MXPA03002890A - Preparacion de virus con envolvente dividido. - Google Patents
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Abstract
La invencion se refiere a formulaciones de vacuna que comprenden una preparacion de virus con envolvente dividido en la que el virus es RSV o PIV, metodos para preparar tales formulaciones, y al uso de tales formulaciones en la prevencion o tratamiento de la enfermedad.
Description
PREPARACIÓN DE VIRUS CON ENVOLVENTE DIVIDIDO
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a formulaciones de vacuna novedosas, métodos para la elaboración de tales vacunas y al uso de tales vacunas en la profilaxis o terapia de la enfermedad. En particular, la presente invención se refiere a vacunas que comprenden preparaciones de virus con envolvente dividido.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Un virus con envolvente es uno en el cual el núcleo de virus se encuentra rodeado por una envolvente exterior rica en lípidos con contenido de proteínas virales. En una modalidad particular, el virus con envolvente dividido de la formulación de vacuna de la presente invención se deriva del virus sincitial respiratorio (RSV) o virus de la parainfluenza (PIV). A manera de ejemplo, se describe específicamente el RSV. El virus sincitial respiratorio humano es un miembro de la familia Paramixoviridiae de los virus y ocasiona enfermedades del tracto respiratorio inferior, particularmente en niños pequeños y bebés. Reportes recientes sugieren que RSV es también un patógeno importante en adultos, particularmente los ancianos. RSV es un virus con envolvente con un genoma de ácido ribonucléico (ARN) de cepa negativa de 15,222 nucleótidos que codifica para 11 ARNs mensajeros, codificando cada uno para un solo polipéptido. Tres de las once proteínas son proteínas de superficie de transmembrana: las proteínas G (unión), F (fusión) y SH. Una proteína es la proteína de matriz de virión (M), tres proteínas son componentes del nucleocápsido (N, P y L), y 2 proteínas son no estructurales (NS1 y NS2). Hay dos proteínas adicionales M2-1 y M2-2. Existen dos subgrupos antigénicamente distintos de RSV, los subgrupos designados A y B. La caracterización de las cepas de estos sub-grupos ha determinado que las diferencias principales residen en las proteínas G, mientras que se conservan las proteínas F. El virus sincitial respiratorio (RSV) ocurre en las epidemias de temporada, que alcanza un máximo durante el invierno en ambientes templados y durante la temporada de lluvias en climas más cálidos. El RSV es una causa importante de serias enfermedades del tracto respiratorio inferior en niños. Se calcula que 40-50% de los niños hospitalizados con bronquiolitis y 25% de los niños hospitalizados con neumonía se encuentran hospitalizados como resultado directo de infecciones del RSV. La infección del RSV primaria ocurre generalmente en niños menores al año de edad; 95% de niños tienen evidencia serológica de infecciones anteriores a los dos años de edad y 100% de la población la tienen en la edad adulta. En infantes y niños pequeños, la infección progresa del tracto respiratorio superior al inferior en aproximadamente 40% de los casos y la presentación clínica es la de la bronquiolitis o la neumonía, Los niños de dos a seis meses de edad se encuentran en gran riesgo de desarrollar manifestaciones serias de la infección con el RSV (principalmente fallas respiratorias); sin embargo, los niños de cualquier edad con enfermedad cardiaca o pulmonar fundamental, infantes prematuros, e infantes inmunocomprometidos, se encuentran también en riesgo de serias complicaciones. La reinfección sintomática ocurre a lo largo de la vida y se ha vuelto crecientemente aparente que el RSV es también un importante patógeno adulto, especialmente para los ancianos. La infección del RSV es ciertamente casi subdiagnosticada en adultos, en parte debido a que se considera que es una infección de niños. Consecuentemente, la evidencia del virus en adultos no se busca con objeto de explicar las enfermedades respiratorias. Además, el RSV es difícil de identificar en secreciones nasales provenientes de personas que tienen cierto grado de inmunidad parcial al virus, como la gran mayoría de adultos. Los adultos jóvenes hasta los adultos de edad media desarrollan típicamente un síndrome de tipo de resfriado persistente cuando se infecta con RSV. Las poblaciones envejecidas pueden desarrollar un síndrome respiratorio prolongado el cual es virtualmente indistinguible de la influenza, con síntomas respiratorios superiores los cuales pueden acompañarse por una intervención del tracto respiratorio inferior, incluyendo la neumonía. Las poblaciones envejecidas institucionalizadas son de particular preocupación, puesto que comprenden grandes números de personas susceptibles agrupadas conjuntamente. La dispersión de la infección a través de tal población, muchos de quienes tienen múltiples problemas médicos que pueden predisponerlos a un transcurso más severo de la enfermedad, es difícil de controlar. Además, los reportes de estudios recientes que evalúan el impacto de la infección del RSV como una causa de hospitalización en adultos y ancianos saludables que residen en la comunidad abordan también un papel importante de la infección del RSV en enfermedades severas del tracto respiratorio inferior en estas poblaciones. Se ha identificado al RSV como uno de los cuatro patógenos más comunes que ocasionan enfermedades severas del tracto respiratorio inferior que dan como resultado la hospitalización de adultos. Se demostró también que las infecciones serias del RSV en personas ancianas no se limitan a sanatorios o situaciones de epidemia. En su lugar, la infección de RSV es una causa predecible de enfermedades serias entre pacientes ancianos que residen en la comunidad. De modo similar a las hospitalizaciones para la influenza A, aquellos relacionados con infecciones del RSV se asociaron con una morbilidad substancial, como se evidencia por permanencias prolongadas en el hospital, proporciones altas de admisión de cuidado intensivo, y proporciones altas de soporte ventilador. Estos estudios abordan la necesidad médica y económica de una vacuna eficaz la cual pueda evitar complicaciones severas de infección de RSV en infantes, adultos y ancianos tal como los ancianos institucionalizados y los ancianos saludables que residen en la comunidad. Consideraciones similares aplican igualmente para el PIV.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una formulación de vacuna que comprende una preparación de virus con envolvente dividido en la que el virus es el virus sincitial respiratorio o el virus de la parainfluenza. De manera adecuada, la formulación de vacuna comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las formulaciones de vacuna de la presente invención se derivarán a partir de virus con envolventes que sean capaces de dividirse. El virus con envolvente puede derivarse a partir de una gran variedad de fuentes que incluyen virus de origen humano o animal. De manera adecuada, el virus es RSVA, RSVB, PIV 1, PIV 2 o PIV 3. Donde el virus es de origen animal, la fuente es preferentemente bovina. Donde el virus es de origen animal, tal como de origen bovino, el virus es preferentemente un virus recombinante. La formulación de vacuna de la invención comprende opcionalmente otro virus dividido seleccionado a partir del grupo que consiste en: virus de la influenza, virus sincitial respiratorio, virus de la parainfluenza, metaneumovirus, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de Epstein Barr, virus del herpes, citomegalovirus, virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis transmitida por garrapata, virus de la encefalitis Japonesa, virus de la rubéola, virus de la encefalitis equina occidental, oriental y Venezolana; y virus de la inmunodeficiencia humana. La formulación de vacuna de la invención comprende opcionalmente un antígeno o antígenos derivados de patógenos en combinación con la preparación dividida, para proporcionar protección adicional contra la enfermedad. Los antígenos adecuados, los cuales no necesitan provenir de preparaciones de división, incluyen por ejemplo antfgenos derivados de cualquiera de los virus listados anteriormente y patógenos que ocasionan enfermedades respiratorias tales como Streptococcus Pneumoniae. Preferentemente, las formulaciones de vacuna de la presente invención son capaces de estimular una respuesta inmunológica protectora contra el virus con envolvente después del suministro. La división del virus se lleva a cabo al interrumpir o fragmentar todo el virus, infeccioso (de tipo silvestre o atenuado) o no infecciosos (inactivado, por ejemplo), con una concentración de interrupción de un agente de división el cual es generalmente, pero no necesariamente, un agente tensioactivo. El virus a dividirse puede ser también un virus recombinante quimérico, que tiene elementos inmunogónicos derivados de más de un virus diferente. La interrupción da como resultado una solubilización completa o parcial de todas las proteínas de virus que altera la integridad del virus. De manera adecuada, se obtiene un virus dividido al contactar el virus PIV o RSV con un agente de división de acuerdo con la presente invención para interrumpir completamente la envolvente viral. Otras proteínas virales se vuelven preferentemente solubilizadas parcialmente o completamente. La pérdida de integridad después de la división hace no infecciosos al virus lo cual puede evaluarse por pruebas de concentración in vitro adecuadas. Una vez interrumpida la envolvente viral, las proteínas generalmente no se encuentran asociadas con viriones intactos completos. Otras proteínas virales son preferentemente solubilizadas parcialmente o completamente y por lo tanto no se encuentran asociadas, o solamente asociadas en parte, con viriones intactos completos después de la división. El efecto del agente de división en la envolvente viral y las proteínas virales puede seguirse por la migración del virus dividido y de proteínas virales en experimentos de amortiguadores de sacarosa con visualización por análisis Western Blot y microscopía electrónica, como se describe en la presente. La preparación de vacunas divididas de acuerdo con la invención puede involucrar los siguientes pasos de eliminación de los agentes de división y una parte o la mayoría del material lípido viral. El proceso para la preparación del virus con envolvente dividido puede incluir además un cierto número de pasos de filtración diferente y/o otros pasos de separación tales como ultracentrifugación, ultrafiltración, centrifugación zonal y pasos cromotográficos en una variedad de combinaciones, y opcionalmente un paso de inactivación, por ejemplo, con formaldehído o ß-propiolactona o tratamiento de UV que puede llevarse a cabo antes o después de la división. El proceso de división puede llevarse a cabo como un proceso por lotes, continuo o semi- continuo. Las vacunas divididas de acuerdo con la invención contienen generalmente fragmentos de membrana y proteínas de envolvente de membrana así como también las proteínas de no membrana tales como la proteína de matriz viral y la nucleoproteína en ausencia de viriones completos significativos. Las vacunas divididas de acuerdo con la invención contendrán generalmente la mayoría o todas las proteínas estructurales de virus aunque no necesariamente en las mismas proporciones que ocurren en todo el virus. Las preparaciones de virus dividido preferidas comprenden al menos la mitad del complemento de las proteínas estructurales virales, preferentemente todas esas proteínas. Por otra parte, las vacunas de subunidad consisten esencialmente de una o unas cuantas proteínas virales altamente purificadas. Por ejemplo, una vacuna de subunidad podría contener proteínas de superficie virales purificadas las cuales son conocidas por ser responsables de producir los anticuerpos deseados neutralizantes del virus después de la vacunación. En esta invención pueden utilizarse diversos agentes de división tales como los agentes tensioactivos iónicos y no iónicos así como también otros diversos agentes reactivos. Los ejemplos de agentes de división útiles en el contexto de la invención incluyen: 1. Ácidos biliares y derivados de los mismos. Los ácidos biliares incluyen ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido cólico quenodesoxi, ácido litocólico, ácido ursodesoxicólico, ácido hiodesoxicólico y derivados de tipo glico-, tauro-, amidopropil-1 - propanosulfónico, derivados de amidopropil-2-hidroxi-1-propanosulfónico de los ácidos biliares anteriormente mencionados, o N,N-bis(3Dgluconoamidopropil)desoxicolamida. Un ejemplo particular es el desoxicolato de sodio - NaDOC. 2. Los agentes tensioactivos no iónicos tales como octoxinoles (la serie Tritón™), éteres de polioxietileno tales como monooleato de sorbitano de polioxietileno (Tween 80™), y éteres o ésteres de polioxitileno de la fórmula general (I): (I) HO(CH2CH20)n-A-R donde n es 1-50, A es un enlace o -C(O)-, R es C -50 alquilo o fenil C1-50 alquilo, y combinaciones de dos o más de estos. Los ejemplos particulares son; Tween 80™, Tritón X-100™ y laureth 9; 3. Alquilglucósidos o alquiltioglucósidos, donde la cadena de alquilo se encuentra entre C6-C18, típicamente entre C8 y C14, la mitad de azúcar es cualquier pentosa o hexosa o combinaciones de las mismas con diferentes enlaces, de tipo 1->6, 1->5, 1->4, 1->3, 1->2. La cadena de alquilo puede ser saturada, no saturada y/o ramificada; 4. Los derivados de 3 anteriormente citados, donde uno o más grupos hidróxilo, preferentemente el grupo hidróxilo 6 se modifica(n), como los ésteres, etoxilatos, sulfatos, éteres, carbonatos, sulfosuccinatos, isetionatos, etercarboxilatos, compuestos de amonio cuaternario; 5. Azúcares de acilo, donde la cadena de acilo se encuentra entre C6 y C18, típicamente entre C8 y C12, la mitad de azúcar es cualquier pentosa o hexosa o combinaciones de las mismas con diferentes enlaces, de tipo 1->6, 1->5, 1->4, 1->3, 1->2. La cadena de acilo puede ser saturada, no saturada y/o ramificada; 6. Las sulfobetaínas de la estructura R-N,N-(R1 ,R2)-3-amino-1 -propanosulfonato, donde R es cualquier cadena de alquilo o arilalquilo entre C6 y C18, típicamente entre C8 y C16. La cadena de alquilo R puede ser saturada, no saturada y/o ramificada. Las cadenas de alquilo de R1 y R2 entre C1 y C4, típicamente C1; 7. Las betaínas de la estructura R-N,N-(R1 ,R2)-glicina, donde R es cualquier cadena de alquilo entre C6 y C18, típicamente entre C8 y C16. La cadena de alquilo puede ser saturada, no saturada y/o ramificada. R1 y R2 son cadenas de alquilo entre C1y C4, típicamente C1 ; 8. El polioxietilenoalquiléter de la estructura R-(-0-CH2-CH2-)n-OH, donde R es cualquier cadena de alquilo entre C6 y C20 típicamente entre C8 y C14. La cadena de alquilo puede ser saturada, no saturada y/o ramificada, n se encuentra entre 5 y 30, típicamente entre 8 y 25; 9. ?,?-dialquil-glucamidas, de la estructura R-(N-R1)-glucamida, donde R es cualquier cadena de alquilo entre C6 y C18, típicamente entre C8 y C12. La cadena de alquilo puede ser saturada, no saturada y/o ramificada o cíclica. R1 y R2 son cadenas de alquilo entre C1 y C6, típicamente C1. La mitad de azúcar puede modificarse con pentosas o hexosas; 10. Hecameg: (6-0-(N-heptil-carbamo(l)-metil-alfa-D- glucopiranosida); 11. Alquilfenoxipolietoxietanol de la estructura R-C6H4-0-(-CH2-CH2-)n-OH, donde R es cualquier cadena de alquilo entre C6 y C18, típicamente C8. La cadena de alquilo puede ser saturada, no saturada y/o ramificada (n>=3); 12. Los compuestos de amonio cuaternarios de la estructura R, -N+ (-R1, -R2, -R3), donde R es cualquier cadena de alquilo entre C6 y C20, típicamente C20. La cadena de alquilo puede ser saturada, no saturada y/o ramificada. R1, R2 y R3 son cadenas de alquilo entre C1 y C4, típicamente C1; 13. Sarcosilo: sal de Na de N-Laurllsarcosina; 14. CTAB (bromuro de amonio de trimetilo de cetilo) o
Cetavlon. Los más preferidos son NaDoc y Sarcosilo. Los agentes de división se incuban de manera adecuada a temperatura ambiente con el virus a dividirse, por ejemplo, durante toda la noche, para efectuar la división. Pueden utilizarse combinaciones de agentes de división, según sea apropiado. La preparación de la vacuna dividida contiene preferentemente al menos un agente tensioactivo que puede ser en particular un agente tensioactivo no iónico. El uno o más agentes tensioactivos puede(n) ser residual(es) del proceso de división, y/o agregarse al virus después de la división. Se considera que el material de antígeno de división se estabiliza en presencia de un agente tensioactivo no Iónico, aunque se comprenderá que la invención no depende de esto siendo necesariamente el caso. Los agentes tensioactivos no iónicos estabilizadores adecuados incluyen los octoxinoles (la serie Tritón™), éteres de polioxietileno tales como monooleato de sorbitano de polioxietileno (Tween 80™), y éteres o ésteres de polioxitileno de la fórmula general (I): (I) HO(CH2CH20)n-A-R donde n es 1-50, A es un enlace o -C(O), R es C1.50 alquilo o fenil Ci_so alquilo, y combinaciones de dos o más de estos. Los agentes tensioactivos no iónicos preferidos derivados de la serie Tritón incluyen Tritón X-100 (t-octilfenoxipolietoxietanol), Tritón X-165, Tritón X-205, Tritón X-305 o Tritón X-405, Tritón N-101. Se prefiere particularmente Tritón X-100. Los agentes tensioactivos no iónicos preferidos incluyen además pero no se restringen a, éteres de polioxietileno de la fórmula general (I) anteriormente descrita, en particular: éter de polioxietilen-9-laurilo, éter de polioxietilen-9-estearilo, éter de polioxietilen-8-estearilo, éter de polioxietilen-4-laurilo, éter de polioxietilen-35-laurilo, y éter de polioxietilen-23-laurilo. Muy preferentemente, el éter de polioxietileno es éter de polioxietilen-9-laurilo (laureth 9). Los términos o nombres alternativos para éter de laurilo de polioxietileno se describen en el registro CAS. El número de registro de CAS de éter de polioxietilen-9-laurilo es: 9002-92-0. Los éteres de polioxietileno tales como éter de laurilo de polioxietileno se describen en el Manual Merck (12a ed.: entrada 7717, Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, N.J. EUA; ISBN 0911910-12-3). Se forma laureth 9 al hacer reaccionar óxido de etileno con alcohol de dodecilo, y tiene un promedio de nueve unidades de óxido de etileno. Preferentemente, la concentración final de agente tensioactivo estabilizador presente en la formulación de vacuna final se encuentra entre 0.001 a 20%, más preferentemente 0.01 a 10%, y muy preferentemente hasta aproximadamente 2% (p/v). Donde se encuentran presentes uno o más agentes tensioactivos, estos se encuentran generalmente presentes en la formulación final a una concentración de hasta aproximadamente 2% cada uno, generalmente hasta una concentración de aproximadamente 1% cada uno, típicamente a una concentración de hasta aproximadamente 0.6% cada uno, y más típicamente en residuos de hasta aproximadamente 0.2% o 0.1% cada uno. Cualquier mezcla de agentes tensioactivos puede estar presente en las formulaciones de vacuna de acuerdo con la invención. El virus con envolvente puede producirse por réplica en una estructura celular adecuada, en suero o en un proceso sin suero. El virus de desarrollo de cultivo de tejidos puede producirse por ejemplo en células humanas tales como MRC-5, WI-38, HEp-2 o células de simio tales como células AGMK, Vero, LLC-Mk2, LLc-Mk2, FRhL, FRhL-2 o bovinas tales como DBK, o células caninas tales como MDCK, o células primarias tales como fibroblastos de embrión de pollo, o cualquier otro tipo celular adecuado para la producción de un virus para propósitos de vacuna que incluyen clones derivados de las líneas celulares anteriormente mencionadas. La preparación de vacunas divididas se combina preferentemente con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes farmacéuticamente aceptables utilizados pueden ser aquellos que son convencionales en el campo de preparación de vacunas. Los excipientes utilizados en cualquier formulación de vacunas determinadas serán compatibles ambos uno con otro y con los ingredientes esenciales de la composición de tal manera que no haya interacción lo cual deteriorarla el rendimiento de los ingredientes y los agentes activos, si hay alguno. Todos los excipientes deben ser por supuesto no tóxicos y de una pureza suficiente para volverlos adecuados para uso humano. Son bien conocidos en la materia los ejemplos adecuados de excipientes. La formulación de vacunas puede incluir también preferentemente un adyuvante el cual puede ser un portador y/o un inmunoestimulante. El adyuvante puede ser residual a partir del proceso de división, y/o agregarse al virus después de la división. Los adyuvantes adecuados para su uso en las vacunas de la presente invención son bien conocidos en la materia. Consecuentemente, un aspecto adicional de la presente invención proporciona una formulación vacuna que comprende una preparación de vacunas del virus sincitial respiratorio dividido o el virus de parainfluenza dividido en combinación con un adyuvante. De manera adecuada, la formulación comprende también un excipiente farmacéuticamente aceptable. La forma de adyuvante adecuada para su uso depende generalmente del medio de administración de la vacuna. Las preparaciones de vacuna de la presente invención pueden utilizarse para proteger o tratar un mamífero susceptible a, o que padece de enfermedades, al administrar dicha vacuna a través de: (a) una ruta mucosa, tal como la ruta oral/bucal/intestinal/vaginal/rectal o nasal; (b) por suministro parenteral, por ejemplo, intramuscular, o administración subcutánea; o (c) por suministro transdérmico, ¡ntradérmico, intra-epitelial o transcutáneo. La invención se extiende a tales métodos de tratamiento y protección. Las preparaciones de vacuna de la presente invención pueden administrarse opcionalmente por una combinación de las rutas listadas.
Suministro por la ruta mucosal Aparte de pasar por alto el requisito de las inyecciones dolorosas y el efecto negativo asociado en el acatamiento del paciente debido al "miedo a la aguja", la vacunación mucosal tal como por un método intranasal es atractiva dado que se ha mostrado en animales que la administración mucosal de antigenos tiene una buena eficacia para inducir respuestas protectoras en las superficies mucosales, la cual es la ruta de entrada de muchos patógenos. En la vacunación, se ha sugerido que la vacunación mucosal, tal como la vacunación intranasal, pueda inducir inmunidad mucosal no solamente en la mucosa nasal, sino tambión en sitios mucosales distantes tales como la mucosa genital. La administración intranasal de acuerdo con la invención puede estar en forma de gotitas, atomizador, o en polvo. Las formulaciones de vacuna nebulizadas o en aerosol forman parte también de esta invención. Las formulaciones entéricas tales como cápsulas gastro-resistentes y gránulos para la administración oral, supositorios para la administración rectal o vaginal y ampollas para la administración bucal u oral también forman parte de esta invención. Una ruta mucosal de administración preferida de la vacuna de la invención es a través de la ruta intranasal. Puede utilizarse cualquier adyuvante adecuado para el suministro intranasal, y en cualquier forma adecuada, tal como una solución, una solución no vesicular, una suspensión o un polvo. Los adyuvantes preferidos incluyen aquellos ejemplificados en WO 99/52549 cuyo contenido completo se incorpora para referencia. Los adyuvantes preferidos incluyen, pero no se limitan a, agentes tensioactivos no iónicos tales como Tween80™, Tritón X-100™ y laureth 9, y combinaciones de los mismos. Los agentes tensioactivos no iónicos pueden combinarse ventajosamente con un inmunoestimulante tal como un derivado no tóxico de lípido A que incluye aquellos descritos en US 4,912,094 y GB 2,220,211, incluyendo los derivados no tóxicos de lípido A de monofosforilo y difosforilo tal como lípido A de monofosforilo 3-de-O-acilado (3D- PL) y lípido A de difosforilo 3-de-O-acilado. Una combinación preferida es Laureth-9 combinada con 3D-MPL. Los inmunoestimulantes anteriores pueden utilizarse también en formulaciones sin agentes tensioactivos no iónicos, donde sea apropiado. En una modalidad adicional de la presente invención, el adyuvante es una toxina ribosilante de ADP o muíante de la misma. Los ejemplos de tales toxinas son la Toxina Lábil de Calentamiento (LT) derivada del E. coli, y mutantes de la misma tales como LTR192G, y fragmentos de estas toxinas tales como el componente de unión de gangliósido (LTB). Los dispositivos preferidos para la administración intranasal de las vacunas de acuerdo con la invención son los dispositivos atomizadores. Los dispositivos atomizadores nasales adecuados se encuentran comercialmente disponibles por Becton Dickinson, Pfeiffer GMBH y Valois. Los dispositivos atomizadores proferidos para uso intranasal no dependen de su rendimiento en la presión aplicada por el usuario. Los dispositivos de umbral de presión son particularmente útiles debido a que el líquido se libera de la boquilla solamente cuando se alcanza una presión de umbral. Estos dispositivos hacen más fácil lograr un atomizador con un tamaño de gotita regular. Los dispositivos de umbral de presión adecuados para su uso con la presente invención son conocidos en la materia y se describen por ejemplo en WO 91/13281 y EP 311 863 B. Tales dispositivos se encuentran actualmente disponibles por Pfeiffer GMBH y se describen también en Bommer, R. Advances in Nasal drug delivery Technology, Pharmaceutical Technology Europe, Septiembre de 1999, p26-33. Los dispositivos intranasales preferidos producen gotitas (medidas utilizando agua como el líquido) en el rango de 1 a 500 m. Debajo de 10 pm existe un riesgo de inhalación, por lo tanto es deseable tener no más de aproximadamente 5% de gotitas debajo de los 10 pm. El suministro de bi-dosis es una característica preferida adicional de un sistema de suministro intranasal para su uso con las vacunas de acuerdo de acuerdo con la invención. Los dispositivos de bi-dosis contienen dos subdosis de una sola dosis de vacuna, una sub-dosis para la administración a cada fosa nasal. La invención proporciona en un aspecto adicional un juego farmacéutico que comprende un dispositivo de administración intranasal como se describe en la presente que contiene una formulación de vacuna de acuerdo con la invención o que comprende un dispositivo de administración intranasal y una formulación de vacuna separada para su uso con ese dispositivo. La invención proporciona también un dispositivo de suministro intranasal que comprende una formulación de vacuna dividida de la presente invención. Este aspecto de la invención no se limita necesariamente para atomizar el suministro de formulaciones líquidas. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden administrarse en otras formas, por ejemplo, como polvo. Las vacunas de la presente invención pueden administrarse también a través de la ruta oral. En tales casos, el excipiente farmacéuticamente aceptable puede incluir también reguladores alcalinos, cápsulas entéricas, microgránulos y/o tener forma de ampollas. Las vacunas de la presente invención pueden determinarse también por la ruta vaginal. En tales casos, los excipientes farmacéuticamente aceptables pueden incluir también emulsores, polímeros tales como CARBOPOL®, y otros estabilizadores conocidos de cremas y supositorios vaginales. Las vacunas de la presente invención pueden administrarse también por la ruta rectal. En tales casos, los excipientes pueden incluir también ceras y polímeros conocidos en la materia de formación de supositorios rectales.
Rutas Parenterales Además, las vacunas de la presente invención pueden suministrarse parenteralmente, por ejemplo, por administración intramuscular, o subcutánea. En esta circunstancia, se prefiere un adyuvante el cual es un estimulante preferencial de una respuesta de TH-1. Una respuesta inmunológica puede distinguirse ampliamente en dos categorías, siendo una respuesta inmunológica humoral (anticuerpos) o mediada por células (CTLs, células auxiliares T, células NK). Tanto en ratones como en humanos, los subconjuntos de células auxiliares T (Th) funcionalmente distintas, conocidas como células Th1 y Th2 se caracterizan por los patrones de citoquinas que producen. Históricamente, las respuestas inmunológicas humorales y mediadas por células se han asociado con las respuestas de tipo Th2 y las respuestas - - de tipo Th1, respectivamente. Estas dos formas polarizadas de la respuesta inmunológica celular especifica proporcionan un modelo útil para explicar los diferentes mecanismos ejecutores involucrados en la protección contra diversos patógenos. Las respuestas predominantes de Th1 son eficaces en la erradicación de los agentes infecciosos, incluyendo los patógenos intracelulares. Las respuestas de Th2 contribuyen a la protección contra las formas extracelulares de los patógenos. La distinción de las respuestas inmunológicas de tipo Th1 y Th2 no es absoluta. En realidad, un individuo puede soportar una respuesta inmunológica que se describa por ser predominantemente Th1 o predominantemente Th2. El mecanismo por el cual las células TH son responsables para la dicotomía Th1/Th2 se describió primeramente en ratones cuando Mosmann y colegas proporcionaron evidencia de que la estimulación de antígeno de las células Th dio como resultado el desarrollo de patrones restringidos y con estereotipos de producción citoquina (Mosmann, T. . y Coffman, R.L. (1989) TH 1 y TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, p145-173). En el sistema murino, las células Th1 producen citoquinas tales como IFN-? y mejoran la activación de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y la hipersensibilidad de tipo retrasado. Las células Th1 se encuentran involucradas también en la regulación de la producción de anticuerpos de lgG2a. Las células murinas Th2 producen citoquinas tales como IL-4 e IL-5 y se encuentran involucradas en la regulación de las respuestas humorales; más específicamente los isotipos I g G 1 e IgE. Se conoce que algunos adyuvantes de vacuna son particularmente adecuados para la estimulación de respuestas de tipo Th1 o Th2. Tradicionalmente, los mejores indicadores del balance Th1:Th2 de la respuesta inmunológica después de una vacunación o infección incluyen la medición de los isotipos de anticuerpo de antígeno específico, tales como la proporción lgG2a:lgG1 en ratones. Consecuentemente, un adyuvante de tipo T 1 es uno que estimula las poblaciones de células T de antígeno de vacuna específico para producir niveles altos de citoquinas de tipo Th1. También induce respuestas de inmunoglobulina de antígeno específico asociadas con isotipos de tipo Th1 (tal como lgG2a) en ratones. Los adyuvantes que son capaces de estimulación preferencial de la respuesta de células TH1 se describen en la Solicitud de Patente Internacional No. WO 94/00153 y WO 95/17209. El lípido A de monofosforilo 3-De-O-acilado (3D-MPL) es uno de tales adyuvantes. Esto se sabe a partir de GB 2220211 (Ribi). Químicamente es una mezcla de lípido A de monosfosforilo 3-De-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas y se elabora por Corixa Montana. Una forma preferida de lípido A de monofosforilo 3-De-O-acílada se describe en la Patente Europea 0 689 454 B1 (SmithKMne Beecham Biologicals SA). Preferentemente, las partículas de 3D-MPL son lo suficientemente pequeñas para filtrarse estériles a través de una membrana de 0.22 micrones (como se describe en la Patente Europea número 0 689 454). 3D-MPL se encontrará presente en el rango de 10 g-100pg preferentemente 25-50 pg por dosis en la que el antígeno se encontrará típicamente presente en un rango de 2-50 pg por dosis, Otro adyuvante preferido comprende QS21, un fragmento purificado de Hplc derivado de la corteza de Quillaja Saponaria Molina. Opcionalmente esta puede mezclarse con lípido A de monofosforilo 3-De-O-acilado (3D-MPL), opcionalmente junto con un portador. El método de producción de QS21 se describe en la Patente de E.U. No. 5,057,540. Las formulaciones de adyuvantes no reactogénicos que contienen QS21 se han descrito con anterioridad (WO 96/33739). Tales formulaciones que comprenden QS21 y colesterol han mostrado ser exitosos adyuvantes estimulantes de Th1 cuando se formulan conjuntamente con un antígeno. Consecuentemente, las composiciones de vacuna que forman parte de la presente invención pueden incluir una combinación de Qs21 y colesterol. Los adyuvantes adicionales que son estimulantes preferenciales de respuesta de células TH1 incluyen oligonucleótidos inmunomoduladores, por ejemplo, secuencias de CpG no metiladas como se describe en WO 96/02555. Las combinaciones de diferentes adyuvantes estimulantes de TH1, tales como aquellas mencionadas con anterioridad, se contemplan también proporcionando un adyuvante el cual es un estimulante preferencial de respuesta celular TH1. Por ejemplo, QS21 puede formularse conjuntamente con 3D-MPL. La proporción de QS21:3D-MPL se encontrará típicamente en el orden de 1:10 a 10:1; preferentemente 1:5 a 5:1 y frecuentemente substancialmente 1:1. El rango preferido para la sinergia óptima es 2.5:1 a 1:1 de 3D-MPL:QS21. En una modalidad preferida de la presente invención, la formulación de vacuna comprende una formulación de adyuvante vesicular que comprende colesterol, una saponina y un derivado de LPS. Sobre este aspecto, la formulación de adyuvante preferida comprende una vesícula unilamelar que comprende colesterol, que tiene una bicapa lípida que comprende preferentemente colina de fosfatidilo de dioleoílo, en la que la saponina y el derivado de LPS se encuentran asociados con, o incorporados dentro de la bicapa Kpida. Más preferentemente, estas formulaciones de adyuvante comprenden QS21 como la saponina, y 3D-MPL y el derivado de LPS, en el que la proporción de QS21 olesterol va desde 1:1 a 1:100 peso/peso, y muy preferentemente 1:5 peso/peso. Tales formulaciones de adyuvante se describen en EP 0 822831 B, cuya descripción se incorpora en la presente para referencia. Preferentemente, también se encuentra presente un portador en la composición de vacunas de acuerdo con la invención. El portador puede ser una emulsión de aceite en agua, estructuras lípidas tales como liposomas o colonias micelares o una sal de aluminio, tal como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio. Una emulsión preferida de aceite en agua comprende un aceite capaz de metabolizarse, tal como escualeno, alfa tocoferol y Tween 80. Además, la emulsión de aceite en agua puede contener Span 85 y/o lecitina y/o tricaprilina.
En un aspecto particularmente preferido, los antígenos en la composición de la vacuna de acuerdo con la invención se combinan con 3D-MPL y ahumbre. La administración en humanos de QS21 y 3D-MPL, típicamente se presentará en una vacuna en el rango de 1 µg - 20C^g, tal como 10-100pg, preferentemente 10µg- 50 g por dosis. El aceite en agua típicamente comprenderá escualeno desde 2 hasta 10%, alfa tocoferol desde 2 hasta 10% y Tween 80 desde 0.3 hasta 3%. Preferentemente, la proporción de escualeno: alfa tocoferol es igual a o menor que 1 dado que éste proporciona una emulsión más estable. El Span 85 puede también estar presente a un nivel de 1%. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan además un estabilizador. Las emulsiones no tóxicas de aceite en agua contienen preferentemente un aceite no tóxico, por ejemplo escualano, escualeno, y emulsor, por ejemplo Tween 80, en un portador acuoso. El portador acuoso puede ser, por ejemplo, salmuera regulada con fosfato. Una formulación de adyuvante particularmente potente que involucra QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en WO 95/17210.
Rutas transdérmicas, intradérmicas, intra-epiteliales o transcutáneas. La presente invención también puede utilizarse para inducir una respuesta inmunológica contra los antígenos virales cuando se aplican en la piel (suministro transdérmico, intradórmico, intra-epitelial o transcutáneo). Esto incluye, pero no se limita a, parches (WO97/48440, WO98/28037, WO99/64580), cremas, suministro mediado por electroporación y suministro balístico tal como por gas comprimido. Los parches pueden incluir opcionalmente dispositivos para interrumpir la integridad de la piel. El suministro ¡ntradérmico puede lograrse en humanos, por ejemplo, por la técnica convencional de inyección intradérmica, el "procedimiento Mantoux". Éste comprende los pasos para la limpieza de la piel, y después se estira con una mano, y con el bisel de una aguja de una medida estrecha (medida 26-31) orientada hacia arriba la aguja se inserta en un ángulo de entre 10 - 15°. Una vez que se inserta el bisel de la aguja, se baja el barril de la aguja y se avanza adicionalmente mientras que se aplica una ligera presión para elevarlo bajo la piel. El liquido se inyecta después muy lentamente formando así una ampolla o chichón en la superficie de la piel, seguido por el retiro lento de la aguja. Puede utilizarse cualquier adyuvante adecuado con la vacuna de la presente invención para el suministro ¡ntradérmico. Preferentemente, el adyuvante comprende MPL, QS21 y colesterol. Preferentemente, el adyuvante ¡ntradérmico comprende una formulación de adyuvante vesicular que comprende colesterol, saponina y un derivado de LPS como se describe anteriormente con respecto a la administración parenteral. Para suministro transdérmico la vacuna puede también ser adyuvante mediante la adición de toxinas ribosilantes de ADP o mutantes de las mismas.
Se apreciará que cualquiera de los adyuvantes anteriores los cuales son adecuados para cualquiera de las rutas de vacunación descritas anteriormente pueden ser adecuados también para su uso a través de cualquier otra ruta, y tales combinaciones se incluyen específicamente T individualmente en la presente invención. Las formulaciones de la presente invención pueden utilizarse para ambos propósitos profiláctico y terapéutico. Consecuentemente, la presente invención proporciona un método de tratamiento a un mamífero susceptible a o que padece de una enfermedad infecciosa, particularmente una infección del PIV o RSV o enfermedades relacionadas con tales infecciones. El método comprende la administración al mamífero de una cantidad eficaz de una formulación de vacuna de acuerdo con la presente invención. En un aspecto adicional de la presente invención ésta proporciona una vacuna como se describe en la presente para su utilización en medicina. La preparación de la vacuna se describe en términos generales en New Trends and Developments ¡n Vaccines, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, E.U.A. 1978. Las vacunas pueden suministrarse en cualquier régimen de dosificación adecuado, tal como en regímenes de una dosis o de dos dosis. La vacuna puede utilizarse en poblaciones jóvenes e imprimadas. Donde se emplea el suministro de IN, nosotros preferimos que la formulación comprenda un adyuvante y/o se entregue a individuos ya imprimados por la exposición a RSV o PIV. La presente invención se refiere adicionalmente a un método para producir una formulación de vacuna la cual comprende los pasos para: (a) dividir un virus con envolvente; (b) mezclar opcionalmente la preparación del virus con envolvente dividido con un agente estabilizador; y (c) mezclar opcionalmente la preparación del virus con envolvente con un adyuvante (portador y/o inmunoestimulante) Preferentemente el virus es RSV o PIV. Consecuentemente, el método comprende los pasos (a) y (b), (a) y (c), o (a) (b) y (c). Consecuentemente, el agente estabilizador que comprende al menos un agente tensioactivo seleccionado a partir del grupo que comprende monooleato de sorbitano de polioxietileno (TWEEN80™), t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X100™); éter de polioxietileno-9-laurilo. Opcionalmente la vacuna producida de esta manera se mezcla con un portador. La presente invención se ilustra por, pero no se encuentra limitada a, los siguientes Ejemplos y Figuras, donde: La Figura 1 ilustra un Western Blot de RSVA dividido con un anticuerpo anti F; La Figura 2 ilustra un Western Blot de RSVA dividido con un anticuerpo anti M2; La Figura 3 ilustra un Western Blot de RSVA dividido con un anticuerpo anti G; La Figura 4 ilustra un Western Blot de RSVA dividido con un anticuerpo anti N; La Figura 5 ilustra la materia prima de RSV/A visualizada por EM; La Figura 6 ¡lustra RSV/A dividido con NaDOC visualizado por EM; La Figura 7 ilustra RSV/A dividido con Sarkosyl visualizado por EM; La Figura 8 ilustra Concentraciones (Post II) de Anticuerpos de Anti-FG (ELISA) en ratones imprimados inmunizados con RSV dividido por rutas intramuscular o intranasal; La Figura 9 ilustra Concentraciones (Post II) de Anticuerpos Neutralizantes Anti-RSV/A en ratones imprimados inmunizados con RSV dividido por las rutas intramuscular o intranasal; La Figura 10 ilustra las Respuestas de Isotipo de Anti-FG IgG (Post II) en ratones imprimados inmunizados con RSV dividido por rutas intramuscular o intranasal; La Figura 11 ilustra las Concentraciones (Post I) Anticuerpos de Anti-FG (ELISA) en ratones imprimados inmunizados con RSV dividido por rutas intramuscular o intranasal; La Figura 12 ¡lustra las Concentraciones de Anticuerpos
(ELISA) de Anti-FG en ratones no imprimados inmunizados con RSV dividido por la ruta intramuscular; La Figura 13 ¡lustra concentraciones de anticuerpos neutralizantes anti-RSV/A en ratones no imprimados inmunizados con RSV dividido por la ruta intramuscular;
La Figura 14 ilustra Respuestas de Isotipo de IgG Anti-FG en ratones no imprimados inmunizados con RSV dividido por la ruta intramuscular; La Figura 15 ilustra Concentraciones de Anticuerpos (ELISA) de Anti-FG en ratones no imprimados inmunizados con RSV dividido por la ruta intranasal; La Figura 16 ilustra Concentraciones de Anticuerpos Neutralizantes Anti-RSV/A en ratones no imprimados inmunizados con RSV dividido por la ruta intranasal; La Figura 17 ilustra las Concentraciones de Anticuerpos
(ELISA) Anti-FG en conejillos de Indias imprimados; inmunizados con RSV dividido por las Rutas Intradérmicas o Intramusculares; y La Figura 18 ilustra Concentraciones de Anticuerpos Neutralizantes Anti-RSV/A en conejillos de Indias imprimados inmunizados con RSV dividido por la ruta intradérmica.
Ejemplo 1 Generación de virus divididos. Los virus con envolventes derivados a partir de una variedad de familias de virus se dividen por la adición de agentes divididos tales como los agentes tensioactivos. La división se evalúa por la caracterización de la migración de los virus divididos en gradientes de sacarosa o amortiguadores con visualización por análisis de SDS-PAGE/Western blot y por examinación directa de productos virales divididos utilizando la evaluación de microscopía electrónica. Los virus divididos descritos en estos ejemplos incluyen representantes de una variedad de familias de virus con envolventes. Por ejemplo, se evalúan los miembros de la familia Paramixoviridae (virus sincitiales A y B, virus-3 de la parainfluenza, virus de las paperas, y sarampión), familia Togaviridae (virus de rubéola) y la familia Herpesviridae (virus de Epstein Barr, citomegalovirus, o virus de herpes simple). El acto de interrupción de la partícula viral (división) se lleva a cabo por la adición de un agente de división tales como un agente tensioactivo en concentraciones solubilizadas en las preparaciones virales libres de células. En particular, los ácidos biliares y alquilglicósidos se utilizan como agentes tensioactivos. Los agentes tensioactivos, solos o en diversas combinaciones, se agregan e incuban para permitir que el proceso llegue a su término. Todos los virus se almacenan pendientes de su evaluación por microscopía electrónica. La evaluación de la división eficiente se lleva a cabo inicialmente utilizando gradiente de sacarosa o centrifugación de amortiguador. Brevemente, las muestras no tratadas o tratadas con agentes tensioactivos se aplican a gradientes/amortiguadores de sacarosa y los fragmentos analizados en geles de SDS-PAGE. La migración de todos los tipos de proteínas de virión en las fracciones solubles indica una división eficiente. Las muestras calcularon eficientemente la división por el análisis de sacarosa-SDS-PAGE se analizan adicionalmente por microscopía electrónica. Las muestras se visualizan utilizando técnicas convencionales de teñido negativo. Se llevaron a cabo los siguientes experimentos de división especifica en RSV y PIV.
1.1 Condiciones del cultivo celular. Se replicaron RSV/A/Largo humano y PIV-3 de tipo silvestre en células VERO en un proceso libre de suero estacionario. Antes de la infección, las células VERO crecieron durante 4 días hasta lograr la confluencia. Las condiciones de producción de virus se adaptaron a cada virus: MOI 0,03, 4 días para RSV/A y MOI 0.01, 5 días para PIV-3 a 37 °C. El día de la cosecha, se recuperaron los fluidos celulares después de la lisis y la adición de estabilizadores y se almacenaron inmediatamente a -70 °C,
1.2 Purificación del Virus. Después de la clarificación por centrifugación a 1000*g durante 10 min, las partículas de los virus se comprimieron a partir del sobrenadante por una precipitación de PEG 6000. El comprimido se volvió a suspender en Tris 50 mM-NaCI 50 mM-MgS04 2 mM pH de 7.5 regulador seguido de un tratamiento de benzonasa. Esta solución se ultrafiltró en una membrana AGT de 500 kD contra 5 volúmenes de salmuera regulada con fosfato, se diafiltró después contra 5 volúmenes de regulador de fosfato pH de 7.5. Se produjeron partículas virales intactas como se confirma por EM y centrifugación en un amortiguador de sacarosa como se describe en la presente, Se determinó la concentración de proteína.
1.3 División del virus Las partículas virales se dividieron por la adición de un agente de división a la preparación viral libre de células. Para ser eficaz, un detergente debe utilizarse por encima de su concentración micelar crítica, eme. Todos los detergentes se utilizaron en una concentración final superior a su valor eme. Se estudió la proporción D/P (proporción de detergente/protelna). Se alcanzó la división exitosamente con una proporción D/P = 25, lo cual se prefiere. Se utilizaron los siguientes detergentes a una concentración de 2% para dividir las partículas de virus; Desoxicolato de Sodio, Sarkosyl, Plantacare y Laureth 9. Después de la división, las soluciones se sometieron a diálisis contra el regulador de formulación (P04 10 mM/NaCI 150 mM pH 7.5) para la extracción del exceso de detergente. El proceso de división se resume a continuación:
RSV-A: Hoja de flujo de purificación de virus Clarificación de la cosecha Centrifugación en un rotor Beckman JA10 a 3500 RPM (1000*g) +4°C durante 10 min. ? Sobrenadante clarificado 4 10% de precipitación de PEG 6000 4 1h30 a baja agitación a +4°C Centrifugación a 3500 RPM (1000*g)-20 min Comprimido resuspendido en 50 mM de Tris - 50 mM de NaCI - 2mM de MgS04 pH de 7.5 regulador. I Tratamiento de benzonasa A 125 unidad/ml Incubación mínima de 4 horas bajo agitación 4 ULTRAFILTRACIÓN: AGT - VAGE4A - 500 Kd - 420 cm2 5 vol contra P04(na) 10 mM - 150 mM de NaCI pH de 7.5 seguido por 5 volúmenes de 20 mM de P04 (Na) pH de 7.5 4 División Adición de detergente => = final al 2% - incubación O/N a temperatura ambiente bajo agitación baja i Clarificación Filtración terminal en Sartopure 300 (GF2-filtro de profundidad 1.2 µ??) 4 ULTRAFILTRACIÓN: eliminación de detergente - concentración 5 vol de 20 mM de P04(Na) pH de 7.5 después 5 vol de 10 mM de P04(Na) / 150 mM de NaCI pH de 7.5 i Masa dividida
1.4 Caracterización de virus dividido Se determinó la integridad de virus iniciales y la calidad da división por ultracentrifugación en un amortiguador de sacarosa al 30% (1h a 50000 rpm en un rotor TL1000 Beckman). Se analizaron los fragmentos por pruebas de manchado sanguíneo Western específicas; microscopía electrónica y la concentración de infectividad se realizó en algunos de estos fragmentos.
1.4.1 Ultracentrifugación: Después de rellenar a la mitad un tubo de centrifugado con la solución de sacarosa al 30% (450 µ?), la muestra (450 µ?) a analizarse se colocó suave y cuidadosamente en este amortiguador de sacarosa, después se colocó durante 4 hora a 50,000 rpm a +4°C en un rotor Beckman TL100. Después de la centrifugación, se drenó el tubo en 3 partes. La fase superior (300 µ?) se refiere como el "sobrenadante". La fase intermedia (300 µ?) es la fase de interfase entre la muestra y el amortiguador de sacarosa, llamado en la presente el "intermedio". La fase inferior (300 µ?) es la solución inferior con el comprimido resuspendido cuando se ha llevado a cabo la centrifugación en un virus entero; llamado el "comprimido". Estos 3 fragmentos se analizaron adicionalmente.
1,4.2 Análisis de manchado sanguíneo Western: Este análisis permite la integridad del virus a verificarse (fracción de comprimido positivo) y la eficacia de la división a determinarse (adecuadamente, la fracción de sobrenadante positivo para todas o para la mayoría de las proteínas estructurales tales como las proteínas de envolvente). Se utilizaron anticuerpos específicos para la caracterización de proteínas virales específicas. Para RSV-A, se analizaron los fragmentos de división y de no división para el contenido de la proteína anti F (proteína de superficie); proteína anti G (proteína de superficie); proteína anti N
(nucleocápsida) y protelna anti M (matriz). Para el virus PIV-3, se analizaron los fragmentos de división y de no división para su contenido de proteína HN con un anticuerpo monoclonal y el contenido de las proteínas F, M, HN con un anticuerpo policlonal.
1.4.3 Criterios para la división La presencia de una señal positiva de Western Blot (WB) contra las cuatro proteínas probadas en el fragmento de comprimido y en ausencia de una señal en los otros dos fragmentos antes de la división sugiere la presencia de todo un virus intacto en la preparación viral. Se consideró eficaz la división cuando se interrumpió la envolvente, y se detectaron las proteínas de envolvente en el sobrenadante y/o fragmento intermedio. Para el RSV, la división fue eficaz cuando F o G, por ejemplo, en fragmentos S o M. Preferentemente, F y G se ubicaron substancialmente en las capas S y/o M, y no en el comprimido.
1.5 Resumen de resultados: Los resultados se muestran en las Figuras 1-4 para el RSVA. En todos los resultados de Western Blot, "División-O" significa el virus antes de la división. "S", "M" y "P" se refieren a las muestras de "Sobrenadante", "Intermedio" y "Comprimido" tomadas después de la ultracentrifugación en el amortiguador de sacarosa respectivamente. La numeración de pistas es de izquierda a derecha. Los volúmenes se refieren a la cantidad de muestra depositada en los geles de SDS-PAGE. La Figura 1 ilustra un Western Blot del RSVA dividido sondeado con mAb B4 (anti-F).
En el panel superior: En el panel inferior: 1 STD 10 µ? 2 División-0 10 µ? 3 División-O-S 10 µ? 4 División-O-M 10 µ? 5 División-O-P 1 0 µ? 6 División DOC-S 1 0 µ? 7 División DOC-M 10 µ? 8 División DOC-P 1 0 µ? 9 División sarco-S 1 0 µ? 1 0 División sarco-M 10 µ? 1 1 División sarco-P 10 µ?
La Figura 2 ilustra Western Blot de RSVA sondeado con monoclonal anti-M ;
En el panel superior: En el panel superior: 1 STD 1 0 µ? 1 STD 10 µ?
2 División-0 20 µ? 2 Regulador muestra 20 µ?
3 División-O-S 20 µ? 3 División-O-S 20 µ?
4 División-O-M 20 µ? 4 División-O-M 20 µ?
5 División-O-P 20 µ? 5 División-O-P 20 µ?
6 División DOC-S 20 µ? 6 División planta-S 20 µ?
7 División DOC-M 20 µ? 7 División planta -M 20 µ?
8 División DOC-P 20 µ? 8 División planta -P 20 µ?
9 División sarco-S 20 µ? 9 División Iaureth9-S 20 µ?
1 0 División sarco-M 20 µ? 10 División Iaureth9-M 20 µ?
1 1 División sarco-P 20 µ? 1 1 División Iaureth9-P 20 µ? La Figura 3 ilustra un Western Blot de SVA dividido sondeado con un anti-G monoclonal ;
Panel superior: Panel inferior:
La Figura 4 ilustra un Western Blot de RSVA dividido sondeado con un anti-N monoclonal;
Panel superior: Panel inferior: 1 STD 10 µ? 1 STD 10 µ?
2 División-0 20 µ? 2 Regulador muestra 20 µ?
3 División-O-S 20 µ? 3 División-O-S 20 µ?
4 División-O-M 20 µ? 4 División-O-M 20 µ?
5 División-O-P 20 µ? 5 División-O-P 20 µ?
6 División DOC-S 20 µ? 6 División planta-S 20 µ?
7 División DOC-M 20 µ? 7 División planta -M 20 µ?
8 División DOC-P 20 µ? 8 División planta -P 20 µ?
9 División sarco-S 20 µ? 9 División Iaureth9-S 20 µ?
10 División sarco-M 20 µ? 1 0 División Iaureth9-M 20 µ?
1 1 División sarco-P 20 µ? 1 1 División Iaureth9-P 20 µ? La presencia de una señal en el medio y los fragmentos de sobrenadante y difícilmente cualquier banda en el fragmento de comprimido después de la división para las proteínas F y G muestra que la envolvente viral se interrumpió completamente. La presencia de una señal en todos los fragmentos para las proteínas N y M muestra la presencia de estas proteínas en las preparaciones de división. Estos resultados sugieren que los cuatro detergentes probados conducen a un virus de división de RSVA. El análisis de las señales contra las cuatro proteínas en todos los fragmentos y en particular las señales comparativas contra las proteínas N y M después de la división en el medio y los fragmentos de sobrenadante sugiere que, en las condiciones probadas, NaDOC y Sarkosyl no conducen solamente a dividir el virus sino que también son capaces de interrumpir todas las estructuras virales y solubilizar las proteínas estructurales y no estructurales. Se obtuvieron resultados similares con el PIV dividido. NaDoc y Sarkosyl son agentes de división preferidos para todos los virus.
1.6 Concentraciones virales in vitro La pérdida de integridad después de la división hace no infeccioso al virus. El análisis de la interrupción exitosa del RSVA y el PIV3 se muestra por la pérdida de 106 log o más en concentraciones virales después de la división.
1.7 Análisis de microscopía electrónica El análisis de microscopía electrónica se llevó a cabo utilizando un método convencional de teñido negativo de dos pasos que utiliza fosfotungsteno de Na como agente contrastante (Hayat y Miller, 1990, Negative Staining, McGraw, ed. Hill). Se examinaron las rejillas para evaluar el patrón de teñido del material. El análisis por microscopía electrónica del RSVA de división de NaDoc o Sarkosyl y de no división y preparaciones del virus PIV3 apoya las observaciones realizadas por el análisis Western Blot. Para ilustrar los resultados, se muestran los datos de RSV. La Figura 5 ilustra el virus RSVA antes de la división. Las Figuras 6 y 7 muestran la división del virus RSVA con NaDOC o Sarkosyl respectivamente. El virus de no división (virus intacto incompleto) contuvo relativamente bien preservadas o ligeramente dañadas partículas virales y un poco de material amorfo. Los virus de división NaDoc o Sarkosyl mostraron que la apariencia de una dispersión heterogénea de material amorfo, agregada en cierto grado, con pocas estructuras identificables derivadas de la envolvente viral u origen nucleoprotóico. Se obtuvieron datos similares con el PIV.
Ejemplo 2. Inmunogenicldad de vacunas divididas en ratones. Las preparaciones de RSV y/o PIV divididas se utilizan como inmunogenes para vacunar ratones a fin de evaluar la inmunogenicidad de estas preparaciones. Brevemente, los ratones hembras de 8 semanas de edad se inmunizan con las preparaciones de vacunas. Se investigan las rutas parenterales, mucosales e ID de inmunización. Los adyuvantes varían dependiendo de la ruta de administración. En todos los casos se incluye un control sin adyuvante. Se aplican dos dosis en un intervalo de varias semanas. Dos semanas después de la dosis final, se sacrifican los animales y se enjuagan la sangre, las células de bazo, y/o los enjuagues nasales. La respuesta inmunológica humoral de virus específico en suero se evalúa al probar el suero de ratón en pruebas de ELISA de virus especifico. Además, el perfil de isotipo de la respuesta de anticuerpo se determina utilizando pruebas de Isotipo específico. La presencia de anticuerpos neutralizantes en el suero se evalúa utilizando una prueba de neutralización de virus específico. La inducción de una respuesta inmunológica local relevante puede evaluarse por la prueba de los anticuerpos neutralizantes en los enjuagues nasales o alternativamente la prueba de IgA de virus específico en los enjuagues nasales. La inducción de las respuestas inmunológicas celulares de virus especifico se evalúa por la estimulación in vitro de células de bazo cosechadas y medición de proliferación celular (captación de timidina tritiada) y/o secreción de IL-5 e IFNy por las células estimuladas. El impacto de las variables en el experimento puede evaluarse con atención específica pagada a la calidad y la magnitud de la respuesta inducida por las formulaciones divididas. El RSV dividido se probó a manera de ejemplo.
2.1 Formulaciones de RSV dividido La siguiente serie de experimentos ejemplifica que el RSV dividido induce una potente respuesta inmunológica cuando se administra por las rutas intramuscular (IM), intranasal (IN), o intradérmica (ID). Con objeto de reflejar con más precisión el estado inmunológico sea de una población pediátrica (joven) o envejecida (imprimada), se evaluó la inmunogenicidad sea en animales imprimados o no imprimados y se demostró la inmunogenicidad en ambas poblaciones. En el primer conjunto de los experimentos, se utilizaron ratones Balb/c hembras de 8 semanas de edad para probar la inmunogenicidad de la preparación de RSV dividido administrada sea por rutas IM o IN. La imprimación se realizó por la administración de unidades de formación de placas 3*105 (pfu) de virus RSV vivos administrados intranasalmente en un volumen de 60 µ? (2*30 µ?). Tres semanas después de la imprimación, se vacunaron los animales con antígeno dividido de RSV. La cuantificación del producto dividido de RSV se basó en un ELISA específico de protelna F de RSV el cual cuantifica la proteína F en el producto dividido comparada con una norma de proteína G recombinante. Los ratones del Grupo A se inmunizaron con 2 dosis de antígeno dividido de RSV con contenido de
4.2 pg de protelna F en 100 µ? administrada por la ruta intramuscular con un intervalo de 21 días. Los ratones del Grupo B se inmunizaron con 2 dosis de antígeno dividido de RSV con contenido de 4.2 pg de proteína F con un adyuvante de 50 pg de AI(OH)3 administrados en 100 µ? por la ruta intramuscular con un intervalo de 21 días. Los ratones del Grupo C se inmunizaron con una primera dosis de antígeno dividido de RSV con contenido de 2.7 pg de proteína F en 60 µ? y una segunda dosis administrada 21 días después del antígeno dividido de RSV con contenido de 4 pg de proteína F en 60 µ? por la ruta ¡ntranasal. Dos semanas después de la última dosis se sacrificaron todos los animales y se evaluó la respuesta inmunológica. Los resultados del experimento se resumen en las Figuras 8-18. Las primeras lecturas inmunológicas utilizadas para evaluar la respuesta inmunológica fueron las pruebas ELISA las cuales miden el total de inmunoglobulina (Ig) de FG específico del RSV o los isotipos de IgG de FG específico (IgG, e lgG2A) presentes en los sueros de animales vacunados. En estas pruebas se envuelven platos de 96 cavidades con antígeno de FG de RSV recombinanta y los sueros de animal se diluyen serialmente y se aplican a las cavidades envueltas. El anticuerpo unido se detecta por la adición de una Ig, IgG^ o lgG2A de anti-ratón biotinilada, seguida de una amplificación con estreptavidina conjugada con peroxidasa. El anticuerpo unido se revela después de la adición de substrato de OPDA, seguida de tratamiento con 2N de H2S04 y la medición de la densidad óptica (OD) a 490 nm. La concentración de anticuerpo se calcula a partir de una referencia que utiliza el software SoftMax (utilizando una ecuación de cuatro parámetros) y se expresa en EU/ml. Además de las pruebas ELISA, se incluyeron las pruebas de neutralización para caracterizar adicionalmente la calidad de la respuesta inmunológica inducida por las inmunizaciones. Para la prueba de neutralización, se incubaron diluciones de dos pliegues de sueros animales con el virus RSV/A (3000 pfu) y complemento de conejillo de Indias durante 1 hora a 37°C en platos de cultivo de tejido de 96 cavidades. Las células Hep-2 (104 células/cavidad) se agregaron directamente a cada cavidad y se incubaron las placas durante 4 días a 37°C. Se aspiraron los sobrenadantes y se agregó una solución WST-1 comercialmente disponible a cada cavidad. Las placas se incubaron durante 18-24 horas adicionales a 37°C. La OD se monitoreó a 450 nm y la concentración se analizó por análisis de regresión lineal. La concentración reportada es el inverso de la dilución de suero lo cual dio como resultado una reducción del 50% de la OD máxima observada para células no infectadas. La Figura 8 muestra los resultados obtenidos utilizando la lectura total de ELISA de Ig. En los ratones imprimados se indujo una potente respuesta de anticuerpo anti-FG por 2 vacunaciones con antlgeno de RSV dividido administrado vía IM (Grupos A, B) o IN (Grupo C). Para la vacunación IM hubo una tendencia hacia la intensificación de la magnitud de la respuesta inmunológica tras el uso del adyuvante con AI(OH)3. Específicamente, la Figura 8 muestra las concentraciones (ELISA) del anticuerpo anti-FG (vacunación post secundaria) en ratones imprimados con RSV vivo e inmunizado con RSV dividido por las rutas intramuscular (IM) o intranasal (IN). El Grupo A recibió 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido IM. El Grupo B recibió 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido con coadyuvante de alumbre IM. El Grupo C recibió 2 dosis de 2.7 y 4.0 pg respectivamente de RSV dividido IN. La Figura 9 muestra los resultados de la prueba de neutralización para las muestras de la Figura 8, Se indujo una potente respuesta de anticuerpo neutralizante de virus en estos animales imprimados sea por vacunación IM o IN con 2 dosis del producto RSV dividido y una tendencia similar para el aumento de la respuesta en el grupo adyuvante de alumbre como se observa con la lectura de ELISA. Específicamente, la Figura 9 muestra las concentraciones de anticuerpo Neutralizante Anti-RSV/A (vacunación post secundaria) en ratones imprimados con RSV vivo e inmunizados con RSV dividido por las rutas intramusculares (IM) o intranasales (IN). El Grupo A recibió 2 dosis de 4.2 pg cada una de IM de RSV dividido. El grupo B recibió 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido con adyuvante de IM de alumbre. El Grupo C recibió 2 dosis de 2.7 y 4.0 pg respectivamente de IN de RSV dividido. La Figura 10 muestra los resultados del análisis de isotipos para las muestras de las Figuras 8 y 9. En animales imprimados intranasalmente se aumenta la proporción de 19028:190, para comparar con los datos subsecuentes (Figura 14) generados en ratones no imprimados, sugiriendo una tendencia hacia una respuesta de tipo más Th1 cuando se imprimen los ratones con el virus vivo (es decir, situaciones naturales en poblaciones envejecidas). Específicamente, la Figura 10 muestra respuestas (ELISA) de Isotipo Anti-Fg IgG (vacunación post secundaria) en ratones imprimados con RSV vivo e inmunizados con RSV dividido por las rutas intramusculares (IM) o intranasales (IN). El Grupo A recibió 2 dosis de 4.2 pg cada una de IM de RSV dividido. El grupo B recibió 2 dosis de 4.2 pg de cada una de RSV dividido con adyuvante de IM de alumbre. El Grupo C recibió 2 dosis de 2.7 y 4.0 pg respectivamente de IN de RSV dividido. La Figura 11 demuestra que incluso después de una sola dosis de antfgeno se genera una fuerte respuesta inrnunológica en respuesta a la vacunación IM o IN con RSV dividido en poblaciones imprimadas. Consecuentemente, en las poblaciones imprimadas el RSV dividido es un poderoso inmunogen que induce respuestas de anticuerpo de concentración alta después de cualquier vacunación IM o IN. Específicamente, la Figura 11 muestra las concentraciones (ELISA) de anticuerpo Anti-FG (vacunación post primaria) en ratones imprimados con RSV dividido e inmunizados con RSV dividido por las rutas intramusculares (IM) o intranasales (IN). El Grupo A recibió 2 dosis de 4,2 pg cada una de IM de RSV dividido. El grupo B recibió 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido con adyuvante de IM de alumbre. El Grupo C recibió 2 dosis de 2.7 y 4.0 pg respectivamente de IN de RSV dividido. El Grupo D solamente se imprimó y no recibió una vacunación - las concentraciones de anticuerpo reportadas para este grupo son los 21 días después de la imprimación. En la segunda serie de experimentos se utilizaron ratones no imprimados para documentar el efecto de la dosis de antígeno y el adyuvante en la inmunogenicidad del producto de RSV dividido. Los ratones se inmunizaron con contenido de antígeno RSV dividido 4.2 (dosis alta) o 0.42 pg (dosis baja) de proteína F administrada en 100 µ? por la ruta IM. Las formulaciones de RSV dividido IM en ambas dosis de antígeno se administraron sin adyuvante o se utilizó como adyuvante la adición de 50 pg de AI(OH)3, o una formulación de adyuvante vesicular que comprende colesterol, 3dMPL y QS21 como se describe en EP0822831, referida en la presente como DQ 3DMPL. Un grupo de control recibió todo el virus RSV purificado con contenido de 3.4 pg de proteína F administrada también en 100 pl por la ruta IM. A una segunda dosis de cada formulación (idéntica toda a la primera inyección excepto todo el grupo de virus purificado el cual recibió una preparación con contenido de 4.2 pg de proteína F) se le administró IM 30 días después. Dos semanas después de la última dosis se sacrificaron todos los animales y se evaluó la respuesta inmunológica. La Figura 12 resume la respuesta de Ig de FG específico en estos animales. Se indujo una potente respuesta inmunológica en animales inmunizados sea con dosis alta o baja de proteína F cuando se utilizó DQ/3DMPL como adyuvante y se administró por la ruta IM. Los niveles inferiores de anticuerpo se indujeron por el alumbre utilizado como adyuvante o las formulaciones no utilizadas como adyuvante administradas por la ruta IM. En todos los casos hubo una respuesta de dosis aparente dado que la dosis de antígeno baja induce niveles inferiores de anticuerpo que la dosis de antigeno alta. Los niveles de anticuerpo inducidos por la dosis alta de todo el virus fueron similares a lo inducidos por la dosis inferior de RSV dividido utilizando como adyuvante DQ/3DMPL. Específicamente, la Figura 12 muestra concentraciones (ELISA) de anticuerpo de Anti-FG (vacunación post secundaria) en ratones no imprimados inmunizados con RSV dividido por la ruta intramuscular (IM). El Grupo A recibió 2 dosis de 0.42 pg cada una de RSV dividido. El grupo B recibió 2 dosis de 0.42 pg cada una de RSV dividido con adyuvante de alumbre. El Grupo C recibió 2 dosis de 0.42 pg cada una de RSV dividido con coadyuvante de DQ/3DMPL. El Grupo D recibió 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido. El Grupo E recibió 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido con coadyuvante de alumbre. El Grupo F recibió 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido con coadyuvante de DQ/3DMPL. El Grupo G recibió 2 dosis de 3.4 y 4.2 pg respectivamente de virus RSV purificado completo. Se obtuvieron resultados similares cuando se utilizó la lectura de neutralización de virus en las muestras de la Figura 12 (Figura 13). La Figura 13 muestra concentraciones de anticuerpo neutralizante Anti-RSV/A (vacunación post-secundaria) en ratones no imprimados inmunizados con RSV dividido por la ruta intramuscular (IM). El Grupo A recibió 2 dosis de 0.42 pg cada una de RSV dividido. El grupo B recibió 2 dosis de 0.42 pg cada una de RSV dividido con adyuvante de alumbre. El Grupo C recibió 2 dosis de 0.42 pg cada una de RSV dividido con coadyuvante de DQ/3DMPL. El Grupo D recibió 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido. El Grupo E recibió 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido con coadyuvante de alumbre. El Grupo F recibió 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido con coadyuvante de DQ/3DMPL. El Grupo G recibió 2 dosis de 3.4 y 4.2 pg respectivamente de virus RSV purificado completo. El análisis de los ¡sotipos de IgG inducidos por estas formulaciones (Figura 14) reveló que mientras las formulaciones sin adyuvante y con adyuvante de alumbre inducen una respuesta típicamente de tipo Th2 en ratones no imprimados, además de DQ/3DMPL a la formulación da como resultado un cambio hacia una respuesta más de tipo Th1 con una proporción creciente de lgG2a:lg i. Esto es similar al perfil observado en animales imprimados vacunados con las formulaciones sin adyuvantes o con adyuvante de alumbre (Figura 10). Consecuentemente, en los ratones no imprimados la vacunación IM con RSV dividido induce respuestas de anticuerpo fuertes que pueden aumentarse por la adición de adyuvantes. Específicamente, la Figura 14 muestra respuestas (ELISA) de Isotipo de IgG anti-FG (vacunaciones post secundarias) en ratones no imprimados inmunizados con RSV dividido por la ruta intramuscular (IM). El Grupo A recibió 2 dosis de 0.42 pg cada una de RSV dividido. El grupo B recibió 2 dosis de 0.42 pg cada una de RSV dividido con adyuvante de alumbre. El Grupo C recibió 2 dosis de 0.42 pg cada una de RSV dividido con coadyuvante de DQ/3D PL. El Grupo D recibió 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido. El Grupo E recibió 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido con coadyuvante de alumbre. El Grupo F recibió 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido con coadyuvante de DQ/3DMPL. El Grupo G recibió 2 dosis de 3.4 y 4.2 pg respectivamente de virus RSV purificado completo. Las inmunizaciones similares se realizaron en ratones no imprimados por la ruta IN. En este caso, los ratones recibieron antígeno de RSV dividido con contenido de 2.4 pg de proteína F (suministrada en 60 µ I — 2*30 µ?) para la primera dosis. Para la segunda dosis suministrada 30 días después, los ratones recibieron antígeno de RSV dividido con contenido de 3.5 pg de protelna F. El RSV dividido IN se administró sea sin adyuvante o con adyuvante por adición de 5 pg de toxina lábil E. coli (LT) o con éter de polioxietilen-9-laurilo al 0.5% (en la presente "Laureth 9"). Se inmunizó un grupo de control intranasalmente con el virus RSV purificado completo con contenido de 2.0 pg de protelna F en la primera dosis y 3.5 pg de proteína F en la segunda dosis. Dos semanas después de la vacunación final se sacrificaron los animales y se evalúo la respuesta inmunológica, Como se muestra en las Figuras 15 y 16, las respuestas de anticuerpo se inducen por las formulaciones IN en ratones no imprimados. Mientras la lectura de ELISA (Figura 15) sugiere que las respuestas a la vacunación IN son ligeramente más débiles que las inducidas por la IM, la lectura de neutralización (Figura 16) sugiere que la formulación IN de RSV dividido con adyuvante de LT es al menos tan buena como la IM para inducir anticuerpos neutralizantes y que las demás formulaciones son también comparables con la IM. Consecuentemente, en los ratones no imprimados el RSV dividido administrado por la ruta IN también es inmunogénico. Específicamente, la Figura 15 muestra las concentraciones (ELISA) de anticuerpo anti-FG (vacunación post secundaria) en ratones imprimados inmunizados con RSV dividido por las rutas intranasal (IN) o intramuscular (IM). El Grupo A recibió 2 dosis de 2.4 y 3.5 pg cada una de RSV dividido IN. El grupo B recibió 2 dosis de 2.4 y 3.5 pg cada una de RSV dividido con adyuvante de Laureth 9 IN. El Grupo C recibió 2 dosis de 2.4 y 3.5 pg cada una de RSV dividido con coadyuvante de LT IN. El Grupo D recibió 2 dosis de 2.0 y 3.5 pg cada una de virus purificado completo IN. El Grupo E recibió 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido IM. La Figura 16 muestra las concentraciones de anticuerpo neutralizantes anti-RSV/A (vacunación post secundaria) en ratones no imprimados inmunizados con RSV dividido por las rutas intranasal (IN) o intramuscular (IM). El Grupo A recibió 2 dosis de 2.4 y 3.5 pg cada una de RSV dividido IN. El grupo B recibió 2 dosis de 2.4 y 3.5 pg cada una de RSV dividido con adyuvante de Laureth 9 IN. El Grupo C recibió 2 dosis de 2.4 y 3,5 pg cada una de RSV dividido con coadyuvante de LT IN. El Grupo D recibió 2 dosis de 2.0 y 3.5 pg cada una de virus purificado completo IN. El Grupo E recibió 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido IM. Se evaluó la inmunogenicidad del antígeno del RSV dividido cuando se administra por la ruta ID en conejillos de Indias. La viabilidad de inyección ID verdadera en esta especie se ha confirmado por la inyección de tinta de la India en la dermis y la examinación histológica de los tejidos (datos no mostrados). Nuevamente, en un esfuerzo por estimular el estado inmunológico encontrado en poblaciones envejecidas (es decir, imprimado contra RSV), los conejillos de Indias de Hartley (5 por grupo) se imprimaron sea con el virus RSV vivo (5* 1 05 pfu administrado IN en 100 µ? -d?µ?/fosa nasal; Grupos A-E) o con virus RSV completo purificado (con contenidod e 6 pg de proteína F administrada I en 1 00 µ? ; Grupos F-J). Se administraron dos dosis equivalentes de vacuna el Día 21 y el Día 42 después de la imprimación. Los Grupos A y F recibieron la preparación de RSV dividido con contenido de 4.2 pg de proteína F administrada por la ruta I D. Los Grupos B y G recibieron la preparación del RSV dividido con contenido de 0.84 µ9 de proteína F adm inistrada por la ruta I D. Los Grupos C y H recibieron la preparación del RSV dividido con contenido de 4.2 pg de proteína F con adyuvante de DQ/3DMPL administrada por la ruta I D. Los Grupos D ? I recibieron la preparación de RSV dividido con contenido de 0.84 pg de proteína F con adyuvante de DQ/3DMPL administrada por la ruta ID . Los Grupos E y J recibieron la preparación del RSV dividido con contenido de 4.2 µ g de proteína F administrada por la ruta IM. Los animales fueron sangrados 3 semanas después de la primera dosis de vacuna y 2 semanas después de la segunda dosis de vacuna y se evaluó la respuesta inmunológica. Los resultados de este experimento se resumen en las
Figuras 1 7 y 1 8. La Figura 1 7 muestra la respuesta inmunológica específica de FG detectada en los sueros de conejillos de Indias durante el transcurso del experimento. LA ELISA de FG específico utilizada para las pruebas de conejillos de Indias fue similar a la ELISA de ratón en que las cavidades se envolvieron con FG recombinante y los sueros animales se diluyeron y aplicaron a las cavidades envueltas. Sin embargo, en esta prueba el anticuerpo unido se detecta por con Ig anticonejillo de India conjugada de peroxidasa de rábano picante, seguida de adición de substrato y revelación como se describió anteriormente. Para todos los grupos se observa una respuesta débil a la imprimación, que permite una observación clara de una respuesta aumentada en la vacunación sea por la ruta ID o IM. Se observa claramente un aumento después de la vacunación primaria y es evidente un aumento adicional después de la vacunación secundaria en todos los grupos excepto el Grupo H donde se han colocado las concentraciones en placas. Se observa un claro aumento en la magnitud de la respuesta tras la aplicación del adyuvante (Grupos C, D, H, I). No se observan efectos claros de la dosis de antígeno en este experimento y 1/5 de la dosis administrada por la ruta ID parece funcionar tan bien como una dosis completa administrada por la ruta IM incluso sin la aplicación del adyuvante. La Figura 18 que resume los datos de neutralización muestra tendencias similares. Consecuentemente, en una población imprimada (sea imprimada por infección de virus vivo o por la administración del virus completo purificado) una dosis sencilla de RSV dividido administrada por la ruta ID es fuertemente ¡nmunogenica y esta respuesta puede aumentarse adicionalmente por una segunda dosis de vacuna. Específicamente, la Figura 17 muestra las concentraciones (ELISA) de anticuerpo Anti-FG en conejillos de Indias imprimados inmunizados con RSV dividido por las Rutas intradérmica (ID) o ¡ntramuscular (IM). Los Grupos A-E se imprimaron con el virus RSV vivo. Los Grupos F-J se imprimaron con el virus completo purificado. Para la vacunación de los Grupos A y F se recibieron 2 dosis de 0.84 µ? cada una de RSV dividido ID. Los Grupos B y G recibieron 2 dosis de 4.2 cada una de RSV dividido ID. Los Grupos C y H recibieron 2 dosis de 0.84 µ9 cada una de RSV dividido con adyuvante de DQ/3DMPL ID. Los Grupos D e I recibieron 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido con adyuvante de DQ/3DMPL ID. Los Grupos E y J recibieron 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido IM. La Figura 18 muestra las concentraciones de anticuerpo neutralizante Anti-RSV/A en los conejillos de Indias imprimados inmunizados con RSV dividido por las Rutas intradérmica (ID) o intramuscular (IM). Los Grupos A-B se imprimaron con el virus RSV vivo. Los Grupos F-J se imprimaron con el virus completo purificado. Para la vacunación, los Grupos A y F recibieron 2 dosis de 0.84 pg cada una de RSV dividido ID. Los Grupos B y G recibieron 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido ID. Los Grupos C y H recibieron 2 dosis de 0.84 pg cada una de RSV dividido con adyuvante con DQ/3DMPL ID. Los Grupos D e I recibieron 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividida con adyuvante de DQ/3DMPL ID. Los Grupos E y J recibieron 2 dosis de 4.2 pg cada una de RSV dividido IM. En resumen, estos experimentos han demostrado que el antígeno de RSV dividido es fuertemente inmunogénico tanto en poblaciones jóvenes como imprimadas. Además, estos experimentos han demostrado que el RSV dividido puede administrarse por una variedad de rutas que incluyen la intramuscular, intranasal e intradérmica y en todos los casos es inmunogénica. La adición de adyuvantes puede aumentar las respuestas de anticuerpos en algunos casos y/o inducir un cambio en el perfil de la respuesta de una respuesta de tipo Th2 a una de tipo Th1.
Claims (29)
1. Una formulación de vacuna caracterizada porque comprende una preparación del virus RSV con envolvente dividido en el que la preparación del virus con envolvente dividido comprende fragmentos de membrana viral, proteínas de envolvente de membrana viral, matriz viral y nucleoproteínas.
2. Una formulación de vacuna según la reivindicación 1, caracterizada porque la preparación de vacuna comprende además otro virus dividido seleccionado a partir del grupo que consiste en: virus de la influenza, virus sincitial respiratorio, virus de la parainfluenza, metaneumovirus, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de Epstein Barr, virus del herpes, citomegalovirus, virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis transmitida por garrapata, virus de la encefalitis Japonesa, virus de la rubéola, virus de la encefalitis equina occidental, oriental y Venezolana; y virus de la inmunodeficiencia humana.
3. Una formulación de vacuna según la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque comprende adicionalmente uno o más agentes de división residuales.
4. Una formulación de vacuna según la reivindicación 3, caracterizada porque el agente de división residual se selecciona a partir del grupo que consiste en: laureth 9, NaDOC, grupo Sarcosilo, Tween 80™ y Tritón X100™.
5. Una formulación de vacuna según la reivindicación 4, caracterizada porque el agente de división residual es NaDOC o Sarkosyl.
6. Una formulación de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 caracterizada porque comprende además un agente estabilizador.
7. Una formulación de vacuna según la reivindicación 6, caracterizada porque el agente estabilizador es un agente tensioactivo.
8. Una formulación de vacuna según la reivindicación 7, caracterizada porque el agente tensioactivo es o solamente una mezcla de monooleato de sorbitano de polioxietileno (TWEEN80™), t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X100™) y éter de polioxietileno-9-laurilo.
9. Una formulación de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizada porque la vacuna se formula para suministrarse intranasalmente.
10. Una formulación de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 caracterizada porque la vacuna se formula para suministrarse intramuscularmente o subcutáneamente.
11. Una formulación de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1-8 caracterizada porque la vacuna se formula para suministrarse a través de la ruta transdérmica, intradérmica, intra-epitelial o transcutánea.
12. Una formulación de vacuna según la reivindicación 11, caracterizada porque la vacuna se formula para el suministro intradórmico.
13. Una formulación de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizada porque comprende además un adyuvante.
14. Una formulación de vacuna según la reivindicación 13, caracterizado porque el adyuvante es éter de polioxietileno-9-laurilo.
15. Una formulación de vacuna según la reivindicación 13, caracterizada porque el adyuvante es un estimulante preferencial de respuesta de células TH1.
16. Una formulación de vacuna según la reivindicación 15, caracterizada porque el estimulador preferencial de la respuesta de células TH1 se selecciona a partir del grupo de adyuvantes que comprende: 3D-MPL, QS21, una mezcla de QS21 y colesterol, un oligonucleótido de CpG y combinaciones de los mismos.
17. Una formulación de vacuna según la reivindicación 16, caracterizada porque el adyuvante es una formulación adyuvante vesicular que comprende colesterol, una saponina y un derivado LPS.
18. Una formulación de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizada porque comprende además un portador.
19. Un método para producir una formulación de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones precedentes caracterizado porque comprende los pasos para (a) dividir un virus con envolvente RSV; (b) mezclar opcionalmente la preparación del virus con envolvente dividido con un agente estabilizador; y (c) mezclar opcionalmente la preparación del virus con envolvente dividido con un adyuvante
20. Un método para producir una formulación de vacuna según la reivindicación 19, caracterizado porque la preparación de virus dividido se mezcla con un agente estabilizante, comprendiendo el agente estabilizante al menos un agente tensioactivo seleccionado a partir del grupo que comprende monooleato de sorbitano de polioxietileno (TWEEN80™); t-octilfenoxipolietoxietanol (TRITON X100™); éter de polioxietileno-9-laurilo.
21. El uso de una preparación de vacuna de RSV dividido en la elaboración de una vacuna.
22. El uso de una preparación de vacuna de RSV dividido en la elaboración de una formulación de vacuna para la profilaxis o tratamiento de la enfermedad.
23. Un juego para el suministro de una formulación de vacuna intranasal según cualquiera de las reivindicaciones 1-18 caracterizado porque comprende: (a) una preparación de virus con envolvente RSV dividido; y (b) un dispositivo de suministro intranasal.
24. Un dispositivo de suministro intranasal caracterizado porque comprende una formulación de vacuna dividida según cualquiera de las reivindicaciones 1-18.
25. Un método para proteger o tratar un mamífero susceptible a, o que padece la enfermedad ocasionada por el RSV, caracterizado el método porque comprende administrar una cantidad eficaz de una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1-18.
26. Un método según la reivindicación 25, caracterizado porque la vacuna se administra por la ruta intradérmica o intranasal.
27. El uso de una preparación de vacuna de RSV dividido en la elaboración de una formulación de vacuna para el suministro intranasal o intradórmico.
28. Una formulación, método, uso, juego, o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizados porque la formulación de vacuna es inmunogénica.
29. Una formulación, método, uso, juego, o dispositivo según la reivindicación 28, caracterizados porque la formulación de vacuna es inmunogénica tanto en individuos seropositivos como seronegativos.
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