CZ20004545A3 - Nový receptor angiotensinu, způsob jeho přípravy a jeho použití - Google Patents

Abstract

Předkládané řešení se týká nového receptorů angiotensinu, způsobu přípravy tohoto receptorů ajeho použití. Receptor angiotensinu obsahuje alespoň jedná podjednotku, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci id. č.10.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nového receptoru angiotensinu, způsobu přípravy tohoto receptoru a jeho použití.

Dosavadní stav techniky

Systém renin-angiotensin je zodpovědný hlavně za regulaci srdečního a oběhového systému, které se podílejí na hospodaření organi-smu s elektrolyty a tekutinami. Fyziologicky účinné efektorové hormony, např. angiotensin II (AnglI) a angiotensin 1-7 (Angl-7) , se vytvářejí proteolytickým štěpením v játrech syntetizovaného prekurzoru angiotensinogenu, popřípadě z něho vznikajícího angiotensinu I. Na tomto štěpení se podílí několik proteáz (např. renin, angiotensin konvertující enzym (ACE)).

Dosud byly popsány dva lidské receptory angiotensinu, které byly nazvány ATI a AT2. Oba receptory patří k receptorům angiotensinu II (AnglI), tzn. receptorům, které přednostně váží AnglI. Sekvence cDNA obou receptorů (Takayanagi, R. et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 183: 910-915, Tsuzuki S. et al., 1994, Biochem. Biophys. Res. Comm. 200: 1449-1454) obsahují sedm hydrofóbních oblastí, které představují případné transmembránové domény. Na základě charakteristických doménových struktur se soudí, že receptory angiotensinu ATI a AT2 patří do rodiny 7 transmembránových • φ φ φφφφ φ φ φ φ φ φ ΦΦΦ φ- φ φφφφ φφ φφ φ φφφφφφ φ ' φ φ φ φ φ φφ φ φφ ΦΦΦ ΦΦΦ φφφφ φφ φφ receptorů, které zprostředkovávají působení svého ligandu .angiotensinu II na kaskádu signální transdukce spojenou intracelulárním G-proteinem.

Na základě . - farmakologických účinků, které jsou zprostředkovány jinými, od AnglI se lišícími, angiotensiny, popřípadě peptidy odvozenými z angiotensinu I a II (endogenně vznikající, fragmenty Angl a AnglI), vznikla domněnka, že existují i další lidské receptory angiotensinu. V této souvislosti byl popsán receptor pro heptapeptid Angl-7 (Ferrario, C.M. et al., 1997, Hyprtension 30: 535-541).

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezů je nový receptor angiotensinu, který má alespoň jednu podjednotku, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci id. č. 10, přičemž tato aminokyselinová sekvence má případně na C-konci další aminokyseliny.

Receptor angiotensinu je transmembránový receptor. Tento receptor má, na rozdíl od dosud popsaných receptorů angiotensinu, výhodně méně než 7 transmembránových domén. Tyto transmembránové domény mají výhodně délku větší než 6 aminokyselin, výhodněji 8 nebo 9, zvláště výhodně pak 7, aminokyselin. Výhodná transmembránové doména má sekvenci MSIVIPL (uvedeno v jednopísmenném kódu pro aminokyseliny).

Receptor angiotensinu může obsahovat jednu nebo více podjednotek. Receptor může být např. ve formě

a) monomeru (jedna podjednotka, která obsahuje sekvenci id. č. 10), nebo

b) dimeru s jednou, identickou nebo odlišnou podjednotkou, nebo ' φφ φφ φφ • φ φφφφ • φ φ φ · • φ · · · φ φ φφφφ φ φφφφ φφ φφ

- 3 φφ φ φ · · • · φ • φ φφφ • · φ φ • Φ . φ φφ φφφ

c) tetrameru se třemi dalšími identickými podjednotkami, nebo jednou identickou a dvěma odlišnými podjednotkami.

Receptor angiotensinu může existovat jako monomer (podjednotka), popřípadě dimer (dvě různé podjědnotky), až do navázání ligandu, a teprve prostřednictvím vazby ligandu přejít do formy dimeru, popřípadě terameru.

K receptorům, které mají podobnou strukturu jako. nový receptor angiotensinu, patří mj . receptor inzulínu, růstových faktorů jako je nervový růstový faktor (NGF) , endotelový růstový faktor (EGF), fibroblastový růstový faktor (FGF), destičkový růstový faktor (PDGF), receptory antigenů T-buněk, receptory cytokinů hematopoezy (jako např. IL1, IL5) a adhezní molekuly (např. integrin, selektin).

Nový Receptor angiotensinu může být případě posttranslačně modifikován, např. může být glykosylován a/nebo fosforylován.

Receptor angiotensinu ligandy, a zprostředkovává ligandu (ligandů). Receptor angiotensin 1-7 a/nebo derivát angiotensinu 1-7 angiotensinu 1-7 jsou např. kratší peptidy, z Angl-7, např. produkty odbourávání Angl-7.

derivátů Angl-7 jsou také angiotensin III· a angiotensin IV. Výhodně receptor angiotensinu váže Angl-7.

váže svůj ligand, případně intracelulární účinek tohoto angiotensinu může vázat Deriváty odvozené Příklady

Předmětem předkládaného vynálezu je receptor, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v tabulce 2 (sekvence id. č. 10) . Receptor angiotensinu, popřípadě podjednotka, která obsahuje sekvenci id. č. 10, má délku alespoň 175 aminokyselin.

Předmětem předkládaného vynálezu je dále ' nukleová

00

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

00

0 0 0 0 0 · ·· • · · 0 0 0 · • · 000 · ·

0 0 · 0 • 0 040 000 0000 kyselina, která obsahuje sekvenci kódující nový receptor angiotensinu (dále jen receptor). Např. receptor může být zcela nebo částečně kódován sekvencí nukleové kyseliny uvedenou zde jako sekvence id. č. 9. Nukleová kyselina, která kóduje receptor, popřípadě podjednotku receptorů, obsahuje sekvenci id. č. 9 a na 3'-konci popřípadě další nukleotidy, které patří ke kódující sekvenci. Nukleová kyselina je např. DNA, cDNA nebo RNA. Nukleová kyselina může být také např. gen,, kdy sekvence id. č. 9 může být přerušena nekódujícími sekvencemi (introny).

Nukleová kyselina může být případně derivatizovaná. Derivátem nukleové kyseliny je např. sůl nukleové kyseliny nebo takový derivát nukleové kyseliny, který kromě přírodních nukleotidů obsahuje také modifikované nukleotidy, popřípadě •je celý sestaven z modifikovaných nukleotidů.

Předkládaný vynález se dále týká způsobu přípravy nukleové kyseliny, která kóduje Receptor angiotensinu a obsahuje sekvenci id. č. 9. taková nukleová kyselina může být např. připravena amplifikaci v polymerázové řetězcové reakci (PCR), kdy se jako primery užijí oligonukleotidy, jejichž sekvence odpovídají homologním úsekům (konzervativním úsekům) nukleotidové sekvence, receptorů angiotensinu ATI a AT2, a jako templát se užije cDNA, která je připravena z tkáně (nebo buněk), na které se projevuje účinek angiotensinu 1-7 nebo jeho derivátu a/nebo je připravena z tkáně (nebo buněk), ve a/nebo AT2. degenerované které nedochází k expresi ATI V jednom provedení vynálezu byly použity primery, jejichž sekvence byla odvozena z homologních úseků ATI a AT2. Výhodně byly použity primery Ang3A a Ang3B. Jako templát byla např. užita cDNA připravená z endotelových buněk. Např. byla jako templát užita· cDNA

99

9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9 · ·· • · · · *· • · * • · ··· « · · · • · ·

999

99

9 9

9 • · • 9

999 9999 připravená z buněk HUVEC (buňky lidské pupečníkové žíly).

Předkládaný vynález se také týká způsobu.přípravy nového receptoru. Tak např. nový receptor angiotensinu může být připraven tak, že se nukleové kyselina, jejíž sekvence kóduje receptor angiotensinu a obsahuje výhodně sekvenci id. č. 9, vloží do vhodného vektoru, rekombinantní vektor se vnese do

buněk a v těchto	buňkách	se receptor angiotensinu exprimuje.
Předkládaný	vynález	se dále	také týká použití	nukleové
kyseliny, která	kóduj e	receptor	angiotensinu a	obsahuj e
výhodně sekvenci id.	č. 9,	např. ve způsobu	:výroby

rekombinantního receptoru angiotensinu, kdy je nukleové kyselina, která je pod kontrolou vhodného promotoru, vnesena do buňky a tam exprimována.

Dále se vynález týká použití nukleové kyseliny, která kóduje receptor angiotensinu a obsahuje výhodně sekvenci id. č. 9, pro přípravu rekombinantní buňky, ve které může být exprimován receptor angiotensinu. Vynález se tedy týká rekombinantní buňky, která exprimuje receptor angiotensinu se sekvencí id. č. 10. Dále se vynález také týká použití nukleové kyseliny., která kóduje receptor angiotensinu a obsahuje výhodně sekvenci id. č. 9, pro přípravu léku k léčení a prevenci nemocí, při kterých dochází k chybné regulaci srdečního a oběhového systému, hospodaření organismu s elektrolyty a nebo obecně hospodaření s tekutinami. Vynález se tedy týká léku, který obsahuje nukleovou kyselinu se· sekvencí id. č. 9.

Dále se vynález týká použití nukleové kyseliny, která kóduje receptor angiotensinu a obsahuje výhodně sekvenci id. č. 9, pro přípravu transgenního zvířete, které neobsahuje odpovídající gen pro receptor angiotensinu, nebo transgenního • 4 4 4 4 4

4 4

4 4 4 4

444 • •«4 zvířete, které odpovídající gen pro receptor angiotensinu exprimuje v nadbytku (tzv. overexprese). Taková transgenní zvířata se mohou použít např. pro . charakterizaci specifičnosti a biochemické funkce receptoru angiotensinu. Vynález se týká transgenních zvířat s výjimkou člověka, která exprimují receptor angiotensinu.

Dále se vynález týká použití nukleové kyseliny, která kóduje receptor angiotensinu a obsahuje výhodně sekvenci id. č. 9, ve způsobu identifikace a charakterizace látek, které mohou být použity, jako agonisté a antagonisté receptoru angiotensinu, a dále způsobu, kterým se identifikují látky, které . inhibují nebo ' aktivují funkční expresi kódovaného receptoru angiotensinu. Vynález se tedy týká způsobu identifikace a charakterizace agonistů a antagonistů receptorů angiotensinu, kdy je nukleová kyselina, která obsahuje .sekvenci id. č. 9, vnesena do buňky a receptor angiotensinu je v této buňce exprimován, tato buňka se inkubuje s testovanou .látkou a pak je určen účinek této látky na receptor angiotensinu. ,

..Vynález se týká také použití nukleové kyseliny, která kóduje receptor angiotensinu a obsahuje výhodně sekvenci id. č. 9, v genové terapii nebo pro- výrobu léku, který je možné použít v genové terapii.

Předkládaný vynález se také týká použití nukleové kyseliny, která kóduje receptor angiotensinu a obsahuje výhodně sekvenci id. č. 9, jako nástroje v molekulární biologii (např. jako sondy).

Předkládaný vynález se dále týká použití nového receptoru angiotensinu. Receptor angiotensinu se může např. využít ve způsobu identifikace a charakterizace látek, které se mohou užít jako agonisté nebo antagonisté receptoru -(např.

- 7 • 9 9 9 9 9 • 9 9

9 9*9

9 9 · • 9 9

9·9

9· 99 99

9 9 9 9 9

9 9 9 9 • 9 · 9 · 9

9 9 9 9

9999 99 ·9 vazebné testy a funkční testy pro screening).

Dále se receptor angiotensinu podle vynálezu nebo jeho část, např. epitop, který je tvořen sekvencí id. č. 10, popřípadě její částí, může použít pro přípravu protilátek způsobem, který je odborníkovi znám (viz Harloww a Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN-0-87969-314-2). Takto připravené protilátky, které se specificky váží na nový ‘ receptor angiotensinu, se mohou užít k prokázání nového receptoru, např. v diagnostických testech (způsobech), a/nebo pro další charakterizaci receptoru.

Detailní popis vynálezu

Pro nalezení nového receptoru se vycházelo ze známých sekvencí, které kódují receptor angiotensinu II, a sice ATI a AT2, a byly syntetizovány oligonukieotidy, jejíchž sekvence odpovídají konzervativním úsekům kódujících sekvencí ATI a AT2, případně jsou orientovány proti těmto sekvencím (Ang3A a Ang3B). Tyto oligonukieotidy byly použity v PCR reakci s cDNA buněk HUVEC (buňky lidské pupečníkové žíly) jako templátem. Buněčná linie HUVEC je odvozena z endotelových buněk výstelky krevních cév. Tyto buňky neexprímují ATI ani AT2 receptory.

Byl tak amplifikován fragment DNA s otevřeným čtecím rámcem s nukleotidovou sekvencí (sekvence id. č. 3), která nebyla dosud popsána. Při identifikaci nukleotídové sekvence nebyla žádná shodná sekvence nalezena v databázích EMBL nebo GenBank®. Srovnání sekvencí s databází LifeSeq® pomocí programových modulů BLAST a ASSEMBLY (Software GCG) ukázalo určitou míru shody (překryv) sekvence id. č. 3 s klony č.. 1458429, 3341232, 3440195, 1250818, 2836520, 1310286 a 1362205 (EST klony bez známé funkce) z databáze • · ·* ·ΦΦ· • φ φ φ φ φφφ φ

φ φ φ φ φ φ φ φ φ

LiféSeq®. Z tohoto virtuálního kontigu dedukovaný teoretický fragment velikosti 0,5 kb byl experimentálně potvrzen (viz příklad 2, PCR s primery Ang4a a Ang4B). Sekvence DNA fragmentu obsahujícího otevřený čtecí rámec byla pomocí 5-prodloužení (viz příklad 3) vyjasněna až po sekvenci vektoru (viz sekvence id. č. 9). Sekvence id. č. 9 obsahuje také 5-netranslatovaný úsek popřípadě jeho část.

Analýza 5-koncového úseku nukleotidové sekvence id. č. 9 ukázala, že proti směru transkripce (upstream) od startovacího tripletu (ATG) leží v pozici -3 purinový nukleotid a v pozici -1 a -4 cytosin, přičemž lokalizace těchto nukleotidů v pozicích -1, -3 a -4 odpovídá eukaryotické kanonické sekvenci pro počátek translace mRNA.

Otevřený čtecí rámec v sekvenci id. č. 9 kóduje protein, který obsahuje alespoň 175 aminokyselin (sekvence id. č. 10). Analýza hydrofilnosti této aminokyselinové sekvence pomocí programového modulu GCG ukázala, že sekvence obsahuje na svém N-konci jednu hydrofobní doménu délky přibližně 7 aminokyselin. Tato hydrofobní doména může představovat transmembránovou doménu, kterou je nový receptor zakotven v membráně. Na C-konci obsahuje sekvence naproti tomu jednu více či méně hydrofilní doménu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Pro první PCR byly použity oligonukleotidové primery Ang3A a Ang3B, které na základě sekvence receptoru ATI a AT2 vymezují fragment DNA velikosti 0,19 kb. Jako templát byla užita cDNA z komerčně dostupné cDNA knihovny z buněk ' HUVEC

Φ 4 ν · · · φ φ

Φ φφφφ

Φ · Φ Φ Φ Φ

Φ φφφφ

ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦ

- 9 ·· ···· β · · • · ΦΦΦ • Φ #9

Φ · Φ • Φ ··· (Stratagene, katalog. č. 937223, Stratagene GmBH, Heidleberg).

Nukleotidová sekvence Ang3A (sekvence id. č. 1):

5'-TTG TKC TKK YCT TYW TCW TTT SCT GGM TTC CC -3'

Nukleotidová sekvence Auig3B (sekvence id. č.2):

5'-TTY CCM ASA AAR CMA TAM ARA ARM GGA TT-3' kde symboly mají následující význam:

M = (A/C)

Y = (C/T)

R = (A/G)

S = (G/C)

K -= (G/T)

W = (A/T)

Pro PCR reakci bylo použito: 1 μg cDNA . z HUVEC banky s rekombinantní polymerázou z Thermus aquaticus (Taq polymeráza, Boehringer Mannheim, Německo) a po 10 pmol každého z primerů Ang3A a Ang3B v 50 μΐ PCR reakci, která byla inkubována v termocykleru Perkin ELmer 2400-Thermocycler (Perkin Elmer Applied Biosystems, Weiterstand). PCR byla provedena s následujícím teplotním profilem: 20 při 96°C, při 38 °C .a 20 při 72 °C, 60 cyklů. Byl amplifikován fragment velikosti 130 párů baží (bp).

Tento PCR fragment velikosti 130bp byl ligován do .vektoru pCR2.1 TOPO® (Invitorgen, NV Leek, Nizozemí) a pak transformován do E. coli ToplOF'. Sekvence fragmentu velikosti 130 bp , v plazmidu pCR2.1 byla určena pomocí automatického s-ekvenačního zařízení s kapilární .

elektorforézou ABI. 310 (Applied Biosystems, Weiterstadt) a je • · φφφφ · φ» φφ φφ • · · φφφφ φφφφ • · ··· · φ φφφφ • · ·· · φ · · φ · · φφφ φ φ φφφφ ·* φφφ φφφ φφφφ φφ φφ

- 10 zde uvedena jako sekvence id. č. 3.

Příklad 2

Sekvence id. č. 3 byla analyzována pomocí programových modulů FASTA a TFASTA (Softwar GCG, University of Wisconsin Genetics Computer Group, USA) a srovnána s veřejně přístupnými databázemi sekvencí (např. EMBL, GenBank®). Kromě toho bylo provedeno vyhledáni homologických sekvencí v databázi LifeSeq® firmy Incyte (Palo Alto, USA).

V databázi LifeSeq® byly identifikovány klony EST (exprimované sekvenční značky) č. 1458429, 3341232, 3440195,

1250818, 2836520, 1310286 a 1362205 jako klony překrývající se se sekvencí id. č. 3. Na základě sekvence, která vznikla uspořádáním překrývajících se sekvencí EST klonů byly syntetizovány primery Ang4A a Ang4B.

Nukleotidová sekvence Ang4A (sekvence id. č. 4):

5'-TGG GGG TTG ATA CAG CAG AGA C -3'

Nukleotidová sekvence Ang4B (sekvence id. č. 5):

5'-GCA CTG CCC TCT CTT TAT CCA AA -3'

Pro PCR reakci bylo použito: 0,1 μg cDNA z HUVEC banky a. po 10 pmol každého z primerů Ang4A a Ang4B v 50 μΐ PCR reakci, kde byla užita polymeráza Advantage-cDNA Polymerase Mix (Clontech, Heidelberg). PCR byla provedena s následujícím teplotním profilem: 30 při 94°C a 2'30 při 60 °C, 60 cyklů. Byl amplifikován fragment velikosti 500 bp. Tento fragment byl klonován stejně jako v příkladu 1 a sekvencován (sekvence id. č. 6) . Sekvence obsahuje jeden otevřený čtecí rámec (ORF) .

Příklad 3

Aby se objasnila sekvence 5'-koncového úseku fragmentu velikosti 500 bp, byly připraveny oligonukleotidové primery Ang5A a Ang5B.

Nukleotidová sekvence Ang5A (sekvence id. č. .7) :

5‘-TGG GGA TTG ATA GGC AG-3'

Nukleotidová sekvence Amig5B (sekvence id. č. 8) :

5'-ATA ACT GTT GGA TTT CTC AA-3'

Nukleotidové sekvence Ang5A a Ang5B odpovídají části sekvence 500 bp fragmentu DNA. Tyto primery byly v další PCR použity společně s primery M13 Reverse a M13 Forward(-20) . Primery M13 Reverse a M13 Forward(-20) odpovídají sekvenci bakteriofágových vektorů Uni-ZAP©, které byly použity pro přípravu cDNA knihovny z buněk HUVEC. Tyto PCR reakce obsahovaly 0,1 pg cDNA z cDNA HUVEC knihovny jako templát, 10 pmol každého z primerů Ang5A, popřípadě AngSB, a M13 Reverse, popřípadě M13 Forward(-20)(ze soupravy pro klonování TOPO-TA, Clontech), Taq polymerázu (Boehringer Mannheim) a také protilátku Taq Start™ (Clontech). PCR reakce proběhly s následujícím teplotním profilem: 30 při 96 °C, 30 při 50 °C a 45 při 72 °C (70 cyklů).

Tímto postupem byl připraven DNA fragment celkové délky 660 bp. Tento fragment byl stejným postupem jako v příkladu. 1 klonován a sekvencován. DNA fragment má sekvenci uvedenou zde • · ···>·· · · ···· • · ·* · ······ • · · · · ···· • 0 ··· ··· ···· ·· ··

- 12 jako sekvence id. č. 9. Sekvence id. č. obsahuje celý 5'-kódující úsek.

Kromě již zmíněných softwarových modulů byly použity k počítačové analýze uvedených sekvencí GCG-moduly ASSEMBLE,

MAP, TRANSLATE, PLOTSTRUCTURE A PILEUP.

Tabulka 1

Nukleotidové (částečná) sekvence receptoru angiotensinu

TCGTGTGTGA ACATCACAGG GTTTGTGGAT GCACTTAGAT GTTTGCAATG

AGCACTGTGG CTGGCATGCC CCAGTGTTTT GGATACCAAT GCATAGGACT

101 CCATAGTAAT CGAATTTACC AGAGGCGAAC GTCATGAGCA TAGTGATCCC

151 ATTGGGGGTT GATACAGCAG AGACGTCATA CTTGGAAATG GCTGCAGGTT

201 CAGAACCAGA ATCCGTAGAA GCTAGCCCTG TGGTAGTTGA GAAATCCAAC

251 AGTTATCCCC ACCAGTTATA TACCAGCAGC TCACATCATT CACACAGTTA

301 CATTGGTTTG CCCTATGCGG ACCATAATTA TGGTGCTCGT CCTCCTCCGA

351 CACCTCCGGC TTCCCCTCCT CCATCAGTCC TTATTAGCAA AAATGAAGTA

401 GGCATATTTA CCACTCCTAA TTTTGATGAA ACTTCCAGTG CTACTACAAT

451 CAGCACATCT GAGGATGGAA GTTATGGTAC TGATGTAACC AGGTGCATAT ' 501 GTGGTTTTAC ACATGATGAT GGATACATGA TCTGTTGTGA CAAATGCAGC

551 GTTTGGCAAC ATATTGACTG CATGGGGATT GATAGGCAGC ATATTCCTGA

601 TACATATCTA TGTGAACGTT GTCAGCCTAG GAATTTGGAT AAAGAGAGGG

651 CAGTGCTACT • · · · · · • · ·

Tabulka 2

Aminokyselinová (částečná) sekvence nového receptoru msmplgvdtaetsylemaagsepesveaspwveksnsyphqlytsss 51 HHSHSYIGLPYADHNYGARPPPTPPASPPPSVLISKNEVG IFTTPNFDET

101 SSATTISTSEDGSYGTDVTRCICGFTHDDGYMICCDKCSV WQHIDCMGID

151 RQHIPDTYLCERCQPRNLDKERAVL

Tabulka 3

Sekvence id. č. 3

CTCCTCCATC AGTCCTTATT AGCAAAAATG AAGTAGGCAT ATTTACCACT 51 CCTAATTTTG ATGAAACTTC CAGTGCTACT ACAACCAGAG CGAG

Tabulka 4

Sekvence id. č'. 6

ATTGGGGGTT GATACAGCAG AGACGTCATA CTTGGAAATG GCTGCAGGTT

CAGAACCAGA ATCCGTAGAA GCTAGCCCTG TGGTAGTTGA GAAATCCAAC

101 AGTTATCCCC ACCAGTTATA TACCAGCAGC TCACATCATT CACACAGTTA

151 CATTGGTTTG CCCTATGCGG ACCATAATTA TGGTGCTCGT CCTCCTCCGA

201 CACCTCCGGC TTCCCCTCCT CCATCAGTCC TTATTAGCAA AAATGAAGTA

251 GGCATATTTA CCACTCCTAA TTTTGATGAA ACTTCCAGTG CTACTACAAT

301 CAGCACATCT GAGGATGGAA GTTATGGTAC TGATGTAACC AGGTGCATAT

351 GTGGTTTTAC ACATGATGAT GGATACATGA TCTGTTGTGA CAAATGCAGC

401 GTTTGGCAAC ATATTGACTG CATGGGGATT GATAGGCAGC ATATTCCTGA

451 TACATATCTA TGTGAACGTT GTCAGCCTAG GAATTTGGAT AAAGAGAGGG

501 CAGTGCTACT • · Φ 0 0 0000

000 000 4000 04 04

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...32 (D) DALŠÍ ZNAKY: M = (A/C), Y = (C/T), R = (A/G), S = (G/C), K. = (G/T), W=(A/T) (xi). POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 1:

TT3TKCTKKY CTTYWTCWTT TSCTGGMTTC CC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 párů baží (Bj TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...29 (D) DALŠÍ ZNAKY: M = (A/C), Y = (C/T), R = (A/G), S = (G/C), K = (G/T), W = (A/T) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 2:

TTYCCMASAA ARCMATAMAR AARMGGATT (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 94 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA

4 · · · ·

4

4 4 4

4 4 9

9 99 • · 9 4

- 15 • · ·

4 9 9 9 • ♦ · · • 9-4

4 94 4 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...94 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 3:

CTCCTCCATC AGTCCTTATT AGCAAAAATG AAG7AGGCAT ATTTACCACT CCTAATTTTG ATGAAACTTC CAGTGCTACT AČAACCAGAG CGAG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...22 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 4:

TGGGGGTTGA TACAGCAGAG AC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...23 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 5:

GCACTGCCCT CTCTTTATCC AAA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 510 párů baží

- 16 • · ···· * ·· φ · • · · ΦΦΦ Φ φ φ Φ 9

9 999 9 9 9 9 9 9

9 9 9 ‘ 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 φφφφ

999 ΦΦΦ 9999 99 99 (Β) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...510 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 6:

ATTGGGGGTT	GATACAGCAG	AGAC GT CATA	CTTGGAAATG	GCTGCAGGTT	CAGAACCAGA '	60
ATCCGTAGAA	GCTAGCCCTG	TGGTAGTTGA	GAAATCCAAC	AGTTATCCCC	ACCAGTTATA	120
TACCAGCAGC	TCACATCATT	CACACAGTTA	CATTGGTTTG	CCCTATGCGG	ACCATAATTA	ISO
TGGTGCTCGT	CCTCCTCCGA	CACCTCCGGC	TTCCCCTCCT	CCATCAGTCC	TTATTAGCAA	240
AAATGAAGTA	GGCATATTTA	CCACTCCTAA	TTTTGATGAA	ACTTCCAGTG	CTACTACAAT	300
CAGCACATCT	GAG GAT GGAA	GTTATGGTAC	TGATGTAACC	AGGTGCATAT	GTGGTTTTAC	360
ACATGATGAT	GGATACATGA	TCTGTTGTGA	CAAATGCAGC	gtttggcaac	ATATTGACTG	42 0
CATGGGGATT	GATAGGCAGC	ATATTCCTGA	TACATATCTA	TGTGAACGTT	GTCAGCCTAG	430
.GAATTTGGAT	AAAGAGAGGG	CAGTGCTACT				510

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENí: exon (B) POZICE: 1...17 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 7:

TGGGGATTGA TAGGCAG

- 17 • · · ·· 9 · · 9 ·· *·· 9······ 99 ·9 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (íx) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...20 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 8:

ATAACTGTTG GATTTCTCAA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 660 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: genomová DNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 1...660 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S ID. Č. 9:

TCGTGTGTGA	ACATCACAGG	GTTTGTGGAT	GCACTTAGAT	GTTT GCAAT G	AGCACTGT GG	60
CTGGCATGCC	CCAGTGTTTT	GGATACCAAT	GCATAGGACT	C CAT AGT AAT	CGAATTTACC	120
AGAGGCGAAC	GTCATGAGCA	TAGTGATCCC	ATTGGGGGTT	C-ATACAGCAG	AGACGTCATA	ISO
CTTGGAAATG	GCTGCAGGTT	CAGFACCAGA	ATCCGTAGAA	GCTAGCCCTG	TGGTAGTTGA	240
GAAATCCAAC	AGTTATCCCC	ACCAGTTATA	TACCAGCAGC	TCACATCATT	CACACAGTTA	300
CATTGGTTTG	CCCTATGCGG	ACCATA-<TTA	TGGTGCTCGT	CCTCCTCCC-A	CACCTCCGGC	360
ttcccctcct	CCATCAGTCC	TTATTAGCAA	AAATGAAGTA	GGCATATTTA	CCACTCCTAA	420
TTTTGATGAA	ACTTCCAGTG	CTACTACAAT	CAGCACATCT	GAGGATGCAA	GTTATGGTAC	480
TGATGTAACC	AGGTGCATAT	GTGGTTTTAC	ACATGATGAT	GGATACATGA	TCTGTTGTGA	540

• · ·· . φ φ

- 18 • φ » φ φφφφ • φ φ φ φ φ • φ φφφφ φ φ φφφ φ · φ φ φ φ φ φφφφ φφφφ φφ φφ

CAAATGCAGC GTTTGGCAAC ATATTGACTG CATGGGGATT GATAGGCAGC ATATTCCTGA 600

TACATATCTA TGTGAACGTT GTCAGCCTAG GAATTTGGAT AAAGAGAGGG CAGTGCTACT 660 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(B) DÉLKA: 175 aminokyselin (C) TYP: aminokyseliny (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid

	(Xj	(B) .) popi:	POZICE: 1...175
3 SEKVENCE: SEKVENCE	S ID. Č. 10:
Met 1'	Ser	Ile Val	Ile Pro Leu Gly Val Asp 5 10	Thr Ala Glu Thr Ser Tyr ,15
Leu	Glu	Met Ala 20	Ala Gly Ser Glu Pro Glu 25	Ser Val Glu Ala Ser Pro 30
Val	Val	Val Glu 35	Lys Ser Asn Ser Tyr Pro 40	His Gin Leu Tyr Thr Ser 45
Ser	Ser 50	His His	Ser His Ser Tyr Ile Gly 55	Leu Pro Tyr -Ala Asp His 60
Asn 65	Tyr	Gly Ala	Arg Pro Pro Pro Thr Pro 70	Pro Ala Ser Pro Pro Pro 75 80
Ser	Val	Leu Ile	Ser Lys Asn Glu Val Gly 85 90	Ile Phe Thr Thr Pro Asn 95
Phe	Asp	Glu Thr 100	Ser Ser Ala Thr Thr Ile 105	Ser Thr Ser Glu Asp Gly 110
Ser	Tyr	Gly Thr 115	Asp Val Thr Arg Cys Ile 120	Cys Gly Phe Thr His Asp 125
Asp	Gly 130	Tyr Met	Ile Cys Cys Asp Lys Cys 135	Ser Val Trp Gin His Ile 140
Asd 145	Cys	Met Gly	Ile Asp Arg Gin His Ile 150	Pro Asp Thr Tyr Leu Cys 155 iso
Glu	Arg	Cys Gin	Pro Arg Asn Leu Asd Lys 165 ' 170	Glu Arg Ala Val Leu 175

·· ·»·1

9 9

9 999 fl/ Utv -ΪΙΫΓ

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Receptor angiotensinu, který obsahuje alespoň jednu podjednotku, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci' id. č. 10.

   Receptor angiotensinu id. č. 10 případně aminokyseliny.

   podle nároku obsahuje na

   1, kde sekvence C-konci další

   Receptor angiotensinu podle nároku 1 nebo podjednotka, která obsahuje sekvenci id. č. transmembránovou doménu.
2. 2, kde 10, má
3. 4. Receptor angiotensinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, který váže angiotensin 1-7 nebf derivát angiotensinu 1-7.
4. 5. Receptor angiotensinu podle kteréhokoliv z nároků 1 'až 4, kde alespoň jedna podjednotka receptoru je kódována nukleovou kyselinou se Sekvencí id. č. 9, přičemž sekvence id. č. 9 případně obsahuje na 3'-konci další nukleotidy, které patří ke kódující sekvenci.
5. 6. Způsob přípravy nukleové kyseliny se sekvencí id. č. 9 vyznačující se tím, že v polymerázové řetězové reakci použijí jako primery oligonukieotidy, jejichž sekvence odpovídají homologním úsekům v nukleotidých sekvencích receptoru angiotensinu ATI a AT2, a jako templát se použije cDNA připravená z buněk, ve kterých nejsou exprimovány receptory ATI a AT2 .

   • · ····

   - 20
6. 7. Způsob přípravy receptorů angiotensinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že nukleová kyselina, která obsahuje sekvenci id. č. 9, je· vložena do vhodného vektoru, rekombinantní vektor se vnese do buňky a receptor angiotensinu je exprimován v této buňce.
7. 8. Použití nukleové kyseliny, která obsahuje sekvenci id. č. 9, pro přípravu rekombinantního receptorů angiotensinu, kdy nukleová kyselina, která je pod kontrolou vhodného promotoru, je vnesena do buňky a exprimována.
8. 9. Použití nukleové kyseliny, která obsahuje sekvenci id. č. 9, pro přípravu rekombinantní buňky, která je schopna exprimovat receptor angiotensinu.
9. 10. Použití nukleové kyseliny, která obsahuje sekvenci id. č. 9, pro přípravu léku, který je určen k léčení a/nebo prevenci nemocí, které jsou způsobeny špatnou regulací srdečního a oběhového systému, hospodaření organismu s elektrolyty a/nebo tekutinami.
10. 11. Použití nukleové kyseliny, která obsahuje sekvenci id. č. 9, pro přípravu léku, který se může užít pro genovou terapii.
11. 12. Použití nukleové kyseliny, č. 9, pro identifikaci a mohou být použity jako receptorů angiotensinu.

    která obsahuje sekvenci id. charakterizaci látek, které agonisté nebo antagonisté ·· φφφφ • · φ φ φφφφ φ φ φ φ φ φ φφ φφφ φ

    φ φ φφφφ

    - 21 φφ φφ φ φ φ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ
12. 13. Použití receptoru angiotensinu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 k identifikaci a charakterizaci agonistů nebo antagonistů receptoru angiotensinu.
13. 14. Způsob identifikace a charakterizace agonistů nebo antagonistů receptoru angiotensinu vyznačuj ící se t i m, že nukleová kyselina obsahující sekvenci id. č. 9 se vnese do buňky a receptor angiotensinu je exprimován v této buňce, buňka se inkubuje s testovanou látkou a určuje se účinek této testované látky na receptor angiotensinu.
14. 15. Lék vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu, která obsahuje sekvenci id. č. 9.
15. 16. Rekombinantní buňka, do které byla vnesena nukleová kyselina obsahující sekvenci id. č. 9 a je v ní exprimována.