CZ2003930A3 - Vakcinační prostředek obsahující štěpený virus s obalem - Google Patents

Description

Oblast techniky

Popisují se nové vakcinační prostředky, způsoby výroby takových vakcín a použití uvedených vakcín při prevenci nebo léčbě onemocnění. Dále se popisují vakcíny zahrnující prostředky tvořené štěpenými viry s obalem.

Dosavadní stav techniky

Virus s obalem je virus, jehož jádro je obaleno vnějším obalem, který obsahuje virové proteiny a je bohatý na lipidy.

V určitém provedení vynálezu vakcinační prostředky obsahující štěpené viry s obalem se získaly z respiračního syncyciálního viru (RSV) a viru parainfluenza (PIV). Zvláště se popisuje RSV.

Lidský respirační syncyciální virus je člen virové rodiny Paramyxoviridiae a způsobuje onemocnění spodních cest dýchacích, zvláště u malých dětí a kojenců. Jisté zprávy naznačují, že RSV je také důležitý patogen u dospělých, zvláště u přestárlých lidí.

RSV je virus s obalem obsahující genom tvořený neděleným, negativním řetězcem kyseliny ribonukleové (RNA) obsahujícím 15 222 nukleotidů, které kódují 11 informačních RNA, přičemž každá kóduje jeden polypeptid. Tři z jedenácti proteinů jsou transmembránové povrchové proteiny. Jsou to proteiny G (zachycení), F (fúze) a SH. Jeden protein je matricový protein virionu (Μ), tři proteiny jsou složky nukleokapsidu (Ν, P a L) a 2 proteiny se nepodílejí na struktuře viru (NS1 a NS2) . Existují dva další proteiny M2-1 a M2-2. Jsou popsány dvě

antigenně odlišné podskupiny Charakterizace kmenů z těchto rozdíly spočívají v proteinu konzervativní.

RSV, označené jako A a B. podskupin ukázala, že hlavní G, zatímco proteiny F jsou

Výskyt respiračního syncyciálního viru (RSV) je sezónní, V mírném pásmu se vrchol jeho výskytu objevuje během zimy a v tropickém pásmu během období dešťů.

RSV způsobuje vážná onemocnění dolních cest dýchacích u dětí. Odhaduje se, že u 40 až 50 % dětí hospitalizovaných s bronchitidou a u 25 % dětí hospitalizovaných se zápalem plic je toto onemocnění způsobené infekcí RSV. Primární infekce RSV se obvykle objevuje u dětí mladších jednoho roku. 95 % dětí ve dvou letech vykazuje seroligicky důkazy o prodělané infekci a stejné důkazy je možné zjistit ve 100 % u dospělých.

U kojenců a malých dětí ve 40 % infekce postupuje z horních cest dýchacích do dolních cest dýchacích a dochází k vývoji bronchitidy nebo pneumonie. U dětí ve věku dvou až šesti měsíců je velké nebezpečí vývoje vážné infekce RSV (primární respirační selhání) a pro děti libovolného věku, které trpí onemocněním srdce nebo plic, pro nedonošené děti a děti, které jsou imunokompromitované, může dojít k vážným komplikacím.

Během celého života může dojít k opakované infekci se všemi symptomy, a je zřejmé, že RSV je důležitý patogen pro dospělé, zvláště pro staré lidi.

U dospělých se většinou infekce RSV podceňuje, protože se považuje převážně za dětskou infekci. Proto se důkaz RSV nepovažuje za podstatný k vysvětlení respiračního onemocnění. Navíc je obtížné RSV identifikovat v nosních sekretech u * * ····· ·· · • · ····· · · · • ··· ·· · · · · φ ·· ···· · · · · ·· ·· ·· ·· ·· dospělých, kteří již mají určitý stupeň imunity vůči viru. U mladých a středně starých dospělých jedinců dochází při infekci RSV k vývoji dlouhotrvajícího syndromu podobného rýmě.

U starých jedinců dochází k vývoji dlouhotrvajícího respiračního syndromu, který je těžko odlišitelný od chřipky.

V tomto případě se projevují symptomy zánětu horních cest dýchacích doprovázených onemocněním dolních cest dýchacích, které zahrnují pneumonii. Zvláště se uvažuje populace starých lidí žijících pohromadě v různých institucích, protože zahrnuje velký počet jedinců náchylných k infekci, kteří žijí pohromadě. Rozšíření infekce v takové populaci, kde jedinci mají řadu zdravotních problémů, které způsobují daleko vážnější průběh infekce, se velmi těžko kontroluje.

Dále, zprávy jistých studií hodnotící dopad infekce RSV, jako příčina hospitalizace u dospělých a v komunitě zdravých starých lidí, zdůrazňují důležitou úlohu infekce RSV u vážných onemocnění dolních cest dýchacích v této populaci. RSV se identifikoval jako jeden ze čtyř nejběžnějších patogenů, který způsobují vážné onemocnění dolních cest dýchacích, které vede k hospitalizaci dospělých. Také se ukázalo, že vážná infekce RSV u starých osob není omezena pouze na domy s pečovatelskou službou nebo situace epidemie. Infekce RSV způsobuje vážné onemocnění pacientů vysokého věku, kteří jsou členy komunity. Podobně hospitalizace v případě chřipky A, která je spojena s infekcemi RSV, je také spojena s vysokou úmrtností, s dlouhým pobytem v nemocnici, s vysokými náklady intenzivní péče a potřebou podpůrného dýchání.

Tyto studie zdůrazňují nutnost vytvoření účinné vakciny, která může zabránit vážným komplikacím infekce RSV, zvláště u malých dětí, dospělých a v komunitě starých zdravých nebo nemocných jedinců. Podobná nebezpečí se zvažují i v případě infekce způsobené virem PIV.

• ·

Podstata vynálezu

Vynález popisuje vakcinační prostředky obsahující štěpené viry s obalem, přičemž virem je respirační syncyciální virus nebo virus parainfluenzy.

Prostředek s výhodou zahrnuje farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku.

Vakcinační prostředky podle vynálezu se získaly od virů s obalem, které je možné štěpit. Viry s obalem se získaly z různých zdrojů, které zahrnují viry pocházející z člověka nebo zvířete. Vhodným virem je RSVA, RSVB, PIV 1, PIV 2 nebo PIV 3. V případě, že virus pochází ze zvířete, jako je například bovinní virus, jde s výhodou o rekombinantní virus.

Vakcinační prostředek podle vynálezu obsahuje jiný štěpený virus vybraný ze skupiny obsahující virus chřipky, respirační syncyciální virus, virus parainfluenzy, metapneumovirus, spalničkový virus, virus příušnic, virus Epstein-Barrové, herpesové viry, cytomegalovirus, virus dengue, virus žluté zimnice, virus klíšťové encefalitidy, virus japonské encefalitidy, virus zarděnek, východní, západní a venezuelský virus koňské encefalitidy a HIV.

Vakcinační prostředek zahrnuje antigen nebo antigeny patogenů v kombinaci se štěpeným prostředkem, aby došlo k další ochraně proti onemocnění. Vhodné antigeny, které nemusí pocházet ze štěpených prostředků zahrnují například antigeny z libovolných virů uvedených shora v textu a patogeny, které způsobují respirační onemocnění. Jsou to například mikroorganizmy Streptococcus Pneumoniae.

·* ·· ·· ···· • · · · ♦ · • ···· · · · • · · · · · · · ·

Vakcinační prostředky podle vynálezu jsou po zavedení schopny stimulovat ochrannou imunitní odezvu proti viru s obalem.

nezbytně, také být imunogenní

Dělení virů se provádí porušením nebo fragmentací celého viru, který je infekční (virus divokého typu nebo atenuovaný) nebo neinfekční (například deaktivovaný) pomocí štěpícího činidla, které je v obecném případě, ale ne povrchově aktivní činidlo. Štěpeným virem může chimérický rekombinantní virus, který obsahuje elementy z více jak jednoho odlišného viru. Porušení vede k úplnému nebo částečnému rozpuštění všech virových proteinů, které mění integritu viru.

Štěpený virus je možné získat tak, že se virus uvede do kontaktu se štěpícím činidlem podle vynálezu, přičemž dojde k plnému porušení virového obalu. Další virové proteiny se stávají zcela nebo částečně rozpustné. Ztrátou integrity po štěpení se virus stává neinfekční a je tak vhodný pro titrační testy in vitro. Po rozštěpení nejsou proteiny virového obalu spojeny s celými neporušenými viriony. Další virové proteiny jsou s výhodou po štěpení zcela nebo částečně rozpouštěny a proto nejsou spojeny nebo jsou pouze částečně spojeny s celým neporušeným virionem.

Účinek štěpícího činidla na obal viru a virové proteiny může být následován migrací štěpeného viru a virových proteinů v experimentech na sacharózovém polštáři s vizualizací analýzou Westernovým přenosem a elektronovou mikroskopií.

Příprava štěpených vakcinačních prostředků podle vynálezu může zahrnovat další kroky odstranění štěpících činidel a některých nebo většiny virových lipidových materiálů. Způsob přípravy štěpeného obalového viru může dále zahrnovat řadu ·« · · ► · · » · ··« různých filtrací a/nebo jiných separačních kroků, jako je ultracentrifugace, ultrafiltrace, zónová centrifugace a chromatografické kroky v různých kombinacích a deaktivační kroky, například s formaldehydem nebo β-propiolaktonem nebo ozářením UV zářením, které je možné provést před štěpením nebo po něm. Proces štěpení se může provést dávkovým, kontinuálním nebo semi-kontinuálním způsobem.

Štěpené vakcinační prostředky podle vynálezu v obecném případě obsahuje membránové fragmenty a proteiny obalu stejně jako membránové proteiny, jako je virový matrixový protein a jaderný protein v případě, že nejsou přítomny podstatné celé viriony. Štěpené vakcinační prostředky podle vynálezu budou obvykle obsahovat většinu nebo všechny virové strukturální proteiny, ačkoliv jejich zastoupení nemusí být ve stejném poměru, jak se vyskytují v celém viru. Výhodné prostředky obsahující štěpený virus zahrnuje alespoň polovinu virových strukturálních proteinů, přednostně všechny takové proteiny. Vakcinační prostředky na druhou stranu obsahují jeden nebo několik vysoce čištěných virových proteinů. Vakcinační prostředky mohou například obsahovat čištěné virové povrchové proteiny, o nichž se ví, že zodpovídají za uvolnění požadovaných protilátek, které neutralizují virus.

Podle vynálezu je možné použít různá štěpící činidla, jako jsou neionogenní a inogenní povrchově aktivní činidla. Příklady štěpících činidel použitelných v souladu s vynálezem zahrnují:

1) Kyseliny žlučové a její deriváty. Žlučové kyseliny zahrnují kyselinu cholovou, deoxycholovou, chenodeoxycholovou kyselinu, litocholovou kyselinu, ursodeoxycholovou kyselinu, hyodeoxycholovou kyselinu a deriváty, jako jsou glyko-, tauro-, amidopropyl-l-pro7 ·· ·♦ • · · • · ·4· pansulfonové deriváty, amidopropyl-2-hydroxy-l-propansulfonové deriváty shora v textu popisovaných žlučových kyselin nebo Ν,Ν-bis(3D-glukonoamidopropyl)deoxycholamid. Zvláštním příkladem je deoxycholát sodný, NaDOC.

2) Neinogenní povrchově aktivní činidla jsou oktoxynoly (série Triton^(tm)), polyoxyetylenetery, jako je polyoxyetylensorbitanmonooleát (Tween 80^(tm|) a polyoxyetylenetery nebo polyoxyetylenestery obecného vzorce I:

HO (CH₂CH₂O) _n-A-R (i:

kde symbol n je od 1 do 50, symbol A je vazba nebo skupina —C(O)—, symbol R je Ci_5oalkyl nebo fenylCi_₅₀alkyl a kombinace dvou nebo více uvedených skupin. Zvláštní příklady jsou Tween80 (tm)

Triton X-100 (tm) a lauret 9.

3) Alkylglykosidy nebo alkylthioglykosidy, kde řetězec alkylu obsahuje šest až osmnáct uhlíků, v typickém případě osm až čtrnáct -uhlíků, cukerná část je libovolná pentóza nebo hexóza nebo její kombinace s různými vazbami, jako 1—>6, l-»5, 1—»4, l->3, 1-2. Řetězec alkylu může být saturovaný, nesaturovaný a/nebo větvený.

4) Deriváty sloučenin uvedených v odstavci 3 shora v textu, kde je modifikována jedna nebo více hydroxylových skupin, s výhodou 6 hydroxylových etoxyláty, sulfáty, etery, skupin, jako jsou estery, uhličitany, sulfosukcináty, isethionáty, eterkarboxyláty, sloučeniny kvarterních aminů.

5) Acylové cukry, kde acylový řetězec obsahuje šest a osmnáct uhlíků, v typickém případě 8 a 12 uhlíků, cukernou složkou je libovolná pentóza nebo hexóza nebo jejich kombinace ♦ ·· ·· ·« 44 444© ······· 4© 9 ί ί ί . ί í ;··, , ; ·.

··· ·♦ ·· ·· «» ··* s různými vazbami, jako 1-+6, 1-+5, 1-»4, 1->3, 1-2. Acylový řetězec může být saturovaný, nesaturovaný a/nebo větvený.

6) Sulfobetainy se strukturou R-N,N-(R1,R2)-3-amino-l-propansulfonát, kde symbol R je libovolný alkylový řetězec arylalkylový řetězec obsahující 6 až 18 uhlíků, v typickém případě 8 až 16 uhlíků. Alkylový řetězec R může být saturovaný, nesaturovaný a/nebo větvený. Symbol Rl a R2 znázorňuje alkylové řetězce obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, v typickém případě 1 atom uhlíku.

7) Betainy se strukturou R-N,N-(Rl,R2)-glycin, kde symbol R je libovolný alkylový řetězec obsahující 6 až 18 uhlíků. V typickém případě 8 až 16 uhlíků. Alkylový řetězec může být saturovaný, nesaturovaný a/nebo větvený. Symbol Rl a R2 jsou alkylové řetězce obsahující 1 až 4 uhlíky, v typickém případě 1 atom uhlíku.

8) Polyoxyetylenalkyleter se strukturou R-(O-CH₂-CH₂)_n~0H, kde symbol R je libovolný alkylový řetězec obsahující 6 až 20 uhlíků v typickém případě 8 až 14 uhlíků. Alkylový řetězec může být saturovaný, nesaturovaný a/nebo větvený. Symbol n je 5 až 30, v typickém případě 8 až 25.

9) N,N-dialkylglukamidy se strukturou R-(N-Rl)-glukamid, kde symbol R je libovolný alkylový řetězec obsahující 6 až 18 uhlíků, v typickém případě 8 až 12 uhlíků. Alkylový řetězec může být saturovaný, nesaturovaný a/nebo větvený nebo cyklický. Symboly Rl a R2 představují alkylové řetězce obsahující 1 až 6 uhlíků, v typickém případě 1 atom uhlíku. Cukerná složka se může upravit pentózami nebo hexózami.

10) Hecameg má strukturu 6-0-(N-heptylkarbamoyl)-metyl-a-Dglukopyranosid.

♦ A A 9 9 A A ·· i * *

11) Alkylfenoxypolyetoxyetanol se strukturou R-C6H4-O-(CH2CH2)n-0H, kde symbol R je libovolný alkylový řetězec obsahující 6 až 18 uhlíků, v typickém případě 8 uhlíků. Alkylový řetezec může být saturovaný, nesaturovaný a/nebo větvený (symbol n je větší nebo roven třem).

12) Kvarterní amonné sloučeniny se strukturou R, -N⁺(-Rl, -R2,

-R3), kde symbol R je libovolný alkylový řetězec obsahující 6 až 20 uhlíků, v typickém případě dvacet uhlíků. Alkylový řetězec může být saturovaný, nesaturovaný a/nebo větvený. Symboly Rl, R2 a R3 jsou alkylové řetězce obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, v typickém případě jeden atom uhlíku.

13) Sarkosyl, což je sodná sůl N-laurylsarkosinu.

14) CTAB (cetyltrimetylamoniumbromid) nebo Cetavlon.

Nejvýhodnější štěpící činidla jsou NaDoc a sarkosyl. Aby došlo k účinnému štěpení viru, inkubuje se se štěpícím činidlem při teplotě místnosti, například přes noc. Je-li to vhodné, může se použít kombinace štěpících činidel.

Štěpený vakcinační prostředek obsahuje alespoň jedno povrchově aktivní činidlo, kterým může být určité neionogenní povrchově aktivní činidlo. Po štěpení viru může ve směsi zbýt jedno nebo více neionogenních povrchově aktivních činidel nebo se může ke směsi přidat. Věří se, že štěpený antigenní materiál se stabilizuje v přítomnosti neionogenního povrchově aktivního činidla. Vhodná stabilizující neionogenní povrchově aktivní činidla zahrnují oktoxynoly (série Triton^(trn)) , polyoxyetylenetery, jako je polyoxyetylensorbitanmonooleát (Tween 80^(tm)) a polyoxyetylenetery nebo estery obecného vzorce I:

	99		99	• 9	99
• 9	•	9	9	•		9
• ·	9	•	•	999	•	9
• 9 99	9 • 9	•	• 99	9 9 99	• • 9	9

HO (CH₂CH₂O) _n ^-A-R (I) kde symbol n je 1 až 50, symbol A je vazba nebo skupina -C(O), symbol R je Ci-₅₀alkyl nebo fenylCi-₅₀ a kombinace dvou nebo více možnosti.

Výhodná neinogenni povrchově aktivní činidla ze série Tritonu zahrnují Triton X-100 (t-oktylfenoxypolyetoxyetanol), Triton X-165, Triton X-205, Triton X-305 nebo Triton X-405, Triton N-101. Zvláště se preferuje Triton X-100.

Výhodné neionogenní povrchově aktivní činidla dále zahrnují polyoxyetylenetery obecného vzorce I uvedené shora v textu. Zvláště pak polyoxyetylen-9-lauryleter, polyoxyetylen-9-stearyleter, polyoxyetylen-8-stearyleter, polyqxyetylen-4-lauryleter, polyoxyetylen-35-lauryleter a polyoxyetylen-23-lauryleter. Nejvýhodnější je, když polyoxyetylen je polyoxyetylen-9-lauryleter (lauret 9). Alternativní termíny nebo názvy pro polyoxyetylenlauryleter se uvádí v registru CAS. Číslo v registru CAS polyoxyetylen-9laurylu je 9002-92-0. Polyoxyetylenetery, jako jsou polyoxyetylen-9-lauryleter se popisují v indexu Merck (12^th, 7717, Merck&Co. Inc. , Whitehouse Station, N.J., USA, ISBN 0911910-12-3) . Lauret 9 se tvoří reakcí etyloxidu s dodecylalkoholem a má v průměru devět etylenoxidových jednotek.

Konečná koncentrace stabilizujícího povrchově aktivního činidla v konečném vakcinačním prostředku je s výhodou mezi 0,001 až 20 %, výhodněji 0,01 až 10 % a nejvýhodněji až přibližně 2 % (hmotnost/objem) . V případě, že je přítomno jedno nebo více povrchově aktivních činidel, jsou v obecném případě přítomny v konečném prostředku v koncentraci až přibližně 2% každý, 1% každý, v typickém případě v koncentraci • ·

0,6 % každý a více typická je koncentrace 0,2 % nebo 0,1 % každý. Libovolná směs povrchově aktivního činidla může být přítomna ve vakcinačních prostředcích podle vynálezu.

Virus s obalem se může produkovat replikací na vhodném substrátu, v séru nebo postupem, při kterém se nepoužívá sérum. Viry rostoucí na tkáňových kulturách je možné produkovat například na lidských buňkách, jako je MRC-5, WI38, Hep-2 nebo opičích buňkách, jako je AGMK, Věro, LL_C-Mk₂, FrhL, FrhL-2 nebo bovinních buňkách, jako jsou MDBK, nebo na psích buňkách, jako jsou MDCK nebo primární buňky, jako jsou kuřecí embryonální fibroblasty nebo libovolný jiný typ buněk vhodných pro produkci viru vhodného pro vakcinační účely, které zahrnují klony získané ze shora v textu uvedených buněčných linií.

Štěpený vakcinační prostředek je vhodně kombinován s farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou. Používané farmaceuticky přijatelné pomocné látky mohou být ty, které jsou běžné v oboru vakcinačních prostředků. Používané pomocné látky v daném vakcinačním prostředku budou vzájemně kompatibilní a budou také kompatibilní s podstatnými složkami sloučenin tak, že neexistují interakce, které mohou poškodit působení složek a aktivních činidel. Všechny pomocné látky nesmí být samozřejmě toxické a musí vykazovat dostatečnou čistotu, aby je bylo možné použít pro člověka. Vhodné příklady pomocných látek jsou dobře známy v oboru.

Vakcinační prostředky mohou také s výhodou zahrnovat adjuvans, kterým může být nosič a imunostimulant. Adjuvans může zbýt po procesu štěpení a/nebo je možné ho přidat k viru po štěpení. Adjuvans vhodná pro použití ve vakcinačních prostředcích podle vynálezu jsou dobře známa v oboru.

• · · ·

• * · · · * · · · · · · • · · · · · · • · · · · · • · · · · ·

Vakcinační prostředek může s výhodou zahrnovat adjuvans, kterým může být nosič a/nebo imunostimulant. Adjuvans může být pozůstatek štěpícího postupu a/nebo se může přidat k viru po štěpení. Adjuvans vhodná pro použití ve vakcinačních prostředcích podle vynálezu jsou dobře známy v oboru.

Vynález dále popisuje vakcinační prostředek obsahující štěpený respirační syncyciální virus s obalem nebo štěpený virus parainfluenzy v kombinaci s adjuvans. Prostředek s výhodou obsahuje farmaceuticky přijatelnou pomocnou látku.

Forma adjuvans, která je vhodná pro použití podle vynálezu, závisí na způsobu aplikace vakcinačního prostředku. Vakcinační prostředky podle vynálezu se mohou použít k ochraně nebo léčbě savců náchylných k onemocnění nebo trpících onemocněním. Způsoby aplikace prostředku jsou:

a) sliznicí, což znamená orálním, bukálním, intestinálním, vaginálním, rektálním nebo nasálním způsobem,

b) parenterálním zavedením, například intramuskulární nebo subkutánní aplikace nebo

c) transdermální, intradermální, intraepiteliální nebo transkutánní aplikace.

Uvedené způsoby aplikace vakcinačních prostředků se mohou kombinovat.

Zavedení mukozální cestou

Bez ohledu na nutnost aplikace bolestivých injekcí spojených s negativním účinkem (strach z bodnutí), mukozální vakcinační prostředky aplikované intranasální cestou jsou atraktivní, protože se ukázalo u zvířat, že mukozální aplikace antigenů vykazuje dobrou účinnost při vyvolání ochranné odezvy na mukozálním povrchu, který je cestou vstupu řady patogenů.

• · • ·< • · • · · · · · • · · • · · • · * ·

Navíc se ukazuje, že mukozální vakcinační prostředky, jako jsou intranasální vakcinační prostředky mohou vyvolat mukozální imunitu, nikoliv pouze na nosní sliznici, ale také na vzdálených místech sliznic, jako jsou genitální sliznice.

Intranasální aplikace podle vynálezu se může aplikovat po kapkách, sprejem nebo aplikací suchého prášku. Vynález dále popisuje vakcinační prostředky ve formě zmlžovače nebo aerosolu. Vynález dále popisuje enterické prostředky, jako jsou kapsule a granule rezistentní vůči trávicímu traktu vhodné pro orální aplikaci, čípky vhodné pro rektální a vaginální aplikaci a kapsule pro bukální nebo orální aplikaci.

Výhodný mukozální způsob aplikace vakcinačního prostředku podle vynálezu je intranasální cestou.

Podle vynálezu je možné použít libovolné vhodné adjuvans a libovolnou vhodnou formu, jako je roztok, roztok, který není vezikulární, suspenze nebo prášek. Výhodné adjuvans zahrnuje ty látky popsané v dokumentu WO 99/52 549. Výhodná adjuvans zahrnují Tween80^(tm), TritonX-100^(tm), lauret 9 a jejich kombinace.

Neionogenní povrchově aktivní činidla se mohou s výhodou kombinovat s imunostimulantem například netoxickými deriváty lipidu A, které zahrnuj deriváty popsané v patentovém dokumentu US 4 912 094 a GB 2 220 211 obsahující netoxické deriváty monofosforyllipidu A a difosforyllipidu A, jako je 3de-O-acylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL) a 3-de-O-acylovaný difosforyllipid A. Výhodnou kombinací je lauret-9 kombinovaný s 3D-MPL. Shora popsané imunostimulanty se mohou také použít v prostředcích, které neobsahují neinogenní povrchově aktivní činidla.

• · · • ··· • · I

V dalším provedení vynálezu adjuvans je ADP-ribosylující toxin nebo jeho mutant. Příklady takových toxinů jsou tepelně labilní toxin (LT) z mikroorganizmu E. coli a jeho mutanti, jako je LTR192G a fragmenty těchto toxinů, jako je složka vázající gangliosid (LTB).

Výhodným zařízením pro intranasální aplikaci vakcinačních prostředků podle vynálezu jsou sprej ovací zařízení. Vhodná nasální sprejovací zařízení jsou běžně dostupná u firmy Becton Dickinson, Pfeiffer GmBH and Valois.

Činnost výhodných sprejových aplikátorů pro nasální použití nezávisí na tlaku aplikovaném člověkem, který je používá. Zvláště je možné použít zařízení s tlakovým prahem, protože roztok se uvolňuje s injektoru pouze v případě, kdy se dosáhne tlakového prahu. Tyto zařízení snadněji dosáhnou spreje s regulérní velikostí kapek. Zařízení s tlakovým prahem jsou vhodná pro použití podle vynálezu a popisují se například v dokumentu WO 91/13281 a EP 311 863 B. Taková zařízení v současné době dodává firma Pfeiffer GmbH a také se popisují v publikaci Bommer, R. Advances in Nasal drug delivery Technology, Pharmaceutical Technology Europe, 1999, p. 26-33.

Výhodné intranasální aplikátory produkují kapénky (měřeno za použití vody, jako roztoku), jejichž velikost je v rozmezí 1 až 500 pm. Když velikost kapek je menší než 10 pm, existuje nebezpečí vdechnutí, proto kapalina tvořící sprej nesmí obsahovat více jak přibližně 5% kapek, jejichž velikost je menší než 10 pm.

Dalším výhodným rysem intranasálního systému zavedení vakcinačního prostředku podle vynálezu je dvou dávkové • ·

Z * · · • · ···· · · ··· ·· ··· · • · · · · · · dvě „sub-dávky jedné se každá sub-dávka zavedení. Dvou dávkové zařízeni obsahuje dávky vakcinačního prostředku, přičemž aplikuje do jedné nosní dírky.

Vynález dále popisuje farmaceutickou sadu obsahující zde popsané intranasální aplikační zařízení nebo intranasální aplikační zařízení a štěpený vakcinační prostředek, který se používá společně s aplikačním zařízení.

Vynález se nezbytně neomezuje na sprejové zavedení kapalných přípravků. Vakcinační prostředky podle vynálezu se mohou aplikovat v jiných formách, například jako prášek.

vakcinační prostředky podle vynálezu se mohou aplikovat orální cestou. V takových případech farmaceuticky přijatelná pomocná látka může také zahrnovat alkalické pufry, střevní kapsle, mikrogranule.

Vakcinační prostředky podle vynálezu se mohou aplikovat vaginální cestou. V takovém případě farmaceuticky přijatelné pomocné látky mohou také zahrnovat emulgátory, polymery, jako je CARBOPOL® a jiné známé stabilizátory vaginálních krémů a čípků. Vakcinační prostředky podle vynálezu se mohou také aplikovat rektální cestou. V takových případech pomocné látky mohou zahrnovat vosky a polymery, které se používají při přípravě rektálních čípků.

Parenterální způsoby aplikace

Vakcinační prostředky podle vynálezu se mohou zavést parenterálně, například intramuskulárně nebo subkutánně. Za těchto okolností je výhodné adjuvans, které je výhodný stimulátor odezvy ΊΉ-1.

• ·

Imunitní odezva se může obecně rozdělit do dvou kategorií. Jde o humorální (protilátkovou) imunitní odezvu a imunitní odezvu zprostředkovanou buňkami (CTL, pomocné buňky T, buňky NK) . U myší i u lidí funkčně rozdílné pomocné buňky T (Th) , známé jako Thl a Th2, jsou charakterizovány paterny produkovaných cytokinů. Humorání odezva a imunitní odezva zprostředkovaná buňkou je spojena s odezvou typu Th2 a Thl. Tyto dvě polarizované formy specifické imunitní odezvy tvoří model vhodný pro vysvětlení různých efektorových mechanizmů, které se podílejí na ochraně proti různým patogenům. Převládající odezvy Thl jsou účinné při likvidaci infekčních činidel, která zahrnují vnitrobuněčné patogeny. Odezvy Th2 se podílejí na ochraně proti extrabuněčným formám patogenů.

Rozdíl imunitní odezvy typu Thl a Th2 není absolutní. Ve skutečnosti jedinec bude podporovat imunitní odezvu, která je popsaná jako převládající Thl nebo převládající Th2. Mechanizmus, který odpovídá- za to, že buňky Th jsou odpovědné za dichotomii Thl/Th2 se poprvé popsal v případě myší, kdy Mosmann a jeho kolegové poskytly důkaz, že antigenní stimulace buněk Th vede k vývoji omezených a stereotypních paternů cytokinové produkce (Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) THI and TH2 Cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7 pl45-173). V myším systému buňky Thl produkují cytokiny, jako je IFN-γ vyvolávají aktivaci cytotoxicity buněk závisející na protilátkách a oddalují typovou přecitlivělost. Buňky Thl se také podílejí na regulaci produkce protilátek IgG2. Cytokiny produkované myšími buňkami Th2, jako jsou IL-4 a IL-5, se podílejí na regulaci humorální odezvy, specificky izotypů IgGl a IgE.

Je známo, že jistá vakcinační adjuvans jsou zvláště vhodné pro stimulaci odezvy typ Thl nebo Th2. Tradičně, nej lepší

• · · • · φφ φ · • φ φφφφ φ φ φ • φ φ φ φφ φφ indikátory rovnováhy imunitní odezvy Thl:Th2 po aplikaci vakcinačního prostředku nebo injekci zahrnují měření produkce cytokinů Thl nebo Th2 pomocí T lymfocytů a/nebo měřením izotypů protilátek specifických pro antigen, jako je u myší poměr IgG2a:IgGl.

Adjuvans typu Thl je to, které stimuluje populaci buněk T specifický pro antigen vakcinačního prostředku k produkci vysokého množství cytokinů typu Thl. To také vyvolává u myší imunoglobulinové odezvy specifické pro antigen spojené izotypy typu Thl (jako je IgG2a).

Adjuvans, která jsou schopná s výhodou stimulovat buněčnou odezvu THl, se popisují v dokumentu mezinárodní patentová přihláška č. WO 94/00153 a WO 95/17209.

3-0-deacylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL) je jedno takové adjuvans. Popisuje se v patentovém dokumentu GB 2220211 (Ribi). Chemicky jde o směs 3-O-deacylovaný monofosforyllipid A se 4, 5, a 6 acylovanými řetězci a vyrábí se ve firmě Corixa ve státě Montana. Výhodná forma 3-O-deacylovaného monofosforyllipidu A se popisuje v dokumentu evropského patentu č. 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA).

Částice 3D-MPL jsou dostatečně malé, aby se daly sterilizovat filtrací přes membránu s velikostí pórů 0,22 mikronů (jak se popisuje v dokumentu evropského patentu č. 0 689 454) . 3D-MPL je přítomen v rozmezí 10 pg až 100 pg, s výhodou 25 až 50 pg v jedné dávce, kde antigen je v typickém případě v dávce přítomen v rozmezí 2 až 50 pg.

Jiné výhodné adjuvans obsahuje QS21, frakci získanou z kůry stromu Quillaja Saponaria Molina čištěnou HPLC. Toto • 4 adjuvans je mozne smíchat

4 • 44

4

3-0-deacylovaným monofosforyllipidem A (3D-MPL) spolu s nosičem.

Způsob produkce QS21 se popisuje v patentovém dokumentu USA č. 5 057 540.

Nereaktivní adjuvanční přípravky obsahující QS21 se popisují převážně v dokumentu WO 96/33739). Ukázalo se, že takové přípravky obsahující QS21 a cholesterol, jsou úspěšná adjuvans stimulující odezvu THI, pokud jsou připravena spolu s antigenem. Takové vakcinační prostředky, které tvoří část vynálezu mohou zahrnovat kombinaci cholesterolu a QS21.

Další adjuvans, která jsou výhodnými stimulátory buněčné odezvy THI zahrnují imunomodulátorové oligonukleotidy, jako jsou například nemetylované sekvence CpG, které se popisují v dokumentu WO 96/02555.

Vynález dále popisuje kombinace různých adjuvans stimulujících buněčnou odezvu THI a předpokládá se, že poskytují adjuvans, které je výhodný stimulátor buněčné odezvy THI. QS21 je možné například připravit spolu s 3D-MPL. Poměr QS21:3D-MPL bude v typickém případě 1:10 až 10:1, s výhodou 1:5 až 5:1 a často následně 1:1. Ve výhodném rozmezí v případě optimální synergie je poměr 3D-MPL:QS21 2,5:1 až 1:1.

V jednom provedení vynálezu vakcinační prostředek obsahuje vezikulární adjuvans obsahující cholesterol, saponin a derivát LPS. V tomto ohledu výhodný adjuvanční přípravek obsahuje unilamelární vážek obsahující cholesterol, který má lipidovou dvojvrstvu, která s výhodou obsahuje dioleoylfosfatidylcholin, kde saponin a derivát LPS je spojen s lipidovou dvojvrstvou nebo se v ní nachází. Tyto adjuvanční přípravky obsahují QS21 • · jako saponin a 3D-MPL jako derivát LPS, přičemž poměr QS21:cholesterolu je 1:1 až 1:100 (hmotnost/hmotnost) a nejvýhodněji 1:5 (hmotnost/hmotnost). Takové adjuvanční přípravky se popisují v patentovém dokumentu EP 0 822 831 B.

Nosič se také s výhodou nachází ve vakcinačním prostředku podle vynálezu. Nosičem může být olej ve vodní emulzi, lipidové struktury, jako jsou lipozomy nebo micely nebo sůl hliníku, jako je fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý.

Výhodná emulze olej ve vodě obsahuje metabolizovatelný olej, jako je skvalen, alfa tokoferol a Tween 80. Navíc emulze olej ve vodě může obsahovat spán 85 a/nebo lecitin a/nebo trikaprylin.

Zvláště výhodné antigeny ve vakcinačním prostředku podle vynálezu se kombinují s 3D-MPL a alum.

V typickém případě při aplikaci lidem QS21 a 3D-MPL je ve vakcinačním prostředku v rozmezí 1 pg až 200 pg, výhodné je množství 10 pg až 100 pg, výhodnější je množství 10 pg až 50 pg v jedné dávce. V typickém případě olej ve vodě bude obsahovat 2 až 10 % skvalenu, 2 až 10 % alfa tokoferolu a 0,3 až 3 % tween 80. Poměr skvalen: alfa-tokoferolu se rovná nebo je menší než 1, čímž vzniká stabilnější emulze. Spán 85 může také být přítomen v koncentraci 1 %. V některých případech může být výhodné, že vakcíny podle vynálezu budou dále obsahovat stabilizátor.

Netoxické emulze olej ve vodě s výhodou obsahuje netoxický olej, jako je například skvalan nebo skvalen a emulgátory, jako je například Tween 80. Vodný nosič může například být fyziologický roztok pufrovaný fosforečnanem.

·· ···· • .......

·· ·· ·· ··

Zvláště silný adjuvanční přípravek zahrnující QS21, 3D-MPL a tokoférol v emulzi olej ve vodě se popisuje v patentovém dokumentu WO 95/17210.

Transdermální, intradermální, intraepiteliální nebo transkutánní způsob aplikace

Vynález se může také používat k vyvolání imunitní odezvy proti virovým antigenům, když se aplikují na kůži (transdermální, intradermální, intraepiteliální nebo transkutánní aplikace). Tyto způsoby zavedení zahrnují, ale neomezují se na náplasti (WO 97/48 440, WO 98/28 037, WO 99/64 580) , krémy, zavedení zprostředkované elektroforézou a balistické zavedení, jako je stlačený plyn. Náplasti mohou zahrnovat zařízení pro porušení integrity kůže.

Intradermální zavedení může být dosaženo člověkem například běžnou intradermální injekcí, což zahrnuje krok čištění kůže a pak natažení kůže jednou rukou a zkosení tenké jehly (26 až 31 gauge) se zavede pod kůži v úhlu 10 až 15°. Po vpíchnutí hrany jehly se válec jehly zavede hlouběji pod kůži, zatímco se vyvíjí slabý tlak k nadzvednutí jehly pod kůží. Kapalina se pak velmi pomalu zavádí velice pomalu, čímž vzniká na povrchu kůže puchýř nebo boule. Pak se jehla pomalu vyndá.

Pro intradermální zavedení vakcinačního prostředku je možné použít libovolné vhodné adjuvans. Adjuvans s výhodou cholesterol. Intradermální adjuvans adj uvanční obsahuje MPL, QS21 a obsahuje vezikulární cholesterol, saponin a derivát LPS, jak se popisuje shora v textu s ohledem na parenterální aplikaci. V případě transdermálního zavedení vakcinačního prostředku je možné také přidat ADP-ribosylační toxiny nebo jejich mutanty.

přípravek obsahující φ φ φ · φ ·

ΦΦΦ

9

1 ·

• Φ

ΦΦ

ΦΦ • Φ Φ • ΦΦΦΦ • · Φ Φ • 11 9

Φ Φ Φ • · Φ • · Φ • · · Φ

ΦΦ ΦΦ

Je vhodné, aby libovolné shora uvedené adjuvans, které je vhodné pro libovolnou cestu zavedení vakcinačního prostředku popsanou shora v textu se mohlo využít prostřednictvím libovolné jiné cesty.

Vakcinační prostředky podle vynálezu se mohou použít při profylakci a léčbě. Vynález dále popisuje způsob léčby savců, kteří jsou náchylní k infekčním onemocněním nebo jimi trpí, zvláště infekcí PIV nebo RSV nebo onemocněním spojeného s takovou infekcí. Způsob obsahuje aplikaci savci účinného množství vakcinačního prostředku podle vynálezu. Vynález dále popisuje zde uvedený vakcinační prostředek, který se používá v medicíně.

Vakcinační prostředek se popisuje v publikaci New Trends and Developments in Vaccines, Voliér et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978.

Vakcinační prostředky je možné zavést ve vhodném dávkovém režimu, jako je jedno dávkový nebo dvou dávkový režim. Vakcinační prostředky se mohou použít v populaci, která se s infekčním onemocněním ještě nesetkala, ale i v populaci, která má protilátky.

V případě, že se využívá intranasální zavedení, je výhodné, aby přípravky obsahovaly adjuvans a/nebo se adjuvans podává jednotlivcům, kteří už byly vystaveni působení viru RSV a PIV.

Vynález dále popisuje způsob produkce vakcinačního prostředku, který zahrnuje kroky

a) štěpení viru s obalem,

b) smíchání přípravku štěpeného viru s obalem se stabilizačním činidlem a přípravku štěpeného víru s adjuvans také může být nosič a/nebo imunostimulant) (kde

c) smíchání adj uvans » 44

4 4

4 4

4 4

4 4

444 44

4 44 • · <

• · · • · · • · · ♦ · 4 4

44 • · »19 4

Je vhodné, aby způsob obsahoval kroky popsané v odstavci a) a b) , kroky a) a c) nebo kroky a) , b) a c) . Je vhodné, aby stabilizační činidlo obsahující alespoň jedno povrchově aktivní činidlo se vybralo ze skupiny obsahující polyoxyetylensorbitanmonooleát (Tween80^(tm)) , t-oktylfenoxypolyetoxyetanol (Triton Xl00^(tm)), polyoxyetylen-9-lauryleter.

Vakcinační prostředek vytvořený uvedeným způsobem se smíchá s vhodným nosičem.

Vynález dále popisuje způsoby štěpení virů s obalem, jak se popisuje shora v textu, za použití vhodného štěpícího činidla.

Přehled obrázků na výkrese

Na	obrázku	č. 1	je zobrazen	test	westernův	přenos
štěpeného	RSVA s	anti-F	protilátkou.
Na	obrázku	č. 2	je zobrazen	test	westernův	přenos
štěpeného	RSVA s	anti-M2	: protilátkou.
Na	obrázku	č. 3	je zobrazen	test	westernův	přenos
štěpeného	RSVA s	anti-G	protilátkou.
Na	obrázku	č. 4	je zobrazen	test	westernův	přenos
štěpeného	RSVA s	anti-N	protilátkou.

Na obrázku č. 5 je zobrazen počáteční materiál viru RSV/A, který je zviditelněný metodou EM.

9'·

9 * · ·* * Φ

9

9 · « ί « · » * ··· » · · Φ > 9 9 « »· » · · < •Φ ··

Na obrázku č. 6 je zobrazen počáteční materiál viru RSV/A štěpený NaDOC, který je zviditelněný metodou EM.

Na obrázku č. 7 je zobrazen počáteční materiál viru RSV/A štěpený sarkosylem, který je zviditelněný metodou EM.

Na obrázku č. 8 jsou zobrazeny titry protilátek proti FG (post II) u primárně imunizovaných myší imunizovaných přípravkem Split RSV intramuskulární nebo intranasální cestou.

Na obrázku č. 9 jsou zobrazeny titry protilátek neutralizujících RSV/A (post II) u primárně imunizovaných myší imunizovaných přípravkem intranasální cestou.

Split RSV intramuskulární nebo

Na obrázku č. 10 jsou zobrazeny odezvy izotypu proti FGIgG (post II) primárně imunizovaných myší imunizovaných přípravkem Split RSV intramuskulární nebo intranasální cestou.

Na obrázku č. 11 jsou zobrazeny titry protilátek proti FG (post I) (test ELISA) imunizovaných přípravkem intranasální cestou.

u primárně imunizovaných myší Split RSV intramuskulární nebo

Na obrázku č. 12 jsou zobrazeny titry protilátek proti FG test ELISA) u myší, které nebyly primárně imunizovány, imunizovaných přípravkem Split RSV intramuskulární cestou.

Na obrázku č. 13 jsou zobrazeny titry protilátek neutralizující RSV/A u myší, které nebyly primárně imunizovány, imunizovaných přípravkem Split RSV intramuskulární cestou.

φφ ΦΦΦΦ

·· φ

φ φ · φ ** «φ φ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ » 94 • φ φ φ φ φ φ φ φ φφ

Na obrázku č. 14 jsou zobrazeny odezvy proti izotypu FG IgG (postil) u primárně imunizovaných myší imunizovaných štěpeným virem RSV intramuskulární cestou.

Na obrázku č. 15 jsou zobrazeny titry protilátek proti FG (hodnoty získané z testu ELISA) u myší, které nebyly primárně imunizovány, imunizovaných štěpeným virem RSV intranásalní cestou.

Na obrázku č. 16 jsou zobrazeny titry protilátek neutralizující RSV/A u myší, které nebyly primárně imunizovány, imunizovaných přípravkem Split RSV intranasální cestou.

Na obrázku č. 17 jsou zobrazeny titry protilátek proti FG (hodnoty získané z testu ELISA) u primárně imunizovaných morčat, imunizovaných štěpeným virem RSV intradermální nebo intranásalní cestou.

Na obrázku č. 18 jsou zobrazeny titry protilátek neutralizující RSV/A u primárně imunizovaných morčat, imunizovaných štěpeným virem RSV intradermální cestou.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava štěpených virů

Viry s obalem získané z různých virových rodin se štěpily přidáním štěpících činidel, jako jsou povrchově aktivní činidla. Štěpení se hodnotilo charakterizací migrace štěpených virů v sacharózovém gradientu nebo na sacharózovém polštáři a vizualizace se provedla analýzou SDS-PAGE a přímým testem • · · · · · • · · · · • · · · · · štěpených virových produktů za použití hodnocení elektronovou mikroskopií.

Štěpené viry popsané v uvedeném příkladu reprezentují různé rodiny virů s obalem. Jsou hodnoceni například členi rodiny Paramyxoviridae (respirační synciciální viry A a B, virus parainluenza 3, virus příušnic a spalničkový virus). Dále se hodnotí rodina Togaviridae (virus zarděnek) a rodina Herpesviridae (virus Epstein-Barrové, cytomegalovirus nebo virus herpes simplex).

Porušení virových částic (štěpení) se provádí tak, že k viru bez buněk se přidá štěpící činidlo, jako je povrchově aktivní činidlo v takové koncentraci, aby došlo k jeho rozpuštění. Jako povrchově aktivní činidla je možné použít žlučové kyseliny a alkylglykosidy. Po přidání povrchově aktivního činidla buď samotného nebo v kombinaci se směs inkubuje až do dosažení dokončení postupu.

Hodnocení účinného štěpení se provede za použití centrifugace v sacharózového gradientu nebo na sacharózovém polštáři. Vzorky ošetřené povrchově aktivním činidlem nebo neošetřené vzorky se aplikovaly na sacharózový gradient nebo polštář a jednotlivé frakce se analyzovaly na gelu v testu SDS-Page. Migrace všech typů virionových proteinů ve frakcích ukazuje účinné štěpení. Vzorky, které se hodnotí shora popsanou analýzou za účinně štěpené, se dále analyzují elektronovou mikroskopií. Vzorky se zviditelnily za použití metod standardního negativního barvení.

Následující specifické štěpící experimenty se provedly s viry RSV, HSV a PIV.

1.1 Podmínky kultivace buněk

Lidské viry RSV/A/Long divokého typu a PIV-3 se replikovaly v buňkách VĚRO stacionárním postupem v kultivačním médiu bez séra. Před infekcí se buňky VĚRO nechaly růst po dobu 4 dní až do dosažení konfluence. Podmínky produkce viru se adaptovaly v případě každého viru: MOI 0,03, 4 dny v případě viru RSV/A, MOI 0,01, 5 dní, teplota 37 °C v případě PIV-3. V den shromáždění viru se po lýzi odstranila kapalina se zbytkem buněk, přidal se stabilizátor a vše se zamrazilo při teplotě -70 °C.

1.2 Čištění virů

Po vyčiření pomocí centrifugace při 1 000 xg po dobu 10 minut, se virové částice shromáždily do peletu srážením s PEG 6000. Pelet se opět resuspendoval v pufru obsahujícím 50 mM Tris, 50 mM NaCl a 2 mM MgSC>4 s hodnotou pH 7,5. Pak následuje ošetření benzonázou. Tento roztok se ultrafiltroval přes membránu AGT (molekulová hmotnost 500 000) proti pěti objemům fyziologického roztoku pufrovaného fosforečnanem a pak se diafiltroval proti pěti objemům fosforečnanového pufru s hodnotou pH 7,5.

Přítomnost neporušených virových částic se potvrdila metodou EM a centrifugací na sacharózovém polštáři, jak se popisuje shora v textu. Stanovila se koncentrace proteinu.

1.3 Štěpení viru

Virové částice se štěpily přidáním štěpícího činidla do virového přípravku, který neobsahuje buňky.

Aby štěpení bylo účinné, povrchově aktivní činidlo se musí použít v koncentraci vyšší než je jeho kritická micelární

koncentrace (cmc). Všechny detergenty se použily v koncentraci vyšší než je jejich hodnota cmc. Studoval se poměr D/P (poměr detergent/proteinu). Účinného štěpení se dosáhlo s poměrem D/P větší nebo rovno hodnotě 25. Tato hodnota je pro štěpení výhodná. Ke štěpení virových částic se používaly následující detergenty v 2% koncentraci: deoxycholát sodný, sarkosyl a přípravky plantacare a lauret 9.

Po štěpení se roztoky dialyzovaly proti pufru tvořeném 10 mM PO₄, 150 mM NaCI, hodnota pH je 7,5 a odstranil se nadbytek detergentu.

Proces štěpení je shrnut dále v textu v případě RSV.

RSV-A: čištění viru

Centrifugace za použití rotoru Beckman JA10 při 3 500 ot./min. (1 000 x g) , při teplotě 4 °C po dobu 10 minut —> vyčiřený supernatant ;

srážení s 10 % PEG 6000 pomalé míchání po dobu 90 minut při teplotě 4°C centrifugace při 3 500 ot./min. (1 OOOx g) po dobu 20 minut pelet se resuspendoval v pufru, který zahrnuje 50 mM Tris, 50 mM NaCI, 2 mM .MgSCg a hodnota pH je 7,5.

Φ ošetření benzoázou v koncentraci 125 jed./ml inkubace trvala po dobu minimálně 4 hodiny za stálého míchání Φ ultrafiltrace: AGT - VAGE4A - mol. hmotn. 500 000 - 420 cm^{2 5} objemů proti pufru obsahujícímu 10 mM PO₄(Na), 150 mM NaCI, hodnota pH 7,5

99 následuje 5 objemů 20 mM PO₄(Na) pH7,5 Φ štěpení přidání detergentu => < 2% konečná koncentrace, inkubace přes noc při teplotě místnosti za pomalého míchání Φ vyčiření filtrace přes membránu sartopure 300 (GF2-hloubka filtru je

1,2 μπι) ultrafiltrace: eliminace detergentu - koncentrace 5 objemů 20 mM PO₄(Na), hodnota pH je 7,5 pak 5 objemů 10 mM PO₄(Na)/150 mM NaCl hodnota pH je 7,5 štěpení

1.4

Charakterizace štěpeného viru

Integrita počátečních virů a kvalita štěpení se stanovila ultracentrifugací za použití 30 % sacharózového polštáře (po dobu jedné hodiny při 50 000 ot./min na rotoru TL100 Beckman). Frakce se analyzovaly specifickými testy westernovým přenosem. U některých frakcí se provedl test elektronovou mikroskopií a stanovil se infekční titr.

1.4.1 Ultracentrifugace

Centrifugační kivety se naplnily 30 % roztokem sacharózy (450 μΐ), analyzovaný vzorek se jemně a opatrně nanesl na tento sacharózový polštář a pak proběhla centrifugace po dobu 60 minut při 50 000 ot./min. při teplotě 4°C za použití rotoru

Beckman TL 100. Po centrífugaci se obsah kivety rozdělil do tří částí. Vrchní vrstva (o objemu asi 300 μΐ) se nazývá • · supernatant. Střední fáze (o objemu 300 μΐ) je fáze rozhraní mezi vzorkem a sacharózovým polštářem, která se nazývá střední fáze. Nejnižší fáze (o objemu 300 μΐ) je roztok na dně kivety, který obsahuje resuspendovaný pelet. Po centrifugací dojde k integraci viru v peletu.

Tyto tři frakce se dále analyzovaly.

1.4.2 Analýza westernovým přenosem

Tato analýza umožňuje testovat integritu (pozitivní frakce peletu) a je možné stanovit účinnost štěpení (frakce, ve kterých se vyskytují všechny nebo většina strukturních proteinů, jako jsou obalové proteiny).

Při charakterizaci specifických virových proteinů se mohou použít specifické protilátky.

U štěpených a neštěpených frakcí RSV-A se analyzoval obsah anti-F proteinu (povrchový protein), anti-G proteinu (povrchový protein), anti-N proteinu (nukleokapsid) a anti-M (matrice) proteinu.

V případě viru PIV-3 se ve štěpených a neštěpených frakcí analyzoval obsah proteinu NH s monoklonální protilátkou a obsah proteinů F, Μ, HN pomocí polyklonální protilátky.

Kritérie pro štěpení

Přítomnost pozitivního signálu při westernově přenosu (WB) proti všem čtyřem proteinům se testoval ve frakci peletu a absence signálu ve dvou dalších frakcí před štěpením naznačuje přítomnost celého neporušeného viru ve virovém přípravku.

Štěpení se považuje za účinné v případě, že se porušil obal a proteiny obalu se detekovaly v supernatantu a/nebo ve střední frakci. V případě RSV je štěpení účinné, když se například protein F nebo G stanovil ve frakcích S nebo M. Protein F a G se lokalizovaly s výhodou ve vrstvách S a/nebo M a nikoliv v peletu.

Shrnutí výsledků

Výsledky v případě RSVA jsou zobrazeny na obrázcích 1 až .

Ve všech výsledcích westernová přenosu termín „split-O znamená virus před štěpením. Symboly „S, „M a „P znamenají supernatant, střední fáze a pelet, které se odebraly po ultracentrifugaci vzorku na sacharózovém polštáři. Dráhy se číslují zleva doprava. Objemy značí množství vzorku naneseného do gelu SDS-Page.

Obrázek č. 1 zobrazuje westernův přenos štěpeného RSVA, který se testoval monoklonální protilátkou B4 (anti-F) .

V horním panelu: Ve spodním panelu:

1	STD	10 μΐ
2	Split - Ο	10 μΐ
3	Split Ο - S	10 μΐ
4	Split Ο - Μ	10 μΐ
5	Split Ο - Ρ	10 μΐ
6	Split DOC-S	10 μΐ
7	SplitDOC-M	10μ1
8	Split DOC - Ρ	10 μΐ
9	Split sarfeo - S	10 μΐ
10	Split satfcp - M	10 μΐ
11	Split sarfeo - P	10 μΐ

1	STD	10 μΐ
2	, vzork.pufr	10 μΐ
3	Split 0 - S	. 10 μΐ
4	Split 0 - M	10 μΐ
5	Split O-P	10 μΐ
6	Split planta - S	10 μ
7	Split planta-M	10 μΐ
8	Split planta - P	10 μΐ
9	Split lauret .9 - S	10 μΐ
10 ·	Split lauret i9 - M	10 μΐ
11	Split lauret 9 - P	. ίο Μ
12	STD	10 μΐ

Obrázek č. 2 znázorňuje westernův přenos štěpeného RSVA, který se testoval monoklonální protilátkou proti proteinu M.

V horním panelu: Ve spodním panelu:

1	STD	10 μϊ
2	Split - Ο	20 μϊ
3	Split Ο- S	20 μΐ
4	Split Ο - Μ	20 μϊ
5	Split Ο-Ρ	20 μϊ
ό	Split DOC - S	20 μϊ
Ί ,	Split DOC-Μ	20 μϊ
8 '	Split DOC-Ρ	20 μϊ
9	Split sarfco - S	20 μϊ
10	Split sar^o - M	20 μϊ
11	Split sarfcp - P	20 μϊ

1	STD	10 μϊ
2	; vzork.pufr	20 μϊ
3	Split O -S	20 μΐ
4	Split O —M	20 μϊ
5	Split O-P	20 μϊ
6	Split planta —S	20 μϊ
7	Split planta -M	20 μϊ
8	Split planta - P	20 μϊ
9	Split lauret — S	20 μϊ
10	Split lauret! <9 — M	20 μϊ
11	Split lauret P-P	20 μϊ

Obrázek č. 3 ilustruje westernův přenos štěpeného RSVA testovaného monoklonální protilátkou proti proteinu G.

V horním panelu:

Ve spodním panelu:

1	STD	10 μϊ
2	Split - Ο	20 /ll
3	Split Ο - S	20 μϊ
4	SplitO-M	20 μϊ
5	Split O-P	20 μϊ
6	Split DOC - S	20 μϊ
7	Split DOC -M	20 μϊ
8	Split DOC-P	20 μϊ
9	Split sarfe» - S	20 μϊ
10	Split sarfc* - M	20 μϊ
11	Split sarfcp - P	20 μϊ

1	STD	10 μϊ
2	vzork.pufr	20 μϊ
3	Split Ο—S	20 μϊ
4	SplitO-M	20 μϊ
5	Split O-P	20 μϊ
6	Split planta - S	20 μϊ
7	Split planta - M	20 μϊ
8	Split planta-P	20 μϊ
9	Split lauret :9 - S	20 μϊ
10	Split lauret i9 - M	20 μϊ
11	Split lauret 9 - P	20 μϊ

Obrázek č. 4 znázorňuje westernův přenos štěpeného RSVA testovaného monoklonální protilátkou proti N.

• · * · « • · · · · · · * · A · » · a • A · · · fl • ·* 99 99 ·· 9999 : i .· • 9 9

Ve spodním panelu:

V horním panelu:

1	STD	10 jul
2	Split - O	20 μΐ
3	Split 0 - S	20/il
4	Split O-M	20/il
5	SplitO-P	20/ll
6	Split DOC - S	20/li
7	Split DOC - M	20/il
8	Split DOC-P	20/il
9	Split sarleo - S	20 μΐ
10	Split saifeo - M	20/ti
11	Split sarfcp - P	20 /il

1	STD	10 μΐ
2	vzork.pufr	20 μΐ
3	Split O-S	20 /il
4	Split O-M	20 μΐ
5	SplitO-P	20 μΐ
6	Split planta-S	20 μΐ
7	Split planta - M	20 μΐ
•8	Split planta - P	20 μΐ
9	Split lauret 9-S	20 μΐ
10	Split lauret 9 - M	20 μΐ
11	Split lauretl .9 - P	20 μΐ

Přítomnost signálu v kultivačním médiu a ve frakcích supernatantu a libovolný pruh ve frakci peletu po štěpení proteinů F a G vykazují, že virový obal byl zcela rozštěpen. Přítomnost signálu ve všech frakcích v případě proteinů N a M ukazují přítomnost těchto proteinů ve štěpených přípravcích. Tyto výsledky naznačují, že všechny čtyři testované detergenty štěpí virus RSVA.

Analýza signálů proti všem čtyřem proteinům ve všech frakcích a zvláště porovnávací signály proti proteinům N a M po štěpení v kultivačním médiu a frakci supernatantů naznačují, že za testovaných podmínek NaDOC a sarkosyl neštěpí virus, ale jsou schopny porušit všechny virové struktury a rozpouštět strukturální a nestrukturální proteiny.

Podobné výsledky se získaly štěpením PIV.

NaDoc a sarkosyl jsou výhodná štěpící činidla v případě všech virů.

1.5 Virová titrace in vitro • · · 0 « 9 9 • · · · 0000

Ztráta integrity po štěpení vede k tomu, že virus není dále infekční. Analýza úspěšného porušení viru je zobrazena snížením virového titru po štěpení 10⁶log.

1.6 Analýza elektronovou mikroskopií (EM)

Analýza elektronovou mikroskopií se provedla za použití metody standardního negativního barvení ve dvou krocích, kdy se jako kontrastní činidlo použije fosfotungstát sodný (popisuje se v publikaci Hayat and Miller, 1990, Negative Staining, McGraw, ed. Hill). Na mřížce se posuzoval štěpený patern materiálu.

Analýza neštěpených virů RSVA a PIV3 a virů štěpených pomocí NaDoc nebo sarkosylem pomocí elektronové mikroskopie podporuje pozorování získané analýzou westernovým přenosem. Pro prezentaci výsledků jsou zobrazeny data v případě RSV. Obrázek č. 5 ilustruje virus RSVA před štěpením. Obrázky č. 6 a 7 ukazují virus RSVA štěpený NaDOC nebo sarkosylem.

Neštěpený virus (celý neporušený virus) obsahoval relativně dobře chráněné nebo slabě poškozené virové částice a nějaký amorfní materiál. Viry štěpené NaDoc a sarkosylem jsou zobrazeny jako heterogenní smír amorfního materiálu, který je do různého stupně agregovaný. Podobná data se získala s PIV.

Příklad 2: Imunogennost štěpených vakcín u myší

Štěpené přípravky RSV a/nebo PIV se používaly jako imunogeny pro vakcinaci myší, aby bylo možné zjistit jejich imunogennost. Osm týdnů staré samice myší se imunizovaly intranasálním štěpeným vakcinačním prostředkem. Zkoumaly se aplikace parenterálním, mukozálním a ID způsobem. Volba adjuvans závisí na způsobu aplikace. V žádném případě kontrola • · • · nezahrnuje adjuvans. Dvě dávky se aplikovaly v intervalu několika týdnů.

Dva týdny po aplikaci konečné dávky se zvířata usmrtila, odebrala se krev, slezinné buňky a/nebo se provedl výplach nosu. Humorální imunitní odezva specifická pro virus se odhadla testováním myšího séra za pomocí testů ELISA, které jsou specifické pro virus. Navíc profil izotypu protilátkové odezvy se stanovil za použití testů specifických pro izotyp. Přítomnost neutralizačních látek v séru se odhaduje za použití testu neutralizace specifického viru. Vyvolání relevantní lokální imunitní odezvy se může hodnotit testem, kdy se neutralizují protilátky v nosním výplachu nebo v jiném případě v testu stanovení IgA specifického pro virus v nosním výplachu.

Vyvolání buněčné imunitní odezvy specifické pro virus se hodnotilo stimulací in vitro slezinných buněk a měřením buněčné proliferace (pohlcení tritiovaného thymidinu) a/nebo vylučováním IL-5 a IFNy ve stimulovaných buňkách.

Při' odhadu dopadu proměnných v experimentu se klade důraz na kvalitu a sílu odezvy vyvolanou štěpenými přípravky.

2.1 Štěpené přípravky RSV

Následující série experimentů ukazuje, že štěpený RSV, vyvolává silnou imunitní odezvu, když se aplikuje intranasálním (IN), intramuskulárním (IM) nebo intradermálním způsobem (ID). Za účelem přesněji reagovat na stav imunitního systému dětské (nedotčené) populace nebo přestárlých lidí (už přišli do kontaktu s virem a nesou protilátky) se imunogennost hodnotila buď u zvířat, která nesou nebo ne nesou protilátky, a demonstrovala se u obou uvedených populací.

4 ♦ ·· • · 4 · · · ♦ * · 4 ·

Ϊ» 4 • · ♦· 4·

V první sadě experimentů se používaly osm týdnů staré samice myši Balb, za účelem testovat imunogennost štěpeného přípravku RSV aplikovaného buď intranasálním nebo intramuskulárním způsobem. Primární imunizace se provedla intranasální aplikací 3xl0⁵ jednotek tvořících plaky živého viru RSV v objemu 60 pl (2x30 pl) . Tři týdny po primární imunizaci se zvířatům aplikoval vakcinační prostředek obsahující antigen štěpeného viru RSV. Stanovení množství produktu štěpeného viru je založeno na testu ELISA specifickém pro protein F viru RSV, který stanoví množství proteinu F ve štěpeném produktu srovnávané s rekombinantním proteinovým standardem FG. Myši ve skupině A se imunizovaly dvěmi dávkami antigenu štěpeného viru RSV, které obsahují 4,2 pg proteinu F v objemu 100 μΐ. Dávky se aplikovaly intranasální cestou v intervalu 21 dní. Myši ve skupině B se imunizovaly dvěmi dávkami antigenu štěpeného viru RSV, který obsahuje 4,2 pg proteinu F upraveného 50 pg A1(OH)₃ aplikovaného v objemu 100 pl intranasální cestou v intervalu 21 dní. Myši skupiny C se imunizovaly první dávkou antigenu štěpeného viru RSV, který obsahuje 2,7 pg proteinu F v objemu 60 pl a druhá dávka antigenu štěpeného viru RSV se aplikovala o 21 dní později. Druhá dávka obsahuje 4 pg proteinu F v objemu 60 pl a aplikovala se intranasální cestou. Dva týdny po poslední dávce se všechna zvířata usmrtila a hodnotila se imunitní odezva.

Výsledky experimentu jsou zobrazeny na obrázku č. 8 až 18. První měření imunity se hodnotilo testy ELISA, které měří celkový imunoglobulin specifický pro FG viru RSV (lg) nebo izotypy IgG specifické pro FG (IgGi a IgG_2A) přítomné v séru vakcinovaných zvířat. V těchto testech se destičky s 96 prohlubněmi potáhly antigenem FG rekombinantního viru RSV a zvířecí sérum se ředilo sériově a aplikovalo se do potažených prohlubní. Vázané protilátky se detekovaly přidáním biotinem ·# 4 94 9 pak následovala s peroxidázou.

značených anti-myších Ig, IgGi nebo IgG_2A, amplifikace se streptavidinem konjugovaným Vázané protilátky se uvolnily přidáním substrátu OPDA, pak následovalo ošetření 2N H2SO4 a měření optické hustoty (OD) při vlnové délce 490 nm. Titr protilátek se vypočítal za použití softwaru SoftMax Pro (za použití rovnice se čtyřmi neznámými) a vyjádřil se v EU/ml.

Vedle testů ELISA se při charakterizaci kvality imunitní odezvy vyvolané imunizací použily neutralizační testy. V případě neutralizačního testu se na kultivačních destičkách s 96 prohlubněmi inkubovalo dvojnásobné ředění zvířecího séra s virem RSV/A (3 000 jednotek tvořící plaky) a s kompiementem morčete po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Přímo do každé prohlubně se přidaly buňky Hep-2 (10⁴ buněk na jednu prohlubeň) a destičky se inkubovaly po dobu 4 dní při teplotě 37 °C. Supernatanty se odsály a do každé prohlubně se přidal komerčně dostupný roztok WST-1. Destičky se inkubovaly po dobu dalších 18 až 24 hodin při teplotě místnosti. Optická hustota se sledovala při vlnové délce 450 nm a titrace se analyzovala lineární regresní analýzou. Uvedený titr je inverze ředění séra, které vede k 50 % snížení maximální hodnoty optické hustoty pozorované u infikovaných buněk.

Obrázek č. 8 znázorňuje výsledky celkového IgG získané testem ELISA. U primárně imunizovaných myší se silná protilátková odezva proti FG vyvolala dvojnásobnou vakcinaci, kdy se antigen štěpeného RSV aplikoval cestou IM (skupina A, B) nebo IN (skupina C). V případě vakcinace IM dochází k zesílení imunitní odezvy po použití adjuvans A1OH)₃.

Ve specifickém případě obrázek č. 8 zobrazuje titry protilátek proti FG (test ELISA) (post sekundární vakcinace) u myší iniciovaných živým virem RSV a imunizovaných štěpeným virem RSV intramuskulární (IM) nebo intranasální (IN) cestou.

Skupině myší A se aplikovaly 2 dávky IM, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného RSV. Myším ve skupině B se aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV upraveného intramuskulární cestou pomocí adjuvans alum. Myším ve skupině C se aplikovaly dvě dávky intranasálním způsobem, kdy první obsahuje 2,7 a druhá 4,0 pg štěpeného viru RSV.

Obrázek č. 9 zobrazuje výsledky neutralizačního testu v případě vzorků z obrázku č. 8. Silná protilátková odezva neutralizující virus se vyvolala u těchto primárně imunizovaných zvířat pomocí vakcinace intramuskulárním nebo intranasálním způsobem dvěmi dávkami produktu štěpeného viru a podobný trend zesílení odezvy se objevuje u skupiny, kterým se aplikovalo adjuvans alum, což se zaznamenalo testem ELISA.

Specifický obrázek č. 9 zobrazuje titry neutralizačních protilátek proti viru RSV/A (po sekundární vakcinaci) u myší primárně imunizovaných živým virem RSV a imunizovaných intramuskulárně nebo intranasálně štěpeným virem RSV. Myším skupiny A se aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV. Myším skupiny B se aplikovaly 2 dávky, kdy každá obsahuje štěpený virus RSV upravený adjuvans, kterým je alum. Myším skupiny C se aplikovaly 2 dávky intranasální cestou, kdy jedna dávka obsahuje 2,7 pg a druhá 4,0 pg štěpeného RSV.

Obrázek č. 10 zobrazuje výsledky analýzy izotypu v případě vzorků na obrázku č. 8 a 9. Zvířata primárně imunizovaná intranasálně vykazují vyšší poměr IgG2_a:IgGi ve srovnání s daty vytvořenými u myší, které neprošly primární imunizací (popisuje se dále v textu), což naznačuje trend vyvolání více jak jedné odezvy podobné Thl, v případě, že se myši primárně imunizují živým virem (například přirozená situace u populace starých lidí).

• i ::.. ::

ί * · · .* ... .

*· ··· ·

Ve specifickém případě obrázek č. 10 zobrazuje odezvy izotypu IgG proti FG (zjištěno testem ELISA) (po sekundární vakcinaci) u imunizovaných intranasálním myší primárně imunizovaných živým RSV a (IM) nebo aplikovaly štěpeným RSV intramuskulárním (IN) způsobem. Skupině A se intramuskulárně dvě dávky 4,2 pg štěpeného RSV upraveného adjuvans, kterým je alum. Skupině C se aplikovaly intranasálně dvě dávky 2,7 a 4 pg štěpeného RSV.

Obrázek č. 11 demonstruje, že dokonce po intranasální aplikaci jediné dávky antigenu dojde k vyvolání silné imunitní odezvy po vakcinaci štěpeným RSV u primárně imunizovaných populací. Tak u primárně imunizovaných populací je štěpený virus RSV silný imunogen, který po vakcinaci intranasální cestou vyvolává vysoký titr protilátek.

Ve specifickém případě obrázek č. 11 zobrazuje titry protilátek proti FG (stanoveno testem ELISA) (po primární vakcinaci) u myší primárně imunizovaných živým virem RSV a imunizovaných štěpeným virem RSV intramuskulární (IM) nebo intranasální (IN) cestou. Myším skupiny A se aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného RSV, intramuskulární cestou. Myším skupiny B se aplikovaly intramuskulárně dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného RSV upraveného pomocí adjuvans, kterým je alum. Myším skupiny C se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 2,7 a druhá obsahuje 4,0 pg štěpeného RSV. Myši skupiny D se pouze primárně imunizovaly a neaplikovala se jim vakcína. Titry protilátek zjištěné u myší v této skupině jsou pod prahem detekce a stanovily se 21 dní po primární imunizaci.

V druhé sérii dokumentů se k dokumentaci účinku dávky antigenu a adjuvans použily myši, které nebyly primárně imunizovány. Myším se aplikoval antigen štěpeného RSV, kdy ·<··

první dávka obsahuje 4,2 pg (vysoká dávka) nebo 0,42 pg (nízká dávka) proteinu F (zavedl se ve 100 pl intramuskulárním způsobem). Intramuskulární přípravky štěpeného RSV v obou dávkách antigenu se aplikovaly buď bez adjuvans nebo adjuvované přidáním 50 pg Al(OH)₃ nebo vezikulárním adjuvančním přípravkem, který obsahuje cholesterol, 3dMPL a QS21, jak se popisuje v patentovém dokumentu EP0822831, který se zde popisuje jako DQ 3DMPL. Kontrolní skupině se aplikoval intramuskulárně celý čištěný virus RSV obsahující 3,4 pg proteinu F v objemu 100 pl. O 30 dní později se intramuskulárně aplikovala druhá dávka každého přípravku (všechny jsou shodné s první injekcí s výjimkou skupiny, které se aplikoval celý čištěný virus, přičemž obdržela přípravek obsahující 4,2 pg proteinu F) . Dva týdny po poslední dávce se všechna zvířata usmrtila a hodnotila se imunitní odezva.

Obrázek č. 12 shrnuje u uvedených zvířat odezvu Ig specifickou pro FG. Silná imunitní odezva se vyvolala u zvířat imunizovaných buď vysokou nebo nízkou dávkou proteinu F, který se upravil adjuvans DQ/3DMPL a aplikoval se intramuskulární cestou. Nižší množství protilátky se vyvolalo přípravkem aplikovaným intramuskulárním způsobem. Uvedený přípravek se aplikoval s adjuvans alum nebo bez adjuvans. Ve všech případech se vyvolala zřejmá protilátková odezva, přičemž dávka obsahující malé množství antigenu vyvolává nižší množství protilátek než dávka s vysokým množstvím antigenu. Množství protilátky vyvolané vysokou dávkou celého viru bude stejné jako vyvolala nízká dávka štěpeného viru adjuvovaného DQ/3DMPL.

Ve specifickém případě obrázek č. 12 zobrazuje titry protilátek proti FG (hodnoceno testem ELISA) (post sekundární vakcinace) u myší, které nejsou primárně imunizovány a kterým se intramuskulárně (IM) aplikoval štěpený RSV. Myším ve skupině A se intranasálně aplikovaly dvě dávky obsahující * Η : '· *’ i. j

0,42 pg štěpeného viru RSV. Myším ve skupině B se intranasálně aplikovaly dvě dávky obsahující 0,42 pg štěpeného viru RSV upraveného pomocí přípravku alum. Myším ve skupině C se aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 0,42 pg štěpeného viru RSV upraveného DQ/3DMPL. Myším ve skupině D se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV. Myším ve skupině E se aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV upraveného přípravkem alum. Myším ve skupině F se aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného přípravkem DQ/3DMPL. Myším ve skupině dávky, kdy první obsahuje 3,4 a druhá 4,2 pg celého čištěného viru RSV.

viru RSV upraveného G se aplikovaly dvě

Podobné výsledky se získaly při odečítání neutralizace viru užívaného za použití vzorků na obrázku č. 12 (obrázek č. 13). Obrázek č. 13 zobrazuje titry protilátek neutralizující RSV/A (po druhé vakcinaci) u myší, které nebyly primárně imunizované, imunizovaných štěpeným RSV intramuskulárním způsobem. Myším ve skupině A se intranasálně aplikovaly dvě dávky obsahující 0,42 pg štěpeného viru RSV. Myším ve skupině B se intranasálně aplikovaly dvě dávky obsahující 0,42 pg štěpeného viru RSV upraveného pomocí přípravku alum. Myším ve skupině C se aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 0,42 pg štěpeného viru RSV upraveného DQ/3DMPL. Myším ve skupině D se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV. Myším ve skupině E se aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV upraveného přípravkem alum. Myším ve skupině F se aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV upraveného přípravkem DQ/3DMPL. Myším ve skupině F se aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV upraveného přípravkem DQ/3DMPL. Myším ve skupině G se aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 3,4 a druhá 4,2 pg celého čištěného viru RSV.

Analýza izotypů IgG vyvolaná uvedenými přípravky (cl č. 14) ukázala, že zatímco přípravky upravené s adjuvanl neupravené přípravky vyvolaly typickou odezvu podobnou Th2 myší, které nebyly primárně imunizovány, přidáním DQ/3DMPL k přípravkům vede k posunu odezvy více k typu Thl se zvýšeným poměrem IgG2a-'IgGi- To je podobné profilu pozorovanému u primárně imunizovaných zvířat, kterým se aplikoval přípravek upravený adjuvans alum nebo neupravený přípravek (obrázek č. 10) . Pak u myší, které nejsou primárně imunizovány, imunizovaných intramuskulárně štěpeným RSV se vyvolala silná protilátková odezva, která se zesílila přidáním adjuvans.

Ve specifickém případě obrázek č. 14 zobrazuje titry protilátek proti FG (hodnoceno testem ELISA) (post sekundární vakcinace) u myší, které nejsou primárně imunizovány a kterým se intramuskulárně (IM) aplikoval štěpený RSV. Myším ve skupině A se intranasálně aplikovaly dvě dávky obsahující 0,42 pg štěpeného viru RSV. Myším ve skupině B se intranasálně aplikovaly dvě dávky obsahující 0,42 pg štěpeného viru RSV upraveného pomocí přípravku alum. Myším ve skupině C se aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 0,42 pg štěpeného viru RSV upraveného DQ/3DMPL. Myším ve skupině D se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV. Myším ve skupině E se aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV upraveného přípravkem alum. Myším ve F se aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 p _rčepeného viru RSV upraveného přípravkem DQ/3DMPL. Myším ve skupině G se aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 3,4 a druhá 4,2 pg celého čištěného viru RSV.

Podobné imunizace se provedly u myší, které nejsou primárně imunizovány, intranasálním způsobem. V tomto případě

0 0 0 · 0

0 0 «0 ► · · 0 0· 00 se myším aplikoval v případě první dávky antigen štěpeného RSV obsahující 2,4 pg proteinu F (zavedeného v objemu 60 pl (2x30 pl) . V případě druhé dávky aplikované o 30 dní později se myším aplikoval antigen štěpeného viru obsahující 3,5 pg proteinu F. Intranasální štěpený RSV se aplikoval buď bez adjuvans nebo upravený přidáním 5 pg labilního toxinu mikroorganizmu E. coli (LT) nebo s 0,5 % polyoxyetylen-9lauryleterem (zde se sloučenina označuje jako lauret 9). Kontrolní skupina se imunizovala intranasálně celým čištěným virem RSV, který obsahuje 2 pg proteinu F v první dávce a 3,5 pg proteinu F ve druhé dávce. Dva týdny po konečné imunizaci se zvířata usmrtila a hodnotila se imunitní odezva.

Jak je zobrazeno na obrázcích č. 15 a 16 protilátkové odezvy byly vyvolány u myší, které nebyly primárně imunizovány intranasální aplikací přípravků. Zatímco odečet testu ELISA (obrázek č. 15) naznačuje, že odezvy na intranasální imunizaci jsou trochu slabší, než ty vyvolané intramuskulární aplikací, odečet neutralizace (obrázek č. 16) naznačuje, že intranasálně aplikovaný přípravek RSV upravený LT je stejně dobrý jako, když se aplikuje intramuskulárně. Pak štěpený RSV aplikovaný intranasálně myším, které nejsou primárně imunizovány, jsou také imunogenní.

Obrázek č. 15 zobrazuje titry protilátek proti FG (po druhé vakcinaci) u myší, které nejsou primárně imunizovány, imunizovaných intranasálně (IN) nebo intramuskulárně (IM) štěpeným RSV. Myším ve skupině A se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 2,4 a druhá 3,5 pg štěpeného viru RSV. Myším ve skupině B se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 2,4 a druhá 3,5 pg štěpeného viru RSV upraveného pomocí přípravku lauret 9. Myším ve skupině C se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 2,4 a druhá 3,5 pg štěpeného viru RSV upraveného LT. Myším ve skupině D se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první • to • to • to toto·· ·?····* toto « • ♦ * · · tototo 9 9 9 .· · * * · · * · * · Σ. Σ obsahuje 2,0 a druhá 3,5 pg čištěného celého viru. Myším ve skupině E se intramuskulárně aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV.

Obrázek č. 16 zobrazuje titry protilátek neutralizující RSV/A (po druhé vakcinaci) u myší, které nejsou primárně imunizovány, imunizovaných intranasálně (IN) nebo intramuskulárně (IM) štěpeným RSV. Myším ve skupině A se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 2,4 a druhá 3,5 pg štěpeného viru RSV. Myším ve skupině B se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 2,4 a druhá 3,5 pg štěpeného viru RSV upraveného pomocí přípravku lauret 9. Myším ve skupině C se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 2,4 a druhá 3,5 pg štěpeného viru RSV upraveného LT. Myším ve skupině D se intranasálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahuje 2,0 a druhá 3,5 pg čištěného celého viru. Myším ve skupině E se intramuskulárně aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV.

Imunogennost antigenu štěpeného RSV, když se aplikuje způsobem ID se hodnotila u morčat. Vhodnost injekce ID u tohoto druhu se potvrdila injekcí India ink do kůže a histologickým zkoumáním tkání (data nejsou uvedena). Za účelem stimulovat imunitní systém u populace přestárlých lidí (například primárně imunizovaných proti RSV) se Hartleyovy morčata (5 ve skupině) primárně imunizovaly buď živým virem RSV (5xl0⁵ jednotek tvořící plaky, intranasálně, v objemu 100 až 50 pl do jedné nosní dírky, skupina-A až E) nebo čištěným celým virem RSV (obsahujícím 6 pg proteinu F aplikovaného intramuskulárně v objemu 100 pl, skupiny az

J) ·

Dvě ekvivalentní dávky vakcín se aplikovaly v den 21 a 42 po primární imunizaci. Myším ve skupině A a F se aplikovaly štěpený RŠV obsahující 4,2 pg proteinu F aplikovaného způsobem ID. Myším ve skupině B a G se aplikoval přípravek RSV • ·· ** *'» 99 9999 *·*···· ·« 4 ♦ · * · 9 9 9 9 4 · ·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 · obsahující 0,84 pg proteinu F aplikovaného způsobem ID. Myším ve skupině C a H se aplikoval štěpený RSV obsahující 4,2 pg proteinu F upraveného DQ/3DMPL aplikovaného způsobem ID. Myším skupiny D a I se aplikoval způsobem ID štěpený RSV obsahující 0,8 4 pg proteinu F upraveného DQ/3DMPL. Myším ve skupině E a J se aplikoval intramuskulárně štěpený RSV obsahující 4,2 pg proteinu F. Zvířatům se po dobu tří týdny po první dávce imunizace odebírala krev a dva týdny po druhé imunizaci a hodnotila se imunitní odezva.

Výsledky uvedeného experimentu se shrnují na obrázku č. 17 a 18. Obrázek č. 17 zobrazuje imunitní odezvu specifickou pro FG detekovanou v séru morčat v průběhu experimentu. Test ELISA specifický pro FG používaný při testování morčat je podobný myšímu testu ELISA tím, že prohlubně se potáhly rekombinantním FG a zvířecí sérum se ředilo a aplikovalo se do potažených prohlubní. .V tomto testu se vázané protilátky detekovaly pomocí lg proti morčeti konjugovanému křenovou peroxidázou. Pak následuje přidání substrátu a zobrazení, jak se popisuje shora v textu. V případě všech skupin se pozoruje po primární imunizaci slabá odezva, což umožňuje pozorování zesílené odezvy na imunizaci intramuskulárním nebo intradermálním způsobem. Zesílení je možné jasně pozorovat po primární imunizaci a další zesílení je zřejmé po sekundární vakcinaci u všech skupin s výjimkou skupiny H, kdy se titry protilátek nezvyšují. Jasné zesílení odezvy se pozorovalo po aplikaci adjuvans (skupina C, D, Η, I) . V tomto experimentu není možné pozorovat zřetelný účinek dávky antigenu a 1/5 dávky aplikovaná intradermálním způsobem funguje stejně jako dávka aplikovaná intramuskulárním způsobem, dokonce aniž se aplikuje adjuvans. Obrázek č. 18 shrnující data neutralizace ukazuje podobný trend. Tak u primárně imunizované . populace (buď infekce živým virem nebo aplikace čištěného celého viru) je jediná dávka štěpeného RSV aplikovaná intradermálním způsobem ·· ·«·· ·

je silně imunogenní a tato odezva může být dále zesílena druhou dávkou vakcinace.

Obrázek č. 17 zobrazuje titry protilátek proti FG (test ELISA) u primárně imunizovaných morčat dále imunizovaných intranasálně (IN) nebo intramuskulárně (IM) štěpeným RSV. Morčata ve skupině A až E se primárně imunizovaly živým virem RSV. Morčata ve skupině F až J se primárně imunizovaly čištěným celým virem. Po vakcinace se morčatům ve skupině A a F intradermálně aplikovaly dvě dávky obsahující 0,84 pg štěpeného viru RSV. Morčatům ve skupině B a G se intradermálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahující 4,2 pg RSV. Morčatům ve skupině C a H se intradermálně aplikovaly dvě dávky obsahující 0,84 pg štěpeného viru RSV upraveného DQ/3DMPL. Morčatům ve skupině D a I se intranasálně aplikovaly dvě dávky obsahující 0,84 pg štěpeného viru RSV upraveného DQ/3DMPL. Morčatům ve skupině E a J se intramuskulárně aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV.

Obrázek č. 18 zobrazuje titry protilátek neutralizující RSV/A u primárně imunizovaných morčat dále imunizovaných intranasálně (IN) nebo intramuskulárně (IM) štěpeným RSV. Morčata ve skupině A až E se primárně imunizovaly živým virem RSV. Morčata ve skupině F až J se primárně imunizovaly čištěným celým virem. Po vakcinace se morčatům ve skupině A a F intradermálně aplikovaly dvě dávky obsahující 0,84 pg štěpeného viru RSV. Morčatům ve skupině B a G se intradermálně aplikovaly dvě dávky, kdy první obsahující 4,2 pg RSV. Morčatům ve skupině C a H se intradermálně aplikovaly dvě dávky obsahující 0,84 pg štěpeného viru RSV upraveného DQ/3DMPL. Morčatům ve skupině D a I se intranasálně aplikovaly dvě dávky obsahující 0,84 pg štěpeného viru RSV upraveného DQ/3DMPL. Morčatům ve skupině E a J se intramuskulárně • tata • «ta • ta • · · ta • · · ta · ta • · · · • tatatata ta « aplikovaly dvě dávky, kdy každá obsahuje 4,2 pg štěpeného viru RSV.

Tyto experimenty demonstrovaly, že antigen štěpeného RSV je silně imunogenní jak u naivní tak u primárně imunizované populace. Navíc tyto experimenty ukazují, že štěpený RSV se způsoby, které zahrnují intradermální a všechny může účinně aplikovat různými intramuskulární, intranasální a způsoby jsou imunogenní. Přidání adjuvans může v některých případech zesílit protilátkovou odezvu a/nebo vyvolat posun profilu odezvy podobné Th2 k odezvě podobné Thl.

Claims (26)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Vakcinační prostředek obsahující přípravek štěpeného viru RSV s obalem, vyznačující se tím, že obsahuje fragmenty virové membrány, proteiny obalu virové membrány, virovou matrici a jaderné proteiny
2. 2. Vakcinační prostředek podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje další štěpený virus vybraný se skupiny zahrnující virus influenzy, respirační syncyciální virus, virus parainfluenzy, metapneumovirus, spalničkový virus, virus příušnic, virus Epstein-Barrové, herpesový virus, cytomegalovirus, virus dengue, virus žluté horečky, virus klíšťové encefalitidy, virus japonské encefalitidy, zarděnkový virus, virus východní, západní a venezuelský koňské encefalitidy a HIV.
3. 3. Vakcinační prostředek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že dále zahrnuje jedno nebo více rezíduálních štěpících činidel.
4. 4. Vakcinační prostředek podle nároku 3, vyznačující se tím, že reziduální štěpící činidlo se vybralo ze skupiny obsahující lauret 9, NaDoc, sarkosylovou skupinu, Tween 80^(tm) a Triton X100^ítm)'
5. 5. Vakcinační prostředek podle nároku 4, vyznačuj ící se tím, že štěpící činidlo je NaDoc nebo sarkosyl.
6. 6. Vakcinační prostředek podle libovolného z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že přípravek obsahuje navíc stabilizační činidlo.

   • 4· 4 4 4 · 4 4 44 4 4 • 4 44 4 44 4 « 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 · 4 4 44 44 4 4 44 44
7. 7. Vakcinační prostředek podle nároku 6, vyznačuj ící se tím, že stabilizační činidlo je povrchově aktivní činidlo.
8. 8. Vakcinační prostředek podle nároku 7, vyznačuj ící se tím, že povrchově aktivní činidlo je buď samotný polyoxyetylensorbitanmonooleát (Tween8 0 ^ítm)) , t-oktylfe
9. 9.

   (Triton X100^(tm)) a polyoxyetylen-9podle libovolného z nároků 1 až 8, se tím, ž e se vytvořil pro noxypolyetoxyetanol lauryleter.

   Vakcinační prostředek vyznačuj ící intranasální zavedení.
10. 10. Vakcinační prostředek vyznačuj ící podle libovolného z nároků 1 až 8, se tím, ž e se vytvořil pro intramuskulární nebo subkutánní zavedení.
11. 11. Vakcinační prostředek podle libovolného z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že se vytvořil tak, aby bylo možné ho aplikovat transdermálním, intradermálním, intraepiteliálním nebo transkutánním způsobem.
12. 12. Vakcinační prostředek podle nároku 11,

    vyznačuj ící s e tím, ž e se vytvořil pro intradermální zavedení. 13. Vakcinační prostředek podle libovolného z nároků 1 až 12, v y z n a č u jící s e tím, že dále obsahuje adjuvans. 14. Vakcinační prostředek podle nároku 13, v y z n a č u jící s e tím, že adjuvans je

    polyoxyetylen-9-lauryleter.

    • 99 • 9 ·· 9» 9994 • · · • • • • • W • · · • • 99 9 • 9 4 9 9 9 • • • 9 • 9 • 4 ·· 9* ·· 9* 99 44
13. 15. Vakcinační prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že adjuvans je výhodný stimulátor buněčné odezvy THI.
14. 16. Vakcinační prostředek podle nároku 15, vyznačující se tím, že výhodný stimulátor buněčné odezvy THI se vybral ze skupiny adjuvans obsahující 3D-MPL, QS21, směs QS21 a cholesterol, oligonukleotid CpG a jejich kombinace.
15. 17. Vakcinační prostředek podle nároku 16, vyznačující se tím, že adjuvans je vezikulární adjuvantní prostředek obsahující cholesterol, saponin a derivát LPS.
16. 18. Vakcinační prostředek podle libovolného z nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že obsahuje nosič.
17. 19. Způsob produkce vakcinačního prostředku podle libovolného z nároků 1 až 18, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky

    a) štěpení viru RSV s obalem,

    b) smíchání přípravku štěpeného viru s obalem se stabilizačním činidlem a

    c) smíchání přípravku štěpeného viru s obalem s adjuvans.
18. 20. Způsob výroby vakcinačního prostředku podle nároku 19, vyznačující se tím, že přípravek štěpeného viru se smíchá se stabilizačním činidlem, které obsahuje alespoň jedno povrchově aktivní činidlo vybrané ze skupiny zahrnující polyoxyetylensorbitanmonooleát (Tween80^(tm)) , toktylf enoxypolyetoxyetanol (Triton X100^(tm)) a polyoxyetylen-9-lauryleter.

    • ·· • · · • · · ·· • · • · ·· • ··· ·· • · • · ··· • • · ta • · • · • ta • ta* ·· ta· ·· ··
19. 21. Použití vakcinačního přípravku, který obsahuje štěpený RSV, při výrobě vakcinačního prostředku.
20. 22. Použití vakcinačního přípravku, který obsahuje štěpený RSV, při výrobě vakcinačního prostředku pro prevenci nebo léčbu onemocnění.
21. 23. Sada pro zavedení intranasálního vakcinačního prostředku podle libovolného z nároků 1 až 18, vyznačuj ící se t i m, ž e zahrnuje

    a) přípravek obsahující štěpený virus RSV s obalem a

    b) zařízení pro intranasální zavedení.
22. 24. Zařízení pro intranasální zavedení, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje vakcinační prostředek podle libovolného z nároků 1 až 18.
23. 25. Způsob ochrany nebo léčby savce náchylného k onemocnění způsobeným RSV nebo trpícího tímto onemocněním, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci účinného množství vakcinačního prostředku podle libovolného z nároků 1 až 18.
24. 26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, ž e se vakcinační prostředek aplikuje intradermálním nebo intranasálním způsobem.
25. 27. Použití vakcinačního přípravku, který obsahuje štěpený RSV, při výrobě vakcinačního prostředku pro intranasální nebo intradermální zavedení.

    Prostředek, libovolného se tím, podle ící způsob, použití, sada nebo zařízení nároku 1 až 27, vyznačuj ž e vakcinační prostředek je imunogenní.
26. 29. Prostředek, způsob, použití, sada nároku 28, vyznačující vakcinační prostředek je u seronegativních jedinců imunogenní.