v lidských nádorových buněčných liniích MAWI (x), MCF-7 (▼) nebo U373 (#) u samotného léku, IC₅₀(-BG), ve srovnání s preinkubací s BG, IC50 (+BG).

Obrázek 4 je graf účinku rostoucích koncentrací temozolomidu na hladiny ATasy v lidských nádorových buněčných liniích: LOVO (), MAWI (x), MCF-7 (▼), U373 (#).

Obrázek 5 je graf záchytu radioaktivní značky při 4 °C buňkami, na něž bylo působeno ^l4Ctemozolomidem. MAWI (), ZR-75-1 (x).

Podrobný popis vynálezu

Toxicita temozolomidu, protinádorového činidla užitečného při léčbě lidských nádorů, může být velice zesílena jeho použitím společně s potenciátorem, jímž je inhibitor enzymu O⁶-alkylguanin DNA alkyltransferázy (ATasy). Konkrétněji: Použití inhibitorů ATasy, jako je O⁶-benzylguanin (BG), může zvýšit toxicitu temozolomidu, například v buněčné linii MAWI, až na asi 300 násobek, když se používá za režimu opakovaných dávek podle předkládaného vynálezu, a umožňuje použití temozolomidu v chemoterapii lidských nádorů jinak nepřístupných nebo jen málo přístupných takovéto terapii.

Paralelní toxicita pro temozolomid a lomustin (CCNU) (po jednohodinové expozici k léku) může být ukázán u řady lidských nádorových buněčných linií, v korelaci s jejich obsahem ATasy. Methylace O⁶ pozice guaninu v DNA temozolomidem ted vede k cytotoxickému poškození. Hodnocením lidských nádorových na jejich relativní produkci ATasy může být stanovena jejich senzitivita k temozolomidu. Buňka produkující vyšší množství ATasy bude tedy k samotnému temozolomidu než méně citlivá než ta, jež produkuje minimální hladiny ATasy.

Předchozí působení na buňky jednotlivou dávkou BG vede ke skromnému (< 4-násobnému) zvýšení toxicity temozolomidu. Stupeň zesílení pro temozolomid a pro lomustin (CCNU) jsou stejného řádu. Při testování kolonií zůstávaly lidské fibroblasty transfekované cDNA ATasy, předem opracované BG, resistentnější k temozolomidu než kontrolní transfekované fibroblasty, ačkoli ATasová bílkovina byla eliminována. Je nepravděpodobné, že by tomu tak bylo pro rozdíl v transportu temozolomidu, a může to jednoduše odrážet resyntézu ATasy phAT fibroblasty ke zmenšení efektu předchozího působení inhibitorem.

Nejvíce překvapující však je, že byla nalezena značná potenciace toxicity temozolomidu (až na asi 300 násobek) BG v buněčné linii MAWI po pěti dnech působení. Podobný stupeň zesílení byl pozorován v buňkách MCF-7, které také obsahují vysoké hladiny ATasy, ale jen malý efekt v buňkách U373, které mají nízké hladiny. Výsledky testování buněčných linií MAWI a MCF-7 implikují, že trvalá přítomnost inhibitoru ATasy umožňuje vzrůst poškození DNA.

-2CZ 286550 B6

Předkládaný vynález tedy poskytuje způsob potenciace toxicity temozolomidu na lidské nádorové buňky pomocí podávání ATasu-inhibujícího množství inhibitoru ATasy, a produkt obsahující temozolomid a inhibitor ATasy jako kombinovaný prostředek pro současné, oddělené nebo postupné podávání při řečené terapii lidských nádorových buněk.

S výhodou je toto podávání inhibitoru ATasy opakováno v období několika nebo více dní, a před podáváním dávek temozomidu. Opakované dávky mohou být podávány po 1, 2, 3, 4 nebo 5 dní, když 4 nebo 5 dní jsou výhodným obdobím terapie.

Dále a nejvýhodněji, temozolomid je podáván pacientovi v opakovaných dávkách během období několika dní, a ATasu-inhibujícího množství inhibitoru ATasy je podáváno před každou dávkou temozolomidu, což vede ke značně zvýšené toxicitě temozolomidu k lidským nádorovým buňkám, např. asi 300-násobné u buněčné linie MAWI.

U výhodného provedení je inhibitor ATasy podáván v množstvích inhibujících ATasu, tj. množství dostatečném ke zcitlivění nádoru in vivo bez toho, že by působilo nežádoucí zcitlivění normální tkáně, když se inhibitor používá souběžně s temozolomidem.

Množství inhibitoru ATasy používané v předkládaném vynálezu se různí podle stupně účinného 20 množství potřebného k léčbě nádorových buněk. Vhodné dávkování je to, které povede k takové koncentraci inhibitoru ATasy v nádorových buňkách, jež mají být léčeny, že způsobí depleci ATasové aktivity, např. 1-2000 mg/kg, a s výhodo 10-800 mg/kg, před chemoterapií.

Neoplasie, pro něž je léčba temozolomidem obzvláště vhodná, zahrnují karcinomy, melanomy, 25 sarkomy, lymfomy a leukemie, se specifickou využitelností při astrocytomy, gliomy, zhoubné malenomy, a mycosis fungoides, Edwingovy sarkomy, chronické lymfocytální leukemie, a nádory plic a prsů. Obzvláště dramatické zesílení aktivity temozolomidu inhibitorem ATasy bylo nalezeno u buněk nádorů prsů, astrocytomů a kolorektálních národů.

Typické rozsahy dávkování temozolomidu jsou obecně mezi 0,1 a 200, s výhodou 1 a 20 mg/kg tělesné váhy denně, nebo vyjádřeno na plochu povrchu těla, asi 40 - 400, a s výhodou asi 150 300 mg/m² denně.

Kvantita potenciace inhibitorem Atasy je závislá na množství Atasy normálně přítomné 35 v konkrétním typu nádorových buněk. Nádorové buňky, které mají vyšší hladiny Atasy budou potencovány předchozím podáváním inhibitoru Atasy dramatičtěji.

Inhibitory Atasy využitelné v předkládaném vynálezu jsou ty, o nichž je známo, že mají takovouto aktivitu, například O⁶-alkylguaniny jako je O⁶-methylguanin, alkenylguaniny jako je 40 O⁶-allylguanin a O⁶-arylguaniny jako jsou O⁶-benzylguanin a benzylované guaninové, guanosinové a 2'-desoxyguanosinové sloučeniny popsané v mezinárodní přihlášce PCT WO 91/13898 (publikované 19. září 1991). Obzvláště vhodný pro použití v předkládaném vynálezu je O⁶benzylguanin.

Konkrétní dávkování inhibitoru ATasy závisí na množství ATasy normálně nalézaném v léčených nádorových buňkách, na věku a stavu pacienta a na konkrétním inihibitoru ATasy, jenž se použije.

O temozolomidu bylo zjištěno, že nejvýhodnější je jeho podávání v opakovaných dávkách v po 50 sobě následujících dnech, a dramatické potenciační účinky předkládaného vynálezu se realizují v tomto vysoce výhodném režimu, se zahrnutím podávání dávky inhibitoru ATasy před, nebo souběžně s, podáním každé dávky podávaného temozolomidu. S výhodou je používán jako inhibitor ATasy O⁶-benzylguanin spolu s temozolomidem podávaným v denním dávkování 150

-3CZ 286550 B6

-300 mgm'², ve čtyřech až pěti rozdělených dávkách během čtyř až pěti po sobě následujících dní (celková dávka 750 - 1500 mg/m²). S výhodou je každá dávka inhibitoru ATasy podávána 2-8 hodin před každou dávkou temozolomidu. Toto poskytuje největší potenciaci toxicity temozolomidu a vede k nej efektivnější léčbě konkrétní pacientovy neoplasmy. Nejvýhodnější je tento režim opakovat po intervalu asi čtyř (4) týdnů.

Altenativním dávkovacím rozvrhem pro podávání temozolomidu s O⁶-benzylguaninem je nepřetržitý rozvrh, při němž se tyto dva léky podávají na denním základě po období čtyř (4) nebo více dní. Tato kombinovaná terapie může být prodloužena jak je zapotřebí na základě pokračování, dokud se nedojde k remisi.

Navíc může být tvorba ATasy konkrétní lidskou nádorovou buňkou použita jako vyhledávací metoda k určení potenciace toxicity temozolomidu k řečené buňce. U výhodného způsobu se testuje obsah ATasy této konkrétní buněčné linie, např. metodou popsanou v Lee et a., Cancer Res., 51:619 (1991), a stanoví se potenciální senzitivita k temozolomidu. Takovéto stanovení pak umožňuje patřičnou kombinaci temozolomidu a inhibitoru ATasy pro podávání v terapeutickém režimu.

Inertní, farmaceuticky přijatelné nosiče pro přípravu farmaceutických prostředků ze sloučenin popsaných předkládaným vynálezem mohou být tuhé nebo tekuté. Prostředky v tuhé formě zahrnují prášek, tablety, disperzibilní granule, kapsle, dražé a čípky. Prášky a tablety mohou obsahovat od 5 do 70 procent aktivní složky. Vhodné tuhé nosiče jsou známé v oboru, např. uhličitan hořečnatý, stearát hořečnatý, talek, cukr, laktóza. Tablety, prášky, dražé a kapsle mohou být použity jako tuhé dávkovači formy vhodné k orálnímu podávání.

K přípravě čípků je napřed roztaven nízkotající vosk, jako je směs glyceridů mastných kyselin nebo kakaové máslo, a aktivní složky jsou v něm stejnoměrně dispergovány, třeba mícháním. Roztavená homogenní směs je pak nalita do forem vhodného tvaru a ponechána vychladnout a tím ztuhnout.

Prostředky v tekuté formě zahrnují roztoky, suspenze a emulze. Jako příklad mohou být vzpomenuty vodné roztoky nebo roztoky ve vodě-propylenglykolu pro parenterální injekce.

Zahrnuty jsou rovněž prostředky v tuhé formě, které mají být krátce před použitím převedeny na prostředky v tekuté formě buď pro orální, nebo parenterální podávání. Takovéto prostředky v tekuté formě zahrnují roztoky, suspenze a emulze.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být též podávány transdermálně. Transdermální přípravky mohou dostat formu krémů, tekutých prostředků, aerosolů a emulzí, a mohou být obsaženy v transdermální náplasti typu nosiče nebo rezervoáru, jak se v oboru konvenčně používá pro tento účel.

Farmaceutický prostředek je s výhodou v jednotkové dávkovači formě. V této formě je prostředek rozdělen do jednotkových dávek obsahujících patřičná množství aktivní složky, např. množství účinné k dosažení žádoucího účele.

Množství aktivní sloučeniny v jednotkové dávce lze obměňovat nebo nastavovat od asi 0,1 mg do 1000 mg, s výhodou od 1 mg do 500 mg, podle konkrétní aplikace.

Konkrétní použité dávkování se může obměňovat v závislosti na pacientovi a na vážnosti stavu, jenž má být léčen. Stanovení správného dávkování spadá pod znalosti v oboru. Pro pohodlí může být denní dávka rozdělena a podávána během dne v částech, pokud je to žádoucí.

-4CZ 286550 B6

Vynález zde zveřejněný je předváděn na následujících příkladech, jež se však nesmí považovat za omezení rozsahu tohoto zveřejnění.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Materiály a metody

Materiály

Médium pro buněčné kultury bylo zakoupeno od ICN Biochemicals Ltd. (High Wycombe, Velká Británie) a fetální telecí sérum od Gibco Ltd. (Paisley, Velká Británie). O⁶-benzylguanin (BG) byl laskavě dodán Dr. R. c. moschelem (NCI-Fredeick Cancer Research & Development Center, Frederick, Maryland, USA). Temozolomid a jeho chlorethyl analog, mitozolomid (8-karbamoyl3-(2-chlorrethylimidazo[5,l-d]-l,2,3,5-tetrazin-4-(3H)-on), byly syntetizovány u May and Baker Ltd. (Dagenham, Velká Británie) a uschovávány jako roztoky v DMSO při -70 °C. Všechny ostatní chemikálie byly zakoupeny u Sigma Chemical Co. Ltd. (Poole, Velká Británie).

Studie cytotoxicity

Buněčné linie byly rutinně rozrůstány jako monovrstvy vDMEM s dodatkem 10% fetálního telecího séra, 25 mM HEPES, glutaminu a penicilinu/streptomycinu. Studie cytotoxicity se prováděly v médiu bez HEPES, v atmosféře 5 % CO₂. 750 - 1000 buněk/jamku bylo naneseno na 96-ti jamkové destičky; na ně se působilo, po předcházející inkubaci přes noc, po 2 hodiny s nebo bez 33 μΜ BG. Temozolomid nebo CCNU pak byly přidány na 1 hodinu do téhož média, přičemž konečná koncentrace MDAO nepřevýšila 1 %. Buňky byly rozrůstány po dalších 7 dní v čerstvém médiu a pak byl stanoven obsah jejich bílkovin pomocí NCI sulforhodaminového stanovení popsaného Skehanem et al., J. Nati. Cancer Jnst., 82:1107 (1990); studie růstu ukázaly, že buňky byly během periody testu v logaritmické fázi růstu. Pro rozvrh opakovaného dávkování temozolomidu se na buňky působilo opakovaně v následných 24-hodinových působeních, s čerstvým médiem každý den. Testy se prováděly přinejmenším v duplikátech.

Lidské XP buňky, transfektované cDNA ATasy nebo kontrolní [Fan et a., Nucleic Acid Res., 18:5723 (1990)], byly rozrůstány v NEM a nanášeny 1000 buněk/jamku. Po 3 hodinách inkubace byl přidán temozolomid, čerstvě zředěný do MEM, a destičky byly inkubovány 5 dní. Přežívající buňky byly stanovovány jak je popsáno v Morten et al., Carcinogenesis, 13:483 (1992). V pokusech s BG bylo nanášeno po 300 buňkách v triplikátech na 9 cm misky a ponecháno k přichycení po 5 hodin. BG (10 μΜ v MEM) byl přidáván 3 hodiny před působením temozolomidem, jenž byl čerstvě zředěn v MEM obsahujícím 10 μΜ BG. Po 7 dnech byly kolonie obarveny s použitím Giemsa a spočítány.

Stanovení O⁶-alkylguanin DNA alkyltransferázy

Toto stanovení se provádělo jak je popsáno v Lee et al, Cancer Res., 51:619 (1991). Takto se inkubovala různá množství buněčných extraktů s DNA, jež obsahuje O⁶-methylguanin značený [³H] v methylové skupině, s výhodou při 37 °C po 2 hodiny v celkovém objemu 300 μΐ pufru 1 obsahujícího 1 mg/ml bovinního sérového albuminu. Po inkubaci se přidají v rychlém sledu bovinní sérový albumin (100 μΐ 4 M roztoku). Přidají se další 2 ml 1 M kyseliny chloristé a směs se zahřívá při 75 °C po 40 minut k degradaci DNA na materiál rozpustný v kyselině. Bílkovina, v níž je obsažena methylovaná ATasa, se pak získá centrifugací, a promyje 4 ml 1 M kyseliny

-5CZ 286550 B6 chloristé před resuspendováním v 300 μΐ 0,01 M hydroxidu sodného, rozpouštěním v 3 ml vodné scintilační kyseliny (Ecoscint A: National Diagnostics) a mřením radioaktivity. Obsah bílkoviny v buňkách byl stanovován s použitím soupravy na stanovování bílkovin BioRad a bovinního sérového albuminu jako standardu. Aktivita ATasy je vyjádřena jako fmol množství methylů 5 přenesených do bílkoviny na 1 mg celkové bílkoviny v extraktu.

Buněčný záchyt [ⁱ⁴C]-značeného temozolomidu

8-karbamoyl-3-[^l4C]methylimidazo[5,l-d]-l,2,3,5-tetrazin-4-(3H)-on (specifická aktivita 10 26,3 mCi/mmol) byl laskavě dodán Dr. Johnem Slackem (Acton Molecules Ltd, Bimingham,

Velká Británie). Buněčné suspenze (5 x 10⁶/ml) byly uvedeny do rovnováhy při 4 °C a působilo se na ně 200 μΜ značeným léčivem. 10⁶ buněk se pipetovalo do Eppendorfových zkumavek a centrifugovalo skrz 250 μΐ olejové směsi (4 : 1 „Three-in-One‘7Dow Coming silikonový olej). Vodná vrstva byla odtažena a olejová vrstva opatrně promyta dalšími 300 μΐ sodného roztoku. 15 Po centrifugaci byly odtaženy dvě vrstvy, buněčná peleta rozpuštěna v solubilizátoru buněk jako je Protosol^R (kvartemí hydroxid amonný v toluenu) a přidána do scintilačních lahviček obsahujících Optiphase^R (95-99 % diisopropylnafitalen).

Výsledky studií cytotoxicity

Data jsou uvedena níže v Tabulce I.

Tabulka I

Cytotoxicita jednotlivé dávky

BUNĚČNÁ LINIE	TEMOZOLIMID	CCNU	ATasa (fmol/mg proteinu)
	IC_5O	IC_5O	Poměr¹	IC₅o	IC50	Poměr¹
	[-BG]	[+BG]		[-BG]	[+BG]
	(μΜ)	(μΜ)		(μΜ)	(μΜ)
PRS ZR-75-+	32	23	1,4	12	25	0,5	<10
MCF-7	325	171	1,9	70	31	2,2	581,3
ASTROCYTOMA U87MG	172	131	1,3	28	8,8	3,2	21,9
U3737	131	78	1,7	15	12	1,2	53,2
KOLOREK- TÁLNÍ LS174T	873	632	1,4	73	13	5,7	199,6
LOVO	848	323	2,6	92	32	2,9	529,0
MAXI	1173	335	3,5	133	30	4,4	992,3
XP LINIE pZip	23²			(0,8)²’³		__	<2
PhAT	100²	-	-	(4,2)^2,3	-	-	1240

Buňky byly vystaveny v buněčné kultuře +/- O⁶-benzylguaninu (BG) před jednotlivou dávkou 30 temozolomidu nebo CCNU

-6CZ 286550 B6

1. IC₅₀ [-BG]/IC_J0 [+BG],

2. Výsledky získané MTT stanovením Wassermana et al, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., 15:699 (1988).

3. Čísla v závorkách se týkají mitozolomidu.

Data z Tabulky I, jež jsou graficky ukázána v Obrázku 1, vykazují smysluplnou korelaci mezi citlivostí (jak je měřena koncentrací, která poskytuje 50 % růstu neboli IC₅₀) nádorové buněčné linie k temozolomidu (r = korelační koeficient = 0,87) nebo CCNU (r = korelační koeficient = 0,92) a jejich obsahem ATasy. Sklony jsou skoro rovnoběžné až na to, že CCNU je na molámím základě přibližně pětkrát toxičtější. Jednou výjimkou byla Linie MCF-7, kteráje mírně citlivá k temozolomidu a má relativně vysokou aktivitu ATasy. Buňky, na které se předem působilo netoxickou dávkou BG byla až 3,5-krát resp. šestkrát citlivější k temozolomidu nebo CCNU.

Kontrolní XP buňky (buňky xeroderma pigmentosa transfekované pZipneoSV(X)l [Fan et al., Nucleic AcidRes., 18:5723 (1990)]), které exprimují stěží detekovatelné hladiny ATasy, jsou 45 krát citlivější k temozolomidu nebo CCNU-podobnému činidlu mitozolomidu než lidská buňka transfekované cDNA ATasy (viz Tabulku I). V testech tvorby kolonií použitých u cytotoxicity temozolomidu (viz Obrázek 2) vykazuje předchozí působení BG podobný stupeň potenciace pro lidské Atasou transfekované XP buňky jako pro nádorové buňky, ale nemá žádný měřitelný účinek na kontrolní XP buňky, které neexprimují Atasu. I když BG depletoval Atasou aktivitu lidských Atasou transfekovaných XP buněk a nádorových buněk (viz níže), tyto buňky zůstaly resistentnější k temozolomidu než kontrolní pZip-transfekované fibroblasty.

Data pro rozvrh opakovaných dávek jsou ukázány níže v Tabulce II.

Tabulka II

Cytotoxicita opakovaných dávek temozolomidu [IC₅₀ (μΜ)]

BUNĚČNÁ LINIE	DEN 1	DEN 2	DEN 3	DEN 4	DEN 5
	-BG	+BG	-BG	+BG	-BG	+BG	-BH	+BG	-BG	+BG
U373				51	18
MAWI	319	196	350	59	383	21	383	7,2	326	1,0
MCF-7	319	89	319	51	375	11

Buňky byly vystaveny v buněčné kultuře +/- O⁶-benzylguaninu (BG) před opakovanými denními dávkami temozolomidu.

Rozvrh opakovaných dávek vykazoval dramatickou potenciaci toxicity temozolomidu O⁶benzylguaninem (BG) v buňkách MAWI a MCF-7 (viz též Obrázek 3).

Po působení pěti 24-hodinových dávek byla buněčná linie MAWI 300 krát citlivější k temozolomidu, když byl přítomen BG. Opakované dávky temozolomidu nejsou samy o sobě toxičtější než jednotlivá 24—hodinová dávka v kterékoli buněčné linii. V podobném pokusu na buňkách U373, jež mají nízkou hladinu ATasy, přítomnost BG způsobila jen trojnásobnou potenciaci po čtyřech 24-hodinových dávkách.

Hladiny alkyltransferázy

Použité koncentrace BG rychle snižovaly na nedetekovatelnou úroveň původně vysoký obsah ATasy v buňkách MAWI a v lidských fibroblastech transfekovaných cDNA ATasy. Analýza

-7CZ 286550 B6

HPLC ukázala, že BG je v médiu pro tkáňové kultury stabilní přinejmenším po 24 hodin při 37 °C.

Pro temozolomid bylo nalezeno, že po tříhodinové inkubaci způsobuje pokles obsahu ATasy v buněčných liniích U373, MCF-7, LOVO a MAWI. Při 50 - 100 μΜ koncentraci bylo snížení kolem 50 % u každé linie (viz Obrázek 4), i přes 3-4 násobný rozdíl v cytotoxicitě k jednotlivé dávce temozolomidu mezi MCF-7 a kolorektálními liniemi (LOVO a MAWI). Podobné snížení bylo nalezeno u citlivější linii U373, i když hladiny ATasy byly blízko detekční hranici testu.

Pro eliminování možnosti rozdílů v transportu temozolomidu byl studován buněčný záchyt [¹⁴C]-značené sloučeniny v nejcitlivějších a nej rezistentnějších buněčných liniích (ZR-75-1 resp. MAWI). Výsledky uvedené v Obrázku 3 ukazují, že záchyt při 4 °C byl velmi rychlý, a úplný během 5 minut v obou buněčných liniích. Podobná množství léčiva byla nalezena v obou buněčných liniích, s úpravou vzhledem ke koncentraci bílkovin. Rychlý záchyt při 4 °C byl konzistentní s pasivní difúzí temozolomidu prokázanou drive ve dvou lymfoidních liniích Bellem et al., Biochem. Pharmacol., 36:3215 (1987).

Příklad 2

Orální prostředek________

Temozolomid

Laktóza, USP

Mikrokrystalická celulóza

Laurylsulfát sodný

Kukuřičný škrob

Stearát horečnatý mg na kapsli

100

213

Smíchej spolu temozolomid a laktózu, mikrokrystalickou celulózu, laurylsulfát sodný a kukuřičný škrob. Prosej skrz síto číslo 80. Přidej stearát hořečnatý, promíchej a uzavři do dvojdílných želatinových kapslí patřičné velikosti.

Příklad 3 ^{* *}

Orální prostředek________

O⁶-benzylguanin

Laktóza, USP

Mikrokrystalická celulóza

Laurylsulfát sodný

Kukuřičný škrob

Stearát hořečnatý mg na kapsli

100

213

Smíchej spolu O⁶-benzylguanin a laktózu, mikrokrystalickou celulózu, laurylsulfát sodný a kukuřičný škrob. Prosej skrz síto číslo 80. Přidej stearát hořečnatý, promíchej a uzavři do dvojdílných želatinových kapslí patřičné velikosti.

-8CZ 286550 B6

Příklad 4

Orální prostředek Temozolomid O⁶-benzylguanin Laktóza, Usp Mikrokrystalická celulóza Laurylsulfát sodný Kukuřičný škrob Stearát hořečnatý

mg na kapsli 100 100 213 30 20 25 2

Smíchej spolu temozolomid a O⁶-benzylguanin, laktózu, mikrokiystalickou celulózu, laurylsulfát sodný a kukuřičný škrob. Prosej skrz síto číslo 80. Přidej stearát hořečnatý, promíchej a uzavři do dvojdílných želatinových kapslí patřičné velikosti.

Příklad 5

Intravenózní prostředek Temozolomid Hydrogensiřičitan sodný, USP EDTA, dvojsodná sůl, USP Voda pro injekce, q.s. ad

mg/ml 100 3,2 0,1 1,0 ml

Příklad 6

Intravenózní prostředek Temozolomid O⁶-benzylguanin Hydrogensiřičitan sodný, USP EDTA, dvojsodná sůl, USP Voda pro injekce, q.s. ad

mg/ml 100 100 3,2 0,1 1,0 ml

Tento vynález může mít provedení jiných forem nebo může být provádět jinými cestami bez toho, že by se odklonil od svého ducha nebo svých základních charakteristik. Předkládané zveřejnění má být proto považováno ve všech ohledech za vysvětlující a ne omezující, přičemž roztah vynálezu je určen připojenými nároky, a záměrem je bez dalšího zahrnovat všechny směny, jež spadají pod stejný význam nebo rozsah ekvivalence.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kombinovaný farmaceutický prostředek pro simultání, oddělené nebo postupné použití pro léčbu lidských nádorových buněk, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství O⁶-benzylguaninu a účinné množství temozolomidu.
2. Kombinovaný farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že uvedený prostředek je pro simultání použití pro léčení rakoviny lidských buněk.
3. Kombinovaný farmaceutický prostředek podle nároku 1,vyznačující se tím, že uvedený prostředek je pro oddělené použití pro léčení rakoviny lidských buněk.
4. Kombinovaný farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že uvedený prostředek je pro následné použití pro léčení rakoviny lidských buněk.
5. Použití O⁶-benzylguaninu a temozolomidu pro přípravu farmaceutického prostředku pro simultání, oddělené nebo postupné použití při léčbě lidských nádorových buněk.
6. Farmaceutický kit pro použití při léčbě lidských nádorových buněk, vyznačující se tím, že obsahuje odděleně farmaceutický prostředek temozolomid a odděleně farmaceutický prostředek O⁶-benzylguanin.