CZ2002341A3 - Chrupavková membrána a její použití - Google Patents

Description

Předložený vynález se týká způsobu a materiálů pro reparování defektů chrupavky nebo kosti a defektů chrupavky v kloubech in vivo u savců, jako například lidí a koní.

Dosavadní stav techniky

Každý rok se v USA a Evropě dohromady u lidí provádí více než jeden milion artroskopických procedur a totálních kloubních náhrad. V tomto počtu je zahrnuto ročně v USA kolem 90 000 totálních kolenních náhrad a kolem 50 000 oprav defektů v samotném koleně (viz: Praemer A,, Furner S., Rice D.P., Musculoskeletal Condition in the United States, Park Ridge, III.: American Academy of Orthopaedic Surgeon, 1992, 125).

Mezi různými koňskými chovy v USA a v Evropě je kolem pěti milionů registrovaných „drahých závodních plnokrevných koní pro koňské dostihy, z nichž odhadem 60 % je přímo nebo nepřímo v majetku U.S. vlastníků koní. Ve všech chovech plnokrevníků je nejfrekventovanější bolestí degenerativní onemocnění kloubů, nejčastěji ve formě osteochondritis dissecans (OCD). Nejčastěji postiženým kloubem je kolenní kloub (femoropatelární kloub, zadní noha). Nejobvyklejší věk pro koně a zvláště závodní koně pro rozvinutí OCD je mezí stářím 1 a 6 let. Čím dříve (ve stáří 1 roku nebo méně) se s tréninkem plnokrevníků začíná, tím častěji se onemocnění bude objevovat.

Ve většině případů s klinickými symptomy se obvykle používá operace počítaje v to artroskopický zásah. Kolem 64 % ošetřených koní se vrací do svého předchozího uplatnění (dostihy atd.). Přibližně 35 % koní se do předchozího uplatnění při dostizích vrátit nemůže nebo má menší schopnosti dosahovat při dostizích stejné dřívější úrovně.

Druhý stav, který lze zaznamenat, popisovaný jako OCD, je fragmentace na proximální nebo plantární straně prvního prstového článku vzadu na nártním kloubu nebo spěnkové kosti. Třetí s častým traumatem závodních koní související stav je poškození chrupavky u kondyl hlezenní kosti, které vlastně pravým OCD není. U

4 4 4 ·♦ * 4 4 «· • ♦44 · · · · 4 ♦ ♦ ♦ •44 4 9 · · · * ♦ 4 4 · 4 4 ···« 4

444 4* 4 444

4444 »4 44 444 ·· 4444 bederních kloubů postihuje OCD často velké oblasti povrchu kloubu a obvyklá je sekundární osteoarthritis.

Konservativní nebo medikamentozní ošetřování má pouze omezený účinek a zaměřuje se hlavně na zbavování koně bolesti. Typickými léky jsou nesteroidní protizánětlivá léčiva (NSAID). Operace beder je obtížná vzhledem k hloubce kloubu v místě pod svalovinou.

Účinek na obnovu koňské kloubní chrupavky léčbou pomocí polysulfatovaného glykosaminoglykanu (PSGAG) nebo hyaluronátu sodného (SH) byl testován na Ohio State University, College of Veterinary Medicine, Columbus, Ohio. Výsledky této studie při srovnávání s kontrolami s fysiologickým roztokem neukázaly žádný účinek blahodárný účinek na klinické parametry, celkové příznaky nebo mikroskopický vzhled defektů. Některé náznaky z této studie naznačují, že intra-artikulární PSGAG může na léčení kloubní chrupavky mít škodlivý účinek.

Abnormalitami kostí a kloubů, které mohou anebo nemusí způsobovat zchromnutí, je obvykle shledáván výskyt subchondrálních cystických poškození, nazývaných také kostní cysty nebo kostní poškození cystám se podobající. Nejobtížnější cysty jsou kloubní cysty. Existuje spor pokud se týče toho, zda tato poškození jsou manifestací osteochondritidy následkem poranění kloubu nebo kombinací zátěže a úrazu.

Lidská kloubní chrupavka není schopná podstupovat šamoobnovu, protože chondrocyty ztrácejí svoji mitotickou schopnost během prvního roku života. Lze předpovídat, že defekty kloubní chrupavky, zvláště u kloubů nesoucích hmotnost, se budou osteoartritidou zhoršovat. Tomuto zhoršování není možné zabránit žádnou konvenční metodou.

Vrtání subchondrální kosti může vést k tvorbě vazivové chrupavky, která není houževnatá a může být považována pouze za dočasnou obnovu, jež zvolna degraduje. Studie na zvířatech ukázaly, že zavedením prudce se množících chondrocytů, jako kloubních chondrocytů, se mohou kloubní defekty spolehlivě rekonstruovat (Robinson D., a spol., Isr. Med. Ass. J., 2000, 2 : 290).

Autologická implantace chondrocytů (ACI) se prokázala jako klinicky efektivní při obnově hyalinu podobné chrupavky lidského kolena u isolovaných patologických chondrálních poškození v celé tlouštce. Několik autorů provedlo u lidí implantaci chondrocytů s vynikajícími výsledky ( Brittberg a spol., 1994 New Engl, J. Med.; MinasT., Am. J. Orthop., 1998, 11 : 739).

·· ♦ · · · ·» * • · φ i · · · · · ·« • ·· · · · · ·

1 » · · « · » · ·

Metoda regeneračního ošetřování chrupavky by mohla být výhodou a mohla by být prováděna v ranném stadiu poškození kloubu, snižujíc tak počet lidí potřebujících operaci náhrady umělým kloubem. Dříve bylo zkoušeno čistění a obnovování povrchu struktury chrupavky aplikací vrtání, obrušování atd., čímž byla odstraněna chorobná chrupavka a dokonce i subchondrální kost [Insall, J. Clin. Orthop., 1974, 101: 61; Ficat R.P. aspol., €lin. Orthop., 1979, 144 : 74; Johnson L. L. v Operative Arthroscopy, (McGinty J.B., Editor), New York, Raven Press, 1991, 341].

Jiné metody jako přišití plátku okostice (odebrané na příklad z holenní kosti) přes defekt, byly použity bud jako ošetřovací procedura sama o sobě, nebo byla

v.

použita ve spojení s implantací vypěstovaných (např. autologických) chondrocytů. Metody, které tuto kombinaci využívají byly vyvinuty hlavně Brittbergem a spol. (Brittberg M. a spol., New Engl. J. Med., 1994, 331: 889).

Buňky kultivované aplikováním způsobů popsaných Brittbergem a spol., New Engl. J. Med., 1994, 331: 889, jsou využívány pro autologickou implantaci do kolenních kloubů pacientů. Kurt Osther a spol. v U. S. patentu č. 5,759,190 popsali překrytí kosti, které může být teoreticky využíváno při poškozeních typu osteoartritidy, aby se zabránilo krvácení a množení kmenových buněk z obnažené pórovité kosti ležící pod tím. Překrytí je vytvořeno z kolagenu typu I.

Hlavní role pro úspěch implantace autologických chondrocytů je hluboce závislá na stavu chondrocytů, které mají být implantovány. Je velice důležité, aby kultura chondrocytů byla životaschopná a způsobilá pro množení, a když je implantována, schopná poskytovat dostačující produkci matrice (Mayhew T. A., Tissue Engl., 1998, 4 : 325). Je důležité, aby se chondrocyty, které mají být implantovány, pěstovaly za nejjemnějších a nejpřísnějších kultivačních metod za vyvarování se zbytečného enzymatického poškození buněčné membrány a současně, aby se získala pokud možno co nejoptimálnější kultura chondrocytů pro produkci zdravé hyalinové kloubní chrupavky. Aplikace co nejjemnějších kutlivačních metod pro chondrocyty je nanejvýše důležitá pro získání dostatečně zdravého implatátu chrupavky, schopného interakce s okolní chrupavkou in šitu. Stejně tak je důležité vytvořit optimální strukruru chrupavky jako součást obnovy osteoartritických defektů.

Vynález poskytuje zlepšené membrány k použití při léčení defektů chrupavky nebo chrupavky a kosti u savců. Vynález poskytuje dále zlepšené způsoby preparace chondroblastů/chondrocytů a osteoblast/osteocytů k použití pro léčení ·

• 4« 4 4 »44 · · · ►

44 4 · · 4 · · *-*«··· · · · · *

4 4 4 · · 4 «4· •««· «4 4 4 *44 44 4444 defektů chrupavky nebo chrupavky a kosti u savců. Vynález poskytuje také nové způsoby léčení chrupavky nebo defektů kosti a chrupavky u savců.

Podstata vynálezu

Tato přihláška popisuje způsob a materiály pro in vivo opravy defektů chrupavky a defektů kosti a chrupavky v kloubech savců, jako jsou lidé a koně.

Vynález se tedy v prvním aspektu týká chrupavkové membrány, která alespoň na jedné části povrchu nese směs obsahující nejméně jednu stimulační molekulu, jež je schopná indukovat v chondroblastech/chondrocytech přenos signálu, jehož výsledkem je produkování chondroblastů/chondrocytů a vylučování komponent matrice, která tvoří hyalinovou chrupavku nebo specifičtěji hyalinovou kloubní chrupavku.

Z jiného hlediska se vynález týká interfaciální membrány s první částí povrchu a druhou částí povrchu, jež obě nesou směs obsahující nejméně jednu stimulační molekulu, jež je schopná indukovat přenos signálu v chondroblastech/chondrocytech a osteoblastech/osteocytech.

Z dalšího hlediska se ještě vynález týká způsobu reparování defektů chrupavky kloubů savců in vivo, zahrnujícího aplikaci chrupavkové membrány přes dutinu kloubu bez chrupavky, s přední stranou jejího povrchu směřující do dutiny kloubu bez chrupavky, přičemž přední část povrchu chrupavkové membrány nese směs obsahující nejméně jednu stimulační molekulu, jež je schopná indukovat v chondroblastech/chondrocytech přenos signálu, zavedení suspenze chondroblastu/chondrocytu do dutiny bez chrupavky mezi chrupavkovou membránu, chrupavku a rozhraní a spojení úseku části přední strany povrchu chrupavkové membrány s okolním povrchem kloubu tak, aby při použití utěsňující dávky suspenze chondroblastu/ chondrocytu tato dutinu bez chrupavky neprodyšně uzavřela a tak umožnila, aby suspenze chondroblastu/chondrocytu produkovala a vylučovala složky matrice charakteristické pro hyalin.

Dále se vynález týká způsobu reparování defektů kosti a chrupavky v kloubech savců in vivo, jako jsou osteoartritické klouby, zahrnujícího aplikaci interfaciální membrány s první částí povrchu směřující do volné dutny kosti přes dutinu bez kosti a pod dutinu kloubu bez chrupavky, přičemž první část • ·φ φ · ·

Μ * • · ·

Φ Φ · Φ <

Φ · * · φ Φ

Φ Φ ΦΦΦ «φ ΦΦΦ Φ * ΦΦΦΦ povrchu interfaciální membrány nese směs obsahující nejméně jednu stimulační molekulu, jež je schopná indukovat v osteoblastu/osteocytu přenos signálu a druhá část povrchu nese směs obsahující nejméně jednu stimulační molekulu, jež je schopná indukovat přenos signálu v chondroblastech/ chondrocytech, zavedení suspenze osteoblast/osteocyt do štěrbiny mezi první část povrchu interfaciální membrány a kost, spojení úseku části přední strany povrchu interfaciální membrány s okolním povrchem rozhraní tak, aby při použití utěsňovací dávky suspenze osteoblastu/ osteocytu neprodyšně uzavřela dutinu bez kosti a tak umožnila, aby suspenze v

osteoblastu/osteocytu produkovala a vylučovala složky matrice charakteristické pro kostní tkáň;

aplikaci chrupavkové membrány s první částí povrchu obrácenou k druhé části povrchu interfaciální membrány přes dutinu bez chrupavky, přičemž první část povrchu chrupavkové membrány nese směs obsahující nejméně jednu stimulační molekulu, jež je schopná vyvolat přenos signálu v chondroblastech/ chondrocytech resultující v produkování chondroblastů/chondrocytů a vylučování složek matrice, které tvoří hyalinovou chrupavku, zavedení suspenze chondroblastu/chondrocytu do dutiny bez chrupavky mezi interfaciální membránu, chrupavkovou membránu a chrupavku, spojení úseku části chrupavkové membrány s okolním povrchem kloubu tak, aby suspenze chondroblastu/chondrocytu neprodyšně uzavřela dutinu bez chrupavky a tak umožnila, aby suspenze chondroblast/chondrocyt produkovala a vylučovala složky matrice, které tvoří hyalin.

Dále se vynález týká způsobu pro reparování defektů kosti a chrupavky v kloubech savců in vivo za použití artroskopie jako například u osteoartritických kloubů, zahrnujícího ošetření interfaciální membrány první dávkou utěsňující komponenty aplikací přes kloubní dutinu bez kosti a pod kloubní dutinu bez chrupavky, interfaciální membrány s přední částí povrchu směřující do dutiny bez kosti, přičemž první část povrchu interfaciální membrány nese směs obsahující nejméně jednu stimulační molekulu, která je schopná indukovat v osteoblastu/ osteocytu přenos signálu, a s druhou částí povrchu, která nese směs obsahující nejméně jednu stimulační molekulu, jež je schopná indukovat přenos signálu v chondroblastech/ chondrocytech, φ φ ·» φ * · · · φ φφ · φφφ φ φ φ φ·· φ φ · · φ φ θ ««·» ·· ·· ··· ·· ··«« zavedení suspenze osteoblastu/osteocytu do štěrbiny mezi přední část povrchu interfaciální membrány a kost, spojení části první části povrchu interfaciální membrány s okolním povrchem rozhraní tak, aby při použití druhé dávky utěsňovací složky, uzavřela suspenze osteoblastu/osteocytu neprodyšně dutinu bez kosti a tak umožnila, aby suspenze osteoblastu/osteocytu produkovala a vylučovala složky matrice charakteristické pro kostní tkáň;

zavedení suspenze chondroblastu/chondrocytu do dutiny bez chrupavky mezi interfaciální membránu a povrch kloubu, čímž se umožní, aby suspenze osteoblastu/osteocytu produkovala a vylučovala složky matrice charakteristické pro hyalin.

Vedle toho se vynález týká způsobu přípravy suspenzí chondroblastu/ chondrocytu nebo osteoblastu/osteocytu zahrnující sběr mezenchymálních a/nebo prekursorových mezenchymálních buněk ze zdroje jako je kostní morek, perichondrium, periosteum, krev, cévy nebo svalovina; přidání shromážděných buněk do baňky pro kultivaci buněk obsahující alespoň jedno kultivační medium; pěstování sebraných buněk dokud nevzniknou kolonie vytvářející jednotky s počtem buněk o velikosti v rozsahu řádu 10 - 20.000 buněk/klon s fibroblastovým fenotypem (CFU-f); přenesení CFU-f buněk do nové baňky pro kultivaci buněk obsahující nejméně jedno selekční medium pro diferenciaci CFU-f buněk na chondroblasty/chondrocyty, osteocyty/osteoblasty nebo myoblasty/myotuby; a sklizení diferencovaných buněk.

Podrobný popis vynálezu

Předložený vynález se týká způsobu a materiálů pro in vivo reparování defektů chrupavky nebo kosti a defektů chrupavky v kloubech u savců, jako na příklad lidí a koní. Buňky chondroblastů/chondrocytů a buňky osteocytů/osteoblastů používané v předloženém vynálezu jsou buňky získané od savců jako na příklad člověka, koně, vepře nebo telat, buňky nejlépe autologické.

V předkládaném vynálezu jsou názvy aminokyselin používány jak je definuje ProteinDataBank (PDB), což se zakládá na IUPAC nomenklatuře [IUPAC Nomenclature and Symbolism of Amino Acids and Peptides (residue names), Eur. J. Biochem., 138, 9-27 (1984) spolu s opravami v Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985)].

Termín zbytek aminokyseliny je zamýšlen pro označení zbytku aminokyseliny obsaženého ve skupině argininu (Arg nebo R), glycinu (Gly nebo G), asparágové kyseliny (Asp nebo D), prolinu (Pro nebo P), histidinu (His nebo H, šeřinu (Ser nebo

S) a asparaginu (Asn nebo N).

··	··	9 9 9	99 99
•	9 9 9	9 9 99	9 9 9 9
•	9 9	9 9 9	9 9 9
• · ·	• · 9	99 9 9·	99 9999

Definice

Termínem suspenze chondroblast/chondrocyt je myšlena suspenze obsahující progenitory buněk pro chondroblasty/chondrocyty nebo chondroblasty /chondrocyty, které, jak je níže popisováno, po aplikaci na defekt podněcují stimulační molekulou diferencování a ulpívání resultující v produkci a vylučování složek matrice, která je charakteristická pro tkáň chrupavky. Složky matrice pro produkci hyalinu nebo hyalinové kloubní chrupavky jsou na příklad fibrily kolagenu typu II a sulfatované proteoglykany, chondrotin-6-sulfát a keratan sulfát.

Termínem suspenze osteoblastu/osterocytu je myšlena suspenze obsahující progenitory buněk pro osteoblasty/osterocyty nebo osteoblasty/osterocyty, které po aplikaci na defekt jak je níže popisováno stimulační molekulou podněcují diferencování a ulpívání resultující v produkci a vylučování složek charakteristických pro kostní tkáň.

Termínem chrupavková membrána je míněna membrána se schopností vázat chondroblasty/chondrocyty alespoň na jedné části povrchu membrány. Nejlépe je, když je chrupavková membrána schopná vázat stimulační molekulu, jak je zde definováno dále a má případně strukturu umožňující, aby chondroblasty/chondrocyty ze suspenze chondroblastu/chondrocytu ulpívaly a pronikly do celé membrány, ale membránou neprošly. Příklady vhodných membrán jsou membrány z kolagenu l/III, zakoupené u fy Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Švýcarsko nebo Baxter, Dánsko.

Termínem interfaciální membrána je míněna membrána se schopností vázat osteoblasty/osterocyty na jednu část povrchu této interfaciální membrány a chondroblasty/chondrocyty na druhou část povrchu této interfaciální membrány. Nejlepší je, když, jak je zde popisováno dále, interfaciální membrána je schopná vázat stimulační molekulu i na jednu stranu i na druhou část povrchu interfaciální membrány. Interfaciální membrána má případně strukturu umožňující suspenzi osteoblastu/osterocytu, aby ulpívala a pronikla do jedné části povrchu inferfaciální membrány, ale inferfaciální membránou neprošla. Inferfaciální membrána má dále strukturu dovolující, aby chondroblasty/chondrocyty ze suspenze chondroblastu •44 * 44

4 4 4

/chondrocytu, ulpívaly a pronikly do druhé části povrchu interfaciální membrány, ale membránou neprošly. Příklady vhodných membrán jsou membrány z kolagenu l/lll, zakoupené u fy Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Švýcarsko nebo Baxter, Dánsko.

Termínem stimulační molekula je míněn peptid a/nebo protein nebo jejich tavenina, přírodní nebo syntetické, nebo jejich směs, schopné indukovat přenos signálu v chondroblastech /chondrocytech a osteoblastech/osterocytech. Nejlépe je, když stimulační molekula, obsahuje alespoň aminokyselinové zbytky Arg-Gly-Asp, nazývané také RGD motiv. Bude pochopitelné, že jakýkoliv motiv nebo sekvence aminokyselinových zbytků, které mají stejnou nebo v podstatě stejnou schopnost indukce jako stimulační molekul obsahující RGD motiv, by mohly být rovněž podle vynálezu použity.

Termínem utěsňovací dávka je míněn lepivý tmel schopný vázat nebo těsně uzavřít membránu a povrch umístěný mimo defekt chrupavky a/nebo defekt v místě kosti a zachycovat suspenzi chondroblastu/chondrocytu a/nebo osteoblastu/ osterocytu v dutině bez chrupavky a/nebo v dutině bez kosti.

Termínem kultivační medium je míněno živné medium zodpovědné za přenos mezenchymálních kmenových buněk a/nebo mezenchymálních buněk prekurzoru získaných od savce do kolonie tvořící jednotky s fibroblastovým fenotypem (CFU-f).

Termínem selekční medium je míněno selekční medium zodpovědné za přenos CFU-f na definovanější buňky na příklad chondroblasty/chondrocyty, osteocyty/osteoblasty nebo myoblasty/myotuby.

Chrupavková membrána nesoucí stimulační molekulu

Z jednoho hlediska se vynález týká membrány nesoucí stimulační molekulu pro použití při ošetřováních defektů chrupavky u savců, takových jako jsou chondrální poškození nebo osteochondrální poškození, osteochondritis dissecans (OCD), chondromalacia a osteoartritida. Příklad takové chrupavkové membrány je uveden na obrázku 1 odkaz 5 respektive na obrázku 2 odkaz 50. Avšak provedení membrán uvedených na obrázcích 1 a 2 jsou příklady membrán a vynález nemůže být jimi limitován.

Vynález se týká chrupavkové membrány s alespoň jednou částí povrchu nesoucí směs obsahující nejméně jednu stimulační molekulu, která je schopná indukovat přenos signálu v chondroblastech/chondrocytech. Vhodná chrupavková

«4

4 4

4 • 44 4 membrána je neimunogenní, netoxickou, biodegradabilní membránou, vhodnější chrupavková membrána je porézní nebo podstatně porézní a právě tak vhodnější je, aby chrupavková membrána měla strukturu umožňující, aby chondroblasty/ chondrocyty v suspenzi chondroblastů/chondrocytú ulpěly a pronikly do celé membrány a nejpreferovanější chrupavkovou membránou je pak membrána z přírodního kolagenu typu I a/nebo III nebo syntetická membrána anebo jejich části. Příkladem chrupavkové membrány je plátek okostice vyříznutý z pacientovy kosti jako na příklad z proximální části hoienní kosti.

Chrupavková membrána může být impregnována stimulační molekulou před nebo přímo po aplikaci membrány na povrch, který má být ošetřen, tak jako je dutina bez chrupavky uvedená na obrázku 1 odkaz 7. Chrupavková membrána se nejlépe impregnuje za použití konvenčních technik jako je sprejování, natírání nebo namáčení nebo jakákoliv jiná konvenční technika.

Při preferovaném provedení obsahuje stimulační molekula nejméně jeden RGD motiv. Vhodnou stimulační molekulou je přírodní nebo syntetický protein nebo peptid anebo jejich tavenina či směs a vhodně se stimulační molekula volí ze skupiny, kterou tvoří proteiny kolagenu na příklad kolagen typů II, VI, IX a XI, proteoglykany jako aggregany, dekorin, fibromodulin a biglykan a nekolagenní proteiny jako kryoprecipitát, fibronektin, vitronektin, fibrinogen, fibrilin, kistrin, echistatin, von Willebrandův faktor, tenascin a anchorin Cil a vhodněji se pak také stimulační molekula volí ze skupiny sestávající z kolagenu typu II a fibronektinu. Mimo to se stimulační molekula připevňuje na podložku.

Finální koncentrace stimulační molekuly není kritická a závisí na stupni defektu chrupavky, který má být ošetřován. Stimulační molekula může být do finální koncentrace přidávána v rozsahu nM až do mM, výhodně mezi 1 nM do 100 mM a nejlépe 10 mM.

Při jiném provedení vynálezu se shora popsaná chrupavková membrána použije pro přípravu sestavy obsahující chrupavkovou membránu samotnou nebo, jak je zde dále definováno, v kombinaci s nejméně jednou interfaciální membránou pro ošetření defektů chrupavky nebo kosti a defektů chrupavky. Sestava může dále obsahovat jiné komponenty užitečné pro ošetřování chrupavky nebo kosti a defektů chrupavky u savců, jako jsou na příklad chondrální poškození nebo osteochondrální poškození, osteochondritis dissecans (OCD), chondromalacia a osteoartritida.

•φ φφ · ·· φφ φφφφ φφφφ φ « φ φ φφφ φφφ φφ φ φ φφφφφ φφφ ·**· ·* ·· *** ·* ·*·*

Interfaciální membrána nesoucí stimulační molekulu

U jiného provedení se vynález týká interfaciální membrány jak definována shora, nesoucí stimulařní molekulu pro ošetřování savců majících defekt chrupavky a kosti, jako jsou chondrální poškození nebo osteochondrální poškození, osteochondritis dissecans (OCD), chondromalacia a osteoartritida. Příklad takové interfaciální membrány je uveden na obrázku 2, odkaz 21. Avšak provedení membrány 21 uvedené na obrázku 2 je pouze příklad a vynález tím nemůže být limitován.

Vynález týká interfaciální membrány s nejméně dvěma rozdílnými částmi povrchu, první a druhou stranou, nesoucí nejméně jednu stimulační molekulu, která je schopná indukovat přenos signálu v chondroblastech/chondrocytech a osteoblastech/osteocytech. První strana povrchu interfaciální membrány má schopnost vázat osteoblasty/osteocyty, jako příklad obrázek 2, odkaz 22 a druhá strana povrchu interfaciální membrány má schopnost vázat chondroblasty/chondrocyty, jako příklad obrázek 2, odkaz 26. Vhodná interfaciální membrána je neimunogenní, netoxickou, biodegradabilní membránou, vhodnější interfaciální membrána je porézní nebo podstatně porézní a stejně vhodné je, aby interfaciální membrána měla strukturu umožňující, aby chondroblasty/chondrocyty v suspenzi chondroblastů/chondrocytů ulpěly a pronikly do jedné strany interfacilání membrány, avšak interfaciální membránou neprošly a osteoblasty/osteocyty v suspenzi osteoblastů/osteocytú do druhé strany interfaciání membrány, avšak interfaciální membránou neprošly a nejpreferovanější interfaciální membránou je pak membrána z přírodního kolagenu typu I a/nebo III nebo části z nich. Příkladem interfaciální membrány je plátek okostice vyříznutý z pacientovy kosti jako na příklad z proximální části holenní kosti.

Interfaciální membrána může být impregnována stimulační molekulou před nebo přímo po aplikaci interfaciální membrány na povrch, který má být ošetřen, jako je na příklad dutina bez kosti uvedená na obrázku 2 odkaz 23. Interfaciální membrána se nejlépe impregnuje za použití konvenčních technik jako je sprejování, natírání nebo namáčení nebo jakákoliv jiná konvenční technika.

Při preferovaném provedení obsahuje stimulační molekula nejméně jeden RGD motiv, vhodnou stimulační molekulou je přírodní nebo syntetický protein nebo peptid anebo jejich tavenina či směs a vhodněji se stimulační molekula volí ze skupiny, kterou tvoří proteiny kolagenu na příklad kolagen typů II, VI, IX a XI, ·· 0» 0 »0 00 0 00 0 0 000 0 00 0

000 00Φ 000

0000 00 0» »0» 0» 0000 proteoglykany jako aggregany, dekorin, fibromodulin a biglykan a nekolagenní proteiny jako kryoprecipitát, fibronektin, vitronektin, fibrinogen, fibrilin, kistrin, echistatin, von Willebrandův faktor, tenascin a anchorin Cil a ještě vhodněji se pak také stimulační molekula volí ze skupiny sestávající z kolagenu typu II a fibronektinu. Vedle toho se stimulační molekula připevňuje na podložku.

Finální koncentrace stimulační molekuly není kritická a závisí na stupni defektu, který má být ošetřován. Stimulační molekula může být do finální koncentrace přidána v rozsahu nM až do mM, výhodně mezi 1 nM do 100 mM a nejlépe 10 mM.

Při jiném provedení vynálezu může být interfaciální membrána použita při ošetřování kosti a defektů chrupavky za použití artroskopie. Interfaciální membrána používaná při artroskopii obsahuje alespoň jednu dávku utěsňovací komponenty jak je zde dále definováno.

Další charakteristika interfaciální membrány pro použití při artroskopii je táž jak definováno shora pro interfaciální membránu užívanou k ošetření defektů kosti a chrupavky jako jsou chondrální poškození nebo osteochondrální poškození, osteochondritis dissecans (OCD), chondromalacia a osteoartritida.

Při jiném provedení předkládaného vynálezu se interfaciální membrána membrána použije pro přípravu sestavy obsahující interfaciální membránu samotnou nebo v kombinaci s nejméně jednou chrupavkovou membránou pro ošetření defektů kosti nebo kosti a defektů chrupavky. Sestava může dále obsahovat jiné komponenty užitečné pro ošetřování defektů chrupavky nebo kosti a defektů chrupavky u savců, jako jsou chondrální poškození nebo osteochondrální poškození, osteochondritis dissecans (OCD), chondromalacia a osteoartritida.

Metody propagace multipotentních mezenchymálních savčích kmenových buněk pro použití k léčení defektů chrupavky nebo chrupavky a kosti u savců

Z jiného hlediska se vynález týká metody propagace multipotentních mezenchymálních savčích buněk a/nebo prekursorů buněk a jejich diferenciace na chondroblasty/chondrocyty, osteoblasty/osteocyty, fibroblasty, myoblasty/myocyty a adipoblasty/adipocyty bez použití enzymů jako jako je kolagenáza. Diferenciované buňky mohou být používány při léčení chrupavky a/nebo kosti a defektů chrupavky u savců.

• fl ·· flfl fl flfl flfl fl ·· · fl flflfl fl flfl · ··· flflfl flfl fl flflfl··· flflfl • flflfl «· flfl flflfl flfl flfl··

Metoda zahrnuje sbírání mezenchymálních a/nebo prekurzorních buněk ze zdroje jako jsou morek kosti, perichondrium, periosteum, krev, cévy nebo svaly; přidání shromážděných buněk do kultivační baňky obsahující alespoň jedno živné medium, jak je definováno pod termínem kultivační medium; pěstování sebraných buněk dokud nevzniknou kolonie vytvářející jednotky s počtem buněk o velikosti v rozsahu řádu 10 - 20.000 buněk/klon s fibroblastovým fenotypem (CFU-f); přenesení CFU-f buněk do nové kultivační baňky obsahující nejméně jedno, shora definováné selekční medium pro diferenciaci CFU-f buněk na chondroblasty/chondrocyty, osteocyty/osteoblasty nebo myoblasty/myotuby; a sklizení diferencovaných buněk a příprava suspenzí chondroblasty/chonderocyty nebo osteoblasty/osteocyty.

Suspenze chondroblastů/chondrocytů nebo osteoblastů/osteocytů mohou být u savců výhodně použity pro léčení defektů chrupavky a/nebo kosti a chrupavky. Doba kultivace je závislá na stavu a podmínkách sebraných mezenchymálních a/nebo prekurzorních buněk od savců, a proto je nesnadné určit časovou periodu pro propagaci mezenchymálních a/nebo prekurzorních buněk v živném a selekčním mediu, které mají diferencovány na chondroblasty/chondrocyty nebo osteoblasty/osteocyty. Nevyzrálé buňky jsou prvotně ovlivňovány selekčním mediem, ve kterém skladba aminokyselin, hormonální, růstové a diferenciační faktory jsou specifičtější pro selekci spíše než pro růst. Může to být určitá násada plodového telecího séra v koncentraci vyšší (nad 10 %) než se obvykle používá až do 30 obj.%, která byla na svoji shopnost diferencovat buňky na chondroblasty/ chondrocyty testována, nebo testována na svoji shopnost diferencovat buňky na osteoblasty/osteocyty. Řečené násady plodového telecího séra, které takový selekční charakter vykazují, jsme u nás identifikovali. Až na další se nová násada nebo násady plodového telecího séra pro diferenciaci buněk musí testovat. Buňky se identifikují kvantitativní PCR mRNA (Lané Smith R. a spol., J. Rehab. Reseach and Development March/April 2000, vol. 37) a v případě řad chondrocytů se buňky testují při použití monoklonálních protilátek jako je kolagen typu II Ab-1 (Klon 5B2.5) monoklonální protilátky myší (Lab. Vision Corp. Fremont, Califomia).

Použití media s plodovým telecím sérem identifikovaným jako dostačující selekční kvalitě vede k určitým diferenciacím prekurzorních buněk. Jiné faktory jako fysikální faktory, např. adheze k určitým plastovým materiálům, nebo adheze k buněčným nebo nebuněčným adhezním faktorům podporují diferenciaci buněk rovněž.

Μ ** 99 9 99 99

9 9 9 9 99 9 9 9 9

99 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9*9 9 9 9 9 999 9 9 9·9 9

Suspenze chondroblastů/chondrocytů nebo osteoblastů/osteocytů obsahují nejvhodněji konvenční kultivační medium jako na příklad DMEM/F12, sérum jako plodové telecí sérum nebo autologické sérum, nejspíše sérum, které je neimunogenní a suspenze chondroblastů/chondrocytů nebo osteoblastů/osteocytů nejvhodněji obsahují buňky chondroblastů/chondrocytů nebo osteoblastů/osteocytů v rozsahu 100.000 až 10 milionů buněk/ml celkové suspenze buněk.

Jiné provedení podle vynálezu se týká systému kultivace buněk založeného na konceptu používání chrupavkové matrice jako vazebného a dodávacího (nebo rezervoárového) systému růstových a diferenciačních faktorů pro různé buňky přítomné v extracelulární matrici, bez používání enzymaticky ošetřených a vyřezaných kousků chrupavky. Tím se míní, že dodáním růstových a diferenciačních faktorů třeba plodovým telecím sérem nebo odděleně, jsou explantáty chrupavky schopné vázat tyto faktory v matrici přítomnými přírodními vázajícími proteiny. Takový vazebný a dodávací sytém může zvětšovat poločas různých růstových a diferenciačních faktorů přítomných v kultivačním mediu s plodovým telecím sérem znamenající, že růstové a diferenciační faktory jsou mnohem více chráněny před proteolýzou, když jsou nositelé dodávky pro různé buněčné receptory nejprve vázány na přírodní intermediátní matricové molekuly. Vedle toho může být vzhledem k vyšší lokální akumulaci (vyšší koncentraci) růstových a diferenciačních faktorů kolem pericelulárního okraje v teritoriálních, stejně jako v interteritoriálních úsecích, ve srovnání s růstovými a diferenciačními faktory přítomnými v konvenčním mediu, uvažována vyšší stimulace buněk růstovými a diferenciačními faktory. Vyšší lokální koncentrace růstových a diferenciačních faktorů vázaných na jejich přírodní intermediáty v matrici a později dodávaná vázajícím receptorům (IGF-R, TGF-R, bTGF-R atd.) ovlivňuje receptory k tvorbě shluků na plasmové membráně a dále přenos signálu - stimulaci růstu. Pro růst různých stimulačních buněk v matrici to je pro buňky mnohem mírnější způsob, aby začaly propagovat a zrát na přirozenou extracelulární matrici namísto odlupování chondroblast/chondrocytů z komponent jejich přirozené matrice (průběh buněčných změn) obvyklou kolagenázovou digestivní metodou. Schopnost chondroblast/chondrocytů zůstávat živoucí v explantátech chrupavky v nepřítomnosti plodového telecího séra nebo jiných přidaných růstových faktorů naznačuje dále, že chondrocyty jsou extracelulární matricí chráněny. Tkáňový kultivační systém s explantáty chrupavky jako výchozím materiálem pro propagaci buněk má řadu dalších výhod před obecnými kultivačními

4» *4 *« • « · * 9 9

99 4 4

9 9 9 9 9

9 9 4 9

9949 94 94

99 49

9 9 4 4

4 9 4

9 4 9 9

4 4 4

494 44 4949 metodami chondrocytů. Jak bylo dříve zmíněno, z chrupavky pocházející buňky v explantátech podržují v matrici svůj diferencovaný stav i když probíhá stimulace a propagace buněk. Za druhé buňky nejsou vystaveny vysoké koncentraci proteolytické aktivity užívané na příklad digesci chrupavkové matrice kolagenázou. To znamená, že extracelulární matrice v procesu propagace buněk pocházejících z chrupavky je uchovávána a blízká podmínkám in vivo.

Utěsňovací dávka

Utěsňovací dávka se může používat k zachycování suspenze v

chondroblastu/chondrocytu v dutině bez chrupavky a/nebo suspenze osteoblastu/osteocytu v dutině bez kosti. Na obrázku 1, odkaz 6 jsou uvedeny příklady utěsňovacích dávek zachycujících suspenzi chondroblastu/chondrocytu (8) v dutině bez chrupavky (7) a na obrázku 2, odkaz (25) je utěsňovací dávka zachycující suspenzi osteoblastu/osteocytu (24) v dutině bez kosti (23). Příkladem utěsňovací dávky je Tisseel™ (Baxter Immuno Austria, lyofilizovaná virus-inaktivovaná substance, která se skládá z fibrinogenu, plasmafibrinonektinu, faktoru Vlil a plasminogenu), který je během aplikace míšen s roztokem apronitinu, trombinem 4, trombinem 500 a roztokem chloridu vápenatého za použití systému dvou stříkaček napojených na jednu tupou injekční jehlu. Vedle toho může utěsňovací dávka obsahovat suspenzi chondroblastu/chondrocytu nebo suspenzi osteoblastu/ osteocytu spolu s nebo bez stimulační molekuly jak je nahoře v definicích popisována. Jiným příkladem utěsňovacího prostředku je CoSeal (Cohesion Technologies, Palo Alto, California, U. S. A), který je rovněž dvousložkovým biologickým lepivým tmelem podobným Tisseelu a může být použit místo Tisseelu.

Je-li dále navíc utěsňovacím tmelem majícím dvě různé komponenty, tvoří tak tmel obě komponenty spolu dohromady. Jedna z komponent, obsahující nejméně jednu stimulační molekulu jak je definováno shora, může být aplikována na pokrytí celé oblasti alespoň jedné strany membrány. Druhá komponenta se přidává mezi utěsňovaný úsek membrány a okraj porušené chrupavky nebo defektu kosti po umístění membrány na chrupavku nebo defekt kosti.

Ošetřování defektů chrupavky

Z dalšího hlediska se vynález týká způsobu a materiálů pro reparování poškození chrupavky savců in vivo, takových defktů jako jsou na příklad chondrální ···· ·· ·· ··· ·· · poškození nebo osteochondrální poškození, osteochondritis dissecans (OCD), chondromalacia a osteoartritida.

Nyní se odkazuje na obrázek 1.

Poškozenou částí chrupavky je obvykle část povrchu, kde se původní chrupavka odtrhla. Jako příprava reparování se poškození odoperuje tak, že povrchová část defektu chrupavky objeví jako dutina bez chrupavky 7, která často zasahuje směrem dolů k rozhraní 3, na rozhraní mezi chrupavku 2 a kost 4 a dutina zbavená chrupavky 7 je obklopena zdravou chrupavkou 2.

Potom se shora popsaná chrupavková membrána _5 aplikuje přes dutinu bez chrupavky 7. Chrupavková membrána 5 je obvykle co do velikosti upravena tak, aby část strany membrány mohla být přišita k okolnímu povrchu kloubu 1. Po aplikaci a přišití chrupavková membrány 5- se okraj membrány k okolnímu povrchu kloubu χ zpravidla těsně uzavře pomocí přiměřených utěsňovacích dávek 6. Utěsnění se neprovádí úplně a malá část obvodu se nechává neutěsněna, aby byla umožněna implantace suspenze chondroblastu/chondrocytu 8. Potom se chrupavková membrána 5 pomocí přiměřené utěsňovací dávky 6 utěsní úplně.

Chrupavková membrána .5 má nejméně jednu část povrchu nesoucí kompozici obsahující alespoň jednu stimulační molekulu, která je schopná indukovat přenos signálu v chondroblastech/chondrocytech pro produkci a vylučování složek matrice, které tvoří hyalin nebo hyalinovou kloubní chrupavku. Ta část povrchu chrupavkové membrány 5, která nese stimulační molekulu je lokalizována proti povrchu kloubu 1_a překrývá dutinu zbavenou chrupavky _7 obsahující suspenzi chondroblastu/ chondrocytu 8 jak je shora popsáno. Další vlastnosti chrupavkové membrány jsou definovány shora v odstavci Chrupavková membrána nesoucí stimulační molekulu.

Při jiném provedení podle vynálezu se na povrch defektu chrupavky před aplikací chrupavkové membrány.5. aplikuje kompozice vytvářející stěny, obklopující dutinu bez chrupavky 7. Jak je shora popisováno, kompozice obsahuje nejméně jednu stimulační molekulu, aby se zvýšila expozice implantovaných chondroblastů/chondrocytů v suspenzi chondroblastů/chondrocytů & vůči stimulační molekule, právě tak jako schopnost implantovaných buněk suspenze chondroblastu/chondrocytu vázat obklopující chrupavku 2.

Vedle toho se suspenze chondroblastu/chondrocytu .8 aplikuje souběžně buď spolu s anebo bez suspenze obsahující stimulační molekulu, jak se popisuje shora.

Vhodnou suspenzí chondroblastu/chondrocytu je suspenze autologických chondroblastů/chondrocytů.

Při jiném provedení podle vynálezu jsou chondroblasty/chondrocyty obsaženy v kompozici nesené v chrupavkové membráně 5 a aplikované případně přímo do dutiny bez chrupavky 7, aby se získal povlak buněk tvořící normální vrstvu povrchu chrupavky a vrstvu přechodovou.

Vhodná suspenze chondroblastu/chondrocytu obsahuje nejlépe běžné kultivační medium jako na příklad DMEM/F12, sérum jako plodové telecí sérum nebo autologické sérum, vhodně sérum, které je neimunogenní a suspenze chondroblastu/chondrocytu nejvhodněji obsahuje buňky chondroblastů/chondrocytů v rozsahu 100.000 až 10 milionů buněk/ml v celkové suspenzi chondroblastu /chondrocytu.

Příklady stavů jejichž výsledkem jsou defekty chrupavky, které mohou být ošetřovány podle vynálezu jsou chondrální poškození nebo osteochondrální poškození, osteochondritis dissecans (OCD), chondromalacia a osteoartritida.

Ošetřování defektů kosti a chrupavky

Zvláštní provedení vynálezu se týká způsobu a materiálů pro reparování defektů jak kosti tak chrupavky savců in vivo, jako jsou poškození chondrální nebo osteochondrální poškození, osteochondritis dissecans (OCD), chondromalacia a osteoartritida.

Odkazy se nyní týkají obrázku 2.

Jako příprava reparování se partie defektu kosti a chrupavky odoperuje tak, že se partie defektu kosti a chrupavky objeví jako dutiny bez kosti a chrupavky 23, 70, rozšiřující zcela cestu skrze chrupavku 20, rozhraní 30 a směrem dolů ke kosti 40. Dutina bez kosti a chrupavky 23, 70 je ohraničena zdravou chrupavkou 20, rozhraním 30 a kostí 40. Přes dutinu bez kosti 23 se na úrovni rozhraní 30 aplikuje interfaciální membrána 21, aby se dosáhlo oddělení dutiny bez chrupavky 70 a dutiny bez kosti 23. Interfaciální membrána se aplikuje tak, že přední strana 22 povrchu interfaciální membrány 21 je obrácena do dutiny po kosti a druhá strana povrchu 26 směřuje do dutiny po chrupavce 70. Interfaciální membrána 21 je obvykle co do velikosti upravena tak, aby část strany membrány mohla být přišita k okolní ploše rozhraní 30. Po aplikaci a přišití interfaciální membrány 21 se okraj membrány s okolním rozhraním pomocí přiměřených utěsňovacích dávek 25_zpravidla těsně • ·

9

uzavře. Utěsnění se neprovádí úplně a malá část obvodu se nechává neutěsněna, aby byla umožněna implantace suspenze osteoblastu/osteocytu 24. Po implantaci suspenze osteoblastu/osteocytu 24 se interfaciální membrána 21 pomocí přiměřené utěsňovací dávky 25 utěsní úplně.

Interfaciální membrána 21 má nejméně dvě rozdílné části povrchu, jednu 22 a druhou 26 stranu povrchu, která nese nejméně jednu stimulační molekulu schopnou vyvolávat přenos signálu. První část povrchu 22 interfaciální membrány 21 má schopnost vázat osteoblasty/osteocyty a druhá část povrchu 26 interfaciální membrány 21 má schopnost vázat chondroblasty/chondrocyty.

V.

Další vlastnosti interfaciální membrány jsou v odstavci Interfaciální membrána nesoucí stimulační molekulu jak je popsáno shora.

Vedle toho se suspenze osteoblastu/osteocytu aplikuje souběžně buď spolu s anebo bez suspenze obsahující stimulační molekulu, jak se popisuje shora. Vhodnou suspenzí osteoblastu/osteocytu je suspenze autologických osteoblastů/osteocytů.

Vhodná suspenze osteoblastu/osteocytu obsahuje nejlépe běžné kultivační medium jako na příklad DMEM/F12, sérum jako plodové telecí sérum nebo autologické sérum, vhodně sérum, které je neimunogenní a nejvhodněji suspenze osteoblastu/osteocytu obsahuje buňky osteoblastu/osteocytu v rozsahu 100.000 až 10 milionů buněk/ml v celkové suspenzi osteoblastu/osteocytu.

Při jiném provedení podle vynálezu jsou osteoblasty/osteocyty v suspenzi osteoblastu/osteocytu 24 obsaženy v kompozici nesené částí povrchu 22 interfaciální membrány 21 a aplikované případně přímo do dutiny bez kosti 23, aby se získal povlak buněk tvořící normální vrstvu na povrchu kosti a vrstvu přechodovou.

Potom se shora popsaná chrupavková membrána 50 aplikuje přes dutinu bez chrupavky 70. Chrupavková membrána 50 se obvykle co do velikostí upraví tak, aby část strany membrány mohla být přišita k okolnímu povrchu kloubu 10. Po aplikaci a přišití chrupavková membrány 50 se okraj membrány s okolním povrchem kloubu 10 normálně těsně uzavře pomocí přiměřených utěsňovacích dávek 60. Utěsnění se neprovádí úplně a malá část obvodu se nechává neutěsněna, aby byla umožněna implantace suspenze chondroblastu/chondrocytu _80. Potom se implantát úplně utěsní s okolním povrchem kloubu 10 pomocí přiměřené utěsňovací dávky 60.

Chrupavková membrána 50 má nejméně jednu část povrchu nesoucí kompozici obsahující alespoň jednu stimulační molekulu, která je schopná vyvolat • 9 9 9 · · 9 9 9 « • ·· · 9 · * β · «9 t

9 9 9 9 9 9 · «

9999 ·· ·· 999 «· 9999 přenos signálu v chondroblastech/chondrocytech, jehož výsledkem je produkce chondroblastů/chondrocytů a vylučování složek matrice, které tvoří hyalin nebo hyalinovou kloubní chrupavku. Ta část povrchu chrupavkové membrány 50, která nese stimulační molekulu je lokalizována proti povrchu kloubu 10 a překrývá dutinu zbavenou chrupavky 70, obsahující suspenzi chondroblastu/chondrocytu 80, jak je shora popsáno. Další vlastnosti chrupavkové membrány jsou definovány shora v odstavci Chrupavková membrána nesoucí stimulační molekulu.

Suspenze chondroblastu/chondrocytu může být aplikována souběžně bud spolu s anebo bez suspenze obsahující stimulační molekulu, jak se popisuje shora.

Při jiném provedení podle vynálezu jsou chondroblasty/chondrocyty v suspenzi chondroblastu/chondrocytu 80 obsaženy v kompozici nesené chrupavkovou membránou 50 a aplikované případně přímo do dutiny bez chrupavky 70, aby se získal povlak buněk tvořící normální vrstvu na povrchu chrupavky a vrstvu přechodovou.

Vhodná suspenze chondroblastu/chondrocytu obsahuje běžné kultivační medium jako na příklad DMEM/F12, sérum jako plodové telecí sérum nebo autologické sérum, vhodně sérum, které je neimunogenní a suspenze chondroblastu/chondrocytu obsahuje nejvhodněji buňky chondroblastů/chondrocytů v rozsahu 100.000 až 10 milionů buněk/ml v celkové suspenzi chondroblastu /chondrocytu.

Příklady stavů jejichž výsledkem jsou defekty kosti a chrupavky, které mohou být ošetřovány podle vynálezu, jsou chondrální poškození nebo osteochondrální poškození, osteochondritis dissecans (OCD), chondromalacia a osteoartritida.

Podle jiného provedení vynálezu se defekt kosti a chrupavky ošetřuje artroskopií za použití utěsňovací dávky dvou složek, komponenty 1 a 2. Příkladem dvousložkové utěsňovací dávky je Tisseel Duo Quick (Baxter). Interfaciální membrána 21 se předem ošetří komponentou 1 utěsňovací dávky, na příklad roztokem trombinu, který obsahuje 500 IU trombinu, 50 mg proteinu savčí plasmy, 40 mol chloridu vápenatého, 10 mg chloridu sodného, 3 mg glycinu a vodu pro injekce do 1 ml, jako Tisseel Duo Quick (Baxter). Utěsňovací dávka může mimo to obsahovat stimulační molekulu.

Jako příprava reparování se partie defektu kosti a chrupavky odoperuje tak, že se partie defektu kosti a chrupavky objeví jako dutiny bez kosti a chrupavky 23 a 70, rozšiřující zcela cestu skrze chrupavku, rozhraní a směrem dolů ke kosti. Dutina * · · · s · · · • ·· bez kosti a chrupavky je ohraničena zdravou chrupavkou 20, rozhraním 3JD a kostí 40. Komponenta 2 utěsňovací dávky se aplikuje na okolní okraje oblasti interfaciální membrány 30. Interfaciální membrána 21 se za použití artroskopie aplikuje přes dutinu bez kosti 23 na úrovni rozhraní 30, aby se dosáhlo oddělení dutiny bez chrupavky 70 a dutiny bez kosti 23. Interfaciální membrána 21 se aplikuje tak, že přední strana 22 povrchu interfaciální membrány 21 je obrácena do dutiny po kosti 23 a druhá strana povrchu 26 směřuje do dutiny po chrupavce 70. Interfaciální membrána 21 je obvykle co do velikosti upravena tak, aby část strany membrány mohla být slepena s okolní plochou rozhraní 3Q. Po aplikaci interfaciální membrány 21 reagují spolu utěsňovací dávka 1 a 2 a tvoří tmel slepující interfaciální membránu 21 s okolní plochou rozhraní 30. Utěsnění se neprovádí úplně a malá část obvodu se nechává neutěsněna, aby byla umožněna implantace suspenze osteoblastu/ osteocytu 24. Po implantaci suspenze osteoblastu/osteocytu 24 se interfaciální membrána pomocí přiměřené utěsňovací dávky 25 utěsní úplně s okolní plochou rozhraní 30. Potom se implantuje a pomocí vhodné dávky 60 těsně spojí s povrchem kloubu suspenze chondroblastu/chondrocytu 80.

Principy vynálezu jsou ilustrovány dále na přiložených výkresech.

Přehled obrázků na výkresech

Předkládaný vynález je dále osvětlován s odkazem na výkresy, kde

Obrázek 1 ukazuje jedno provedení předkládaného vynálezu použitelné pro ošetřování defektů chrupavky. Obrázek ukazuje anatomii normální chrupavky a defekt chrupavky.

Obrázek 2 ukazuje jiné provedení předkládaného vynálezu použitelné pro ošetřování defektů chrupavky a kosti.. Obrázek ukazuje anatomii normální chrupavky a kosti a defektů chrupavky a kosti.

Příklady provedení vynálezu

Odstavce níže popisují komponenty, které mají být používány při způsobech podle tohoto vynálezu.

Materiály a metody

9· 4 » 9 4 4

4 9 44 9

99 9 9 9 9 9

Kultivační medium; DMEM/F12 obsahující 20 % plodového telecího séra. DMEM/F12 bylo získáno od Life Technologies lne., Rockville, MD, USA a plodové telecí sérum od Life Technologies lne., Rockville, MD, USA.

Příklad 1

Suspenze chondrocytů použitá k ošetřování defektů chrupavky Biopsie zdravě vyhlížející chrupavky (200-500 mg) byla za aseptických podmínek získána atroskopem z oblasti kloubu nesoucí menší zatížení a umístěna do sterilní banky obsahující transportní medium (DMEM/12 s 20 % plodového telecího séra). Baňka obsahující transportní medium byla k dalšímu zpracování na buněčnou kulturu předána na 48 hodin do laboratoře pro kultivací buněk. Pro propagaci chondrocytů byla použita metoda popsaná v příkladu 3. Chondrocyty byly až 6 týdnů v živném mediu rozmnoženy v baňkách pro kultivaci tkání v CO2 inkubátoru (5 % CO2) při 37°C a později po 3 až 10 dnů udržovány v DMEM/F12 s pacientovým (savčím) vlastním, tepelně inaktivovaným sérem (rozsah 10-20 %). Když kultura chondrocytů narostla do množství buněk potřebných pro reparaci poškození chrupavky u daného pacienta (savce), byly buňky sklizeny trypsinizací v 0,25 % trypsinu v 1 mM EDTA, promyty v mediu obsahujícím plodové telecí sérum (10-20 %) pak centrifugovány při 900 x g 10 minut při teplotě místnosti a znovu suspendovány na počet buněk mezi 0,5 až 2 χ 10⁶ buněk na 0,1 ml živného media (5 až 20 x 10⁶ buněk na 1 ml živného media). Optimální počet buněk pro implantaci je na 0,1 ml živného media kolem 1 milionu buněk. Defekt chrupavky má obecně prostor pro 0,1 ml suspenze buněk na 1 cm² defektu.

Chondrocyty se dodávají ortopedovi, který do 24 hodin implantuje chondrocyty do poškozené chrupavky. Chirurg před implantací buď přes defekt umístil plátek okostice nebo vhodné biodegradabilní překrytí a plátek přišil a s výjimkou místa pro injekci utěsnil. Potom se pod překrytí injektují buňky a místo pro injekci se utěsní pomocí Tisseel Duo Quick (Baxter).

• · ·· ·· · ·· ·· ···· · · 9 9 « · · · ···· ·· ·· ··· ·· ····

Příklad 2

Stimulační molekula

Z velkokapacitní kultivace prasečích chondrocytů byl rafinován kolagen II stejně jako proteoglykany pocházející ze stejného zdroje prasečí chrupavky. Z velkokapacitní kultivace savčích chondrocytů (nejraději species specifických pro recipienta buněk) byl získán kolagen II, a kultivován jako expantát, čímž se dostane adekvátní množství kolagenu II.

Příklad 3

Protokol kultivace explantátů chrupavky na jednovrstvou kulturu

Biopsie chrupavky se nasbírá z kolena pacienta a bezprostředně přenese do aseptického media pro růst, doplněného L-askorbovou kyselinou [50 pg /1 (300 μΙ / I)] a gentamicin sulfátem [50 pg / ml (10 mmol /1)] a Fungizonem [2 pg/ml (2,2 pmol / I)] do baněk pro kultivaci tkání. Biopsie chrupavky se potom pečlivě promyje novým živným roztokem a v živném roztoku rozkrájí na 2-4 mm kousky chrupavky (explantáty). Od počátečního umístění do kultury vyžadují explantáty chrupavky v závislosti na materiálu donoru přibližně několik dní, aby dosáhly konstantního metabolického stavu. Po dosažení takového ustáleného stavu (ustáleným stavem je rovnováha mezi syntézou a katabolismem) jsou teď růstovými faktory v živném mediu stimulovány původní chondroblasty/chondrocyty, které difundují skrze chrupavkovou matrici a vážou se na různé vazebné proteiny přítomnými v matrici stejně jako přímým vázáním na selektivní buněčné receptory.

Stimulované a prudce se množící buňky setrvávají v explantátech zpravidla jeden nebo dva týdny (v závislosti na materiálu donoru) a potom opouštějí explantáty prostřednictvím buněčné migrace do kultivačního media k dalšímu spojení s živnou půdou (jednovrstvá kultura).

Po dosažení splynutí buněk se chrupavkové explantáty přenesou do separátní živné půdy s novým růstovým mediem a prve vytvořená monovrstvá kultura se štěpí dříve popsanou konvenční trypsinizační metodou. V procesu propagace buněčné kultury na vysoký počet buněk je tento krok důležitý. Jak shora popsáno, po každém ·· fcfc fcfc • fcfcfc · · • fcfcfc fcfc fcfc trypsinizačním procesu se k jednovrstvým buňkám přidává nové medium pro růst jednovrstvých buněk.

Po 3 - 5 týdnech konečné kultivace buněk se všechny chrupavkové expiantáty odstraní a monovrstvé kultury se několikrát promyjí fysiologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS). Autologické medium pro růst obsahující 10 % savčího séra ke přidá ke kultuře buněk na další 2-3 dny kultivace buněk před tím, než se buňky dodají na kliniku nebo do nemocnice.

Příklad 4

v.

Membrána k použití pro ošetřování a užívání membrány

Během chirurgického zákroku na otevřeném koleně se používá membrána z kolagenu typu l/(III), zakoupená u Geistlich Biomaterials, Wolhusen, Switzerland nebo u Baxter (Denmark). Membrána se nařeže na velikost, která je poněkud větší než poškození chrupavky tak, že membrána může defekt chrupavky pokrýt a přesahovat kolem ¹Z cm za okraj defektu. Membrána se s okrajem chrupavky dohromady sešije. Ohraničení mezi membránou a chrupavkou se pomocí Tisseel Duo Quíck (Baxter) utěsní. Membrána z kolagenu typu I se před použitím k implantaci předem, 5-15 minut při teplotě místnosti, ošetřuje 1-5 ml roztoku kolagenu typu II [ 3-10 mg kolagenu ll/ml (Dep. Materiál Engineering, Drexel University, Philadelphia, Pennsylvania)].

a) Při provádění artroskopického chirurgického zákroku je u membrány z kolagenu typu l/(lll) povrch, který je obrácen k defektu chrupavky, předem ošetřen komponentou II, roztokem trombinu, který obsahuje: 500 IU trombinu, 50 mg proteinu savčí plasmy, 40 mol chloridu vápenatého, 10 mg chloridu sodného, 3 mg glycinu a vodu pro injekce do 1 ml, jako na příklad jednou části Tisseelu Duo Quick (Baxter).

b) Při artroskopii využívající roztažení kloubu pomocí plynů, jako na příklad CO2, namísto roztahování pomocí roztoků jako na příklad 0,9 % roztoku chloridu sodného, se zdravá chrupavka tvořící okraj kolem defektu pokryje komponentou I, která je složena z vysrážitelné bílkoviny 75-115 mg z toho 70-110 mg fibrinogenu, 29 mg fibronektinu, 10-50 IU faktoru XIII, 40-120 g 3000 KIU apronitinu (hovězího), 10-20 mg savčího albuminu, 15-35 mg glycinu, 2-4 mg chloridu sodného, 4-8 mg citrátu sodného, 0,2-0,4 mg polysorbátu 80, 15 mg kreatinmonohydrátu a vody pro injekce do 1 ml jako příkladem jiné kompozice Tisseel.

• · ·♦ ·· · ·« «· • · · · · · · · ····

Shora popsaná tenkovrstvá membrána pokrytá jak se popisuje s II, se potom vkládá nad poškození (velikost membrány je v průměru poněkud větší než defekt) a umístí s pokrytou stranou obrácenou k defektu. Když dojde ke kontaktu membrány s pokrytým okrajem defektu chrupavky, pokrytým jak popsáno s II, vznikne z obou typů povlaků (povlak I a povlak II, který je komponentami v Tisseel) biologický tmel a tak se membrána přilepí na defekt. Membrána je na místě udržována vložením malých absorbovatelných kolíčků do obvodu defektu, ukotvujících utěsněnou membránu k chrupavce pevnějším způsobem. Potom se v jednom místě membrány blízko okraje do defektu injektuje pomocí jehly suspenze chondrocytu a otvor v membráně se utěsní, když se jehlou natáhne dvousložkový biologický lepivý tmel jako na příklad Tisseel Dou Quick jak uvedeno níže.

K provedení shora popisované artroskopické procedury jsme v tomto příkladu použili dvousložkový biologický tmel, kde komponenta II je užita jako povlak na straně membrány obrácené k defektu, a kde komponenta I je použita jako povlak na okraj chrupavky obklopující defekt. Komponenta II bude reagovat s komponentou I, ale nebude reagovat jako lepivý tmel s mediem obsahujícím složku autologického séra, ale jako RGD povlak vůči mediu a tím bude vyvolávat přilnavost a produkci injektovaných chondrocytů v matrici.

Jako povlak na straně membrány směrem k defektu může být rovněž použit dvousložkový tmel Tisseel, avšak bude se s ním nesnadněji pracovat, když je vpravován. Jinou alternativou je pokrývat okraj chrupavky obklopující defekt dvousložkovým lepivým tmelem. V tomto případu bude rovněž nesnadné vypořádávat se s umístěním membrány přes defekt.

Tisseel Duo Quick tvoří:

I: vysrážitelná bílkovina 75-115 mg z toho 70-110 mg fibrinogenu, 2-9 mg fibronektinu, 10-50 IU faktoru XIII, 40-120 g 3000 KIU apronitinu (hovězího), 10-20 mg savčího albuminu, 15-35 mg glycinu, 2-4 mg chloridu sodného, 4-8 mg citrátu sodného, 0,2-0,4 mg polysorbátu 80, 15 mg kreatinmonohydrátu a vody pro injekce do 1 ml.

II: Roztok trombinu obsahuje: 500 IU trombinu, 50 mg proteinu savčí plasmy, 40 mol chloridu vápenatého, 10 mg chloridu sodného, 3 mg glycinu a vodu pro injekce do 1 ml.

Příklad 5

Chondrogeneze buněk v kambiu proteiny obsahujícími RGD motivy

Dva vzorky plátku prasečí okostice byly zkoumány dvěma různými přístupy s kultivačními medii, media pro růst jako jedním a tak zvaným kondiciovaným mediem sestávajícím z media pro růst a 1-20 % kolagenu II. Toto kondiciované medium bylo používáno jako schopné provádět přenos. Po kompletním kondiciování media bylo toto kondiciovanémedium zmraženo na -20°C až do použití.

Medium pro růst bylo užíváno jako kontrolní medium neschopné vyvolávat tvorbu chondrocytů ve vrstvě kambia na plátku okostice.

Dva vzorky plátku okostice, o velikosti % x % cm, získané ze střední části holenní kosti prasete byly umístěny do dvou misek pro kultivaci tkání. Kondiciované medium bylo rozmraženo, centrifugováno 20 minut při 3 000 ot/min a sterilně sfiltrováno 0,8 my filtrem a následně použito na jeden ze vzorků okostice. Inkubováno bylo při 37°C v CO2 inkubátoru po dobu 4 týdnů.

Plátek okostice, o velikosti % x % cm, získaný ze střední části holenní kosti téhož zvířete byl použit pro kontrolní experiment. Tyto vzorky byly inkubovány při 37°C v CO2 inkubátoru po dobu 4 týdnů.

Ty dva vzorky plátku okostice byly obvyklou fixační technikou konservovány ve formaldehydu, různým rutinním barvením, včetně safraninu, obarveny a podrobeny mikroskopickému zkoumání.

Příklad 6

Diferenciace kmene a/nebo prekurzorních buněk

Odsátý materiál ze spongiozy stehenní kosti, obsahující i hematopoetické prekurzozní buňky i stromální kmen morku a/nebo buňky prekursoru, byl nejprve umístěn do baněk pro kultivaci buněčných tkání a zhruba naředěn. Jednotlivé a kolonie tvořící buňky morku byly 24 hodin (primární inkubace) stimulovány v živném prostředí. Po primární inkubaci byly náhradou supernatantu novým mediem jemně odstraněny neulpělé buňky, jak hematopoetické stejně jako nehematopoetické buňky. Ulpělé buňky byly dále 1 týden stimulovány v uvedeném živném mediu, které

25-20 • 9· ··· · ·«

I · ·· · · přivodilo vznik několika kolonií tvořících jednotky s počtem buněk kolísajícím v řádu 10-20.000 buněk/klon a s fibroplastickým fenotypem (CFU-f).

Po proliferaci těchto buněk v živném mediu po další týden nebo více (v závislosti na materiálu donoru) byly některé kultury buněk přeneseny do selekčního prostředí a jsou více specifikovány pro selekci než pro růst. Mohla by to být určitá násada plodového telecího séra o vyšší koncentraci než se obvykle používá (nad 10%) až do 30 obj. % , která byla testována na svoji schopnost diferenciovat buňky na chondroblasty/chondrocyty, nebo testována na svoji schopnost diferenciovat buňky na osteoblasty/osteocyty. U nás jsme identifikovali řečené násady plodového telecího séra^ které vykazovaly tyto selekční charakteristiky. I nadále se na diferenciaci buněk musí testovat nová násada nebo nové násady plodového telecího séra. Buňky se identifikují kvantitativní PCR mRNA (Lané Smith R. a spol., J. Rehab. Reseach and Development March/April 2000, vol. 37) a v případě řad chondrocytů se buňky testují za použití monoklonálních protilátek jako je kolagen typu II Ab-1 (Klon 5B2.5) monoklonální protilátky myší (Lab. Vision Corp. Fremont, California) pro další diferenciaci a zrání buněk (2-4 týdny v selekčním mediu).

Vedle toho vyvinuté kostní buňky prokázaly, že produkují mineralizovanou matrici, že chondroblasty/chondrocyty tvoří v kosti charakteristické dutiny, kde byla matrice metachromaticky zabarvována barvivém jako je safranin-O.

Claims (20)

1. Chrupavková membrána vyznačující se tím, že má nejméně jednu část povrchu nesoucí kompozici obsahující nejméně jednu stimulační molekulu, která vyvolává přenosový signál v chondroblastech/chondrocytech, a která je zvolena ze skupiny tvořené proteiny kolagenu jako je kolagen typů II, VI, IX a XI, proteoglykany jako aggregany, dekorin, fibromodulin a biglykan a nekolagenními proteiny jako kryoprecipitát, fibronektin, vitronektin, fibrinogen, fibrilin, kistrin, echistatin, von Willebrandův faktor, tenascin a anchorin Cil.

2. Chrupavková membrána podle nároku 1 vyznačující se tím, že je neimunogenní, netoxickou, biodegradabilní membránou.

3. Chrupavková membrána podle nároků 1 nebo2 vyznačující se tím, že materiál membrány je porézní nebo v podstatě porézní.

4. Chrupavková membrána podle nároku 3 vyznačující se tím, že membránou je membrána z přírodního nebo syntetického kolagenu typu I nebo její část.

5. Interfaciální membrána vyznačující se tím, že má první část povrchu a druhou část povrchu, obě nesoucí kompozici obsahující nejméně jednu stimulační molekulu, která vyvolává přenosový signál v chondroblastech/ chondrocytech a osteoblastech/osteocytech, a která je zvolena ze skupiny tvořené proteiny kolagenu jako je kolagen typů II, VI, IX a XI, proteoglykany jako aggregany, dekorin, fibromodulin a biglykan, a nekolagenními proteiny jako kryoprecipitát, fibronektin, vitronektin, fibrinogen, fibrilin, kistrin, echistatin, von Willebrandův faktor, tenascin a anchorin Cil.

6. Interfaciální membrána podle nároku 5 vyznačující se tím, že je neimunogenní, netoxickou, biodegradabilní membránou.

7. Interfaciální membrána podle nároků 5 nebo 6 vyznačující se tím, že materiál membrány je porézní nebo v podstatě porézní.

AA ·*·· • A ·♦

A A * A

A A « • AAA A ♦ A A • AAA

A · ·

AAA • A A A A

A A A A A A ♦· *

AAA ♦ · A A A ·

8. Interfaciální membrána podle nároku 7 vyznačující se tím, že membránou je membrána z přírodního nebo syntetického kolagenu typu I nebo její část.

9. Membrána podle některého z nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že stimulační molekula obsahuje nejméně jeden RGD motiv.

10. Membrána podle nároku 9 vyznačující se tím, že stimulační molekulou je přírodní nebo syntetický protein nebo peptid nebo jejich kondenzát nebo směs.

11. Membrána podle nároku 10 vyznačující se tím, že stimulační molekula je zvolena ze skupiny tvořené kolagenem typu II a fibronektinem.

12. Membrána podle nároku 11 vyznačující se tím, že stimulační molekula je připojena k podložce.

13. Sestava pro reparování chrupavky vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu chrupavkovou membránu podle některého z nároků 1 až 4 a alespoň jednu stimulační molekulu podle některého z nároků 1, 9 až 12.

14. Sestava podle nároku 13 vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu interfaciální membránu podle nároků 5 až 8.

15. Použití nejméně jedné membrány podle nároků 1 až 12 pro přípravu sestavy podle nároků 13 nebo 14 pro ošetřování savce majícího defekty chrupavky nebo defekty kosti a chrupavky.

16. Způsob přípravy suspenzí chondroblastů/chondrocytů nebo osteocytu/ osteoblastu vyznačující se tím, že zahrnuje

I) shromáždění mezenchymálních buněk a/nebo prekurzorů mezenchymálních buněk ze zdroje jako je kostní morek, perichondrium, periosteum, krev, cévy nebo svaly, • *0*» ♦ 0 · ·*· ·* 00 • 04 · 9 0 « » » ·

4 4 00 00» «« «

29 · ί ‘ · ’ * ’ · · ·* • 00 000 ·· * 0· »00*

II) přidání sebraných buněk do baňky pro kultivaci buněk obsahující nejméně jedno medium pro růst,

III) pěstování sebraných buněk dokud vznikají jednotky tvořící kolonie s počtem buněk v rozmezí řádu 10 až 20.000 buněk/klon s fibroplastickým fenotypem (CFU-f).

IV) přenesení CFU-f buněk do nové baňky pro kultivaci buněk obsahující nejméně jedno selekční medium pro diferenciaci CFU-f buněk na chondroblasty/ chondrocyty, osteocyty/osteoblasty nebo myoblasty/myotuby a

V) sběr diferenciovaných buněk.

17. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že suspenze jsou používány pro ošetřování defektů chrupavky a/nebo kosti a chrupavky u savců.

18. Způsob podle nároku 15 nebo 16 vyznačující se tím, že selekční medium obsahuje komponenty, které jsou specifičtější pro selekci než pro růst.

19. Způsob kultivace buněk pro preparaci chondroblastu/chondrocytu bez enzymatického působení vyznačující se tím, že obsahuje vytěžování chrupavkových explantátů ze savce;

I) přidání sebraných chrupavkových explantátů do kultivační baňky obsahující nejméně jedno medium pro růst;

II) pěstování chrupavkových explantátů v mediu, aby se získala monovrstva chondroblastu/chondrocytu;

III) propagace chrupavkových explantátů dokud se nezíská několik monovrstev a vysoký počet buněk a

IV) přenesení monovrstvé kultury do autologického růstového media.

20. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že chrupavkové explantáty jsou používány k ošetřování defektů chrupavky a/nebo kosti a chrupavky