CZ20021428A3 - Způsoby a kompozice vyuľívající chinazoliny - Google Patents

Description

Tento vynález se týká derivátů chinazolinonů, které působí jako inhibitory mitotického kinesinu KSP a jsou používané při léčbě buněčných proliferačních onemocnění, jako jsou např. rakovina, hyperplazie, restenóza, srdeční hypertrofíe, poruchy imunity a zánět.

Dosavadní stav techniky

Deriváty chinazolinonů vzbudily zájem lékařské chemie počátkem padesátých let poté, co byla objasněna struktura chinazolinového alkaloidu, 3-[p-keto-gama-(3-hydroxy2-piperidyl)-propyl]-4-chinazolonu, pocházejícího z asijských rostlin a známého pro své antimalarické vlastnosti. Další substituované chinazoliny byly syntetizovány při snaze o přípravu dalších antimalarických agens. Zvláštní význam měla syntéza derivátu 2“methyl-3-o-tolyl-4-(3H)-chinazolinonu. Tato sloučenina, známá jako metachualon, ačkoliv je neúčinná proti protozoa byla shledána jako účinné hypnotikům.

Od představení metachualonu a objevení jeho hypnotických účinků začala být zkoumána farmaceutická aktivita chinazolinonů a odvozených sloučenin. Chinazolinony a jejich deriváty jsou známé pro své různorodé biologické vlastnosti zahrnující hypnotické, sedativní, analgetické, antikonvulzívní, antitusivní a protizánětlivé účinky.

Deriváty chinazolinonů, u kterých bylo popsáno specifické biologické použití, jsou popsány v americkém patentu č. 5,147,875 popisujícím 2-(substituovaný fenyl)-4-oxo chinazoliny s bronchodilatačními účinky. Americké patenty č. 3,723,432, 3,740,442 a 3,925,548 popisují třídu derivátů l-substituovaného-4-aryl-2(lH)-chinazolinonu a jejich použití jako protizánětlivé agens. Evropský patent EP 0 056 637 B1 popisuje třídu derivátů 4(3H)-chinazolinonu pro léčbu hypertenze. Evropský patent EP 0 884 319 Al popisuje farmaceutické kompozice derivátů chinazolin-4-onu používané pro léčbu neurodegenerativních, psychotropních a drogami a alkoholem indukovaných poruch centrálního a periferního nervového systému.

Chinazolinony jsou mezi vzrůstajícím počtem terapeutických agens používány pro léčbu buněčných proliferačních onemocnění včetně rakoviny. Například mezinárodní

přihláška PCT WO 96/06616 popisuje farmaceutickou kompozici zahrnující deriváty chinazolinonu, které inhibují vaskulámí proliferaci buněk hladkého svalstva. Mezinárodní patentová přihláška PCT WO 96/19224 popisuje ty samé deriváty chinazolinonu jako inhibitory proliferace mesengiálních buněk. Americké patenty č. 4,981,856, 5,081,124 a 5,280,027 popisují využití derivátů chinazolinonu pro inhibici thymidylát syntázy, enzymu, který katalyzuje methylaci deoxyuridin mono fosfátu pro produkci thymidin monofosfátu, který je potřebný pro syntézu DNA. Americké patenty č. 5,747,498 a 5,773,476 popisují využití derivátů chinazolinonu pro léčbu rakoviny, která je charakterizovaná nadměrnou nebo nevhodnou aktivitou receptoru tyrosin kinázy. Americký patent č. 5,037,829 se zabývá (lH-azol-l-ylmethyl) substituovanými kompozicemi chinazolinu, které se využívají pro léčbu karcinomů epitelových buněk. Mezinárodní přihláška PCT WO 98/34613 popisuje kompozice zahrnující deriváty chinazolinonu a jejich využití pro zmírnění neovaskularizace a pro léčbu zhoubných nádorů. Americký patent č. 5,187,167 popisuje farmaceutické kompozice zahrnující deriváty chinazolin-4-onu, které vykazují protinádorovou aktivitu.

Další terapeutická agens využívaná pro léčbu rakoviny jsou taxany a vinca alkaloidy. Taxany a vinca alkaloidy působí na mikrotubuly, které jsou přítomné v různých buněčných strukturách. Mikrotubuly jsou základním stavebním kamenem mitotického vřeténka. Mitotické vřeténko je odpovědné za distribuci replikovaných kopií genomu do každé ze dvou dceřiných buněk, které jsou výsledkem buněčného dělení. Předpokládá se, že narušení mitotického vřeténka těmito léčivy bude mít za následek inhibici dělení rakovinných buněk a zapříčiní jejich zánik. Nicméně mikrotubuly tvoří jiné typy buněčných struktur včetně drah pro intracelulární transport v nervových procesech. Jelikož tyto agens nepůsobí specificky na mitotické vřeténko, mají vedlejší účinky, které limitují jejich použitelnost.

Vylepšení specifity těchto agens užívaných pro léčbu rakoviny je velice žádoucí, a to z hlediska terapeutického využití v případě, že by byly omezeny vedlejší účinky spojené s aplikací těchto agens. Dramatická vylepšení léčby rakoviny jsou tradičně spojena s objevením terapeutických agens, která působí novými mechanismy. Příkladem jsou nikoli pouze taxany, ale také kamptoteciny, třída inhibitorů topoisomerázy I. Mitotické kinesinyjako nové protirakovinné agens jsou zajímavé z obou těchto hledisek.

Mitotické kinesiny jsou enzymy nezbytné pro shromáždění a fungování mitotického vřeténka, ale nejsou obvyklou součástí jiných mikrotubulámích struktur, jako • · · 4 ·

4 · · · např. v nervových procesech. Mitotické kinesiny hrají nezbytnou roli během všech fází mitózy. Tyto enzymy jsou „molekulárními motory“, které transformují energii uvolněnou hydrolýzou ATP na mechanickou sílu, která řídí směr pohybu buněčných komponent podél mikrotubulů. Katalytickou doménou dostačující pro tento úkol je kompaktní struktura přibližně 340 aminokyselin. Během mitózy kinesiny uspořádají mikrotubuly do bipolámí struktury, kterou je mitotické vřeténko. Kinesiny ovlivňují jak pohyb chromozomů podél vřeténka mikrotubulů, tak strukturální změny mitotického vřeténka spojené se specifickými fázemi mitózy. Experimentální perturbace funkce mitotického kinesinu má za následek malformaci nebo dysfunkci mitotického vřeténka často končící přerušením buněčného cyklu a smrtí buňky.

Mezi identifikované mitotické kinesiny patří KSP. KSP náleží do vývojově zachované skupiny kinesinů, mikrotubulámích motorů, které směřují kplus konci a shromažďují se do bipolárních homotetramerů skládajících se z antiparalelních homodimerů. Během mitózy se KSP spojuje s mikrotubuly mitotického vřeténka. Mikroinjekce protilátky proti KSP vpravené do lidské buňky zabraňuje oddělení pólů vřeténka během prometafáze, což má za následek vznik monopolámího vřeténka a zapříčiňuje zastavení mitózy a vede k programovému usmrcení buňky. KSP a příbuzné kinesiny v dalších, jiných než lidských organismech, shlukují antiparalelní mikrotubuly a posouvají je naproti sobě, čímž se utvoří dva oddělené póly vřeténka. KSP může také ovlivňovat prodlužování a umístění mikrotubulů do pólů vřeténka v anafázi B.

Lidské KSP (také nazývané HsEg5) jsou popsány [Blangy, et al., Cell, 83: 1159-69 (1995); Whitehead, et al., Arthritis Rheum., 39: 1635-42 (1996); Galgio et al., J. Cell. Biol., 135: 339-414 (1996); Blangy, et al., J Biol. Chem., 272: 19418-24 (1997); Blangy, et al., Cell Motil Cytoskeleton, 40: 174-82 (1998); Whitehead a Rattner, J. Cell Sci., 111: 2551-61 (1998); Kaiser, et al., JBC 274: 18925-31 (1999); GenBank vstupní čísla: X85137, NM004523 a U37426], a fragmenty KSP genu (TRIPS) jsou popsány [Lee, et al., Mol Endocrinol., 9: 243-54 (1995); GenBank vstupní číslo L40372]. Jsou známé xenopus KSP homologa (Eg5), stejně tak jako Drosophila KLP61 F/KRP1 30.

Mitotické kinesiny jsou zajímavé z hlediska objevení a rozvoje nových mitotických chemoterapeutik. Proto je předmětem tohoto vynálezu stanovit metody a kompozice použitelné pro inhibici KSP, mitotického kinesinu.

00 • « » 0

Podstata vynálezu

V souladu s výše uvedeným záměrem tento vynález poskytuje kompozice a metody, které mohou být použity pro léčbu nemocí spojených s proliferaci buněk. Kompozice působí jako KSP inhibitory, zvláště pak lidské KSP inhibitory.

V jednom pohledu se tento vynález vztahuje na metody léčby nemocí buněčné proliferace, na léčbu nemocí souvisejících s aktivitou KSP kinesinu a inhibici KSP kinesinu. Metody využívají sloučeniny, které jsou vybrány ze skupiny sestávající z:

kde:

substituent Ri je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R₂ a substituent R₂' jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, alkylu, oxaalkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu; nebo substituenty R₂ a R₂' spolu tvoří 3- až 7-členný kruh;

substituent R₃ je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu, oxaalkylu, oxaalkylarylu, substituovaného oxaalkylarylu, substituentu R15O- a substituentu R15-NH-;

substituent R₃· je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu a substituentu R15-NH-;

substituent R₃ je vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R4 je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu a substituentu Rie-alkylen-, substituenty R₅, Re, R₇ a Rg jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, alkylu, alkoxy skupiny, halogenu, fluoralkylu, nitro skupiny, dialkylamino skupiny, alkylsulfonylu, alkylsulfonamido skupiny, sulfonamidoalkylu, sulfonamidoarylu, alkylthio skupiny, karboxyalkylu, karboxamido skupiny, aminokarbonylu, arylu a heretoarylu;

substituent R₁₅ je vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent Ri_ó je vybrán z alkoxy skupiny, amino skupiny, alkylamino skupiny, dialkylamino skupiny, N-heterocyklylu a substituovaného N-heterocyklylu.

Nemoci a poruchy, které reagují na léčbu pomocí sloučenin tohoto vynálezu zahrnují rakovinu, hyperplázii, restenózu, srdeční hypertrofíi, poruchy imunity a zánět.

V dalším aspektu se tento vynález vztahuje na sloučeniny použitelné pro inhibici KSP kinesinu. Sloučeniny mají vzorce, které jsou uvedeny výše.

V dalším aspektu se tento vynález vztahuje na metody testování sloučenin, které se mohou vázat na KSP kinesin, např. sloučeniny, které mohou nahrazovat nebo soutěžit •· 9 9 · 9 9 « 9 · 9 9 9 ···· · · · 9 * · 9

999 999 9 · *

999 999 999

999 99 · 99 9999 o vazbu s kompozicemi tohoto vynálezu. Metody zahrnují kombinaci značené sloučeniny tohoto vynálezu, KSP kinesinu a nejméně jednoho kandidátského agens a určení navázání kandidátského bioaktivního agens na KSP kinesin.

V dalším aspektu se tento vynález vztahuje na metody testování modulátorů aktivity KSP kinesinu. Metody zahrnují kombinaci kompozice tohoto vynálezu, KSP kinesinu a nejméně jednoho kandidátského agens a určení efektu kandidátského bioaktivního agens na aktivitu KSP kinesinu.

Podrobný popis vynálezu

Tento vynález je zaměřen na třídu nových sloučenin, jejichž základem je struktura jádra chinazolinonu, a které jsou modulátory mitotických kinesinů. Inhibici nebo modulací mitotických kinesinů, nikoli však jiných kinesinů (např., transportních kinesinů), je dosaženo specifické inhibice buněčné proliferace. Tento vynález je tedy zaměřen na nalezení odchylek ve funkci mitotického kinesinu, které jsou příčinou malformace nebo dysfunkce mitotického vřeténka, což má často za následek přerušení buněčného cyklu a smrt buňky. Metody inhibice lidského KSP kinesinu zahrnují spojení inhibitoru tohoto vynálezu s KSP kinesinem, zvláště pak lidskými KSP kinesiny, zahrnujícím fragmenty a varianty KSP. Může jít rovněž o inhibici ATP hydrolytické aktivity KSP kinesinu a/nebo aktivity tvorby mitotických vřetének tak, že mitotická vřeténka jsou porušena. Meiotická vřeténka mohou být také porušena.

Záměrem tohoto vynálezu je vyvinout inhibitory a modulátory mitotických kinesinů, zvláště pak KSP, za účelem léčby nemocí a poruch spojených s buněčnou proliferaci. Významné vylepšení v léčbě rakoviny, jednoho typu poruch buněčné proliferace, jsou tradičně spojeny s objevením terapeutických agens, které působí pomocí nových mechanismů. Příkladem jsou nejen taxany, což je třída agens, které pravděpodobně působí na tvorbu mikrotubulů, ale také kamptoteciny, třída inhibitorů topoisomerázy I. Kompozice a metody zde popsané se mohou lišit v selektivitě a jsou určeny pro léčbu nemocí spojených s proliferaci buněk, zahrnující kromě jiného rakovinu, hyperplazii, restenózu, srdeční hypertrofii, poruchy imunity a zánět.

Proto se tento vynález vztahuje na metody využívající amidy chinazolinonu o vzorci la:

la sulfonamidy chinazolinonu o vzorci lb

lb a aminy chinazolinonu o vzorci 1 c a 1 d

lc

4 · 44 44*4 44 44

4444 44 4 444*

444 444 · · *

444 444 444 <4 444 44 4 4« 4444 •· · ··»· ·· ···· ·· · ···♦ • » · · · » · · · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 « 99 9999

ld kde:

substituent Ri je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylů a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R2 a substituent R2' jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, alkylu, oxaalkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylů a substituovaného alkylheteroarylu; nebo substituenty R2 a R2' spolu tvoří 3- až 7-členný kruh;

substituent R3 je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylů, substituovaného alkylheteroarylu, oxaalkylu, oxaalkylarylu, substituovaného oxaalkylarylu, substituentu R15O- a substituentu R15-NH-;

substituent R3' je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylů, substituovaného alkylheteroarylu a substituentu R15-NH-;

substituent R3·' je vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylů a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R4 je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného

9 » · 99 9 9

9 9 9 9 ·· 9 ·♦

9 99 9 9

9 9 9 ·

9 f 9 9

9-9 999 99 * · 9 9 9 • 9 9 9 « 99 9999 alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu a substituentu Rió-alkylen-, substituenty R5, Rg, R7 a Rg jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, alkylu, alkoxy skupiny, halogenu, fluoralkylu, nitro skupiny, dialkylamino skupiny, alkylsulfonylu, alkylsulfonamido skupiny, sulfonamidoalkylu, sulfonamidoarylu, alkylthio skupiny, karboxyalkylu, karboxamido skupiny, aminokarbonylu, arylu a heretoarylu;

substituent R15 je vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R^ je vybrán z alkoxy skupiny, amino skupiny, alkylamino skupiny, dialkylamino skupiny, N-heterocyklylu a substituovaného N-heterocyklylu.

Všechny sloučeniny spadající do výše uvedené základní skupiny a jejich deriváty jsou použitelné jako kinesin inhibitory. Ne všechny sloučeniny jsou nové. Zvláště pak určité močoviny (tzn. sloučeniny kde substituent R3 je R15NH) jsou popsány v americkém patentu č. 5,756,502 jako agens, které modifikují aktivitu cholcystokininu. Specifické výjimky v patentových nárocích odrážejí záměr přihlašovatele vyhnout se nárokování látky, která, ačkoli je funkční částí konceptu tohoto vynálezu, není patentovatelná, protože nemá co do činění s rozsahem tohoto vynálezu.

Definice

Termín alkyl se vztahuje na lineární, rozvětvenou nebo cyklickou uhlovodíkovou strukturu a jejich kombinace. Nižší alkyl se vztahuje na alkyly čítající 1 až 5 atomů uhlíku. Příklady nižších alkylů jsou např. methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, s- a t-butyl atd. Výhodnými alkyly jsou alkyly o C20 nebo méně. Výhodnější alkyly jsou alkyly o C13 nebo méně. Cykloalkyl je podmnožina alkylu a zahrnuje cyklické uhlovodíky čítající 3 až 13 atomů uhlíku. Příklady cykloalkylů zahrnují c-propyl, c-butyl, c-pentyl, norbomyl, adamantyl atd. V této patentové přihlášce se alkyl vztahuje na alkanyl, alkenyl a alkynylový zbytek, což znamená, že zahrnuje cyklohexylmethyl, vinyl, allyl, isoprenyl atd. Alkylen se vztahuje na stejný zbytek jako alkyl, ale má dvě volné vazby. Příklady alkylenu zahrnují ethylen (-CH₂CH₂-), propylen (-CH₂CH₂CH₂-), dimethylpropylen (CH₂C(CH3)₂CH₂-) a cyklohexylpropylen (-CH₂CH₂CH(CóHi3)-). Jestliže má alkylový zbytek určitý počet atomů uhlíku, je pojmenován a zahrnuje všechny geometrické isomery, • to · to* · · * to to · toto ··«· ·* ♦ ···* toto to · · · · ·«· · ··· ··· ·«· ·· ··· ·· · toto ··♦· které mají stejný počet atomů uhlíku; tedy např. „butyl“ zahrnuje n-butyl, sec-butyl, isobutyl a t-butyl; „propyl“ zahrnuje n-propyl a isopropyl.

Termíny alkoxy skupina nebo alkoxyl se vztahují na skupiny čítající 1 až 8 atomů uhlíku lineárního, rozvětveného nebo cyklického uspořádání a jejich kombinace vázané přes atom kyslíku na základní struktury. Příklady zahrnují skupiny methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, cyklopropyloxy, cyklohexyloxy atd. Nižší alkoxy skupiny se vztahují na skupinu čítající jeden až čtyři atomy uhlíku.

Termín acyl se vztahuje na skupiny čítající 1 až 8 atomů uhlíku lineárního, rozvětveného, cyklického uspořádání, nesycené, nenasycené a aromatické uhlovodíky a jejich kombinace vázané se základní strukturou přes karbonyl. Jeden nebo více atomů uhlíku acylového zbytku může být nahrazeno dusíkem, kyslíkem nebo sírou, pokud místem spojení k mateřské sloučenině zůstane karbonyl. Příklady zahrnují acetyl, benzoyl, propionyl, isobutyryl, t-butoxykarbonyl, benzyloxykarbonyl atd. Nižší acyl se vztahuje na skupiny čítající jeden až čtyři atomy uhlíku.

Termín aryl a heteroaryl se vztahuje na 5- nebo 6-členný aromatický nebo heteroaromatický kruh obsahující 0 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z O, N, nebo S; bicyklický 9- nebo 10-členný aromatický nebo heteroaromatický kruhový systém obsahující 0 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z O, N, nebo S; nebo tricyklický 13- nebo 14-členný aromatický nebo heteroaromatický kruhový systém obsahující 0 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z O, N, nebo S. Aromatický 6- až 14-členný kruh zahrnuje, např. benzen, naftalen, indan, tetralin, a fluoren a 5- až 10členný aromatický heterocykl zahrnuje např. imidazol, pyridin, indol, thiofen, benzopyranon, thiazol, furan, benzimidazol, chinolin, isochinolin, chinoxalin, pyrimidin, pyrazin, tetrazol a pyrazol.

Termín alkylaryl se vztahuje na zbytek, ve kterém je aryl vázaný na základní strukturu pomocí alkylového zbytku. Příklady zahrnují benzyl, fenethyl, fenylvinyl, fenylallyl atd. Oxaalkyl a oxaalkylaryl se vztahují na alkylové a alkylarylové zbytky, ve kterých jeden nebo více methylenů bylo nahrazeno atomem kyslíku. Příklady oxaalkylových a oxaalkylarylových zbytků zahrnují ethoxyethoxyethyl(3,6-dioxaoktyl), benzyloxymethyl a fenoxymethyl; obecně jsou do této skupiny počítány glykolové ethery jako je polyethylenglykol. Alkylheteroaryl se vztahuje na zbytek, ve kterém je heteroaryl vázán na základní strukturu pomocí alkylového zbytku. Příklady zahrnují furanylmethyl, pyridinylmethyl, pyrimidinylethyl atd.

Termín heterocykl se vztahuje na cykloalkylový nebo arylový zbytek, ve kterém je jeden ze čtyř atomů uhlíku nahrazen heteroatomem jako je kyslík, dusík nebo síra. Příklady heterocyklů, které jsou v rámci tohoto vynálezu zahrnují imidazolin, pyrrolidin, pyrazol, pyrrol, indol, chinolin, isochinolin, tetrahydroisochinolin, benzofuran, benzodioxan, benzodioxol (běžně popisovaný jako methylendioxyfenyl, vyskytuje-li se jako substituent), tetrazol, morfolin, thiazol, pyridin, pyridazin, pyrimidin, thiofen, furan, oxazol, oxazolin, isoxazol, dioxane, tetrahydrofuran atd. Termín „N-heterocyklyl“ se vztahuje na substituent zbytku heterocyklů obsahující atom dusíku. Termín heterocyklyl zahrnuje heteroaryl, který je podskupinou heterocyklylu. Příklady N-heterocyklylových zbytků zahrnují 4morfolinyl, 4-thiomorfolinyl, 1-piperidinyl, 1-pyrrolidinyl, 3-thiazolidinyl, piperazinyl a 4(3,4-dihydrobenzoxazinyl). Příklady substituovaného heterocyklylu zahrnují 4-methyl-l piperazinyl a 4-benzyl-l-piperidinyl.

Termín substituovaný alkyl, aryl a heteroaryl se vztahuje na alkyl, aryl nebo heteroaryl, kde atomy vodíku jsou nahrazeny alkylem, halogenem, hydroxy skupinou, alkoxy skupinou, alkylendioxy skupinou (např. methylendioxy skupinou), fluoralkylem, karboxy skupinou (-COOH), karboalkoxy skupinou (tzn. acyloxy skupinou RCOO-), karboxyalkylem (-COOR), karboxamido skupinou, sulfonamidoalkylem, sulfonamidoarylem, aminokarbonylem, benzyloxykarbonylamino skupinou (CBZ-amino), kyano skupinou, karbonylem, nitro skupinou, dialkylamino skupinou, alkylamino skupinou, amino skupinou, alkylthio skupinou, alkylsulfmylem, alkylsulfonylem, alkylsulfonamido skupinou, arylthio skupinou, arylsulfínylem, arylsulfonylem, amidino skupinou, fenylem, benzylem, heteroarylem, heterocyklylem, fenoxy skupinou, benzyloxy skupinou nebo heteroaryloxy skupinou. Pro účely tohoto vynálezu substituovaný alkyl zahrnuje také oxaalkylový zbytek, tzn. alkylový zbytek, ve kterém je jeden nebo více atomů uhlíku nahrazeno kyslíkem.

Termín halogen se vztahuje na fluor, chlor, brom nebo jod. Výhodné jsou fluor, chlor a brom. Dihalogenaryl, dihalogenalkyl, trihalogenaryl atd. se vztahují na aryl a alkyl substituovaný dvojicí halogenů, není však nutné, aby oba halogeny byly stejné; tedy 4-chlor-3-fluorfenyl spadá pod dihalogenaryly.

Většina sloučenin popsaných v tomto vynálezu obsahuje jedno nebo více asymetrických center (např. uhlík, na který jsou vázány substituenty R₂ a R₂') a mohou se tedy vyskytovat ve formě enantiomerů, diastereoisomerů a ve stereoisomerických formách, které mohou být definovány pomocí termínů absolutní stereochemie, jako (R)- nebo (S)-.

• · ft · ftft ftft • ftft ft ftft ft ·· • ft* • ftft •ft ftft··

Tento vynález zahrnuje všechny tyto možné formy isomerů, včetně racemických směsí, opticky čistých forem a přechodných směsí. Opticky aktivní (R)- a (S)-isomery mohou být připraveny použitím chirálních syntonů nebo chirálních činidel, nebo pomocí tradičních technik. Jestliže zde popsané sloučeniny obsahují olefinickou dvojnou vazbu nebo jiná centra geometrické asymetrie a není-li uvedeno jinak, míní se tím sloučeniny zahrnující oba E a Z geometrické isomery. Stejně tak jsou zahrnuty všechny tautomemí formy.

Je-li to požadováno, mohou být R- a S-isomery rozděleny metodami, které jsou odborníkům v oboru známé. Např. utvořením diastereoisomerických solí nebo komplexů, které mohou být separovány např. krystalizací; utvořením diastereoisomerických derivátů, které mohou být odděleny např. krystalizací, plynovou-kapalinovou nebo kapalinovou chromatografií; selektivní reakcí jednoho enantiomeru s enantiomemě specifickým činidlem, např. enzymatickou oxidací nebo redukcí, která je následována oddělením modifikovaných a nemodifikovaných enantíomerů; nebo plynovou-kapalinovou nebo kapalinovou chromatografií v chirálním prostředí např. na chirálním nosiči jako silikagel s navázanými chirálními ligandy nebo v přítomnosti chirálního rozpouštědla. Zvláště výhodné je, že požadovaný enantiomer je převeden na jinou chemickou entitu jedním ze separačních postupů, které jsou popsány výše, a dalším krokem může být uvolněn požadovaný enantiomer. Alternativně mohou být jednotlivé enantiomery syntetizovány asymetrickou syntézou za použití opticky aktivních činidel, substrátů, katalyzátorů nebo rozpouštědel, nebo převedením jednoho enantiomeru na jiný asymetrickou transformací. Příklad syntézy vycházející z opticky aktivní látky je zobrazen na obrázku 4.

V jednom provedení tohoto vynálezu, mohou být dva sousední substituenty R₂ spojeny dohromady a utvořit tak kruhovou strukturu. Spojená kruhová struktura může opět obsahovat heteroatomy a může být substituována jedním nebo více substituenty „R“. Mělo by se dodatečně upozornit na to, že u cykloalkylu (tzn. nasycené kruhové struktury) může každá pozice obsahovat dvě substituující skupiny, substituent R a substituent R'.

S ohledem na struktury la, lb, lc a ld, zejména na 1 a, je ve výhodném provedení tohoto vynálezu substituent Ri vybraný ze skupiny sestávající z atomu vodíku, alkylu, arylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, alkylarylu a substituovaného alkylarylu.

Ve výhodnějším provedení tohoto vynálezu je substituent Ri vybrán ze skupiny sestávající z atomu vodíku, nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu, fenylu, naftylu a substituovaného fenylu.

• ♦ to ·« ··* · ·· to··* ·· · · · · to ··· <«· «· <

•to· ··· ··* •to ·«« toto · «to ··♦·

V nej výhodněj ším provedení tohoto vynálezu je substituent R_t vybrán z atomu vodíku, ethylu, propylu, methoxyethylu, naftylu, fenylu, bromfenylu, chlorfenylu, methoxyfenylu, ethoxyfenylu, tolylu, dimethylfenylu, chorfluorfenylu, methylchlorfenylu, ethylfenylu, fenethylu, benzylu, chlorbenzylu, methylbenzylu, methoxybenzylu, kyanobenzylu, hydroxybenzylu, tetrahydrofuranylmethylu a (ethoxykarbonyl)ethylu.

Ve výhodném provedení tohoto vynálezu je substituent R₂ vybrán z atomu vodíku, alkylu nebo substituovaného alkylu. Struktury la, lb, lc a ld mají potenciálně chirální centrum na atomu uhlíku, na který je vázán substituent R₂. Tedy poloha R₂ může obsahovat dvě substituční skupiny, substituent R₂ a substituent R₂'. Substituenty R₂ a R₂' mohou být stejné nebo odlišné; jsou-li odlišné, kompozice je chirální. Jestliže substituenty R₂ a R₂' jsou odlišné, výhodná provedení tohoto vynálezu využívají pouze jednoduchý nevodíkový substituent R₂. Úmyslem tohoto vynálezu je použití čistých enantiomerů a směsí enantiomerů, zahrnující racemické směsi, ačkoli obecně bude výhodné použití podstatně čistého eutomeru.

Ve výhodnějším provedení tohoto vynálezu je substituent R₂ vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu a substituovaného nižšího alkylu, a substituent R₂· je atom vodíku. V nej výhodněj ším provedení tohoto vynálezu je substituent R₂ vybrán z atomu vodíku, methylu, ethylu, propylu, methylthioethylu, aminobutylu, (CBZ)aminobutylu, cyklohexylmethylu, benzyloxymethylu, methylsulfinylethylu, methylsulfinylmethylu, hydroxymethylu, benzylu a indolylmethylu.

Ve výhodném provedení tohoto vynálezu je substituent R₃ vybrán ze skupiny sestávající z alkylu, substituovaného alkylu, alkylarylu, heteroarylu, arylu, substituovaného arylu, substituovaného oxaalkylarylu, substituentu R15O- a substituentu R15-NH-, a substituent R15 je vybrán z alkylu, arylu a substituovaného arylu.

Ve výhodnějším provedení, když substituent R₃ není R]₅NH, substituent R₃ je vybrán z Ci-Ci₃ alkylu, substituovaného nižšího alkylu, fenylu, naftylu, fenylu substituovaného jedním nebo více halogeny, nižšího alkylu, nižší alkoxy skupiny, nitro skupiny, karboxy skupiny, methylendioxy skupiny nebo trifluormethylu, bifenylylu, benzylu, fenoxymethylu, halogenfenoxymethylu, fenylvinylu, heteroarylu, heteroarylu substituovaného nižším alkylem a benzyloxymethylu.

Není-li v nej výhodněj ším provedení vynálezu substituent R₃ substituent R15NH, je substituent R₃ vybrán z ethylu, propylu, chlorpropylu, butoxy skupiny, heptylu, butylu, oktylu, tridekanylu, (ethoxykarbonyl)ethylu, dimethylaminoethylu,

4 4

9

4 49« ·

4 «

4 4

44

4 4 4

4 4 • « 4

4444

1 1 11 111 • 44 •i · dimethylaminomethylu, fenylu, naftylu, halogenfenylu, dihalogenfenylu, kyanofenylu, halogen(trifluormethyl)fenylu, chlorfenoxymethylu, methoxyfenylu, karboxyfenylu, ethylfenylu, tolylu, bifenylylu, methylendioxyfenylu, methylsulfonylfenylu, methoxychlorfenylu, chlomaftylu, methylhalogenfenylu, trifluormethylfenylu, butylfenylu, pentylfenylu, methylnitrofenylu, fenoxymethylu, dimethoxyfenylu, fenylvinylu, nitrochlorfenylu, nitrofenylu, dinitrofenylu, bis(trifluormethyl)fenylu, benzyloxymethylu, benzylu, furanylu, benzofuranylu, pyridinylu, indolylu, methylpyridinylu, chinolinylu, pikolinylu, pyrazolylu a imidazolylu.

Ve výhodnějším provedení, je-li substituentem R3 substituent R15NH, substituent R15 je vybrán z nižšího alkylu; cyklohexylu; fenylu; a fenylu substituovaného halogenem, nižším alkylem, nižší alkoxy skupinou nebo nižší alkylthio skupinou.

V nej výhodnějším provedení, je-li substituent R3 substituent R15NH, substituent R15 je isopropyl, butyl, cyklohexyl, fenyl, bromfenyl, dichlorfenyl, methoxyfenyl, ethylfenyl, tolyl, trifluormethylfenyl nebo methylthiofenyl.

Ve výhodném provedení je substituent R4 vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, alkylhetero arylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu a substituentu R_]6-alkylen-, a substituent Ri6 je vybrán z alkoxy skupiny, amino skupiny, alkylamino skupiny, dialkylamino skupiny a N-heterocyklylu.

Ve výhodnějším provedení je substituent R4 vybrán z nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, cyklohexylu; fenylu substituovaného hydroxy skupinou, nižší alkoxy skupinou nebo nižším alkylem; benzylu; heteroarylmethylu; hetroarylethylu; heteroarylpropylu a R]6-alkylenu-, kde substituent Rr, je amino skupina, nižší alkylamino skupina, di(nižší alkyljamino skupina, nižší alkoxy skupina nebo N-heterocyklyl.

V nej výhodnějším provedení je substituent R4 vybrán z methylu, ethylu, propylu, butylu, cyklohexylu, karboxyethylu, karboxymethylu, methoxyethylu, hydroxyethylu, hydroxypropylu, dimethylaminoethylu, dimethylaminopropylu, diethylaminoethylu, diethylaminopropylu, aminopropylu, methylaminopropylu,

2,2-dimethyl-3-(dimethylamino)propylu, l-cyklohexyl-4-(diethylamino)butylu, aminoethylu, aminobutylu, aminopentylu, aminohexylu, aminoethoxyethylu, isopropylaminopropylu, diisopropylaminoethylu, l-methyl-4-(diethylamino)butylu, (tBoc)aminopropylu, hydroxyfenylu, benzylu, methoxyfenylu, methylmethoxyfenylu, dimethylfenylu, tolylu, ethylfenylu, (oxopyrrolidinyl)propylu, (methoxykarbonyl)ethylu,

00		0	0 0	0 000		00		00
•	0	* 0	0	0 9	0		0	0 0
0	0	0	0	0 0	•		0	1
0
0	0	0	•	0 0	0		0	0
0-0		000	··	•		0 9		0000

benzylpiperidinylu, pyridinylethylu, pyridinylmethylu, morfolinylethylu, morfolinylpropylu, piperidinylu, azetidinylmethylu, azetidinylpropylu, pyrrolidinylethylu, pyrrolidinylpropylu, piperidinylmethylu, piperidinylethylu, imidazolylpropylu, imidazolylethylu, (ethylpyrrolidinyl)methylu, (methylpyrrolidinyl)ethylu, (methylpiperidinyl)propylu, (methylpiperazinyl)propylu, furanylmethylu a indolylethylu.

V dalším výhodném provedení je substituent R5 atom vodíku nebo halogen; substituent Rď je atom vodíku, methyl nebo halogen; substituent R₇ je atom vodíku, halogen, methyl nebo trifluormethyl; substituent Rg je atom vodíku nebo halogen.

Ve zvláště výhodné podskupině je substituent Ri benzyl nebo halogenbenzyl; substituent R₂ je vybrán z ethylu a propylu; substituent R₂' je atom vodíku; substituent R3 je substituovaný fenyl; substituent R3'je substituovaný fenyl; substituent R3 substituovaný fenyl; substituent R4 je -(CH)_mOH nebo -(CH₂)_pRi6; m je dvě nebo tři; p je jedna až tři; substituent R5 je atom vodíku; substituent Rg je atom vodíku; substituent R7 je halogen; substituent Rs je atom vodíku; substituent Rió je vybrán z amino skupiny, propylamino skupiny a azetidinylu.

Zvláště u sulfonamidů o struktuře lb je substituent Rj výhodně vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu, fenylu a substituovaného fenylu; substituent R₂ je vybrán z atomu vodíku a nižšího alkylu a substituent R₂' je atom vodíku; substituent R₃Je vybrán ze C1-C13 alkylu; fenylu; naftylu; fenylu substituovaného halogenem, nižším alkylem, nižší alkoxy skupinou, nitro skupinou, methylendioxy skupinou nebo trifluormethylem; bifenylylu a heteroarylu; a substituent R4 je vybrán z nižšího alkylu, cyklohexylu; fenylu substituovaného hydroxy skupinou, nižší alkoxy skupinou nebo nižším alkylem; benzylu; heteroarylmethylu; heteroarylethylu; heteroarylpropyíu; heteroarylethylu; heteroarylpropylu a Ri6-alkylenu, kde substituent Rió je di(nižší alkyljamino skupina, (nižší alkyljamino skupina, amino skupina, nižší alkoxy skupina nebo N-heterocyklyl, zvláště pak pyrrolidin, piperidin nebo imidazolyl.

Zvláště u sulfonamidů o struktuře lb, substituent Ri je nej výhodněj i vybrán z nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu a substituovaného fenylu; substituent R₂ je atom vodíku nebo nižší alkyl; substituent R₂' je atom vodíku; substituent R₃ je vybrán ze substituovaného fenylu a naftylu; substituent R4 je Ri₆-alkylen-; substituent R7 je atom vodíku, fluor, methyl nebo chlor; substituenty R5, Rf, a Rg jsou atomy vodíku; a substituent R,ď je vybrán z di(nižší alkylamino) skupiny, (nižší alkyljamino skupiny, amino skupiny, pyrrolidinu, piperidinu, imidazolylu a morfolinu.

•ti• ti ·» • · · · • ti ·

9 9

9 9 «ti·· • · • · ti • · ti • ti * titi tititi ti ti • titi • titi

Zvláště u aminů o struktuře lc a ld je substituent Ri výhodně vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu, fenylu, naftylu a substituovaného fenylu; substituent R₂ je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu a substituovaného nižšího alkylu a substituent R₂' je atom vodíku; substituent R₃·· je vybrán z C1-C13 alkylu; substituovaného nižšího alkylu; fenylu; naftylu; fenylu substituovaného halogenem, nižším alkylem, nižší alkoxy skupinou, nitro skupinou, methylendioxy skupinou, nebo trifluormethylem; bifenylylu, benzylu a heterocyklylu; a substituent R4 je \ybrán z nižšího alkylu; cyklohexylu; fenylu substituovaného hydroxy skupinou, nižší alkoxy skupinou nebo nižším alkylem; benzylu; substituovaného benzylu; heterocyklylu; heteroarylmethylu; heteroaryl ethylu; heteroarylpropylu a Ri6-alkylenu, kde substituent Riď je di(nižší alkyl)amino skupina, (nižší alkyl)amino skupina, amino skupina, nižší alkoxy skupina nebo N-heterocyklyl.

Zvláště u aminů o struktuře lc a ld je substituent Ri nej výhodněji vybrán z nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu a substituovaného fenylu; substituent R₂ je atom vodíku nebo nižší alkyl; substituent R₂'je atom vodíku; substituent Ryje vybrán ze substituovaného fenylu, heterocyklylu a naftylu; substituent R4 je vybrán ze substituovaného benzylu, heterocyklylu a Ri6-alkylenu-; substituenty Ró a R₇ jsou vybrány z atomu vodíku a halogenu; substituenty R5 a R₈ jsou atomy vodíku; a substituent Rió je vybrán z di(nižší alkylamino) skupiny, (nižší alkyl)amino skupiny, amino skupiny, pyrrolidinylu, piperidinylu, imidazolylu a morfolinylu. Je-li substituent R₃ přítomen (jako v ld) je nejvýhodněji vybrán z halogenfenylu, polyhalogenfenylu, tolylu, dimethylfenylu, methoxyfenylu, dimethoxyfenylu, kyanofenylu, trifluormethylfenylu, trifluormethoxyfenylu, bis(trifluormethyl)fenylu, karboxyfenylu, t-butylfenylu, methoxykarbonylfenylu, piperidinylu a naftylu.

Kompozice tohoto vynálezu naznačené níže jsou syntetizovány za použití známých technik. Např. jak je popsáno v Ager et al., J. of Med. Chem., 20: 379-386 (1977), zde uvedené jako odkaz, chinazolinony mohou být získány kysele katalyzovanou kondenzací N-acylanthranilových kyselin s aromatickými primárními aminy. Další postupy přípravy chinazolinonů jsou popsány v americké patentové přihlášce č. 5,783,577; 5,922,866 a 5,187,167, všechnyjsou zde uvedenyjako odkazy.

Kompozice tohoto vynálezu mohou být připraveny způsobem, kterýje zobrazen na obrázcích 1, 2, 4 a 5. Sloučeniny o vzorci ld jsou připraveny analogickým způsobem jako na obrázku 1, až na to, že acyl halid je ve finálním kroku nahrazen alkyl halidem.

• · · ··· * · • · · ♦ » ♦ « «·· * ··· ♦ · ♦ ··· ·♦ ··· ·· · ·· ·♦··

Takto připravené kompozice tohoto vynálezu nacházejí využití v různých aplikacích. Mitóza může být upravována různými způsoby; to znamená, že může být ovlivněna jak zvyšováním tak snižováním aktivity komponent mitotické dráhy. Jinak řečeno mitóza může být ovlivněna (např. narušena) narušením rovnováhy a také různými inhibičními nebo aktivačními komponentami. Podobnými způsoby může být upravována meióza.

V výhodném provedení jsou kompozice tohoto vynálezu používány pro modulaci tvorby mitotického vřeténka, tím že způsobují prodloužení buněčného cyklu zadržením v mitóze. Termín „modulace“ je zde použit ve smyslu upravení tvorby mitotického vřeténka, zahrnující zvýšení nebo snížení tvorby mitotického vřeténka. „Tvorbou mitotického vřeténka“ se v tomto textu rozumí uspořádání mikrotubulů do bipolární struktury mitotickými kinesiny. „Dysfunkcí mitotického vřeténka“ se zde rozumí zastavení mitózy a utvoření monopolámího vřeténka.

Kompozice tohoto vynálezu jsou použitelné pro vazebné a/nebo modulační aktivity mitotického kinesinu, KSP. V výhodném provedení je KSP lidský KSP, ačkoliv KSP kinesiny z jiných organismů mohou být také použity. V tomto kontextu modulace znamená jak zvýšení tak snížení oddělení pólů vřeténka způsobující malformace, tzn. roztažení pólů mitotického vřeténka, nebo dále také způsobující morfologické perturbace mitotického vřeténka. V rámci definovaného KSP jsou pro tyto účely také zahrnuty varianty a/nebo fragmenty KSP. Viz. americká patentová přihláška (číslo 09/428,156) „Methods of Screening for Modulators of Cell Proliferation a Methods of Diagnosing Cell Proliferation States“, podaná 27. října 1999, která je zde uvedena jako odkaz v celém svém rozsahu. Mimoto v tomto vynálezu mohou být použity další mitotické kinesiny. Nicméně kompozice tohoto vynálezu jsou specifické pro KSP.

Pro určení aktivity jsou obecně jak KSP, tak sloučeniny podle tohoto vynálezu nerozpustně vázány na nerozpustný nosič s izolovanými místy pro navázání vzorku (např. na mikrotitrační destičky, misky atd.). Nerozpustný nosič může být vyroben z jakékoli směsi, ke které se tato kompozice může vázat, je snadno oddělitelný od rozpustného materiálu a dále je také celkově kompatibilní s metodami testování. Povrch těchto nosičů může být hladký nebo pórovitý a nosiče mohou mít jakýkoliv vhodný tvar. Příklady vhodných nerozpustných nosičů zahrnují mikrotitrační destičky, misky, membrány a perličky, které jsou obvykle vyrobeny ze skla, plastu (např. polystyrenu), polysacharidů, nylonu nebo nitrocelulózy, Teflonu, atd. Mikrotitrační destičky a misky jsou obzvláště • fr frfr fr frfr 4 • fr 4 ·« frfrfrfr vhodné, protože může být současně provedeno mnoho testů ve velice malém množství činidla a vzorku. Konkrétní způsob vázání kompozice není rozhodující v případě, že je slučitelný s činidly a metodami tohoto vynálezu, zachovává aktivitu kompozice a je nedifůzní. Výhodné metody navázání zahrnují použití protilátek (které stericky nebrání buď navázání ligandu nebo aktivaci sekvence, když je protein navázaný na nosič), přímé navázání na „lepkavý “ iontový nosič, chemickou zesíťovanou vazbu, syntézu proteinu nebo agens přímo na povrchu atd. Následuje navázání proteinu nebo agens, přebytečný nenavázaný materiál je odstraněn omytím. Oblasti obsahující vzorek pak mohou být zablokovány pomocí inkubace s hovězím sérovým albuminem (BSA), kaseinem nebo jiným neškodným proteinem či jiným podílem.

Antimitotické agens tohoto vynálezu mohou být použity samotné pro modulaci aktivity mitotického kinesinu, zvláště KSP. V tomto provedení jsou mitotické agens tohoto vynálezu kombinovány s KSP a je měřena aktivita KSP. Aktivita kinesinu je pracovníkům v oboru známa a zahrnuje jednu nebo více aktivit kinesinu. Aktivity kinesinu zahrnují schopnost ovlivňovat ATP hydrolýzu; vazbu mikrotubulů; skluz a polymerizaci/depolymerizaci (účinky na dynamiku mikrotubulů); vazbu na další proteiny vřeténka; vazbu na proteiny účastnící se kontroly buněčného cyklu; fungování jakožto substrátu pro ostatní enzymy, jako jsou kinázy a proteázy; specifické buněčné aktivity kinesinu jako je separace pólů vřeténka.

Metody na měření pohyblivosti jsou pracovníkům v oboru dobře známy. [Viz např., Halí, et al. (1996), Biophys. J., 71; 3467-3476, Turner et al., 1996, AnaL. Biochem. 242 (1): 20-5; Gittes et al., 1996, Biophys. J. 70 (1) : 418-29; Shirakawa et al., 1995, J. Exp. BioL 198: 1809-15 ; Winkelmann et al., 1995, Biophys. J. 68: 2444-53; Winkelmann et al., 1995, Biophys. J. 68: 72S.]

Metody pro stanovení hydrolytické aktivity ATPázy známé ze stavu techniky mohou být rovněž použity. Výhodně se využívají metody založené na roztocích. Americká přihláška 09/314,464, podaná 18. května, 1999, která je zde uvedena jako odkaz v celém svém rozsahu, tyto testy popisuje. Alternativně jsou používány konvenční metody. Například může být kvantifikováno uvolnění Pj substituentu z kinesinu. V jednom z výhodných provedení využívá test hydrolytické aktivity ATPázy 0,3 M PCA (kyselina chloristá) a substituční látku malachitovou zeleň (8,27 mM molybdenan sodný, 0,33 mM oxalát malachitové zeleně a 0,8 mM Triton X-100). Při provedení testu se 10 μΐ reakční směsi utlumí v 90 μΐ ledové 0,3 M kyselině chloristé. Používají se fosfátové standardy, • 0 0» <0 ·

0 0 • 4 · ·· »««0 • · ·· »0 0 • 00 ·00

0 0 0 0 0 04 000 04 0

0·

0« 0000 takže data mohou být převedena na mM uvolněného anorganického fosfátu. Jakmile jsou všechny reakce a standardy utlumeny kyselinou chloristou, přidá se např. do příslušných jamek mikrotitrační destičky 100 μΐ činidla malachitové zeleně. Směs se nechá vyvíjet 10 až 15 minut a destička je odečtena při absorbanci 650 nm. Pokud jsou použity fosfátové standardy, mohou být hodnoty absorbance převedeny na mM Pi a porovnány v čase. Testy ATPázy používané v oboru zahrnují rovněž testy luciferázou.

ATPázová aktivita motoru domény kinesinu může být rovněž použita k testování účinku modulačních agens. V jednom provedení tohoto vynálezu jsou ATPázové testy kinesinu prováděny v nepřítomnosti mikrotubulů. Ve výše uvedených testech mohou být stanoveny různé typy modulačních agens. V výhodném provedení tohoto vynálezu je účinek modulačních agens nezávislý na koncentraci mikrotubulů a ΑΤΡ. V dalším provedení tohoto vynálezu může být účinek činidel na ATPázu kinesinu snížen zvýšením koncentrace ATP, mikrotubulů nebo obou. V dalším provedení tohoto vynálezu je účinek tohoto modulačního agens zesílen zvýšením koncentrace ATP, mikrotubulů nebo obou.

Agens, které modulují biochemickou aktivitu KSP in vitro pak mohou být testovány in vivo. Metody pro in vivo sledování těchto činidel zahrnují testy rozdělení buněčného cyklu, životaschopnosti buněk nebo sledování přítomnosti, morfologie, aktivity, rozdělení nebo množství mitotických vřetének. Metody pro sledování rozdělení buněčného cyklu populace buněk například pomocí průtokové cytometrie jsou pracovníkům v oboru dobře známy. Stejně tak metody pro určení životnosti buněk. Viz například americká patentová přihláška „Methods of Screening for Modulators of Cell Proliferation a Methods of Diagnosing Cell Proliferation States,“ podaná 22. října, 1999, čísla 09/428,156, která je zde zahrnuta ve formě odkazu.

Kromě výše popsaných testů jsou pracovníkům v oboru dobře známy rovněž mikroskopické metody pro testování tvorby vřeténka a malformací (viz např., Whitehead a Rattner (1998), J. Cell Sci. 111: 2551-61 ; Galgio et al, (1996) J. Cell biol., 135: 399-414).

Kompozice tohoto vynálezu inhibují KSP kinesin. Jedním měřítkem inhibice je IC50, definované jako koncentrace kompozice, při které je aktivita KSP snížena o 50 %. Výhodné kompozice mají IC50 kolem 1 mM, přičemž výhodná provedení tohoto vynálezu mají IC₅₀ menší než 100 μΜ, přičemž výhodnější provedení tohoto vynálezu mají IC50 nižší než 10 μΜ, zvláště výhodná provedení tohoto vynálezu mají IC50 nižší než 1 μΜ, speciálně výhodná provedení tohoto vynálezu mají IC50 nižší než 100 nM, a nejvýhodnější

·»* ·* * ·· ·«*« provedení tohoto vynálezu mají IC₅o méně než 10 nM. Měření IC50 se provádí s použitím ATPázového testu.

Dalším měřítkem je inhibice Kj. Pro sloučeniny s IC50 nižším než 1 μΜ je Kj nebo Kd definováno jako disociační konstanta interakce chinazolinonu s KSP. Výhodné sloučeniny mají K nižší než 100 μΜ, přičemž výhodná provedení tohoto vynálezu mají K nižší než 10 μΜ, zvláště výhodná provedení tohoto vynálezu mají K, nižší než 1 μΜ, speciálně výhodná provedení mají Kj nižší než 100 nM, a nejvýhodnější provedení tohoto vynálezu mají Kj nižší než 10 nM. Stanovení Kj sloučeniny z IC50 je založené na třech předpokladech. První předpoklad, pouze jedna molekula sloučeniny se váže na tento enzym a nedochází k žádné součinnosti. Druhý předpoklad, koncentrace aktivního enzymu a testované sloučeniny jsou známé (tj. v přípravě nejsou žádná významná množství nečistot nebo inaktivních forem). Třetí předpoklad, enzymatická aktivita komplexu enzym-inhibitor je nulová. Tyto hodnoty (např. koncentrace sloučeniny) jsou dosazeny do rovnice:

V = V_maxE₀

I(E_o + I_o + Kd) - ý( E_o + I_o + Kd ý - 4 E_o Io

2E_n

Kde V je sledovaná rychlost, V_max je rychlost volného enzymu, I_o je koncentrace inhibitoru, E_o je koncentrace enzymu a Kj je disociační konstanta komplexu enzyminhibitor.

Dalším měřítkem inhibice je GI₅₀, definovaný jako koncentrace sloučeniny, která vede ke snížení rychlosti buněčného růstu o 50%. Výhodné sloučeniny mají GI50 nižší než 1 mM. Úroveň preference provedení je funkcí jejich GI50: ty, které mají GI50 nižší než 20 μΜ, jsou výhodnější; ty, které mají GI₅₀ 10 μΜ, jsou ještě více preferovány; ty, které mají GI50 menší než 1 μΜ, jsou opět výhodnější; ty, které mají GI50 100 nM, jsou ještě více preferovány; ty, které mají GI50 nižší než 10 nM, jsou ještě více preferovány. Měření GI50 je prováděno s použitím testu na proliferaci buněk.

Kompozice tohoto vynálezu jsou používány pro léčbu onemocnění proliferace buněk. Stavy nemocí, které lze léčit metodami a kompozicemi zde zahrnutými mimo jiné zahrnují rakovinu (blíže popsáno dále v textu), autoimunitní onemocnění, artritidu, • * • · · • to • · » ·· ··· ·-♦ ·· ·♦ • « to to to * · • •e · · * • · to · · · •to · ·· ···· odmítnutí štěpu, zánětlivé onemocnění střev, proliferaci indukovanou lékařskými postupy jako například operacemi, angioplastikou a podobně. Oceňuje se, že v některých případech buňky nemusí být ani ve stavu hyperproliferace nebo hypoproliferace (abnormální stavy), a přesto potřebují léčbu. Například během léčby zranění mohou buňky proliferovat „normálně“, ale může být požadováno zesílení jejich proliferace. Podobně, jak již bylo výše uvedeno, v oblasti zemědělství, buňky mohou být v „normálním“ stavu, ale může být požadována modulace proliferace pro zvýšení úrody přímým posílením růstu úrody nebo inhibici růstu rostliny nebo organismu, který úrodu nepříznivě ovlivňuje. Proto jedno provedení tohoto vynálezu zahrnuje aplikaci do buněk nebo jednotlivců trpících či počínajících trpět kteroukoli z těchto nemocí či stavů.

Kompozice a metody tohoto vynálezu jsou považovány za zvláště užitečné v léčbě rakoviny včetně pevných nádorů jako jsou kožní nádory, rakovina prsu, rakovina mozku, karcinomy děložního čípku, karcinomy varlat atd. Přesněji, rakoviny, které mohou být léčeny kompozicemi a metodami tohoto vynálezu kromě jiného zahrnují: srdeční: sarkom (angiosarkom, fibrosarkom, Rhabdomyosarkom, liposarkom), myxom, rhabdomyom, fíbrom, lipom a teratom; plíce: bronchogenní karcinom (dlaždicové buňky, nediferenciované malé buňky, nediferenciované velké buňky, adenokarcinom), alveolámí (bronchiolámí) karcinom, bronchiální adenom, sarkom, lymfom, chondromatózní hamartom, mesotheliom; gastrointestinální soustava: jícen (karcinom dlaždicového epitelu, adenokarcinom, leiomyosarkom, lymfom), žaludek (karcinom, lymfom, leiomyosarkom), pankreas (duktální adenokarcinom, insulinom, glukagonom, gastrinom, karcinoidní nádory, vipom), tenké střevo (adenokarcinom, lymfom, karcinoidní nádory, Karposiho sarkom, leiomyom, hemangiom, lipom, neurofibrom, fíbrom), tlusté střevo (adenokarcinom, tubulámí adenom, vilózní adenom, hamartom, leiomyom); močopohlavní trakt: ledviny (adenokarcinom, Wilmův nádor [nefroblastom], lymfom, leukémie), močový měchýř a močová trubice (karcinom dlaždicového epitelu, karcinom přechodných buněk, adenokarcinom), prostata (adenokarcinom, sarkom), varlata (seminom, teratom, embryonální karcinom, teratokarcinom, choriokarcinom, sarkom, karcinom vmezeřených buněk, fíbrom, fibroadenom, adenomatózní nádory, lipom); játra: hepatom (karcinom jaterní ch buněk), cholangiokarcinom, hepatoblastom, angiosarkom, adenom jaterní ch buněk, hemangiom; kosti: osteogenní sarkom (osteosarkom), fibrosarkom, maligní fíbrózní histiocytom, chondrosarkom, Ewingův sarkom, maligní lymfom (sarkom retikulámích buněk), násobný myelom, maligní tumor chordoma obrovských buněk, osteochrondrom • ti •* ti · titi titi titi titi·· ZZti o·* ti· • ti ti · ti ti tititi ti «•ti ti ti ti tititi titi tititi ti ti ti ti ti tititi· (osteokartilaginózní exostóza), benigní chondrom, chondroblastom, chondromyxofibrom, osteoidní osteom a nádory obrovských buněk; nervový systém: lebka (osteom, hemangiom, granulom, xanthom, deformující záněty kostí), mozkové pleny (meningiom, meningiosarkom, gliomatóza), mozek (astrocytom, medulloblastom, gliom, ependyom, germinom [pinalom], multiformní glioblastom, oligodendrogliom, schwannom, retinoblastom, kongenitální nádory), neurofibrom míchy, meningiom, gliom, sarkom); gynekologické: děloha (karcinom endometria), děložní čípek (karcinom děložního čípku, pre-tumorální cervikální dysplazie), vaječníky (karcinom vaječníků [serózní cystadenokarcinom, mucinoidní cystadenokarcinom, neklasifíkované karcinomy], nádory buněk zrnité blány, nádory Sertoli-Leydigových buněk, dysgerminom, maligní teratom), vulva (karcinom dlaždicovitého epitelu, intraepitelový karcinom, adenokarcinom, fibrosarkom, melanom), pochva (karcinom jasných buněk, karcinom dlaždicovitého epitelu, botryoidní sarkom, embryonální rhabdomyosarkom), karcinom vejcovodů; hematologie: krev (myeloidní leukémie [akutní a chronická], akutní lymfoblastická leukémie, chronická lymfocytická leukémie, myeloproliferativní nemoci, násobný myelom, myelodysplastický syndrom), Hodgkinsova nemoc, non-Hodgkinův lymfom [maligní lymfom]; kůže: maligní melanom, karcinom bazálních buněk, karcinom dlaždicového epitelu, Karposiho sarkom, mateřská znaménka, lipom, angiom, dermatofibrom, keloidy, lupénka; nadledvinky: neuroblastom. Takže zde používaný termín „rakovinná buňka“ zahrnuje buňky postižené kterýmkoli zvýše uvedených stavů.

Kompozice tohoto vynálezu jsou tedy aplikovány na buňky. „Aplikací“ se v tomto textu rozumí použití terapeuticky účinné dávky mitotického agens tohoto vynálezu na buňky v buněčné kultuře nebo u pacienta. „Terapeuticky účinnou dávkou“ se zde rozumí dávka, která vyvolává účinek, kvůli kterému je aplikována. Přesná dávka bude záviset na účelu léčby a pro pracovníky v oboru bude zjistitelná pomocí známých technik. Pracovníci v oboru vědí, že mohou být nutné úpravy pro systémovou nebo lokální distribuci, věk, tělesnou váhu, celkový zdravotní stav, pohlaví, dietu, čas aplikace, interakci léčiva a závažnost stavu pacienta a tyto úpravy je možno stanovit pomocí obvyklých experimentů, které jsou pracovníkům v oboru známy. „Buňkami“ se v tomto textu rozumí téměř jakákoli buňka, ve které může být upravena mitóza nebo meióza.

„Pacientem“ se pro účely tohoto vynálezu rozumí jak lidé, tak další živočichové, zvláště pak savci a další organismy. Tak jsou tyto metody použitelné jak pro humánní ·· • · · ♦ · • · • · »· * • · ♦

«· ·»·* a* • 9 9 ·

9

9

9999 medicínu, tak pro veterinární použití. Ve výhodném provedení tohoto vynálezu je pacientem savec a v nej výhodnějším provedení tohoto vynálezu je pacientem člověk.

Mitotické agens mající požadované farmakologické aktivity mohou být aplikovány ve fyziologicky akceptovatelném nosiči pacientovi, jak je popsáno v tomto textu. V závislosti na způsobu aplikace mohou být sloučeniny připraveny různými způsoby, jak bude dále popsáno. Koncentrace terapeuticky aktivní sloučeniny v léčebném přípravku se mohou lišit od 0,1 do 100 hmotnostních %. Agens mohou být aplikována samotná nebo v kombinaci s jinou léčbou, např. ozařováním nebo jinými chemoterapeutickými agens.

Ve výhodném provedení tohoto vynálezu jsou farmaceutické kompozice ve formě rozpustné ve vodě, jako jsou farmaceuticky akceptovatelné sole, které zahrnují sole vzniklé přidáním jak kyseliny, tak zásady. „Farmaceuticky akceptovatelné sole vzniklé přidáním kyseliny“ znamenají ty sole, které si zachovávají biologickou účinnost volných bází, a které nejsou biologicky aktivní či jinak nežádoucí, které jsou připraveny takovými anorganickými kyselinami jako je kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina sírová, kyselina dusičná, kyselina fosforečná a podobně, a které jsou připraveny organickými kyselinami jako je kyselina octová, kyselina propionová, kyselina glykolová, kyselina pyrohroznová, kyselina šťavelová, kyselina maleinová, kyselina malonová, kyselina jantarová, kyselina fumarová, kyselina vinná, kyselina citrónová, kyselina benzoová, kyselina skořicová, kyselina mandlová, kyselina methansulfonová, kyselina ethansulfonová, kyselina p-toluensulfonová, kyselina salicylová a tak podobně.

„Farmaceuticky akceptovatelné sole vzniklé přidáním zásady“ zahrnují sole odvozené od anorganických zásad jako jsou sole sodíku, draslíku, lithia, amonia, vápníku, hořčíku, železa, zinku, mědi, manganu, hliníku a podobně. Zvláště výhodnými jsou sole amonia, draslíku, sodíku, vápníku a hořčíku. Sole odvozené od farmaceuticky akceptovatelných netoxických organických zásad zahrnují sole primárních, sekundárních a terciárních aminů, substituované aminy zahrnující přirozeně se vyskytující substituované aminy, cyklické aminy a pryskyřice měnící záporné ionty, jako je isopropylamin, trimethylamin, diethylamin, triethylamin, tripropylamin a ethanolamin.

Farmaceutické přípravky mohou být připraveny v různých formách, jako jsou granule, tablety, pilulky, čípky, kapsle, suspenze, masti, pleťové vody a podobně. Pro přípravu kompozic obsahujících terapeuticky aktivní sloučeniny mohou být použity farmaceutické organické či anorganické nosiče a/nebo ředící roztoky vhodné pro orální nebo povrchové použití. Ředící roztoky známé pracovníkům v oboru zahrnují například • 4 1

4

4

4

4444 *· 44*4

4» • to •

• to to • to • · to 4 to ·

44 vodná média, rostlinné a živočišné oleje a tuky. Stabilizační agens, zvlhčující a emulzifikační agens, sole pro změnu osmotického tlaku nebo pufry zajišťující odpovídající hodnotu pH a látky podporující prostupnost pokožkou mohou být použity jako pomocná agens. Farmaceutické kompozice mohou rovněž obsahovat jednu nebo více z následujících látek: nosičové proteiny jako je sérový albumin; pufry; plnidla jako je mikrokrystalinová celulóza, laktóza, kukuřičný škrob a jiné škroby; vazebná činidla; sladidla a další ochucovadla; barvící agens a polyethylen glykol. Aditiva jsou pracovníkům v oboru dobře známá a mohou být použita v řadě formulací.

Aplikace mitotických agens tohoto vynálezu může být provedena mnoha různými způsoby, jak bude dále uvedeno, včetně, nikoli však pouze, orálně, podkožně, nitrožilně, intranazálně, transdermálně, intraperitoneálně, intramuskulámě, intrapulmonámě, vaginálně, rektálně nebo nitroočně. V některých případech, například při léčbě zranění nebo zánětů, mohou být antimitotická agens aplikována přímo jako roztok nebo sprej.

Pro využití sloučenin tohoto vynálezu v metodě testování sloučenin, které se váží na KSP kinesin, je KSP vázán na nosič a sloučenina tohoto vynálezu, (která je mitotickým agens), je k testu přidána. Alternativně je sloučenina tohoto vynálezu vázána k nosiči a přidán KSP. Třídy sloučenin, mezi kterými lze najít nová vazebná agens, zahrnují specifické protilátky, nepřírodní vazebná agens identifikovaná pomocí chemických knih, peptidová analoga a tak podobně. Zvláště zajímavé jsou vyhledávací testy pro možná agens s nízkou toxicitou pro lidské buňky. Pro tyto účely může být použito široké spektrum testů včetně in vitro testů využívajících vazbu proteinů na značené proteiny, elektroforetické testy změny pohyblivosti látek, imunotesty pro vazbu proteinů, testy funkcí (fosforylační test aj.) a tak podobně.

Stanovení vazby mitotického agens na KSP může být provedeno řadou způsobů. Ve výhodném provedení tohoto vynálezu je mitotické agens (sloučenina tohoto vynálezu) označena například fluorescenční nebo radioaktivní složkou a vazba je stanovena přímo. To může být například provedeno navázáním veškerého KSP nebo jeho části k pevnému nosiči, přidáním značeného mitotického agens (například sloučeniny tohoto vynálezu, ve které byl nejméně jeden atom nahrazen detekovatelným izotopem), odmytím přebytku činidel a stanovením množství značené látky na pevném nosiči. Mohou být použity různé odborníkům známé postupy blokování a odmývání příslušných látek.

Termínem „značený” se v tomto textu míní, že daná sloučenina je buď přímo nebo nepřímo označena značkou, která poskytuje detekovatelný signál, jako je například ·· ···· i · · • · · • · · · • · · ·· r a· • · • · • · • · ·* • · · • · • · • · ··<· radioizotop, fluorescenční značka, enzym, protilátka, částice jako jsou magnetické částice, chemiluminiscenční značka nebo specifické vazebné molekuly atd. Specifické vazebné molekuly zahrnují páry jako jsou biotin a streptavidin, digoxin a antidigoxin atd. Pro specifické vazebné členy bude komplementární člen normálně označen molekulou, která umožňuje detekci, pomocí známých postupů, jak bylo uvedeno výše. Značka může detekovatelný signál poskytnout přímo nebo nepřímo.

V některých provedeních tohoto vynálezu je značena pouze jedna složka. Například kinesinové proteiny mohou být značeny v poloze tyrosinu použitím ¹²⁵I nebo pomocí fluoroforů. Je rovněž možné označit více než jednu složku různými značkami použitím například ¹²⁵I pro proteiny a fluorofory pro mitotická agens.

Sloučeniny tohoto vynálezu mohou být rovněž použity jako kompetitoři pro vyhledávání dalších kandidátů léčiv. „Kandidátské bioaktivní agens” nebo “kandidát na léčivo” nebo gramatický ekvivalent, jak je zde použito, popisuje jakoukoli molekulu, např. protein, oligopeptid, malou organickou molekulu, polysacharid, polynukleotid atd., který má být testován na bioaktivitu. Mohou mít schopnost přímo nebo nepřímo změnit fenotyp buněčné proliferace nebo exprese sekvence pro buněčnou proliferaci, a to jak sekvence nukleové kyseliny, tak sekvence proteinů. V jiných případech je testována změna vazby a aktivity proteinů buněčné proliferace. Testy tohoto druhu mohou být prováděny buď v přítomnosti nebo nepřítomnosti mikrotubulů. V případech, kdy je testována vazba nebo aktivita proteinu, nezahrnují výhodná provedení tohoto vynálezu molekuly, u kterých je již známo, že se vážou k těmto konkrétním proteinům, jako například na polymerní struktury jako jsou mikrotubuly a zdroje energie jako je ATP. Výhodná provedení testů zde zahrnují kandidátské agens, která se nevážou na proteiny buněčné proliferace ve svém endogenním nativním stavu zde označované jako „exogenní” agens. V jiném provedení tohoto vynálezu exogenní agens nezahrnují protilátky na KSP.

Kandidátské agens mohou zahrnovat mnoho chemických tříd, typicky jsou to organické molekuly, výhodně malé organické sloučeniny mající molekulovou hmotnost větší než 100 a menší než okolo 2500 daltonů. Kandidátské agens obsahují funkční skupiny nutné pro strukturální interakci s proteiny, zvláště pak pro vodíkové a lipofilní vazby a obvykle obsahují amin, karbonyl, hydroxyl, ether nebo karboxy skupinu, výhodně nejméně dvě funkční skupiny. Kandidátské agens často zahrnují cyklické nebo heterocyklické struktury a/nebo aromatické nebo polyaromatické struktury substituované jednou nebo více výše uvedenými funkčními skupinami. Kandidátské agens jsou často také nalezeny mezi biomolekulami zahrnujícími peptidy, sacharidy, mastné kyseliny, steroidy, puriny, pyrimidiny, deriváty, strukturálními analogy a jejich kombinacemi. Zvláště výhodné jsou peptidy.

Kandidátské agens jsou získávány z bohatých zdrojů zahrnujících knihovny syntetických a přírodních sloučenin. Například některé z nich jsou získávány náhodnou nebo přímou syntézou širokého spektra organických sloučenin a biomolekul, včetně exprese náhodných oligonukleotidů. Alternativně jsou dostupné nebo připravované knihovny přírodních sloučenin ve formě bakteriálních, fungálních, rostlinných a zvířecích extraktů. Dále jsou pak přirozeně nebo synteticky produkované knihovny a sloučeniny jsou modifikovány obvyklými chemickými, fyzikálními a biochemickými způsoby. Známé farmakologické agens mohou být převedeny na strukturní analogy náhodnými chemickými modifikacemi jako jsou acylace, alkylace, esterifikace a amidifikace.

Na prvním vzorku mohou být provedeny kompetitivní testy kombinací KSP s kandidátem léčiva. Na druhém vzorku mohou být provedeny testy obsahující mitotické agens, KSP a kandidáta na léčivo. Toto může být provedeno v přítomnosti nebo nepřítomnosti mikrotubulů. Pro oba vzorky je určeno navázání kandidáta léčiva a změny nebo odlišnosti v navázání mezi oběma vzorky určuje přítomnost činidla, které je vhodné pro vazbu s KSP a potenciálně moduluje jeho aktivitu. To znamená, že je-li navázání kandidáta na léčivo v druhém vzorku odlišné oproti prvnímu vzorku, je kandidát na léčivo vhodný pro vazbu s KSP.

Ve výhodném provedení tohoto vynálezu je navázání kandidáta léčiva určováno pomocí kompetitivních testů. V tomto provedení jsou kompetitorem látky, které jsou schopné vázat se na KSP, jako jsou protilátky, peptidy, vazebný partner, ligandy, atd. Za jistých okolností může být kompetitivní navázání mezi kandidátem léčiva a vazebnou látkou takové, že vazebná látka nahrazuje kandidáta léčiva.

V jednom provedení vynálezu je kandidát na léčivo značený. Buď kandidát léčiva nebo kompetitor nebo oba jsou přidány ke KSP na dobu dostačující pro vytvoření vazby, jestliže k ní dochází. Inkubace může být provedená při jakékoliv teplotě, která zaručuje optimální aktivitu, obvykle mezi 4 a 40°C.

Inkubační periody jsou vybrány pro optimální aktivitu, ale mohou být také optimalizovány pro rychlé testování. Obvykle dostačuje doba mezi 0,1 a 1 hodinou. Přebytek činidla je obvykle odstraněn nebo vymyt. Poté je přidána druhá komponenta a následuje indikace navázání pomocí přítomnosti nebo absence značené komponenty.

V výhodném provedení je kompetitor přidáván jako první a následně poté je přidán kandidát na léčivo. Nahrazení kompetitoru je indikací, že kandidát léčiva se navázal na KSP a je tedy vhodný pro tuto vazbu a potenciálně moduluje aktivitu KSP. V tomto provedení může být značen také komponent. A tedy např. je-li kompetitor značený, přítomnost značky v promývacím roztoku indikuje nahrazení léčivem. Alternativně, jestliže je značený kandidát léčiva, nahrazení indikuje značka na nosiči.

V alternativním provedení je kandidát léčiva přidáván jako první, inkubován a promyt a následně je přidán kompetitor. Absence navázání kompetitoru může indikovat, že kandidát na léčivo se váže na KSP s větší afinitou. A tedy, je-li kandidát léčiva značený, přítomnost značky na nosiči, která souvisí s nedostatkem navázaného kompetitoru, může indikovat, že kandidát na léčivo je vhodný pro vazbu s KSP.

Hodnotné může být také určení místa navázání na KSP. To může být provedeno mnoha způsoby. V jednom provedení, je-li identifikováno, že KSP je vázán s mitotickým agens, je KSP fragmentován nebo modifikován a test je proveden znovu a jsou určeny součásti, které jsou nutné pro navázání.

Modulace je určována testováním kandidátů léčiv, které jsou schopné modulovat aktivitu KSP, zahrnující kombinaci kandidátů léčiv s KSP, jak je uvedeno výše, a určením změny biologické aktivity KSP. V tomto provedení by se tedy kandidát léčiva měl vázat na KSP (ačkoliv to nemusí být nutné) a také změnit jeho biologickou nebo biochemickou aktivitu jak je zde definováno. Metody zahrnují testování in vivo a in vitro. Tímto způsobem se testují změny buněk v cyklu buněčného dělení, životaschopnost buněk nebo přítomnost morfologie, aktivita, rozdělení nebo množství mitotických vřetének, jak je naznačeno výše.

Alternativně, odlišné testování může být použito pro identifikaci kandidátů léčiv, které se váží na původní KSP, ale nemohou se vázat na modifikovaný KSP.

V testech mohou být použity pozitivní a negativní kontroly. Výhodně jsou všechny kontroly a testy vzorků prováděny nejméně třikrát, aby se získaly statisticky významné výsledky. Všechny vzorky jsou inkubovány po dobu, která je dostačující pro navázání agens na protein. Po inkubaci jsou všechny vzorky omyty specificky nevazebným materiálem a je určeno množství vazeb, což je obecně prováděno značenými činidly. Například je-li použito radioaktivní značení, množství navázaných sloučenin ve vzorcích může být určeno pomocí scintilátoru.

• · · · ·

Při testování mohou být použity další činidla, které zahrnují sole, neutrální proteiny např. albumin, detergenty atd., které mohou být použity pro usnadnění optimálního navázání protein-protein a/nebo redukovat nespecifické nebo specifické nebo vedlejší interakce. Mohou být také použita činidla, která jakkoli zvyšují efektivitu testů. Těmito činidly jsou inhibitory proteáz, inhibitory nukleáz, antimikrobiální agens atd. Z důvodů zajištění navázání může být přidána také směs komponent.

Následující příklady slouží pro úplnější popis způsobů použitých ve výše popsaném vynálezu, stejně tak jako stanovení nej lepších způsobů provedení různých aspektů tohoto vynálezu. Tyto příklady v žádném případě nelimitují rámec tohoto vynálezu, ale jsou zde uvedeny pro ilustraci. Všechny citované odkazy jsou zahrnuty jako odkazy v celém svém rozsahu.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 zobrazuje obecné schéma syntézy kompozicí tohoto vynálezu.

Obrázek 2 zobrazuje syntézu chinazolinonových inhibitorů KSP.

Obrázek 3 zobrazuje reprezentativní chemické struktury chinazolinonových ihibitorů KSP. Obrázek 4 zobrazuje syntetickou cestu k jednotlivým podstatně čistým enantiomerům. Obrázek 5 zobrazuje syntézu sulfonamidů (5a), karbamátů (5b), močovin (5c) a aminů (5d).

Příklady provedení vynálezu

Zkratky a definice

Následující zkratky a termíny mají uvedený význam po celý dokument: Ac = acetyl

BNB = 4-brommethyl-3-nitrobenzoová kyselina

Boc = t-butyloxy karbonyl

Bu = butyl c- = cyklo

CBZ = karbobenzoxy = benzyloxykarbonyl

DBU = diazabicyklo [5.4.0]undec-7-en ·· · ·«*··· ·· ·· i 9 9 9 9 9 · · · · 9 • 9 · · · · 9 9 ·

DCM	= dichlormethan = methylenchlorid = CH2CI2
DCE	=	dichlorethylen
DEAD	=	diethyl azodikarboxylát
DIC	=	diisopropylkarbodíimid
DIEA		N,N-diisopropylethylamin
DMAP	=	4-N,N-dimethylaminopyridin
DMF	=	N,N-dimethylformamid
DMSO	=	dimethylsulfoxid
DVB		2,4-divinylbenzen
EEDQ		2-ethoxy-1 -ethoxykarbonyl-1,2-dihydrochinolin
Et	=	ethyl
Fmoc	-	9-fluorenylmethoxykarbonyl
GC	=	plynová chromatografie
HATU	=	O-(7-azabenzotriazol-1 -yl)-1,1,3,3 -tetramethyluronium hexafluorofosfát
HMDS	=	hexamethyldisilazan
HOAc	=	octová kyselina
HOBt	-	hydroxybenzotriazol
Me	=	methyl
Mesyl	-	methansulfonyl
MTBE	=	methyl t-butylether
NMO	=	N-methylmorfolin oxid
PEG	-	polyethyleneglykol
Ph	=	fenyl
PhOH	=	fenol
PfP	=	pentafluorfenol
PPTS	=	pyridinium p-toluensulfonát
Py	=	pyridin
PyBroP	=	brom-tris-pyrrolidino-fosfonium hexafluorfosfát
rt	=	pokojová teplota
sat=d	=	nasycený
s-	=	sekundární
t-	=	terciální

TBDMS	- t-butyldimethylsilyl
TES	=	triethylsilan
TFA	=	trifluoroctová kyselina
THF	=	tetrahydrofuran
TMOF	-	trimethylorthoformiát
TMS	=	trimethylsilyl
Tosyl	=	p-toluensulfonyl
Trt	=	trifenylmethyl

Příklad 1

Syntéza sloučenin

Obecná syntéza je naznačena na obrázcích 1 a 2.

Krok 1: N-butyryl anthranilová kyselina.

Do tříhrdlé 500 ml baňky s kulatým dnem vybavené teploměrem, přikapávací nálevkou a výkonným magnetickým míchadlem se přidá anthranilová kyselina (1) (0,5 molů, 68,5 g) a dimethylformamid (250 ml). Do tohoto roztoku se přidá po kapkách butyrylchlorid (0,55 molů, 57,1 ml) takovou rychlostí, aby teplota směsi nepřekročila 40°C. Suspenze se silně míchá při pokojové teplotě po dobu nejméně dalších 3 hodin. Směs se přilije do vody (2000 ml) a míchá se další 1 hodinu. Precipitovaný produkt se shromáždí filtrací, promyje studenou vodou a suší za sníženého tlaku nad P2O5, čímž se získá sloučenina 2 (67,3 g, 65%).

Krok 2: 2-propyl-3,l-[4H]benzoxazin-4-on.

Sloučenina 2 (51,8 g, 0,25 molů) se rozpustí v acetanhydridu (180 ml) v 500 ml baňce s kulatým dnem vybavené magnetickým míchadlem, Claisenovým destilačním nástavcem (s přívodem vakua) a teploměrem. Baňka se umístí do olejové lázně a pomalu se zahřívá na teplotu 170 až 180°C za stálého míchání. Octová kyselina, která se tvoří, se pomalu oddestilovává za atmosférického tlaku. Monitorování teploty destilačního nástavce bylo použito pro následující vývoj transformace. Reakční směs se poté zchladí na teplotu ·> ···· • ·

60°C a přebytek acetanhydridu se odstraní destilací za sníženého tlaku (cca. 20 mm Hg). Zbytek se posléze zchladí a produkt se nechá vykrystalizovat. Produkt se rozmělní s n-hexanem (75 ml) a izoluje se filtrací, čímž se získá 2-propyl-3,l-[4H]benzoxazin-4-on (3) (29,3 g, 62%). Výše uvedeným postupem se získá sloučenina 3 dostatečně čistá pro přímé použití do příštího kroku.

Krok 3: 2-propyl-3-benzylchinazolin-4-on.

Sloučenina 3 (28,4 g, 0,15 molů) a benzylamin (17,5 ml, 0,16 molů) se refluxují v chloroformu (50 ml) v jednohrdlé 250 ml baňce s kulatým dnem po dobu 6 hodin. Poté co je sloučenina 3 kompletně spotřebována se chloroform odpaří za sníženého tlaku. Do zbytku v baňce, která je vybavena Claisenovým destilačním nástavcem a magnetickým míchadlem, se přidá ethylenglykol (100 ml) a NaOH tabletky (0,60 g). Baňka se ponoří do olejové lázně a znovu zahřeje na teplotu lázně 130 až 140°C za stálého míchání a udržuje se na této teplotě po dobu 5 hodin, tvořící se voda se odstraňuje destilací. Po kompletní reakci se čistý roztok ponechá zchladit na pokojovou teplotu a nechá se stát přes noc, čímž se utvoří precipitát produktu. Hodnota pH suspenze se upraví na 7 až 8 přidáním 3% vodné HC1, krystaly se zfiltrují a promyjí studenou vodou, a poté rekrystalizují z isopropanolu (nebo případně z acetonu), čímž se získá sloučenina, 2-propyl-3-benzylchinazolin-4-on (sloučenina 4) (28,0 g, 67%).

Krok 4: 2-(l'-brompropyl)-3-benzylchinazolin-4-on.

Do tříhrdlé 250 ml baňky s kulatým dnem vybavené teploměrem, přikapávací nálevkou a výkonným magnetickým míchadlem se přidá sloučenina 4 (27,8 g, 0,10 molů), bezvodý acetát sodný (10,0 g) a ledová kyselina octová (130 ml). Do roztoku se při teplotě 40°C po dobu 1 až 2 hodiny přidává po kapkách brom (16,0 g, 0,10 molů) rozpuštěný v kyselině octové (10 ml). Poté se směs přelije do vody (1500 ml) a míchá se po dobu 1 až 2 hodiny při pokojové teplotě. Precipitovaný produkt, 2-(l'-brompropyl)-3benzylchinazolin-4-on (5) se izoluje filtrací, promyje se horkou vodou, aby se odstranily zbytky kyseliny octové a opláchne se malým množstvím isopropanolu. Sušením se získá sloučenina 5 (33,0 g, 92%).

Krok 5; 2-[r-(N,N-dimethylethylendiamino)propyl]-3-benzylchinazolin-4-on.

Sloučenina 5 (10,7 g, 0,03 molů) a N,N-dimethylethylendiamin (6,6 ml, 0,06 molů) se rozpustí v abs. ethanolu (60 ml) a zahřívá se pod refluxem po dobu 6 hodin. Po dokončení reakce se rozpouštědlo odstraní za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustí v díchlormethanu (150 ml) a promyje se 3% vodným roztokem NaOH (cca. 10 až 20 ml). Organická vrstva se suší nad MgSO₄ a odpaří se do sucha za sníženého tlaku. Zbývající olejovitý produkt se přečistí tlakovou chromatografií na krátkém sloupci silikagelu mobilní fází CHCl₃-MeOH-vodný NH₃, 90:10:0,1, čímž se získá požadovaná sloučenina (5), 2-[r-(N,N-dimethylethylendiamino)propyl]-3-benzylchinazolin-4-on (6) (6,0 g, 55%).

Krok 6: 2-[l'-(N-4-fluorbenzoyl)-(N,N-dimethylethylenediamino)propyl]-3-benzyl-chinazolin-4-on.

Zásobní roztok sloučeniny 5 (1,822 g, 5,0 mmol) se připraví v HPLC kvalitě v CHC1₃ (0,5 ml). Zásobní roztok p-flurbenzoylchloridu (160,2 mg, 1 mmol) v HPLC kvalitě v 1,2-dichlorethanu (2,0 ml) se připraví v 2,0 ml odměmé baňce. Třetí roztok triethylaminu (2,0 ml , 0,5 M) se připraví v HPLC kvalitě v 1,2-dichlorethanu. 100 pL alikvotní části každého roztoku se napipetuje do skleněné reakční nádoby pomocí automatu Beckman Biomet 2000. Reakční směs se míchá pomocí automatického míchadla, sonikuje v ultrazvukové vodní lázni a poté inkubuje přes noc při pokojové teplotě. Směs se zředí CHC1₃ (300 pL) a promyje se 5% vodným roztokem NaHCO₃ a vodou. Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu, čímž se získá požadovaná sloučenina 6 (65%). Čistota sloučeniny se analyzuje pomocí TLC v mobilní fázi C^CL-ethanol-koncentrovaný vodný NH₃, 100:10:1.

Příklady 2 a 3

Syntéza sloučenin o obecné struktuře ld

H,N.

ti ti · • ti * * • ti · • ti ti ti ti • ti titititi \

alkylen \

DIEA, DMF, CHCI·, NH— Pryskyřice

R,

HN^ alkylen

NH,

Všechna bezvodá rozpouštědla byla získána od Aldrich Chemical Company ve SureSeal® kontejnerech. Většina činidel byla získána od Aldrich Chemical Company.

Zkratky: DCM, dichlormethan; DIEA, Ν,Ν-diisopropylethylamin; DMF, Ν,Ν-dimethylformamid; TES, triethylsilan; TFA, trifluoroctová kyselina. Sada syntéz byla provedena v 15 x 75 mm skleněných ampulkách se šroubovacím uzávěrem a kulatým dnem zasazených v 4 x 6 aluminiovém syntézním bloku, utěsněném teflonovou membránou s pryžovým lemováním. Byla přidávána činidla a vodné extrakce byly prováděny jednoduchými nebo násobnými pipetory. Filtrace byly prováděna použitím Whatman/Polyfíltronics 24 jamek, 10 ml filtrační bloky. Odpaření těkavých materiálů bylo prováděno odparkou Labconco Vortex-Evaporator nebo mnohonásobným pročištěním 4 x 6 dusíkem.

Příklad 2 (syntéza jednoduché sloučeniny na pevné fázi)

Krok 1) 1,3-diaminopropan trityl pryskyřice (Novabiochem, 1,2 mmol/g) (0,20 g, 0,24 mmol) se naváží do šroubovací ampulky a přidá se 3 ml 1:1 směsi DMF a chloroformu. Přidá se DIEA (0,130 ml, 0,72 mmol) a 2-(l'-brompropyl)-3-benzylchinazolin-4-on (z příkladu 1) (0,188 g, 0,48 mmol). Ampulky se utěsní, zahřívají na teplotu 70°C a třepou

9999 ·· ·· • * 9 · · · · ··♦· • · * » · · · · · • · · · » · · «·· · • · · · · 9 9 9 9 «· · · · ·«· * 9 9 999 9 přes noc. Pryskyřice se zfiltruje a promyje se (3 x DCM, 2 x MeOH, 1 x DCM, 2 x ether) a suší se pod vakuem. 27 mg alikvotní části pryskyřice se nechá působit s 5:5:90, TFA : TES : DCM po dobu 15 minut a směs se zfiltruje a odpaří, získá se 8 mg (64% výtěžek) chinazolinondiamin intermediátu. LCMS analýza ukáže čistotu > 80%.

Krok 2) Pryskyřice z kroku 1 se nechá nabobtnat ve 3 ml DCM. Přidá se DIEA (0,130 ml,

0,72 mmol) a 4-brombenzylbromid (0,12 g, 0,48 mmol). Ampulka se utěsní a třepe se přes noc. LCMS analýza odděleného alikvótu ukáže přibližně směs 1:1 výchozí látky a produktu. Přidá se další 0,130 ml DIEA a 0,12 g 4-brombenzylbromidu a směs se třepe při teplotě 70°C po dobu 8 hodin. Pryskyřice se zfiltruje, promyje (jak je uvedeno výše) a suší se pod vakuem.

Krok 3) Pryskyřice z kroku 2 se dvakrát protřepe po dobu 30 minut se směsí 5:5:90 TFA:TES:DCM a zfiltruje. Filtráty se spojí a odpaří, čímž se získá 140 mg oranžového oleje. Tento materiál se přečistí preparativní HPLC na reverzní fázi (acetonitril-voda, gradient) a získá se 27 mg (17% pro 3 kroky) mono-TFA sole.

Příklad 3 (kombinační syntéza více sloučenin)

Krok 1) 1,2-diaminoethan trityl pryskyřice (Novabiochem, 0,95 mmol/g) (200 g, 1,9 mmol) a 1,3-diaminopropan trityl pryskyřice (Novabiochem, 1,14 mmol/g) (2,0 g, 2,28 mmol) se obě rozprostřou do různých 10 ml polypropylenových frit (Bio Rad). Do každé se přidá 4 ml DMF, 4 ml chloroformu, 3 ekv. DIEA (1,0 ml a 1,2 ml, resp.) a 2 ekv. 2-(l brompropyl)-3-benzylchinazolin-4-on (z příkladu 1) (1,5 g a 1,8 g, resp.). Směs se třepe při teplotě 70°C přes noc. Obě směsi se promyjí (3 x DCM, 2 x MeOH, 1 x DCM, 2 x ether) a suší se pod vakuem. Analýza alikvotního podílu ukáže na přiměřené množství chinazolinondiaminu, pro obě v čistotě > 90 %.

Krok 2) Chinazolinon ethyl-diamin pryskyřice (105 mg, 0,10 mmol) se umístí do každé ampulky v prvních dvou řadách syntézní desky, a chinazolinon propyl-diamin pryskyřice (88 mg, 0,10 mmol) se umístí do každé ampulky v posledních dvou řadách syntézní desky.

Do každé ampulky se přidá DIEA (0,131 ml, 0,75 mmol). Do každé ampulky v prvních 2 ·· 0» » · 0 * řadách syntézní desky se přidá odlišný amin, a to se opakuje pro poslední dvě řady syntézní desky. Reakční blok se třepe při teplotě 70°C přes noc. Z každé ampulky se odstraní tekutina pomocí násobné pipety a pryskyřice se promyje (2 x DCM, 1 x MeOH, 1 x DCM) a suší se pod vakuem.

Krok 3) Do každé ampulky syntézní desky se přidají 2 ml roztoku směsi 10:5:85, TFA: TES: DCM. Reakční blok se třepe po dobu 45 minut a směs se převede do filtračního bloku, zfiltruje a promyje se dvakrát 0,75 ml DCM. Roztoky se odpaří a získají se žluté až červené oleje. Tyto husté oleje se dvakrát rozmělní s etherem, rozpustí se v DCM a nechají se působit s 4 M HC1 v dioxanu, čímž vzniknou HC1 sole (počet solí na sloučenin je neznámý) jako snědé až bílé prášky nebo amorfní pevné látky. Analýza pomocí LCMS ukáže na čistotu > 75% pro všechny sloučeniny.

Příklady 4 až 6

Šest racemických chinazolinonů se separuje na jednotlivé enantiomery chirální chromatografií. Chirální chromatografie tří těchto sloučenin je popsána níže:

Příklad 4:

Kolona-Chiralpak AD, 250 x 4,6 mm (Diacel lne.). Vzorek - 0,5 mg/ml v EtOH. Podmínky -15 minut v 60% EtOH v hexanu, enantiomer 1 eluuje po 4,5 minutách, enantiomer 2 eluuje po 4,9 minutách.

9 9 9 9 ··♦· · 9 9 »

9 * · · * · 9 t 9 * *99 9 9 · »9 * «« 9 9 9 9 · · 9 · ·

9 9 · 9 · 999 • 9 9·9 9· * ·· 9999

Příklad 5:

Kolona -Chiralcel OJ, 250 x 4,6 mm (Diacel Inc.). Vzorek - 0,5 mg/ml v EtOH. Podmínky - 15 minut v 10% EtOH v hexanu, (R)-enantiomer eluuje po 8,4 minutách, (S)-enantiomer eluuje po 9,6 min.

Příklad 6:

Kolona-Chiralpak AD, 250 x 4,6 mm (Diacel Inc.). Vzorek - 0,5 mg/ml v EtOH. Podmínky - 15 minut v 70% EtOH v hexanu, enantiomer 1 eluuje po 6,5 minutách, enantiomer 2 eluuje po 8,8 minutách.

Níže uvedená tabulka znázorňuje IC50 aktivitu racemátu a enantiomerů třech různých sloučenin oddělených způsobem uvedeným výše. Ve všech třech případech byl jeden enantiomer podstatně účinnější než ostatní. Podle nezávislé chirální syntézy se jako aktivnější enantiomer jeví R enantiomer.

IC₅₀(gM)

Raeemál

• · · ·

ICso(gM)

Enantiomer 1

Κ₅ο(μΜ)

Enantiomer 2 ·· • ♦

0,06

0,28

0,03

12,7 »40

6,6

44

4 4 4 • 4 4

4 4 4 *

* 4 • 4

4

4 • 4 • ·

4 4

4444

Příklady 7 a 8

Následující dvě sloučeniny byly syntetizovány jako jednotlivé enantiomery způsobem, který je naznačen na obrázku 4. Hodnoty naznačují, že účinnějším enantiomerem je R enantiomer.

·· • to to ♦ * • · • · «

• to · to· to •

• to to • · to • · · ** ··*·

	Ň (μΜ)	Ki (μΜ)
	S enantiomer	R enantiomer
•9 oX Br	2	<0,1
°γΝ—nh2 Br	>0,5	<0,05

Příklad 9

Chirální rozlišení pomocí krystalizace s kyselinou vinnou Intermediát A, připravený v příkladu 1, může být převeden na intermediát B, který je po rozlišení alternativou prvních pěti kroků naznačených na obrázku 4. Postup je znázorněn na následujícím schématu:

• to ···· toto • to to · • to • to • ·

> to* • to · • to • · • to

R enantiomer sloučeniny B může být selektivně vykrystalizován zahříváním směsi B a 1,1 ekvivalentu D-vinné kyseliny ve směsi isopropanolu a methanolu, a poté opětným ochlazením na pokojovou teplotu.

Příklad 9:

X = Cl, R = H

Racemický intermediát B (1,5 g), rozpuštěný ve 100 ml vroucího isopropanolu se smíchá s 0,8 g D-vinné kyseliny ve 100 ml vroucího methanolu. Směs se ponechá pomalu ochladit na pokojovou teplotu. Po stání přes noc se pevná látka odstraní filtrací a propláchne se ethylacetátem a hexany, poté se nechá vyschnout na vzduchu. Suchá pevná látka (0,8 g) se poté rozpustí ve vroucí směsi 50 ml isopropanolu a 50 ml methanolu a nechá se pomalu chladnout na pokojovou teplotu. Po stání přes noc se utvoří pevná látka, která se zfiltruje a propláchne ethylacetátem a hexany, a poté se nechá vyschnout na vzduchu. Suchá pevná látka se poté míchá s nasyceným hydrogenuhličitanem sodným po dobu 30 minut a extrahuje se ethylacetátem. Organické vrstvy se suší (MgSO₄), filtrují a odpaří do sucha. Získá se čistý olej, 345 mg. Chirální čistota > 95% byla určena převedením části produktu na S-Mosher amid a změřením 'HNMR produktu. Následující enantiomericky čistá sloučenina se připraví podle zbývajících kroků obrázku 4, z látky, která se získá postupem popsaným výše použitím jak D- tak L-vinné kyseliny.

·· ·· • * · · ·# to ·· • to • to

-♦·· to · · ·»··

Zastavení mitózy buněčných populací působením chinazolinonového inhibitoru KSP

FACS analýza pro stanovení stadia buněčného cyklu pomocí měření obsahu DNA byla provedena následujícím způsobem. Buňky Skov-3 (buňky rakoviny vaječníků) byly rozděleny v poměru 1:10 pro výsev na 10 cm misky a pěstovány do částečných shluků v mediu RPMI obsahujícím 5% fetálního hovězího séra (FBS). Poté byly buňky na 24 hodin zality buď 10 nM paclitaxelem, 400 nM chinazolinonu 1, 200 nM chinazolinonu 2 nebo 0,25 % DMSO (nosič pro sloučeniny). Buňky byly poté opláchnuty z misek pomocí PBS obsahujícího 1% FCS a fixovány přes noc 85% ethanolem při teplotě 4°C. Před analýzou byly buňky peletovány, jednou omyty a obarveny v roztoku 10 pg propidium jodidu a 250 pg ribonukleázy A (RNáza) na mililitr při teplotě 37°C po dobu půl hodiny. Analýza pomocí průtokové cytometrie byla provedena na Becton-Dickinson FACScan a údaje o vzorcích, z nichž každý obsahoval 10 000 buněk, byly analyzovány pomocí programu Modfit.

Chinazolinonové sloučeniny stejně jako známé antimitotické činidlo paclitaxel způsobily posun populace buněk ze stadia G0/G1 buněčného cyklu (obsah DNA 2n) do stadia G2/M buněčného cyklu (obsah DNA 4n). Bylo zjištěno, že ostatní sloučeniny této třídy mají podobné účinky.

• 0 0»

9 9 0

0 ♦

0 «

0 9

0090 «00 ««· 00 ·

Tvorba monopolámího vřeténka následující po aplikaci chinazolinonového inhibitoru KSP.

K určení povahy akumulace G2/M byly nádorové buňky linie Skov-3 (buňky vaječníků), HeLa (buňky děložního čípku) a A549 (plicní buňky) vysety na misky v hustotě 4 000/misku (SKOV-3 & HeLa) nebo v hustotě 8 000/misku (A549), ponechány 24 hodin adherovat, a pak ponechány k působení roztoků o různých koncentrací chinazolinonových sloučenin po dobu 24 hodin. Buňky byly fixovány 4% formaldehydem a obarveny anti-tubulinovými protilátkami (následně rozpoznávané pomocí fluorescenčně značených sekundárních protilátek) a Hechstovým barvivém (barvícím DNA).

Vizuální kontrola ukázala, že chinazolinonové sloučeniny způsobily zastavení buněčného cyklu ve stadiu prometafázy mitózy. DNA byla kondenzována a tvorba vřeténka byla zahájena, ale takto zastavené buňky jednotně vykazovaly monopolámí vřeténka, což naznačovalo, že došlo k inhibici oddělení pólových částí vřeténka. Mikroinjekce protilátek anti-KSP rovněž způsobuje zastavení mitózy, přičemž zastavené buňky vykazují monopolámí vřeténka.

Inhibice buněčné proliferace v nádorové buněčné linii ošetřené chinazolinonovými inhibitory KSP.

Buňky byly vysety do 96ti-jamkových destiček v hustotě 1000 až 2500 buněk/jamku (podle buněčné linie) ponechány 24 hodin adherovat a růst. Buňky byly ponechány k působení různých koncentrací léčiva po dobu 48 hodin. Čas, ve kterém byly přidány sloučeniny, je označován jako To. Ke stanovení počtu živých buněk v čase To a počtu buněk zbylých po 48 hodinách působení sloučeniny byl použit test založený na tetrazolinu využívající látku 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-karboxymethoxyfenyl)-2-(4sulfofenyl)-2H-tetrazolium (MTS) (I.S>Patent č.5,185,450) (viz Katalog výrobků Promega Č.G3580, CellTiter96®AQ_Ueous One Solution Cell Proliferation Assay). Počet buněk zbylých po 48 hodinách byl porovnán s počtem živých buněk v době aplikace léčiva a použit pro výpočet inhibice růstu buněk.

Růst buněk po 48 hodinách v kontrolních jamkách, do kterých byl aplikován pouze nosič (0,25 % DMSO), byl považován za 100% růst a růst buněk v ostatních jamkách byl s tímto porovnáván. Chinazolinonové inhibitory KSP inhibovaly proliferaci buněk v nádorových buněčných liniích následujících typů nádorů: plíce (NCI-H460, A549), prsa (MDA-MB-231, MCF-7, MCF-7/ADR-RES), tlusté střevo (HT29, HCT 15), vaječníky

4 44 4·

Λ 4

• · * 4 ♦ « ♦

4 4 4 4 ·

444· · 4 · ·

4 4 4 4 4

4 44 ·»*· (SKOV-3, OVCAR-3), leukémie (HL-60(TB), K-562), centrální nervový systém (SF-268), ledviny (A498), osteosarkom (U2-OS) a cervikální (HeLa). Navíc myší nádorové buňky (B16, melanom) byly rovněž inhibovány ve svém růstu v přítomnosti chinazolinonových sloučenin.

Hodnota GÍ50 byla vypočtena pomocí vynesení koncentrace sloučeniny v μΜ proti procentům buněčného růstu buněk v jamkách obsahujících sloučeniny. Gi₅₀ vypočtené pro sloučeniny je odhadovaná koncentrace, při které je růst buněk inhibován o 50 % v porovnání s kontrolními vzorky, tj. koncentrace, při které

100 x [(se sloučeninou₄₈ - T_o) / (kontrola₄₈ - T_o)] = 50

Všechny koncentrace sloučenin jsou testovány ve dvou vzorcích a kontroly jsou průměrovány z 12 jamek. Velice podobné rozvržení 96ti-jamkových destiček a výpočetní schéma pro G150 je používáno National Cancer Institute (viz Monks, et al., J. Nati. Cancer Inst. 83:757-766 (1991)). Nicméně tato metoda používaná National Cancer Institutes pro kvantifikici buněk nepoužívá MTS, ale místo toho využívá jiné alternativní metody.

Výpočet IC₅₀:

Měření IC50 kompozicí pro KSP aktivity využívá ATPázový test. Jsou používány následující roztoky: roztok 1 obsahuje 3 mM draselnou sůl fosfoenolpyruvátu (Sigma P7127), 2 mM ATP (Sigma A-3377), 1 mM IDTT (Sigma D-9779), 5 μΜ paclitaxel (Sigma T-7402), 10 ppm antifoam 289 (Sigma A-8436), 25 mM trubičky/KOH pH 6,8 (Sigma P6757), 2 mM MgCl₂ (VWR JT400301) a 1 mM EGTA (Sigma E3889). Roztok 2 obsahuje 1 mM NADH (Sigma N8129), 0,2 mg/ml BSA (Sigma A7906), pyruvát kinázu 7U/ml, L-laktátdehydrogenázu 10 U/ml (Sigma P0294), 100 nM KSP motorovou doménu, pg/ml mikrotubulů, 1 mM DTT (Sigma D9779), 5 μΜ paclitaxel (Sigma T-7402), 10 ppm antifoam 289 (Sigma A-8436), 25 mM trubičky/KOH pH 6,8 (Sigma P6757), 2 mM MgCl₂ (VWR JT4003-01) a 1 mM EGTA (Sigma E3889). V 96ti-jamkových mikrotitračních destičkách (Corning Costar 3695) bylo provedeno postupné ředění (8 - 12ti násobné ředění) roztokem 1. Po tomto ředění obsahovala každá jamka 50 μί roztoku 1. Reakce byla nastartována přidáním 50 μί roztoku 2 do každé jamky. To může být provedeno buď násobnou pipetou ručně nebo automatickým zařízením na pipetování tekutin. Mikrotitrační destička je pak přenesena na analyzátor absorbancí na mikrodeskách «Τ4 4 <·· »»»* ·4 ·♦ • · 44 «4 « 4444

444 «44 44 4

444 444 444

444 44 » 44 4444 a pro každou jamku jev kinetickém módu odečteno několik hodnot při absorbanci 340 nm. Pozorovaná míra změny, která je úměrná poměru ATPázy, je pak vynesena jako funkce koncentrace sloučeniny. Pro stanovení IC50 standardu jsou údaje získány pomocí následující rovnice o čtyř parametrech při použití programu nelineárních čísel (např. Grafit 4):

rozsah

+ pozadí kde y je pozorovaná míra změny a x koncentrace sloučeniny.

Chinazolinonové sloučeniny inhibují růst buněk různých buněčných linií včetně linií (MCF-7/ADR-RES, HCT1 5), které exprimují P-glykoprotein (rovněž známý jako Multidrug Resistence nebo MDR⁺), který je nositelem rezistence na další chemoterapeutická léčiva, jako je paclitaxel. Chinazolinony jsou tudíž anti-mitotika, která inhibují buněčnou proliferaci a nepodléhají rezistenci v důsledku nadměrné exprese MDR⁺ buňkami nádorových linií rezistentních na léčiva.

Bylo zjištěno, že další sloučeniny této třídy inhibují proliferaci buněk, ačkoli se jejich hodnoty GI50 liší. Hodnoty GI50 testovaných chinazolinonových sloučenin se pohybovaly od 200 nM k hodnotám vyšším než nejvyšší testovaná koncentrace. Tímto máme na mysli, že ačkoli většina sloučenin, které inhibují KSP aktivitu biochemicky, skutečně inhibovala proliferaci buněk, u některých byl buněčný růst při nejvyšší testované koncentraci inhibován méně než 50 %. Mnohé tyto sloučeniny mají hodnoty GI50 menší než 10 μΜ a některé mají hodnoty GI50 nižší než 1 μΜ. Anti-proliferační sloučeniny, které byly úspěšně použity při klinické léčbě rakoviny (rakovinná chemoterapeutika) mají velmi různé hodnoty GI50. Například u buněk A549 je GI50 paclitaxelu 4 nM, doxorubicinu 63 nM, 5-fluoruracilu 1 μΜ a hydroxy močoviny 500 μΜ (údaje poskytnuté National Cancer Institute, Developmental Therapeutic Program, http://dtp.nci.nih.gov/). U sloučenin, které inhibují proliferaci buněk, může být tedy použita jakákoli koncentrace. Nicméně je preferováno, aby sloučeniny měly hodnoty GI50 nižší než 1 mM. Více preferováno je, aby sloučeniny měly hodnoty GI50 nižší než 20 μΜ. Ještě více je preferováno, aby sloučeniny ··· ·· «· • * · 9 • 9*9 měly hodnoty GI50 nižší než 10 μιη. Další snížení hodnot GI50 může být také vhodné, včetně sloučenin s hodnotami GI50 nižšími než 1 μΜ. Některé chinazolinonové sloučeniny tohoto vynálezu inhibují proliferaci buněk při hodnotách GI50 pod 200 nM do hodnot pod

Claims (59)

1. Způsob léčby buněčných proliferativních poruch, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci sloučeniny vybrané ze skupiny sestávající z :

kde;

substituent Ri je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R₂ a substituent R₂' jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, alkylu, oxaalkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu; nebo substituenty R₂ a R₂' spolu tvoří 3- až 7-členný kruh;

• ·· • • ·· • t> • • • ·· • • « * • • • • • • • • • • • • • < i • • ·* ··· ·· «

substituent R3 je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu, oxaalkylu, oxaalkylarylu, substituovaného oxaalkylarylu, substituentu R15O- a substituentu R15-NH-;

substituent R3’ je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu a substituentu R15-NH-;

substituent R3 je vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R4 je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu a substituentu Rió-alkylen-, substituenty R₅, R₆, R₇ a Rg jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, alkylu, alkoxy skupiny, halogenu, fluoralkylu, nitro skupiny, dialkylamino skupiny, alkylsulfonylu, alkylsulfonamido skupiny, sulfonamidoalkylu, sulfonamidoarylu, alkylthio skupiny, karboxyalkylu, karboxamido skupiny, aminokarbonylu, arylu a heretoarylu;

substituent R₎₅ je vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent Ri₆ je vybrán z alkoxy skupiny, amino skupiny, alkylamino skupiny, dialkylamino skupiny, N-heterocyklylu a substituovaného N-heterocyklylu.

2. Způsob léčby poruch spojených s aktivitou KSP kinesinu, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci sloučeniny vybrané ze skupiny sestávající z:

·♦ · ·* ···· • fc • · 44 • • · • • • · • · • • • · • • • 4 • 4 • • • · • • • ·«· ·· • ·· 4··4

a kde:

substituent Ri je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R2 a substituent R2' jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, alkylu, oxaalkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu; nebo substituenty R2 a R2' spolu tvoří 3- až 7-členný kruh;

substituent R3 je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu, oxaalkylu, oxaalkylarylu, substituovaného oxaalkylarylu, substituentu R15O- a substituentu R15-NH-;

substituent R₃· je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu a substituentu R,5-NH-;

substituent R₃ je vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R4 je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu a substituentu Rió-alkylen-, substituenty R5, Ró, R7 a Rg jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, alkylu, alkoxy skupiny, halogenu, fluoralkylu, nitro skupiny, dialkylamino skupiny, alkylsulfonylu, alkylsulfonamido skupiny, sulfonamidoalkylu, sulfonamidoarylu, alkylthio skupiny, karboxyalkylu, karboxamido skupiny, aminokarbonylu, arylu a heretoarylu;

substituent R15 je vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent Rig je. vybrán z alkoxy skupiny, amino skupiny, alkylamino skupiny, dialkylamino skupiny, N-heterocyklylu a substituovaného N-heterocyklylu.

3. Způsob inhibice KSP kinesinu, vyznačující se tím, že zahrnuje kontakt KSP kinesinu se sloučeninou vybranou ze skupiny sestávající z:

a kde:

substituent Rj je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R2 a substituent R2¹ jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, alkylu, oxaalkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu; nebo substituenty R2 a R₂' spolu utvoří 3- až 7-členný kruh;

substituent R₃ je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu, oxaalkylu, oxaalkylarylu, substituovaného oxaalkylarylu, substituentu R15O- a substituentu R15-NH-;

substituent R₃- je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu a substituentu R15-NH-;

substituent R3» je vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R4 je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu a substituentu Rió-alkylen-, substituenty R5, Ró, R7 a Rg jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, alkylu, alkoxy skupiny, halogenu, fluoralkylu, nitro skupiny, dialkylamino skupiny, alkylsulfonylu, alkylsulfonamido skupiny, sulfonamidoalkylu, sulfonamidoarylu, alkylthio skupiny, karboxyalkylu, karboxamido skupiny, aminokarbonylu, arylu a heretoarylu;

substituent R15 je vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent Riď je vybrán z alkoxy skupiny, amino skupiny, alkylamino skupiny, dialkylamino skupiny, N-heterocyklylu a substituovaného N-heterocyklylu.

4. Způsob podle nároků 1, 2 nebo 3, vyznačující se tím, že substituent Ri, je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, alkylarylu, substituovaného alkylarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R2 je vybrán z atomu vodíku, alkylu a substituovaného alkylu; substituent R2'je atom vodíku;

substituent R3 je vybrán z alkylu, substituovaného alkylu, alkylarylu, heteroarylu, arylu, substituovaného arylu, substituovaného hereroarylu, substituovaného oxaalkylarylu Ri₅O-a R,5-NH-;

substituent R4 je vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu a Ri6-alkylenu-;

substituent R5 je atom vodíku;

substituenty Rď, R7 a Rg jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, halogenu, methylu a trifluormethylu;

substituent R15 je vybrán z alkylu, arylu a substituovaného arylu;

substituent Rj₆ je vybrán z alkoxy skupiny, amino skupiny, alkylamino skupiny, dialkylamino skupiny a N-heterocyklylu.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že stereogenní centrum na kterém jsou vázány substituenty R2 a R2' má R konfiguraci.

6. Způsob podle nároků 1, 2 nebo 3 sloučeniny o vzorci:

vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že substituent Ri je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu, fenylu, naftylu a substituovaného fenylu.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že substituent Ri je vybrán z atomu vodíku, ethylu, propylu, methoxyethylu, naftylu, fenylu, bromfenylu, chlorfenylu, methoxyfenylu, ethoxyfenylu, tolylu, dimethylfenylu, chorfluorfenylu, methylchlorfenylu, ethylfenylu, fenethylu, benzylu, chlorbenzylu, methylbenzylu, methoxybenzylu, tetrahydrofuranylmethylu a (ethoxykarbonyl)ethylu.

9. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že substituent R2 je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu a substituovaného nižšího alkylu, a substituent R2' je atom vodíku.

• ti ·· · ·· ···· titi ti··· ·· ti · ti·· 9 9 9 9 9 9

99 tititi ·· · ·· ····

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že substituent R₂ je vybrán z atomu vodíku, methylu, ethylu, propylu, methylthioethylu, aminobutylu, (CBZ)aminobutylu, cyklohexylmethylu, benzyloxymethylu, methylsulfinylethylu, methylsulfínylmethylu, hydroxymethylu, benzylu a indolylmethylu.

11. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že substituent R₃ je vybrán z Ci-C_]3 alkylu; substituovaného nižšího alkylu; fenylu; naftylu; fenylu substituovaného jedním nebo více halogeny, nižším alkylem, nižší alkoxy skupinou, nitro skupinou, karboxy skupinou, methylendioxy skupinou nebo trifluormethylem; bifenylylu; benzylu; fenoxymethylu; halogenfenoxymethylu; fenylvinylu; heteroarylů; heteroarylů substituovaného nižším alkylem; a benzyloxymethylu.

12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že substituent R₃ je vybrán z ethylu, propylu, chlorpropylu, butoxy skupiny, heptylu, butylu, oktylu, tridekanylu, (ethoxykarbonyl)ethylu, dimethylaminoethylu, dimethylaminomethylu, fenylu, naftylu, halogenfenylu, dihalogenfenylu, kyanofenylu, halogen(trifluormethyl) fenylu, chlorfenoxymethylu, methoxyfenylu, karboxyfenylu, ethylfenylu, tolylu, bifenylylu, methylendioxyfenylu, methylsulfonylfenylu, methoxychlorfenylu, chlomaftylu, methylhalogenfenylu, trifluormethylfenylu, butylfenylu, pentylfenylu, methylnitrofenylu, fenoxymethylu, dimethoxyfenylu, fenylvinylu, nitrochlorfenylu, nitrofenylu, dinitrofenylu, bis(trifluoromethyl)fenylu, benzyloxymethylu, benzylu, furanylu, benzofuranylu, pyridinylu, indolylu, methylpyridinylu, chinolinylu, pikolinylu, pyrazolylu a imidazolylu.

13. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že substituent R₃ je Ri₅-NH- a substituent R15 je vybrán z nižšího alkylu; cyklohexylu; fenylu; a fenylu substituovaného halogenem, nižším alkylem, nižší alkoxy skupinou nebo nižší alkylthio skupinou.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že substituent R15 je vybrán z isopropylu, butylu, cyklohexylu, fenylu, bromfenylu, dichlorfenylu, methoxyfenylu, ethylfenylu, tolylu, trifluormethylfenylu a methylthiofenylu.

15. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že substituent R4 je vybrán z nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, cyklohexylu; fenylu substituovaného hydroxy skupinou, nižší alkoxy skupinou nebo nižším alkylem; benzylu; heteroarylmethylu; heteroarylethylu; heteroarylpropylu a Ri₆-alkylenu-, kde substituent R₎₆ je amino skupina, nižší alkylamino skupina, di(nižší alkyl)amino skupina, nižší alkoxy skupina, nebo N-heterocyklyl.

16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že substituent R4 je vybrán z methylu, ethylu, propylu, butylu, cyklohexylu, karboxyethylu, karboxymethylu, methoxyethylu, hydroxyethylu, hydroxypropylu, dimethylaminoethylu, dimethylaminopropylu, diethylaminoethylu, diethylaminopropylu, aminopropylu, methylaminopropylu, 2,2dimethyl-3-(dimethylamino)propylu, l-cyklohexyl-4-(diethylamino)butylu, aminoethylu, aminobutylu, aminopentylu, aminohexylu, aminoethoxyethylu, isopropylaminopropylu, diisopropylaminoethylu, 1 -methyl-4-(diethylamino)butylu, (t-Boc)aminopropylu, hydroxyfenylu, benzylu, methoxyfenylu, methylmethoxyfenylu, dimethylfenylu, tolylu, ethylfenylu, (oxopyrrolidinyl)propylu, (methoxykarbonyl)ethylu, benzylpiperidinylu, pyridinylethylu, pyridinylmethylu, morfolinylethylu, morfolinylpropylu, piperidinylu, azetidinylmethylu, azetidinylpropylu, pyrrolidinylethylu, pyrrolidinylpropylu, piperidinylmethylu, piperidinylethylu, imidazolylpropylu, imidazolylethylu, (ethylpyrrolidinyl)methylu, (methylpyrrolidinyl)ethylu, (methyipiperidinyl)propylu, (methylpiperazinyl)propylu, furanylmethylu a indolylethylu.

17. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že substituent Ri je vybrán z nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu a substituovaného fenylu;

substituent R₂ je vybrán z atomu vodíku, alkylu, substituovaného nižšího alkylu a benzylu;

substituent R₂' je atom vodíku;

substituent R3 je vybrán ze substituovaného fenylu a naftylu; substituent R4 je vybrán ze substituovaného alkylu a Rió-alkylen-, substituent R5 je atom vodíku nebo halogen, substituent Ró je atom vodíku, methyl nebo halogen; substituent R7 je atom vodíku, halogen, methyl nebo trifluormethyl; substituent R₈ je atom vodíku nebo halogen;

• • · • to to • ·· · • • • to • • « • to· • · • • • • • to • • • to • • • • « • • • toto to to to • · • • ·

substituent R₎₆ je vybrán z di(nižší alkylamino) skupiny, (nižší alkyl)amino skupiny, amino skupiny, N-heterocyklylu a substituovaného N-heterocyklylu.

18. Způsob podle nároků 1, 2 nebo 3, vyznačující se tím, že substituent Ri je benzyl nebo halogenbenzyl; substituent R₂ je vybrán z ethylu a propylu; substituent R₂'je atom vodíku;

substituent R3 je substituovaný fenyl; substituent R3'je substituovaný fenyl; substituent R3 je substituovaný fenyl;

substituent R4 je (CH₂)_mOH nebo (CH₂)_pRi₆, kde m je 2 nebo 3 a p je 1 až 3;

substituent R₅ je atom vodíku;

substituent R₆ je atom vodíku;

substituent R7 je halogen;

substituent Rg je atom vodíku;

substituent Riď je vybrán z amino skupiny, propylamino skupiny a azetidinylu.

19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že stereogenní centrum, na kterém jsou vázány substituenty R₂ a R₂' má R konfiguraci.

20. Způsob podle nároků 1, 2 nebo 3, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci sloučeniny o vzorci:

21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že:

'· ·· • «to « • · * • toto substituent R, je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu, fenylu, naftylu a substituovaného fenylu;

substituent R₂ je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu a substituovaného nižšího alkylu a substituent R₂' je atom vodíku;

substituent R₃· je vybrán zCi-Ci3 alkylu; fenylu; naftylu; fenylu substituovaného halogenem, nižšího alkylu, nižší alkoxy skupiny, nitro skupiny, methylendioxy skupiny nebo trifluormethylu; bifenylyl, benzylu a heteroarylu;

substituent R4 je vybrán z nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, cyklohexylu; fenylu substituovaného hydroxy skupinou, nižší alkoxy skupinou nebo nižším alkylem; benzylu; heteroarylmethylu; heteroarylethylu; heteroarylpropylu a Ri₆alkylenu, kde substituent Riď je amino skupina, (nižší alkyljamino skupina, di (nižší alkyljamino skupina, nižší alkoxy skupina, nebo N-heterocyklyl.

22. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že:

substituent Ri je vybrán z nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu a substituovaného fenylu;

substituent R₂ je atom vodíku nebo nižší alkyl; substituent R₂' je atom vodíku;

substituent R₃ je vybrán ze substituovaného fenylu a naftylu; substituent R4 je Ri6-alkylen-hydroxy nižší alkyl nebo karboxy nižší alkyl; substituenty Rf, a R7 jsou vybrány z atomu vodíku a halogenu; substituenty R5 a Rg jsou atomy vodíku;

substituent Ri6 je vybrán z di(nižší alkylamino) skupiny, (nižší alkyljamino skupiny, amino skupiny, piperidinylu, azetidinylu, pyrrolidinylu a morfolinylu.

23. Způsob podle nároků 1, 2 nebo 3, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci sloučeniny o vzorci:

• 4 · ·· ···· ·· ·· • · ftft ft· · ft · · ♦ ··« «·· ftft ft • •ft ··· ··· • · ··· ftft · ftft ftftft »

24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že:

substituent Ri je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu, fenylu, naftylu a substituovaného fenylu;

substituent R₂ je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu a substituovaného nižšího alkylu a substituent R₂'je atom vodíku; a substituent R4 je vybrán z nižšího alkylu, cyklohexylu; fenylu substituovaného hydroxy skupinou, nižší alkoxy skupinou nebo nižším alkylem; benzylu; heteroarylmethylu; heteroarylethylu; heteroarylpropylu a Ri6-alkylenu, kde substituent Rió je di(nižší alkyl)amino skupina, alkylamino skupina, amino skupina, nižší alkoxy skupina, nebo N-heterocyklyl.

25. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že:

substituent Ri je vybrán z nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu a substituovaného fenylu;

substituent R₂ je atom vodíku nebo nižší alkyl; substituent R₂' je atom vodíku; substituent R4 je Ri6-alkylen-;

substituenty R& a R7 jsou vybrány z atomu vodíku a halogenu; substituenty R5 a Rg jsou atomy vodíku;

substituent Ri₆ je vybrán z di(nižší alkylamino) skupiny, (nižší alkyl)amino skupiny, amino skupiny, pyrrolidinylu, piperidinylu, imidazolylu a morfolinylu.

26. Způsob podle nároku 1, 2 nebo 3, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci sloučeniny o vzorci:

»* ··♦♦

27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že:

substituent Ri je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu, fenylu, naftylu a substituovaného fenylu;

substituent R₂ je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu a substituovaného nižšího alkylu a substituent R₂' je atom vodíku;

substituent R₃je vybrán z C1-C13 alkylu; substituovaného nižšího alkylu; fenylu; naftylu; fenylu substituovaného halogenem, nižším alkylem, nižší alkoxy skupinou, nitro skupinou, methylendioxy skupinou nebo trifluormethylem; bifenylylu; benzylu a heterocyklylu; a substituent R4 je vybrán z nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu; cyklohexylu; fenylu substituovaného hydroxy skupinou, nižší alkoxy skupinou nebo nižším alkylem; benzylu; substituovaného benzylu; heterocyklylu; heteroarylmethylu; heteroarylethylu; heteroarylpropylu a Rió-alkylenu, kde substituent Ri_Ď je di(nižší alkyl)amino skupina, (nižší alkyljamino skupina, amino skupina, nižší alkoxy skupina nebo N-heterocyklyl.

28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že:

substituent Ri je vybrán z nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu a substituovaného fenylu;

substituent R₂ je atom vodíku nebo nižší alkyl; substituent R₂'je atom vodíku;

substituent R₃ je vybrán ze substituovaného fenylu, heterocyklylu a naftylu;

substituent R4 je vybrán ze substituovaného benzylu, heterocyklylu substituovaného nižším alkylem a Rió-alkylenu-;

substituenty Rg a R₇ jsou vybrány z atomu vodíku a halogenu;

substituenty R₅ a Rg jsou atomy vodíku;

substituent Rió je vybrán z di(nižší alkylaminojskupiny, (nižší alkyljamino skupiny, amino skupiny, pyrrolidinylu, azetidinyl piperidinylu, imidazolylu a morfolinylu.

29. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že: substituent Ri je benzyl;

substituent R₂ je ethyl; substituent R₂' je atom vodíku;

substituent R₃·· je vybrán z halogenfenylu, polyhalogenfenylu, tolylu, dimethylfenylu, methoxyfenylu, dimethoxyfenylu, kyanofenylu, trifluormethylfenylu, trifluormethoxyfenylu, bis(trifluoromethyl)fenylu, karboxyfenylu, t-butylfenylu, methoxykarbonylfenylu, piperidinylu a naftylu;

substituent R4 je vybrán ze substituovaného benzylu, piperidinylu, hydroxy(nižšího alkylu) a Rió-alkylenu-;

substituenty R^ a R7 jsou vybrány z atomu vodíku a halogenu; substituenty R5 a Rg jsou atomy vodíku;

substituent Rió je vybrán z dimethylamino skupiny, amino skupiny, pyrrolidinylu piperidinylu.

30. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že uvedená nemoc nebo porucha je vybrána ze skupiny sestávající z rakoviny, hyperplazie, restenózy, srdeční hypertrofie, imunitních poruch a zánětu.

31. Sloučenina vybraná ze skupiny sestávající z:

• 4* ·«♦· 44 *4

4 44 44 4 4444

4 4 444 44 4

4 44444 44* 4

44 444 4*4

444 *» * ·* ···♦ a

kde:

substituent Ri je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R2 a substituent R2' jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, alkylu, oxaalkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu; nebo substituenty R2 a R₂' spolu tvoří 3- až 7-členný kruh;

substituent R₃ je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu, oxaalkylu, oxaalkylarylu, substituovaného oxaalkylarylu, substituentu R15O- a substituentu R15-NH-;

substituent R₃· je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného ♦ * ·'♦ · alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu a substituentu R,5-NH-;

substituent R₃- je vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R4 je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu a substituentu Rió-alkylen-, substituenty R5, Rf,, R7 a Rg jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, alkylu, alkoxy skupiny, halogenu, fluoralkylu, nitro skupiny, dialkylamino skupiny, alkylsulfonylu, alkylsulfonamido skupiny, sulfonamidoalkylu, sulfonamidoarylu, alkylthio skupiny, karboxyalkylu, karboxamido skupiny, aminokarbonylu, arylu a heretoarylu;

substituent R15 je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroaryl, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu substituent R^ je vybrán z alkoxy skupiny, amino skupiny, alkylamino skupiny, dialkylamino skupiny, N-heterocyklylu a substituovaného N-heterocyklylu;

s podmínkou, že je-li substituent R3 skupina R15-NH- vázaná na karbonyl, musí být oba substituenty R2 a R4 jiné než atom vodíku.

32, Sloučenina podle nároku 31, kde:

substituent Ri je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, heteroarylu, substituovaného heteroarylu, alkylarylu, alkylheteroarylu a substituovaného alkylarylu;

substituent R2 je vybrán z atomu vodíku, alkylu a substituovaného alkylu; substituent R2'je atom vodíku;

substituent R₃ je vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylu, substituovaného heteroarylu, oxaalkylarylu, substituovaného oxaalkylarylu, R15O- a R15-NH-;

substituent R4 je vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, a Ri₆-alkylenu-;

substituent R₅ je atom vodíku;

ft »· * * ♦ • ·*· substituenty R₆, R7 a R₈ jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, halogenu, methylu a trifluormethylu;

substituent R₁₅ je vybrán z alkylu, arylu a substituovaného arylu;

substituent Rió je vybrán z alkoxy skupiny, amino skupiny, alkylamino skupiny, dialkylamino skupiny a N-heterocyklylu.

33. Sloučenina podle nároku 31 o vzorci:

34. Sloučenina podle nároku 33, kde substituent Ri je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu, fenylu, naftylu a substituovaného fenylu.

35. Sloučenina podle nároku 34, kde substituent Ri je vybrán z atomu vodíku, ethylu, propylu, methoxyethylu, naftylu, fenylu, bromfenylu, chlorfenylu, methoxyfenylu, ethoxyfenylu, tolylu, dimethylfenylu, chlorfluorofenylu, methylchlorfenylu, ethylfenylu, fenethylu, benzylu, chlorbenzylu, methylbenzylu, methoxybenzylu, tetrahydrofuranylmethylu a (ethoxykarbonyl)ethylu.

36. Sloučenina podle nároku 33, kde substituent R₂ je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu a substituovaného nižšího alkylu a substituent R₂' je atom vodíku.

37. Sloučenina podle nároku 36, kde substituent R₂ je vybrán z atomu vodíku, methylu, ethylu, propylu, methylthioethylu, aminobutylu, (CBZ)aminobutylu, cyklohexylmethylu, benzyloxymethylu, methylsulfmylethylu, methylsulfinylmethylu, hydroxymethylu, benzylu a indolylmethylu.

·· ·· ♦ * * · ·♦<· «

38. Sloučenina podle nároku 33, kde substituent R3 je vybrán z C1-C13 alkylu; substituovaného nižšího alkylu; fenylu; naftylu; fenylu substituovaného jedním nebo více halogeny, nižším alkylem, nižší alkoxy skupinou, nitro skupinou, karboxy skupinou, methylendioxy skupinou, nebo trifluormethylem; bifenylylu; benzylu; fenoxymethylu; halogenfenoxymethylu; fenylvinylu; heteroarylu; heteroarylu substituovaného nižším alkylem; a benzyloxymethylu.

39. Sloučenina podle nároku 38, kde substituent R3 je vybrán z ethylu, propylu, chlorpropylu, butoxy skupiny, heptylu, butylu, oktylu, tridekanylu, (ethoxykarbonyl)ethylu, dimethylaminoethylu, dimethylaminomethylu, fenylu, naftylu, halogenfenylu, dihalogenfenylu, kyanofenylu, halogen(trífluormethyl)fenylu, chlorfenoxymethylu, methoxyfenylu, karboxyfenylu, ethylfenylu, tolylu, bifenylylu, methylendioxyfenylu, methylsulfonylfenylu, methoxychlorfenylu, chlomaftylu, methylhalogenfenylu, trifluormethylfenylu, butylfenylu, pentylfenylu, methylnitrofenylu, fenoxymethylu, dimethoxyfenylu, fenylvinylu, nitrochlorfenylu, nitrofenylu, dinitrofenylu, bis(trifluormethyl)fenylu, benzyloxymethylu, benzylu, furanylu, benzofuranylu, pyridinylu, indolylu, methylpyridinylu, chinolinylu, pikolinylu, pyrazolylu a imidazolylu.

40. Sloučenina podle nároku 33, kde substituent R3 je Ris-NH-a R15 je vybrán z nižšího alkylu; cyklohexylu; fenylu a fenylu substituovaného halogenem, nižším alkylem, nižší alkoxy skupinou nebo nižší alkylthio skupinou.

41. Sloučenina podle nároku 40, kde substituent R15 je vybrán z isopropylu, butylu, cyklohexylu, fenylu, bromfenylu, dichlorfenylu, methoxyfenylu, ethylfenylu, tolylu, trifluormethylfenylu a methylthiofenylu.

42. Sloučenina podle nároku 33, kde substituent R4 je vybrán z nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, cyklohexylu; fenylu substituovaného hydroxy skupinou, nižší alkoxy skupinou nebo nižším alkylem; benzylu; heteroarylmethylu; heteroarylethylu; heteroarylpropylu a Ri6-alkylenu-, kde Ri6 je amino skupina, nižší alkylamino skupina, di(nižší alkyl)amino skupina, nižší alkoxy skupina nebo N-heterocyklyl.

·· ··

9 ♦ · • ·

9 « 9

00 000·

0 0 * • * *·

9 0 4 • 00 · • 0 • 00

0 0 9

0* ♦

43. Sloučenina podle nároku 42, kde substituent R4 je vybrán z methylu, ethylu, propylu, butylu, cyklohexylu, karboxyethylu, karboxymethylu, methoxyethylu, hydroxyethylu, hydroxypropylu, dimethylaminoethylu, dimethylaminopropylu, diethylaminoethylu, diethylaminopropylu, aminopropylu, methylaminopropylu, 2,2-dimethyl-3-(dimethylamino)propylu, l-cyklohexyl-4-(diethylamino)butylu, aminoethylu, aminobutylu, aminopentylu, aminohexylu, aminoethoxyethylu, isopropylaminopropylu, diisopropylaminoethylu, 1 -methyl-4-(diethylamino)butylu, (t-Boc)aminopropylu, hydroxyfenylu, benzylu, methoxyfenylu, methylmethoxyfenylu, dimethylfenylu, tolylu, ethylfenylu, (oxopyrrolidinyl)propylu, (methoxykarbonyl)ethylu, benzylpiperidinylu, pyridinylethylu, pyridinylmethylu, morfolinylethyl morfolinylpropylu, piperidinylu, azetidinylmethylu, azetidinylpropyl pyrrolidinylethylu, pyrrolidinylpropylu, piperidinylmethylu, piperidinylethylu, imidazolylpropylu, imidazolylethylu, (ethylpyrrolidinyl)methylu, (methylpyrrolidinyl)ethylu, (methylpiperidinyl)propylu, (methylpiperazinyl)propylu, furanylmethylu a indolylethylu.

44. Sloučenina podle nároku 33, kde:

substituent Ri je vybrán z nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu a substituovaného fenylu;

substituent R₂ je vybrán z atomu vodíku, alkylu, substituovaného nižšího alkylu a benzylu;

substituent R₂' je atom vodíku;

substituent R3 je vybrán ze substituovaného fenylu a naftylu; substituent R4 je vybrán ze substituovaného alkylu a Ric-alkylenu-; substituent R5 je atom vodíku nebo halogen;

substituent Rg je atom vodíku, methyl nebo halogen;

substituent R₇ je atom vodíku, halogen, methyl nebo trifluormethyí;

substituent Rg je atom vodíku nebo halogen;

substituent Riď je vybrán z di(nižší alkyl aminojskupiny, (nižší alkyljamino skupiny, amino N-heterocyklylu a substituovaného N-heterocyklylu.

45. Sloučenina podle nároku 31, kde:

substituent Ri je benzyl nebo halogenbenzyl; substituent R₂ je vybrán z ethylu a propylu;

« · · • 9 • ·

9 · • ♦·* · substituent R₂'je atom vodíku; substituent R₃ je substituovaný fenyl; substituent R₃· je substituovaný fenyl; substituent Ryje substituovaný fenyl; substituent R4 je (CH₂)_m OH nebo (CH₂)_pRi₆ , kde m je 2 nebo 3 a p je 1 až 3; substituent R₅ je atom vodíku; substituent Ró je atom vodíku; substituent R₇ je halogen; substituent Rg je atom vodíku;

substituent R^ je vybrán z amino skupiny, propylamino skupiny a azetidinylu.

46. Sloučenina podle nároku 31 o vzorci:

47. Sloučenina podle nároku 46, kde:

substituent R| je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu, fenylu, naftylu a substituovaného fenylu;

substituent R₂ je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu a substituovaného nižšího alkylu a R₂' je atom vodíku;

substituent R₃· je vybrán z C,-Ci₃ alkylu; fenylu; naftylu; fenylu substituovaného halogenem, nižším alkylem, nižší alkoxy skupinou, nitro skupinou, methylendioxy skupinou nebo trifluormethylem; bifenylylu, benzylu a heteroarylu a substituent R4 je vybrán z nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, cyklohexylu; fenylu substituovaného hydroxy skupinou, nižší alkoxy skupinou nebo nižším alkylem; benzylu; heteroarylmethylu; heteroarylethylu; heteroarylpropylu a

Ri₆-alkylenu, kde ·<♦· # * • 4

4 4 4

4 4 · ·

4 4 4

444 44

4 » · 4

4 4 4

4 « ·

4 4 4

4< 4444 substituent R_]6 je amino skupina, (nižší alkyljamino skupina, di(nižší alkyl)amino skupina, nižší alkoxy skupina nebo N-heterocyklyl.

48. Sloučenina podle nároku 47, kde:

substituent Ri je vybrán z nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu a substituovaného fenylu;

substituent R2 je atom vodíku nebo nižší alkyl; substituent R₂' je atom vodíku;

substituent R3 je vybrán ze substituovaného fenylu a naftylu;

substituent R4 je R^-alkylen-, hydroxy(nižšího alkylu) nebo karboxy(nižšího alkylu);

substituent Ryje atom vodíku, fluor, chlor nebo methyl; substituenty R5, Ró a Rg jsou atomy vodíku;

substituent Ri6 je vybrán z di(nižší alkyl)amino skupiny, (nižší alkyl)amino skupiny, amino skupiny, pyrrolidinylu a piperidinylu.

49. Sloučenina podle nároku 31 o vzorci:

50. Sloučenina podle nároku 49, kde:

substituent R] je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu, fenylu, naftylu a substituovaného fenylu;

substituent R₂ je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu a substituovaného nižšího alkylu a R₂' je atom vodíku; a substituent R4 je vybrán z nižšího alkylu, cyklohexylu; fenylu substituovaného hydroxy skupinou, nižší alkoxy skupinou nebo nižším alkylem; benzylu; heteroarylmethylu; heteroarylethylu; heteroarylpropylu a Rió-alkylenu, kde substituent Ri6 to to · • * • to • ♦ *··to ♦ to ·♦♦♦ ♦ · • · toto · • · je di(nižší alkyljamino skupina, (nižší alkyljamino skupina, amino skupina, nižší alkoxy skupina nebo N-heterocyklyl.

51. Sloučenina podle nároku 49, kde:

substituent Ri je vybrán z nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu a substituovaného fenylu;

substituent R₂ je atom vodíku nebo nižší alkyl;

substituent R₂'je atom vodíku;

substituent R4 je Riů-alkylen-;

substituent R7 je atom vodíku, fluor, chlor nebo methyl;

substituenty R5, Rg a Rg jsou atomy vodíku;

substituent Riď je vybrán z di(nižší alkylaminojskupiny, (nižší alkyljamino skupiny, amino skupiny, pyrrolidinylu, piperidinylu, imidazolylu a morfolinylu.

52. Sloučenina podle nároku 31 o vzorci:

o

53. Sloučenina podle nároku 52, kde:

substituent R| je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu, fenylu, naftylu a substituovaného fenylu;

substituent R₂ je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu a substituovaného nižšího alkylu a substituent R₂' je atom vodíku;

substituent R3je vybrán z C1-C13 alkylu; substituovaného nižšího alkylu; fenylu;

naftylu; fenylu substituovaného halogenem, nižším alkylem, nižší alkoxy skupinou, nitro skupinou, methylendioxy skupinou nebo trifluormethylem; bifenylylu, benzylu a heterocyklylu; a • •4 · 4 4 · 4 4 ·· 444 ·♦ * ♦· ♦·*· substituent R4 je vybrán z nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, cyklohexylu; fenylu substituovaného hydroxy skupinou, nižší alkoxy skupinou nebo nižším alkylem; benzylu; substituovaného benzylu, heterocyklylu, heteroarylmethylu; heteroarylethylu; heteroarylpropylu a Ri6-alkylenu, kde substituent Ri_óje di(nižší alkyl) amino skupina, (nižší alkyl)amino skupina, amino skupina, nižší alkoxy skupina nebo N-heterocyklyl.

54. Sloučenina podle nároku 53, kde:

substituent R] je vybrán z nižšího alkylu, benzylu, substituovaného benzylu a substituovaného fenylu;

substituent R2 je atom vodíku nebo nižší alkyl; substituent R2¹ je atom vodíku;

substituent R₃ je vybrán ze substituovaného fenylu, heterocyklylu a naftylu; substituent R4 je vybrán ze substituovaného benzylu, heterocyklylu substituovaného nižším alkylem a Ri6-alkylenu-;

substituenty Ró a R7 jsou vybrány z atomu vodíku a halogenu; substituenty R5 a Rg jsou atomy vodíku;

substituent Ri6 je vybrán z di(nižší alkylamino)skupiny, (nižší alkyl)amino skupiny, amino skupiny, pyrrolidinu, piperidinu, imidazolylu a morfolinu.

55. Sloučenina podle nároku 54, kde: substituent Ri je benzyl; substituent R2 je ethyl; substituent R2'je atom vodíku;

substituent R₃ je vybrán z halogenfenylu, polyhalogenfenylu, tolylu, dimethylfenylu, methoxyfenylu, dimethoxyfenylu, kyanofenylu, trifluoromethylfenylu, trifluoromethoxyfenylu, bis(trifluoromethyl)fenylu, karboxyfenylu, t-butylfenylu, methoxykarbonylfenylu, piperidinylu a naftylu;

substituent R4 je vybrán ze substituovaného benzylu, piperidinylu, hydroxy(nižšího alkylu) aRió-alkylenu-;

substituenty R<, a R7 jsou vybrány z atomu vodíku a halogenu; substituenty R5 a Rg jsou atomy vodíku;

• 9 • • 9 9 99 · 9 9 «9 9 9 9 9 9 9 9 * 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 • « 9 9 9 ♦ · 9 «9 99*

substituent R)₆ je vybrán z dimethylamino skupiny, amino skupiny, pyrrolidinylu a piperidinylu.

56. Sloučenina podle kteréhokoli z nároků 32 až 45, 47, 48, 50, 51 a 53 až 55, kde stereogenní centrum, na kterém jsou vázány substituenty R₂ a R₂' má R konfiguraci.

57. Sloučenina podle nároku 31, kde řečená sloučenina má vzorec, jak je definováno na obrázku 3.

58. Způsob testování modulátorů KSP kinesinu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) kombinaci kinesinu, kandidátského bioaktivního agens a sloučeniny vybrané ze skupiny sestávající z:

kde:

substituent R| je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylů a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R₂ a substituent R₂' jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, alkylu, oxaalkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylů a substituovaného alkylheteroarylu; nebo substituenty R₂ a R₂' spolu tvoří 3- až 7-členný kruh;

substituent R₃ je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylů, substituovaného alkylheteroarylu, oxaalkylu, oxaalkylarylu, substituovaného oxaalkylarylu, substituentu R15O- a substituentu R15-NH-;

substituent R₃· je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylů, substituovaného alkylheteroarylu a substituentu Ris-NH-;

substituent R₃ je vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylů a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R4 je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylů, substituovaného alkylheteroarylu a substituentu Riú-alkylen-, substituenty R5, Ré, R7 a Rg jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, alkylu, alkoxy skupiny, halogenu, fluoralkylu, nitro skupiny, dialkylamino skupiny, alkylsulfonylu, alkylsulfonamido skupiny, sulfonamidoalkylu, sulfonamidoarylu, alkylthio skupiny, karboxyalkylu, karboxamido skupiny, aminokarbonylu, arylu a heretoarylu;

substituent R15 je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroaryl, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylů a substituovaného alkylheteroarylu substituent R)₆ je vybrán z alkoxy skupiny, amino skupiny, alkylamino skupiny, dialkylamino skupiny, N-heterocyklylu a substituovaného N-heterocyklylu; a

• • • 0 0 0 0 0 ♦ 0 00 0 0 0 0 ♦ 00* * 0 • 0 • 0 0 0 • • 0 0 « 0 0 0 0 0 0 0 0 0 »0 0 0 0 00 • 0· 00 0 0

(b) určení účinku daného kandidátského bioaktivního agens na aktivitu daného kinesinu.

59. Způsob testování sloučenin, které se vážou na kinesin, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) kombinaci kinesinu, kandidátského bioaktivního agens a značené sloučeniny vybrané ze skupiny sestávající z:

a kde:

substituent Ri je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R₂ a substituent R₂' jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, alkylu, oxaalkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a to* ·«·* to to · • to · •to toto • to » · ·· · to«to • •to toto «to·· substituovaného alkylheteroarylu; nebo substituenty R₂ a R₂' spolu tvoří 3- až 7-členný kruh;

substituent R₃ je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu, oxaalkylu, oxaalkylarylu, substituovaného oxaalkylarylu, substituentu R15O- a substituentu R15-NH-;

substituent R₃· je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu. substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu a substituentu R15-NH-;

substituent R₃ je vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R4 je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu a substituentu Riň-alkylen-, substituenty R5, Ré, R7 a Rg jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, alkylu, alkoxy skupiny, halogenu, fluoralkylu, nitro skupiny, dialkylamino skupiny, alkylsulfonylu, alkylsulfonamido skupiny, sulfonamidoalkylu, sulfonamidoarylu, alkylthio skupiny, karboxyalkylu, karboxamido skupiny, aminokarbonylu, arylu a heretoarylu;

substituent Ri₅ je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroaryl, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu substituent Ri6 je vybrán z alkoxy skupiny, amino skupiny, alkylamino skupiny, dialkylamino skupiny, N-heterocyklylu a substituovaného N-heterocyklylu; a (b) určením vazby daného kandidátského bioaktivního agens na kinesin.

Obrázek 1