CZ20013773A3 - Vakcina - Google Patents
Vakcina Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20013773A3 CZ20013773A3 CZ20013773A CZ20013773A CZ20013773A3 CZ 20013773 A3 CZ20013773 A3 CZ 20013773A3 CZ 20013773 A CZ20013773 A CZ 20013773A CZ 20013773 A CZ20013773 A CZ 20013773A CZ 20013773 A3 CZ20013773 A3 CZ 20013773A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- vaccine
- rsv
- mpl
- valent
- protein
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
- A61K39/092—Streptococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/05—Adjuvants
- C12N2501/056—Immunostimulating oligonucleotides, e.g. CpG
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
- C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nových vakcin, způsobů jejich výroby a jejich použití při prevenci a léčení. Předkládaný vynález se týká zvláště kombinovaných vakcin pro podávání dětem a starším lidem. Vynález se týká zejména kombinovaných vakcin pro ochranu proti infekci nebo onemocnění Streptococcus pneumoniae a virem respiračního syncytia (Respirátory Syncytial Viurs, RSV).
Dosavadní stav techniky
Streptococcus pneumoniae je grampozitivní bakterie odpovědná za velký počet onemocnění a úmrtí, zvláště u mladších a starších věkových kategorií. Expanzivní kolonizace respiračního traktu a středního ucha, zvláště u malých dětí, je nejčastější příčinou návštěv nemocnic v USA. Bakterie se může stát invazivní, infikovat dolní část plic a způsobit pneumonii. Míra výskytu pneumokokové pneumonie v USA u osob starších než 60 let se odhaduje na 3 až 8 případů na 100 000 lidí. Ve 20% případů vede toto onemocnění k bakteremii a jiným projevům, jako je meningitida, s mírou úmrtnosti, která se blíží 30 % i při léčení antibiotiky. Existuje 90 známých sérotypů Streptococcus pneumoniae, které se určují na základě struktur obalového (kapsulárního) polysacharidu obklopujícího bakterii, který je také hlavním faktorem virulence.
Je známá 17-valentní vakcina proti pneumokokúm (Moniarix) založená na purifikovaných polysacharidech sérotypů pneumokoků, které se nejčastěji účastní invazivního onemocnění. Způsob čištění těchto polysacharidů byl popsán v evropském patentu 72513 B1.
-2 Pokusy s účinností vakcíny prováděné u vakcin s nižší valencí ukázaly 70 až 90% účinnost vzhledem k sérotypům přítomným v kombinaci. Studie na nemocných v USA u osob starších 55 let používaly 14valentní vakcinu, která ukázala 70% účinnost (Mills, O. F., a Rhoads, G. G., J. Clin. Epidemiol. (1996); díl 49 (6) 631 - 636). Přidání dalších polysacharidů (pro vytvoření 23-valentní vakciny proti pneumokokům) bylo akceptováno na základě odpovídající sérologické odpovědi, ačkoli chyběly údaje o klinické účinnosti (K. R. Brown, 'Combined. Vaccines and Simultaneous Administration’, ed. Williams a další, New York Academy of Sciences 1995, str. 241 - 249).
Byla studována současná imunizace 23-valentní vakcínou proti pneumokokům (Pnu-lmmune 23-Lederle USA) a vakcínou proti chřipce (Fluarix, T. J. Fletcher, T. W. Tunnicliffe, K. Hammond, K. Roberts, J. G. Ayres (1997), Br. Med. J. 314: 1663), přičemž nebyly pozorovány žádné významné imunologické rozdíly mezi současnou imunizací nebo imunizací v odstupu jednoho měsíce.
Pneumokokové polysacharidy byly upravovány pro dosažení větší imunogenicity u dětí chemickou vazbou těchto polysacharidů na proteinové nosiče. Byly prováděny výzkumy klinické účinnosti pro ověření tohoto postupu z hlediska účinnosti při prevenci dětského otitis media.
U dětí, kterým byla podána aktivační dávka 7- až 11-valentní konjugovanou vakcínou proti pneumokům může být podána zesilující dávka 23-valentní vakcínou proti pneumokokům založenou na samotných polysacharidech, aby se dosáhlo zvýšení sérotypového pokrytí a koncentrací IgG (Block, S. L., J. A. Hedrick, R. A. Smith, R. D. Tyler, M. Giordani, M. D. Blum, J. Sadoff, E. Keegan, Abstract G88, 37th ICAAC, Toronto (1997); Anderson, E. L., Kennedy, D. J., Geldmacher, K. M., Donnelly, J., Mendelman, P, The Journal of Paediatrics, květen 1996, díl 128, no 5, část 1, 649 -653).
Virus respiračního syncytia člověka (Human Respirátory Syncytial Virus, RSV) je členem skupiny virů Paramyxoviridiae, a způsobuje onemocnění dolního respiračního traktu, zvláště u malých dětí a kojenců. Poslední zprávy uvádějí, že RSV je také důležitý patogen u dospělých, zvláště u starší populace.
RSV je virus opatřený obalem s nesegmentovaným genomem tvořeným ribonukleovou kyselinou s negativním řetězcem o délce 15 222 nukleotidů, kódující 10 druhů mRNA, kde každá kóduje jediný polypeptid. Tři z deseti proteinů jsou transmembránové povrchové proteiny: protein G (přichycení), F (fúze) a proteiny SH. Dva proteiny jsou proteiny virionové matrice (M a M2), tři proteiny jsou složky nukleokapsidy (N, P a L) a dva proteiny jsou nestrukturní (NS1 a NS2). Existují dva antigenně odlišné geny RSV, označované jako kmeny A a B. Charakterizace kmenů z těchto skupin ukázala, že hlavní rozdíly jsou v proteinech G, zatímco proteiny F jsou konzervované.
Virus respiračního syncytia (RSV) se vyskytuje v sezónních vypuknutích onemocnění, jejichž vrchol je v mírném klimatu během zimy a v teplejších klimatech v období dešťů (DeSilva LM & Hanlon MG, Respirátory Syncytial Virus: a report of a 5-year study at a children’s hospital. J. Med. Virol. 1986; 19: 299 - 305). V oblastech, kde se vyskytuje, má většinou RSV pravidelný a předvídatelný obraz a další respirační virové patogeny, které se vyskytují hromadně, se pouze zřídka vyskytují současně (Glezen WP & Denny FW. Epidemiology of acute lower respirátory disease in children, N. Engl.
J. Med. 1973; 288: 498 - 505).
RSV je hlavní příčinou vážných onemocnění dolního dýchacího traktu u dětí. Odhaduje se, že 40 až 50 % dětí hospitalizovaných s bronchiolitidou a 25 % dětí hospitalizovaných s pneumonií je hospitalizováno jako přímý důsledek infekcí RSV. Primární infekce
RSV se často vyskytuje u dětí mladších než jeden rok; 95 % dětí nese sérologické důkazy prodělané infekce do dvou let věku a 100 % populace v dospělosti.
U dětí a mládeže infekce postupuje z horního do dolního respiračního traktu v přibližně 40 % případů při klinickém obrazu bronchiolitidy nebo pneumonie. Největší riziko vyvinutí vážných projevů infekce RSV (primární respirační selhání) je u dětí od dvou do šesti měsíců; riziko vážných komplikací je však u dětí jakéhokoli věku po prodělaném srdečním nebo plicním onemocnění, u nedonošených dětí a dětí s oslabenou imunitou.
V průběhu života dochází k symptomatické reinfekci a je stále zjevnější, že RSV je také důležitým patogenem dospělých, zvláště starších osob.
Téměř určitě není u dospělých infekce RSV diagnostikována ve všech případech, částečně proto, že je považována za dětskou infekci. U dospělých se tedy nehledá důkaz viru pro vysvětlení respiračního onemocnění. Navíc je obtížné identifikovat virus RSV v nosních sekretech pacientů, u kterých se již vyskytuje určitý stupeň imunity k viru, jak je tomu u velké většiny dospělých. U dospělých mladšího až středního věku se typicky vytváří při infekci RSV přetrvávající syndrom podobný nachlazení. U starších osob se může vyvinout setrvávající respirační syndrom, který je v podstatě neodlišitelný od chřipky, s příznaky onemocnění horního respiračního traktu, které mohou být doprovázeny vyvinutím onemocnění dolního respiračního traktu včetně zápalu plic. Starší osoby umístěné pohromadě jsou zvláště ohrožené, protože se na jednom místě vyskytuje velký počet jedinců s podezřením na onemocnění. Šíření infekce v takové populaci, kde mnoho lidí má řadu lékařských problémů, které mohou způsobit vážnější průběh tohoto onemocnění, je obtížně ovlivnitelné.
- 5 Údaje z nedávných studií vyhodnocujících dopad infekce RSV jako příčiny hospitalizace u dospělých a u zdravých starších osob přítomných ve společenství většího počtu lidí, dále poukazují na důležitou úlohu infekce RSV u těžkých onemocnění dolního respiračního traktu u těchto populací (Dowell S. F., Anderson L. J., & Gary Jr Η. E., a další, J. Infect Dis. 1996; 174: 456 - 462; Falsey A. R., Cunningham C. K., & Barker W. H., a další, J. Infect Dis. 1995; 172: 389 - 394). Dowell identifikoval RSV jako jeden ze čtyř nejběžnějších patogenů způsobujících těžké onemocnění dolního respiračního traktu vedoucí k hospitalizaci dospělých (Dowell S. F., Anderson L. J., & Gary Jr Η. E., a další, J. Infect Dis. 1996; 174: 456 - 462). Falsey ukázal, že vážné infekce RSV u starších osob nejsou omezeny na domovy s pečovatelskou službou nebo epidemické situace. Infekce RSV je spíše pravděpodobná příčina vážného onemocnění u starších pacientů, kteří se pohybují ve společenství. Podobně jako u hospitalizací s chřipkou typu A, byly hospitalizace v souvislosti s infekcemi RSV doprovázeny vážnou nemocností, jak je dokázáno delšími pobyty v nemocnici, potřebou intenzívní péče a použitím podpory dýchání (Falsey A. R., Cunningham C. K., & Barker W. H., a další, J. Infect Dis. 1995; 172: 389 - 394).
Tyto studie ukazují na lékařskou a ekonomickou potřebu vyvinout účinnou vakcinu, která může zabránit vážným komplikacím infekce RSV u dětí, dospělých a starších osob v domovech i mladších osob, které se tam pohybují.
Pro rekombinantní podjednotkovou vakcinu nebo usmrcenou vakcinu má primární důležitost adjuvans. Hydroxid hlinitý (alum) je jediné adjuvans, které má v současnosti povolení pro humánní použití. Hydroxid hlinitý má však omezený adjuvantní účinek na humorální odpověď a je známo, že indukuje zejména imunitní odpověď typu Th2 (Byars N. E., Nakano G., & Welch M., a další, Vaccine 1991; 9: 309 318). Bylo však zjištěno, že 3 De-O-acylovaný monofosforyllipid A • 99 · * · · (3D-MPL) v kombinaci s hydroxidem hlinitým zlepšuje humorální odpověď a preferenčně stimuluje imunitu typu Th1. Adjuvans na bázi soli hliníku s 3D-MPL je označováno Alum/3D-MPL.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje vakcinu obsahující:
(a) jeden nebo více polysacharidů Streptococcus pneumoniae buď konjugovaných s proteinem nebo peptidem nebo nekonjugovaných; a (b) antigen RSV v kombinaci s adjuvans, které je preferenčním stimulátorem odpovědi typu Th1.
Trend směřující ke kombinovaným vakcinám má výhodu v omezení nepohodlí pro příjemce, usnadnění plánování a zajištění úplnosti režimu; současně však existuje riziko snížení účinku vakcíny. Proto by bylo výhodné vyrobit kombinace vakcin, které splňují požadavky obyvatelstva a které navíc vzájemně neinterferují. Dále by bylo výhodné, pokud by kombinace vakcin vedla k synergii s výsledným zlepšením účinnosti jedné nebo obou vakcin, nebo došlo ke zlepšené korelaci ochranných účinků jedné nebo obou vakcin. Tohoto cíle se dosahuje vakcinou podle vynálezu, jejímž velkým přínosem je možnost podávání dětem nebo starším osobám, u kterých může být zvláště vysoké riziko infekce Streptococcus pneumoniae, a/nebo RSV.
Vakcina podle vynálezu popřípadě navíc obsahuje jeden nebo větší počet jiných antigenů jako je antigen viru chřipky. Mezi vakciny proti chřipce dostupné v současnosti patří vakciny založené na úplném inaktivovaném viru, štěpené částicové vakciny a ♦ ♦
• · · · · podjednotkové vakciny. Vakciny proti chřipce všech typů jsou obvykle trivalentní vakciny. Obsahujují antigeny odvozené od dvou kmenů viru chřipky typu A a jednoho kmene chřipky typu B. Standardní dávka 0,5 ml většiny těchto vakcin obsahuje 15 pg hemaglutininové složky každého kmene.
Způsob určení kmenů, které mají být zařazeny do vakciny proti chřipce, je komplexní proces zahrnující spolupráci mezi Světovou zdravotnickou organizací (World Health Organisation), národními zdravodními úřady a výrobci vakcin.
Imunogenicita pneumokokových polysacharidů může být zvýšena jejich chemickou vazbou na proteinové nosiče, a pro ověření tohoto postupu pro zvýšení účinnosti pří prevenci dětského otitis media se provádějí výzkumy klinické účinnosti.
Pro výrobu imunogenních polysacharidových konstruktů existují dvě obecně používané metody konjugace: (1) přímá konjugace uhlohydrátu a proteinu; a (2) nepřímá konjugace uhlohydrátů a proteinu prostřednictvím bifunkčního propojovacího nebo mezerníkového reakčního činidla. Obecně vyžadují jak přímá, tak i nepřímá konjugace chemickou aktivaci uhlohydrátové skupiny před derivatizací, viz např. US 5,651,971 a Dick & Beurret, „Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens“, Conjugate Vaccines, J. M. Cruse & R. E. Lewis (ed.), díl 10, 48 - 114 (1989).
Polysacharid Streptococcus pneumoniae je v prostředku podle vynálezu s výhodou, ale ne nezbytně, v konjugované formě. Nekonjugovaný polysacharid S. pneumonie není vyloučen.
Pokud jsou konjugovány, jsou polysacharidy Streptococcus pneumoniae konjugovány buď s proteinem nebo peptidem.
Polysacharidové antigeny byly konjugovány s řadou T-helperových proteinů. Ty poskytují T-helperové epitopy. Mezi příklady proteinů patří záškrtový toxoid, tetanový toxoid a protein D nebo jeho
lipidovaný derivát lipoprotein D z Heamophilius influenzae B. Mezi vhodné další proteinové nosiče patří protein záškrtu Crm 197 a hlavní nestrukturní protein chřipky NS1 (zvláště aminokyseliny 1 - 81).
Výhodnou složkou vakcíny podle vynálezu, ve které jsou konjugovány polysacharidy Streptococcus pneumoniae, je protein D. Vhodné jsou také fragmenty proteinu D. Protein D se popisuje v EP 0 594 610. Mezi fragmenty vhodné pro použití patří fragmenty obsahující T-helperové epitopy. Konkrétně fragment proteinu D bude s výhodou obsahovat N-koncovou 1/3 proteinu.
Překvapivě bylo dále zjištěno, že kombinace polysacharidů Streptococcus pneumoniae konjugovaného s proteinem D s antigenem RSV v prostředku podle vynálezu neovlivňuje imunitní odpověď na složku proteinu D konjugátu. Protein D je ochranný antigen proti netypovatelné infekci Haemophilus influenzae B (NTHi).
Předkládaný vynález tedy dále poskytuje vakcinu obsahující antigen RSV a alespoň jeden polysacharid Streptoccocus pneumoniae konjugovaný s proteinem D nebo jeho fragmentem, popřípadě spolu s adjuvans jako je adjuvans Th1.
Typicky bude složka Streptococcus pneumoniae ve vakcině podle předkládaného vynálezu obsahovat polysacharidové antigeny (s výhodou konjugované), kde polysacharidy jsou odvozené z alespoň čtyř sérotypů pneumokoků. Tyto čtyři sérotypy s výhodou zahrnují 6B, 14, 19F a 23F. Výhodněji je v prostředku přítomno alespoň 7 sérotypů, například odvozených ze sérotypů 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F a 23F. Nejvýhodněji je v prostředku zahrnuto alespoň 11 sérotypů, například v jednom provedení obsahuje prostředek obalové polysacharidy odvozené ze sérotypů 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F a 23F (s výhodou konjugované). Ve výhodném provedení vynálezu je v prostředku obsaženo alespoň 13 nebo alespoň 15 nebo alespoň 17 polysacharidových antigenů (s výhodou konjugovaných), ačkoli do
- 9 • 4 • 4 4 4 • · · · · · · 4 4 4 rámce vynálezu jsou zahrnuty také další polysacharidové antigeny, například 23-valentní (jako jsou sérotypy 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F a 33F).
Pro vakcinací starších osob (například pro prevenci pneumonie) je výhodné zahrnout do 11-valentního antigenního prostředku popsaného výše sérotypy 8 a 12F (a nejvýhodněji rovněž 15 a 22) za vytvoření 15-valentní vakciny, zatímco u dětí nebo batolat (kterých se více týká zánět středního ucha) se s výhodou přidávají sérotypy 6A a 19A za vytvoření 13-valentní vakciny.
Mezi vhodné antigeny RSV pro zařazení do vakcin podle předkládaného vynálezu patří inaktivovaný virus RSV, jako je chemicky inaktivovaný virus RSV inaktivovaný například formalinem. Inaktivovaný virus může být vyráběn například z oslabeného RSV, který byl oslaben například pasážováním nebo genetickou manipulací, nebo může být produkován z viru RSV standardního typu. Může být použit rekombinantní RSV, který byl upraven metodami genetického inženýrství tak, aby obsahoval antigen obalu z odlišného kmene RSV, například kostru RSV kmen A s proteinem obalu RSV B, popřípadě oslabených.
Mezi vhodné antigeny RSV patří zvláště antigeny odvozené od viru RSV, s výhodou glykoproteiny obalu lidského RSV, jako je protein F nebo G RSV nebo jejich imunogenní fragmenty, jak se popisuje například v US patentu 5,149,650, nebo chimérní polypeptid obsahující alespoň jeden imunogenní fragment jak z RSV proteinů F, tak i G, s výhodou chimérní protein RSV FG popisovaný například v US patentu 5,194,595, s výhodou exprimovaný buňkami CHO.
Antigenem RSV je s výhodou glykoprotein obalu RSV nebo jeho derivát. Antigen je s výhodou odvozen od RSV kmene A. Alternativně může být antigen odvozen od kmene B, nebo může být v prostředku antigen každého z kmenů A a B. Výhodné antigeny jsou zvoleny
- 10 z glykoproteinu F, glykoproteinu G nebo fúzního proteinu FG nebo jejich imunogenních derivátů.
Mezi typické imunogenní deriváty patří deriváty, ve kterých je protein zbaven transmembránové domény, tj. F Atm, G Atm a F Atm GAtm. S výhodou je z proteinu G odstraněna signální sekvence. Výhodné je, jestliže je přítomno alespoň přibližně 50 % nebo alespoň přibližně 80 % (souvislé sekvence) extracelulární domény proteinu F nebo G. Mezi konkrétní příklady patří aminokyseliny 1 až 526 nebo 1 až 489 aminokyselin proteinu F, aminokyseliny 69 až 298 nebo alternativní polohy 97 až 279 proteinu G a fúzní protein F1-526 nebo G69-298· Alternativní fúzní protein obsahuje 1 až 489 aminokyselin z proteinu F následovaných 97 až 279 aminokyselinami proteinu G.
Vakcina RSVIStreptococcus pneumoniae podle vynálezu obsahuje adjuvans, které je preferenčním induktorem odpovědi typu Th1 pro zlepšení pomoci části imunitního systému zprostředkované buňkami.
Imunitní odpověď je vytvářena proti antigenu v průběhu interakce antigenu s buňkami imunitního systému. Získaná imunitní odpověď může být v širokých rysech rozlišována na dvě extrémní kategorie, a to humorální nebo buněčnou imunitní odpověď (tradičně charakterizované protilátkovým, popřípadě buněčně-efektorovým mechanismem ochrany). Tyto kategorie odpovědi byly nazvány odpovědi typu Th1 (odpověď zprostředkovaná buňkami) a odpovědi typu Th2 (humorální odpověď).
Extrémní imunitní odpovědi typu Th1 mohou být charakterizovány vytvářením pro antigen specifických, haplotypově omezených cytotoxických T-lymfocytů, a odpovědí buněk - přirozených zabíječů. U myší jsou odpovědi typu Th1 často charakterizovány vytvářením protilátek subtypu lgG2a, zatímco u lidí odpovídají typu
-11 • · · 4 · 4 4 • 444 4 4 44 4 4 • 4 4 4 4 4
4·4 4444 44 4«4 protilátek lgG1. Imunitní odpovědi Th2 jsou charakterizovány tvorbou široké řady isotypů imunoglobulinů, včetně u myší lgG1, IgA a IgM.
Je třeba vzít v úvahu, že hnací síla, která stojí za vytvořením těchto dvou typů imunitních odpovědí, jsou cytokiny, přičemž jde o řadu identifikovaných proteinových mediátorů, které slouží pro pomoc buňkám imunitního systému a řídí eventuální imunitní odpověď ve smyslu buď Th1 nebo Th2. Vysoké hladiny cytokinů typu Th1 zvýhodňují indukci imunitních odpovědí na daný antigen zprostředkovaných buňkami, zatímco vysoké hladiny cytokinů typu Th2 upředňostňují indukci humorálních imunitních odpovědí na antigen.
Je důležité připomenout, že rozlišení imunitních odpovědí typu Th1 a Th2 není absolutní. Ve skutečnosti bude u jednotlivce docházet k podpoře imunitní odpovědi, kterou je možno popsat jako převážně Th1 nebo převážně Th2. Často je však pohodlné uvažovat rodiny cytokinů z hlediska kategorií popsaných u klonů myších T-buněk CD4 +ve Mosmannem a Coffmanem (Mosmann, T. R. a Coffinan, R. L. (1989) TH1 a TH2 cells: different patterns of lymphokin secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, str. 145 - 173). Tradičně jsou odpovědi typu Th1 spojovány s produkcí cytokinů IFN-γ a IL-2 T-lymfocyty. Další cytokiny, které jsou často přímo spojeny s indukcí imunitních odpovědí typu Th1, nejsou produkovány T-buňkami, například IL-12. Naopak odpovědi typu Th2 jsou spojeny se sekrecí IL-4, IL-5, lL-6, IL-10 a tumorového nekrózního faktoru β (TNF-β).
Je známo, že některá adjuvans pro vakcíny jsou zvláště vhodná pro stimulaci jen jedné z odpovědí cytokinů typu Th1 nebo Th2. Tradičně zahrnují nejlepší indikátory rovnováhy Th1 : Th2 imunitní odpovědi po vakcinaci nebo infekci přímá měření produkce cytokinů Th1 nebo Th2 T-lymfocyty in vitro po restimulaci antigenem, a/nebo
měření poměru lgG1 : lgG2a protilátkových odpovědí specifických pro antigen.
Adjuvans typu Th1 je tedy takové adjuvans, které stimuluje izolované populace T-buněk k produkci vysokých hladin cytokinů typu Th1 při restimulaci antigenem in vitro, a indukuje imunoglobulinové odpovědi specifické pro antigen asociované s isotypem Th1. Vhodné adjuvantní systémy, které podporují převážně odpověď Th1, zahrnují monofosforyllipid A nebo jeho derivát, zvláště 3-de-O-acylovaný monofosforyllipid A, a kombinaci monofosforyllipidu A, s výhodou 3de-O-acylovaného monofosforyllipidu A (3D-MPL) se solí hliníku. Další vhodné adjuvantní systémy se popisují dále.
Tato adjuvans se popisují například v mezinárodní patentové přihlášce No. WO 94/00153 a WO 95/17209.
3D-MPL se popisuje v GB 2220211 (Ribi). Chemicky jde o směs 3-de-O-acylovaného monofosforyllipidu A s 4, 5 nebo 6 acylovanými řetězci, která je dodávána firmou Ribi Immunochem Montana. Výhodná forma 3 De-O-acylovaného monofosforyllipidu A se popisuje v evropském patentu EP 0 689 454 B.
Částice 3D-MPL jsou s výhodou dostatečně malé, aby je bylo možno sterilně filtrovat přes membránu 0,22 pm (jak se popisuje v evropském patentu EP 0 689 454).
3D-MPL bude normálně přítomen v množství 10 pg až 100 pg, s výhodou 25 až 50 pg na dávku, přičemž antigen bude typicky přítomen v množství 2 až 50 pg na dávku.
Další výhodné adjuvans zahrnuje QS21, netoxickou saponinovou frakci čištěnou HPLC odvozenou z kůry Quillaja Saponaria Molina. Tato látka může být popřípadě ve směsi s 3-de-Oacylovaným monofosforyllipidem A (3D-MPL), popřípadě spolu s nosičem.
- 13 Φ Φ φ φφφφ φφφφ φ φ φφ φ φ φ · φ φφφ φφφ φφ φφφ φφφφ φφ φφφ
Způsob výroby QS21 se popisuje (jako QS21) v US patentu No. 5,057,540.
Nereaktogenní adjuvantní formulace obsahující QS21 se popisují ve WO 96/33739. Tyto formulace obsahující QS21 a cholesterol byly při formulaci společní s antigenem podle výzkumů úspěšná stimulační adjuvans Th1. Vákciny, které jsou částí předkládaného vynálezu, mohou tedy obsahovat kombinaci QS21 a cholesterolu.
Mezi další adjuvans, která jsou přednostními stimulátory odpovědi Th 1, patří imunomodulační oligonukleotidy, například nemethylované sekvence CpG, jak se popisuje ve WO 96/02555.
Jako složky adjuvans preferenčně stimulujícího odpověď typu Th1, jako jsou adjuvans popsaná výše, jsou rovněž uvažovány kombinace různých adjuvans stimulujících Th1. Například QS21 (s výhodou také s cholesterolem) může být formulován spolu s 3DMPL. Poměr QS21 : 3D-MPL bude typicky řádově 1 : 10 až 10 : 1; s výhodou 1 : 5 až 5 : 1 a často v podstatě 1:1. Výhodné rozmezí pro optimální synergii je 2,5 : 1 až 1 : 1 3D MPL : QS21.
Ve vakcině podle vynálezu je s výhodou také přítomen nosič. Nosičem může být emulze typu olej ve vodě nebo sůl hliníku.
Výhodná emulze typu olej ve vodě obsahuje metabolizovatelný olej jako je skvalen, alfa-tokoferol a Tween 80. Emulze typu olej ve vodě může navíc obsahovat spán 85 a/nebo lecithin a/nebo trikaprylin.
Ve výhodném provedení se bude do prostředku podle vynálezu pro zvýšení imunogenicity přidávat hydroxid hlinitý (alum) nebo fosforečnan hlinitý.
Ve zvláště výhodném provedení se antigeny ve vakcině podle vynálezu kombinují s 3D-MPL a hydroxidem hlinitým.
- 14 • · · • 00 ·· ··· ···· «0 00·
Pro podávání člověku budou QS21 a 3D-MPL typicky přítomny ve vakcině v množství 1 pg až 200 pg, jako je 10 až 100 pg, s výhodou 10 pg až 50 pg na dávku. Typicky obsahuje emulze typu olej ve vodě od 2 do 10 % skvalenu, od 2 do 10 % alfa-tokoferolu a od 0,3 do 3 % Tweenu 80. Poměr skvalen : alfa-tokoferol je s výhodou roven nebo nižší než 1, protože takto se získá stabilnější emulze. Může být také přítomen spán 85 v koncentraci 1 %. V některých případech může být výhodné, že vakciny podle předkládaného vynálezu dále obsahují stabilizátor.
Netoxické emulze typu olej ve vodě obsahují s výhodou netoxický olej, například skvalan nebo skvalen, emulgátor, například Tween 80 ve vodném nosiči. Vodným nosičem může být například fyziologický roztok s fosfátovým pufrem.
Zvláště silná adjuvantní formulace obsahující QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzi typu olej ve vodě je popsána ve WO 95/17210.
Vakcina podle předkládaného vynálezu bude obsahovat imunoprotektivní množství antigenů a může být připravena běžnými způsoby.
Příprava vakcin se obecně popisuje v publikaci Pharmaceutical Biotechnology, díl 61, Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach, ed. Powell a Newman, Plenům Press, 1995; New Trends and Developments in Vaccines, ed. Voliér a další, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA 1978. Zapouzdřování do liposomů se popisuje například v Fullerton, US patent 4,235,877. Konjugace proteinů k makromolekulám se popisuje například v Likhite, US patent 4,372,945 a Armor a další, US patent 4,474,757.
Množství proteinu v každé dávce vakciny se volí jako množství, které indukuje v typických vakcinách imunoprotektivní odpověď bez významných nepříznivých vedlejších účinků. Toto množství se bude lišit v závislosti na konkrétním použitém imunogenu. Obecně se
- 15 • 44 9 «4 44 4 •4 · « 444 4 4 «44
444 4 4444 • 4444 4 4·· 4 4 • 4 4 4 4 4 4 >44 44 444 4444 44 49# očekává, že každá dávka bude obsahovat 1 až 1000 mg proteinu, s výhodou 2 až 100 mg, nejvýhodněji 4 až 40 mg. Optimální množství v určité vakcině se bude zjišťovat standardními studiemi zahrnujícími pozorování titrů protilátek a dalších odpovědí u pacientů. Po počáteční vakcinací mohou pacienti dostat zesilující dávku po přibližně čtyřech týdnech. Zvláště u dětí mohou být výhodné tři dávky.
Navíc k vakcinací osob vnímavých k infekcím Streptococcus pneumoniae nebo RSV mohou být farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu použity pro imunoterapeutické léčení pacientů trpících těmito infekcemi.
V dalším provedení předkládaného vynálezu se poskytuje způsob výroby vakciny popisované výše, kde tento způsob zahrnuje míšení antigenu Streptococcous pneumoniae a antigenu RSV s adjuvans indukujícím odpověď typu Th-1, například 3D-MPL a s výhodou nosičem, například hydroxidem hlinitým.
V případě potřeby mohou být přidány další antigeny jakýmkoli běžným způsobem pro získání multivalentních vakcin popisovaných v předkládaném vynálezu.
Vynález dále poskytuje způsob výroby vakciny, který zahrnuje míšení polysacharidu Streptococcus pneumoniae konjugovaného s proteinem D, s antigenem RSV a farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou.
V následujících příkladech bylo prováděno vyhodnocení účinku kombinace možného kandidáta na vakcinu proti RSV, FG, s komerčně dostupnou 23-valentní vakcinou proti pneumokokům (Pneumune firmy Wyeth-Lederle) na myším modelu. Tento model testoval kombinovanou imunizaci, kde se vakciny fyzicky míchají a vstřikují do stejného místa. Výsledky této studie ukazují vzájemnou synergii vedoucí ke zlepšeným odpovědím pro některé imunologické markéry obou vakcin.
- 16 • ΦΦ 9 »9 ΦΦ Φ
ΦΦ· · ΦΦΦ φ · «ΦΦ * Φ » · ΦΦΦΦ
Φ ΦΦΦΦ Φ ΦΦΦΦ Φ
Φ Φ Φ Φ ΦΦΦ
ΦΦΦ ·Φ ΦΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ φφ«
Tyto příklady dále ukazují kombinovanou vakcinu s možným kandidátem na vakcinu proti RSV a 11-valentní konjugovanou vakcinou proti pneumokokům na myším modelu. Tato studie ukazuje, že pro většinu imunologických markérů nedochází k interferenci nebo dochází pouze k malé interferenci mezi antigeny, ale pro některé imunologické markéry dochází ke zlepšené odpovědi, a proto synergickému účinku. Důležité je, že nedochází k žádnému snížení imunitní odpovědi na složku proteinu D konjugovaného pneumokokového polysacharidů.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Vyhodnocení kombinované vakciny proti RSV + 23-valentní vakcíny proti pneumokokům
1. Způsob sestavení vakciny
Antigen FG zředěný H2O (2 pg : 1/10 HD) byl adsorbován 15 min na 50 pg AI(OH)3. Při použití bylo do tohoto preparátu přidáno 5 pg 3D-MPL ve formě suspenze s velikostí částic 100 nm a směs byla inkubována 30 min. Prostředky byly potom smíseny s desetinásobně koncentrovaným PBS pH 7,4 pro dosažení pufračních účinků. Při použití byla přidána 15 min po přidání pufračního roztoku 23-valentní vakcina proti pneumokokům (11,5 pg : 1/50 HD). Pro skupiny bez přidaného FG byl zachován stejný postup, takže 3D-MPL byl nejprve adsorbován na AI(OH)3 bez přidání 23-valentní vakciny proti pneumokokům. 15 min po přidání koncentrovaného pufru nebo 23valentní pneumokokové vakciny byl přidán fenoxyethanol (5 mg/ml) jako ochranná látka.
* 4· | 4 ·· | 44 4 |
44 4 · | 44 4 4 | 4 4 44 |
4 4 4 | 4 4 | • 4 4 |
• ··· · | • 4 | r · · 4 |
4 4 | 4 4 | 4 4 4 |
444 44 | 444 4444 | 44 44 |
Všechny inkubace byly prováděny při teplotě laboratoře za míchání. Formulace byly připravovány současně pro dvě injekce se sedmidenním zráním hotových prostředků před první injekcí.
Složení jednotlivých složek vakcin:
Složka | Číslo šarže | Koncentrace (Mg/ml) | Pufr |
FG | 54/023 | 265 | 10 PO4, 150 NaCl pH 6,8 |
AI(OH)3 | 96A0089 | 10380 | h2o |
23-valentní | Pneumune | 1150 | fyziol. roztok |
3D-MPL | 109 | 964 | h2o |
Imunizační protokol
Jedenáct skupin po 10 myších bylo různými způsoby imunizováno (50 μΙ) ve dnech 0 a 28 různými prostředky (viz tabulka 1). Skupiny 7 a 8 byly imunizovány živým RSV intranazálním způsobem (60 μΙ). Séra byla odebírána ve dnech 28 (28 dní po první imunizaci) a 42 (14 dní po druhé imunizaci). V den 42 byly odebrány vzorky sleziny a lymfatických uzlin od pěti myší ze skupin 4, 5, 6, 7, 8, 9, stejně jako od pěti intaktních myší Balb/c (skupina 1, neimunizována).
3. Humorální odpověď
3.1 Protilátky anti-FG
Všechny výsledky humorální aktivity byly získávány pro 10 myší ve skupině (jednotlivé odpovědi na titry anti-FG a spojená séra pro profil isotypů) a výsledky buněčné aktivity byly předkládány pro pět myší ve skupině.
• ·· | • · · | • · · | ||
• · · | • · | • | • | |
• · · · · | • · | • · | • | |
• · | • · | • | • | |
• · · · · | • · · · · · · | • · | • · |
Jednotlivá séra byla získávána 28 dnů po první imunizaci a 14 dnů po druhé imunizaci a byla testována na přítomnost protilátek Ig specifických pro FG a distribuci isotypů Ig (lgG2a, lgG1).
Protokol testu byl následující: potahování přes noc při 4 °C 50 pl purifikovaného FG 54/023 (1 pg/ml) na jamku, saturace 1 hod při 37 °C, inkubace se sérem 1,50 hod při 37 °C, inkubace s konjugátem antimyší Ig-biotin 1/1500 (nebo lgG1, lgG2a biotin 171000) 1,5 hod při 37 °C, inkubace se strepta-peroxidázou 1/2500 30 min při 37 °C, inkubace s OPDA Sigma 15 min při teplotě laboratoře, ukončení reakce H2SO4 2N.
OD byla monitorována při 490 nm a titry byly zjišťovány programem Softmaxpro (čtyřparametrická rovnice) vzhledem ke standardní křivce a vyjádřeny v EU/ml.
Jednotlivá séra získaná 14 dnů po druhé imunizaci byla testována na přítomnost neutralizačních protilátek použitím následujícího protokolu: 50 pl sériových dvojnásobných ředění séra (první ředění 1/25) bylo inkubováno 1 hod při 37 °C s 50 pl směsi obsahující 300 pfu RSV A/Long (šarže 14) a komplement morčete (ředění 1/25) v 96-jamkové destičce při použití dvojnásobného opakování. Potom bylo do každé jamky přidáno 100 pl suspenze buněk HEp-2 při koncentraci 105 buněk/ml a destičky byly inkubovány 4 dny při 37 °C v přítomnosti 5% CO2.
Supernatanty byly potom odsáty a po přidání 100 pl preparátu WST-1 (ředění 1/12,5) byly destičky dále inkubovány 24 hod při 37 °C v přítomnosti 5% CO2. OD byla monitorována při 595 nm a titry byly určovány metodou lineární regrese (y = a.logx + b): titer je ředění séra, které poskytne 50% snížení maximální OD pozorované u neinfikovaných buněk.
- 19 Kontroly v testu zahrnovaly spojená náhodně vybraná lidská séra (Human pool) a Sandoglobuline (šarže 069, obecný lidský IgG vyráběný firmou Sandoz).
3.2 IgG proti pneumokokovému polysacharidu
Hladiny myších IgG proti pneumokokovým polysacharidům typů 6B, 14, 19F a 23F byly měřeny metodou ELISA upravenou na základě protokolu CDC. Tento protokol zahrnuje přidání rozpustného polysacharidu buněčné stěny (CPS) do séra pro inhibici měření protilátek proti CPS. CPS je kyselina teichoová obsahující fosforylcholin, běžná u všech pneumokoků. Je přítomný pod obalem a protilátky proti ní mají pouze slabé ochranné účinky. Protože CPS je navázán na polysacharid pouzdra, obvykle se nachází 0,5 až 1% koncentrace CPS jako kontaminace v čištěném polysacharidu pouzdra používaném pro potahování destiček ELISA. Měření protilátek proti CPS může tedy pokazit interpretaci výsledků ELISA týkajících se polysacharidu pouzdra.
Metoda ELISA byla prováděna s polysacharidy potahovanými při koncentracích 20, 5, 10 a 20 pg/ml v karbonátovém pufru pro typy 6B, 14, 19F, popřípadě 23F. Séra byla předem smísena s ekvivalentem 500 pg/ml CPS v nezředěných sérech a inkubována 30 min před přidáním na destičku ELISA. Myší IgG byl detekován kozím anti-myším IgG (H+L) konjugovaným s peroxidázou Jackson ImmunoLab při ředění 1 : 2000. Titrační křivky jsou vztaženy na myší monoklonální protilátky specifické pro polysacharid známých koncentrací pro každý sérotyp použitím logistického logaritmického porovnání softwarem SoftMax Pro. jako monoklonální protilátky byly použity HASP4, PS14/4, PS19/5 a PS23/22 pro typy 6B, 14, 19F, popřípadě 23F. Pro omezené dostupné množství sér byla testována spojená séra, takže nejsou k dispozici statistické analýzy.
- 20 4. Buněčná odpověď
Čtrnáct dnů po druhé imunizaci byly izolovány buňky sleziny a lymfatických uzlin ze skupin 4 až 9 a z neimunizovaných myší (skupina 1) jako negativní kontroly pro analýzu buněčné odpovědi specifické pro FG. Vzorky byly analyzovány jak na FG-specifickou lymfoproliferaci, tak i na sekreci cytokinů (IFN-γ + IL-5).
Proliferace byla vyhodnocována po 96 hodinové inkubaci 4 x 105 buněk/jamku 96-jamkových destiček s 200 pl média obsahujícího 10 až 0,03 pg/ml FG (trojnásobná ředění). Po inkorporaci 3H-thymidinu byla měřena proliferace specifická pro FG pomocí standardního protokolu. Indukce cytokinů byla testována po 96 hodinové inkubaci 2,5 x 106 buněk/jamku 24-jamkové destičky s 1 ml média obsahujícího 10 pg až 0,01 pg FG (desetinásobná ředění). Potom byly supernatanty sklizeny pro stanovení množství indukovaných IFN-γ a IL-5 metodou ELISA podle standardního protokolu.
1. Skupiny skupin dostalo dvě imunizace různými prostředky obsahujícími buď 23-valentní vakcinu nebo FG nebo kombinaci obou formulovaných s hydroxidem hlinitým a 3D-MPL nebo hydroxidem hlinitým. Skupina 1 tvoří kontrolu pro studie CMI. Skupiny 2 a 9 umožní vyhodnocení imunogenicity 23-valentní vakcíny proti pneumokokům po intraperitoneální imunizaci, která byla pro hodnocení 23-valentní vakcíny proti pneumokokům používána v literatuře, a po imunizaci i.m. umožní skupiny 3 a 10 paralelní analýzu se skupinami 2 a 9 s tím rozdílem, že 23-valentní vakcina proti pneumokokům se formuluje se směsí hydroxid hlinitý/3D-MPL. Skupiny 2 a 3 také tvoří kontroly pro vliv adjuvans hydroxid hlinitý/3D-MPL na 23-valentní vakcinu proti pneumokokům, pokud se nekombinuje s FG
-21 hydroxid hlinitý/3D-MPL. Skupina 4 umožní vyhodnocení imunitní odpovědi indukované po i.m. imunizaci kombinace 23-valentní vakciny proti pneumokokům a FG hydroxid hlinitý/3D-MPL. Skupiny 5 a 6 tvoří kontrolu pro vyhodnocení vlivu adjuvans hydroxid hlinitý/3D-MPL na FG, jestliže se nepoužije kombinace s 23-valentní vakcinou proti pneumokokům. Imunizace živým RSV byla použita jako kontrola pro imunitní odpověď indukovanou po přirozené infekci RSV i.n. (skupina 7). Konečně, skupina 9 je kontrola pro vliv samotného hydroxidu hlinitého/3D-MPL. 2 *
Tabulka 1
Skupiny | Antigen | Adjuvans | Způsob podání |
1 | žádný | žádné | |
2 | 23-valentní Pneumune (11,5 pg) | žádné | i.m. |
3 | 23-valentní Pneumune (11,5 pg) | AI(OH)3/3D-MPL | i.m. |
4 | 23-valentní Pneumune (11,5 pg)/FG (2 pg) | AI(OH)3/3D-MPL | i.m. |
5 | FG (2 pg) | AI(OH)3/3D-MPL | i.m. |
6 | FG (2 pg) | Aí(OH)3 | i.m. |
7 | živý RSV (šarže 14: 105 PFU) | žádné | i.m. |
8 | žádný | AI(OH)3/3D-MPL | i.m. |
9 | 23-valentní Pneumune (11,5 pg) | žádné | i.p. |
10 | 23-valentní Pneumune (11,5 pg) | AI(OH)3/3D-MPL | i.p. |
2. Humorální odpověď
2.1. Protilátky anti-FG
Analýza specifických protilátek proti FG 28 dnů po první imunizaci a 14 dnů po druhé imunizaci ukazuje indukci podobných
-22 ·· ··
odpovědí protilátek po imunizaci materiálem FG hydroxid hlinitý/3DMPL/23-valentní (skupina 4) nebo FG hydroxid hlinitý/3D-MPL samostatně (skupina 5) s mírně vyššími titry pozorovanými pro materiál FG hydroxid hlinitý/3D-MPL/23-valentní vakcina (obr. 1). Imunizace směsí FG hydroxid hlinitý (skupina 6) indukuje podle očekávání nižší titry protilátek v obou časech. Statistická analýza ukazuje, že existuje významný rozdíl mezi titry anti-FG Ig indukovanými ve skupinách 4 až 6 28 dnů po první imunizaci a 14 dnů po druhé imunizaci.
Výsledky
Analýza neutralizačních protilátek proti RSVA (obr. 2) ukazuje souhlasný profil jako při pozorování odpovědí Ig proti FG.
» Na základě těchto výsledků byl vypočten poměr neutralizačních protilátek anti-FG/anti-RSV (28 dnů po druhé imunizaci), přičemž bylo ukázáno, že poměr FG hydroxid hlinitý/3D-MPL/23-valentní vakcina, FG hydroxid hlinitý/3D-MPL a FG hydroxid hlinitý odpovídá poměru indukovanému ve skupině RSV i.n. (tabulka 2).
ί • ·
Tabulka 2
Titry protilátek (GMT) | 28 po první imunizaci 14 dnů po druhé imunizaci | Poměr EUSA/Neutra | v- t~ OJ CN v- 05 CN |
RSV-A Neutra | σ> O CO h- £ oo co r- tn Ν’ CN 1 | ||
Anti FG ELISA Ig | t σ> co σ> ° S £ 7 5 Í2 š | ||
Poměr ELISA/Neutra I | o m to o t- t-t- CM | ||
RSV-A Neutra | CN 1. 1· u-, cn oo T- CO t-t- ™ | ||
Anti FG ELISA Ig | co CO T- n CO T- CN X oo r-~ r-~ fť CO CN T- | ||
Skupina (#) | τφ lq co r- | ||
Kandidát na vakcinu | GG SB AS4/23- valentní FG SB AS4 FG hydroxid hlinitý Živý RSV |
-24 Jak ukázala podrobná statistická analýza titrů jednotlivých isotypů anti-FG lg, lgG1 a lgG2a, přídavek 23-valentní vakciny k materiálu FG hydroxid hlinitý/3D-MPL zachovává odpovědi lg a igG1 a významně zvyšuje odpovědi lgG2a (obr. 3A). navíc tato analýza ukázala, že poměr lgG1/lgG2a a titr lgG1 u směsi FG hydroxid hlinitý/3D- MPL/23-valentní a FG hydroxid hlinitý/3D-MPL byly podobné, i když významně odlišné od poměrů získaných s materiálem FG hydroxid hlinitý (obr. 3B). U těchto tří formulací byly zjištěny významné rozdíly v titrech lgG2a.
2,2 IgG proti pneumokokovému polysacharidů
Zatímco myši a další hlodavci mohou produkovat IgM proti polysacharidovým imunogenům, za normálních okolností neprodukují IgG proti polysacharidům. Je tomu tak proto, že jejich imunitní systém postrádá signály pro indukci přepnutí isotypů na T-independentní antigen jako je polysacharid. Měření IgG proti polysacharidům u myší je tedy citlivým testem pro indukci zlepšené T-independentní imunitní odpovědi.
Koncentrace IgG indukovaných proti čtyřem z 23 polysacharidů jsou ukázány v tabulce 3. Jak autoři vynálezu zjistili v jiných experimentech, žádný IgG nebyl produkován proti typům polysacharidů 6B a 23F. Byly však zjištěny měřitelné koncentrace IgG proti typům 14 a 19F.
Skupiny, které neobsahovaly 23-valentní vakcinu, neukázaly detekovatelné hladiny IgG proti polysacharidům 14 a 19F, což potvrzuje specificitu měření.
Porovnání způsobu imunizace ukazuje, že jestliže se u 23valentní vakciny použije jako adjuvans hydroxid hlinitý/3D-MPL, intramuskulární způsob imunizace se jeví jako lepší než
interperitoneální pro typ 19F, zatímco pro typ 14 je tomu opačně. S čistou 23-valentní vakcinou se neukazují podstatné rozdíly.
Směs 23-valentní + hydroxid hlinitý/3D-MPL indukuje vyšší hladiny IgG pro typy 14 a 19F jak při i.m., tak i i.p. imunizacích, v porovnání se samostatnou 23-valentní vakcinou. Jestliže se však provede kombinace s FG, dojde ke snížení odpovědi IgG. Odpověď IgG proti 19F v případě směsi 23-valentní + FG/ hydroxid hlinitý/3DMPL je však stále vyšší než odpověď indukovaná samotnou 23valentní vakcinou (srovnej skupiny 3 a 4), a odpověď na typ 14 je io zlepšená.
ω
C\l
CO
CU =s .Ω ra l·— sk o
o
E
Ό
Φ
C
Q i
>
X
Σ5
O c
Ό ra >
O c
ra >
o c
XI E o
SK
3Σ.
O >
c
Φ >u.
O >
>
>
E ~S
O σ
o >(/>
>
E >
c
TJ ro
X
Skupina 10 | Q. | 23-valentní | co íl < | <1.2 | CM T“ | CO | v |
CD | c | ||||||
·♦—< | |||||||
cn | c | CN T“ | |||||
pin | Q. | o co | CN o | co | T“ v | ||
=3 | *“ | > | v | ||||
23- | |||||||
co | |||||||
oo | co | ||||||
CO | _l | X | CN | CN | |||
Q. =5 | E | 0. 2 | o 'S-Z | T“ v | O v | <1, | v |
< | |||||||
co | |||||||
<o | co | ||||||
upina | i.m. | O u. | (HO)l | CN v | <0,04 | <1,2 | v |
< | |||||||
co | |||||||
UJ | _í | CO | |||||
pina | É | 0- Σ | (HO | CM 5Γ | 0,04 | CM_ | v |
□ | — | 0 | V | v | V | ||
u_ | < | ||||||
co | |||||||
upina 4 | i.m. | c H—> c <D co > | _1 co 2 O O | <1.2 | 0,2 | CO cm | V“ V |
O) | CO | LL· < | |||||
CN | |||||||
co | Έ | ||||||
-♦—< | co | ||||||
upina | i.m. | c o co > | (HO)I IdlAl | <1.2 | 0,6 | oo co | T“ V |
ω | 23- | < | |||||
CN | 'c | ||||||
CO | c | CN | |||||
c | cu | V- | |||||
Q. | co | o | V | ||||
Ξ3 | > | v | |||||
23- | |||||||
ω | |||||||
V“ | |||||||
ina | CN | 04 | CN | ||||
idn | 7 | <0, | v | v | |||
co | |||||||
ω to | 9F | LL co | |||||
PSI | PS | PS1 | PS2 | ||||
·— | Μ—l | ·— | |||||
c | c | c | |||||
< | < | < | < |
• φ » φ
I · φφφ
- 27 3. Buněčná odpověď
Indukovaná FG-specifická lymfoproliferace neukázala jakýkoli rozdíl mezi FG hydroxid hlinitý/3D-MPL ± 23-valentní a FG hydroxid hlinitý, a to ani v buňkách sleziny, ani v buňkách lymfatických uzlin.
Analýza produkce IL-5 a IFN-γ ukazuje, že směs 23-valentní vakciny s FG hydroxid hlinitý/3D-MPL nepotlačuje produkci IFN-γ, ale mohla by poněkud zvýšit produkci IL-5 (obr. 4). Toto pozorování je potvrzeno 2 až 8 násobným rozdílem v poměru IFN-y/IL-5 pozorovaným při dvou dávkách FG (10 a 1 pg FG/ml) použitých pro io restimulaci in vitro. Kombinace FG hydroxid hlinitý/3D-MPL/23-valentní vakcína však stále indukuje mnohem vyšší poměr IFN-y/IL-5 než materiál FG hydroxid hlinitý.
Závěry
Analýza titrů indukovaných Ig specifických pro FG a neutralizačních protilátek proti RSVA ukazuje, že kombinace FG hydroxid hlinitý/3D-MPL s 23-valentní vakcinou proti pneumokokům nesnižuje indukci odpovědi pozorované se samotným FG hydroxid hlinitý/3D-MPL. Jakost této odpovědi měřená poměrem neutralizačních protilátek anti-FG/anti-RSVA, zůstává také nezměněná a blízká poměru pozorovanému po přirozené infekci RSV i.n. cestou.
Analýza indukovaných buněčných odpovědí specifických pro FG ukazuje, že přídavek 23-valentní vakciny k FG hydroxid hIinitý/3D-MPL neovlivňuje indukci lymfoproiiferace ani u buněk sleziny, ani u buněk lymfatických uzlin. Navíc není indukce odpovědi typu Th1 pozorovaná typicky u materiálu FG hydroxid hlinitý/3D-MPL tlumena přídavkem 23valentní vakciny, jak se zjišťuje na základě produkce cytokinů in vitro v buňkách sleziny a lymfatických uzlin specifických pro FG a při analýze distribuce isotypů protilátek specifických pro FG se jeví jako
zvýšená. Produkce IFN-γ, markéru odpovědi Th1, zůstává ovšem po přidání 23-valentní vakciny k materiálu FG hydroxid hlinitý/3D-MPL nezměněná, zatímco produkce IL-5, markéru odpovědi Th2, je pouze mírně zvýšená. Je zajímavé, že přidání 23-valentní vakciny k materiálu FG hydroxid hlinitý/3D-MPL, podstatně zvyšuje produkci protilátek lgG2a, markéru odpovědi Th1, zatímco neovlivňuje produkci lgG1 (markér odpovědi Th2) ani poměr odpovědí lgG1/lgG2a.
Kombinace FG hydroxid hlinitý/3D-MPL a 23-valentní vakciny tedy neovlivňuje odpověď pozorovanou u materiálu FG hydroxid hlinitý/3D-MPL, a proto jsou výhody spojené s formulací FG hydroxid hlinitý/3D-MPL proti formulaci FG hydroxid hlinitý, tj. indukce vysokých odpovědí primárních a sekundárních neutralizačních protilátek a odpovědi Th1 při měření na základě přítomnosti protilátek lgG2a a indukce vysokých hladin IFN-γ, zachovány.
Kombinace 23-valentní vakciny Pneumune s materiálem FG hydroxid hlinitý/3D-MPL vede ke zvýšení produkce IgG u dvou ze čtyř testovaných polysacharidů, ale v největší míře pro typ 19F. Samotná 23-valentní vakcina s materiálem hydroxid hlinitý/3D-MPL poskytla nejvyšší koncentrace IgG. Závěrem je možno uvést, že existuje výhodná kombinace 23-valentní vakciny proti pneumokokům s RSV FG hydroxid hlinitý/3D-MPL, ve které dochází k synergickému účinku pro obě vakciny v tom, že obě vakciny ukazují zlepšení některých imunologických testů, přičemž v žádných testech nedochází k inhibici.
Příklad 2
Vyhodnocení kombinace RSV + 11-valentní konjugovaná vakcina proti pneumokokům
Kombinovaná vakcina byla vyhodnocována buď pro 3D-MPL + hydroxid hlinitý, 3D-MPL + QS21 v liposomech s obsahem
cholesterolu, nebo oligonukleotidy obsahující CpG (s nebo bez hydroxidu hlinitého).
Byl vyhodnocován také dopad kombinované vakciny na imunitní odpověď IgG na nosič protein D (PD).
PD je ochranný antigen proti infekci netypovatelným
Haemophilus influenzae B (NTHi). Proto by mohla kombinace pneumokokového PS konjugovaného s PD a FG poskytnout účinnou ochranu proti třem patogenům: S. pneumoniae, RSV a netypovatelný Haemophilus influenzae B. Ochrany proti NTHi se patrně účastní imunita typu Th1. Proto byly také testovány protilátky lgG2a proti PD, které jsou dobrým indikátorem odpovědi Th1.
11-valentní testovaná vakcina používaná v tomto příkladu obsahuje sérotypy kapsulárních polysacharidů 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F a 23F, které byly připraveny v podstatě podle popisu v EP 72513. Každý polysacharid se aktivuje a derivatizuje použitím chemických reakcí CDAP (WO 95/08348) a konjuguje se s proteinovým nosičem. Všechny tyto poiysacharidy jsou konjugovány ve své nativní formě kromě sérotypu 3 (u kterého byla snížena velikost pro snížení jeho viskozity).
Proteinový nosič byl rekombinantní protein protein D (PD) z netypovatelného Haemophilus influenzae, exprimovaný v E. coli.
1, Postup formulace
Prostředky byly připravovány 12 dnů před první injekcí.
1,1 Prostředky založené na QS21, 3D-MPL
V případě potřeby byly antigeny (FG (2 pg) nebo/a neadsorbované konjugáty PS (0,5 pg/valenci)) ředěny ve směsi
desetkrát koncentrovaného PBS pH 7,4 a H2O. QS21 (5 pg) byl přidáván jako směs s liposomy obsahujícími MPL v hmotnostním poměru QS21/cholesterol 1/5 (označováno jako DQ/3D-MPLin). O 30 min později byl jako ochranná látka přidán 1 pg/ml thiomersalu.
1.2 Prostředky založené na CpG nebo 3D-MPL
V případě potřeby byl AI(OH)3 ředěn H2O před přidáním antigenů (FG (2 pg)) nebo/a neadsorbované konjugáty PS (0,5 pg/valenci)). Po adsorpci v trvání 30 min byl přidán MPL nebo io CpG. O 30 min později byly prostředky pufrovány desetinásobně koncentrovaným PO4-NaCI pH 6,8. Potom byl jako ochranná látka přidán thiomersal v koncentraci 1 mg/ml nebo fenoxy v koncentraci mg/ml.
Všechny inkubace byly prováděny při teplotě místnosti za 15 míchání. Prostředky byly připravovány současně pro dvě injekce se sedmidenním zráním hotových prostředků před první injekcí.
1,3 Složení jednotlivých komponent prostředků:
Složka | Koncentrace AG nebo IMST (pg/ml) | Koncentrace Al3+ (pg/ml) | Pufr |
FG | 484 | PO4/NaCI 10/150 mM pH 6,8 | |
11-valentní vakcína pro klinické použití bez aditiv | |||
PS1 | 133 | NaCl 150 mM pH 6,1 | |
PS3 | 149 | NaCl 150 mM pH 6,1 | |
PS3 | 125 | NaCl 150 mM pH 6,1 | |
PS5 | 135 | NaCl 150 mM pH 6,1 | |
PS6b | 206 | NaCl 150 mM pH 6,1 |
-31 9
9 9 9 • 9 9 99
9 9 9
9 9 9 9
9 9
9 9 9 999
PS7 | 168 | NaCl 150 mM pH 6,1 | |
PS9 | 175 | NaCl 150 mM pH 6,1 | |
PS14 | 180 | NaCl 150 mM pH 6,1 | |
PS18 | 127 | NaCl 150 mM pH 6,1 | |
PS19 | 140 | NaCl 150 mM pH 6,1 | |
PS23 | 158 | NaCl 150 mM pH 6,1 | |
QS21 | 2000 | h2o | |
MPL | 1019 | h2o | |
CpG | 5000 | h2o | |
SUV | DOPC 40000 Chol 10000 MPL 2000 | PBS pH 7,4 | |
aipo4 | 1000 | NaCl 150 mM pH 6,1 | |
AI(OH)3 | 10380 | H2O |
2. Protokol imunizace skupin po 10 myších bylo imunizováno i.m. (50 pl) ve dnech 0 a 28 různými prostředky (viz část Výsledky). Séra byla získána 5 v den 42 (14 dnů po druhé imunizaci). V den 42 byly odebírány buňky sleziny od 5 myší ze skupin imunizovaných antigenem FG a od 5 neimunizovaných myší Balb/c.
3. Humorální odpověď io 3.1 Protilátky proti FG
Všechny výsledky humorální odpovědi byly získány pro 10 myší ve skupině (jednotlivé odpovědi pro anti-FG Ig, lgG1 a lgG2a a neutralizační titry) a výsledky buněčné odpovědi byly získány souhrnně pro 5 myší ve skupině.
·· · ·· ··
- 32 • ♦ · · · · · • · · · ♦ · ·«· · • * · · · · • · · ·· ······· · ·
Jednotlivá séra byla odebírána 14/15 dnů po druhé imunizaci a byla testována na přítomnost protilátek Ig specifických pro FG a distribuci jejich sérotypů (lgG2a, lgG1). Protokol testu byl následující. Potahování přes noc při 4 °C 50 pl čištěného FG
DFGP107 (1 pg/ml) na jamku, saturace 1 hod při 37 °C, inkubace se séry 1,50 hod při 37 °C, inkubace s konjugátem antimyší Ig-biotin 1/1500 (nebo lgG1, lgG2a-biotin 1/1000) 1,50 hod při 37 °C, inkubace se streptaperoxidázou 1/1500 30 min při 37 °C, inkubace s OPDA Sigma 20 min při teplotě laboratoře, ukončení 2N H2SO4.
io OD byla monitorována při 490 nm a titry byly určovány pomocí softwaru Softmaxpro (čtyřparametrická rovnice) vzhledem ke standardní křivce a vyjádřeny v EU/ml.
Jednotlivá séra získaná 14 dnů po druhé imunizaci byla testována na přítomnost neutralizačních protilátek s použitím následujícího protokolu. 50 μΙ sériových dvojnásobných ředění sér (první ředění 1/25) bylo inkubováno 1 hod při 37 °C s 50 μΙ směsi obsahující 3000 pfu RSV-A/Long (šarže 14) a komplementu morčat (ředění 1/25) v 96-jamkové destičce při dvojnásobném opakování. Potom bylo do každé jamky přidáno 100 μΙ suspenze buněk HEp-2 s koncentrací 105 buněk/ml a destičky byly inkubovány 4 dny při 37 °C v přítomnosti 5% CO2.
Supernatanty byly potom odsáty a po přidání 100 μΙ preparátu WST-1 (ředění 1/15) byly destičky dále inkubovány 24 hod při 37 °C v přítomnosti 5% CO2. OD byla monitorována při 490 nm a titry byly zjišťovány metodou lineární regrese (y = a.logx + b): titr = ředění séra, které poskytne 50% snížení maximální OD pozorované u neinfikovaných buněk.
-33 • ·· · ·· ·· ·
9 9 999 9 · 9 9·
9 9 9 9 9 9 9 • ♦ 9 9 9 · ··· · · • · · · 9 9 9
999 99 999 9999 99 ·99
3.2 IgG proti pneumokokovým polysacharidům
Myší IgG proti pneumokokovým polysacharidům typů 3, 6B, 7F, 14, 19F a 23F byl měřen metodou ELISA upravenou pro protokol CDC. Tento protokol zahrnuje přídavek rozpustného polysacharidů buněčné stěny (CPS) k séru pro inhibicí měření protilátek CPS. CPS je kyselina teichoová s obsahem fosforylcholinu běžná pro všechny pneumokoky. Je přítomná pod obalem a protilátky proti ní mají pouze slabé ochranné účinky. Protože CPS je navázán na polysacharid obalu, čištěný polysacharid obalu použitý pro potahování destiček ELISA je io obvykle kontaminován 0,5 až 1% CPS. Měření protilátek proti CPS může tedy ovlivnit interpretaci výsledků ELISA týkajících se polysacharidů obalu.
Metoda ELISA byla prováděna s polysacharidy potahovanými při koncentracích 20, 5, 5, 20 a 20 pg/ml v pufru PBS pro typy 6B, 7F, 14,
19F, popřípadě 23F. Tato séra byla předem smíchána s ekvivalentem
500 pg/ml CPS v neředěném séru a inkubována 30 min před přidáním na destičku ELISA. Myší IgG byl detekován konjugátem kozí protilátky proti myšímu IgG (H+L) s peroxidázou firmy Jackson ImmunoLab v ředění 1 : 5000. Titrační křivky byly vztaženy na myší monoklonální protilátky specifické pro polysacharid, známých koncentrací pro každý sérotyp, s použitím logistického logaritmického porovnání softwarem SoftMax Pro. Jako monoklonální protilátky byly použity HASP4, PS7/19, PS14/4, PS19/5 a PS23/22 pro typy 6B, 7F, 14, 19F, popřípadě 23F.
Pro sérotyp 3 byla prováděna podobná analýza ELISA s tím rozdílem, že imunologické destičky byly nejprve potaženy methylovaným lidským sérovým albuminem (1 pg/ml v PBS, 2 hod, 37 °C) s cílem zlepšit potažení PS3 (2,5 pg/ml v PBS, přes noc, 4 °C). Jako standardní referenční hodnota byla použita monoklonální protilátka PS3/6.
·· • · • ·
- 34 3.3 Dávkování sérového IgG proti PD metodou ELISA
Imunologické destičky Maxisorp Nunc byly potahovány při 37 °C 2 hod 100 μΙ/jamku 2 pg/ml antigenu PD zředěného v PBS (v řadách B až H destičky), nebo 100 pl 1 pg/ml čištěné kozí protilátky proti myšímu Ig (Jackson), v PBS (řada A). Potom byla přidána sériová dvojnásobná ředění (v PBS Tween-20 0,05% pufr, 100 pl na jamku) čistého myšího IgG (Jackson) jako standardní křivka (počáteční koncentrace 1 pg/ml v řadě A) a vzorky séra (počáteční ředění 1/20 io v řadách B až H) byly inkubovány přes noc při 4 °C. Potom byla inkubována kozí protilátka proti myšímu IgG, konjugovaná s peroxidázou (Jackson), zředěná 1/5000 v PBS Tween-20 0,05% pufru (100 pl/jamku) 30 min při 20 °C za míchání. Po několika promytích byly destičky inkubovány 15 min při teplotě laboratoře v temnu se 100 μΙ/jamku vyvíjecího pufru (OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) a H2O2 0,05 % ve 100mM pH 4,5 citrátového pufru). Vyvíjení bylo zastaveno přidáním 50 μΙ/jamku HCl 1N. Optické hustoty byly odečítány při 490 a 620 nm na čtecím zařízení Emax immunoreader (Moíecular Devices). Titry protilátek byly vypočteny čtyřparametrickou matematickou metodou použitím softwaru SoftMaxPro.
3.4 Dávkování sérových lgG1, 2a a 2b proti PD metodou ELISA
Destičky pro imunologii Maxisorp Nunc byly potahovány přes noc při 4 °C 50 pl/jamku 2 pg/ml antigenu PD zředěného v PBS (v řadách B až H destičky) nebo 50 pl 5 pg/ml čištěné kozí protilátky proti myšímu Ig (Boerhinger), v PBS (řada A). Po saturaci destičky PBS Tween-20 0,05% BSA 1% pufr, byla přidána dvojnásobná ředění (v saturačním pufru, 50 pl na jamku) čistých myších monoklonálních protilátek lgG1, lgG2a nebo lgG2b (Sigma) jako standardní křivka
3o (počáteční ředění 200 ng/ml, řada A) a vzorky séra (počáteční ředění
1/20 v saturačním pufru v řadách B až H) byly inkubovány 1 hod při 37 °C za míchání. Po několika promytích pufrem NaCl 0,9% Tween-20 0,05 %, byly inkubovány biotinylované kozí IgG proti myšímu lgG1 nebo proti myšímu lgG2a nebo proti myšímu lgG2b (Amersham) zředěné 1/1000 v saturačním pufru (50 μΙ/jamku) 30 min, při 20 °C za míchání. Po dalším promytí byly destičky inkubovány 30 min při 20 °C za míchání se streptavidinem s konjugovanou peroxidázou (Amersham) v ředění 1/1000 v saturačním pufru (50 μΙ/jamku). Po promytí se provádělo vyvíjení přidáním 50 μΙ/jamku vyvíjecího pufru (OPDA 0,4 mg/ml (Sigma) a H2O2 0,05 % ve 100 mM citrátovém pufru pH 4,5) 20 min při teplotě laboratoře v temnu. Vyvíjení bylo zastaveno přidáním 50 μΙ/jamku HCI 1N. Optické hustoty byly odečítány při 490 a 620 nm použitím odečítacího zařízení Emax immunoreader (Molecular Devices). Titry protilátek byly počítány čtyřparametrickou matematickou metodou použitím softwaru SoftMaxPro.
4, Buněčná odpověď
Buňky sleziny byly izolovány 14 dnů po druhé imunizaci od všech skupin imunizovaných FG a od neimunizovaných myší jako negativní kontroly pro analýzu buněčné odpovědi specifické pro FG. Vzorky byly analyzovány jak na FG-specifickou lymfoproliferaci, tak i na sekreci cytokinů (IFN-γ + IL-5).
Proliferace byla vyhodnocována po 96 hodinové inkubaci 4 x 104 5 buněk/jamku 96-jamkových destiček s 200 μΙ média obsahujícího 10 až 0,03 pg/ml FG (trojnásobná ředění). Po inkorporaci 3H-thymidinu byla měřena proliferace specifická pro FG podle standardního protokolu autorů vynálezu. Indukce cytokinů byla vyhodnocována po 96 hodinové inkubaci 2,5 x 106 buněk na jamku 24-jamkové destičky s 1 ml média obsahujícího 10 pg až 0,01 pg FG (desetinásobná ředění). Potom byly odebrány supernatanty pro stanovení množství
- 36 4 4 44 4 indukovaných IFN-γ a IL-5 metodou ELISA podle standardního protokolu autorů vynálezu.
Výsledky
1. Skupiny skupin bylo imunizováno dvakrát i.m. v odstupu 28 dnů různými prostředky obsahujícími buď 11-valentní konjugovanou vakcinu nebo FG nebo kombinaci obou formulované s materiály hydroxid hlinitý 3D-MPL, CpG, Cpg hydroxid hlinitý nebo hydroxid io hlinitý.
Jsou diskutovány výsledky předkládané v částech 1 až 4. V každé části jsou zahrnuty výsledky pro kombinaci FG hydroxid hlinitý jako kontrola pro indukci specifické imunitní odpovědi proti RSV s adjuvans převážně typu Th2. Jako vnitřní kontrola pro analýzu CMI is specifických pro FG byla také přidána skupina neimunizovaných myší.
Část 1
Skupiny | Antigen | Adjuvans | Způsob podání |
A | PS-PD (0,5 pg) | AI(OH)3 3D-MPL | i.m. |
B | FG (2pg) | AI(OH)3 3D-MPL | i.m. |
C | PS-PD (0,5 pg)+FG (2 pg) | AI(OH)3 3D-MPL | i.m. |
D | FG (2 pg) | AI(OH)3 | i.m. |
E | žádný | žádné | i.p. |
- 37 • · « ·
Část 2
Skupiny | Antigen | Adjuvans | Způsob podání |
A | PS-PD (0,5 pg) | 3D-MPL+QS21 | i.m. |
B | FG (2pg) | 3D-MPL+QS21 | i.m. |
C | PS-PD (0,5 pg)+FG (2 pg) | 3D-MPL+QS21 | i.m. |
D | FG (2 pg) | AI(OH)3 | i.m. |
E | žádný | žádné | i.p. |
Část 3
Skupiny | Antigen | Adjuvans | Způsob podání |
A | PS-PD (0,5 pg) | CpG (50 pg) | i.m. |
B | FG (2pg) | CpG (50 pg) | i.m. |
C | PS-PD (0,5 pg)+FG (2 pg) | CpG (50 pg) | i.m. |
D | PS-PD (0,5 pg) | CpG (50 pg) AI(OH)3 | i.m. |
E | FG (2 pg) | CpG (50 pg) AI(OH)3 | i.m. |
F | PS-PD (0,5 pg)+FG (2 pg) | CpG (50 pg) AI(OH)3 | i.m. |
G | FG (2 pg) | AI(OH)3 | i.m. |
H | žádný | žádné |
s Část 4
Stejné skupiny jako v části 3.
- 38 0
0 0 • 4· • · 0 · · * · · • 990 9
9
999 00 0
0
0
2. Část 1
2.1 Protilátky proti FG
Podobné hladiny neutralizačních protilátek proti RSVA byly indukovány materiály FG/hydroxid hlinitý/3D-MPL nebo FG/hydroxid 5 hlinitý/3D-MPL v kombinaci s 11-valentním konjugátem PS (obr. 5). Po kombinaci obou vakcin může být ve skutečnosti pozorován mírný synergický účinek pro indukci neutralizačních protilátek proti RSVA.
Analýza titrů jednotlivých isotypů lgG1 a lgG2a proti FG ukázala indukci podobných nebo mírně nižších titrů působením materiálu io FG/hydroxid hlinitý/3D-MPL/11-valentní konjugát PS proti FG/hydroxid hlinitý/3D-MPL (obr. 6).
Analýza poměru isotypů lgG2a k lgG1 ukazuje, že přítomnost obou vakcin nemění poměr isotypů, který zůstává mnohem nižší než poměr indukovaný materiálem FG hydroxid hlinitý, uznávaným adjuvans indukujícím odpověď Th2.
2.2 IgG proti pneumokokovým polysacharidům
Titry IgG proti polysacharidům 3, 6B, 14, 19F a 23F v séru byly měřeny tak jak bylo popsáno v příkladu 1. Podobné odpovědi
2o protilátek byly indukovány po imunizaci materiálem 11-valentní konjugát PS/hydroxid hlinitý/3D-MPL nebo stejnou vakcinou doplněnou antigenem FG (obr. 7). Tento výsledek ukazuje, že kombinace konjugátů pneumokokových PS a antigenů FG RSV s materiálem hydroxid hlinitý 3D-MPL nesnížila nebo nezměnila imunitní odpověď proti pneumokokům.
-39 2.3 Buněčná odpověď specifická pro FG
4 44 | 9 99 | 44 4 | |
• · 4 | • 4 4 4 | • 4 | 44 |
• · · | • · | 4 · | |
• ··· * | • 4 | • 4 4 | |
• 4 | • · | • 4 | |
4* 44 | ··· 444· | • 4 | 44 |
Analýza produkce IL-5 a IFN-γ ukazuje, že směs FG/hydroxid hlinitý/3D-MPL s 11-valentním konjugátem PS poněkud ovlivňuje míru produkce těchto cytokinů (obr. 8). Poměr měřených cytokinů, který je 5 indikátorem profilu Th odpovědi, však není touto směsí ovlivněn a zůstává zcela odlišný od poměru pozorovaného pro formulaci FG hydroxid hlinitý, tj. adjuvans indukující odpověď Th2.
3. Část 2: DQ/3D-MPLin io 3.1 Protilátky proti FG
Podobné hladiny Ig protilátek proti FG byly indukovány materiálem FG DQ/3D-MPLin nebo FG DQ/3D-MPLin v kombinaci s 11-valentním konjugátem PS (obr. 9).
Jak je vidět z analýzy Ig proti FG, nepozoruje se žádná is interference s hladinami neutralizačních protilátek proti RSVA, jestliže se smíchá FG DQ-MPLin s 11-valentním konjugátem PS (obr. 10).
Analýza titrů jednotlivých isotypů lgG1 a lgG2a proti FG ukázala indukci podobných titrů materiálem FG DQ-MP/11-valentní konjugát PS ve srovnání s čistým FG DQ-MP (obr. 11). Analýza poměrů isotypů ukazuje, že kombinace těchto vakcin nemění poměr isotypů, který zůstává mnohem nižší, než poměr indukovaný směsí FG hydroxid hlinitý, uznávaným adjuvans odpovědí typu Th2.
3.2 IgG proti pneumokokovým polysacharidům
Titry IgG proti polysacharidům 3, 6B, 14, 19F a 23F v séru byly měřeny podle popisu v příkladu 1. Podobné odpovědi protilátek byly indukovány po imunizaci materiálem 11-valentní konjugát PS/DQ/3DMPLin, nebo stejnou vakcinou doplněnou antigenem FG (obr. 12).
-40 Tento výsledek ukázal, že kombinace konjugátů pneumokokových PS a antigenů FG viru RSV s formulací DQ/3D-MPLin nesnížila nebo nezměnila imunitní odpověď proti pneumokokům.
3,3 Buněčná odpověď specifická pro FG
Analýza produkce IL-5 a IFN-γ zpočátku ukazuje, že směs FG DQ/3D-MPLin s 11-valentním konjugátem PS poněkud ovlivňuje hladinu produkce INF-γ (obr. 13). Další analýza poměru měřených cytokinů, indikátoru profilu Th odpovědi ukazuje, že směs FG DQ/3Dio MPLin s 11-valentním konjugátem PS poněkud ovlivňuje profil Th. Převaha IFN-γ nad IL-5 je však pro kombinaci těchto dvou antigenů s DQ/3D-MPLin zachována a zůstává mnohem vyšší, než se pozoruje pro materiál FG hydroxid hlinitý, uznávané adjuvans indukující odpověď Th2.
4. Část 3: CPG a CPG hydroxid hlinitý
4,1 Protilátky proti FG
Byly indukovány podobné hladiny protilátky Ig proti FG prostřednictvím FG CpG nebo FG CpG v kombinaci s 11-valentním konjugátem PS (obr. 14). Nepřítomnost interference způsobená směsí FG CpG a 11-valentního konjugátu PS byla také pozorována pro prostředky založené na směsi CpG hydroxid hlinitý.
Jak je zřejmé pro analýzu Ig proti FG, nepozoruje se žádná interference u hladin neutralizačních protilátek proti RSVA, jestliže se použije směs FG CpG nebo FG CpG hydroxid hlinitý s 11-valentním konjugátem PS (obr. 15).
Analýza titrů jednotlivých isotypů lgG1 a lgG2a proti FG ukázala, že nedochází k žádné interferenci po přidání 11-valentního
-41 konjugátu PS ke směsím FG CpG nebo FG CpG hydroxid hlinitý (obr. 1θ).
Další analýza poměru isotypů lgG1/lgG2a ukazuje, že směs obou vakcin nemění poměr isotypů, který zůstává mnohem nižší než poměr indukovaný materiálem FG hydroxid hlinitý, s adjuvantními účinky podporujícími odpověď Th2.
4.2 IgG proti pneumokokovým polysacharidům
Titry IgG v séru proti polysacharidům 3, 6B, 7F, 14, 19F a 23F io byly měřeny podle popisu v příkladu 1. V předkládaném příkladu byly testovány dvě adjuvantní směsi: CpG a hydroxid hlinitý/CpG. Pro obě adjuvantní směsi byly titry IgG proti PS alespoň podobné u zvířat, která dostala 11-valentní konjugát PS doplněný FG, ve srovnání se zvířaty imunizovanými samotným 11-valentním konjugátem PS (obr. 17). Tento výsledek ukázal, že kombinace konjugátů pneumokokových PS a RSV antigenu FG s CpG nebo směsi hydroxid hlinitý CpG nesnížila nebo nezměnila imunitní odpověď proti pneumokokům. Titry protilátek proti sérotypům 7F a 14 byly dokonce mírně zlepšené v přítomnosti FG s využitím adjuvantní formulace CpG.
4.3 Buněčná odpověď specifická pro FG
Analýza produkce IL-5 a IFN-γ ukazuje, že směs FG CpG nebo CpG hydroxid hlinitý a 11-valentní konjugát PS neovlivňuje úroveň produkce těchto cytokinů, ani jejich poměr IFN-y/IL-5 (obr. 18). Proto se udržuje pro obě kombinace převaha IFN-γ, znaku odpovědi Th1, pro směsi CpG a CpG hydroxid hlinitý. Indukce IFN-γ byla v přítomnosti FG s použitím adjuvantní formulace CpG dokonce zvýšena.
-42 5. Část 4
Dopad přidání FG do prostředků obsahujících konjugát PS na imunitní odpověď IgG vůči proteinu D (PD) jako nosiči byl vyhodnocován v následujícím experimentu. PD je ochranný antigen proti infekci netypovatelným Haemophilus influenzae B (NTHi). Buněčná imunita typu Th1 se pravděpodobně účastní ochrany proti NTHi. Proto byly také testovány protilátky lgG2a proti PD, které jsou dobrým indikátorem odpovědi Th1.
io 5.1 Protilátky proti FG
Viz část 3.
5.2 IgG proti pneumokokovym polysacharidům
Viz část 3.
5.3 Buněčná odpověď specifická pro FG
Viz část 3.
5.4 Dávkování sérových IgG, lgG1, 2a a 2b proti PD metodou ELISA
Jak je ukázáno v obr. 19, odpovědi celkových sérových IgG na nosič PD nebyly významně ovlivněny přítomností FG ve formulacích s konjugátem pneumokokových PS, ať bylo použito jakéhokoli adjuvans (CpG nebo hydroxid hlinitý CpG). Vysoký podíl sérových protilátek lgG2a proti PD (přibližně 30 % celkových IgG), který byl vyvolán po vakcinaci formulacemi CpG nebo hydroxid hlinitý CpG s konjugátem PS nebyl modifikován přidáním FG k těmto formulacím (obr. 20). Tato odpověď lgG2a ukazovala na silnou imunitu typu Th1.
Celkově vzato ukazují tyto výsledky, že kombinace pneumokokových
-43 PS kombinovaných s PD a antigenu RSV FG s materiálem CpG nebo hydroxid hlinitý CpG neovlivnila imunitní odpověď proti PD.
Diskuse a závěr
Část 1: Hydroxid hlinitý/3D-MPL
Výsledky ukázaly, že kombinace konjugátů pneumokokových PS a RSV antigenu FG s formulací hydroxid hlinitý 3D-MPL neovlivňuje humorální imunitní odpovědi proti pneumokokům. Hladina humorálních a buněčných imunitních odpovědí specifických pro FG je patrně touto io směsí mírně ovlivněna, ale není ovlivněn profil Th čisté formulace FG.
Část 2: DQ/3D-MPLin
Výsledky ukázaly, že kombinace konjugátů pneumokokových PS a RSV antigenu FG ve formulaci s DQ/3D-MPLin neovlivňuje humorální imunitní odpovědi proti pneumokokům nebo humorální odpovědi specifické pro FG. Další analýza buněčné odpovědi ukazuje, že kombinace obou antigenů ve formulaci s DQ/3D-MPLin ovlivňuje určitým způsobem indukci IFN-γ. Není však ovlivněn profil Th ve srovnání se (samotným) FG.
Část 3: CpG/CpG hydroxid hlinitý
Výsledky ukazují, že kombinace konjugátů pneumokokových PS a RSV antigenu FG ve formulaci s CpG nebo hydroxid hlinitý CpG nesnížila nebo nezměnila humorální imunitní odpověď proti pneumokokům nebo humorální a buněčné odpovědi specifické pro FG.
Část 4: CpG/CpG hydroxid hlinitý
Tyto výsledky ukázaly, že kombinace pneumokokových PS konjugovaných s PD a RSV antigenu FG ve formulaci s materiálem CpG nebo hydroxid hlinitý CpG nesnížila nebo nezměnila imunitní odpověď proti PD.
Závěrem je možno uvést, že je výhodná kombinace 23-valentní vakciny proti pneumokokům s RSV FG 3D-MPL, ve které nastává synergický účinek pro obě vakciny v tom, že obě vakciny vykazují zlepšení v některých imunologických testech, přičemž při žádném io z testů nedochází k inhibici. Z výše uvedených výsledků je také možno odvodit výhodnou kombinaci, jestliže se kombinuje 11-valentní pneumokokový polysacharid konjugovaný s PD s RSV antigenem FG v rámci souboru adjuvantních materiálů podporujících odpověď Th1. Pro mnoho imunologických výsledků pro různé testované adjuvantní látky podporující odpověď Th1 ovšem kombinace antigenů vakciny netlumí, nebo pouze mírně tlumí (nikoliv významně v míře týkající se odpovědi jako celku) již existující vlastnosti jednotlivých vakcin. Jak bylo pozorováno při kombinaci FG s 23-valentní vakcinou v příkladu 1, v některých případech došlo u jedné nebo druhé vakciny ke zlepšení některých imunologických testů.
Claims (15)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Vakcina, vyznačující se tím, že obsahuje:5 (a) jeden nebo více polysacharidů Streptococcus pneumoniae buď konjugovaných s proteinem nebo peptidem, nebo nekonjugovaných; a (b) antigen RSV ve spojení s adjuvans, které je preferenčním stimulátorem odpovědi typu Th1.
- 2. Vakcina podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e polysacharid Streptococcus pneumoniae je konjugován preferenčně k proteinu ze skupiny zahrnující: protein D z Haemophilus influenzae B nebo jeho část, lipidovaná verze15 proteinu D neboli lipoprotein D; tetanový toxin a záškrtový toxin.
- 3. Vakcina podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že navíc obsahuje nosič.
- 4. Vakcina podle některého z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že preferenčním stimulátorem odpovědi typu Th1 je alespoň jedno adjuvans zvolené ze skupiny adjuvans zahrnující: 3D-MPL, 3D-MPL, jehož velikost částic je s výhodou25 přibližně méně než 100 nm, QS21, směs QS21 a cholesterolu a oligonukleotid CpG.- 46 ··· ·· ··· ···· ·· ···
- 5. Vakcina podle nároku 4, vyznačující se tím, ž e preferenční stimulátor odpovědi typu Th1 zahrnuje 3DMPL.5
- 6. Vakcina podle nároku 5, vyznačující se tím, ž e dále obsahuje QS21.
- 7. Vakcina podle některého z nároků 1až6, vyznačující se tím, že polysacharidem Streptococcus pneumoniae io je 23-valentní vakcina proti pneumokokovým polysacharidům.
- 8. Vakcina podle některého z nároků 1až6, vyznačující se tím, že polysacharidem Streptococcus pneumoniae je 11-valentní vakcina proti pneumokokovým polysacharidům.
- 9. Vakcina podle některého z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že antigenem RSV je glykoprotein obalu lidského RSV.2o
- 10. Vakcina podle některého z nároků 1až9, vyznačující se tím, že antigenem RSV je chimérní FG nebo jeho fragment.
- 11. Vakcina podle některého z nároků 1 až 10,25 vyznačující se tím, že navíc je přítomen antigen viru chřipky.4· 4 4 4 4·· • 4 4 4 44 4 4 4 4 44 4 4 · ·4444444 44 444
- 12. Vakcina podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že nosič je zvolen ze skupiny zahrnující hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý a tokoferol, a emulzi typu olej ve vodě.
- 13. Způsob výroby vakciny podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že se míchá antigen Streptococcus pneumoniae a antigen RSV s adjuvans indukujícím odpověď Th1.
- 14. Způsob výroby vakciny, vyznačující se tím, že se míchá polysacharid Streptococcus pneumoniae konjugovaný s proteinem D nebo jeho fragmentem, s antigenem RSV a farmaceuticky přijatelnou pomocnou látkou.
- 15. Způsob prevence nebo zmírnění infekce virem RSV a/nebo bakterií Streptococcus pneumoniae u pacienta, který zahrnuje podávání účinného množství vakciny podle některého z nároků 1 až 12 pacientovi.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB9909077.1A GB9909077D0 (en) | 1999-04-20 | 1999-04-20 | Novel compositions |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ20013773A3 true CZ20013773A3 (cs) | 2002-05-15 |
Family
ID=10851924
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ20013773A CZ20013773A3 (cs) | 1999-04-20 | 2000-04-17 | Vakcina |
Country Status (26)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20040228879A1 (cs) |
EP (2) | EP1171159B1 (cs) |
JP (1) | JP2002542204A (cs) |
KR (1) | KR100632835B1 (cs) |
CN (1) | CN1192797C (cs) |
AR (1) | AR023535A1 (cs) |
AT (1) | ATE395079T1 (cs) |
AU (1) | AU754101B2 (cs) |
BR (1) | BR0010682A (cs) |
CA (1) | CA2365579A1 (cs) |
CO (1) | CO5300414A1 (cs) |
CZ (1) | CZ20013773A3 (cs) |
DE (1) | DE60038877D1 (cs) |
ES (1) | ES2304960T3 (cs) |
GB (1) | GB9909077D0 (cs) |
HK (1) | HK1045100A1 (cs) |
HU (1) | HUP0201905A3 (cs) |
IL (1) | IL145981A0 (cs) |
MY (1) | MY125000A (cs) |
NO (1) | NO20015074L (cs) |
NZ (1) | NZ514961A (cs) |
PL (1) | PL351894A1 (cs) |
TR (1) | TR200103012T2 (cs) |
TW (1) | TWI234463B (cs) |
WO (1) | WO2000062801A2 (cs) |
ZA (1) | ZA200108620B (cs) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9706957D0 (en) | 1997-04-05 | 1997-05-21 | Smithkline Beecham Plc | Formulation |
GB9820525D0 (en) | 1998-09-21 | 1998-11-11 | Allergy Therapeutics Ltd | Formulation |
DE60038166T2 (de) | 1999-03-19 | 2009-03-12 | Glaxosmithkline Biologicals S.A., Rixensart | Impfstoff gegen bakterielle antigene |
GB0000891D0 (en) * | 2000-01-14 | 2000-03-08 | Allergy Therapeutics Ltd | Formulation |
AUPQ761200A0 (en) | 2000-05-19 | 2000-06-15 | Hunter Immunology Limited | Compositions and methods for treatment of mucosal infections |
FR2828406B1 (fr) * | 2001-08-08 | 2005-06-24 | Aventis Pasteur | Composition vaccinale bivalente havi |
CN101180079B (zh) | 2005-04-08 | 2012-07-18 | 惠氏公司 | 多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物组合物 |
US9839685B2 (en) | 2006-04-13 | 2017-12-12 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods of inducing human immunodeficiency virus-specific immune responses in a host comprising nasally administering compositions comprising a naonemulsion and recombinant GP120 immunogen |
TW200806315A (en) | 2006-04-26 | 2008-02-01 | Wyeth Corp | Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions |
US8808707B1 (en) | 2006-05-08 | 2014-08-19 | Wyeth Llc | Pneumococcal dosing regimen |
ES2678694T3 (es) * | 2008-04-16 | 2018-08-16 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vacuna |
EP2442827B1 (en) * | 2009-06-16 | 2016-01-06 | The Regents of the University of Michigan | Nanoemulsion vaccines |
CA2773637A1 (en) | 2009-09-10 | 2011-03-17 | Novartis Ag | Combination vaccines against respiratory tract diseases |
CN101703769B (zh) * | 2009-11-13 | 2013-05-08 | 广东永顺生物制药股份有限公司 | 一种新型猪链球菌病四价灭活疫苗 |
AU2011262346B2 (en) | 2010-06-04 | 2014-12-11 | Wyeth Llc | Streptococcus pneumoniae vaccine formulations |
US9107906B1 (en) | 2014-10-28 | 2015-08-18 | Adma Biologics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency |
RU2017120039A (ru) | 2014-12-10 | 2019-01-10 | Дженентек, Инк. | Антитела к рецепторам гематоэнцефалического барьера и способы их применения |
KR20200038339A (ko) * | 2015-09-10 | 2020-04-10 | 인벤트프라이즈 엘엘씨 | 다가 vlp 접합체 |
US10259865B2 (en) | 2017-03-15 | 2019-04-16 | Adma Biologics, Inc. | Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection |
WO2023218322A1 (en) | 2022-05-11 | 2023-11-16 | Pfizer Inc. | Process for producing of vaccine formulations with preservatives |
Family Cites Families (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4235877A (en) | 1979-06-27 | 1980-11-25 | Merck & Co., Inc. | Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit |
US4372945A (en) | 1979-11-13 | 1983-02-08 | Likhite Vilas V | Antigen compounds |
IL61904A (en) | 1981-01-13 | 1985-07-31 | Yeda Res & Dev | Synthetic vaccine against influenza virus infections comprising a synthetic peptide and process for producing same |
BE889979A (fr) | 1981-08-14 | 1982-02-15 | Smith Kline Rit | Procede de preparation de polysaccharides bacteriens capsulaires antigeniques purifies, produits obtenus et leur utilisation |
US5149650A (en) | 1986-01-14 | 1992-09-22 | University Of North Carolina At Chapel Hill | Vaccines for human respiratory virus |
US5057540A (en) | 1987-05-29 | 1991-10-15 | Cambridge Biotech Corporation | Saponin adjuvant |
DE3878468T2 (de) | 1987-12-23 | 1993-06-09 | Upjohn Co | Chimarenglykoproteine, enthaltend immunogene segmente des humanen respiratorischen synzytialvirus. |
US4912094B1 (en) | 1988-06-29 | 1994-02-15 | Ribi Immunochem Research Inc. | Modified lipopolysaccharides and process of preparation |
SE466259B (sv) | 1990-05-31 | 1992-01-20 | Arne Forsgren | Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal |
ES2108278T3 (es) | 1992-06-25 | 1997-12-16 | Smithkline Beecham Biolog | Composicion de vacuna con coadyuvantes. |
WO1994021292A1 (en) * | 1993-03-23 | 1994-09-29 | Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) | Vaccine compositions containing 3-o deacylated monophosphoryl lipid a |
US5723130A (en) * | 1993-05-25 | 1998-03-03 | Hancock; Gerald E. | Adjuvants for vaccines against respiratory syncytial virus |
EP0720485B1 (en) | 1993-09-22 | 2003-11-19 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Method of activating soluble carbohydrate using novel cyanylating reagents for the production of immunogenic constructs |
GB9326253D0 (en) | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
US6764682B1 (en) * | 1994-06-16 | 2004-07-20 | Aventis Pasteur Limited | Adjuvant compositions containing more than one adjuvant |
ATE328890T1 (de) | 1994-07-15 | 2006-06-15 | Univ Iowa Res Found | Immunomodulatorische oligonukleotide |
AU716806B2 (en) * | 1995-04-17 | 2000-03-09 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Induction and enhancement of the immune response to polysaccharides with bacterial lipoproteins |
UA56132C2 (uk) * | 1995-04-25 | 2003-05-15 | Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. | Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини |
GB9620795D0 (en) * | 1996-10-05 | 1996-11-20 | Smithkline Beecham Plc | Vaccines |
WO1997020940A1 (en) * | 1995-12-06 | 1997-06-12 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Compositions and method for stimulating antibody release by b lymphocytes |
SE9601158D0 (sv) * | 1996-03-26 | 1996-03-26 | Stefan Svenson | Method of producing immunogenic products and vaccines |
US6020182A (en) * | 1996-07-12 | 2000-02-01 | Connaught Laboratories Limited | Subunit respiratory syncytial virus vaccine preparation |
AU6908598A (en) * | 1996-10-29 | 1998-05-22 | Smithkline Beecham Biologicals (Sa) | Purification of respiratory syncytial virus antigens |
US6406705B1 (en) * | 1997-03-10 | 2002-06-18 | University Of Iowa Research Foundation | Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant |
FR2763244B1 (fr) * | 1997-05-14 | 2003-08-01 | Pasteur Merieux Serums Vacc | Composition vaccinale multivalente a porteur mixte |
GB9712347D0 (en) * | 1997-06-14 | 1997-08-13 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
-
1999
- 1999-04-20 GB GBGB9909077.1A patent/GB9909077D0/en not_active Ceased
-
2000
- 2000-04-17 JP JP2000611937A patent/JP2002542204A/ja active Pending
- 2000-04-17 EP EP00940231A patent/EP1171159B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-17 TR TR2001/03012T patent/TR200103012T2/xx unknown
- 2000-04-17 EP EP08151478A patent/EP1927366A1/en not_active Withdrawn
- 2000-04-17 CA CA002365579A patent/CA2365579A1/en not_active Abandoned
- 2000-04-17 AU AU55233/00A patent/AU754101B2/en not_active Ceased
- 2000-04-17 NZ NZ514961A patent/NZ514961A/en unknown
- 2000-04-17 PL PL00351894A patent/PL351894A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-04-17 CN CNB00809053XA patent/CN1192797C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-17 WO PCT/EP2000/003514 patent/WO2000062801A2/en active Search and Examination
- 2000-04-17 AT AT00940231T patent/ATE395079T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-04-17 HU HU0201905A patent/HUP0201905A3/hu not_active Application Discontinuation
- 2000-04-17 CZ CZ20013773A patent/CZ20013773A3/cs unknown
- 2000-04-17 DE DE60038877T patent/DE60038877D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-17 ES ES00940231T patent/ES2304960T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-17 KR KR1020017013365A patent/KR100632835B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-04-17 IL IL14598100A patent/IL145981A0/xx unknown
- 2000-04-17 BR BR0010682-8A patent/BR0010682A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-04-18 AR ARP000101808A patent/AR023535A1/es not_active Application Discontinuation
- 2000-04-18 MY MYPI20001649A patent/MY125000A/en unknown
- 2000-04-19 CO CO00028930A patent/CO5300414A1/es not_active Application Discontinuation
- 2000-04-20 TW TW089107452A patent/TWI234463B/zh not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-10-18 NO NO20015074A patent/NO20015074L/no not_active Application Discontinuation
- 2001-10-19 ZA ZA200108620A patent/ZA200108620B/en unknown
-
2002
- 2002-06-27 HK HK02104796.6A patent/HK1045100A1/zh unknown
-
2004
- 2004-06-15 US US10/867,880 patent/US20040228879A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HK1045100A1 (zh) | 2002-11-15 |
CO5300414A1 (es) | 2003-07-31 |
IL145981A0 (en) | 2002-07-25 |
KR20010110784A (ko) | 2001-12-13 |
WO2000062801A2 (en) | 2000-10-26 |
AU754101B2 (en) | 2002-11-07 |
MY125000A (en) | 2006-07-31 |
ZA200108620B (en) | 2002-09-13 |
CA2365579A1 (en) | 2000-10-26 |
HUP0201905A3 (en) | 2003-12-29 |
TWI234463B (en) | 2005-06-21 |
NO20015074L (no) | 2001-11-15 |
GB9909077D0 (en) | 1999-06-16 |
NZ514961A (en) | 2003-08-29 |
CN1355710A (zh) | 2002-06-26 |
JP2002542204A (ja) | 2002-12-10 |
ES2304960T3 (es) | 2008-11-01 |
ATE395079T1 (de) | 2008-05-15 |
TR200103012T2 (tr) | 2002-06-21 |
EP1171159A2 (en) | 2002-01-16 |
DE60038877D1 (de) | 2008-06-26 |
AU5523300A (en) | 2000-11-02 |
CN1192797C (zh) | 2005-03-16 |
PL351894A1 (en) | 2003-06-30 |
BR0010682A (pt) | 2002-02-05 |
AR023535A1 (es) | 2002-09-04 |
NO20015074D0 (no) | 2001-10-18 |
EP1927366A1 (en) | 2008-06-04 |
EP1171159B1 (en) | 2008-05-14 |
US20040228879A1 (en) | 2004-11-18 |
WO2000062801A3 (en) | 2001-01-11 |
KR100632835B1 (ko) | 2006-10-16 |
HUP0201905A2 (en) | 2002-09-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1171159B1 (en) | Combination vaccine against streptococcus pneumoniae and respiratory syncytial virus (rsv) | |
JP4870895B2 (ja) | ワクチン組成物 | |
JP5095595B2 (ja) | ワクチン組成物 | |
JP3602448B2 (ja) | 核酸呼吸器シンシチウムウイルスワクチン | |
AU762857B2 (en) | Vaccine | |
MXPA01010653A (es) | Vacuna de combinacion contra streptococcus pneumoniae y virus sincital respiratorio | |
AU2005203302A1 (en) | Vaccine composition | |
TW201008578A (en) | Vaccine composition |