JPH08505615A

JPH08505615A - ヒト腫瘍細胞におけるテモゾロミドの薬効の増強

Info

Publication number: JPH08505615A
Application number: JP6515840A
Authority: JP
Inventors: ベアー，ジョン・コリン; フリーマン，アザデ・アリソン; ニューランズ，エドワード・スチュアート; ワトソン，アマンダ・ジーン; ラファーティ，ジョセフ・アンソニー; マージソン，ジオフリー・ポール
Original assignee: キャンサー・リサーチ・キャンペーン・テクノロジー・リミテッド
Priority date: 1993-01-14
Filing date: 1994-01-13
Publication date: 1996-06-18
Also published as: IL108328A0; KR960700063A; CZ179795A3; TW414710B; EP0679086A1; ZA94248B; PL175842B1; MX9400434A; SK89295A3; KR100352046B1; CA2153775C; NO952781D0; UA29466C2; EP0922458A1; FI953423A; IL108328A; HUT72665A; CZ286550B6; MY116474A; NO952781L

Abstract

(57)【要約】種々の哺乳類新生物形成の治療において有用な抗腫瘍剤、テモゾロミドの毒性は、ATアーゼ阻害剤、即ちO⁶-ベンジルグアニンの前もっての投与により薬効増強できる。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト腫瘍細胞におけるテモゾロミドの薬効の増強発明の背景テモゾロミド（temozolomide）、即ち8-カルバモイル-3-メチルイミダゾ［5,1 -d］-1,2,3,5-テトラジン-4-（3H）-オン（CCRG 81045，NSC 362856）は有用な抗腫瘍効果を有していることが見出されている。これについては、Newlands et al.，Br．J．Cancer，65:287（1992）を参照されたい。臨床的には、テモゾロミドは星状細胞腫、神経膠腫、悪性黒色腫及び菌状息肉腫に対して活性を示す。この薬剤は、反復投与スケジュールに従って投与された場合に最も有効である。例えばMTIC（テモゾロミドの活性メチル化種）との反応からの、メチル化O⁶- アルキルグアニンは、タンパクO⁶-アルキルグアニンDNAアルキルトランスフェラーゼ（ATアーゼ）により修復される。従って、ATアーゼ発現細胞のメチル化剤による前処理（例えば、Zlotogoski et al.，Carcinogenesis，5:83，1984；Gibso n et al.，Cancer Res.，46:4995，1986）、O⁶-メチルグアニンによる前処理（例えばDolan et al.，Biophys．Res．Commun.，132:178，1985）またはO⁶-ベンジルグアニンによる前処理（O⁶-BG，Dolan et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U. S.A，87:5368，1990）は、クロロエチル化剤の細胞毒性活性を増加させるが、AT アーゼを発現しない細胞においては感受性化は殆どあるいは全く見られないことが示されている。米国特許第5,091,430号において、Moschel、Dolan及びPeggはATアーゼ活性の一時的な減少が、クロロエチル化剤の有効性を増強するのに必要なことの全てであると指摘している。PCT公開出願WO91/13898は、例えば、SF767細胞中でO⁶-ベンジルグアニンと組み合わせたときにMe CCNUについてはED₅₀の3.8分の１への減少を指摘している。従って、Moschel et al.は、アルキルトランスフェラーゼ涸渇剤とともに使用した場合のアルキル化剤の抗新生物形成活性の一般的な増強を示すものである。本出願人の発明は、ATアーゼ阻害剤の投与を含む特定の投与計画（dosing reg imen）を使用することにより、テモゾロミドの化学治療効果を劇的に増強できる（MIWI細胞系について300倍に及ぶ）ことにあり、これは驚くべきことであり、上記の以前の研究からは自明ではないことである。即ち、これまでテモゾロミド療法に対して感受性を有していなかったかあるいは僅かに感受性を有していたのみのヒト細胞癌を、テモゾロミドとATアーゼ阻害剤との組合せにより治療できるものである。従って、本発明の主たる目的は、テモゾロミドの抗新生物形成剤としての治療的有用性を、酵素O⁶-アルキルグアニンDNAアルキルトランスフェラーゼ（ATアーゼ）の阻害剤である薬効増強剤（potentiator）との組合せ治療により改良し、延長するための組成物及び方法を提供することである。本発明の別の目的は、これらの組成物及び方法を使用した、ヒト癌細胞に対するテモゾロミドの毒性の最適な薬効増強のための治療計画を提供することである。本発明のさらに別の目的は、ATアーゼ阻害剤の前もってのあるいは同時の投与により薬効を増強されたテモゾロミドの反復投与計画を提供することである。本発明のさらに別の目的は、特定のヒト癌細胞により生成されたATアーゼの量を測定することにより、その癌細胞のATアーゼ阻害剤によるテモゾロミド毒性の相対的薬効増強を測定する方法を提供することである。発明の要旨本発明は、O⁶-アルキルグアニンDNAアルキルトランスフェラーゼ（ATアーゼ）の阻害剤を用いた、ヒト癌細胞におけるテモゾロミド毒性の薬効増強に関する。さらに、最適な治療のための投与計画、及びテモゾロミドに感受性を有する可能性のあるヒト癌細胞を同定する方法が提供される。図面の簡単な説明図１は、テモゾロミド（■）及びCCNU（×）の細胞毒性（IC₅₀）と、ヒト腫瘍細胞系（ATアーゼレベルが増加する順に）ZR-75-1、U87MG、U373、LS174T、LOVO 、MCF-7及びMAWIにおける細胞ATアーゼレベルとのグラフである。図２は、pZipneoSV（X）1-トランスフェクト（○、■）またはphAT-トランスフェクト（▼、▲）XP-誘導細胞系中の、10μM BG存在下（■、▲）もしくは不存在下（○、▼）におけるテモゾロミドの細胞毒性のグラフである。誤差線は+/-1 標準偏差を示す。図３は、BGとの予備インキュベーションした場合のIC₅₀（+BG）と比較した、薬剤のみの場合のIC₅₀（-BG）の、MAWI（×）、MCF-7（▼）またはU373（＃）ヒト腫瘍細胞系におけるテモゾロミドの反復毎日投与量の細胞毒性比のグラフである。図４は、ヒト腫瘍細胞系、LOVO（■）、MAWI（×）、MCF-7（▼）、U373（＃）におけるATアーゼレベルに対するテモゾロミドの増加する濃度の効果のグラフである。図５は、¹⁴C-テモゾロミドにより処理された細胞による4℃での放射活性標識の取り込みのグラフである。MAWI（■）、ZR-75-1（×）。発明の詳細な説明ヒト癌の治療に有用な抗腫瘍剤、テモゾロミドの毒性は、酵素O⁶-アルキルグアニンDNAアルキルトランスフェラーゼ（ATアーゼ）の阻害剤である薬効増強剤とともにそれを使用することにより大きく増大することができる。特に、ATアーゼ阻害剤、例えばO⁶-ベンジルグアニン（BG）の使用は、本発明のスケジュール化された投与計画に使用した場合、例えばMAWI細胞系において、約300倍までテモゾロミドの毒性を増強することができ、これまでそのような治療に対しては感受性を有さないか僅かしか感受性を有さなかったヒト癌の化学療法におけるテモゾロミドの使用を可能とするものである。テモゾロミドとロムスチン（CCNU）の同様な毒性（１時間の薬剤露出の後）は、いくつかのヒト腫瘍細胞系により示すことができ、そのATアーゼ含量と関連している。従って、DNA中のグアニンのO⁶-位置のテモゾロミドによるメチル化は細胞毒性障害を起こす。ヒト癌細胞をその相対ATアーゼ生産についてスクリーニングすることにより、テモゾロミドに対する感受性を測定することができる。即ち、大きな量のATアーゼを生産する細胞は少ない量のATアーセルベルを生産するものよりも、テモゾロミドのみに対して感受性が低い。 BGの単一投与により細胞を前処理することにより、テモゾロミド毒性の中程度の増加（４倍未満）が起こる。テモゾロミド及びロムスチン（CCNU）についての増強の程度は同様な大きさである。コロニーアッセイにおいて、BGにより前処理されたヒトATアーゼcDNA-トランスフェクト繊維芽細胞は、ATアーゼタンパクが除去されていても、対照のトランスフェクト繊維芽細胞よりもテモゾロミドに対してより抵抗性が高いままであった。これはテモゾロミド輸送の相違によるものではなく、単にphAT繊維芽細胞によりATアーゼが再合成され阻害剤による前処理の効果が減じられたことを示しているようである。しかし、最も驚くべきことは、BGによるテモゾロミド毒性の大きな薬効増強（約300倍まで）が、MAWI細胞系において５日間の処置の後に見られたことである。同じく高いレベルのATアーゼを含有するMCF-7細胞においても同様の増強の程度が見られたが、低いレベルを有するU373細胞では小さな効果しか見られなかった。MAWI及びMCF-7細胞系の試験における結果は、ATアーゼ阻害剤が連続的に存在することにより、DNA損傷を形成し得ることを示している。従って本発明は、ATアーゼ阻害量のATアーゼ阻害剤を投与することによる、ヒト癌細胞中でテモゾロミドの毒性の薬効を増強する方法、及びヒト癌細胞の治療における同時の、あるいは別々の、あるいは連続的な投与のための、テモゾロミドとATアーゼ阻害剤とを混合調製物として含む製品を提供するものである。好ましくは、ATアーゼ阻害剤のこの投与は、数日または多数日の期間にわたって反復されるものであり、テモゾロミドの投与量の投与の前に行われる。反復投与量は１、２、３、４あるいは５日において投与されることができ、４または５日が好ましい治療の期間である。さらに最も好ましくは、テモゾロミドは複数日の期間にわたって反復投与量により患者に投与され、ATアーゼ阻害剤のATアーゼ阻害量はテモゾロミドの各投与量の前に投与され、その結果、ヒト癌細胞に対するテモゾロミドの顕著に増加した毒性、例えばMAWI細胞系について約300倍の毒性が得られる。好ましい態様においては、ATアーゼ阻害剤は、ATアーゼ阻害量、即ち、ATアーゼ阻害剤をテモゾロミドと同時に使用した場合に、正常な組織に過度な感受性化を起こすことなく、インビボで腫瘍を感受性にさせるのに充分な量で投与される本発明において使用される使用するATアーゼ阻害剤の量は、腫瘍細胞を治療するのに必要とされる有効量の程度により変化する。適した投与量は、それにより生じる治療される腫瘍細胞におけるATアーゼ阻害剤の濃度が、ATアーゼ活性の消失を生じるようなものであり、例えば、化学療法の前に、約１〜2000mg/kg、及び好ましくは約10〜800mg/kgである。テモゾロミドが特に適した治療である新生物としては、カルシノーマ、黒色腫、肉腫、リンパ腫、及び白血病があり、具体的な用途としては、星状細胞腫、神経膠腫、悪性黒色腫、菌状息肉腫、ユーイング肉腫、慢性リンパ球白血病、並びに肺癌及び乳癌がある。ATアーゼ阻害剤によるテモゾロミド活性の特に劇的な増強は乳癌、星状細胞腫、及び結直腸癌細胞において見られる。テモゾロミドの典型的な投与量範囲は、一般的には１日あたりO.1〜200mg/kｇ体重、好ましくは１〜20mg/kg体重であり、あるいは体表面積で表すと、１日あたり約40〜400mg/m²、好ましくは約150〜300mg/m²である。 ATアーゼ阻害剤による薬効増強の量は、特定の癌細胞種に通常存在するATアーゼの量に依存する。ATアーゼのより高いレベルを有する癌細胞において、ATアーゼ阻害剤の予備的投与により、より劇的に薬効が増強されることになる。本発明において使用できるATアーゼ阻害剤は、そのような活性を有するものとして知られているものであり、例えば、O⁶-メチルグアニンのようなO⁶-アルキルグアニン、O⁶-アリルグアニンのようなO⁶-アルケニルグアニン、O⁶-ベンジルグアニンのようなO⁶-アリールグアニン、及びPCT国際出願WO91/13898（1991年９月 19日公開）に記載されたO⁶-ベンジル化グアニン、グアノシン、及び2'-デオキシグアノシン化合物がある。本発明における使用に特に適しているのはO⁶-ベンジルグアニンである。 ATアーゼ阻害剤の具体的な投与量は、治療される癌細胞に通常見られるATアーゼの量、患者の年齢及び症状、使用される具体的なATアーゼ阻害剤に依存する。テモゾロミドは連続的な日において反復没与量で投与されるのが最も好ましいことが判明し、本発明の劇的な薬効増強効果は、投与されるテモゾロミドの各投与量の投与に先立って、あるいはそれと同時にATアーゼ阻害剤のATアーゼ阻害投与量を投与することを含む非常に好ましい投与計画において実現される。好ましくは、４〜５日の連続した日において150〜300mg/m²の１日あたりの量での４または５の分割された投与量（合計投与量750〜1500mg/m²）で投与されるテモゾロミドとともに、O⁶-ベンジルグアニンがATアーゼ阻害剤として使用される。好ましくは、ATアーゼ阻害剤の各投与量は、テモゾロミドの各投与量の２〜８時間前に投与される。これによりテモゾロミド毒性の最大の薬効増強が得られ、患者の特定の新生物の最も有効な治療が得られる。最も好ましくは、この投与計画は約４週の間隔をおいて反復される。 O⁶-ベンジルグアニンとともにテモゾロミドを投与するための別の投与スケジュールは、前記２種の薬剤を４日以上の期間毎日投与する、連続的なスケジュールである。この組合せによる治療は、緩解が得られるまで必要により連続的に延長することができる。さらに、特定のヒト癌細胞のATアーゼ生産は、該細胞に対するテモゾロミド毒性の薬効増強を測定するスクリーニング方法として使用することができる。好ましい方法においては、特定の細胞系のATアーゼ含量を、例えばLee et al.，Canc er Res.，51:619（1991）により記載された方法によりアッセイし、テモゾロミドに対する潜在的な感受性を測定する。そしてこのような測定により、治療計画において投与されるテモゾロミド及びATアーゼ阻害剤の適当な組合せが可能となる。本発明により開示される化合物から医薬組成物を製造するためには、不活性な医薬上許容されるキャリアは固体でも液体でもよい。固体形態の調製物としては、散剤、錠剤、分散可能な顆粒、カプセル、カシェ及び座剤がある。散剤及び錠剤は、約５〜約70％の活性成分を含むことができる。適当な固体キャリアは当分野で知られており、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース等である。錠剤、散剤、カシエ及びカプセルを経口投与に適した固体投与形態として使用することができる。座剤を製造するためには、低い融点のワックス、例えば脂肪酸グリセリドあるいはカカオバターの混合物を最防に溶融し、その中に攪拌により活性成分を均一に分散させる、。溶融状態の均一な混合物を好適なサイズの型に注入し、冷却して固化させる。液体形態の調製物は、溶液、懸濁液、及び乳液を含む。例としては、非経口注射用の水または水−プロピレングリコール溶液が挙げられる。使用の直前に経口または非経口投与用の液体形態の調製物にされる固体形態の調製物も含まれる。そのような液体形態は、溶液、懸濁液、及び乳液を含む。本発明の化合物は、経皮的にも投与することができる。経皮的組成物は、クリーム、ローション、エアロゾル、及び／または乳液の形態を取ることができ、マトリックスあるいはレザバータイプの経皮パッチ中に含めることもでき、これらはこの目的で当分野において慣用なものである。好ましくは、前記医薬調製物は単位投与量形態にあるものである。そのような形態においては、この調製物は活性成分の適当な量、例えば所望の目的を達成するのに有効な量を含む複数の単位投与量にさらに分けられている。調製物の単位投与量中の活性化合物の量は、特定の用途により、約0.1mg〜100 0mg、より好ましくは約１mg〜500mgに変化させ、調整することができる。実際に使用する投与量は、患者における要請、及び治療する症状の重篤度により変化させることができる。特定の場合における適当な投与量の決定は、当分野の技術の範囲である。便宜的には、所望により、１日あたりの全投与量をその日の間に部分的に分けて投与してもよい。テモゾロミドは、Wasserman et al.，Cancer，36:1258-1268（1975）に記載されたもののような慣用の方法を使用して投与することができる。適当な場合には、１日あたり40〜400mg/m²、好ましくは150〜300mg/m²の量で、１〜５、好ましくは４〜５の投与量を１〜５日、好ましくは４〜５日の連続した日にわたって経口投与することが特に好ましい。連続的投与治療計画については25〜250mg/m²の１日投与量の静脈内投与が好ましい。経口投与は反復投与計画に使用することができる。 ΛTアーゼ阻害剤は別にテモゾロミドより前に、あるいはそれと同時に投与することができる。そのようにすることが望ましい場合には、ATアーゼ阻害剤及びテモゾロミドを１つの単位投与形態に合わせ、患者への投与を容易にすることができる。そのような組み合わせた投与形態は上記した投与形態のいずれのものでもよいが、上記したように、好ましくは経口あるいは静脈投与形態のものである。テモゾロミド及びΛTアーゼ阻害剤はキットの形態に包装することができる。そのようなキットにおいては、テモゾロミド及びATアーゼ阻害剤は、特定の投与経路のための特定の投与量形態に個々に配合され、内容物の投与のための説明書を含む。経口用配合物についての典型的な態様においては、そのようなキットは、別々に配合されたテモゾロミドとATアーゼ阻害剤の経口投与形態を含むブリスターパッケージの形態のものとすることができる。投与量における任意の必要な調整を行い、個々の患者の化学療法の要請に容易に適合させることができ、習熟した実務者であればしかるべく調整することができる。ここに開示される本発明を以下の調製実施例により例示するが、開示の範囲を限定するものと解されるべきではない。実施例１材料及び方法材料組織培養培地は、ICN Biomedicals Ltd.（High Wycombe，UK）から購入し、胎児子ウシ血清はGibco Ltd（Pais1ey，UK）から購入した。O⁶-ベンジルグアニン（BG）はDr．R.C．Moschel（NCI-Frederick Cancer Research & Development Ce nter，Frederick，Maryland，USA）からその好意により提供を受けた。テモゾロミド及びそのクロロエチル類似体、ミトゾロミド（8-カルバモイル-3-（2-クロロエチル）イミダゾ［5,1-d］-1,2,3,5-テトラジン-4-（3H）-オン）はMay and Baker Ltｄ（Dagenham，UK）により合成されたものであり、DSMO中の溶液として -70℃で貯蔵した。その他の全ての化学物質はSigma Chemical Co．Ltd.（Poole ，UK）から購入した。細胞毒性試験細胞系は、通常は10%胎児子ウシ血清、25mM HEPES、グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したDMEM中で単層として増殖させた。細胞毒性試験は５%CO²雰囲気中でHEPESを含まない培地中で実施した。96ウェルプレート中、750〜1000細胞／ウェルをプレーティングし、一晩インキュベートした後、3 3μM BGにより２時間処理するかまたはその処理を行わなかった。次いでテモゾロミドまたはCCNUを同じ培地に１時間にわたって加えた。最終的なDMSO濃度は１ %を越えなかった。細胞を新鮮な培地中でさらに７日間増殖させ、Skehan et al. ，J．Natl．Cancer Inst.，82:1107（1990）により記載されたNCIスルホローダミンアッセイによりタンパク含量についてアッセイした。増殖試験により細胞がアッセイ期間中に対数増殖期にあったことが示された。反復テモゾロミド投与スケジュールについては、各日新鮮な培地で細胞に連続的な24時間処理を行った。アッセイは少なくとも２つずつ行った。ヒトATアーゼcDNAトランスフェクトまたは対照XP細胞（Fan et al.，Nucleic Acid．Res.，18:5723（1990））をMEM中で増殖させ、1000細胞／ウェルをプレーティングした。３時間のインキュベーションの後、MEM中に新たに希釈したテモゾロミドを加え、プレートを５日間インキュベートした。Morten et al.，Carci nogenesis，13:483（1992）に記載されたようにして生存細胞をアッセイした。B G実験においては、９cmプレートに300細胞をプレーティングし、５時間接着させた。これは３つずつ行った。BG（MEM中10μM）を加え、３時間後に10μM BGを含むMEM中に新たに希釈したテモゾロミドで処理した。７日間の後、コロニーをギームザ法で染色しカウントした。O⁶-アルキルグアニンDNAアルキルトランスフエラーゼアッセイこのアッセイは、Lee et al.，Cancer Res.，51:619（1991）に記載されたようにして行った。即ち、種々の量の細胞抽出物を、メチル基を［H³］で標識されたO⁶-メチルグアニンを含むDNAと、好ましくは37℃で２時間、バッファー１中の１mg/mlのウシ血清アルブミンの300μlの全容量中でインキュベートする。インキュベートの後、ウシ血清アルブミン（バッファー１中の10mg/ml溶液の100μl ）及び過塩素酸（４M溶液の100μl）を素早く連続的に加目える。さらに２mlの１M過塩素酸を加え、混合物を75℃で40分間加熱しDNAを酸に可溶な物質に分解する。次にメチル化ATアーゼを含むタンパク質を遠心分離により回収し、４mlの１M 過塩素酸で洗浄し、その後300μlの0.01M水酸化ナトリウム中に再懸濁し、３ml の水性シンチレーシヨン液体（Ecoscint A： National Diagnostics）中に溶解し、カウントする。細胞のタンパク質含量を、ウシ血清アルブミンを標準として使用して、BioRadタンパク質アッセイキットにより測定した。ATアーゼ活性を、抽出物中の全タンパク質のmgあたりタンパク質に転位されたfmolメチルとして表した。［C¹⁴］-標識テモゾロミドの細胞取り込み 8-カルバモイル-3-［C¹⁴］メチルイミダゾ［5,1-d］-1,2,3,5-テトラジン-4- （3H）-オン（比活性26.3mCi/mmole）をDr．John Slack（Aston Molecules Ltd ，Birmingham，UK）から、その好意により提供を受けた。細胞懸濁物（５ｘ10⁶/ ml）を４℃において平衡化させ、200μMの前記標識薬剤で処理した。10⁶細胞をピペットでエッペンドルフ管中に取り、250μlのオイル混合物（4:1“Three-in- One”/Dow Corningシリコンオイル）を通して遠心分離にかけた。水性層を吸引し、油層を別の300μlの塩水により穏やかに洗浄した。遠心分離の後、両層を吸引し、）を含むシンチレーションバイアルに加えた。細胞毒性試験の結果データを下記表Ｉに示す。表Ｉのデータは図１にグラフとして示したが、腫瘍細胞系のテモゾロミド（ｒ =相関係数=0.87）またはCCNU（ｒ=相関係数=0.92）に対する感受性（50%の増殖を与える濃度、即ちIC₅₀により測定）と、それらのATアーゼ含量との間の理にかなった相関を示している。CCNUがモルベースにおいて約５倍毒性が高いことを除いて、傾斜は殆ど平行である。１つの例外はMCF-7系であり、これはテモゾロミドに対して中程度の感受性を有し、比較的高いATアーゼ活性を有する。非毒性投与量のBGで前処理された細胞系は、テモゾロミド及びCCNUに対してそれぞれ3.5 倍及び６倍感受性が高かった。対照のXP細胞（pZipneoSV（X）１によりトランスフェクトされた色素性乾皮症（xeroderma pigmentosa）細胞（Fan et al.，Nucleic Acids Res.，18:5723，1 990）はかろうじて検出できるレベルのATアーゼを発現するが、テモゾロミドまたはCCNU-関連薬剤ミトゾロミドに対して、ヒトATアーゼcDNAトランスフェクト細胞よりも４〜５倍高い感受性を有する（表Ｉ参照）。テモゾロミドの細胞毒性についてのコロニー形成アッセイにおいては（図２参照）、BG前処理によりヒト ATアーゼトランスフェクトXP細胞について、ヒト腫瘍細胞についてと同様の程度の薬効増強を示したが、ATアーゼを発現しない対照のXP細胞に対しては何等測定可能な影響を及ぼさなかった。BGは前者の細胞中においてATアーゼ活性を消失させるが（下記参照）、これらは対照のpZipトランスフェクト繊維芽細胞よりもテモゾロミドに対してより高い抵抗性を有するままであった。反復投与スケジュールのデータを下記表IIに示す。反復投与スケジュールは、MAWI及びMCF-7細胞においてBGにより劇的なテモゾロミド毒性の薬効増強を示した（図３も参照）。５回の24時間投与量による処置の後、MAWI細胞系は、BGが存在する場合、テモゾロミドに対して300倍を越えて感受性が強くなった。テモゾロミドの複数回の投与それ自体では、いずれの細胞系においても単一の24時間投与量よりも毒性が強いということはない。低いレベルのATアーゼを有するU373細胞についての同様の実験において、BGの存在は４回の24時間投与量の後に３倍の薬効増強を起こしただけであった。アルキルトランスフエラーゼレベル使用したBGの濃度は、MAWI細胞及びヒトATアーゼcDNAトランスフェクトXP繊維芽細胞の当初は高かったATアーゼ含量を検出できないレベルに急速に減少させた。HPLC分析により、BGは組織培養培地において37℃で少なくとも24時間安定であることが判った。３時間のインキュベーションの後、テモゾロミドは、U373、MCF-7、LOVO及びM AWI細胞系中のATアーゼ含量を減少させることが判った。各細胞系について50〜 100μMにおいて50%の減少が見られたが（図４参照）、単一投与量によるテモゾロミド細胞毒性においてMCF-7及び結直腸系（LOVO及びMAWI）の間には３〜４倍の違いがあった。同様の減少がより感受性の高いU373系において見られたが、AT アーゼレベルはアッセイの検出限界に近いものであった。テモゾロミド輸送における相違の可能性を除去するために、前記［C¹⁴］-標識化合物の細胞取り込みを、最も感受性の高い細胞系と最も抵抗性の強い細胞系（それぞれZR-75-1及びMAWI）により試験した。図５に示した結果は、４℃において取り込みが非常に急速であり、両方の細胞系において５分以内に終了したことを示している。タンパク質濃度について調整した場合、同様な量の薬剤が両方の細胞系において見られた。４℃における急速な取り込みは、２つのリンパ系において以前にBull et al.，Biochem．Pharmacol.，36:3215（1987）により示された、テモゾロミドの受動的拡散に合致するものである。実施例２経口用配合物カプセルあたりmg テモゾロミド 100 ラクトース，USP 213 微結晶セルロース 30 ラウリル硫酸ナトリウム 20 コーンスターチ 25 ステアリン酸マグネシウム 2 テモゾロミドとラクトース、微結晶セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム及びコーンスターチを混合する。No．80のスクリーンを通し、ステアリン酸マグネシウムを加え、混合し、適当なサイズの２ピースゼラチンカプセル内に封入する。実施例３経口用配合物カプセルあたりmg O⁶-ベンジルグアニン 100 ラクトース，USP 213 微結晶セルロース 30 ラウリル硫酸ナトリウム 20 コーンスターチ 25 ステアリン酸マグネシウム 2 O⁶-ベンジルグアニン、ラクトース、微結晶セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム及びコーンスターチを混合する。No．80のスクリーンを通し、ステアリン酸マグネシウムを加え、混合し、適当なサイズの２ピースゼラチンカプセル内に封入する。実施例４経口用配合物カプセルあたりmg テモゾロミド 100 O⁶-ベンジルグアニン 100 ラクトース，USP 213 微結晶セルロース 30 ラウリル硫酸ナトリウム 20 コーンスターチ 25 ステアリン酸マグネシウム 2 テモゾロミド及びO⁶-ベンジルグアニン、ラクトース、微結晶セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム及びコーンスターチを混合する。No．80のスクリーンを通し、ステアリン酸マグネシウムを加え、混合し、適当なサイズの２ピースゼラチンカプセル内に封入する。実施例５静脈内配合物 mg/ml テモゾロミド 100 亜硫酸水素ナトリウム，USP 3.2 エデト酸２ナトリウム，USP 0.1 注射液用水，q.s．ad 1.0ml 実施例６静脈内配合物 mg/ml テモゾロミド 100 O⁶-ベンジルグアニン 100 亜硫酸水素ナトリウム，USP 3.2 エデト酸２ナトリウム，USP O.1 注射液用水，q.s．ad 1.Oml 本発明は、その概念あるいは必須の特徴を逸脱することなく別の形態に具体化しあるいは別のやり方で実施することができる。従って、本明細書における開示はあらゆる点において例示的なものであって制限的なものではないと考えるべきで、本発明の範囲は添付の請求の範囲により示されるものであり、均等なものの意味及び範囲内にある全ての変更はその範囲内に含まれるものであることを意図するものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者フリーマン，アザデ・アリソンイギリス国シーアール４・３エスビークロイドン，ミッチャム，ヴィールス・ミード 51 (72)発明者ニューランズ，エドワード・スチュアートイギリス国ロンドンエヌダブリュー１・４キューピー，ニューイントン・グリーン・ロード３ (72)発明者ワトソン，アマンダ・ジーンイギリス国エスケイ14・２エスダブリューチェシャー，ゴッドリー・ハイド，セント・ポールズ・ヒル・ロード 44 (72)発明者ラファーティ，ジョセフ・アンソニーイギリス国エスケイ３・９エルジェイチェシャー，エッジリー・ストックポート, レイ・ストリート 14 (72)発明者マージソン，ジオフリー・ポールイギリス国エスケイ12・１ティーエイチチェシャー，ポイントン，ライム・ロード（番地なし），ヒルトップ・バンガロー

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト癌細胞中でテモゾロミドの毒性の薬効を増強する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、ATアーゼ阻害量のATアーゼ阻害剤と有効量のテモゾロミドを投与することによる前記方法。２．ATアーゼ阻害剤がテモゾロミドの投与の前に投与される請求項１に記載の方法。３．ATアーゼ阻害剤が、O⁶-アルキルグアニン、O⁶-アルケニルグアニン、O⁶-アリールグアニン、及びO⁶-ベンジル化グアニン、グアノシン、及び2'-デオキシグアノシン化合物からなる群から選択される請求項１に記載の方法。４．ATアーゼ阻害剤がO⁶-ベンジルグアニンである請求項１に記載の方法。５．投与される前記阻害剤の投与量が患者体重kgあたり約１〜2000mgである請求項１に記載の方法。６．投与されるATアーゼ阻害剤の投与量が患者体重kgあたり10〜800mgである請求項１に記載の方法。７．テモゾロミドが１日に体表面積m²あたり150〜300mgの割合で投与される請求項６に記載の方法。８．ATアーゼ阻害剤及びテモゾロミドが分割された投与量で連続した日において投与される請求項１に記載の方法。９．ATアーゼ阻害剤が患者体重kgあたり10〜800mgの投与量でテモゾロミドの投与の前に投与され、テモゾロミドが１日に体表面積m²あたり150〜300mgの量で投与され、ATアーゼ阻害剤及びテモゾロミドが分割された投与量で連続した日において投与される請求項１に記載の方法。 10．ATアーゼ阻害剤がO⁶-ベンジルグアニンである請求項９に記載の方法。 11．テモゾロミドの全投与量が少なくとも４つの個々の投与量に分割され、それが少なくとも４日の連続した日に投与される請求項10に記載の方法。 12．ATアーゼ阻害剤がテモゾロミドの投与の２〜８時間前に投与される請求項11 に記載の方法。 13．ヒト癌細胞が、乳癌腫瘍細胞、星状細胞腫腫瘍細胞、結直腸腫瘍細胞、黒色腫腫瘍細胞、菌状息肉腫腫瘍細胞、または神経膠腫腫瘍細胞である請求項１に記載の方法。 14．最初にATアーゼ阻害剤を投与し、次にテモゾロミドを投与することを含む組合せ治療によるヒト癌細胞の治療における使用のための医薬組成物の製造におけるATアーゼ阻害剤の使用。 15．最初にATアーゼ阻害剤を投与し、次にテモゾロミドを投与することを含む組合せ治療によるヒト癌細胞の治療における使用のための医薬組成物の製造におけるテモゾロミドの使用。 16．ヒト癌細胞の治療を必要とする患者におけるそのような治療のためのATアーゼ阻害剤及びテモゾロミドの使用。 17．ヒト癌細胞の治療を必要とする患者におけるそのような治療のための薬剤の製造のためのATアーゼ阻害剤及びテモゾロミドの使用。 18．有効量のATアーゼ阻害剤と有効量のテモゾロミドとを含む、ヒト癌細胞の治療を必要とする患者におけるそのような治療での使用のための医薬組成物。 19．医薬投与形態のテモゾロミドと別の医薬投与形態のATアーゼ阻害剤とを含む、ヒト癌細胞の治療を必要とする患者におけるそのような治療における使用のためのキット。 20．テモゾロミド及びATアーゼ阻害剤を１以上の医薬的に許容されるキャリアと混合することを含む医薬組成物の製造方法。 21．テモゾロミドとATアーゼ阻害剤を、ヒト癌細胞の治療を必要とする患者に対する、そのような治療における、同時の、あるいは別々の、あるいは連続的な投与のための組み合わせた調製物として含む製品。 22．ATアーゼ阻害剤によるテモゾロミド毒性の薬効増強についてヒト癌細胞をスクリーニングする方法であって、前記細胞のATアーゼ含量をアッセイし、その含量がATアーゼ阻害剤の前もっての投与により減少されるのに充分なものであるかどうかを決定することを含む前記方法。