CZ20004412A3 - Pyrrole-substituted 2-indolinones functioning as protein kinase inhibitors - Google Patents

Abstract

Řešení se týká nových pyrrolem substituovaných 2-indolinonů a jejich fyziologicky přijatelných solí a proléčiv, které modulují aktivitu proteinkináz, a lze tudíž očekávat, že budou užitečné pro prevenci a léčbu buněčných poruch souvisejících s proteinkinázami, jako je rakovina.The present invention relates to novel pyrrole-substituted 2-indolinones and their physiologically acceptable salts and prodrugs that modulate the activity of protein kinases and can therefore be expected to be useful for the prevention and treatment of protein kinase-related cellular disorders such as cancer.

Description

Oblast vynálezuField of the invention

Předložený vynález se obecně týká organické chemie, biochemie, farmakologie a medicíny. Zejména se vztahuje na nové pyrrolem substituované 2-indolinony a jejich fyziologicky přijatelné soli a proléčiva, jenž modulují aktivitu protein kináz (PK), z čehož lze usuzovat, že vykazují pozitivní účinky u onemocnění, které jsou spojené s abnormální aktivitou PK.The present invention relates generally to organic chemistry, biochemistry, pharmacology and medicine. In particular, it relates to novel pyrrole substituted 2-indolinones and their physiologically acceptable salts and prodrugs that modulate protein kinase (PK) activity, suggesting that they exhibit positive effects in diseases that are associated with abnormal PK activity.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Následující text je zde uveden pouze jako popis dosavadního stavu techniky a nemá být chápán jako známý stav techniky předloženého vynálezu.The following is given only as a description of the prior art and is not to be understood as the prior art of the present invention.

PK jsou enzymy, které katalyzují fosforylací hydroxy skupin na tyrosinovém, serinovém a threoninovém zbytku proteinů. Následky této zdánlivě jednoduché aktivity jsou enormní; růst buněk, diferenciace a proliferace, tzn. prakticky všechny aspekty života buňky jsou závislé na aktivitě PK. Kromě toho byla abnormální aktivita PK spojována s nemocemi hostitele, v rozmezí od relativně život neohrožujících onemocnění, např. psoriáza, až po extrémně virulentní onemocnění, např. glioblastom (rakovinu mozku). PK mohou být prakticky rozděleny na dva typy, protein tyrozinkinázu (PTK) a serin/threonin kinázu (STK).PKs are enzymes that catalyze the phosphorylation of hydroxy groups on the tyrosine, serine and threonine residues of proteins. The consequences of this seemingly simple activity are enormous; cell growth, differentiation and proliferation; virtually all aspects of cell life are dependent on PK activity. In addition, abnormal PK activity has been associated with host diseases ranging from relatively life-threatening diseases such as psoriasis to extremely virulent diseases such as glioblastoma (brain cancer). PKs can be practically divided into two types, protein tyrosine kinase (PTK) and serine / threonine kinase (STK).

Jeden z hlavních aspektů aktivity PTK je její participace s receptory růstového faktoru. Receptory růstového faktoru jsou povrchové proteiny buňky. Pokud se navážou ligandem růstového faktoru, jsou receptory růstového faktoru konvertovány na aktivní formy, které interagují s proteiny na vnitřním povrchu buněčné membrány, což vede k fosforylací na tyrosinovém zbytku receptoru aOne of the main aspects of PTK activity is its participation with growth factor receptors. Growth factor receptors are cell surface proteins. When bound by a growth factor ligand, growth factor receptors are converted to active forms that interact with proteins on the inner surface of the cell membrane, resulting in phosphorylation at the receptor tyrosine residue and

dalších proteinech a k tvoření komplexů uvnitř buňky s různými cytoplazmatickými signálními molekulami, které ovlivňují mnoho buněčných reakcí, např. buněčné dělení (proliferace), buněčnou diferenciaci, růst buňky, expresi metabolických účinků do extracelulárního mikroprostoru, atd. Pro detailnější popis viz Schlessinger a Ullrich, Neuron, 9:303-391 (1992), zde je uvedeno jako odkaz.other proteins and complexing within the cell with different cytoplasmic signaling molecules that affect many cellular responses, eg cell division (proliferation), cell differentiation, cell growth, expression of metabolic effects into extracellular micropspace, etc. For a more detailed description see Schlessinger and Ullrich, Neuron, 9: 303-391 (1992), incorporated herein by reference.

Receptory růstového faktoru, které mají PTK aktivitu, jsou známy jako tyrozinkinázové receptory (RTK). Obsahují velkou skupinu transmembránových receptorů s rozdílnou biologickou aktivitou. Do současné doby bylo identifikováno alespoň devatenáct (19) odlišných podskupin RTK, např. podskupina označená „HER“ RTK, která zahrnuje EGFR (epiteliální receptor růstového faktoru), HER2, HER3 a HER4. Tyto RTK se skládají z vazebné oblasti extracelulárního glykosylovaného ligandu, transmembránové oblasti a intracelulární cytoplazmatické katalytické oblasti, která může fosforylovat tyrozinové zbytky na proteinech.Growth factor receptors having PTK activity are known as tyrosine kinase receptors (RTKs). They contain a large group of transmembrane receptors with different biological activity. To date, at least nineteen (19) distinct RTK subgroups have been identified, such as the subgroup designated "HER" RTK, which includes EGFR (epithelial growth factor receptor), HER2, HER3 and HER4. These RTKs consist of an extracellular glycosylated ligand binding region, a transmembrane region, and an intracellular cytoplasmic catalytic region that can phosphorylate tyrosine residues on proteins.

Další podskupiny RTK se skládají z receptoru insulinu (IR), receptoru růstového faktoru I (IGF-1R), který je podobný receptoru insulinu, a receptoru příbuzného receptoru insulinu (IRR). IR a IGF-1R interagují s insulinem, IGF-I a IGF-II za vzniku heterotetrameru dvou zcela glykosylovaných extracelulárních podjednotek a a dvou podjednotek β, které protínají buněčnou membránu, a které obsahují tyrozinkinázovou oblast.Other RTK subgroups consist of the insulin receptor (IR), the growth factor I receptor (IGF-1R), which is similar to the insulin receptor, and the insulin related receptor (IRR). IR and IGF-1R interact with insulin, IGF-I and IGF-II to form a heterotetramer of two fully glycosylated extracellular subunits and two β subunits that cross the cell membrane and which contain a tyrosine kinase region.

Třetí podskupina RTK je označována jako skupina receptoru růstového faktoru destičkového charakteru (PDGFR), která zahrnuje PDGFRa, ΡϋΰΕΚβ, CSFIR, c-kit a c-fms. Tyto receptory se skládají z glykosylovaných extracelulárních oblastí složených z různého množství ohybů podobných imuglobulinu a intracelulárních oblastí, kde tyrozinkinázová oblast je přerušena nepříbuznými sekvencemi aminokyselin.The third subset of RTKs is referred to as the platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) family, which includes PDGFRα, ΡϋΰΕΚβ, CSFIR, c-kit and c-fms. These receptors consist of glycosylated extracellular regions composed of a variety of imuglobulin-like bends and intracellular regions where the tyrosine kinase region is interrupted by unrelated amino acid sequences.

Jiná skupina, která, díky své podobnosti k podskupině PDGFR, je někdy zařazována do novější skupiny, podskupina receptoru plodové • ·Another group that, due to its similarity to the PDGFR subgroup, is sometimes classified into a newer group, the fetal receptor subgroup • ·

jaterní kinázy (flk). Byla vyslovena domněnka, že tato skupina je vytvořena z receptoru fetální jaterní kinázy 1, (KDR/FLK-1), flk-lR, flk-4 a fms-jako tyrozinkináza 1 (flt-1), vloženého do oblasti kinázy.liver kinases (flk). It has been suggested that this group is formed from the fetal liver kinase 1 (KDR / FLK-1), flk-1R, flk-4 and fms-like tyrosine kinase 1 (flt-1) receptors inserted into the kinase region.

Další člen skupiny receptoru růstového faktoru tyrozinkinázy je podskupina fibroblastického růstového faktoru (FGF). Tato skupina je složena ze čtyřech receptorů, FGFR1-4, a sedmi ligandů, FGF1-7. Zatímco ještě není dostatečně popsán, zdá se, že se receptory skládají z glykosylovaných extracelulárních oblastí obsahujících různý množství smyček podobných imuglobulinu a intracelulárních oblastí, kde tyrosinkinázová oblast je přerušena nepříbuznými sekvencemi aminokyselin.Another member of the tyrosine kinase growth factor receptor family is the fibroblastic growth factor (FGF) subset. This group is composed of four receptors, FGFR1-4, and seven ligands, FGF1-7. While not yet sufficiently described, receptors appear to consist of glycosylated extracellular regions containing varying amounts of imuglobulin-like loops and intracellular regions where the tyrosine kinase region is interrupted by unrelated amino acid sequences.

Další člen skupiny receptoru růstového faktoru tyrozinkinázy je podskupina vaskulárního endoteliálního receptoru růstového faktoru (VEGF). VEGF je dimérní glykoprotein podoný PDGF, ale má odlišné biologické funkce a in vivo specifické cílové buňky. Zejména o VEGF se nyní uvažuje v souvislosti s jeho hlavní úlohou při vaskulární genezi a angiogenezi. Ucelenější přehled známých podskupin RTK lze nalézt v Plowman et al., DN&P, 7(6): 334-339 (1994), zde je připojeno jako odkaz.Another member of the tyrosine kinase growth factor receptor family is the vascular endothelial growth factor receptor (VEGF) subset. VEGF is a dimeric PDGF-like glycoprotein but has different biological functions and in vivo specific target cells. In particular, VEGF is now being considered in connection with its main role in vascular genesis and angiogenesis. A more comprehensive overview of known RTK subgroups can be found in Plowman et al., DN&P, 7 (6): 334-339 (1994), incorporated herein by reference.

Kromě RTK existuje také skupina zcela intracelulárních PTK nazývaná „nereceptorové tyrozinkinázy“ nebo „buněčné tyrozinkinázy“. Toto poslední označení bude dále zkráceno na CTK. CTK neobsahují extracelulární a transmembránové oblasti. Do současné doby bylo indentifikováno přes 24 CTK v 11 podskupinách (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak a Ack). Podskupina Src vypadá na to, že bude největší skupinou CTK a zahrnuje Src, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hek, Fgr a Yrk. Pro podrobnější přehled o CTK viz Bolen, Oncogene, 8:2025-2031 (1993), zde je připojeno jako odkaz.In addition to RTKs, there is also a group of completely intracellular PTKs called "non-receptor tyrosine kinases" or "cellular tyrosine kinases". This last designation will be shortened to CTK. CTKs do not contain extracellular and transmembrane regions. To date, over 24 CTKs have been identified in 11 subgroups (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak and Ack). The Src subgroup appears to be the largest CTK group and includes Src, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hek, Fgr, and Yrk. For a more detailed overview of CTKs, see Bolen, Oncogene, 8: 2025-2031 (1993), incorporated herein by reference.

Serin/threoninkinázy, dále jen STK, podobné CTK, jsou převážně intracelulární, ačkoliv je zde několik receptorových kináz typu STK. Z cytosolových kináz jsou nejběžnější STK; tj. kinázy, které vykonávají svoji funkci v této části cytoplazmy mimo cytoplazmatických organel a cytoskeletu. Cytosol je oblast v buňce, kde probíhá mnoho intermediálních metabolických a biosyntetických aktivit buňky; např.Serine / threonine kinases, hereinafter CTK-like STKs, are predominantly intracellular, although there are several receptor kinases of the STK type. Of the cytosolic kinases, STKs are the most common; i.e., kinases that perform their function in this part of the cytoplasm outside the cytoplasmic organelles and cytoskeleton. Cytosol is an area in a cell where many of the intermediate metabolic and biosynthetic activities of a cell take place; e.g.

v cytosolu se na ribozómech syntetizují proteiny.proteins are synthesized on ribosomes in the cytosol.

Byla prokázána účast RTK, CTK a STK na patogenních onemocněních hostitele, včetně, a to významně, rakoviny. Jiné patogenní onemocnění, která byla spojena s PTK zahrnují, ale není to nikterak omezeno, psoriázu, cirhózu jater, diabetes, angiogenezi, restenózu, oční onemocnění, revmatoidní artritidu, a jiná zánětlivá onemocnění, např. autoimunní chorobu, kardiovaskulární onemocnění, např. aterosklerózu a různé renální poruchy.RTK, CTK and STK have been implicated in pathogenic diseases of the host, including, significantly, cancer. Other pathogenic diseases that have been associated with PTK include, but are not limited to, psoriasis, liver cirrhosis, diabetes, angiogenesis, restenosis, eye diseases, rheumatoid arthritis, and other inflammatory diseases, e.g., autoimmune disease, cardiovascular diseases, e.g., atherosclerosis. and various renal disorders.

Co se týká rakoviny, tak dvě hlavní hypotézy objasňují nadměrnou buněčnou proliferaci, která je motorem rakovinného bujení spojeného s funkcemi, o kterých je známo, že jsou regulovány (řízeny) PK. Tj., byl vysloven předpoklad, že maligní buněčný růst vzniká nabouráním mechanismů, které regulují (řídí) buněčné dělení a/nebo buněčnou diferenciaci. Bylo uvedeno, že tvorba proteinů mnoha protoonkogenů je zahrnuta v signálních cestách transdukce, které regulují (řídí) buněčný růst a diferenciaci. Tyto proteinové produkty protoonkogenů zahrnují extracelulární růstové faktory, transmembránové receptory PTK růstového faktoru (RTK), cytoplazmatické PTK (CTK) a cytosolové STK, jak je uvedeno výše.With regard to cancer, the two main hypotheses explain the excessive cellular proliferation that drives cancerous growth associated with functions that are known to be PK regulated. That is, it has been hypothesized that malignant cell growth results from the breakdown of mechanisms that regulate cell division and / or cell differentiation. It has been reported that protein production of many protooncogens is involved in transduction signaling pathways that regulate (direct) cell growth and differentiation. These protooncogene protein products include extracellular growth factors, growth factor PTK transmembrane receptors (RTKs), cytoplasmic PTKs (CTKs), and cytosolic STKs, as described above.

Vzhledem k zdánlivé spojitosti mezi buněčnými aktivitami souvisejícími s PK a širokou paletou lidských poruch, není překvapením, že bylo vynaloženo hodně úsilí při pokusech identifikovat způsoby modulování aktivity PK. Některé z těchto pokusů se týkaly biomimetických metod prováděných pomocí velkých molekul modelovaných pro účinné buněčné zpracování (např. mutantní ligandy (U.S. App. No. 4,966,849); rozpustné receptory a protilátky (App. No. WO 94/10202, Kendall and Thomas, Proč. Naťl Acad. Sci., 90: 1070509 (1994), Kim, et al., Nátuře, 362: 841-844 (1993)); ligandy RNA (Jelínek, et al., Biochemistry, 33: 10450-56); Takano, et al., Mol, Bio, Cell 4: 358A (1993); Kinsella, et al., Exp. Cell Res. 199: 56-62 (1992); Wright, et al., J. Cellular Phys., 152: 448-57) a inhibitory tyrozinkinázy (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO • · · · · ·Given the apparent association between PK-related cellular activities and a wide variety of human disorders, it is not surprising that much effort has been made in attempting to identify ways to modulate PK activity. Some of these experiments involved biomimetic methods performed using large molecules modeled for efficient cell processing (eg, mutant ligands (US App. No. 4,966,849); soluble receptors and antibodies (App. No. WO 94/10202, Kendall and Thomas, Proc. Nat'l Acad Sci., 90: 1070509 (1994), Kim, et al., Nature, 362: 841-844 (1993); RNA ligands (Jelinek, et al., Biochemistry, 33: 10450-56); Takano, et al., Mol, Bio, Cell 4: 358A (1993); Kinsella, et al., Exp. Cell Res. 199: 56-62 (1992); Wright, et al., J. Cellular Phys. 152: 448-57) and tyrosine kinase inhibitors (WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO

94/14808; U.S. Pat. No. 5,330,992; Mariani, et al., Proč. Am. Assoc. Cancer Res., 35: 2268 (1994)).94/14808; U.S. Pat. Pat. No. 5,330,992; Mariani, et al., Proc. Am. Assoc. Cancer Res., 35: 2268 (1994)).

Kromě výše uvedeného, byly prováděny pokusy k identifikování malých molekul, které reagují jako inhibitory PK. Jako inhibitory tyrozinkinázy byly popsány např. bis-monocyklické, bicyklické a heterocyklické arylové sloučeniny (PCT WO 92/20642), deriváty vinylen-azaindolu (PCT WO 94/14808) a 1 -cyklopropyl-4pyridylchinolony (U.S. Pat. No. 5,330,992). Jako inhibitory PTK účinné při ošetření rakoviny byly popsány styrylové sloučeniny (U.S. Pat. No. 5,217,999), pyridylové sloučeniny substituované styrylem (U.S. Pat. No. 5,302,606), deriváty chinazolinu (EP App. No. 0 566 266 Al), selenindoly a selenidy (PCT WO 94/03427), tricyklické polyhydroxylové sloučeniny (PCT WO 92/21660) a sloučeniny benzylfosfonové kyseliny (PCT WO 91/15495).In addition to the above, attempts have been made to identify small molecules that respond as PK inhibitors. Bis-monocyclic, bicyclic and heterocyclic aryl compounds (PCT WO 92/20642), vinylene-azaindole derivatives (PCT WO 94/14808) and 1-cyclopropyl-4-pyridylquinolones (U.S. Pat. No. 5,330,992) have been described as tyrosine kinase inhibitors. Styryl compounds (US Pat. No. 5,217,999), styryl substituted pyridyl compounds (US Pat. No. 5,302,606), quinazoline derivatives (EP App. No. 0 566 266 A1), selenindoles and selenides have been described as PTK inhibitors effective in the treatment of cancer. (PCT WO 94/03427), tricyclic polyhydroxyl compounds (PCT WO 92/21660) and benzylphosphonic acid compounds (PCT WO 91/15495).

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Naše úsilí identifikovat malé organické molekuly, které modulují aktivitu proteinkináz a u kterých tudíž lze očekávat, že budou užitečné při léčbě a prevenci poruch souvisejících s abnormální aktivitou proteinkináz, nás vedlo k objevu rodiny nových sloučenin, pyrrolem substituovaných 2-indolinonů, které vykazují schopnost modulovat aktivitu proteinkináz, a tudíž lze očekávat, že mají příznivý účinek na poruchy odvozené od abnormálních aktivit proteinkináz. Jsou to tyto sloučeniny, které jsou předmětem tohoto vynálezu.Our efforts to identify small organic molecules that modulate protein kinase activity and therefore can be expected to be useful in the treatment and prevention of disorders associated with abnormal protein kinase activity have led us to the discovery of a family of novel compounds, pyrrole substituted 2-indolinones that have the ability to modulate activity protein kinases, and thus can be expected to have a beneficial effect on disorders derived from abnormal protein kinase activities. These are the compounds of the present invention.

Tak se tento vynález obecně týká nových pyrrolem substituovaných 2-indolinonů, které modulují aktivity receptorových tyrozinkináz (RTK), nereceptorových proteintyrozinkináz (CTK) a serin/threoninproteinkináz (STK). Dále se tento vynález týká přípravy a použití farmaceutické kompozice zde předkládaných sloučenin a jejich fyziologicky přijatelných solí a proléčiv pro léčbu a prevenci poruch souvisejících s proteinkinázami, jako je například, nikoli však pouze, rakovina, diabetes, cirhóza jater, kardiovaskulární nemoci jako « · · · atheroskleróza, angiogeneze, imunologická onemocnění jako autoimunitní onemocnění a ledvinová onemocnění.Thus, this invention generally relates to novel pyrrole substituted 2-indolinones that modulate the activity of receptor tyrosine kinases (RTKs), non-receptor protein tyrosine kinases (CTKs), and serine / threonine protein kinases (STKs). Further, the present invention relates to the preparation and use of a pharmaceutical composition of the present compounds and their physiologically acceptable salts and prodrugs for the treatment and prevention of protein kinase related disorders such as, but not limited to, cancer, diabetes, liver cirrhosis, cardiovascular diseases such as · Atherosclerosis, angiogenesis, immunological diseases such as autoimmune diseases and kidney diseases.

Termíny 2-indolinon,indolin-2-on a 2-oxindol jsou zde zaměnitelné a vztahují se k molekule mající chemickou strukturu:The terms 2-indolinone, indolin-2-one and 2-oxindole are used interchangeably herein and refer to a molecule having a chemical structure:

Termín pyrrol se vztahuje k molekule mající chemickou strukturu:The term pyrrole refers to a molecule having a chemical structure:

Termíny pyrrolem substituovaný 2-indolinon a 3-pyrrolidenyl2-indolinon jsou zde zaměnitelné a vztahují se k chemické sloučenině s obecnou strukturou danou vzorcem 1.The terms pyrrole substituted 2-indolinone and 3-pyrrolidenyl-2-indolinone are used interchangeably herein and refer to a chemical compound having the general structure given by Formula 1.

Termín farmaceutická kompozice se vztahuje ke směsi jedné nebo více složek, fyziologicky přijatelných solí nebo jejich proléčiv, s dalšími chemickými složkami jako jsou např. fyziologicky přijatelné nosiče a vehikulum. Záměrem použití farmaceutické kompozice je usnadnit aplikaci sloučeniny do organizmu.The term pharmaceutical composition refers to a mixture of one or more components, physiologically acceptable salts or prodrugs thereof, with other chemical components such as, for example, physiologically acceptable carriers and vehicles. The intent of using the pharmaceutical composition is to facilitate administration of the compound to the body.

Termín proléčivo se týká chemického prostředku, který je přeměněn v mateřské léčivo in vivo. Proléčiva jsou často užitečná, protože mohou být, v některých případech, snadněji aplikována než • · · · mateřské léčivo. Mohou být například biologicky dostupná pro orální podávání, zatímco mateřské léčivo nikoliv. Proléčivo může být také lépe rozpustné ve farmaceutických kompozicích než mateřské léčivo. Příkladem proléčiva by kromě jiného, byla sloučenina podle vynálezu, která je podávána jako ester (proléčivo), aby se usnadnil přestup přes membránu buňky, kde je rozpustnost ve vodě škodlivá z důvodů pohyblivosti, ale poté je metabolicky hydrolyzována na karboxylovou kyselinu, aktivní látku, která je již uvnitř buňky, kde je rozpustnost ve vodě prospěšná.The term prodrug refers to a chemical composition that is converted into a parent drug in vivo. Prodrugs are often useful as they may, in some cases, be easier to administer than the parent drug. For example, they may be bioavailable for oral administration, while the parent drug may not. The prodrug may also be better soluble in pharmaceutical compositions than the parent drug. An example of a prodrug would be, inter alia, a compound of the invention which is administered as an ester (prodrug) to facilitate cross-cell membrane transfer where water solubility is detrimental to mobility but then metabolically hydrolyzed to carboxylic acid, the active ingredient, which is already inside a cell where water solubility is beneficial.

Dalším příkladem by mohl být krátký polypeptid, například, kromě jiného, 2-10 polypeptidová aminokyselina, navázaná přes konečnou amino skupinu na karboxylovou skupinu této sloučeniny podle vynálezu, v níž je polypeptid hydrolyzován nebo metabolizován in vivo, aby uvolnil aktivní molekulu.Another example would be a short polypeptide, for example, inter alia, a 2-10 polypeptide amino acid linked via a terminal amino group to the carboxyl group of the compound of the invention, in which the polypeptide is hydrolyzed or metabolized in vivo to release the active molecule.

Termín pyrrolaldehyd se vztahuje k molekule mající chemickou strukturu:The term pyrrolaldehyde refers to a molecule having a chemical structure:

Jak zde bylo použito, fyziologicky přijatelný nosič se týká nosiče nebo ředidla, které nezpůsobí významné podráždění organismu a nezruší biologickou aktivitu a vlastnosti podávané sloučeniny.As used herein, a physiologically acceptable carrier refers to a carrier or diluent that does not cause significant irritation to the organism and does not impair the biological activity and properties of the compound administered.

Termín vehikulum se vztahuje k inertní látce, která se přidává do farmaceutické kompozice pro další usnadnění podávání sloučeniny. Příklady pomocných látek, kromě jiných, zahrnují uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry a typy škrobů, celulózové deriváty, želatinu, rostlinné oleje a polyethylenové glykoly.The term vehicle refers to an inert substance that is added to a pharmaceutical composition to further facilitate administration of the compound. Examples of excipients include, but are not limited to, calcium carbonate, calcium phosphate, various sugars and starch types, cellulose derivatives, gelatin, vegetable oils, and polyethylene glycols.

• · · · ·• · · · ·

1. Chemie1. Chemistry

A. Obecné strukturální charakteristikyA. General structural characteristics

V jednom směru se předkládaný vynález vztahuje k pyrrolem substituovaným 2-indolinonům, které jsou navíc kromě toho volitelně nahrazovány jak pyrrolovými tak 2-indolinovými částmi sloučeniny, a které jsou nezbytně nahrazovány v pyrrolové části jedním nebo více uhlovodíkovými řetězci, které jsou sami nahrazovány nejméně jednou polární skupinou. Fyziologicky přijatelné soli nebo proléčiva požadované sloučeniny jsou rovněž předmětem zkoumání toho vynálezu.In one aspect, the present invention relates to pyrrole substituted 2-indolinones which are additionally optionally additionally replaced by both pyrrole and 2-indoline moieties of the compound and which are necessarily replaced in the pyrrole moiety by one or more hydrocarbon chains which are themselves replaced by at least one polar group. Physiologically acceptable salts or prodrugs of the desired compound are also within the scope of the present invention.

Termín uhlovodíkový řetězec se, jak zde bylo definováno, vztahuje k alkylu, alkenylu nebo alkynylu.The term hydrocarbon chain, as defined herein, refers to alkyl, alkenyl, or alkynyl.

Termín polární skupina se vztahuje ke skupině v níž jsou jádra atomů navzájem kovalentně vázána jeden k druhému tak, že tvoří skupinu, která nesdílí elektrony kovalentní vazby, je spojující, stejnou měrou; tedy elektronový oblak je hustější okolo jednoho atomu než okolo druhého. Výsledkem je, že jeden konec kovalentní vazby je relativně záporný a druhý relativně kladný, tj. existuje záporný a kladný pól. Příklady polárních skupin, mimo jiné, zahrnují hydroxy skupinu, alkoxy skupinu, karboxy skupinu, nitro skupinu, kyano skupinu, amino skupinu, amonium, amido skupinu, ureido, sulfonamidy, sulfinyly, sulfonily, fosfonyly, morfolino, piperazinyl a tetrazol.The term polar group refers to a group in which the nuclei of atoms are covalently bonded to each other such that they form a group that does not share the electrons of the covalent bond, is connecting, equally; thus, the electron cloud is denser around one atom than around another. As a result, one end of the covalent bond is relatively negative and the other is relatively positive, i.e., there is a negative and a positive pole. Examples of polar groups include, but are not limited to, hydroxy, alkoxy, carboxy, nitro, cyano, amino, ammonium, amido, ureido, sulfonamides, sulfinyls, sulfoniles, phosphonyls, morpholino, piperazinyl, and tetrazole.

Tím, že přihlašovatelé nejsou vázáni žádnou teorií, v tuto chvíli věří, že polární skupiny mohou navzájem působit elektronově, například, kromě jiného, přes vodíkové vazby, Van der Wallsovy síly anebo iontové vazby (nikoliv kovalentní), s amino kyselinami v aktivním místě PTK. Tyto interakce mohou pomoci molekule tohoto vynálezu, aby se navázala na aktivní místo s dostatečnou pevností tak, že ztěžuje nebo zabraňuje přírodnímu substrátu zaujmout toto místo. Polární skupiny mohou rovněž přispět k selektivitě sloučeniny, tj., jedna polární skupina může mít větší afinitu k PTK vazební oblasti než jiná polární skupina, takže sloučenina obsahující první určitou polární skupinu je pravděpodobněji vázána než sloučeniny obsahující jiné polární skupiny.By not being bound by any theory, applicants believe at this point that polar groups can interact electronically, for example, inter alia, through hydrogen bonds, Van der Walls forces, or ion bonds (not covalent), with amino acids at the active site of the PTK. . These interactions can help the molecule of the invention to bind to an active site of sufficient strength so as to make it difficult or prevent the natural substrate from occupying that site. Polar moieties may also contribute to the selectivity of the compound, i.e., one polar moiety may have greater affinity for the PTK binding region than another polar moiety, so that a compound containing the first particular polar moiety is more likely to be bound than compounds containing other polar moieties.

Tudíž, jeden aspekt stávajícího vynálezu se týká sloučeniny mající následující chemickou strukturu;Thus, one aspect of the present invention pertains to a compound having the following chemical structure;

R¹ je vybrán ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, alkenylu, cykloalkylu, arylu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, Ckarboxy skupiny, acetylu, C-amidu, C-thioamidu, sulfonylu a tr ihal ogen methan sulfonylu.R ¹ is selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, alkenyl, cycloalkyl, aryl, hydroxy, alkoxy, Ccarboxy, acetyl, C-amide, C-thioamide, sulfonyl and trihalo methane sulfonyl.

R² je vybrán ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, halogenu, á’kylu, cykloalkylu, arylu, heteroarylu a heteroalicyklu.R ² is selected from the group consisting of hydrogen, halogen, alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl and heteroalicyclic.

R³ ,R⁴, R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vybrané ze skupin sestávající se z atomu yodíku, alkylu, trihalogenalkylu, cykloalkylu, alkenylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merka',uto skupiny, alkylthio skupiny, arylthiol skupiny, sulfinylu, sulfonylu, S-sulfonamidu, N-sulfonamidu, trihalogenmethansulfonamjdu, karbonylu, C-karboxy skupiny, Okarboxy skupiny, C-amidu, N-amidu, kyano skupiny, nitro skupiny, halogenu, O-karbamylu, N-k/?rbamylu, O-thiokarbamylu, Nthiokarbamylu, amino skupiny a -NR”Ř¹², ίR ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are independently selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, trihaloalkyl, cycloalkyl, alkenyl, aryl, heteroaryl, heteroalicyclic, hydroxy, alkoxy, aryloxy, mercapto, and so on , alkylthio groups, arylthiol groups, sulfinyl, sulfonyl, S-sulfonamide, N-sulfonamide, trihalomethanesulfonamide, carbonyl, C-carboxy groups, Okarboxy groups, C-amides, N-amides, cyano groups, nitro groups, halogen, O-carbamyl , Nk /? -Bamyl, O-thiocarbamyl, Nthiocarbamyl, amino groups and -NR? Ř ¹² , ί

• · · ·• · · ·

R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, cykloalkylu, arylu, karbonylu, acetylu, sulfonylu, trifluormethansulfonylu a kombinovaných pěti- nebo šesti-ělenných heteroalicyklů.R ¹¹ and R ¹² are independently selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, cycloalkyl, aryl, carbonyl, acetyl, sulfonyl, trifluoromethanesulfonyl, and combined five- or six-membered heteroalicycles.

R³ a R⁴, R⁴ a R⁵, nebo R⁴ a R⁵ se mohou spojit a vytvoří šestičlenný arylový kruh, methylendioxy skupinu nebo ethylendioxy skupinu.R ³ and R ⁴ , R ⁴ and R ⁵ , or R ⁴ and R ⁵ may combine to form a six-membered aryl ring, a methylenedioxy group or an ethylenedioxy group.

R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, cykloalkylu, alkenylu, alkynylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklů, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, karbonylu, acetylu,C-amidu, C-thioamidu, amidinu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, sulfonylu a trihalogenmethan-sulfonylu.R ⁷ is selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, heteroalicyclic, hydroxy, alkoxy, aryloxy, carbonyl, acetyl, C-amide, C-thioamide, amidine, C -carboxy groups, O-carboxy groups, sulfonyl and trihalomethanesulfonyl.

R⁸, R⁹ a R¹⁰ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, trihalogenalkylu, cykloalkylu, alkenylu, alkynylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklů, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkylthio skupiny, arylthio skupiny, sulfinylu, sulfonylu, S-sulfonamidu, N-sulfonamidu, karbonylu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, kyano skupiny, nitro skupiny, halogenu, O-karbamylu, N-karbamylu, O-thiokarbamylu, N-thiokarbamylu, C-amidu, N-amidu, amino skupiny a -NRⁿR¹², za předpokladu, že nejméně jeden z R⁸, R⁹ nebo R¹⁰ je skupina mající vzorec -(alk[)Z.R ⁸ , R ⁹ and R ¹⁰ are independently selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, trihaloalkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, heteroalicyclic, hydroxy, alkoxy, aryloxy, mercapto, alkylthio, arylthio, sulfinyl, sulfonyl, S-sulfonamide, N-sulfonamide, carbonyl, C-carboxy, O-carboxy, cyano, nitro, halogen, O-carbamyl, N-carbamyl, O-thiocarbamyl, N-thiocarbamyl , C-amido, N-amido, amino and -NR ⁿ R ^12, provided that at least one of R ^8, R ⁹ or R ¹⁰ is a group having the formula - (alk [) Z.

Alki je vybrán ze skupiny sestávající se z alkylu, alkenylu nebo alkynylu.Alki is selected from the group consisting of alkyl, alkenyl or alkynyl.

Z je a polární skupina.Z is a polar group.

Jak bude dále používáno, termín alkyl se vztahuje na saturovaný alifatický uhlovodík, včetně přímého řetězce a postranních řetězců. Ve většině případů, alkyl má 1 až 20 uhlíkových atomů (kdykoliv se dále v textu uvede numerické rozpětí; např. 1-20, znamená to, že skupina, v tomto případě alkyl, může obsahovat 1 uhlíkový atom, 2 uhlíkové atomy, 3 uhlíkové atomy, atd, až do 20 uhlíkových atomů včetně). Často je to alkyl střední velikosti mající 1 až 10 uhlíkových atomů. Nejěastěji je to nižší alkyl mající 1 až 4 uhlíkové atomy. Alkyl může a iAs used hereinafter, the term alkyl refers to a saturated aliphatic hydrocarbon, including straight chain and side chains. In most cases, alkyl has 1 to 20 carbon atoms (whenever numeric ranges are given below; eg 1-20, this means that the group, in this case alkyl, may contain 1 carbon atom, 2 carbon atoms, 3 carbon atoms atoms, etc., up to and including 20 carbon atoms). Often it is a medium size alkyl having 1 to 10 carbon atoms. Most often it is a lower alkyl having 1 to 4 carbon atoms. Alkyl can and i

• · · · · nemusí být substituován. Je-li substituován, substituent je nejčastěji jedna nebo více skupin vybraných nezávisle z cykloalkylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkylthio skupiny, arylthio skupiny, kyano skupiny, halogenu, karbonylu, thiokarbonylu, O- karbamylu, Nkarbamylu, O-thiokarbamylu, N-thiokarbamylu, C-amidu, N-amidu, Ckarboxy skupiny, O-karboxy skupiny, nitro skupiny, silylu, amino skupiny a -NR^UR¹², s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno výše.It may not be substituted. When substituted, the substituent is most often one or more selected independently from cycloalkyl, aryl, heteroaryl, heteroalicyclic, hydroxy, alkoxy, aryloxy, mercapto, alkylthio, arylthio, cyano, halogen, carbonyl, thiocarbonyl, O- carbamyl, Nkarbamylu, O-thiocarbamyl, N-thiocarbamyl, C-amido, N-amido, Ckarboxy, O-carboxy, nitro, silyl, amino and -NR ¹² R ^U, if R ¹¹ and R ¹² as defined above.

Termín cykloalkyl se vztahuje k uhlíkovému monocyklu nebo spojenému kruhu (tzn. kruhy , které sdílí sousední pár uhlíkových atomů), skupině, kde jeden nebo více kruhů nemá kompletně konjugovaný pí-elektronový systém. Příklady cykloalkylů, kromě jiného, jsou cyklopropan, cyklobutan, cyklopentan, cyklopenten, cyklohexan, adamantan, cyklohexadien, cykloheptan a cykloheptatrien. Cykloalkyl může nebo nemusí být substituován. Je-li substituován, substituent je nejčastěji jedna nebo více skupin vybraných nezávisle z alkylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkylthio skupiny, arylthio skupiny, kyano skupiny, halogenu, karbonylu, thiokarbonylu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, O-karbamylu, N-karbamylu, C-amidu, Namidu, nitro skupiny, amino skupiny a -NRⁿR¹², s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno výše.The term cycloalkyl refers to a carbon monocycle or fused ring (i.e., rings that share an adjacent pair of carbon atoms), a group in which one or more rings do not have a completely conjugated pi-electron system. Examples of cycloalkyls include, but are not limited to, cyclopropane, cyclobutane, cyclopentane, cyclopentene, cyclohexane, adamantane, cyclohexadiene, cycloheptane, and cycloheptatriene. Cycloalkyl may or may not be substituted. When substituted, the substituent is most often one or more groups selected independently from alkyl, aryl, heteroaryl, heteroalicycl, hydroxy, alkoxy, aryloxy, mercapto, alkylthio, arylthio, cyano, halogen, carbonyl, thiocarbonyl, C-carboxy, O-carboxy, O-carbamyl, N-carbamyl, C-amido, benzenesulfonamide, nitro, amino and -NR ⁿ R ^12, R ¹¹ and R ¹² as defined above.

Termín alkenyl se vztahuje k alkylu, jak bylo definováno, obsahujícímu nejméně dva uhlíkové atomy a nejméně jednu uhlík-uhlík dvojnou vazbu.The term alkenyl refers to an alkyl as defined containing at least two carbon atoms and at least one carbon-carbon double bond.

Termín alkynyl se vztahuje k alkylu, jak bylo definováno, obsahujícímu nejméně dva uhlíkové atomy a nejméně jednu uhlík-uhlík trojnou vazbu.The term alkynyl refers to an alkyl as defined containing at least two carbon atoms and at least one carbon-carbon triple bond.

Termín aryl se vztahuje k uhlíkovému monocyklu nebo polycyklu (tzn., kruhy , které sdílí sousední páry uhlíkových atomů), skupině mající kompletně konjugovaný pí-elektronový systém. Příklad arylu, kromě jiného, jsou fenyl, nafthalenyl a anthracenyl. Aryl může a nemusí být substituován. Je-li substituován, substituent je nejčastěji ·» 00 00 • · · · · · · • · 0 0 0 >The term aryl refers to a carbon monocycle or polycycle (i.e., rings that share adjacent pairs of carbon atoms), a group having a completely conjugated pi-electron system. Examples of aryl include, but are not limited to, phenyl, naphthalenyl, and anthracenyl. The aryl may or may not be substituted. When it is substituted, the substituent is most often "00 00"

• 0 · · • · · · ·· <··· 00 · jedna nebo více skupin vybraných z halogenu, trihalogenmethylu, alkylu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkylthio skupiny, arylthio skupiny, kyano skupiny, nitro skupiny, karbonylu, thiokarbonylu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, O-karbamylu, N-karbamylu, O- thiokarbamylu, Nthiokarbamylu, C-amidu, N-amidu, sulfinylu, sulfonylu, amino skupiny a -NR^I!R¹², s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno.One or more groups selected from halogen, trihalomethyl, alkyl, hydroxy, alkoxy, aryloxy, mercapto, alkylthio, arylthio, cyano, nitro groups, carbonyl, thiocarbonyl, C-carboxy groups, O-carboxy groups, O-carbamyl, N-carbamyl, O-thiocarbamyl, N-thiocarbamyl, C-amide, N-amide, sulfinyl, sulfonyl, amino groups and -NR 11 ^; R ¹² , with R ¹¹ and R ¹² as defined.

Jak bude dále používáno, termín heteroaryl se vztahuje k monocyklu nebo spojeným kruhům (tzn., kruhy , které sdílí sousední páry atomů), skupině mající v kruhu(-zích) jeden nebo více atomů vybraných ze skupiny sestávající se z dusíku, kyslíku a síry , a dále, který má kompletně konjugovaný pí-elektronový systém. Příklad heteroarylu, kromě jiného, jsou pyrrol, furan, thiofen, imidazol, oxazol, thiazol, pyrazol, pyridin, pyrimidin, chinolin, izochinolin, purin a karbazol. Heteroaryl může a nemusí být substituován. Je-li substituován, substituent je nejčastěji jedna nebo více skupin vybraných z alkylu, cykloalkylu, halogenu, trihalogenmethylu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkylthio skupiny, arylthio skupiny, kyano skupiny, nitro skupiny, karbonylu, thiokarbonylu, sulfonamidu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, sulfinylu, sulfonylu, O-karbamylu, N-karbamylu O-thiokarbamylu, Nthiokarbamyl, C-amidu, N-amidu, amino skupiny a -NRⁿR¹², sR¹¹ a R¹² jak bylo definováno.As used herein, the term heteroaryl refers to a monocycle or fused rings (i.e., rings that share adjacent pairs of atoms), a group having in the ring (s) one or more atoms selected from the group consisting of nitrogen, oxygen and sulfur , and further having a completely conjugated pi-electron system. Examples of heteroaryl include, but are not limited to, pyrrole, furan, thiophene, imidazole, oxazole, thiazole, pyrazole, pyridine, pyrimidine, quinoline, isoquinoline, purine, and carbazole. The heteroaryl may or may not be substituted. When substituted, the substituent is most often one or more selected from alkyl, cycloalkyl, halogen, trihalomethyl, hydroxy, alkoxy, aryloxy, mercapto, alkylthio, arylthio, cyano, nitro, carbonyl, thiocarbonyl, sulfonamide C-carboxy, O-carboxy, sulfinyl, sulfonyl, O-carbamyl, N-carbamyl O-thiocarbamyl, Nthiokarbamyl, C-amido, N-amido, amino and -NR ⁿ R ^12, sR ¹¹ and R ¹² as defined.

Termín heteroalicyklse vztahuje k monocyklu nebo spojenému kruhu majícímu v kruhu (zích) jeden nebo více atomů vybraných ze skupiny sestávající se dusíku, kyslíku a síry. Kruh může mít jednu nebo více dvojných vazeb. Kruh však nemá kompletně konjugovaný píelektronový systém. Heteroalicykl může a nemusí být substituován. Jeli substituován, substituent je nejčastěji jedna nebo více skupin vybraných z alkylu, cykloaklylu, halogenu, trihalogenmethylu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkylthio skupiny, arylthio skupiny, kyano skupiny, nitro skupiny, karbonylu, thiokarbonylu, C-karboxy skupiny, O-karboxy skupiny, O- karbamylu, >The term heteroalicyclic refers to a monocycle or a fused ring having one or more atoms in the ring (s) selected from the group consisting of nitrogen, oxygen and sulfur. The ring may have one or more double bonds. However, the ring does not have a completely conjugated pielectron system. The heteroalicyclic may or may not be substituted. When substituted, the substituent is most often one or more selected from alkyl, cycloaclyl, halogen, trihalomethyl, hydroxy, alkoxy, aryloxy, mercapto, alkylthio, arylthio, cyano, nitro, carbonyl, thiocarbonyl, C- carboxy groups, O-carboxy groups, O-carbamyl, &gt;

·» »9 99 • · 9 9 9 · · • · » » · • 99 · · • 9 «999 999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 999 99

N-karbamylu, O-thiokarbamylu, N-thiokarbamylu, sulfinylu, sulfonylu,N-carbamyl, O-thiocarbamyl, N-thiocarbamyl, sulfinyl, sulfonyl,

1110 11 to1111 11 to

C-amidu, N-amidu, amino skupiny a -NR R , s R a R jak bylo definováno.C-amide, N-amide, amino groups and -NR R, with R and R as defined.

Termín hydroxy skupina se týká -OH skupiny.The term hydroxy refers to an -OH group.

Termín alkoxy skupina se týká jak -O-alkylu, tak -Ocykloalkylu, jak bylo definováno.The term alkoxy refers to both -O-alkyl and -Ocycloalkyl as defined herein.

Termín aryloxy skupina se týká jak -O-arylu, tak -Oheteroarylu, jak bylo definováno.The term aryloxy refers to both -O-aryl and -O-heteroaryl as defined.

Termín merkapto skupina se týká -SH skupiny.The term mercapto group refers to the -SH group.

Termín alkylthio skupina se týká jak S-alkylu, tak -Scykloalkylu, jak bylo definováno.The term alkylthio group refers to both S-alkyl and -Scycloalkyl as defined.

Termín arylthio skupina se týká jak -S-arylu, tak -Sheteroarylu, jak bylo definováno.The term arylthio refers to both -S-aryl and-heteroaryl as defined.

Termín karbonylse týká -C(=O)-R skupiny, kde R je vybrán ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, cykloalkylu, arylu, heteroarylu (vázaného přes uhlíkový kruh) a heteroalicyklu (vázaného přes uhlíkový kruh), jak bylo definováno.The term carbonyl refers to a -C (= O) -R group wherein R is selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl (bonded via a carbon ring) and heteroalicyclic (bonded via a carbon ring) as defined .

Termín aldehyd se týká karbonylové skupiny, kde R je atom vodíku.The term aldehyde refers to a carbonyl group wherein R is hydrogen.

Termín thiokarbonyl se týká -C(=S)-R skupiny, s R jak bylo definováno.The term thiocarbonyl refers to a -C (= S) -R group, with R as defined.

Termín C-karboxy skupina se týká -C(=O)O-R skupiny, s R jak bylo definováno.The term C-carboxy group refers to a -C (= O) O-R group, with R as defined.

Termín O-karboxy skupina se týká -OC(=O)R skupiny, s R jak bylo definováno.The term O-carboxy group refers to the -OC (= O) R group, with R as defined.

Termín ester se týká -C(=O)O-R skupiny, s R jak bylo definováno, avšak R nesmí být atom vodíku.The term ester refers to a -C (= O) O-R group, with R as defined, but R may not be hydrogen.

Termín acetyl se týká -C(=0)CH3 skupiny.The term acetyl refers to a -C (= O) CH 3 group.

Termín karboxylová kyselina se vztahuje k C-karboxy skupině, ve které R je atom vodíku.The term carboxylic acid refers to a C-carboxy group in which R is a hydrogen atom.

Termín halogen se týká fluoru, chloru, bromu nebo jodu.The term halogen refers to fluorine, chlorine, bromine or iodine.

Termín trihalogenmethyl se vztahuje k -CX3 skupině, kde X je halogen, jak bylo definováno.The term trihalomethyl refers to a -CX 3 group wherein X is halogen as defined.

• flflfl fl flfl flfl flfl • fl flflflfl flflfl • · « flflfl • flflfl flflflfl fl flflfl flfl • flfl flfl flflflfl flfl ·• flflfl flfl flfl flfl • flflflfl flflfl • · «flflfl • flflfl flflflfl fl flflfl flfl • flfl flfl flflflfl flfl ·

Termín trihalogenmethansulfonylse vztahuje k X3CS(=O)2skupině, s X jak bylo definováno.The term trihalomethanesulfonyl refers to the X 3 CS (= O) 2 group, with X as defined.

Termín kyano skupina se týká -C=N skupiny.The term cyano refers to a -C = N group.

Termín sulfinylse týká -S(=O)-R skupiny, kde kromě definovaného, R může být také hydroxy skupina.The term sulfinyl refers to a -S (= O) -R group wherein, in addition to the defined, R may also be a hydroxy group.

Termín sulfonyl se týká -S(=O)2R skupiny, kde kromě definovaného, R může být také hydroxy skupina.The term sulfonyl refers to a -S (= O) 2 R group wherein, in addition to the defined, R may also be a hydroxy group.

Termín methylendioxy skupina se týká -OCH2O- skupiny, kde dva kyslíkové atomy jsou vázány se sdílenými uhlíkovými atomy.The term methylenedioxy group refers to a -OCH 2 O- group wherein two oxygen atoms are bonded to shared carbon atoms.

Termín ethylendioxy skupina se týká -OCH2CH2O-, kde dva kyslíkové atomy jsou vázány k sousedním uhlíkovým atomům.The term ethylenedioxy refers to -OCH 2 CH 2 O-, wherein two oxygen atoms are bonded to adjacent carbon atoms.

Termín S-sulfonamid se vztahuje k -S(=O)2 NRⁿR¹² skupině, s Rl 1 a R12 jak bylo definováno.The term sulfonamide refers to -S (= O) 2 NR ⁿ R ¹² group, with R 1 and R 12 as defined.

Termín N-sulfonamid se vztahuje k -NR¹¹ S(=O)2R¹² skupině, sThe term N-sulfonamide refers to the -NR ¹¹ S (= O) 2 R ¹² group, p

1919 Dec

R a R jak bylo definováno.R and R as defined.

Termín O-karbamyl se vztahuje k -OC(=O)NR¹ *R¹² skupině, s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno.The term O-carbamyl refers to the -OC (= O) NR ¹¹ R ¹² group, with R ¹¹ and R ¹² as defined.

Termín N-karbamylse vztahuje k R¹²OC (=O)NR^U- skupině, s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno.The term N-karbamylse refers to R ¹² OC (= O) NR ^U - group, with R ¹¹ and R ¹² as defined.

Termín O-thiokarbamyl se vztahuje k -OC(=S)NR’^]R¹² skupině, s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno.The term O-thiocarbamyl refers to a -OC (= S) ^NR] R ¹² group with R ¹¹ and R ¹² as defined.

Termín N-thiokarbamyl se vztahuje k R¹²OC(=S)NR’¹ - skupině, s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno.The term N-thiocarbamyl refers to the R ¹² OC (= S) NR ¹¹ - group, with R ¹¹ and R ¹² as defined.

Termín amino skupina se týká -NRⁿR¹² skupiny, kde R¹¹ a R¹² jsou oba atomy vodíku.The term amino refers to the group -NR ⁿ R ¹² groups wherein R ¹¹ and R ¹² are both hydrogen.

Termín C-amid se vztahuje k -(3(=0) NRⁿR¹² skupině, s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno.C. The term amide refers to - (3 (= 0) NR ⁿ R ¹² group with R ¹¹ and R ¹² as defined.

Termín N-amid se vztahuje k R¹²C(=O)NR¹¹- skupině, s R¹¹ aThe term N-amide refers to the R ¹² C (= O) NR ¹¹ - group, with R ^11a

R¹² jak bylo definováno.R ¹² as defined.

Termín amonium se vztahuje k -+NHR^1IR¹² skupině, kde R¹¹ aThe term ammonium refers to the - + NHR ¹¹ R ¹² group, wherein R ¹¹ and R ¹¹

R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z alkylu, cykloalkylu, arylu, a heteroarylu.R ¹² are independently selected from the group consisting of alkyl, cycloalkyl, aryl, and heteroaryl.

Termín ureidose týká -NR¹'C(=O)NR¹²R¹³ skupiny, s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno, a stejně tak je definován i R¹³.The term ureidose refers to the -NR ¹ 'C (= O) NR ¹² R ¹³ group, with R ¹¹ and R ¹² as defined, as well as R ¹³ .

Termín guanidino se vztahuje k -R¹ 'NC(=N)NR¹²R¹³ skupině, s R¹¹, R¹² a R¹³ jak bylo definováno.The term guanidino refers to the -R ¹ 'NC (= N) NR ¹² R ¹³ group, with R ¹¹ , R ¹² and R ¹³ as defined.

Termín amidin se vztahuje k R¹¹R¹²NC(=N)- skupině, s R¹¹ a R¹² jak bylo definováno.The term amidine refers to the R ¹¹ R ¹² NC (= N) - group, with R ¹¹ and R ¹² as defined.

Termín nitro skupina se týká -NO2 skupiny.The term nitro group refers to the -NO2 group.

Termín fosfonyl se vztahuje -OP(=O)2OR, s R jak bylo definováno.The term phosphonyl refers to -OP (= O) 2 OR, with R as defined.

Termín morfolino se vztahuje k skupině mající chemickou strukturu:The term morpholino refers to a group having a chemical structure:

Termín piperazinyl se vztahuje k skupině mající chemickou strukturu:The term piperazinyl refers to a group having the chemical structure:

IAND

NN

IAND

Termín tetrazol se vztahuje k skupině mající chemickou strukturu:The term tetrazole refers to a group having a chemical structure:

• ·• ·

B. Výhodné strukturální vlastnosti.B. Advantageous structural properties.

Výhodným provedením tohoto vynálezu je, že R¹ je atom vodíku.Rovněž výhodným provedením tohoto vynálezu je, že R² je atom vodíku.Stejně tak je výhodným provedením tohoto vynálezu, že R⁷ je atom vodíku.Výhodným provedením tohoto vynálezu je, že všechny tři výše uvedené výhody existují ve stejné molekule; tzn., že ve sloučenině tohoto vynálezu, R¹, R² a R⁷ jsou atomy vodíku.A preferred embodiment of the present invention is that R ¹ is a hydrogen atom. Also a preferred embodiment of the present invention is that R ² is a hydrogen atom. Likewise, a preferred embodiment of the present invention is that R ⁷ is a hydrogen atom. the three advantages mentioned above exist in the same molecule; that is, in the compound of the invention, R ¹ , R ² and R ⁷ are hydrogen atoms.

Další výhodou tohoto vynálezu je, že R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z hydroxy skupiny, halogenu, C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z atomu vodíku a nesubstituovaného nižšího alkylu, amino skupiny nebo NR“R¹² ; nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, nižší alkoxy skupiny substituované jedním nebo více halogeny, nižší alkoxy skupiny substituované nesubstituovaným arylem nebo arylem substituovaným jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, halogenu, amino skupiny, nesubstituovaného nižšího alkyl S-sulfonamidu nebo -NRⁿR¹², nesubstituovaného arylu nebo arylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, nižší alkoxy skupiny substituované jedním nebo více halogeny, nižší alkoxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného arylu nebo arylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, halogenu, amino skupiny, nesubstituovaného nižšího alkyl S-sulfonamidu nebo -NRⁿR¹² , hydroxy skupiny, amino skupiny, nesubstituovaného nižšího alkyl sulfonamidu, C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z atomu vodíku nebo nesubstituovaného nižšího alkylu, morfolinu, -NR R , trihalogenmethylu, arylu, arylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z hydroxy skupiny, halogenu, trihalogenmethylu, amino skupiny, NRⁿR¹², sulfonamidu, C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z atomu vodíku nebo nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituovaného nižšího alkylu nebo nižšího alkylu substituovaného skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z hydroxy skupiny, halogenu, C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z atomu vodíku nebo nesubstituovaného nižšího alkylu, amino skupiny nebo NRⁿR¹², nesubstituovaného heteroalicyklu, heteroalicyklu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z halogenu, hydroxy skupiny, nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituovaného nižšího alkylkarbonylu, hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny nebo alkoxy skupiny substituované jedním nebo více halogeny, nesubstituované aryloxy skupiny , aryloxy skupiny substituované jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, trihalogenmethylu, halogenu, hydroxy skupiny, amino skupiny nebo -NRⁿR¹², merkapto skupiny, nesubstituované nižší alkyl alkylthio skupiny, nesubstituované arylthio skupiny, arylthio skupiny substituované jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z halogenu, hydroxy skupiny, amino skupiny nebo -NRⁿR¹², C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající sé z atomu vodíku a nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituované nižší alkyl Okarboxy skupiny, nesubstituovaného nižšího alkyl S-sulfonamidu, nitro skupiny, nesubstituovaného nižšího alkyl C-amidu, nesubstituovaného nižšího alkyl N-amidu, amino skupiny a -R R .Another advantage of the present invention is that R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are selected from the group consisting of hydrogen, unsubstituted lower alkyl, lower alkyl substituted with a group selected from the group consisting of hydroxy, halogen, C-carboxy a group substituted with a group selected from the group consisting of hydrogen and unsubstituted lower alkyl, amino or NR ¹² R ¹² ; unsubstituted lower alkyl alkoxy groups, lower alkoxy groups substituted with one or more halogens, lower alkoxy groups substituted with unsubstituted aryl or aryl substituted with one or more groups independently selected from the group consisting of unsubstituted lower alkyl, hydroxy, unsubstituted lower alkyl alkoxy, halogen, amino groups , unsubstituted lower alkyl S-sulfonamido or -NR ⁿ R ^12, unsubstituted aryl or aryl substituted by one or more groups independently selected from the group consisting of unsubstituted lower alkyl, unsubstituted lower alkyl alkoxy, lower alkoxy substituted by one or more halogens, lower alkoxy a group substituted with a group selected from the group consisting of unsubstituted aryl or aryl substituted with one or more groups independently selected from the group consisting of unsubstituted tuovaného lower alkyl, hydroxy, unsubstituted lower alkyl alkoxy, halo, amino, unsubstituted lower alkyl S-sulfonamido or -NR ⁿ R ^12, hydroxy, amino, unsubstituted lower alkyl sulfonamide, C-carboxy substituted with a group selected from consisting of hydrogen or unsubstituted lower alkyl, morpholino, -NR R, trihalomethyl, aryl, aryl substituted with one or more groups independently selected from the group consisting of hydroxy, halo, trihalomethyl, amino, -NR ⁿ R ^12, sulfonamide, C-carboxy groups substituted with a group selected from the group consisting of hydrogen or unsubstituted lower alkyl, unsubstituted lower alkyl or lower alkyl substituted with a group selected from the group consisting of hydroxy, halogen, C-carboxy groups substituted with a group selected from six ávající from hydrogen or unsubstituted lower alkyl, amino or -NR ⁿ R ^12, unsubstituted heteroalicyclic, heteroalicyclic substituted with one or more groups independently selected from the group consisting of halogen, hydroxy, unsubstituted lower alkyl, unsubstituted lower alkylcarbonyl, hydroxy, unsubstituted lower alkyl alkoxy or alkoxy substituted with one or more halogens, unsubstituted aryloxy, aryloxy substituted with one or more groups independently selected from the group consisting of unsubstituted lower alkyl, trihalomethyl, halo, hydroxy, amino or -NR ⁿ R ¹² , mercapto groups, unsubstituted lower alkyl alkylthio groups, unsubstituted arylthio groups, arylthio groups substituted with one or more groups selected from the group consisting of halogen, hydroxy, amino groups or -NR ⁿ R ^12, C-carboxy substituted with a group selected from the group consisting of hydrogen and unsubstituted lower alkyl, unsubstituted lower alkyl Okarboxy groups, unsubstituted lower alkyl S-sulfonamido, nitro, unsubstituted lower alkyl C-amido, unsubstituted lower alkyl N-amide, amino groups and -RR.

V dalších výhodných provedeních tohoto vynálezu, R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, halogenu, nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z hydroxy skupiny, halogenu, C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z atomu vodíku nebo nesubstituovaného nižšího alkylu, amino skupiny nebo NR^flR¹², nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, nižší alkylalkoxy skupiny substituované jedním nebo více halogeny, nesubstituované aryloxy skupiny, aryloxy skupiny substituované jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny, hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, halogenu, amino skupiny nebo -NR R , Ssulfonamidu, kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku a nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z halogenu, nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, amino skupiny nebo -NR^UR¹², nesubstituovaného heteroarylu, heteroarylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, hydroxy skupiny, halogenu, amino skupiny nebo -NRⁿR¹², nesubstituovaného heteroalicyklu, heteroalicyklu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z halogenu, hydroxy skupiny, nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, amino skupiny nebo -NR^UR¹², nesubstituované nižší alkyl O-karboxy skupiny, C-amidu, kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a nesubstituovaného arylu, a N-amidu, kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a nesubstituovaného arylu.In other preferred embodiments of the invention, R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are independently selected from the group consisting of hydrogen, halogen, unsubstituted lower alkyl, lower alkyl substituted with one or more groups selected from the group consisting of hydroxy , halo, C-carboxy substituted with a group selected from the group consisting of hydrogen or unsubstituted lower alkyl, amino or NR ^{fl R12,} unsubstituted lower alkyl alkoxy, lower alkyl alkoxy substituted with one or more halogens, unsubstituted aryloxy groups, aryloxy groups substituted with one or more groups independently selected from the group consisting of unsubstituted lower alkyl, lower alkyl substituted with one or more halo, hydroxy, unsubstituted lower alkylalkoxy, halogen, amino or -NR R, Ssulfonamide, wherein R ¹¹ and R ¹² are independently selected from the group consisting of hydrogen and unsubstituted lower alkyl, unsubstituted aryl, aryl substituted with one or more groups independently selected from the group consisting of halogen, unsubstituted lower alkyl, lower alkyl substituted with one or more halogen, unsubstituted lower alkyl alkoxy, an amino group or -NR ¹² R ^U, unsubstituted heteroaryl, heteroaryl substituted by one or more groups independently selected from the group consisting of unsubstituted lower alkyl, lower alkyl substituted with one or more halogens, unsubstituted lower alkyl alkoxy, hydroxy, halogen, amino or -NR ⁿ R ^12, unsubstituted heteroalicyclic, heteroalicyclic substituted with one or more groups independently selected from the group consisting of halogen, hydroxy, unsubstituted lower alkyl, lower í alkyl substituted with one or more halogens, unsubstituted lower alkyl alkoxy, amino or -NR ¹² R ^U, unsubstituted lower alkyl O-carboxy, C-amido wherein ^R11 and ^R12 are independently selected from the group consisting of hydrogen , unsubstituted lower alkyl and unsubstituted aryl, and an N-amide wherein R ¹¹ and R ¹² are independently selected from the group consisting of hydrogen, unsubstituted lower alkyl and unsubstituted aryl.

···· ·· ····· ·· ·

Výhodným provedením tohoto vynálezu je, že jeden z R⁸, R⁹ a R¹⁰ je -(alki)Z , zatímco ostatní dva jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, hydroxy skupiny, nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituovaného nižšího alkenylu, nesubstituovaného nižšího alkynylu, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, nižší alkoxy skupiny substituované jedním nebo více halogeny, nesubstituované arylalkoxy skupiny, amino skupiny, NR^UR¹², halogenu, C-karboxy skupiny substituované skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z atomu vodíku nebo nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituované nižší alkyl Okarboxy skupiny, nesubstituovaného nižšího alkylu, C-amidu, nesubstituovaného nižšího alkyl N-amidu, acetylu, nesubstituovaného nižšího alkyl S-sulfonamidu, nesubstituovaného arylu nebo arylu substituovaného skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z halogenu, hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, alkoxy skupiny substituované jedním nebo více halogeny, C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z atomu vodíku nebo nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituované nižší alkyl O-karboxy skupiny, amino skupiny, nesubstituovaného nižšího alkyl S-sulfonamidu a -NR R .A preferred embodiment of the invention is that one of R ⁸ , R ⁹ and R ¹⁰ is - (alki) Z while the other two are independently selected from the group consisting of hydrogen, hydroxy, unsubstituted lower alkyl, unsubstituted lower alkenyl, unsubstituted lower alkynyl, unsubstituted lower alkyl alkoxy, lower alkoxy substituted by one or more halogens, unsubstituted arylalkoxy, amino, NR ^U R ^12, halo, C-carboxy substituted with groups selected from the group consisting of hydrogen or unsubstituted lower alkyl, unsubstituted lower alkyl ocarboxy, unsubstituted lower alkyl, C-amide, unsubstituted lower alkyl N-amide, acetyl, unsubstituted lower alkyl S -sulfonamide, unsubstituted aryl or aryl substituted with a group selected from the group consisting of halogen, hydroxy, unsubstituted lower C1-6alkyl alkoxy, alkoxy groups substituted with one or more halogens, C-carboxy groups substituted with a group selected from the group consisting of hydrogen or unsubstituted lower alkyl, unsubstituted lower alkyl O-carboxy groups, amino groups, unsubstituted lower alkyl S-sulfonamide, and - NR R.

1010

Výhodným provedením tohoto vynálezu je, že R a R jsou vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku a nesubstituovaného nižšího alkylu.A preferred embodiment of the invention is that R and R are selected from the group consisting of hydrogen and unsubstituted lower alkyl.

Je také výhodným provedením tohoto vynálezu, že alkj je nesubstituovaný nižší alkyl.It is also a preferred embodiment of the invention that alkj is unsubstituted lower alkyl.

Další výhodu tohoto vynálezu je, že Z je vybráno ze skupiny sestávající se z hydroxy skupiny, amino skupiny, -NRⁿR¹², kvartérního amonia, C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z atomu vodíku nebo nesubstituovaného nižšího alkyl, C-amidu substituovaného skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z atomu vodíku a nesubstituovaného nižšího alkylu, morfolinu, piperadinylu, tetrazolu a fosfonylu.Another advantage of this invention, Z is selected from the group consisting of hydroxy, amino, -NR ⁿ R ^12, quaternary ammonium, C-carboxy substituted group selected from the group consisting of hydrogen or unsubstituted lower alkyl, C an amide substituted with groups selected from the group consisting of hydrogen and unsubstituted lower alkyl, morpholine, piperadinyl, tetrazole, and phosphonyl.

Další výhodou tohoto vynálezu je, že alki je dvou až čtyř uhlíkatý nesubstituovaný nižší alkyl a Z je karboxylová kyselina.Another advantage of the present invention is that alki is two to four carbon unsubstituted lower alkyl and Z is a carboxylic acid.

Výhodou tohoto vynálezu je, že R⁹ je alk]Z.An advantage of the present invention is that R ⁹ is alk 12.

19·19 ·

Obdobně je výhodou tohoto vynálezu, že R a R jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu, hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny, nesubstituovaného nižšího alkylkarbonylu, nesubstituované nižší alkyl O-karboxy skupiny a acetylu.Similarly, it is an advantage of the present invention that R and R are independently selected from the group consisting of hydrogen, unsubstituted lower alkyl, hydroxy, unsubstituted lower alkyl alkoxy, unsubstituted lower alkylcarbonyl, unsubstituted lower alkyl O-carboxy, and acetyl.

Další výhodným provedením tohoto vynálezu je, že R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ a R⁷ jsou atom vodíku, R⁸ a R¹⁰ jsou methyl a R⁹ je CH₂CH₂C(=O)OH.Another preferred embodiment of the invention is that R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ and R ⁷ are hydrogen, R ⁸ and R ¹⁰ are methyl and R ⁹ is CH ₂ CH ₂ C (= O) OH.

Také výhodným provedením tohoto vynálezu je, že R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ a R⁸ jsou atom vodíku, R¹⁰ je methyl a R⁹ je CH₂CH₂C(=O)OH.Also a preferred embodiment of the invention is that R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ , R ⁷ and R ⁸ are hydrogen, R ¹⁰ is methyl and R ⁹ is CH ₂ CH ₂ C (= O) OH.

Stejně tak je výhodným provedením tohoto vynálezu, že R je vybrán ze skupiny sestávající se z ;Likewise, a preferred embodiment of the present invention is that R is selected from the group consisting of;

atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a nižšího alkylu substituovaného skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného cykloalkylu, nesubstituovaného arylu a arylu substituovaného skupinou vybranou z hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny a halogenu.hydrogen, unsubstituted lower alkyl and lower alkyl substituted by a group selected from the group consisting of unsubstituted cycloalkyl, unsubstituted aryl and aryl substituted with a group selected from hydroxy, unsubstituted lower alkyl alkoxy and halogen.

Dále je také výhodným provedením tohoto vynálezu, že Z je vybráno ze skupiny sestávající se z -C(=O)NR¹³R¹⁴, kde R¹³ a R¹⁴ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z amino skupiny a RⁿR¹², nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z halogenu, hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny a trihalogenmethylu, nesubstituovaného heteroarylu, nesubstituovaného heteroalicyklu, a kombinovaných pěti-členných nebo šesti-členných nesubstituovaných heteroalicyklů, -NR^HR¹², kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného • ·It is also a preferred embodiment of the present invention that Z is selected from the group consisting of -C (= O) NR ¹³ R ¹⁴ , wherein R ¹³ and R ¹⁴ are independently selected from the group consisting of hydrogen, unsubstituted lower alkyl, lower alkyl substituted with a group selected from the group consisting of amino groups, and R ⁿ R ^12, unsubstituted aryl, aryl substituted with one or more groups selected from the group consisting of halogen, hydroxy, unsubstituted lower alkyl alkoxy and trihalomethyl, unsubstituted heteroaryl, unsubstituted heteroalicyclic, and combined five-membered or six-membered unsubstituted heteroalicyclic, -NR ^H R ¹² , wherein R ¹¹ and R ¹² are independently selected from the group consisting of unsubstituted;

··· nižšího alkylu a kombinovaných pěti-členných nebo šesti-členných ne substituovaných heteroalicyklů.Lower alkyl and combined five-membered or six-membered unsubstituted heteroalicyclics.

Preferovaným a výhodným provedením tohoto vynálezu je, že R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného cykloalkylu, nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z halogenu a nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny a nesubstituovaného nižšího alkylkarboxyalkylu, a Z je vybráno ze skupiny sestávající se z nesubstituované C-karboxy skupiny a nesubstituované nižší alkyl Ckarboxy skupiny.A preferred and preferred embodiment of the invention is that R ⁷ is selected from the group consisting of unsubstituted lower alkyl, lower alkyl substituted with one or more groups selected from the group consisting of unsubstituted cycloalkyl, unsubstituted aryl, aryl substituted with one or more groups independently selected from a group consisting of halogen and an unsubstituted lower alkylcarboxy group and an unsubstituted lower alkylcarboxyalkyl group, and Z is selected from the group consisting of an unsubstituted C-carboxy group and an unsubstituted lower alkyl Ccarboxy group.

A konečně, výhodným provedením tohoto vynálezu je také, že R , R⁴, R⁵, a R⁶ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, halogenu, nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jednou nebo více hydroxy skupinami, nesubstituované nižší alkoxy skupiny, nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného jednou nebo více nesubstituovanými nižšími alkoxy skupinami a S(O)2NR' 'r'², R⁵ je atom vodíku, R⁶ je -NR^UR¹², R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a kombinovaných pěti-členných nebo šesti-členných nesubstituovaných heteroalicyklů.Finally, a preferred embodiment of the invention is also that R, R ⁴ , R ⁵ , and R ⁶ are independently selected from the group consisting of hydrogen, halogen, unsubstituted lower alkyl, lower alkyl substituted with one or more hydroxy groups, unsubstituted lower alkoxy, unsubstituted aryl, aryl substituted with one or more unsubstituted lower alkoxy groups, and S (O) 2 NR 'R ^2, R ⁵ is hydrogen, R ⁶ is -NR ¹² R ^U, R ¹¹ and R ¹² are independently selected selected from the group consisting of hydrogen, unsubstituted lower alkyl, and combined five-membered or six-membered unsubstituted heteroalicyclic.

Chemický vzorec zde popsaný může vykazovat jev tautomerie a strukturální izomerie. Například, sloučeniny zde popsané mohou mít E nebo Z konfiguraci, spojenou s dvojnou vazbou spojující 2indolinonovou část s pyrrolovou částí nebo to může být směs E a Z. Tento vynález zahrnuje všechny tautomerní nebo strukturální izomery a jejich směsi, které mají schopnost modulovat aktivitu RTK, CTK a/nebo STK, a neomezuje se na žádný z tautomerních a strukturálních izomerů.The chemical formula described herein may exhibit the phenomenon of tautomerism and structural isomerism. For example, the compounds described herein may have an E or Z configuration, linked to a double bond linking the 2-indolinone moiety to the pyrrole moiety, or may be a mixture of E and Z. This invention encompasses all tautomeric or structural isomers and mixtures thereof that have the ability to modulate RTK activity. CTK and / or STK, and is not limited to any of the tautomeric and structural isomers.

·♦· ·· ♦ · ·

2. Syntézní/Kombinatorické knihovny2. Synthesis / Combinatorial libraries

Dalším aspektem tohoto vynálezu je kombinatorická knihovna nejméně deseti sloučenin 3-pyrrolidinyl-2-indolinonů, které mohou vzniknout reakcí oxindolů struktury 2 s aldehydy struktury 3.Another aspect of the invention is a combinatorial library of at least ten compounds of 3-pyrrolidinyl-2-indolinones that can be formed by reacting oxindoles of structure 2 with aldehydes of structure 3.

kde R¹- R¹⁰ mají výše uvedený význam.wherein R ¹ -R ¹⁰ are as defined above.

Jak bylo použito, termín kombinatorická knihovna se vztahuje na všechny sloučeniny vzniklé reakcí každé sloučeniny jedné dimenze se sloučeninou z každé z dalších dimenzí v multi-dimenzionální skupině sloučenin. V kontextu tohoto vynálezu je skupina dvou dimenzionální a jednu dimenzi representují všechny oxindoly podle vynálezu a druhou dimenzi representují všechny aldehydy podle vynálezu. Každý oxindol může reagovat s každým a všemi aldehydy, a vytvořit tak sloučeninu 3pyrrolidinyl-2-indolinon. Všechny sloučeniny 3-pyrrolidinyl-2indolinonu vzniklé touto cestou jsou předmětem tohoto vynálezu. Předmětem tohoto vynálezu jsou také menší kombinatorické knihovny vzniklé reakcí některých oxindolů se všemi aldehydy, všech oxindolů s některými aldehydy, nebo některých oxindolů s některými aldehydy.As used herein, the term combinatorial library refers to all compounds resulting from the reaction of each compound of one dimension with a compound of each of the other dimensions in a multi-dimensional group of compounds. In the context of this invention, the group is two dimensional and one dimension represents all oxindoles of the invention and the other dimension represents all aldehydes of the invention. Each oxindole can be reacted with each and all aldehydes to form the compound 3-pyrrolidinyl-2-indolinone. All 3-pyrrolidinyl-2-indolinone compounds formed by this route are the subject of this invention. The present invention also provides smaller combinatorial libraries resulting from the reaction of some oxindoles with all aldehydes, all oxindoles with some aldehydes, or some oxindoles with some aldehydes.

Oxindol z výše uvedené kombinatorické knihovny je vybrán ze skupiny sestávající se z oxindolů a substituovaných oxindolů jako jsou, kromě jiných, 6-bromoxindol, 5-hydroxyoxindol, 5-methoxyoxindol, 6methoxyoxindol, 5-fenylaminosulfonyloxindol, 4-[2-(2izopropylfenoxy)-ethyl]oxindol, 4-[2-(3-izopropylfenoxy)ethyl]oxindol, 4-[2-(4-izopropylfenoxy)ethyl]oxindol, 5-fluoroxindol, 6-fluoroxindol, 7-fluoroxindol, 6-trifluormethyloxindol, 5-chloroxindol, 6φ φ φ φ φ φ φ φ φ φThe oxindole from the above combinatorial library is selected from the group consisting of oxindoles and substituted oxindoles such as, but not limited to, 6-bromoxindole, 5-hydroxyoxindole, 5-methoxyoxindole, 6methoxyoxindole, 5-phenylaminosulfonyloxindole, 4- [2- (2-isopropylphenoxy) - ethyl] oxindole, 4- [2- (3-isopropylphenoxy) ethyl] oxindole, 4- [2- (4-isopropylphenoxy) ethyl] oxindole, 5-fluorooxindole, 6-fluorooxindole, 7-fluorooxindole, 6-trifluoromethyloxindole, 5- chloroxindole, 6 φ φ φ φ φ φ φ φ φ

ΦΦΦΦ φφφ chloroxindol, indol-4-karboxylová kyselina, 5-bromoxindol, 6-(Νacetamido)-oxindol, 4-methyloxindol, 5-methyloxindol, 4-methyl-5chloroxindol, 5-ethyloxindol, 6-hydroxyoxindol, 5-acetyloxindol, oxindol-5-karboxylová kyselina, 5-methoxyoxindol, 6-methoxyoxindol, 5-aminooxindol, 6-aminooxindol, 4-(2-N-morfolinethyl)oxindol, 7azaoxindol, t-butylester oxindol-4-karbamové kyseliny, t-butylester oxindol-6-karbamové kyseliny, 4-(2-karboxyethyl)oxindol, 4-nbutyloxindol, 4,5-dimethoxyoxindol, 6-(methansulfonamido)oxindol, 6(benzamido)oxindol, 5-ethoxyoxindol, 6-fenyloxindol, 6-(2methoxyfen-1 -yl)oxindol, 6-(3-methoxyfen-1 -yl)oxindol, 6-(4methoxyfen-1-yl)oxindol, 5-aminosulfonyloxindol, 5izopropylaminosulfonylox indol, di methy lamino sul fonylox indol, 5-(Nmorfolinsulfonyl)oxindol a 4-(2-hydroxyethyl)oxindol.Chloroxindole, indole-4-carboxylic acid, 5-bromoxindole, 6- (acetamido) -oxindole, 4-methyloxindole, 5-methyloxindole, 4-methyl-5-chloroxindole, 5-ethyloxindole, 6-hydroxyoxindole, 5-acetyloxindole, oxindole 5-carboxylic acid, 5-methoxyoxindole, 6-methoxyoxindole, 5-aminooxindole, 6-aminooxindole, 4- (2-N-morpholinethyl) oxindole, 7azaoxindole, oxindole-4-carbamic acid t-butyl ester, oxindole t-butyl ester 6-carbamic acids, 4- (2-carboxyethyl) oxindole, 4-n-butyloxindole, 4,5-dimethoxyoxindole, 6- (methanesulfonamido) oxindole, 6 (benzamido) oxindole, 5-ethoxyoxindole, 6-phenyloxindole, 6- (2-methoxyphenyl- 1-yl) oxindole, 6- (3-methoxyphen-1-yl) oxindole, 6- (4-methoxyphen-1-yl) oxindole, 5-aminosulfonyloxindole, 5-isopropylaminosulfonylox indole, di-methylamino-sulfonylox indole, 5- (N-morpholinesulfonyl) oxindole and 4- (2-hydroxyethyl) oxindole.

Aldehyd z výše uvedené kombinatorické knihovny je vybrán ze skupiny sestávající se z, kromě jiného, 3-(5-formyl-2,4-dimethyl-lHpyrrol-3-yl)propionové kyseliny, 3-(5-formyl-4-methyl -1 H-pyrrol-3-yl) propionové kyseliny, 3-(l -benzyl-5-formyl-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3yl)propionové kyseliny, 3-(5-formyl -1 -methoxy-karbony lmethy 1-2,4dimethyl-ΊΗ- pyrrol-3-yl)propionové kyseliny, 3-(5-formyl-1,2,4trimethyl-ΙΗ- pyrrol-3-yl)propionové kyseliny, methyl esteru 3-[5formy 1-1-(3-methoxy-benzyl)-2,4-di methyl-1 H-pyrrol-3-yl]propionové kyseliny, methyl esteru 3-( 1 -cyklohexylmethyl-5-formyl-2,4-dimethyl1 H-pyrrol-3-yl)propionové kyseliny, methyl esteru 3-[ 1-(2,2-dimethylpropyl)-5-formy 1-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3-yl]propionové kyseliny,The aldehyde from the above combinatorial library is selected from the group consisting of, inter alia, 3- (5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl) propionic acid, 3- (5-formyl-4-methyl- 1H-pyrrol-3-yl) propionic acid, 3- (1-benzyl-5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3yl) propionic acid, 3- (5-formyl-1-methoxy- Methyl 1-2,4-dimethyl-ΊΗ-pyrrol-3-yl) propionic acid carbonyl, 3- (5-formyl-1,2,4-trimethyl-ΙΗ-pyrrol-3-yl) propionic acid, 3- [5-formyl 1-methyl ester -1- (3-methoxy-benzyl) -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] propionic acid, 3- (1-cyclohexylmethyl-5-formyl-2,4-dimethyl) -1H- methyl ester pyrrol-3-yl) propionic acid, 3- [1- (2,2-dimethylpropyl) -5-form of 1-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] propionic acid methyl ester,

1,3,5-trimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-3-oxo-propyl)- lH-pyrrol-2karb aldehydu, 3-(5-formyl -1,2,4-trimethyl -1 H-pyrrol-3-yl)-N-(2morfolin-4-yl-ethyl)propionamidu, 3-(5-formyl -1,2,4-trimethyl -1Hpyrrol-3-yl)-N-fenylpropionamidu, 1,3,5-trimethyl-4-(3-oxo-3piperidin-1 -y 1 -propyl) -1H-pyrrol-2- karbaldehydu, 1,3,5-trimethyl-4-(3oxo-3-pyrrolidin-1 - yl-propyl)-1 H-pyrrol-2-karbaldehydu, 3-(5-formy 11,2,4- trimethyl-1 H-pyrrol-3-yl)-N-(4-methoxy-fenyl)propionamidu, 3(5-formyl -1,2,4-trimethyl - lH-pyrrol-3-yl)-N-(4methoxyfenyl)propionamidu, N-(4-fluor-fenyl)-3-(5-formyl -1,2,424 • ·· · tri methyl -1 H-pyrrol-3-yl)propionamidu, 3-(5-formyl -1,2,4-tr im ethyl1 H-pyrrol-3-yl)-N-(4-trifluormethyl-fenyl)propionamidu, 3-[5-formyl1 -(3-methoxy-benzyl)-2,4-dimethyl- ÍH-pyrrol-3-yl]propionové kyseliny, 3-(l -cyklohexylmethy 1-5-formy 1-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3 yl)propionové kyseliny, methyl esteru 3-[ 1-(3-fluor-benzyl)-5-formyl2,4-dimethyl-1 H-pyrrol-3-yl]propionové kyseliny, 3-(l-benzyl-5formyl-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-yl)propionové kyseliny, methyl esteru 3-[ 1 - (4- fluorbenzyl)-5-formy 1-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-yljpropionové kyseliny, 3-[l -(4-fluor-benzyl)-5-formy 1-2,4-dimethy 1-1 H-pyrrol-3 yl]propionové kyseliny, 3-[l -(3-fluorbenzy 1)-5-formy 1-2,4-dimethyl1 H-pyrrol-3-yl]propionové kyseliny, 3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl) -1H-py r rol-2-karb aldehydu, 4-(3 -dimethyl amino-p ropy 1)-3,5 dimethyl -1H- pyrrol-2-karbaldehydu, 5-formy 1-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol3-karboxylové kyseliny, 3,5-dimethyl-4-(4-methyl-piperazin-lkarbonyl) -1 H-pyrrol-2-karbaldehydu, (2-dimethylaminoethyl)amidu 5formyl-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny.1,3,5-trimethyl-4- (3-morpholin-4-yl-3-oxo-propyl) -1H-pyrrole-2-carbonyl aldehyde, 3- (5-formyl-1,2,4-trimethyl-1H) -pyrrol-3-yl) -N- (2-morpholin-4-yl-ethyl) -propionamide, 3- (5-formyl-1,2,4-trimethyl-1H-pyrrol-3-yl) -N-phenyl-propionamide, 1,3 , 5-trimethyl-4- (3-oxo-3-piperidin-1-yl-propyl) -1H-pyrrole-2-carbaldehyde, 1,3,5-trimethyl-4- (3-oxo-3-pyrrolidin-1-yl) -propyl) -1H-pyrrole-2-carbaldehyde, 3- (5-forms 11,2,4-trimethyl-1H-pyrrol-3-yl) -N- (4-methoxyphenyl) propionamide, 3 ( 5-formyl-1,2,4-trimethyl-1H-pyrrol-3-yl) -N- (4-methoxyphenyl) propionamide, N- (4-fluorophenyl) -3- (5-formyl-1,2,424) 3-methyl-1H-pyrrol-3-yl) propionamide, 3- (5-formyl-1,2,4-trimethyl-1H-pyrrol-3-yl) -N- (4-trifluoromethyl-phenyl) 3- [5-formyl-1- (3-methoxy-benzyl) -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid, propionamide, 3- (1-cyclohexylmethyl-1-5-form 1-2,4) -dimethyl-1H-pyrrol-3-yl) propionic acid, 3- [1- (3-fluoro-benzyl) -5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid methyl ester, 3 - (1-Benzyl) 5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl) propionic acid 3- [1- (4-fluorobenzyl) -5-form of 1-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3- yl] propionic acid, 3- [1- (4-fluorobenzyl) -5-forms of 2,4,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] propionic acid, 3- [1- (3-fluorobenzyl)] 5-Forms of 1-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] propionic acid, 3,5-dimethyl-4- (3-morpholin-4-ylpropyl) -1H-pyrrole-2-carb aldehyde 4- (3-dimethylamino-petroleum) -3,5-dimethyl-1H-pyrrole-2-carbaldehyde, 5-forms of 1-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxylic acid, 3,5- 5-Methyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxylic acid dimethyl-4- (4-methyl-piperazine-1-carbonyl) -1H-pyrrole-2-carbaldehyde, 2-dimethylamino-ethyl) -amide.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je, že poskytuje metodu syntézyAnother aspect of the invention is that it provides a method of synthesis

3- pyrrolidinyl-2-indolinonu vzorce 1 zahrnující reakci oxindolu vzorce s aldehydem vzorce 3 v rozpouštědle, nejlépe za přítomnosti báze.3-pyrrolidinyl-2-indolinone of formula 1 comprising reacting oxindole of formula with aldehyde of formula 3 in a solvent, preferably in the presence of a base.

Příklady oxindolů vzorce 2, které mohou reagovat s aldehydy vzorce 3 za vzniku 3-pyrrolidinyl-2-indolinonů vzorce 1, jsou oxindoly a substituované oxindoly jako jsou, kromě jiných, 6-bromoxindol, 5hydroxyoxindol, 5-methoxyoxindol, 6-methoxyoxindol, 5fenylaminosulfonyloxindol, 4-[2-(2-izopropylfenoxy)- ethyljoxindol, 4[2-(3-izopropylfenoxy)ethyl]oxindol, 4-[2-(4izopropylfenoxy)ethyl]oxindol, 5-fluoroxindol, 6-fluoroxindol, 7fluoroxindol, 6-trifluormethyloxindol, 5-chloroxindol, 6-chloroxindol, indol-4-karboxylová kyselina, 5-bromoxindol, 6-(N-acetamido)-oxindol,Examples of oxindoles of formula 2 that can be reacted with aldehydes of formula 3 to give 3-pyrrolidinyl-2-indolinones of formula 1 are oxindoles and substituted oxindoles such as, but not limited to, 6-bromoxindole, 5-hydroxyoxindole, 5-methoxyoxindole, 6-methoxyoxindole, 5-phenylaminosulfonyloxindole 4- [2- (2-isopropylphenoxy) ethyl] oxindole, 4- [2- (3-isopropylphenoxy) ethyl] oxindole, 4- [2- (4-isopropylphenoxy) ethyl] oxindole, 5-fluorooxindole, 6-fluorooxindole, 7-fluoroxindole, 6 -trifluoromethyloxindole, 5-chlorooxindole, 6-chlorooxindole, indole-4-carboxylic acid, 5-bromooxindole, 6- (N-acetamido) -oxindole,

4- methyloxindol, 5-methyloxindol, 4-methyl-5-chlorox:indol, 5ethyloxindol, 6-hydroxyoxindol, 5-acetyloxindol, oxindol-5karboxylová kyselina, 5-methoxyoxindol, 6-methoxyoxindol, 5aminooxindol, 6-aminooxindol, 4-(2-N-morfolinoethyl)oxindol, Ίazaoxindol, t-butylester oxindol-4-karbamové kyseliny, t-butylester4-methyloxindole, 5-methyloxindole, 4-methyl-5-chlorox: indole, 5ethyloxindole, 6-hydroxyoxindole, 5-acetyloxindole, oxindole-5-carboxylic acid, 5-methoxyoxindole, 6-methoxyoxindole, 5-aminooxindole, 6-aminooxindole, 4- ( 2-N-morpholinoethyl) oxindole, oxazoxindole, oxindole-4-carbamic acid t-butyl ester, t-butyl ester

oxindol-6-karbamové kyseliny, 4-(2-karboxyethyl)oxindol, 4-nbutyloxindol, 4,5-dimethoxyoxindol, 6-(methansulfonamido)oxindol, 6(benzamido)oxindol, 5-ethoxyoxindol, 6-fenyloxindol, 6-(2methoxyfen-1-yl)oxindol, 6-(3-methoxyfen-1 -yl)oxindol, 6-(4methoxyfen-l-yl)oxindol, 5-aminosulfonyloxindol, 5izopropylaminosulfonyloxindol, dimethylaminosulfonylox indol, 5-(Nmorfolinosulfonyl)oxindol a 4-(2-hydroxyethyl)oxindol.oxindole-6-carbamic acids, 4- (2-carboxyethyl) oxindole, 4-n-butyloxindole, 4,5-dimethoxyoxindole, 6- (methanesulfonamido) oxindole, 6 (benzamido) oxindole, 5-ethoxyoxindole, 6-phenyloxindole, 6- ( 2-methoxyphen-1-yl) oxindole, 6- (3-methoxyphen-1-yl) oxindole, 6- (4-methoxyphen-1-yl) oxindole, 5-aminosulfonyloxindole, 5-isopropylaminosulfonyloxindole, dimethylaminosulfonyloxindole, 5- (N-morpholinosulfonyl) oxindole and 4- (2-hydroxyethyl) oxindole.

Příklady aldehydů struktury 3, které mohou reagovat s oxindoly struktury 2 jsou, kromě jiných, 3-(5- formyl-2,4-dimethyl-ÍH-pyrrol-3yl)propionová kyselina, 3-(5-formyl-4-methyl-lH-pyrrol-3yl)propionová kyselina, 3-(l-benzyl-5-formyl-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol3-yl)propionová kyselina, 3-(5- formyl-l-methoxykarbonylmethyl-2,4dimethyl-1 H-pyrrol-3-yl)propionová kyselina, 3-(5-formyl-1,2,4trimethyl-1 H-pyrrol-3-yl)propionová kyselina, methyl ester 3-[5formyl-l-(3-methoxy-benzyl)-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3-yl]propionové kyseliny, methyl ester 3-( 1 -cyklohexylmethyl-5-formyl-2,4-dimethyl1 H-pyrrol-3-yl)propionové kyseliny, methyl ester 3-[l-(2, 2-dimethylpropyl)-5- formy 1-2,4-dimethyl-1 H-pyrrol-3-yl]propionové kyseliny, 1,3,5-trimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-3-oxo-propyl) -1 H-pyrrol-2karb aldehyd, 3-(5-formy 1-1,2,4-trimethyl-1 H-pyrrol-3-yl)-N-(2morfolin-4-yl-ethyl)propionamid, 3-(5-formyl -1,2,4-trimethyl-1Hpyrrol-3-yl)-N-fenylpropionamid, 1,3,5-trimethyl-4-(3-oxo-3-piperidin1 -yl-propyl) -1 H-pyrrol-2-karbaldehyd, 1,3,5-tri methy 1-4-(3-oxo-3pyrrolidin -1 -ylpropyl)-1 H-pyrrol-2-karbaldehyd, 3-(5-formy 1-1,2,4trimethyl-1 H-pyrrol-3-yl)-N-(4-methoxy-fenyl)propionamid, 3-(5formyl -1,2,4-trimethyl -1 H-pyrrol-3-yl)-N-(4-methoxyfenyl)propionamid, N-(4-fluor-fenyl)-3-(5-formyl-1,2,4-trimethyl-1Hpyrrol-3-yl)propionamid, 3-(5-formy 1-1,2,4-trimethyl-1 H-pyrrol-3-yl)N-(4-trifluormethyl-fenyl)propionamid, 3-[5-formy 1-1 - (3-methoxybenzyl)-2,4-dimethyl-1 H-pyrrol-3-yl]propionová kyselina, 3-(lcyklohexy 1 methy 1-5 -formy 1-2,4-dimethyl - lH-pyrrol-3-yl)propionová kyselina, methyl ester 3-[l-(3-fluor-benzyl)-5-formyl-2,4-dimethyl-lHpyrrol-3-yl]propionové kyseliny, 3-(l -benzy 1-5-formy 1-2,4-di methyl0 · ··Examples of aldehydes of structure 3 that can react with oxindoles of structure 2 are, inter alia, 3- (5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3yl) propionic acid, 3- (5-formyl-4-methyl- 1H-pyrrol-3-yl) propionic acid, 3- (1-benzyl-5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl) propionic acid, 3- (5-formyl-1-methoxycarbonylmethyl-2,4-dimethyl) -1H-pyrrol-3-yl) propionic acid, 3- (5-formyl-1,2,4-trimethyl-1H-pyrrol-3-yl) propionic acid, 3- [5-formyl-1- (3- methoxy-benzyl) -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] propionic acid 3- (1-cyclohexylmethyl-5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl) propionic acid methyl ester acid, 3- [1- (2,2-dimethylpropyl) -5-form of 1-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] propionic acid methyl ester, 1,3,5-trimethyl-4- (3-Morpholin-4-yl-3-oxo-propyl) -1H-pyrrole-2-carbonyl aldehyde, 3- (5-Forms 1-1,2,4-trimethyl-1H-pyrrol-3-yl) - N- (2-morpholin-4-yl-ethyl) -propionamide, 3- (5-formyl-1,2,4-trimethyl-1H-pyrrol-3-yl) -N-phenyl-propionamide, 1,3,5-trimethyl-4- ( 3-oxo-3-piperidine -yl-propyl) -1H-pyrrole-2-carbaldehyde, 1,3,5-trimethyl-4- (3-oxo-3-pyrrolidin-1-ylpropyl) -1H-pyrrole-2-carbaldehyde, 3- (5-Forms 1-1,2,4-trimethyl-1H-pyrrol-3-yl) -N- (4-methoxy-phenyl) -propionamide, 3- (5-formyl-1,2,4-trimethyl-1H-pyrrole) 3-yl) -N- (4-methoxyphenyl) propionamide, N- (4-fluorophenyl) -3- (5-formyl-1,2,4-trimethyl-1H-pyrrol-3-yl) propionamide, 3- (5-Forms 1-1,2,4-trimethyl-1H-pyrrol-3-yl) N- (4-trifluoromethyl-phenyl) propionamide, 3- [5-Forms 1-1- (3-methoxybenzyl) - 2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] propionic acid, 3- (1-cyclohexylmethyl-5-form 1-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl) propionic acid, methyl ester 3- [1- (3-Fluoro-benzyl) -5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid, 3- (1-benzyl-1-5-form of 1-2,4-di) methyl0 · ··

0 • 00 0 · lH-pyrrol-3-yl)propionová kyselina, methyl ester 3-(1-(4- fluorbenzyl)5-formyl-2,4-dimethyl - lH-pyrrol-3-yl]propionové kyseliny, 3-[l-(4fluor-benzyl)-5-formyl-2,4-dimethyl- lH-pyrrol-3-yl]propionová kyselina, 3-[ 1 -(3-fluorbenzyl)-5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3yljpropi onová kyselina, 3,5 -dimethy 1-4-(3-morfolin-4-yl-propyl) -1 řípy rr o 1-2-karbaldehyd, 4-(3-dimethy lamino-propy 1)-3,5-dimethy 1- 1Hpyrrol-2-karbaldehyd, 5 -formy 1-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3-karboxylová kyselina, 3,5-dimethyl-4-(4-methyl-piperazin-1 -karbonyl) -1 H-pyrrol-2karbaldehyd, (2-dimethylaminoethyl)amid 5-formyl-2,4-dimethyl- 1Hpyrrol-3-karboxylové kyseliny.0 • 00 0 · 1H-pyrrol-3-yl) propionic acid, 3- (1- (4-fluorobenzyl) 5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] propionic acid methyl ester, 3 - [1- (4-Fluoro-benzyl) -5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] propionic acid, 3- [1- (3-fluorobenzyl) -5-formyl-2,4- dimethyl-1H-pyrrol-3-yl-propionic acid, 3,5-dimethyl-4- (3-morpholin-4-yl-propyl) -1-piperazin-2-carbaldehyde, 4- (3-dimethylaminopropyl) 1) -3,5-dimethyl-1 H -pyrrole-2-carbaldehyde, 5-form 1-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxylic acid, 3,5-dimethyl-4- (4-methyl- piperazine-1-carbonyl) -1H-pyrrole-2-carbaldehyde, 5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxylic acid (2-dimethylamino-ethyl) -amide.

Reakce může probíhat za přítomnosti báze. Báze může být organická nebo anorganická. Použije-li se organická báze, preferuje se báze dusíkatá. Příklady organických dusíkatých bází jsou, kromě jiných, diizopropylamin, trimethylamin, triethylamin, anilin, pyridin, 1,8-diazabicyklo-[5,4,1 ]-undeka-7-en, pyrrolidin a piperidin.The reaction may be carried out in the presence of a base. The base may be organic or inorganic. If an organic base is used, a nitrogen base is preferred. Examples of organic nitrogen bases are, inter alia, diisopropylamine, trimethylamine, triethylamine, aniline, pyridine, 1,8-diazabicyclo [5.4.1] undeca-7-ene, pyrrolidine and piperidine.

Příklady anorganických bází jsou, kromě jiného, amonium, hydroxidy alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, fosfáty, uhličitany, hydrogenuhličitany, hydrogensírany a amidy. Alkalické kovy jsou, lithium, sodík a draslík, zatímco kovy alkalických zemin jsou vápník, hořčík a barium.Examples of inorganic bases are, inter alia, ammonium, alkali or alkaline earth metal hydroxides, phosphates, carbonates, bicarbonates, hydrogen sulfates and amides. Alkali metals are lithium, sodium and potassium, while alkaline earth metals are calcium, magnesium and barium.

Výhodným provedením tohoto vynálezu je, když rozpouštědlo je protické rozpouštědlo, jako je voda nebo alkohol, báze je alkalického kovu nebo kovů alkalických zemin, preferován je hydroxid alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin.A preferred embodiment of the invention is when the solvent is a protic solvent such as water or an alcohol, the base is an alkali metal or alkaline earth metal, preferably an alkali metal or alkaline earth metal hydroxide.

Pracovníkům v oboru bude zřejmé, na základě obecně známých principů organické syntézy a na základě informací zde uvedených, kterou bázy je třeba použít pro průběh reakce.It will be apparent to those skilled in the art based on the generally known principles of organic synthesis and the information provided herein which bases to use for the reaction.

Rozpouštědlo, ve kterém se reakce uskuteční, může být protické nebo aprotické rozpouštědlo, preferuje se rozpouštědlo protické.The solvent in which the reaction is carried out may be a protic or aprotic solvent, preferably a protic solvent.

Termín protické rozpouštědlo je rozpouštědlo, které má atomy vodíku kovalentně vázané ke kyslíku nebo atomům dusíku, které činí atom vodíku kyselým a tím pádem možným býti sdílen s rozpouštěnouThe term protic solvent is a solvent having hydrogen atoms covalently bonded to oxygen or nitrogen atoms, which makes the hydrogen atom acidic and thus can be shared with the dissolved solvent.

Φ φφ · látkou ve vodíkové vazbě. Příkladem protických rozpouštědel jsou , kromě jiných, voda a alkohol.Ve φφ · a substance in a hydrogen bond. Examples of protic solvents are, inter alia, water and alcohol.

Termín aprotické rozpouštědlo může být polární nebo nepolární, ale v každém případě neobsahuje kyselý vodík, a tak není schopno tvořit s rozpouštěnou látkou vodíkovou vazbu. Příklady, kromě jiných, nepolárních aprotických rozpouštědel, jsou pentan, hexan, benzen, toluen, methylenchlorid a tetrachlormethan.The term aprotic solvent may be polar or non-polar, but in any case does not contain acidic hydrogen and thus is unable to form a hydrogen bond with the solute. Examples, among others, of apolar aprotic solvents are pentane, hexane, benzene, toluene, methylene chloride and carbon tetrachloride.

Příklady polárních aprotických rozpouštědel jsou chloroform, tetrahydrofuran, dimethylsulfoxid a dimethylformamid.Examples of polar aprotic solvents are chloroform, tetrahydrofuran, dimethylsulfoxide and dimethylformamide.

Výhodným provedením tohoto vynálezu je, že rozpouštědlo je protické rozpouštědlo, preferuje se voda nebo alkohol, jako je ethanol.A preferred embodiment of the invention is that the solvent is a protic solvent, preferably water or an alcohol such as ethanol.

Reakce probíhá při teplotě větší než je pokojová teplota. Teplota se obecně pohybuje okolo 30°C až okolo 150°C, přesněji okolo 80°C až okolo 100°C, ještě přesněji okolo 75°C až okolo 85°C, což je zhruba bod varu ethanolu. Termínem okolo se rozumí, že teplotní rozsah je přednostně v rozmezí 10 stupňů Celsia uvedené teploty, přednostněji v rozmezí 5 stupňů Celsia uvedené teploty a nejpřednostněji je to v rozmezí 2 stupňů Celsia uvedené teploty. Takže, například, termínem okolo 75°C se rozumí 75°C ± 10°C, přednostněji 75°C ± 5°C a nejpřednostněji 75°C ± 2°C.The reaction proceeds at a temperature greater than room temperature. The temperature is generally about 30 ° C to about 150 ° C, more specifically about 80 ° C to about 100 ° C, even more specifically about 75 ° C to about 85 ° C, which is about the boiling point of ethanol. By about is meant that the temperature range is preferably within 10 degrees Celsius of said temperature, more preferably within 5 degrees Celsius of said temperature, and most preferably within 2 degrees Celsius of said temperature. Thus, for example, the term about 75 ° C means 75 ° C ± 10 ° C, more preferably 75 ° C ± 5 ° C, and most preferably 75 ° C ± 2 ° C.

3. Biochemie/Farmakoterapie3. Biochemistry / Pharmacotherapy

Další aspekt tohoto vynálezu se vztahuje k metodě modulace PK katalytické aktivity kontaktováním PK se sloučeninou tohoto vynálezu nebo fyziologicky akceptovatelnou solí nebo proléčivem.Another aspect of the invention relates to a method of modulating PK catalytic activity by contacting PK with a compound of the invention or a physiologically acceptable salt or prodrug.

Jak zde bylo použito, termín PK se týká receptorových proteintyrozinkináz (RTK), nereceptorových nebo buněčných tyrozinkináz (CTK) a serin-threoninkináz (STK).As used herein, the term PK refers to receptor protein tyrosine kinases (RTKs), non-receptor or cellular tyrosine kinases (CTKs), and serine-threonine kinases (STKs).

Termín metoda se vztahuje na způsoby, prostředky, techniky a postupy pro splnění daného problému, ale neomezuje se pouze na tyto způsoby, prostředky, techniky a postupy, buď známé nebo snadno odvoditelné způsoby, prostředky, techniky a postupy známé odborníkům • · • φ · v 4 4 9 4 4 věd chemických, farmaceutických, biologických, biochemických a medicínských.The term method refers to methods, means, techniques, and procedures to address a given problem, but is not limited to these methods, means, techniques, and procedures, either known or readily derivable methods, means, techniques, and procedures known to those skilled in the art. chemical, pharmaceutical, biological, biochemical and medical sciences.

Jak zde bylo použito, termín modulace nebo modulování se týká změny katalytické aktivity RTK, CTK a STK. Přesněji, modulace se vztahuje na aktivaci, katalytické aktivity RTK, CTK a STK, přednostně aktivace nebo inhibice katalytické aktivity RTK, CTK a STK, závisející na koncentraci sloučeniny nebo soli, kterým jsou RTK, STK, CTK vystaveny, ještě přednostněji inhibice katalytické aktivity RTK, CTK, STK.As used herein, the term modulation or modulation refers to a change in the catalytic activity of RTKs, CTKs, and STKs. More specifically, modulation refers to the activation, catalytic activity of RTKs, CTKs, and STKs, preferably activation or inhibition of the catalytic activity of RTKs, CTKs, and STKs, depending on the concentration of the compound or salt to which RTKs, STKs, CTKs are exposed. , CTK, MOT.

Termín katalytická aktivita, jak zde bylo použito, se týká poměru fosforylace tyrosinu pod vlivem, přímo nebo nepřímo, RTK a/nebo CTK nebo fosforylace šeřinu a threoninu pod vlivem, přímo nebo nepřímo, STK.The term catalytic activity, as used herein, refers to the ratio of phosphorylation of tyrosine under the influence, directly or indirectly, of RTK and / or CTK, or of phosphorylation of serine and threonine under the influence, directly or indirectly, of STK.

Termín kontaktující, jak zde bylo použito, se týká přivedení sloučeniny tohoto vynálezu a do kontaktu s danou PK takovým způsobem, že sloučenina může ovlivnit katalytickou aktivitu PK, buď přímo, tzn. interakcí s kinázou samotnou, nebo nepřímo, tzn. interakcí s jinou molekulou, na které katalytická aktivita závisí. Takového kontaktu může být dosaženo in vitro, tzn. ve zkumavce, Petriho misce nebo podobně. Ve zkumavce se kontaktu může účastnit sloučenina a daná PK nebo se ho účastní celé buňky. Buňky mohou být udržovány nebo pěstovány v miskách buňečných kultur a kontaktovány se sloučeninou v tomto prostředí. V tomto kontextu je snahou ověřit schopnost určité sloučeniny ovlivnit poruchy spojené s PK, tj. IC50 sloučenin, definované níže, určit ještě před použitím sloučenin in vivo^ tj. na složitějších žijících organizmech. Pro buňky mimo organizmus existují četné metody, dobře známé odborníkům v oboru, včetně toho jak dostat PK do kontaktu se sloučeninami a neomezující se pouze na přímé mikroinjekce do buněk a četné techniky transmembránových přenašečů.The term contacting, as used herein, refers to contacting a compound of the invention and contacting a given PK in such a way that the compound can affect the catalytic activity of the PK, either directly, i. by interacting with the kinase alone or indirectly; interaction with another molecule upon which catalytic activity depends. Such contact can be achieved in vitro, i. in a test tube, petri dish or the like. In the test tube, the compound and the PK may be involved, or the whole cell may be involved in the contact. Cells can be maintained or grown in cell culture dishes and contacted with the compound in this environment. In this context, an attempt is made to verify the ability of a particular compound to affect PK-related disorders, i.e., the IC 50 of the compounds defined below, to be determined prior to use of the compounds in vivo, i.e. on more complex living organisms. For cells outside the organism, there are numerous methods well known to those skilled in the art, including how to contact PK with compounds and not limited to direct microinjection into cells and numerous transmembrane transporter techniques.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je, že modulace katalytické aktivity PK užitím sloučeniny tohoto vynálezu může probíhat in vitro nebo in vivo.Another aspect of the present invention is that modulation of the catalytic activity of PK using a compound of the present invention can take place in vitro or in vivo.

• · • •«4• 4 • 4

Termín in vitro se vztahuje na postupy provedené v umělém prostředí jako jsou např., kromě jiného, ve zkumavce nebo živné půdě.The term in vitro refers to procedures performed in an artificial environment such as, but not limited to, in a test tube or culture medium.

Jak zde bylo použito, termín in vivo se vztahuje na postupy provedené uvnitř žijících organismů jako jsou, kromě jiného, myš, krysa nebo králík.As used herein, the term in vivo refers to procedures performed within living organisms such as, but not limited to, a mouse, rat, or rabbit.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je, že proteinkináza, jejíž katalytická aktivita je modulována sloučeninou tohoto vynálezu, je vybrána ze skupiny sestávající se z receptorové proteintyrozinkinázy, buněčné tyrozinkinázy a serin-threoninkinázy.Another aspect of the invention is that the protein kinase whose catalytic activity is modulated by a compound of the invention is selected from the group consisting of receptor protein tyrosine kinase, cellular tyrosine kinase and serine threonine kinase.

Aspektem tohoto vynálezu je, že receptorová proteinkináza, jejíž katalytické aktivita je modulována sloučeninou tohoto vynálezu je vybrána ze skupiny sestávající se z EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF1R, IRR, PDGFRa, PDGFRβ, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-lR, Flk4, KDR/Flk-1, Flt-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3R a FGFR-4R.An aspect of the invention is that the receptor protein kinase whose catalytic activity is modulated by a compound of the invention is selected from the group consisting of EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF1R, IRR, PDGFRα, PDGFRβ, CSFIR, C-Kit, C- fms, Flk-1R, Flk4, KDR / Flk-1, Flt-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3R, and FGFR-4R.

A dále aspektem tohoto vynálezu je, že buněčná tyrozinkináza, jejíž katalytická aktivita je modulována sloučeninou tohoto vynálezu, je vybrána ze skupiny sestávající se z Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hek, Fgr a Yrk.Furthermore, an aspect of the present invention is that a cell tyrosine kinase whose catalytic activity is modulated by a compound of the present invention is selected from the group consisting of Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes / Fps, Fak, Jak, Ack, Yes , Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hek, Fgr, and Yrk.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je, že serinthreoninproteinkináza jejíž katalytická aktivita je modulována sloučeninou tohoto vynálezu, je vybrána ze skupiny sestávající se z CDK2 a Raf.Another aspect of the invention is that the serinthreonine protein kinase whose catalytic activity is modulated by a compound of the invention is selected from the group consisting of CDK2 and Raf.

Farmaceutická kompozice sloučeniny podle tohoto vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič jsou dalším aspektem tohoto vynálezu. Taková farmaceutická kompozice může obsahovat také vehikulum.A pharmaceutical composition of a compound of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier are another aspect of the invention. Such a pharmaceutical composition may also contain a vehicle.

Metoda působení nebo prevence poruch spojených s proteinkinázou v organizmu zahrnující aplikaci terapeuticky efektivního množství sloučeniny, soli nebo proléčiva 3-pyrrolidenyl-2-indolinonu tohoto vynálezu na organizmus je dalším aspektem tohoto vynálezu.A method of treating or preventing protein kinase-related disorders in an organism comprising administering to the organism a therapeutically effective amount of a compound, salt or prodrug of 3-pyrrolidenyl-2-indolinone of the invention is another aspect of the invention.

Jak zde bylo použito, termíny poruchy spojené s PK, poruchy řízené PK a abnormální PK aktivita pojednávají o podmínkách charakterizující nevhodnou, tj. nedostačující, nebo častěji nadměrnouAs used herein, the terms PK related disorders, PK controlled disorders, and abnormal PK activity refer to conditions characterized by inappropriate, i.e., inadequate, or more often excessive.

PK katalytickou aktivitu, kde jednotlivé PK mohou být RTK, CTK nebo STK. Nevhodná katalytická aktivita může nastat jako výsledek: (1) PK exprese v buňkách, které normálně PK neexprimují, (2) zvýšení PK exprese vedoucí k nechtěné buněčné proliferaci, diferenciaci a/nebo růstu, nebo (3) snížení PK exprese vedoucí k nechtěné redukci buněčné proliferace, diferenciace a/nebo růstu. Nadměrná aktivita vypovídá buď o zesílení genu kódujícího určitou PK nebo o produkci takové úrovně PK aktivity, která koreluje s poruchami buněčné proliferace, diferenciace a/nebo růstu ( tj. tak jak se zvyšuje hladina PK, tak se zvyšuje závažnost jednoho nebo více symptomů buněčných poruch). Nedostačující aktivita je, samozřejmě naopak, tam kde se závažnost jednoho nebo více symptomů zvyšuje se snižující se hladinou PK aktivity.PK catalytic activity, wherein the individual PKs may be RTK, CTK or STK. Inappropriate catalytic activity may occur as a result of: (1) PK expression in cells that do not normally express PK, (2) increased PK expression leading to unwanted cell proliferation, differentiation and / or growth, or (3) decreased PK expression leading to unwanted reduction cell proliferation, differentiation and / or growth. Excessive activity is indicative of either enhancement of the gene encoding a particular PK or production of a level of PK activity that correlates with disorders of cell proliferation, differentiation and / or growth (i.e., as PK levels increase, the severity of one or more symptoms of cellular disorders ). Insufficient activity is, of course, vice versa where the severity of one or more symptoms increases with decreasing levels of PK activity.

Jak zde bylo použito, termíny zabránit, zabraňující a prevence se v první řadě vztahují k metodě zabraňující organizmu získat poruchy spojené s PK.As used herein, the terms prevent, prevent and prevent primarily refer to a method to prevent an organism from acquiring PK related disorders.

Jak zde bylo použito, termíny ošetření , léčení a léčba se týká metody zmírnění nebo ukončení poruch pojených s PK a/nebo jejich přítomných symptomů. S ohledem zvláště na rakovinu, tyto termíny jednoduše znamenají, že délka života jedince majícího rakovinu se prodlouží nebo se redukuje jeden nebo více symptomů této nemoci.As used herein, the terms treatment, treatment and treatment refers to a method of alleviating or terminating PK-related disorders and / or their symptoms present. With particular reference to cancer, these terms simply mean that the life expectancy of an individual having cancer will prolong or reduce one or more symptoms of the disease.

Termín organizmus se týká jakéhokoli živého celku sestávajícího nejméně z jedné buňky. Živý organizmus může být tak jednoduchý jako například jediná eukaryotická buňka, nebo tak složitý jako savec včetně člověka.The term organism refers to any living entity consisting of at least one cell. The living organism may be as simple as, for example, a single eukaryotic cell, or as complex as a mammal, including a human.

Termín terapeuticky efektivní množství tak, jak je zde používán, se týká množství podávané sloučeniny, které vede do určité míry ke zmírnění jednoho nebo více symptomů léčené poruchy. S ohledem na léčbu rakoviny, terapeuticky efektivní množství se týká množství, které způsobí (1) redukci velikosti nádoru , (2) inhibici (tj., zpomalení do určité míry nebo zastavení) metastázy nádoru, (3) inhibici , do určité míry (tj., zpomalení do určité míry nebo zastavení) růstu ·· • · · ·The term "therapeutically effective amount" as used herein refers to the amount of compound administered that results in some degree of amelioration of one or more symptoms of the disorder being treated. With respect to the treatment of cancer, a therapeutically effective amount refers to an amount that causes (1) a reduction in tumor size, (2) inhibition (i.e., slowing to some extent or arrest) of tumor metastasis, (3) inhibiting, to some extent (i.e. ., slowing to some extent or stopping) growth ·· • · · ·

• · » » · · • · • ** • · «· ···· nádoru a/nebo (4) do určité míry zmírnění ( nebo lépe eliminaci) jednoho nebo více symptomů spojených s rakovinou.And / or (4) to some extent relieving (or better eliminating) one or more of the symptoms associated with cancer.

Aspektem tohoto vynálezu je, že výše zmíněné poruchy spojené s proteinkinázou jsou vybrány ze skupiny sestávající s z poruch spojených s receptorovou proteintyrozinkinázou, buněčnou tyrozinkinázou a serin-threoninkinázou.An aspect of the invention is that the above-mentioned protein kinase-related disorders are selected from the group consisting of disorders associated with receptor protein tyrosine kinase, cellular tyrosine kinase and serine threonine kinase.

A následně aspektem tohoto vynálezu je, že výše zmíněné poruchy spojené s proteinkinázou jsou vybrány ze skupiny sestávající se z poruch spojených s EGFR, PDGFR, IGFR a flk.Consequently, an aspect of the invention is that the aforementioned protein kinase related disorders are selected from the group consisting of EGFR, PDGFR, IGFR and flk related disorders.

Výše zmíněná porucha spojená s proteinkinázou je rakovina vybraná ze skupiny sestávající se ze spinocelulárního karcinomu (karcinomu epitelu buňek), astrocytomu, sarkomu jako je Kaposiho sarkomu, glioblastomu, rakoviny plic, rakoviny močového měchýře, rakoviny tlustého střeva, gastrointestinální rakoviny, rakoviny hlavy a krku, melanomu, rakoviny vaječníku, rakoviny prostaty, rakoviny prsu, rakoviny malých plicních buňek a gliomu v dalším aspektu tohoto vynálezu.The aforementioned protein kinase-related disorder is a cancer selected from the group consisting of squamous cell carcinoma, astrocytoma, sarcoma such as Kaposi's sarcoma, glioblastoma, lung cancer, bladder cancer, colon cancer, gastrointestinal cancer, head and neck cancer , melanoma, ovarian cancer, prostate cancer, breast cancer, small lung cell cancer, and glioma in another aspect of the invention.

Výše zmíněná poruchy spojená s proteinkinázou je vybrána ze skupiny sestávající se z diabetů, hyperproliferační poruchy, von Hippel-Lindauovy nemoci, restenózy, fibrosy, psoriasy, osteo-artritidy, revmatické artritidy, zánětlivých poruch a angiogeneze v nyní dalším aspektu tohoto vynálezu.The aforementioned protein kinase related disorders is selected from the group consisting of diabetes, hyperproliferative disorders, von Hippel-Lindau's disease, restenosis, fibrosis, psoriasis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, inflammatory disorders and angiogenesis in a further aspect of the invention.

Dalšími poruchami, které mohou být léčeny nebo, kterým může být zabráněno užitím sloučeniny tohoto vynálezu jsou imunologické poruchy, jako je autoimunitní nemoc (AIDS) a kardiovaskulární poruchy jako je ateroskleróza.Other disorders that can be treated or prevented by the use of a compound of this invention are immunological disorders such as autoimmune disease (AIDS) and cardiovascular disorders such as atherosclerosis.

Aspektem tohoto vynálezu je, že chemické složení, které moduluje katalytickou aktivitu proteinkinázy může být identifikováno kontaktováním buněk exprimujících danou proteinkinázu se sloučeninou, solí nebo proléčivem, což jeAn aspect of the invention is that a chemical composition that modulates the catalytic activity of a protein kinase can be identified by contacting cells expressing the protein kinase with a compound, salt or prodrug, which is

3-pyrrolidenyl-2-indolinon z tohoto vynálezu a poté sledováním účinku na dané buňky.3-pyrrolidenyl-2-indolinone of the invention and then monitoring the effect on the cells.

• ·• ·

9 ·*·♦*··*· · · · 9 9 9 99 9 9 9 9

9999 999 99 9999 99 99999 999 99

Termínem sledování se míní pozorování nebo detekce účinku kontaktu sloučeniny s buňkou exprimující určitou PK. Pozorovaný nebo detekovaný účinek se může měnit v buněčném fenotypu, v katalytické aktivitě PK nebo změnami v interakci PK s přirozeným vazebným partnerem. Techniky pozorování nebo detekce těchto účinků jsou odborníkům dobře známé.By monitoring is meant observation or detection of the effect of contacting a compound with a cell expressing a particular PK. The observed or detected effect may vary in cellular phenotype, in catalytic PK activity, or by changes in PK interaction with the natural binding partner. Techniques for observing or detecting these effects are well known to those skilled in the art.

Výše zmíněný účinek je vybrán ze změny nebo nepřítomnosti změny buněčného fenotypu, změny nebo nepřítomnosti změny katalytické aktivity řečené proteinkinázy nebo změny nebo nepřítomnosti změny v interakci řečené proteinkinázy s přirozeným vazebným partnerem v konečném aspektu tohoto vynálezu.The above effect is selected from a change or absence of a change in the cell phenotype, a change or absence of a change in the catalytic activity of said protein kinase or a change or absence of a change in interaction of said protein kinase with a natural binding partner in a final aspect of the invention.

Termín buněčný fenotyp se týká vnějšího vzhledu buněk nebo tkání nebo biologických funkcí buněk nebo tkání. Příklady, kromě jiných, jsou buněčná velikost, růst buněk, proliferace buněk, diferenciace buněk, přežívání buněk, apoptóza a příjem a využití živin.The term cell phenotype refers to the external appearance of cells or tissues or the biological functions of cells or tissues. Examples include, but are not limited to, cell size, cell growth, cell proliferation, cell differentiation, cell survival, apoptosis, and nutrient uptake and utilization.

Termín přirozený vazebný partner se týká polypeptidu, který se váže na určitou PK v buňce. Přirozený vazebný partner může hrát roly v transdukěních procesech, kde jsou signály zprostředkovávány PK. Změna v interakci přirozeného vazebného partnera s PK se může projevit jako snížení nebo zvýšení koncentrace komplexu PK/přirozený vazebný partner, což má za následek pozorovatelnou změnu ve schopnosti PK zprostředkovávat transdukční signál.The term natural binding partner refers to a polypeptide that binds to a particular PK in a cell. The natural binding partner can play roles in transduction processes where signals are mediated by PK. A change in the interaction of the natural binding partner with PK may manifest itself as a decrease or increase in the concentration of the PK / natural binding partner complex, resulting in an observable change in the ability of the PK to mediate the transduction signal.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je, že sloučenina zde popsaná, nebo její sůl či proléčivo, mohou být kombinovány s dalšími chemoterapeutiky na léčbu nemocí a poruch diskutovaných výše. Například, sloučenina, sůl nebo proléčivo tohoto vynálezu mohou být kombinovány s alkylačními činidly jako jsou fluoruracil (5-FU) samotný nebo v další kombinaci s leukovorinem; nebo dalšími alkylačními činidly jako jsou , kromě jiných, další analoga pyrimidinu jako jsou UFT, capecitabin, gemcitabin a cytarabin, alkyl sulfonáty, např. busulfan ( používaný na léčbu chronické granulocytární lukemie), improsulfan a piposulfan; aziridiny, např. benzodepa, karboquon, meturedepa a uredepa; ethyleniminy a methylmelaminy, např.Another aspect of the invention is that the compound described herein, or a salt or prodrug thereof, can be combined with other chemotherapeutic agents to treat the diseases and disorders discussed above. For example, the compound, salt or prodrug of the invention may be combined with alkylating agents such as fluorouracil (5-FU) alone or in another combination with leucovorin; or other alkylating agents such as, but not limited to, other pyrimidine analogs such as UFT, capecitabine, gemcitabine and cytarabine, alkyl sulfonates such as busulfan (used to treat chronic granulocytic lukemia), improsulfan and piposulfan; aziridines such as benzodepa, carboquone, meturedepa and uredepa; ethylenimines and methylmelamines, e.g.

φ · φφφφ φφφ φ φ φφφ ίφ φφφφ φ φ φ φ φφ φφφφ φφ φ altretamin, triethylenmelamin, triethylenfosforamid, triethylenthiofosforamid a trimethylolmelamin; a dusíkaté přípravky, např. chlorambucil (používaný na léčbu chronické lymfocytické leukémie, primární makroglobulinémie a non-Hodgkinsova lymfomu), cyklofosfamid (používaný na léčbu Hodgkinsovy choroby, četného myelomu, neuroblastomu, rakoviny prsu, rakoviny vaječníku, rakoviny plic, Wilmsova tumoru a rabdomyosarkomu), estramustin, ifosfamid, novembrichin, prednimustin a uráčil přípravky (používané na léčbu primární trombocytosy, non-Hodgkinsova lymfomu, Hodgkinsovy choroby a rakoviny vaječníku); a triaziny, např. dakarbazin (používaný na léčbu lehkého tkáňového sarkomu).Altretamine, triethylenmelamine, triethylenephosphoramide, triethylenethiophosphoramide and trimethylolmelamine; and nitrogenous agents such as chlorambucil (used to treat chronic lymphocytic leukemia, primary macroglobulinemia and non-Hodgkins lymphoma), cyclophosphamide (used to treat Hodgkins disease, numerous myeloma, neuroblastoma, breast cancer, ovarian cancer, lung cancer, Wilms' tumor and rhabdomyosarcoma) ), estramustine, ifosfamide, novembrichin, prednimustine and uracicide (used to treat primary thrombocytosis, non-Hodgkins lymphoma, Hodgkins disease, and ovarian cancer); and triazines such as dacarbazine (used to treat light tissue sarcoma).

Stejně tak se očekává, že sloučenina, sůl nebo proléčivo tohoto vynálezu, mají prospěšný účinek v kombinaci s dalšími antimetabolickými chemotherapeutickými činidly jako jsou, kromě jiných, analoga kyseliny listové, např. methotrexát (používaný na léčbu akutní lymfocytické leukémie, choriokarcinomu, mykosis fungiodes rakoviny prsu, rakoviny hlavy a krku a osteogenního sarkomu) a pteropterin; a analoga purinu jako jsou merkaptopurin a thioguanin, který našel uplatnění při léčbě akutní granulocytární, akutní lymfocytární a chronické granulocytární leukémie.Likewise, the compound, salt or prodrug of the invention is expected to have a beneficial effect in combination with other antimetabolic chemotherapeutic agents such as, but not limited to, folic acid analogues, e.g., methotrexate (used to treat acute lymphocytic leukemia, choriocarcinoma, mycosis fungiodes cancer breast, head and neck cancer, and osteogenic sarcoma) and pteropterin; and purine analogs such as mercaptopurine and thioguanine, which have found utility in the treatment of acute granulocytic, acute lymphocytic and chronic granulocytic leukemia.

Také se může očekávat, že se zvýší účinnost sloučeniny, soli nebo proléčiva v kombinaci s chemoterapeutiky na přírodní bázy jako jsou, kromě jiných, např. vinblastin ( používaný na léčbu rakoviny prsu a rakoviny varlat), vincristin a vindesin; epipodofylotoxiny, např. etoposid a teniposid, oba používané na léčbu rakoviny varlat a Kaposiho sarkomu; antibiotická chemoterapeutika, např. daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, mitomycin (používané na léčbu rakoviny žaludku, děložního hrdla, tlustého střeva, prsu, močového měchýře a pankreatu), dactinomycin, temozolomid, plicamycin, blomycin (používaných na léčbu rakoviny kůže, jícnu a močo-pohlavního traktu); a enzymatická chemoterapeutika jako L-asparaginaza.Also, the efficacy of the compound, salt or prodrug in combination with chemotherapeutics on natural bases such as, but not limited to, vinblastine (used to treat breast and testicular cancer), vincristine and vindesine can also be expected to increase; epipodophyllotoxins, e.g., etoposide and teniposide, both used to treat testicular cancer and Kaposi's sarcoma; antibiotic chemotherapeutic agents such as daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, mitomycin (used to treat gastric, cervical, colon, breast, bladder and pancreatic cancer), dactinomycin, temozolomide, plicamycin, urine cancer, and blomycin (used to treat skin cancer) - genital tract); and enzymatic chemotherapeutics such as L-asparaginase.

A dále se očekává, že užitečný účinek bude mít sloučenina, sůl nebo proléčivo tohoto vynálezu v kombinaci s platinovými koordinačními komplexy (cisplatin, atd.); substituovanými močovinami jako hydroxymočovina; deriváty methylhydrazinu, např. procarbazin; adrenokortikálními supresivy, např.mitotan, aminoglutethimid; a hormony a hormonálními antagonisty jako adrenokortikosteriody (např. prednizon), progestiny (např. hydroxyprogesteron kaproát); estrogeny (např. diethylstilbesterol); antiestrogeny jako je tamoxifen; androgeny, např. testosteron propionát; a aromatáza inhibitory (jako je anastrozol).Furthermore, it is expected that the compound, salt or prodrug of the invention in combination with platinum coordination complexes (cisplatin, etc.) will have a useful effect; substituted ureas such as hydroxyurea; methylhydrazine derivatives such as procarbazine; adrenocortical suppressants such as mitotane, aminoglutethimide; and hormones and hormone antagonists such as adrenocorticosteroids (eg, prednisone), progestins (eg, hydroxyprogesterone caproate); estrogens (eg, diethylstilbesterol); antiestrogens such as tamoxifen; androgens such as testosterone propionate; and aromatase inhibitors (such as anastrozole).

A konečně jako částečně efektivní se očekává kombinace sloučeniny tohoto vynálezu s mitoxantrolem nebo paclitaxelem, které se používají na léčbu pevných rakovinných nádorů a leukémií jako jsou, kromě jiných, akutní myelogenní (non-lymfocitická) leukémie.Finally, a combination of a compound of the invention with mitoxantrol or paclitaxel, which is used to treat solid cancer tumors and leukemias such as, inter alia, acute myelogenous (non-lymphocytic) leukemia, is expected to be partially effective.

Současně preferovanou sloučeninou, u které se očekává užitečný účinek v kombinaci s jedním nebo více výše uvedenými chemoterapeutiky je 3-[2,4-dimethyl-5-(2-oxo-l ,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1 H-pyrrol-3-yl]propionová kyselina.A currently preferred compound expected to have a useful effect in combination with one or more of the above chemotherapeutic agents is 3- [2,4-dimethyl-5- (2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrole- 3-yl] propionic acid.

DETAILNÍ POPIS VYNÁLEZUDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

1. Stručný popis tabulek1. Brief description of the tables

Tabulka 1 ukazuje chemickou strukturu a biologickou aktivitu některých sloučenin tohoto vynálezu. Číslování sloučenin odpovídá číslům příkladů v příkladové části. To znamená, že syntéza sloučeniny 1 v tabulce 1 je popsána v Příkladu 1. Použité biotesty jsou podrobně popsány níže. Výsledky jsou vykazovány v termínech IC50, mikromolární (μΜ) koncentraci testovaných sloučenin, které způsobí 50 % změnu v aktivitě určité PKT ve srovnání s aktivitou PTK v kontrolním testu, kde nebyla přidána testovaná sloučenina. Specificky, ukázaný výsledek indikuje koncentraci testované sloučeniny potřebné pro způsobení 50 % redukce aktivity dané PTK. Sloučeniny uvedené v Tabulce 1 jsou pouze pro příklad a nejsou konstruovány s úmyslem jakýmkoli způsobem omezit rozsah tohoto vynálezu.Table 1 shows the chemical structure and biological activity of some of the compounds of the invention. The numbering of the compounds corresponds to those of the Examples in the Examples section. That is, the synthesis of Compound 1 in Table 1 is described in Example 1. The bioassays used are described in detail below. Results are reported in terms of IC50, the micromolar (μΜ) concentration of test compounds, which causes a 50% change in the activity of a particular PKT compared to the PTK activity in a control test where no test compound was added. Specifically, the result shown indicates the concentration of test compound needed to cause a 50% reduction in the activity of a given PTK. The compounds listed in Table 1 are for example only and are not intended to limit the scope of the invention in any way.

• · ♦ 9 9 99 • · · · 9 9 9 9 • · 9 9 9 o c 9 9 9 4 4 4• · 9 9 99 • · · 9 9 9 9 · · 9 9 9 o c 9 9 9 4 4 4

9999 999 99 99999999 999 99999

Tabulka 1Table 1

Příklad* Example* Struktura Structure blo-FLK-l ICj,(«M) blo-FLK-1 ICj, («M) bio-PDGFr ICwí-M) bio-PDGFr ICwí-M) bio-FGFR bio-FGFR HUVEC- VEGF ICm(biM) HUVEC- VEGF ICm (biM) HUVEC- aFGF IC.(nM) HUVEC- aFGF IC (nM) BrdU- PDGFr ICw(biM) BrdU- PDGFr ICw (biM) BrdU- FGFr ICm(oiM) BrdU- FGFr ICm (oM) BrdU- EGFr IC,(»M) BrdU- EGFr IC (M) 1 1 1.3 1.3 <0.78 <0.78 20.2 20.2 0.38 0.38 21.4 21.4 8.4 8.4 8.8 8.8 12 12 2 2 ^,*νζ-^'^{ΟΒ ,} * νζ- ^ ' ^ΟΒ 89.1 89.1 0.14 0.14 12.1 12.1 1.6 1.6 31.6 31.6 1.2 1.2 >50 > 50 >50 > 50 3 3 Vp'‘ In P'' 1.2 1.2 0.042 0.042 0.86 0.86 0.05 0.05 2.8 2.8 2.5 2.5 30 30 >50 > 50 4 4 1.2 1.2 13 13 9 9 0.11 0.11 7.1 7.1 8.2 8.2 >50 > 50 >50 > 50 5 5 αρ“' αρ '' 0.13 0.13 <1.2 <1.2 8.81 8.81 0.42 0.42 9.3 9.3 10.7 10.7 46.8 46.8 95.9 95.9 6 6 6.8 6.8 0.26 0.26 0.63 0.63 18.4 18.4 8.6 8.6 >50 > 50 >50 > 50 7 7 v? in? 19.2 19.2 2.2 2.2 1.34 1.34 12.3 12.3 11.4 11.4 >50 > 50 >50 > 50 8 8 0.77 0.77 0.37 0.37 0.68 0.68 0.74 0.74 4.52 4.52 8.2 8.2 >50 > 50 >50 > 50 9 9 1.06 1.06 0.13 0.13 0.33 0.33 13.4 13.4 6.3 6.3 >50 > 50 >50 > 50 10 10 %°£z$ % ° £ of $ 11 11 <0.78 <0.78 1.63 1.63 10.62 10.62 >50 > 50 5.1 5.1 >50 > 50 >50 > 50 Π Π V^”^M o^tiIn ^ ^M o ^ ti 0.7 0.7 0.13 0.13 7.73 7.73 1.4 1.4 9.6 9.6 11.1 11.1 >50 > 50 >50 > 50 12 12 vyP^⁰ vyP ^ ⁰ 52.3 52.3 13.6 13.6 3.3 3.3 11 11 24.6 24.6 1 1 >50 > 50 >50 > 50

Příklad* Example* Struktura Structure bio-FLK-1 ICtt(mM) bio-FLK-1 ICtt (mM) i bio-PDGFr i bio-FGFR IC„(«M) I !C„(mM) I and bio-PDGFr and bio-FGFR IC "(" M) III "(mM) AND HUVEC- VEGF IC„<mM) HUVEC- VEGF IC (<mM) HUVEC- aFGF IC»(aM) HUVEC- aFGF IC »(AM) BrdU- PDGFr IQ,(mM) BrdU- PDGFr IQ, (mM) BrdU- FGFr )C»(l»M) BrdU- FGFr ) C »(l» M) BrdU- EGFr lCa.(nM) BrdU- EGFr ICa (nM) 13 13 ' *Vi θ£ '* Vi θ £ r r 31 31 4.2 4.2 1 i 1 and 14 14 Λ Λ 17 17 6 6 15 15 Dec Z OF 6.6 6.6 <0.78 . <0.78. 16 16 Mo-U·'· Mo-U · '· •w Ct£ • w Ct £ Λ Λ >100 > 100 8.7 8.7 i 1 i and 1 and 17 17 o ζ-Λ⁰ by ζ-Λ ⁰ 10 10 10.3 10.3 1.2 1.2 20 20 May 6.3 6.3 44.3 44.3 >50 > 50 18 18 >» > » 2.9 2.9 2 2 2.4 2.4 18.4 18.4 14.3 14.3 « « >50 > 50 19 19 Dec Ί Ί 0.006 0.006 0.063 0.063 0.07 0.07 3.6 3.6 3.7 3.7 39.6 39.6 >50 > 50 20 20 May Ί Ί Y^^0M Α'ΒΗ,Y ^ ^0M Α'ΒΗ, 0.027 0.027 0.7 0.7 0.29 0.29 5 5 7.4 7.4 >50 > 50 >50 > 50 21 21 sí sí ď ï 0.02 0.02 0.68 0.68 4 4 4 4 5.6 5.6 24.4 24.4 >50 > 50 >50 > 50 22 22nd J- x*\ J- x * \ 0.61 0.61 0.73 0.73 0.13 0.13 15.8 15.8 5 5 >50 > 50 23 23 J J 5.2 5.2 0.8 0.8 0.68 0.68 3 3 1.1 1.1 10.8 10.8 >50 > 50 >50 > 50 24 24 V-O-C V-O-C £ H £ H Z 'CH, OF 'CH, <0.78 <0.78 0.55 0.55 17.9 17.9 0.67 0.67 25.1 25.1 2.4 2.4 21 21 >50 > 50

«···«···

Prikhiil· Prikhiil · Struktura Structure bio-FLK-1 IQ. («Μ) bio-FLK-1 IQ. («Μ) bio-PDGFr 1C»(»M) bio-PDGFr 1C » bio-FGFR ICm(-M) bio-FGFR ICm (-M) HUVEC- VEGF lC»(mM) HUVEC- VEGF IC »(mM) HUVEC- »FGF IC«(mM) HUVEC- »FGF IC «(mM) BrdU- PDGFr BrdU- PDGFr BrdU- FGFr BrdU- FGFr BrdU- EGFr ICeCBM) BrdU- EGFr ICeCBM) 25 25 «Λ» «Λ» 0.8 0.8 1.2 1.2 26 26 Fř Fř Θ1.8 .81.8 >100 > 100 27 27 Mar: «\··* «\ ·· * 16.9 16.9 <0.78 . <0.78. 0.99 0.99 1.5 1.5 28 28 <0.78 <0.78 0.16 0.16 0.04 0.04 0.15 0.15 1.9 1.9 3.4 3.4 37 37 >50 > 50 29 29 S.9 S.9 1.18 1.18 6.89 6.89 0.18 0.18 0.13 0.13 0.29 0.29 13.2 13.2 30.6 30.6 30 30 2.6 2.6 0.52 0.52 3.5 3.5 0.25 0.25 0.64 0.64 0.4 0.4 22 22nd 24.7 24.7 31 31 X X 3.1 3.1 1.53 1.53 0.09 0.09 0.18 0.18 2.1 2.1 35.9 35.9 37.2 37.2 32 32 5.1 5.1 <0.009 <0.009 10 10 10 10 0.076 0.076 12 12 32.7 32.7 33 33 4.6 4.6 0.16 0.16 0.81 0.81 1 1 0.1 0.1 21 21 30.5 30.5 34 34 24.7 24.7 3.1 3.1 3.8 3.8 34.7 34.7 36.8 36.8 35 35 14.4 14.4 1.2 1.2 1.59 1.59 35.8 35.8 >50 > 50 36 36 «_λ~ «_Λ ~ 89.7 89.7 1.4 1.4

• · 0 · 0 ·• 0 · 0 ·

9 9 9 9 9 9 * · 9 9 9 • 99 · a • 0 0 00 0 0 0 09 9 9 9 9 9 * · 9 9 9 • 99 · and • 0 0 00 0 0 0 0

Příklad» Example" Struktura Structure blo-FLK-1! bio-PDGFr blo-flk-1! bio-PDGFr bio-FGFR bio-FGFR HUVEC- VEGF HUVEC- VEGF HUVEC- FGF ICb(»M) HUVEC- FGF ICb (»M) BrdU- PDGFr IC«(aM) BrdU- PDGFr IC «(aM) BrdU- FGFr IChÍbM) BrdU- FGFr IChÍbM) BrdU- EGFr ιε»(·Μ) BrdU- EGFr ιε »(· Μ) 37 37 85.6 85.6 1.5 1.5 38 38 ’9r^r^° c^''9r ^r ^ ° c ^' 39 39 40 40 41 41 0.01 0.01 0.09 0.09 3.2 3.2

Tabulka 2Table 2

Příklad. Example. Struktura Structure bio-FLK-1 ις»(«Μ) bio-FLK-1 ις »(« Μ) bio-EGFr bio-EGFr bio-PDGFr 1Cm(»M> bio-PDGFr 1Cm (»M>) HUVEC- VEGF ICmIoM) HUVEC- VEGF ICmIoM) HUVEC- •FGF HUVEC- • FGF BrdU- PDGFr 1Cm(«M) BrdU- PDGFr 1Cm («M) BrdU- FGFr !C»<mM) BrdU- FGFr IC (<mM) BrdU- EGFr BrdU- EGFr 42 42 H H <0.78 <0.78 >100 > 100 2.31 2.31 0.38 0.38 34.93 34.93 >50 > 50 43 43 <0.78 <0.78 >100 > 100 1.59 1.59 0.37 0.37 45.48 45.48 44.83 44.83 44 44 42.82 42.82 >100 > 100 0.27 0.27 0.44 0.44 >50 > 50 >50 > 50 45 45 >100 > 100 >100 > 100 7.53 7.53 1.02 1.02 4.96 4.96 3.9 3.9 46 46 ,0 , 0 >100 > 100 >100 > 100 >100 > 100 0.52 0.52 15.42 15.42 41.9 41.9

φ · ♦ φ · · · • « « · • » * φ φ φφφ · «φ φφ·φφ · «· • * · * φ * φ φ φ

Přikladli They did Struktura Structure 1 1 bio-FLK-li bio-EGFr 1 1 bio-FLK if bio-EGFr bio-PDGFr bio-PDGFr HUVEC- VEGF ICm(biM) HUVEC- VEGF ICm (biM) HUVEC- aFGF IC»(bM) HUVEC- aFGF IC (bM) BrdU- PDGFr IC_W(»M)BrdU- PDGFr IC _W BrdU- FGFr BrdU- FGFr BrdU- EGFr BrdU- EGFr lCe(mM) 1Ce (mM) ICm <-M> ICm <-M> 47 47 >100 > 100 >100 > 100 0.75 0.75 >50 > 50 >50 > 50 >50 > 50 48 48 <0.78 <0.78 >100 > 100 0.053 0.053 0.079 0.079 9.93 9.93 12.6 12.6 49 49 <0.78 <0.78 >100 > 100 <0.046 <0.046 <0.069 <0.069 1.26 1.26 4.1 4.1 50 50 5.16 5.16 >100 > 100 0.1 0.1 0.103 0.103 3.42 3.42 4 4 51 51 1 1 42.36 42.36 22.83 22.83 1.02 1.02 1.54 1.54 3.9 3.9 9.56 9.56 52 52 .X .X 9.77 9.77 28.06 28.06 0.11 0.11 0.7 0.7 10.9 10.9 9.57 9.57 53 53 99.55 99.55 >100 > 100 4.35 4.35 0.48 0.48 3.1 3.1 3.66 3.66 54 54 X-S-S'“’ °V<r X-S-S '' ° E <r <0.78 <0.78 >100 > 100 <0.0078 <0.0078 <0.069 <0.069 3.01 3.01 7.49 7.49 55 55 ífrF ífrF <0.78 <0.78 86.56 86.56 <0.0078 <0.0078 <0.069 <0.069 13.85 13.85 25.37 25.37 56 56 -ο -ο <0.78 <0.78 >100 > 100 0.16 0.16 0.55 0.55 4.86 4.86 11.01 11.01 57 57 <0.78 <0.78 >100 > 100 0.05 0.05 0.29 0.29 15.7 15.7 27.47 27.47

Přiklad· Example· Struktura Structure blo-FLK-l ICninM) blo-FLK-1 ICninM) bio-FOGFr bio-FOGFr bio-FGFR bio-FGFR HUVEC- VEGF !C»(mM) HUVEC- VEGF IC (mM) HUVEC- •FGF HUVEC- • FGF BrdU- PDGFr BrdU- PDGFr BrdU- FGFr BrdU- FGFr BrdU- EGFr KW**·» BrdU- EGFr KW ** 58 58 <0.78 <0.78 >100 > 100 <0.0078 <0.0078 <0.069 <0.069 9.18 9.18 25.35 25.35 59 59 <0.78 <0.78 >100 > 100 0.067 0.067 0.32 0.32 9.95 9.95 20.2 20.2 60 60 <0.78 <0.78 >100 > 100 0.43 0.43 0.56 0.56 ³³ 25.34 25.34 61 61 χΧ χΧ 0.91 0.91 >100 > 100 0.44 0.44 1.04 1.04 11.31 11.31 6.59 6.59 62 62 1.97 1.97 >100 > 100 2.35 2.35 0.57 0.57 2.14 2.14 8.38 8.38 63 63 x^< 9 ftA* H x ^ <9 ftA H 12.08 12.08 >100 > 100 2.41 2.41 10.32 10.32 29.09 29.09 29.77 29.77 64 64 XA H XA H 15.07 15.07 >100 > 100 2.86 2.86 1.45 1.45 4.58 4.58 11.24 11.24

Tabulka 2 ukazuje chemické struktury některých přídavných sloučenin tohoto vynálezu. Stejně jako v Tabulce 1, čísla sloučenin odpovídají číslům příkladů. Základní popis výše použitých biotestů se shoduje s biotesty v Tabulce 2.Table 2 shows the chemical structures of some of the additional compounds of the invention. As in Table 1, the compound numbers correspond to the example numbers. The basic description of the bioassays used above is identical to the bioassays in Table 2.

2. Indikace/urěená onemocnění2. Indications / designated diseases

PK, jejichž katalytická aktivita je modulována sloučeninami podle tohoto vynálezu, obsahující proteintyrosinkinázy, které jsou dvojího typu, receptorové tyrozinkinázy (RTK) a buněčné tyrozinkinázy (CTK), a serín-threoninkinázy (STK). Signální transdukce zprostředkovávaná RTK je iniciována extracelulární interakcí se specifickým růstovým faktorem (ligandem), po které následuje dimerizace receptoru, dočasná stimulace aktivity vnitřního proteinu tyrozinkinázy a fosforylace. Vytváří se tudíž vazebná místa pro intracelulární signální transdukční molekuly a vedou k formaci komplexu s celou řadou cytoplazmatických signálních molekul, které zprostředkovávají příslušnou buněčnou odpověď (např. dělení buněk, metabolické účinky na mimobuněčný mikrosvět atd.). Viz Schlessinger a Ulrych, 19992, Neuron 9:303-391.PK whose catalytic activity is modulated by the compounds of the invention comprising dual-type protein tyrosine kinases, receptor tyrosine kinases (RTKs) and cell tyrosine kinases (CTKs), and serine-threonine kinases (STKs). RTK-mediated signal transduction is initiated by extracellular interaction with a specific growth factor (ligand), followed by receptor dimerization, temporary stimulation of tyrosine kinase intrinsic protein activity, and phosphorylation. Thus, binding sites for intracellular signal transduction molecules are formed and result in the formation of a complex with a variety of cytoplasmic signaling molecules that mediate the respective cellular response (eg, cell division, metabolic effects on extracellular microworld, etc.). See Schlessinger and Ulrych, 19992, Neuron 9: 303-391.

Bylo ukázáno, že tyrozinová fosforylaění místa na receptorech růstového faktoru fungují jako vazebná místa s vysokou afinitou pro SH2 doménu (homolog src) signálních molekul. Fantl et al., 19992, Cell 69:413-423, Songyang et al. 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785), Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778, a Koch at al., 1991, Science 252:668-678. Bylo identifikováno několik intracelulárních substrátových proteinů, které se asociují s RTK. Lze je rozdělit do dvou základních skupin: (1) substráty, které mají katalytickou doménu, a (2) substráty, které takovou doménu nemají, ale které slouží jako adaptéry a asociují s katalyticky aktivními molekulami. Songyng et al., 1993, Cell 72:767-778. Specifita interakcí mezi receptory a doménami SH2 jejich substrátů je určena podle zbytků aminokyselin bezprostředně obklopujících fosforylovaný tyrozinový zbytek. Rozdíly ve vazebné afinitě mezi SH2 doménami a aminokyselinovou sekvencí obklopující fosfotyrozinové zbytky na určitém receptoru souhlasí s pozorovanými rozdíly v profilech jejich fosforylovaných substrátů. Songyang et al., 1993, Cell 72:767-778. Tato pozorování vedou k názoru, že funkce každé RTK je určena nikoli pouze jejím vzorcem exprese a dostupnosti ligandu, ale také řadou downstream signálů transdukčních cest, které jsou aktivovány určitým receptorem. Tak fosforylace poskytuje důležitý regulační krok, který určuje výběrovost signálních cest používaných specifickými receptory růstových faktorů stejně tak jako receptory diferenciačních faktorů.Tyrosine phosphorylation of the site at growth factor receptors has been shown to function as high affinity binding sites for the SH2 domain (homolog src) of signaling molecules. Fantl et al., 19992; Cell 69: 413-423; Songyang et al. 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 2777-2785), Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778, and Koch et al., 1991, Science 252: 668-678. Several intracellular substrate proteins have been identified that associate with RTKs. They can be divided into two basic groups: (1) substrates having a catalytic domain and (2) substrates which do not have such a domain but which serve as adapters and associate with catalytically active molecules. Songyng et al., 1993, Cell 72: 767-778. The specificity of the interactions between the receptors and the SH2 domains of their substrates is determined by the amino acid residues immediately surrounding the phosphorylated tyrosine residue. The differences in binding affinity between SH2 domains and the amino acid sequence flanking phosphotyrosine residues at a particular receptor are consistent with the observed differences in the profiles of their phosphorylated substrates. Songyang et al., 1993, Cell 72: 767-778. These observations suggest that the function of each RTK is determined not only by its pattern of ligand expression and availability, but also by a series of downstream transduction pathway signals that are activated by a particular receptor. Thus, phosphorylation provides an important regulatory step that determines the selectivity of signaling pathways used by specific growth factor receptors as well as differentiation factor receptors.

STK, které jsou primárně cytoplazmatické, ovlivňují biochemii uvnitř buňky, často jako down-line odpověď na působení PTK. STK byly prokázány v signálních procesech, které iniciují syntézu DNA a následnou mitózu vedoucí k buněčné proliferaci.STKs, which are primarily cytoplasmic, affect biochemistry within the cell, often as a down-line response to PTK action. STKs have been shown in signaling processes that initiate DNA synthesis and subsequent mitosis leading to cell proliferation.

Tak PK signální transdukce vede, kromě jiných odpovědí, k buněčné proliferaci, diferenciaci, růstu a metabolizmu. Abnormální buněčná proliferace může vést k celé řadě onemocnění a nemocí, včetně k rozvinutí neoplasmů jako jsou karcinomy, sarkomy, glioblastomy a hemangiomy, k onemocněním jako leukémie, psoriáza, arterioskleróze, arthritidě a diabetické retinopathii a k dalším onemocněním souvisejícím s nekontrolovanou angiogenezi a/nebo vaskulogenezí.Thus, PK signal transduction leads, among other responses, to cell proliferation, differentiation, growth and metabolism. Abnormal cell proliferation can lead to a variety of diseases and diseases, including the development of neoplasms such as carcinomas, sarcomas, glioblastomas and hemangiomas, diseases such as leukemia, psoriasis, arteriosclerosis, arthritis and diabetic retinopathy, and other diseases related to uncontrolled angiogenesis and / or vasculologenesis .

Používání tohoto vynálezu nevyžaduje precizní pochopení mechanizmů, jakými sloučeniny tohoto vynálezu inhibují proteinkinázy. Nicméně, zatímco sloučeniny zde nejsou vázány k žádné určité teorii mechanizmu působení, má se za to, že tyto sloučeniny interagují s aminokyselinami v katalytických oblastech proteinkináz. Proteinkinázy mají typicky dvoulaločnou strukturu, ve které se ATP zřejmě váže ve štěrbině mezi těmito dvěma laloky v oblasti, kde se vyskytují aminokyseliny v proteinkinázách konzervované. Věří se, že inhibitory proteinkináz se vážou nekovalentními vazbami jako vodíkovými můstky, van der Waalsovými sílami a iontovými interakcemi v té samé oblasti, kde se již zmíněné ATP váže na proteinkinázy. Přesněji, má se za to, že 2-indolinové složky sloučenin tohoto vynálezu se vážou na obecné místo obvykle obsazeného adeninovým kruhem ATP. Specifita určité molekuly k určité proteinkináze může vzniknout jako výsledek dodatečné interakce mezi různými substituenty na 2-indolinovém jádře a aminokyselinovou doménou specifickou pro určitou proteinkinázu. Tak různé idolinové substituenty mohou přispívat k přednostní vazbě na určitou proteinkinázu. Schopností vybrat sloučeniny aktivní na různých vazebných místech ATP (nebo jiného nukleotidu) jsou sloučeniny tohoto vynálezu užitečné pro zacílení jakéhokoli proteinu s takovým místem. Sloučeniny zde popsané tak mohou mít užitek v in vitro testech pro takové proteiny a také pro in vivo předvedení terapeutických účinků prostřednictvím interakce s takovými proteiny.The use of the invention does not require a precise understanding of the mechanisms by which the compounds of the invention inhibit protein kinases. However, while the compounds herein are not bound by any particular mechanism of action theory, these compounds are believed to interact with amino acids in the catalytic regions of protein kinases. Protein kinases typically have a bilobal structure in which ATP appears to bind in the cleft between the two lobes in the region where amino acids conserved in protein kinases are present. Protein kinase inhibitors are believed to bind by non-covalent bonds such as hydrogen bridges, van der Waals forces, and ionic interactions in the same region where the aforementioned ATP binds to protein kinases. More specifically, the 2-indoline components of the compounds of this invention are believed to bind to the general site usually occupied by the adenine ring of ATP. The specificity of a particular molecule to a particular protein kinase may arise as a result of the additional interaction between different substituents on the 2-indoline nucleus and the amino acid domain specific for that particular protein kinase. Thus, various idoline substituents may contribute to preferential binding to a particular protein kinase. By the ability to select compounds active at different ATP binding sites (or other nucleotides), the compounds of the invention are useful for targeting any protein with such a site. Thus, the compounds described herein may be useful in in vitro assays for such proteins as well as in vivo demonstration of therapeutic effects through interaction with such proteins.

V dalším aspektu je proteinkináza, jejíž katalytická aktivita je modulována kontaktem s některou sloučeninou tohoto vynálezu, je proteintyrozinkináza, přesněji receptorová proteintyrozinkináza. Mezi »♦ «··· ·In another aspect, the protein kinase whose catalytic activity is modulated by contact with a compound of the invention is a protein tyrosine kinase, more specifically a receptor protein tyrosine kinase. Among »♦« ··· ·

receptorové proteintyrozinkinázy, jejichž katalytická aktivita může být modulovaná některou sloučeninou tohoto vynálezu nebo její solí, patří kromě jiných EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF-1R, IRR, PDGFRa, PDGFRp, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-IR, Flk4, KDR/Flk-1, Flt-1, FGFR2R, FGFR-3R a FGFR-4R.receptor protein tyrosine kinases whose catalytic activity can be modulated by a compound of the invention or a salt thereof include, but are not limited to, EGF, HER2, HER3, HER4, IR, IGF-1R, IRR, PDGFRα, PDGFRβ, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-IR, Flk4, KDR / Flk-1, Flt-1, FGFR2R, FGFR-3R, and FGFR-4R.

Proteintyrozinkináza, jejíž katalytická aktivita je modulována kontaktem se sloučeninou tohoto vynálezu nebo její solí či jejím proléčivem, může být buď nereceptorová, nebo buněčná proteintyrozinkináza (CTK). Tak katalytická aktivita CTK jako takové, kterou může být kromě jiných Src, Frk, Brk, Csk, Abl, ZAP70, Fes, Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hek, Fgr a Yrk, je modulována kontaktem se sloučeninou tohoto vynálezu nebo její solí.The protein tyrosine kinase whose catalytic activity is modulated by contact with a compound of the invention or a salt or prodrug thereof may be either a non-receptor or a cellular protein tyrosine kinase (CTK). Thus, the catalytic activity of CTK as such, which may be, among others, Src, Frk, Brk, Csk, Abl, ZAP70, Fes, Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lek, Blk, Hek, Fgr and Yrk, is modulated by contact with a compound of the invention or a salt thereof.

Další skupinou proteinkináz, které mohou mít své katalytické aktivity modulovány kontaktem s některou sloučeninou tohoto vynálezu, jsou serin-threoninproteinkinázy jako takové, mezi jinými CDK2 a Raf.Another class of protein kinases that may have their catalytic activities modulated by contact with a compound of the invention are serine-threonine protein kinases as such, among others CDK2 and Raf.

V dalším aspektu se tento vynález vztahuje na metodu léčby nebo prevence poruch v souvislosti s PK podáním terapeuticky efektivního množství některé sloučeniny tohoto vynálezu, její soli nebo proléčiva, do organizmu.In another aspect, the invention relates to a method of treating or preventing PK-related disorders by administering to the body a therapeutically effective amount of a compound of the invention, a salt or a prodrug thereof.

Je rovněž aspektem tohoto vynálezu, že farmaceutická kompozice obsahující některou sloučeninu tohoto vynálezu nebo její sůl či proléčivo, je podáno organizmu za účelem prevence nebo léčby poruch souvisejících s PK.It is also an aspect of the invention that a pharmaceutical composition comprising a compound of the invention, or a salt or prodrug thereof, is administered to an organism for the prevention or treatment of PK-related disorders.

Tento vynález je tedy zaměřen na sloučeniny, které modulují proteinkinázovou signální transdukci ovlivněním enzymatické aktivity RTK, CTK a/nebo STK, čímž interferují se signály transdukovanými těmito proteiny. Přesněji je tento vynález zaměřen na sloučeniny, které modulují RTK, CTK a/nebo STK zprostředkovávané signální transdukční dráhy jako terapeutický přístup k léčbě mnoha druhů pevných nádorů, zahrnujících kromě jiného karcinomy, sarkomy včetně Kaposiho sarkomu, erytroblastomy, glioblastomy, meningiomy, astrocytomy, melanomy a myoblastomy. Léčba nebo prevence ♦ · 9 · 9 99 9« • 999 999« 9 9 · • · 9 9 9 9 9 44 · 9999 9999Thus, the present invention is directed to compounds that modulate protein kinase signal transduction by affecting the enzymatic activity of RTKs, CTKs, and / or STKs, thereby interfering with signals transduced by these proteins. More specifically, the present invention is directed to compounds that modulate RTK, CTK and / or STK-mediated signal transduction pathways as a therapeutic approach to the treatment of many solid tumor types including but not limited to carcinomas, sarcomas including Kaposi's sarcoma, erythroblastomas, glioblastomas, meningiomas, astrocytomas, melanomas and myoblastomas. Treatment or prevention 9 · 9 · 9 99 9 • • 999 999 9 9 9 · · · 9 9 9 9 9 44 · 9999 9999

T^T · 9 9 9 9 9 9T ^ T · 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 9999 99 9 nepevných rakovinných nádorů, jako je leukemie, jsou do tohoto vynálezu rovněž zahrnuty. Indikace mohou zahrnovat kromě jiného rakoviny mozku, rakoviny močového měchýře, rakoviny vaječníků, rakoviny pankreatu, rakoviny tlustého střeva, rakoviny krve, rakoviny plic a rakoviny kostí.9999 999 99 9999 99 9 non-solid cancerous tumors such as leukemia are also included in the invention. Indications may include, but are not limited to, brain cancer, bladder cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, colon cancer, blood cancer, lung cancer, and bone cancer.

Dalšími příklady typů poruch souvisejících se nevhodnou proteinkinázovou aktivitou, ke kterým mohou být sloučeniny zde popsané vhodnou prevencí, léčbou a studiem, jsou kromě jiného poruchy proliferace, fibrotické poruchy a metabolické poruchy.Other examples of types of disorders associated with inappropriate protein kinase activity, to which the compounds described herein may be by suitable prevention, treatment, and study, are, inter alia, proliferative disorders, fibrotic disorders, and metabolic disorders.

Poruchy buněčné proliferace, kterým tento vynález může být prevencí, léčbou nebo dalším studiem, zahrnují rakovinu, poruchy proliferace buněk krevních cév a poruchy proliferace mesangiálních buněk.Cell proliferative disorders, which the invention may be by prevention, treatment or other study, include cancer, blood vessel cell proliferative disorders, and mesangial cell proliferative disorders.

Poruchy proliferace krevních cév se týkají poruchám souvisejícím s abnormální vaskulogenezí (tvorbou krevních cév) a angiogenezí (šíření krevních cév). Zatímco vaskulogeneze a angiogeneze hrají důležitou roli v mnoha normálních fyziologických procesech, jako je embryonální vývoj, formace žlutého tělíska, hojení ran a regenerace orgánů, hrají také zásadní roli ve vývoji rakoviny, kde vedou k tvorbě nových kapilár potřebných pro udržení nádoru při životě. Dalšími příklady poruch proliferace krevních cév je artritida, kde nové kapiláry krevních cév poškozují kloub a ničí chrupavku, dále oční onemocněni jako diabetická retinopatie, kde nové kapiláry v sítnici napadají sklivec, krvácejí a způsobují slepotu.Blood vessel proliferative disorders are related to abnormal vasculogenesis (blood vessel formation) and angiogenesis (blood vessel spread). While vasculogenesis and angiogenesis play an important role in many normal physiological processes, such as embryonic development, yellow body formation, wound healing, and organ regeneration, they also play an essential role in cancer development, where they lead to the formation of new capillaries needed to keep the tumor alive. Other examples of blood vessel proliferative disorders are arthritis, where new blood vessel capillaries damage the joint and destroy cartilage, and eye disease such as diabetic retinopathy, where new retinal capillaries attack the vitreous, bleed and cause blindness.

Bylo zjištěno, že dvě strukturálně příbuzné RTK se vážou k VEGF s vysokou afinitou: fms-podobný tyrosin 1 (fit-1) receptor (Shibuya et al., 1990, Oncogene, 5:519-524, De Vries et al., 1992, Science, 255:989-991) a receptor KDR/FLK-1 také známý jako VEGF-R2. Bylo publikováno, že vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF) je specifickým mitogenem endotelových buněk s podpůrnou aktivitou na růst endotelových buněk in vitro. Ferrara & Henzel, 1989, Biochein. Biophys. Res. Comm., 161:851-858, Vaisman et al., 1990, J. Biol. Chem., 265:19461-19566. Informace podané v US přihlášce č. 08/193,Two structurally related RTKs have been found to bind to VEGF with high affinity: the fms-like tyrosine 1 (fit-1) receptor (Shibuya et al., 1990, Oncogene, 5: 519-524, De Vries et al., 1992 , Science, 255: 989-991) and the KDR / FLK-1 receptor also known as VEGF-R2. Vascular endothelial growth factor (VEGF) has been reported to be a specific endothelial cell mitogen with endothelial cell growth promoting activity in vitro. Ferrara & Henzel, 1989, Biochein. Biophys. Res. Comm., 161: 851-858; Vaisman et al. (1990) J. Biol. Chem., 265: 19461-19566. Information filed in US Application No. 08/193,

829, 08/038, 596 a 07/975, 750 trvají na tom, že VEGF je odpovědný nejen za proliferaci endotelových buněk, ale také je primárním regulátorem normální a patologické angiogeneze. Obecně viz Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3(10)699-702; Houck, et al.829, 08/038, 596 and 07/975, 750 insist that VEGF is not only responsible for endothelial cell proliferation but also is the primary regulator of normal and pathological angiogenesis. See generally, Klagsburn & Soker, 1993, Current Biology, 3 (10) 699-702; Houck, et al.

1992, J. Biol. Chem., 267:26031-26037.1992, J. Biol. Chem., 267: 26031-26037.

Normální vaskulogeneze a angiogeneze hrají důležitou roli v řadě fyziologických procesů jako je embryonální vývoj, hojení ran, regenerace orgánů, v ženském reprodukčním procesu jako je vývoj folikula ve žlutém tělísku během ovulace a růst placenty v těhotenství. Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem., 267(16):10931-34. Nekontrolovaná vaskulogeneze a/nebo angiogeneze je spojována s takovými nemocemi, jako je diabetes a s maligními pevnými nádory, které jsou svým růstem závislé na vaskularizaci. Klagsburn & Soker,Normal vasculogenesis and angiogenesis play an important role in a number of physiological processes such as embryonic development, wound healing, organ regeneration, in the female reproductive process such as follicle development in the yellow body during ovulation, and placental growth in pregnancy. Folkman & Shing, 1992, J. Biological Chem., 267 (16): 10931-34. Uncontrolled vasculogenesis and / or angiogenesis has been associated with diseases such as diabetes and with malignant solid tumors that are dependent on vascularization for growth. Klagsburn & Soker

1993, Current Biology, 3(10):699-702; Flokham, 1991, J. Nati. Cancer Inst., 82:4-6; Weidner, et al., 1991, New Engl. J. Med., 324:1-5.1993, Current Biology, 3 (10): 699-702; Flokham, 1991, J. Natl. Cancer Inst., 82: 4-6; Weidner, et al., 1991, New Engl. J. Med., 324: 1-5.

Předpokládaná role VEGF v proliferaci endotelových buněk a migrace během angiogeneze a vaskulogeneze ukazuje na důležitou úlohu receptoru KDR/FLK-1 v těchto procesech. Nemoci jako diabetes mellitus (Folkman, 198, na XI. Kongresu o thrombóze a hemostázi (Vestraeta, et al., eds.), str. 583-596, Leuven University Press, Leuven) a arthritida, stejně jako růst maligních nádorů mohou mít příčinu v nekontrolované angiogenezi. Viz např. Folkman, 1971, N. Engl. J. Med., 285:1 182-1 186. Receptory, na které se VEGF specificky váže, jsou důležitým a silným terapeutickým cílem pro regulaci a modulaci vaskulogeneze a/nebo angiogeneze v řadě vážných onemocnění, která zahrnují abnormální buněčný růst způsobený takovýmito procesy. Plowman, et al., 1994, DN&P, 7(6):334-339. Přesněji, vysoce specifická role receptoru KDR/FLK-1 v neovaskularizaci z něho činí možný cíl pro terapeutické přístupy v léčbě rakoviny nebo jiných nemocí, které zahrnují nekontrolovaný vznik krevních cév.The assumed role of VEGF in endothelial cell proliferation and migration during angiogenesis and vasculogenesis suggests an important role for the KDR / FLK-1 receptor in these processes. Diseases such as diabetes mellitus (Folkman, 198, at the XIth Congress on Thrombosis and Hemostasis (Vestraeta, et al., Eds.), Pp. 583-596, Leuven University Press, Leuven) and arthritis, as well as the growth of malignant tumors may have cause in uncontrolled angiogenesis. See, eg, Folkman, 1971, N. Engl. J. Med., 285: 1182-1186. Receptors to which VEGF specifically binds are an important and potent therapeutic target for the regulation and modulation of vasculogenesis and / or angiogenesis in a number of serious diseases, including abnormal cell growth caused by such processes . Plowman, et al., 1994, DN & P, 7 (6): 334-339. More specifically, the highly specific role of the KDR / FLK-1 receptor in neovascularization makes it a potential target for therapeutic approaches in the treatment of cancer or other diseases involving uncontrolled blood vessel formation.

Tak se jedním svým aspektem tento vynález vztahuje na sloučeniny schopné regulovat a/nebo modulovat tyrozinkinázovou signální transdukci včetně transdukčního signálu KDR/FLK-1 receptoru ·♦♦· · za účelem inhibovat nebo podpořit angiogenezi a/nebo vaskulogenezi, tj. sloučeniny, které inhibují, zabraňují nebo interferují se signálem transdukovaným KDR/FLK-1, jsou-li aktivovány ligandem jako je VEGF. Přestože byla vyslovena domněnka, že sloučeniny tohoto vynálezu působí na receptor nebo jinou sloučeninu podél transdukční dráhy tyrozinkinázového signálu, mohou rovněž působit přímo na nádorové buňky, které jsou výsledkem nekontrolované angiogeneze.Thus, in one aspect, the present invention relates to compounds capable of regulating and / or modulating tyrosine kinase signal transduction including the KDR / FLK-1 receptor transduction signal in order to inhibit or promote angiogenesis and / or vasculogenesis, ie, compounds that inhibit prevent or interfere with the KDR / FLK-1 transduced signal when activated by a ligand such as VEGF. Although it is believed that the compounds of the invention act on the receptor or other compound along the transduction pathway of the tyrosine kinase signal, they may also act directly on tumor cells resulting from uncontrolled angiogenesis.

Ačkoli se nomenklatura pro lidský a myší protějšek druhového receptorů „flk-I“ liší, jsou tyto receptory v mnoha ohledech zaměnitelné. Myší receptor, Flk-1, a jeho lidský protějšek, KDR, sdílejí sekvenční homologii 93,4 % na své intracelulární doméně. Stejně tak myší FLK-I váže lidský VEGF se stejnou afinitou jako myší VEGF, a tudíž je aktivován ligandem odvozeným z jednoho nebo druhého druhu. Millauer et al., 1993, Cell, 72:835-846; Quinn et al., 1993, Proč. Nati. Acd. Sci. USA, 90:7533-7537. FLK-1 rovněž asociuje a následně fosforyluje tyrosin substrátů lidských RTK např. PLC-γ nebo p85), je-li koexprimován v buňkách 293 (linie fibroblastoidních buněk lidských embryonálních ledvin).Although the nomenclature for the human and murine counterpart of the generic "flk-I" receptors is different, these receptors are interchangeable in many respects. The mouse receptor, Flk-1, and its human counterpart, KDR, share sequence homology of 93.4% on their intracellular domain. Similarly, mouse FLK-I binds human VEGF with the same affinity as murine VEGF and is therefore activated by a ligand derived from one or the other species. Millauer et al., 1993, Cell 72: 835-846; Quinn et al., 1993, Proc. Nati. Acd. Sci. USA, 90: 7533-7537. FLK-1 also associates and subsequently phosphorylates tyrosine of human RTK substrates (eg PLC-γ or p85) when co-expressed in 293 cells (human embryonic kidney fibroblastoid cell line).

Pro pochopení KDR receptorů jsou tedy přímo použitelné modely, které jsou založeny na FLK-1 receptorů. Například využití myšího receptorů FLK-1 v metodách určujících sloučeniny, které regulují myší signální transdukční dráhy, je přímo využitelné na identifikaci sloučenin, které mohou být použity na regulaci lidských signálních transdukčních drah, tj. které regulují aktivity spojené s KDR receptorem. Tak chemické sloučeniny identifikované jako inhibitory KDR/FLK-1 in vitro mohou být potvrzeny jako vhodné modely in vivo. Jak myší tak krysí in vivo živočišné modely vykazují výbornou vlastnosti pro vyšetřování klinického potenciálu látek působících na KDR/FLK-1 indukovanou signální transdukční dráhu.Thus, models based on FLK-1 receptors are directly useful for understanding KDR receptors. For example, the use of murine FLK-1 receptors in methods of determining compounds that regulate mouse signal transduction pathways is directly useful for identifying compounds that can be used to regulate human signal transduction pathways, i.e., that regulate KDR receptor-associated activities. Thus, chemical compounds identified as KDR / FLK-1 inhibitors in vitro can be confirmed as suitable in vivo models. Both mouse and rat in vivo animal models exhibit excellent properties for investigating the clinical potential of agents acting on the KDR / FLK-1 induced signal transduction pathway.

Tak v jednom z aspektů je tento vynález zaměřen na sloučeniny, které regulují, modulují a/nebo inhibují vaskulogeneze a/nebo angiogeneze ovlivňováním enzymatické aktivity receptorů KDR/FLK-1 a interferencí se signálem transdukovaným KDR/FLK-1. V jiném svém ·♦·· v • 4 *· 44 4 • · 4 4 4 4··Thus, in one aspect, the present invention is directed to compounds that regulate, modulate and / or inhibit vasculogenesis and / or angiogenesis by affecting the enzymatic activity of KDR / FLK-1 receptors and interfering with the signal transduced by KDR / FLK-1. In another one · ♦ ·· v • 4 * · 44 4 • · 4 4 4 4 ··

4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 • 44 4444 44 444 aspektu je tento vynález zaměřen na sloučeniny, které regulují, modelují a/nebo inhibují signální transdukční dráhu zprostředkovanou KDR/FLK-1 jako terapeutický přístup k léčbě mnoha druhů pevných nádorů včetně, mimo jiných, glioblastomů, melanomů a Kaposiho sarkomu, karcinomů vaječníků, plic, mléčných žláz, prostaty, pankreatu, tlustého střeva a epidermu. Navíc údaje zakládají předpoklad, že podávání sloučenin, které inhibují signální transdukční dráhu zprostředkovanou KDR/FLK-1, může být rovněž použito jako léčba hemangiomu, restenois a diabetické retinopatie.Aspect of the present invention is directed to compounds that regulate, model, and / or inhibit the KDR / FLK-1 mediated signal transduction pathway as a therapeutic approach to the treatment of many solid tumor types including, but not limited to, glioblastomas, melanomas and Kaposi's sarcoma, ovarian, lung, mammary, prostate, pancreatic, colon, and epidermal cancers. In addition, the data suggests that administration of compounds that inhibit KDR / FLK-1 mediated signal transduction pathway can also be used as a treatment for hemangioma, restenois and diabetic retinopathy.

Další aspekt tohoto vynálezu se vztahuje k inhibici vaskulogeneze a angiogeneze dráhami zprostředkovanými dalšími receptory, včetně dráhy zahrnující receptor flt-1.Another aspect of the invention relates to the inhibition of vasculogenesis and angiogenesis by pathways mediated by other receptors, including the pathway comprising the flt-1 receptor.

Signální transdukce zprostředkovaná receptorovou tyrozinkinázou je iniciována extracelulární interakcí se specifickým růstovým faktorem (ligandem), po které následuje dimerizace receptoru, dočasná stimulace aktivity vnitřního proteinu tyrozinkinázy a autofosforylace. Tím se vytvoří vazebná místa pro intracelulární signální transdukční molekuly, což vede ke tvorbě komplexů s celou řadou cytoplazmatických signálních molekul, které zprostředkovávají vhodnou buněčnou odpověď, např. dělení buněk a metabolické účinky na extracelulální mikroprostředí. Viz Schlessinger a Ullrich, 1992, Neuron, 9:1-20.Receptor tyrosine kinase-mediated signal transduction is initiated by extracellular interaction with a specific growth factor (ligand), followed by receptor dimerization, temporary stimulation of tyrosine kinase intrinsic protein activity, and autophosphorylation. This creates binding sites for intracellular signal transduction molecules, resulting in the formation of complexes with a variety of cytoplasmic signal molecules that mediate a suitable cellular response, e.g., cell division and metabolic effects on the extracellular microenvironment. See Schlessinger and Ullrich, 1992, Neuron, 9: 1-20.

Blízká homologie intracelulárních oblastí KDR/FLK-1 s těmito oblastmi na receptoru PDGF-β (50,3 % homologie) a/nebo příbuzném receptoru flt-1 ukazuje na indukci přesahujících signálních transdukčních drah. Například bylo prokázáno, že pro receptor PDGFβ, člen src rodiny, (Twamley, et al., 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90:7696-7700), se fosfatidylinositol-3'-kináza (Hu et al,, 1992, Mol, Cell, Biol,, 12: 981-990), fosfolipáza cy (Kashishian & Kooper, 1993, Mol, Cell, Biol,, 4: 49-51), ras-GTPázu aktivující protein, (Kashishian et al,, 1992, EMBO J,, 1 1: 1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas et al,, 1993, Proč, Nati, Acad, Sci, USA, 10 90: 6939-6943), Grb2 (Arvidsson et al,, 1994, Mol, Cell, Biol,, 14: 6715-6726), a molekuly adaptéru Shc a Nck (Nishimura et al,, 1993, Mol, Cell, Biol,, 13: 6889-6896) vážou φ φThe close homology of the KDR / FLK-1 intracellular regions with these regions at the PDGF-β receptor (50.3% homology) and / or the related flt-1 receptor indicates the induction of overlapping signal transduction pathways. For example, it has been shown that for the PDGFβ receptor, a member of the src family, (Twamley, et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7696-7700), phosphatidylinositol-3'-kinase (Hu et al. ,, 1992, Mol, Cell, Biol ,, 12: 981-990), phospholipase cy (Kashishian & Kooper, 1993, Mol, Cell, Biol ,, 4: 49-51), ras-GTPase activating protein, (Kashishian et. al, 1992, EMBO J, 11: 1373-1382), PTP-ID / syp (Kazlauskas et al, 1993, Proc, Natl, Acad, Sci, USA, 10 90: 6939-6943), Grb2 ( Arvidsson et al, 1994, Mol, Cell, Biol, 14: 6715-6726), and Shc and Nck adapter molecules (Nishimura et al, 1993, Mol, Cell, Biol, 13: 6889-6896) bind φ φ

ΦΦΦΦ

na oblasti obsahující různá autofosforylační místa. Obecně viz Claesson-Welsh, 1994, Prog, Growth Factor Res., 5: 37-54. Je tudíž pravděpodobné, že signální transdukční dráhy aktivované KDR/FLK-1 zahrnují dráhu ras (Rozakis et al,, 1992, Nátuře, 360: 689-692), PI-3'kinázy, dráhy zprostředkovávané src a plcy. Každá z těchto drah může hrát kritickou úlohu v angiogenezním a/nebo vaskulogenezním účinku KDR/FLK-1 v endoteliálních buňkách. V důsledku toho se další aspekt tohoto vynálezu vztahuje k využití těchto organických sloučenin zde popsaných pro modulaci angiogeneze a vaskulogeneze jako procesů, kontrolovaných těmito dráhami.to areas containing various autophosphorylation sites. See generally, Claesson-Welsh, 1994, Prog, Growth Factor Res., 5: 37-54. Therefore, KDR / FLK-1 activated signal transduction pathways are likely to include the ras pathway (Rozakis et al, 1992, Nature, 360: 689-692), PI-3'kinases, src-mediated and plcy-mediated pathways. Each of these pathways can play a critical role in the angiogenic and / or vasculogenic effect of KDR / FLK-1 in endothelial cells. Accordingly, another aspect of the invention relates to the use of these organic compounds described herein for the modulation of angiogenesis and vasculogenesis as processes controlled by these pathways.

A naopak onemocnění související se smršťováním, zkracováním či uzavíráním krevních cév, jako je restenóza, jsou zde rovněž zahrnuty a mohou být léčeny nebo jim může být předcházeno metodami tohoto vynálezu.Conversely, diseases related to shrinkage, contraction, or occlusion of blood vessels, such as restenosis, are also included and can be treated or prevented by the methods of the invention.

Fibrotické poruchy mají souvislost s abnormální tvorbou extracelulární matrix. Příklady fibrotických poruch zahrnují cirhózu jater a poruchy proliferace mesangialních buněk. Cirhóza jater je charakterizována zvýšením složek extracelulární matrix vedoucím k tvorbě jaterních jizev. Zvýšená extracelulární matrix vedoucí ke zjizvení jater může být rovněž způsobena virovou infekcí jako je žloutenka. Vypadá to, že hlavní roli v cirhóze jater hrají tukové buňky. Další implikované fibrotické poruchy zahrnují atherosklerózu.Fibrotic disorders are associated with abnormal extracellular matrix formation. Examples of fibrotic disorders include liver cirrhosis and mesangial cell proliferative disorders. Liver cirrhosis is characterized by an increase in extracellular matrix components leading to the formation of liver scars. Increased extracellular matrix leading to scarring of the liver can also be caused by a viral infection such as jaundice. Fat cells seem to play a major role in liver cirrhosis. Other implied fibrotic disorders include atherosclerosis.

Poruchy proliferace mezangiálních buněk souvisí s poruchami zapříčiněnými abnormální proliferaci mezangiálních buněk. Mezangiální proliferační poruchy zahrnují různá lidská ledvinová onemocnění, jako je glomerulonefritida, diabetická nefropatie a maligní nefroskleróza spolu s takovými onemocněními jako jsou syndromy trombotického onemocnění mikrocév, odmítání transplantátů a glomerulopatie. Na procesu proliferace mazangiálních buněk se podílí RTK PDGFR. Floege et al., 1993, Kidney International 43:47S54S.Mesangial cell proliferative disorders are associated with disorders caused by abnormal mesangial cell proliferation. Mesangial proliferative disorders include various human renal diseases such as glomerulonephritis, diabetic nephropathy and malignant nephrosclerosis along with such diseases as thrombotic microvascular disease syndromes, transplant rejection and glomerulopathy. RTK PDGFR is involved in the process of mazangial cell proliferation. Floege et al., 1993, Kidney International 43: 47S54S.

Mnoho rakovin je poruchami proliferace buněk a jak již bylo dříve uvedeno, proteinkinázy jsou spojeny s poruchami proliferaceMany cancers are cell proliferative disorders and, as mentioned previously, protein kinases are associated with proliferative disorders

ΦΦ φ φφ φφ φ φ ·Φ φ φ φ ♦ • φ φ · * φ φ φ φ · φφφφ φφφ φφ φφφφ buněk. Proto není překvapivé, že takové proteinkinázy jako jsou například kinázy z rodiny RTK, jsou spojovány se vznikem rakoviny. Některé z těchto receptorů, jako je EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cancer 63:227-233, Torp et al., 1992, APMIS 100:713-719) HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244:707-712) a PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncogene, 7:627-633) jsou ve zvýšené míře exprimovány v mnoha nádorech a/nebo persistentně aktivovány autokrinními smyčkami. Ve skutečnosti byla v nejčastějších a nejtěžších rakovinách prokázána nadměrná exprese těchto receptorů (Akbasak a SunerAkbasak et al., 1992, J. Neurol. Sci., 111:119-133, Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61:249-273, Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90:1352-1360) a autokrinní smyčky (Lee a Donoghue, 1992, J. Cell. Biol., 1 18:1057-1070, Korc. et al., supra, Akbasak a SunerAkbasak et al., supra). Například EGFR je spojen s karcinomem plochých buněk, astrocytomem, glioblastomem, rakovinou hlavy a krku, rakovinou plic a žlučníku. HER2 je spojen s rakovinou prsu, vaječníků, žaludku, plic, slinivky a žlučníku. PDGFR je spojován s glioblastomem a melanomem spolu s rakovinou plic, vaječníků a prostaty. RTK c-met je rovněž spojován s tvorbou maligních nádorů. Například je c-met spojován, mimo jiné typy rakovin, s kolorektálním, thyroidním, pankreatickým, gastrickým a jaterním karcinomem a lymfomem. Navíc c-met je spojen s leukémií. Nadměrná exprese genu c-met je rovněž zjišťována u pacientů s Hodgkinsovou nemocí a Burkittovou nemocí.ΦΦ φ φ φ · · · ♦ ♦ ♦ φ · * * φ φ · φ φ φ φ φ φ φ buněk buněk buněk Therefore, it is not surprising that protein kinases such as RTK family kinases are associated with cancer development. Some of these receptors, such as EGFR (Tuzi et al., 1991, Br. J. Cancer 63: 227-233, Torp et al., 1992, APMIS 100: 713-719) HER2 / neu (Slamon et al., 1989, Science 244: 707-712) and PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncogene, 7: 627-633) are overexpressed in many tumors and / or persistently activated by autocrine loops. In fact, overexpression of these receptors has been demonstrated in the most common and severe cancers (Akbasak and SunerAkbasak et al., 1992, J. Neurol. Sci., 111: 119-133, Dickson et al., 1992, Cancer Treatment Res. 61: 249 -273, Korc et al., 1992, J. Clin. Invest. 90: 1352-1360) and autocrine loops (Lee and Donoghue, 1992, J. Cell. Biol., 1 18: 1057-1070, Korc. Et al. , supra, Akbasak and SunerAkbasak et al., supra). For example, EGFR is associated with flat cell carcinoma, astrocytoma, glioblastoma, head and neck cancer, lung and gallbladder cancer. HER2 is associated with breast, ovarian, stomach, lung, pancreatic and gallbladder cancer. PDGFR has been associated with glioblastoma and melanoma along with lung, ovarian and prostate cancer. RTK c-met is also associated with the formation of malignant tumors. For example, c-met is associated, inter alia, with cancers, with colorectal, thyroid, pancreatic, gastric, and liver cancer and lymphoma. In addition, c-met is associated with leukemia. C-met gene overexpression is also found in patients with Hodgkins disease and Burkitt disease.

IGF-IR, kromě toho, že má souvislost s nutriční podporou a diabetes typu II, je rovněž spojován s několika typy rakovin. Například byl IGF-I implikován jako autokrinní růstový stimulátor pro několik typů nádorů, např. buňky lidského karcinomu prsu (Artaega et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1418-1423) a nádorové buňky plic (Macauley at al., 1990, Cancer Res., 50:251 1-2517). Dále IGF-I, zatímco je integrální součástí normálního růstu a diferenciace nervového systému, je zřejmě rovněž autokrinní stimulátor lidských gliomů. Sandgerg-Nordqvist et al., 1993, Cancer Res. 53:2475-2478. Důležitost IGF-IR a jeho ligandů pro proliferaci buněk je dále podporována skutečností, že mnoho typů ·· · ·Φ ·· ·· ♦ · ·· » · · * » · • · · « · · * • · · · * ···· • · · « « · · «··· ··· ·· »··· *· buněk v kultuře (fibroblasty, epiteliální buňky, buňky hladkého svalstva, T-lymfocyty, myeloidní buňky, chondrocyty a osteoblasty (kmenové buňky kostní dřeně) jsou stimulovány k růsty prostřednictvím IGF-I. Goldring a Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression, 1:301326. V řadě posledních publikací Baserba navrhuje, že IGF-IR hraje ústřední roli v mechanizmu transformace a jako takový může být přednostním cílem pro terapeutické zásahy do širokého spektra lidských zhoubných bujení. Baserga, 1995, Cancer Res., 55:249-252, Baserga, 1994, Cell 79:927-930, Coppola et al., 1994, Mol. Cell. Biol., 14:45884595.IGF-IR, in addition to being related to nutritional support and type II diabetes, is also associated with several cancers. For example, IGF-I has been implicated as an autocrine growth stimulator for several types of tumors, such as human breast cancer cells (Artaega et al., 1989, J. Clin. Invest. 84: 1418-1423) and lung tumor cells (Macauley at al. , 1990, Cancer Res., 50: 251-22517). Furthermore, IGF-I, while being an integral part of normal growth and differentiation of the nervous system, appears to be also an autocrine stimulator of human gliomas. Sandgerg-Nordquist et al., 1993, Cancer Res. 53: 2475-2478. The importance of IGF-IR and its ligands for cell proliferation is further supported by the fact that many types of IGF-IR and its ligands for cell proliferation are further supported. • cells in culture (fibroblasts, epithelial cells, smooth muscle cells, T-lymphocytes, myeloid cells, chondrocytes and osteoblasts (stem cells) bone marrow cells) are stimulated to grow by IGF-I. Goldring and Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression, 1: 301326. In a number of recent publications, Baserba suggests that IGF-IR plays a central role in the mechanism of transformation and as such may be preferred target for therapeutic interventions in a wide range of human malignancies Baserga, 1995, Cancer Res., 55: 249-252, Baserga, 1994, Cell 79: 927-930, Coppola et al., 1994, Mol. 14: 45884595.

STK byly implikovány v mnoha typech rakovin včetně, a především, v rakovině prsu (Cance, et al., Int. J. Cancer, 54:571-77 (1993)).STKs have been implicated in many types of cancers including, and in particular, breast cancer (Cance, et al., Int. J. Cancer, 54: 571-77 (1993)).

Spojení mezi abnormální aktivitou PK a onemocnění není omezeno pouze na rakovinu. Například RTK jsou rovněž spojeny s nemocemi jako lupénka, diabetes mellitus, endometrióza, angiogeneze, vývoj ateromatických plaků, Alzheimerovou nemocí, von HippelLindauovou nemocí, epidermální hyperproliferací, neurodegenerativními onemocněními, makulární degenerace související s věkem a hemangiom. Například EGFR byl indikován v hojení poranění pokožky a rohovky. V diabetes mellitus typu II jsou indikovány defekty IGF-IR a insulin-R. Složitější korelace mezi specifickými RTK a jejich terapeutické indikace jsou více popsány v Plowman et al., 1994, DN&P 7:334-339.The association between abnormal PK activity and disease is not limited to cancer. For example, RTKs are also associated with diseases such as psoriasis, diabetes mellitus, endometriosis, angiogenesis, atheromatic plaque development, Alzheimer's disease, von HippelLindau disease, epidermal hyperproliferation, neurodegenerative diseases, age-related macular degeneration and hemangioma. For example, EGFR has been indicated in the healing of skin and corneal injury. IGF-IR and insulin-R defects are indicated in type II diabetes mellitus. More complex correlations between specific RTKs and their therapeutic indications are more described in Plowman et al., 1994, DN&P 7: 334-339.

Jak již bylo uvedeno, nejen RTK, ale kromě jiných také CTK src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lek, blk, hek, fgr a yrk (přezkoumány Bolenem et al., 1992, FASEB J., 6:3403-3409) se podílí na proliferačních a metabolických signálních transdukčních drahách ,a tudíž lze očekávat, a bylo to předvedeno, že se podílejí na mnoha poruchách zprostředkovávaných proteintyrozinkinázami, na které je směřován tento vynález. Například bylo dokázáno, že mutovaný src (v-src) je u kuřat onkoproteinem (pp60^{v src})· Navíc jeho buněčný homolog, protoonkogen pp60^c'^src přenáší onkogenní signál na mnoho receptorů.As mentioned above, not only RTK but also CTK src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lek, blk, hek, fgr and yrk (reviewed by Bolen et al., 1992, FASEB J., 6: 3403 -3409) is involved in the proliferative and metabolic signal transduction pathways and thus can be expected to have been implicated in the many protein tyrosine kinase mediated disorders to which this invention is directed. For example, mutated src (v-src) has been shown to be an oncoprotein in chickens (pp60 ^{in src} ). In addition, its cellular homologue, the proto60 oncogenic pp60 ^c ' ^src, transmits the oncogenic signal to many receptors.

·· ·· · ·<· ·· ·· ···· * · · · *9 • · · · · · · · • ···· · 9 9 9 9·························· On 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9

9999 999 99 9999 99 9999999 999 99

Nadměrná exprese EGFR nebo HER2/bez v nádorech vede ke konstitutivní aktivaci pp60^c'^src , což je charakteristické pro maligní buňky, ale nevyskytuje se v normálních buňkách. Na druhé straně myši, které postrádají expresi c-src, vykazují osteopetrotický fenotyp, značící klíčovou účast c-src ve funkci osteoklastů a možného zapojení do souvisejících poruch.Overexpression of EGFR or HER2 / no in tumors leads to constitutive activation of pp60 ^c ' ^src , which is characteristic of malignant cells but does not occur in normal cells. On the other hand, mice lacking c-src expression show an osteopetrotic phenotype, indicating a key involvement of c-src in osteoclast function and possible involvement in related disorders.

Podobně byl implikován Zap70 v signalizaci T-buněk, což může mít souvislost autoimunitními poruchami.Similarly, Zap70 has been implicated in T-cell signaling, which may be related to autoimmune disorders.

STK jsou zapojeny do zánětů, autoimunitních onemocnění, imunoodpovědí a hyperproliferačních poruch, jako je restenóza, fibróza, lupénka, osteoarhtritida a revmatická arthritida.STLs are involved in inflammation, autoimmune diseases, immune responses and hyperproliferative disorders such as restenosis, fibrosis, psoriasis, osteoarthritis and rheumatoid arthritis.

PK hrají rovněž roli v implantaci embrya. Tak sloučeniny tohoto vynálezu mohou poskytovat účinnou metodu pro prevenci takové implantace embrya, a tím být užitečnou látkou pro kontrolu porodnosti.PKs also play a role in embryo implantation. Thus, the compounds of the invention may provide an effective method for preventing such embryo implantation and thus be a useful birth control agent.

A konečně jak RTK, tak CTK jsou v současnosti podezírány z účasti na hyperimunitních poruchách.Finally, both RTK and CTK are currently suspected of participating in hyperimmune disorders.

Metoda pro identifikaci chemické sloučeniny, která moduluje katalytickou aktivitu jedné nebo více výše diskutovaných proteinkináz je dalším aspektem tohoto vynálezu. Tato metoda zahrnuje kontaktováni buněk exprimujících požadovanou proteinkinázu s některou sloučeninou tohoto vynálezu (nebo její solí či proléčivem) a sledování těchto buněk, jaký účinek na ně daná sloučenina měla. Tento účinek může být pozorovatelný buď prostým okem nebo pomocí nástrojů, dále změnou nebo nepřítomností změny fenotypu buněk. Takovou změnou nebo absencí změny ve fenotypu sledovaných buněk může být například, mimo jiné, změna nebo absence změny katalytické aktivity proteinkinázy v buňkách nebo změna či absence změny v interakci proteinkinázy s přirozeným vazebným partnerem.A method for identifying a chemical compound that modulates the catalytic activity of one or more of the protein kinases discussed above is another aspect of the invention. The method involves contacting cells expressing the desired protein kinase with a compound of the invention (or a salt or prodrug thereof) and monitoring the cells for an effect on the compound. This effect can be observed either by the naked eye or by means of tools, further by a change or absence of a change in the cell phenotype. Such a change or absence of a change in the phenotype of the cells of interest may be, inter alia, a change or absence of a change in the catalytic activity of the protein kinase in the cells or a change or absence of a change in protein kinase interaction with the natural binding partner.

Příklady účinku řady exemplárních sloučenin tohoto vynálezu na několik PTK jsou uvedeny v Tabulce 1 a 2 v oddíle Biologické příklady níže. Uvedené sloučeniny a data nejsou v žádném případě konstruovány jako omezení rozsahu tohoto vynálezu.Examples of the effect of many exemplary compounds of the invention on several PTKs are provided in Tables 1 and 2 in the Biological Examples section below. Said compounds and data are not to be construed as limiting the scope of the invention in any way.

5. Farmaceutické přípravky a jejich použití5. Pharmaceutical preparations and their use

Sloučeniny podle předloženého vynálezu, jejich proléčiv nebo fyziologicky přijatelné soli buď sloučenin podle předloženého vynálezu anebo jejich proléčiv, mohou být aplikovány jako takové lidským subjektům nebo mohou být aplikovány formou farmaceutických přípravků, ve kterých jsou výše uvedené látky smíchány s vhodnými nosiči nebo vehikulem. Techniky přípravy preparátů a aplikace léčiv mohou být nalezeny v „Remington's Pharmacological Sciences,“ Mack Publishing Co., Easton, PA, nejnovější vydání.The compounds of the present invention, prodrugs thereof, or physiologically acceptable salts of either the compounds of the present invention or prodrugs thereof, can be administered as such to human subjects, or they can be administered in the form of pharmaceutical compositions in which the above substances are mixed with suitable carriers or vehicles. Formulation and drug delivery techniques can be found in "Remington's Pharmacological Sciences," by Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition.

Způsoby aplikaceMethods of application

Termín „aplikace“ nebo „aplikování“, jak je používán zde, se vztahuje na podání sloučeniny, soli nebo proléčiva podle předloženého vynálezu nebo farmaceutického přípravku obsahujícího sloučeninu, sůl nebo proléčiva tohoto vynálezu do organizmu za účelem prevence nebo ošetření poruch souvisejících s PK.The term "administration" or "administration" as used herein refers to the administration to a body of a compound, salt or prodrug of the present invention or a pharmaceutical composition comprising a compound, salt or prodrug of the invention for the prevention or treatment of PK-related disorders.

Vhodné způsoby aplikace mohou zahrnovat, ale není to nikterak limitováno, perorální, rektální, transmukózní nebo intestinální aplikaci nebo intramuskulámí, subkutánní, intramedulární, intratekální, přímo intraventrikulární, intravenózní, intravitreální, intraperitoneální, intranazální nebo intraokulární injekce. Výhodné způsoby aplikace jsou perorální a parenterální způsoby.Suitable routes of administration may include, but are not limited to, oral, rectal, transmucosal or intestinal or intramuscular, subcutaneous, intramedullary, intrathecal, directly intraventricular, intravenous, intravitreal, intraperitoneal, intranasal or intraocular injection. Preferred routes of administration are oral and parenteral routes.

Nebo lze aplikovat sloučeniny místně spíše než soustavně, např. injekcí sloučeniny přímo do pevného nádoru, často v preparátu s depotním nebo trvalým uvolňováním.Alternatively, the compounds may be administered topically rather than systematically, e.g., by injecting the compound directly into a solid tumor, often in a depot or sustained release formulation.

Dále lze aplikovat léčivo v systému s cílovým dodáním léčiva, např. léčivo pokryté lipozómy s specifickou protilátkou proti určitému nádoru. Lipozómy budou určeny a vytvářeny selektivně podle charakteru nádoru.Further, the drug may be administered in a target drug delivery system, eg, a drug coated with liposomes with a specific antibody against a particular tumor. Liposomes will be determined and generated selectively according to the nature of the tumor.

• ·• ·

Farmaceutické přípravkyPharmaceutical preparations

Farmaceutické přípravky podle předloženého vynálezu mohou být připravovány způsoby, které jsou známy z dosavadního stavu techniky, např. pomocí standardního míchání, rozpouštění, granulování, přípravy dražé, roztírání, emulgace, zapouzdření, uzavření(do tuhé látky) nebo lyofilizací.The pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared by methods known in the art, for example by means of standard mixing, dissolving, granulating, dragee-making, spreading, emulsifying, encapsulating, encapsulating, or lyophilizing.

Farmaceutické přípravky pro použití podle předloženého vynálezu mohou být připravovány standardním způsobem použitím jednoho nebo více fyziologicky přijatelných nosiěů obsahujících vehikulum a pomocné prostředky, které usnadňují zpracování aktivních látek do preparátů, jenž mohou být farmaceuticky používány. Vlastní příprava záleží na vybraném způsobu aplikace.Pharmaceutical compositions for use according to the present invention can be prepared in a standard manner using one or more physiologically acceptable carriers comprising a vehicle and excipients which facilitate processing of the active ingredients into preparations which can be used pharmaceutically. The preparation itself depends on the selected method of application.

Pro dávky ve formě injekce mohou být sloučeniny podle vynálezu připravovány ve vodných roztocích, výhodně ve fyziologicky kompatibilních pufrech, např. Hankův roztok, fyziologický roztok. Pro transmukózní aplikaci jsou v preparátech používány takové vhodné penetrátory, známé z dosavadního stavu techniky, které jsou schopny prostoupit bariérou.For injectable doses, the compounds of the invention may be prepared in aqueous solutions, preferably in physiologically compatible buffers, e.g. Hank's solution, saline. For transmucosal application, suitable penetrants known from the prior art that are able to cross the barrier are used in the compositions.

Pro dávky ve formě perorální aplikace mohou být sloučeniny připraveny spojením aktivních sloučenin s farmaceuticky přijatelnými nosiči, které jsou známy z dosavadního stavu techniky. Takové nosiče umožňují sloučeninám podle předloženého vynálezu, aby byly připravovány ve formě tablet, pilulek, pastilek, dražé, pouzder, tekutých roztoků, gelů, sirupů, zahuštěných suspenzí ,suspenzí, apod. pro perorální příjem pacientem. Farmaceutické preparáty pro perorální použití mohou být vyrobeny použitím pevných excipientů, případně třením výsledné směsi, a zpracováním směsi granulí, po přidání dalších vhodných pomocných látek, pokud je požadováno, k obdržení tablet nebo dražé. Použitelné excipienty jsou zejména plniva, např. cukry, včetně laktózy, sacharózy, mannitolu nebo sorbitolu, celulózových preparátů, např. kukuřičný škrob, pšeničný škrob, rýžový škrob a bramborový škrob a jiné látky, např. želatina, tragant, methylcelulóza, ®For dosages in the form of oral administration, the compounds can be prepared by combining the active compounds with pharmaceutically acceptable carriers known in the art. Such carriers allow the compounds of the present invention to be prepared in the form of tablets, pills, lozenges, dragees, capsules, lotions, gels, syrups, thickened suspensions, suspensions, and the like for oral ingestion by a patient. Pharmaceutical preparations for oral use can be made using solid excipients, optionally by rubbing the resulting mixture, and processing the mixture of granules, after adding other suitable excipients, if desired, to obtain tablets or dragees. Useful excipients are, in particular, fillers such as sugars, including lactose, sucrose, mannitol or sorbitol, cellulose preparations such as corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch, and other substances such as gelatin, tragacanth, methylcellulose, ®.

hydroxypropylmethylcelulóza, karboxymethylcelulóza sodná, a/nebo pólyvinylpyrrolidon (PVP). Pokud je třeba, může být přidána také látka zajišťující rozpad tablety po požití, např. síťový polyvinylpyrrolidon, agar nebo kyselina alginová. Může být používána také sůl, např. alginát sodný.hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, and / or polyvinylpyrrolidone (PVP). If desired, a tablet disintegrant may also be added after ingestion, such as cross-linked polyvinylpyrrolidone, agar, or alginic acid. A salt such as sodium alginate may also be used.

Dražé mají vhodnou povrchovou vrstvu. Pro tento účel mohou být používány koncentrované roztoky cukru, které případně obsahuje arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidon, karbopolgel, polyethylenglykol, a/nebo oxid titaniěitý, lakařské roztoky a vhodná organická rozpouštědla nebo směs rozpouštědel. Do povrchových vrstev tablet nebo dražé mohou být přidána barviva nebo pigmenty kvůli rozpoznání nebo charakterizování různých kombinací dávek aktivní sloučeniny.Dragees have a suitable coating. For this purpose, concentrated sugar solutions may be used which optionally contain gum arabic, talc, polyvinylpyrrolidone, carbopolgel, polyethylene glycol, and / or titanium dioxide, lacquer solutions and suitable organic solvents or solvent mixtures. Dyestuffs or pigments may be added to the surface layers of tablets or dragees to identify or characterize different combinations of active compound doses.

Farmaceutické přípravky, které mohou být používány perorálně, zahrnují zasunovací pouzdra vyrobená z želatiny, jakož i měkká, uzavřená pouzdra vyrobená z želatiny a změkčovadla, např. glycerol nebo sorbitol. Zasunovací pouzdra mohou obsahovat aktivní složky v příměsi s plnivem, např. laktózou, pojivém, např. škrob, a/nebo lubrikans, např. talek nebo stearát hořečnatý, případně stabilizátory.Pharmaceutical preparations that can be used orally include push-fit shells made of gelatin as well as soft, sealed shells made of gelatin and a plasticizer, such as glycerol or sorbitol. The push-fit sheaths may contain the active ingredients in admixture with a filler, eg lactose, a binder, eg starch, and / or a lubricant, eg talc or magnesium stearate, optionally stabilizers.

V měkkých pouzdrech mohou být aktivní sloučeniny rozpuštěny nebo rozptýleny ve vhodných tekutinách, např. oleje mastných kyselin, minerální olej nebo tekuté polyethylenglykoly. Také mohou být v těchto přípravcích přidány stabilizátory.In soft capsules, the active compounds may be dissolved or dispersed in suitable liquids, e.g., fatty acid oils, mineral oil, or liquid polyethylene glycols. Stabilizers may also be added in these formulations.

Pro aplikaci ve formě inhalace jsou sloučeniny pro použití podle předloženého vynálezu vhodně uvolňovány ve formě aerosolového spreje pomocí tlakovacího zařízení nebo rozprašovače a vhodné hnací látky, například, bez jakéhokoliv omezení, dichlordifluormethan, trichlorfluormethan, dichlortetrafluorethan nebo oxid uhličitý.For administration by inhalation, the compounds for use in the present invention are suitably released in the form of an aerosol spray by means of a pressurizer or nebulizer and a suitable propellant, for example, without limitation, dichlorodifluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane or carbon dioxide.

V případě natlakovaného aerosolu může být dávka regulována spec. ventilem k zajištění dávkovaného množství. Pouzdra a náplně, např. z želatiny, pro použití v inhalovači nebo insuflatoru mohou být připravena s obsahem práškové směsi sloučeniny a vhodné práškové báze, např. laktóza nebo škrob.In the case of a pressurized aerosol, the dose may be controlled by spec. valve to secure the dosing amount. Shells and cartridges, eg of gelatin, for use in an inhaler or insufflator may be prepared containing a powder mix of the compound and a suitable powder base, eg lactose or starch.

·· ·· ·· • · · · · · • · · · ··· ·· ·· · · · · · · · · ·

Sloučeniny mohou být také připraveny pro parenterální aplikaci, např. injekcí bolusu nebo kontinuální infúzi. Preparáty pro injekci mohou být v formě jednotné dávky, např. v ampulích, nebo v obalech na více dávek s přidanou konzervační látkou. Přípravky mohou být také ve formě suspenzí, roztoků nebo emulzí v olejovitém nebo vodném nosiči a mohou také obsahovat pomocné látky, např. suspendační prostředky, stabilizační prostředky a/nebo dispergující prostředky.The compounds may also be prepared for parenteral administration, eg, by bolus injection or continuous infusion. Formulations for injection may be presented in unit dosage form, e.g., in ampoules, or in multi-dose containers, with an added preservative. The compositions may also be in the form of suspensions, solutions, or emulsions in an oily or aqueous carrier, and may also contain excipients such as suspending, stabilizing and / or dispersing agents.

Farmaceutické přípravky pro parenterální aplikaci zahrnují vodné roztoky ve vodě rozpustných forem, např., ale není to nikterak limitováno, soli aktivní sloučeniny. Dále suspenze aktivní sloučeniny mohou být připraveny v lipofilním nosiči. Vhodné lipofilní nosiče zahrnují oleje mastných kyselin, např. sezamový olej, syntetické estery mastných kyselin, např. ethyl oleát a triglyceridy nebo látky, např. lipozómy. Vodné injekční suspenze mohou obsahovat látky, které zvyšují viskozitu suspenze, např. karboxymethylcelulóza sodná, sorbitol nebo dextran. Případně mohou také suspenze obsahovat vhodné stabilizační prostředky a/nebo agens, které zvyšují rozpustnost sloučenin, čímž umožní přípravu vysoce koncentrovaných roztoků.Pharmaceutical formulations for parenteral administration include aqueous solutions of water-soluble forms, eg, but not limited to, salts of the active compound. Further, suspensions of the active compound may be prepared in a lipophilic carrier. Suitable lipophilic carriers include fatty acid oils such as sesame oil, synthetic fatty acid esters such as ethyl oleate, and triglycerides or substances such as liposomes. Aqueous injection suspensions may contain substances that increase the viscosity of the suspension, such as sodium carboxymethylcellulose, sorbitol, or dextran. Optionally, the suspensions may also contain suitable stabilizing agents and / or agents which increase the solubility of the compounds, thereby allowing the preparation of highly concentrated solutions.

Nebo před použitím může být aktivní složka v práškové formě přimíchána s vhodným nosičem, např. sterilní voda neobsahující pyrogen.Alternatively, the active ingredient in powder form may be admixed with a suitable carrier, e.g. sterile pyrogen-free water, before use.

Sloučeniny mohou také být připravovány ve formě rektálních přípravků, např. čípky nebo retenční střevní nálevy, použitím, např., standardních čípkových základů, např. kakaový olej nebo jiné glyceridy.The compounds may also be prepared in the form of rectal formulations, eg, suppositories or retention enemas, using, eg, standard suppository bases, eg, cocoa oil or other glycerides.

Vedle výše popsaných preparátů mohou být sloučeniny také připravovány ve formě depotních přípravků. Takové preparáty s dlouhou dobou působení mohou být aplikovány implantací (např. subkutánně nebo intramuskulárně) nebo intramuskulární injekcí. Sloučeniny tohoto vynálezu mohou být připravovány pro tento způsob aplikace s vhodnými polymerními nebo hydrofóbními látkami (např. v emulzi s farmakologicky přijatelným olejem), s iontovými měniči nebo jako těžko rozpustné soli.In addition to the preparations described above, the compounds may also be prepared in the form of depot preparations. Such long acting formulations may be administered by implantation (eg, subcutaneously or intramuscularly) or by intramuscular injection. The compounds of the invention may be prepared for this method of administration with suitable polymeric or hydrophobic substances (eg, in an emulsion with a pharmacologically acceptable oil), ion exchangers, or as sparingly soluble salts.

• ·• ·

Příklad farmaceuticky přijatelného nosiče pro hydrofobní sloučeniny podle vynálezu, ale není to nikterak limitováno, je latentní rozpouštědlo obsahující benzylalkohol, nepolární surfaktant, organický polymer mísitelný s vodou a vodná fáze, např. latentní rozpouštědlo VPD. VPD je roztok 3% w/v benzylalkoholu, 8% w/v nepolárního surfaktantu Polysorbátu 80™ a 65% w/v polyethylenglykolu 300, připraveného do objemu v absolutním ethanolu. Latentní rozpouštědlo VPD (VPD:D5W) se skládá z VPD zředěného 1:1 s 5% dextrózou ve vodném roztoku. Toto latentní rozpouštědlo dobře rozpouští hydrofobní sloučeniny a má nízkou toxicitu při soustavném podávání. Samozřejmě, že poměrné díly tohoto latentního rozpouštědla se mohou podstatně lišit, nicméně by měly být takové, aby se neporušily jeho rozpustné a toxické vlastnosti. Dále charakter komponent tohoto latentního rozpouštědla se může být odlišný: například mohou být místo Polysorbátu 80™ používány jiné málo toxické nepolární surfaktanty, rozměry částí polyethylenglykolu se mohou lišit, polyethylenglykol může být nahrazen jinými biokompatibilními polymery, např. póly vinylpyrrolidonem a jinými cukry nebo polysacharidy mohou nahradit dextrózu.An example of a pharmaceutically acceptable carrier for the hydrophobic compounds of the invention, but is not limited to, is a latent solvent containing benzyl alcohol, a non-polar surfactant, a water-miscible organic polymer, and an aqueous phase, e.g., a latent VPD solvent. VPD is a solution of 3% w / v benzyl alcohol, 8% w / v non-polar Polysorbate 80 ™ surfactant, and 65% w / v polyethylene glycol 300, prepared in volume in absolute ethanol. The VPD latent solvent (VPD: D5W) consists of 1: 1 diluted VPD with 5% dextrose in aqueous solution. This latent solvent dissolves the hydrophobic compounds well and has a low toxicity upon continuous administration. Of course, the proportions of this latent solvent may vary substantially, but should be such that its soluble and toxic properties are not impaired. Furthermore, the nature of the components of this latent solvent may be different: for example, other low-toxic non-polar surfactants may be used instead of Polysorbate 80 ™, the dimensions of polyethylene glycol portions may vary to replace dextrose.

Nebo mohou být pro hydrofobní farmaceutické sloučeniny používány jiné způsoby podání. Lipozómy a emulze jsou velmi dobře známé příklady pojiv nebo nosičů používaných při podávání hydrofóbních léčiv. Kromě toho mohou být používána určitá organická rozpouštědla, např. dimethylsulfoxid, ačkoliv často za cenu větší toxicity.Alternatively, other modes of administration may be used for the hydrophobic pharmaceutical compounds. Liposomes and emulsions are well known examples of binders or carriers used in the administration of hydrophobic drugs. In addition, certain organic solvents such as dimethylsulfoxide may be used, although often at the cost of greater toxicity.

Dále mohou být sloučeniny podávány použitím systému s postupným uvolňováním, např. semipermeabilní matrice pevných hydrofóbních polymerů obsahujících terapeutické agens. Byly zavedeny různé materiály s postupným uvolňováním a jsou dobře známy odborné veřejnosti. Pouzdra s postupným uvolňováním mohou, v závislosti na jejich chemickém charakteru, uvolňovat sloučeniny po několik týdnů až stovky dnů. V závislosti na chemickém původu (charakteru) a • · · · · 99 99 9 • ··· 9 9 9 9 9 999 • · · · · · · · • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 9 9Further, the compounds may be administered using a sustained release system, eg, a semipermeable matrix of solid hydrophobic polymers containing the therapeutic agent. Various sustained release materials have been introduced and are well known to the expert public. Sustained-release shells may, depending on their chemical nature, release compounds for several weeks to hundreds of days. Depending on the chemical origin (character) and • 9 99 9 9 • 9 9 9 9 9 999 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 9999 99 999 biologické stabilitě mohou být pro stabilizaci proteinů používány doplňkové koncepce.9999 999 99 9999 99 999 Additional concepts can be used to stabilize proteins.

Farmaceutické přípravky mohou také obsahovat vhodné pevné nebo gelové nosiče nebo excipienty. Příklady takových nosičů nebo excipientů zahrnují, ale není to nikterak omezeno, uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry, škroby, deriváty celulózy, želatinu a polymery, např. polyethylenglykoly.The pharmaceutical preparations may also contain suitable solid or gel carriers or excipients. Examples of such carriers or excipients include, but are not limited to, calcium carbonate, calcium phosphate, various sugars, starches, cellulose derivatives, gelatin, and polymers such as polyethylene glycols.

Hodně PK modulujících sloučenin podle vynálezu může být ve formě fyziologicky přijatelných solí, kde patentované sloučeniny mohou tvořit negativně nebo pozitivně nabité částice. Příklad solí, ve kterých sloučenina tvoří pozitivně nabitou část, zahrnují, ale není to nikterak limitováno, kvartérní amonné soli (podle zde uvedené definice), např. hydrochlorid, sulfát, uhličitan, laktát, tartarát, maleát, sukcinát, kde dusíkový atom kvartérní amonné skupiny je dusík vybrané sloučeniny tohoto vynálezu, která se nechala reagovat s příslušnou solí. Soli, ve kterých sloučeniny tohoto vynálezu tvoří negativně nabité částice zahrnují, ale není to nikterak limitováno, sodné, draselné, vápenaté a hořečnaté soli tvořené reakcí skupiny karboxylové kyseliny ve sloučenině s příslušnou bází (např. hydroxid sodný (NaOH), hydroxid draselný (KOH), hydroxid vápenatý (Ca(OH)₂), atd.Many PK modulating compounds of the invention may be in the form of physiologically acceptable salts, where the patented compounds may form negatively or positively charged particles. Examples of salts in which the compound forms a positively charged moiety include, but are not limited to, quaternary ammonium salts (as defined herein), e.g., hydrochloride, sulfate, carbonate, lactate, tartrate, maleate, succinate, wherein the quaternary ammonium nitrogen atom group N is a selected compound of the invention which is reacted with the corresponding salt. Salts in which the compounds of this invention form negatively charged particles include, but are not limited to, sodium, potassium, calcium and magnesium salts formed by reacting a carboxylic acid group in a compound with an appropriate base (e.g., sodium hydroxide (NaOH), potassium hydroxide (KOH) ), calcium hydroxide (Ca (OH) ₂ ), etc.

DávkyBenefits

Farmaceutické přípravky vhodné pro použití v předloženém vynálezu zahrnují přípravky, kde aktivní složky jsou obsaženy v takovém množství, které je potřebné k dosažení určeného záměru, tzn. modulaci aktivity PK nebo prevenci nebo ošetření poruch souvisejících s PK.Pharmaceutical formulations suitable for use in the present invention include formulations wherein the active ingredients are included in an amount necessary to achieve the intended purpose, i. modulating PK activity or preventing or treating PK related disorders.

Přesněji řečeno, terapeuticky účinné množství znamená množství sloučeniny účinné k prevenci, zmírnění nebo zlepšení příznaků onemocnění nebo prolongování přežití subjektu, který je ošetřován.More specifically, a therapeutically effective amount means an amount of a compound effective to prevent, ameliorate, or ameliorate the symptoms of the disease or prolong the survival of the subject being treated.

• ·• ·

Stanovení terapeuticky účinného množství je v rámci způsobilosti odborné veřejnosti, zejména v souvztažnosti se zde podrobně uvedenou popisnou částí.Determination of a therapeutically effective amount is within the skill of the artisan, particularly in conjunction with the descriptive portion detailed herein.

Pro jakoukoliv zde používanou sloučeninu ve způsobech podle vynálezu může být na počátku terapeuticky účinné množství této sloučeniny navrženo podle provedených stanovení na buněčné kultuře. Poté může být dávka připravena pro použití na zvířecích modelech tak, aby se dosáhlo periodického rozpětí koncentrace, které zahrnuje hodnotu IC50 podle provedeného stanovení na buněčné kultuře (tzn. koncentrace testované sloučeniny, která dosáhne poloviční maximální inhibice aktivity PK). Tento údaj pak může být používán jako přesněji stanovená účinná dávka u lidských subjektů.For any compound used herein in the methods of the invention, a therapeutically effective amount of the compound can initially be designed according to the cell culture assays performed. Thereafter, the dose can be prepared for use in animal models to achieve a periodic concentration range that includes an IC 50 value as determined by cell culture (i.e., the concentration of test compound that achieves half maximal inhibition of PK activity). This data can then be used as a more accurate effective dose in human subjects.

Toxicita a terapeutická účinnost zde popisovaných sloučenin může být stanovena standardními farmaceutickými postupy na buněčných kulturách nebo na experimentálních zvířatech, např. stanovením hodnoty IC50 a LD50 (obé je uvedeno v této popisné části) pro danou sloučeninu. Údaje obdržené z těchto stanovení prováděných na buněčné kultuře a zvířecích subjektech mohou být používána při formulování rozsahu dávky pro použití u lidských subjektů. Dávka se může lišit v závislosti na používané formě dávky a na používaném způsobu aplikace dávky. Přesné způsobu přípravy, aplikace a dávky mohou být vybrány jednotlivými lékaři v závislosti na stavu pacienta. Viz např. Fingl, et al., 1975, v „The Pharmacological Basis of Therapeutics“, kapitola 1, str. 1).Toxicity and therapeutic efficacy of the compounds described herein can be determined by standard pharmaceutical procedures on cell cultures or experimental animals, eg, by determining the IC 50 and LD 50 values (both described in this specification) for a given compound. The data obtained from these assays performed on cell culture and animal subjects can be used in formulating a dosage range for use in human subjects. The dosage may vary depending upon the dosage form employed and the route of administration utilized. The exact method of preparation, administration and dosage can be selected by the individual physician depending on the condition of the patient. See, eg, Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Chapter 1, p. 1).

Množství dávky a interval může být přizpůsoben jednotlivým subjektům k poskytnutí plazmatické hladiny aktivní látky, která je dostačující k udržení kinázových modulačních účinků na kinázu. Tyto plazmatické hladiny se nazývají minimální účinné koncentrace (MEC). MEC se budou podle sloučeniny lišit, ale mohou být odhadnuty na základě in vitro údajů, např. koncentrace, která je nezbytná k dosažení 50 - 90% inhibice kinázy může být určena pomocí stanovení, která jsou zde popsána. Míry dávky, které jsou nezbytné k dosažení MEC, budou závislé na jednotlivých charakteristikách a způsobech aplikace.The dosage amount and interval may be adapted to individual subjects to provide a plasma level of the active agent sufficient to maintain kinase modulating effects on the kinase. These plasma levels are called minimum effective concentrations (MECs). MECs will vary by compound, but can be estimated based on in vitro data, eg, the concentration that is required to achieve 50-90% kinase inhibition can be determined using the assays described herein. The dosage rates necessary to achieve the MEC will depend on the particular characteristics and routes of administration.

• · » · · · · · · • ·♦·· · * · « • · · · · · · ···· ··· ·· ···· ··· · · · · · * · · · * · · · ·

Rozpětí dávky může být také stanoveno pomocí hodnoty MEC. Sloučeniny by měly být aplikovány v takovém režimu, který zajistí z 10 - 90% času plazmatické hladiny nad MEC.The dose range can also be determined using the MEC value. Compounds should be administered in a regimen that provides 10-90% of the time plasma levels above the MEC.

V případech místní aplikace nebo volitelné absorpce nesouvisí koncentrace léčiva s koncentrací v plazmě a ke stanovení správného množství a rozpětí dávky mohou být používány jiné postupy známé z dosavadního stavu techniky.In cases of topical application or optional absorption, drug concentration is not related to plasma concentration and other prior art techniques may be used to determine the correct amount and dose range.

Množství aplikovaného přípravku bude samozřejmě záviset na subjektu, který je ošetřován, závažnosti poruchy, způsobu aplikace, posouzení předepisujícího lékaře, atd.The amount of preparation administered will, of course, depend on the subject being treated, the severity of the disorder, the mode of administration, the judgment of the prescriber, etc.

Balicí technikaPackaging technology

Přípravky mohou, pokud je to požadováno, být v balení nebo v dávkovacím zařízení, např. schválený kit FDA, který může obsahovat jeden nebo více dávkovačích jednotek aktivní složky. Balení může např. obsahovat kovovou nebo umělohmotnou fólii, např. pevný plastický obal s lepenkovou podpěrou. Balení nebo dávkovači zařízení mohou být opatřena návodem k použití. Balení nebo dávkovači zařízení mohou být také opatřena doprovodným upozorněním o formě předepsané orgánem státní správy regulujícím výrobu, použití nebo prodej farmaceutických přípravků, jenž povoluje formy přípravku nebo lidské nebo veterinární aplikace. Takové upozornění, např. může být označení schválené americkým Úřadem pro kontrolu potravin a léků, pro léčivý přípravek (pouze na lékařský předpis) nebo schválený přidaný produkt. Mohou být také připraveny přípravky obsahující sloučeninu podle vynálezu připravenou v kompatibilním farmaceutickém nosiči, umístněné v příslušném zásobníku a označené pro ošetření indikovaného stavu. Vhodné stavy onemocnění, které jsou indikované na štítku, mohou zahrnovat ošetření nádoru, inhibice angiogeneze, ošetření fibrózy, diabetes, apod.The formulations may, if desired, be packaged or dispensed, eg, an approved FDA kit, which may contain one or more dosage units of the active ingredient. For example, the package may comprise a metal or plastic foil, such as a rigid plastic package with a cardboard support. Packaging or dispensing devices may be provided with instructions for use. The packaging or dispensing device may also be accompanied by an accompanying notice on the form prescribed by the governmental authority regulating the manufacture, use or sale of pharmaceutical products, which authorizes the formulations or human or veterinary applications. Such a warning, for example, may be a label approved by the US Food and Drug Administration, for a medicinal product (prescription only) or an approved added product. Compositions comprising a compound of the invention prepared in a compatible pharmaceutical carrier, placed in an appropriate container and labeled for treatment of the indicated condition, may also be prepared. Suitable disease states that are indicated on the label may include tumor treatment, angiogenesis inhibition, fibrosis treatment, diabetes, and the like.

0 • · · · 0 0 0 • 0 ·000 • · · 0 0 0

6. Syntézy6. Syntheses

Sloučeniny tohoto vynálezu, stejně tak jako prekurzory 2oxindolů a aldehydů, mohou být snadno syntetizovány použitím odborníkům dobře známých technik. Bude oceněno odborníky v oboru, že cesty vedoucí k syntéze sloučenin tohoto vynálezu jsou dosažitelné, a že následující nabízené způsoby jsou pouze jako příklad a nikoliv jako jediná možnost syntézy těchto sloučenin.The compounds of this invention, as well as the 2-oxindole and aldehyde precursors, can be readily synthesized using techniques well known to those skilled in the art. It will be appreciated by those skilled in the art that the routes leading to the synthesis of the compounds of this invention are achievable, and that the following methods are offered by way of example only and not as the sole possibility of synthesizing these compounds.

A. Základní syntetický postupA. Basic synthetic procedure

Následují základní metody, které mohou být použity k přípravě sloučenin tohoto vynálezu:The following are the basic methods that can be used to prepare the compounds of this invention:

Vhodně substituovaný 2-oxindol (1 ekvivalent), vhodně substituovaný aldehyd (1,2 ekv.) a piperidin (0,1 ekv.) jsou smíchány s ethanolem (1-2 ml/mmol 2-oxindolu) a směs se poté zahřívá při 90°C po dobu 3 až 5 hodin. Po zchlazení se reakční směs koncentruje a okyselí se na pH 3. Vytvořený precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 7 a poté studeným ethanolem, ethylacetátem a/nebo hexanem a suší se ve vakuu, čímž se získá požadovaná sloučenina. Produkt se může případně přečistit chromatografií.Suitably substituted 2-oxindole (1 equivalent), suitably substituted aldehyde (1.2 eq) and piperidine (0.1 eq) are mixed with ethanol (1-2 mL / mmol of 2-oxindole) and the mixture is then heated at 90 ° C for 3-5 hours. After cooling, the reaction mixture is concentrated and acidified to pH 3. The precipitate formed is filtered, washed with water to pH 7 and then with cold ethanol, ethyl acetate and / or hexane and dried in vacuo to give the title compound. Alternatively, the product can be purified by chromatography.

B. 2-oxindoly.B. 2-Oxindoles.

Následující příklady representují syntézy sloučenin tohoto vynálezu z prekurzorů 2-oxindolu. Tyto 2-oxindoly budou vytvářet požadované sloučeniny reakcí s vhodně substituovaným pyrrol aldehydem použitím základního syntetického postupu nebo postupů uvedených v části C, níže. Rozumí se, že následující syntézy nejsou konstruovány jako omezení ať už syntetického přístupu, nebo oxindolů, jejichž syntéza se provádí.The following examples represent the syntheses of compounds of this invention from 2-oxindole precursors. These 2-oxindoles will form the desired compounds by reaction with an appropriately substituted pyrrole aldehyde using the basic synthetic procedure or procedures set forth in Part C, below. It will be understood that the following syntheses are not to be construed as limiting either the synthetic approach or the oxindoles to be synthesized.

• ·• ·

Φ φΦ φ

5-amino-2-oxindol5-amino-2-oxindole

5-nitro-2-oxindol (6,3 g) se hydrogenuje v methanolu přes 10 % paladium na aktivním uhlí, čímž se získají 3,0 g (60 % výtěžek) požadované sloučeniny jako bílé pevné látky.5-Nitro-2-oxindole (6.3 g) was hydrogenated in methanol over 10% palladium on charcoal to give 3.0 g (60% yield) of the title compound as a white solid.

5-brom-2-oxindol5-Bromo-2-oxindole

2-oxindol (1,3 g) v 20 ml acetonitrilu se ochladí na 10°C a pomalu se přidají 2,0 g N-bromsukcinimidu za stálého míchání. Reakce se míchá po dobu 1 hodiny při -10°C a 2 hodiny při 0°C. Precipitát se shromáždi, promyje se vodou a usuší se. Získá se 1,9 g (90 % výtěžek) požadované sloučeniny.2-Oxindole (1.3 g) in 20 ml of acetonitrile was cooled to 10 ° C and 2.0 g of N-bromosuccinimide was slowly added with stirring. The reaction was stirred for 1 hour at -10 ° C and 2 hours at 0 ° C. The precipitate was collected, washed with water and dried. 1.9 g (90% yield) of the title compound are obtained.

4-methyl-2-oxindol4-Methyl-2-oxindole

Diethyloxalát (30 ml) v 20 ml suchého etheru se přidá za stálého míchání dol9 g ethoxidu draselného rozpuštěného v 50 ml suchého etheru. Směs se ochladí v ledové lázni a pomalu se přidá 20 ml 3-nitro-o-xylen ve 20 ml suchého etheru. Hustá tmavá směs se zahřívá pod refluxem po dobu 30 minut, koncentruje se do vzniku tmavě červené pevné látky a nechá se působit sl0% hydroxidem sodným dokud se téměř veškerá pevná látka nerozpustí. Tmavě červená směs se nechá působit s 30% peroxidem vodíku dokud se červená barva nezmění na žlutou. Nebo se směs nechá působit s 10% hydroxidem sodným a 30% peroxidem vodíku dokud nezmizí tmavě červená barva. Pevná látka se zfiltruje a filtrát se okyselí 6N chlorovodíkovou kyselinou. Výsledný precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a suší pod vakuem. Získá se 9,8 g (45% výtěžek) 2-methyl-6-nitrofenylocotvé kyseliny jako našedlé pevné látky. Pevná látka se hydrogenuje v methanolu přes 10 % paladium na aktivním uhlí. Získá se 9,04 g požadované sloučeniny jako bílé pevné látky.Diethyl oxalate (30 mL) in 20 mL dry ether was added with stirring to 9 g of potassium ethoxide dissolved in 50 mL dry ether. The mixture was cooled in an ice bath and 20 mL of 3-nitro-o-xylene in 20 mL of dry ether was slowly added. The thick dark mixture was heated to reflux for 30 minutes, concentrated to give a dark red solid, and treated with 10% sodium hydroxide until almost all of the solid dissolved. The dark red mixture is treated with 30% hydrogen peroxide until the red color turns yellow. Alternatively, the mixture is treated with 10% sodium hydroxide and 30% hydrogen peroxide until the dark red color disappears. The solid was filtered and the filtrate was acidified with 6N hydrochloric acid. The resulting precipitate was collected by vacuum filtration, washed with water, and dried under vacuum. 9.8 g (45% yield) of 2-methyl-6-nitrophenylacetic acid are obtained as an off-white solid. The solid was hydrogenated in methanol over 10% palladium on charcoal. 9.04 g of the desired compound is obtained as a white solid.

• 4 • 4• 4 • 4

7-brom-5-chlor-2-oxindol7-Bromo-5-chloro-2-oxindole

5-chlor-2-oxindol (16,8 g) a 19,6 g N-bromsukcinimid se rozpustí ve 140 ml acetonitrilu a refluxuje po dobu 3 hodiny. Tenkovrstvá chromatografie (silica, ethylacetát) po 2 hodinách refluxu ukáže 5-chlor-2-oxindol nebo N-bromsukcinimid (Rf 0,8), produkt (Rf 0,85) a druhý produkt (Rf 0,9) jejichž poměr se za další hodinu refluxu nezmění. Směs se zchladí na 10°C, precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 25 ml ethanolu a vysává se v nálevce po dobu 20 minut. Získá se 14,1 g vlhkého produktu (56 % výtěžek). Pevná látka se rozpustí ve 200 ml denaturovaného ethanolu, rozmělní se mícháním a refluxuje po dobu 10 minut. Směs se ochladí v ledové lázni na 10°C. Pevný produkt se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 25 ml ethanolu a suší se pod vakuem při 40°C, čímž se získá 12,7 g (51% výtěžek) 7-brom-5chlor-2-oxindol.5-Chloro-2-oxindole (16.8 g) and 19.6 g of N-bromosuccinimide are dissolved in 140 ml of acetonitrile and refluxed for 3 hours. Thin-layer chromatography (silica, ethyl acetate) after 2 hours at reflux showed 5-chloro-2-oxindole or N-bromosuccinimide (Rf 0.8), product (Rf 0.85) and second product (Rf 0.9) whose another hour of reflux does not change. The mixture is cooled to 10 ° C, the precipitate is collected by vacuum filtration, washed with 25 ml of ethanol and sucked in a funnel for 20 minutes. 14.1 g of wet product are obtained (56% yield). The solid is dissolved in 200 ml of denatured ethanol, triturated with stirring and refluxed for 10 minutes. The mixture was cooled in an ice bath to 10 ° C. The solid product was collected by vacuum filtration, washed with 25 mL of ethanol and dried under vacuum at 40 ° C to give 12.7 g (51% yield) of 7-bromo-5-chloro-2-oxindole.

5-fluor-2-oxindol5-fluoro-2-oxindole

5-fluorisatin (8,2 g) se rozpustí v 50 ml hydrátu hydrazinů a refluxuje po dobu 1 hodiny. Poté se reakční směs přelije do ledové vody. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou a usuší ve vakuové peci, čímž se získá požadovaná sloučenina.5-Fluoroisatin (8.2 g) was dissolved in 50 ml of hydrazine hydrate and refluxed for 1 hour. The reaction mixture was then poured into ice water. The precipitate is filtered, washed with water and dried in a vacuum oven to give the title compound.

5-nitro-2-oxindol5-nitro-2-oxindole

2-oxindol (6,5 g) se rozpustí v 25 ml koncentrované kyseliny sírové a směs se udržuje při teplotě -10 až -15°C. V této době se po kapkách přidá 2,1 ml dýmavé kyseliny dusičné. Po přidání kyseliny dusičné se reakční směs míchá při 0°C po dobu 30 minut a přelije do vody. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a krystalizuje z 50 % kyseliny octové. Krystalický produkt se zfiltruje, promyje vodou a suší pod vakuem, čímž se získá 6,3 g (70%) 5-nitro2-oxindolu.Dissolve 2-oxindole (6.5 g) in 25 mL concentrated sulfuric acid and maintain the mixture at -10 to -15 ° C. At this time, 2.1 ml of fuming nitric acid was added dropwise. After the addition of nitric acid, the reaction mixture was stirred at 0 ° C for 30 minutes and poured into water. The precipitate was collected by vacuum filtration, washed with water and crystallized from 50% acetic acid. The crystalline product was filtered, washed with water and dried under vacuum to give 6.3 g (70%) of 5-nitro-2-oxindole.

5-jod-2-oxindol5-Iodo-2-oxindole

2-oxindol (82,9 g) se rozpustí v 630 ml kyseliny octové mechanickým mícháním a směs se zchladí na 10°C v ledové vodní lázni. Pevný N-jodsukcinimid (175 g) se přidá po částech během 10 minut. Poté se směs míchá po dobu 1 hodiny při 10°C. Stále přítomná rozpuštěná pevná látka během této doby zhoustne. Pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 100 ml 50 % kyseliny octové ve vodě, 200 ml vody a vysává v nálevce po dobu 20 minut. Produkt se suší pod vakuem, čímž se získá 93,5 g (36 %) 5-jod-2-oxindolu obsahujícího podle protonové NMR přibližně 5% 2-oxindolu.2-Oxindole (82.9 g) was dissolved in 630 ml of acetic acid by mechanical stirring and the mixture was cooled to 10 ° C in an ice water bath. Solid N-iodosuccinimide (175 g) was added portionwise over 10 minutes. Then the mixture was stirred for 1 hour at 10 ° C. The dissolved solid still present thickens during this time. The solid was collected by vacuum filtration, washed with 100 mL of 50% acetic acid in water, 200 mL of water, and vacuumed in a funnel for 20 minutes. The product was dried under vacuum to give 93.5 g (36%) of 5-iodo-2-oxindole containing about 5% 2-oxindole according to proton NMR.

5-methyl-2-oxindol5-Methyl-2-oxindole

5-methylisatin (15,0 g) a 60 ml hydrátu hydrazinu se zahřívají na teplotu 140 až 160°C po dobu 4 hodin. Tenkovrstvá chromatografie(ethylacetát: hexan 1: 2, silikagel) neukáže žádný zbývající výchozí materiál. Reakční směs se ochladí na pokojovou teplotu, přelije do 300 ml ledové vody a okyselí se na pH 2 pomocí 6N kyseliny chlorovodíkové. Po stání při pokojové teplotě po dobu 2 dnů se precipitát shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a suší pod vakuem, čímž se získá 6,5 g (47 % výtěžek) 5-methyl-2-oxindolu.5-Methylisatin (15.0 g) and 60 mL of hydrazine hydrate were heated at 140-160 ° C for 4 hours. Thin layer chromatography (ethyl acetate: hexane 1: 2, silica gel) showed no remaining starting material. The reaction mixture was cooled to room temperature, poured into 300 mL of ice water and acidified to pH 2 with 6N hydrochloric acid. After standing at room temperature for 2 days, the precipitate was collected by vacuum filtration, washed with water and dried under vacuum to give 6.5 g (47% yield) of 5-methyl-2-oxindole.

5-brom-4-methyloxindol a 5,7-dibrom-4-methyloxindol5-bromo-4-methyloxindole and 5,7-dibromo-4-methyloxindole

4-methyl-2-oxindol (5 g) ve 40 ml acetonitrilu se nechá působit s 7,26 g N-bromsukcinimidu a míchá se při pokojové teplotě po dobu 4 hodiny. Tenkovrstvá chromatografie (ethylacetát: hexan 1: 2, silikagel) ukáže směs 5-brom (Rf 0,3) a 5,7-dibrom (Rf 0,5) produktů. Přidá se dalších 7,26 g N-bromsukcinimidu a směs se míchá po dobu dalších 4 hodiny. Pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 20 ml acetonitrilu a suší, čímž se získá směs mono a dibrom sloučenin v poměru 1:1. Filtrát se koncentruje a chromatografuje na silikagelu (ethylacetát: hexan (1: 2)) . Získá se 1,67 g 5-brom-4-methyl-264 ♦ · oxindolů jako béžové pevné látky. Zbývající směs pevných látek o poměru 1:1 se dvakrát rekrystaluje z ledové kyseliny octové, čímž se získá 3,2 g 5,7-dibrom-4-methyl-2-oxindolu jako světle oranžová pevná látka. Filtráty tohoto materiálu se chromatografují podle viz. výše, čímž se získá 0,6 g 5-brom-4-methyl-2- oxindolů a 0,5 g 5,7dibrom-4-methyl-2-oxindolu.4-Methyl-2-oxindole (5 g) in 40 ml of acetonitrile was treated with 7.26 g of N-bromosuccinimide and stirred at room temperature for 4 hours. Thin Layer Chromatography (ethyl acetate: hexane 1: 2, silica gel) showed a mixture of 5-bromo (Rf 0.3) and 5,7-dibromo (Rf 0.5) products. An additional 7.26 g of N-bromosuccinimide was added and the mixture was stirred for an additional 4 hours. The solid was collected by vacuum filtration, washed with 20 mL acetonitrile and dried to give a 1: 1 mixture of mono and dibromo compounds. The filtrate was concentrated and chromatographed on silica gel (ethyl acetate: hexane (1: 2)). 1.67 g of 5-bromo-4-methyl-264-oxindoles are obtained as a beige solid. The remaining 1: 1 mixture of solids was recrystallized twice from glacial acetic acid to give 3.2 g of 5,7-dibromo-4-methyl-2-oxindole as a pale orange solid. The filtrates of this material are chromatographed according to FIG. above to give 0.6 g of 5-bromo-4-methyl-2-oxindoles and 0.5 g of 5,7-dibromo-4-methyl-2-oxindole.

6-fluor-2-oxindol6-fluoro-2-oxindole

Hydrid sodný (2,6 g) a 14,5 g dimethylmalonátu se míchá a zahřívá při 100°C v 160 ml dimethylsulfoxidu po dobu 1 hodiny. Směs se ochladí na pokojovou teplotu, přidá se 7,95 g 2,5difluornitrobenzenu a směs se míchá po dobu 30 minut. Poté se směs zahřívá při 100°C po dobu 1 hodiny, zchladí se na pokojovou teplotu a přelije do 400 ml roztoku saturovaného chloridu sodného. Směs se extrahuje 200 ml ethylacetátu a organická vrstva se promyje solankou, suší nad bezvodým síranem sodným a koncentruje pod vakuem. Zbytek se krystalizuje z methanolu, čímž se získá 24,4 g (80 % výtěžek) dimethyl 4-fluor-2-nitrofenylmalonátu jako bílé pevné látky, Rf 0,2 na tenkovrstvé chromatografií (ethylacetát: hexan 1: 6, silikagel). Filtrát se koncentruje a chromatografuje na sloupci silikagelu (ethylacetát: hexan 1: 8), čímž se získá dalších 5,03 g dimethyl 4fluor-2-nitro-fenylmalonátu. Což dohromady činí 29,5 g (96 % výtěžek).Sodium hydride (2.6 g) and 14.5 g of dimethyl malonate were stirred and heated at 100 ° C in 160 ml of dimethyl sulfoxide for 1 hour. The mixture was cooled to room temperature, 7.95 g of 2,5-difluoronitrobenzene was added and the mixture was stirred for 30 minutes. The mixture was then heated at 100 ° C for 1 hour, cooled to room temperature and poured into 400 ml saturated sodium chloride solution. The mixture was extracted with 200 mL of ethyl acetate and the organic layer was washed with brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under vacuum. The residue was crystallized from methanol to give 24.4 g (80% yield) of dimethyl 4-fluoro-2-nitrophenylmalonate as a white solid, Rf 0.2 on thin layer chromatography (ethyl acetate: hexane 1: 6, silica gel). The filtrate was concentrated and chromatographed on a silica gel column (ethyl acetate: hexane 1: 8) to give an additional 5.03 g of dimethyl 4-fluoro-2-nitrophenylmalonate. Combined to 29.5 g (96% yield).

Dimethyl 4-fluor-2-nitrofenylmalonát (5,0 g) se refluxuje ve 20 ml 6N kyseliny chlorovodíkové po dobu 24 hodin. Reakce se ochladí a bílá pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a usuší. Získá se 3,3 g (87 % výtěžek) 4-fluor-2-nitrofenyloctvé kyseliny, Rf 0,6 na tenkovrstvé chromatografií (ethylacetát: hexan 1: 2, silikagel).Dimethyl 4-fluoro-2-nitrophenylmalonate (5.0 g) was refluxed in 20 mL of 6N hydrochloric acid for 24 hours. The reaction was cooled and the white solid was collected by vacuum filtration, washed with water and dried. There was obtained 3.3 g (87% yield) of 4-fluoro-2-nitrophenylacetic acid, Rf 0.6 on thin layer chromatography (ethyl acetate: hexane 1: 2, silica gel).

4-fluor-2-nitrofenyloctová kyselina (3,3 g) zředěná v 15 ml kyseliny octové se hydrogenuje přes 0,45 g 10 % paladia na aktivním uhlí při 60 psi H₂ po dobu 2 hodiny. Katalyzátor se odstraní filtrací a • · • · • φ φφ φφφ* • φφφφ φφφφ φ • 9 9, 9 9 9 9 9 ··· ΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦ promyje se 15 ml methanolu. Spojené filtráty se spojí a zředí vodou. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a usuší, čímž se získá 1,6 g (70 % výtěžek) 6-fluor-2-oxindolu, Rf 0,24 na tenkovrstvé chromatografií. Filtrát se koncentruje do vzniku nachové pevné látky s podobným NNM spektrem jako první množství. Chromatografií nachové pevné látky (ethylacetát: hexan 1: 2, silikagel) se získá druhé množství 6-fluor-2-oxindolu jako bílé pevné látky.4-Fluoro-2-nitrophenylacetic acid (3.3 g) diluted in 15 ml of acetic acid is hydrogenated over 0.45 g of 10% palladium on charcoal at 60 psi H ₂ for 2 hours. The catalyst was removed by filtration and washed with methanol (15 ml). The combined filtrates were combined and diluted with water. The precipitate was collected by vacuum filtration, washed with water and dried to give 1.6 g (70% yield) of 6-fluoro-2-oxindole, Rf 0.24 on thin layer chromatography. The filtrate was concentrated to give a purple solid with a similar NNM spectrum as the first amount. Chromatography of the purple solid (ethyl acetate: hexane 1: 2, silica gel) gave a second amount of 6-fluoro-2-oxindole as a white solid.

5-ami nosu lfonyl-2-oxindol5-Amino-2-oxindole

Do 100 ml baňky naplněné 27 ml chlorsírové kyseliny se pomalu přidá 13,3 g 2-oxindolu. Během přidávání se reakční teplota udržuje pod 30°C . Po přídavku se reakční směs míchá při pokojové teplotě po dobu 1,5 hodiny, zahřívá se na 68°C po dobu 1 hodiny, zchladí se a přilije do vody. Precipitát se promyje vodou a usuší ve vakuové peci, čímž se získá 11,0 g 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu (50% výtěžek), který se použije bez dalšího čištění.To a 100 mL flask filled with 27 mL chlorosulfuric acid was slowly added 13.3 g of 2-oxindole. The reaction temperature is kept below 30 ° C during the addition. After the addition, the reaction mixture was stirred at room temperature for 1.5 hours, heated to 68 ° C for 1 hour, cooled and poured into water. The precipitate was washed with water and dried in a vacuum oven to give 11.0 g of 5-chlorosulfonyl-2-oxindole (50% yield), which was used without further purification.

5-chlorsulfonyl-2-oxindol (2,1 g) se přidá do 10 ml hydroxidu amonného v 10 ml ethanolu a míchá se při pokojové teplotě přes noc. Směs se koncentruje a pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací. Získá se 0,4 g (20% výtěžek) požadované sloučeniny jako šedé pevné látky.5-Chlorosulfonyl-2-oxindole (2.1 g) was added to 10 mL of ammonium hydroxide in 10 mL of ethanol and stirred at room temperature overnight. The mixture was concentrated and the solid was collected by vacuum filtration. 0.4 g (20% yield) of the title compound is obtained as a gray solid.

5-methylaminosulfonyl-2-oxindol5-methylaminosulfonyl-2-oxindole

Suspenze 3,38 g 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu v 10 ml 2M methylaminu v tetrahydrofuranu se míchá při pokojové teplotě po dobu 4 hodiny, během které se utvoří bílá pevná látka. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje dvakrát 5 ml vody a suší pod vakuem při 40°C přes noc. Získá se 3,0 g (88 % výtěžek) 5methy lamin osul fony 1-2-oxindolu.A suspension of 3.38 g of 5-chlorosulfonyl-2-oxindole in 10 ml of 2M methylamine in tetrahydrofuran was stirred at room temperature for 4 hours, during which time a white solid formed. The precipitate was collected by vacuum filtration, washed twice with 5 ml of water and dried under vacuum at 40 ° C overnight. 3.0 g (88% yield) of a 5-methylamine osuline of 1-2-oxindole are obtained.

5-(4-trifluormethylfenylaminosulfonyl)-2-oxindol5- (4-Trifluoromethylphenylaminosulfonyl) -2-oxindole

Suspenze 2,1 g 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu, 1,6 g 4trifluormethylanilinu a 1,4 g pyridinu ve 20 ml dichlormethanu se míchá při pokojové teplotě po dobu 4 hodiny. Precipitát, který se utvořil se shromáždí vakuovou filtrací, promyje dvakrát 5 ml vody a suší pod vakuem při 40°C přes noc. Získá se 2,4 g surového produktu, který podle tenkovrstvé chromatografie obsahuje nějaké nečistoty. Surový produkt se chromatografuje na silikagelu mobilní fází ethylacetát: hexan (1: 2), čímž se získá 1,2 g (37 % výtěžek) 5-(4tr i fluor m e thy 1 feny 1-amin o sul fonyl)-2-ox indolu.A suspension of 2.1 g of 5-chlorosulfonyl-2-oxindole, 1.6 g of 4-trifluoromethylaniline and 1.4 g of pyridine in 20 ml of dichloromethane is stirred at room temperature for 4 hours. The precipitate that formed was collected by vacuum filtration, washed twice with 5 mL of water and dried under vacuum at 40 ° C overnight. 2.4 g of crude product are obtained which, according to thin-layer chromatography, contains some impurities. The crude product was chromatographed on silica gel eluting with ethyl acetate: hexane (1: 2) to give 1.2 g (37% yield) of 5- (4-trifluoromethylphenyl-aminosulfonyl) -2-ox. indole.

5- (morfolinosulfonyl)-2-oxindol5- (morpholinosulfonyl) -2-oxindole

Suspenze 2,3 g 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu a 2,2 g morfolinu v 50 ml dichlormethanu se míchají při pokojové teplotě po dobu 3 hodiny. Bílý precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se ethylacetátem a hexanem a suší se pod vakuem při 40°C přes noc. Získá se 2,1 g (74 % výtěžek) 5-(morfolinosulfonyl)-2-oxindolu.A suspension of 2.3 g of 5-chlorosulfonyl-2-oxindole and 2.2 g of morpholine in 50 ml of dichloromethane is stirred at room temperature for 3 hours. The white precipitate was collected by vacuum filtration, washed with ethyl acetate and hexane, and dried under vacuum at 40 ° C overnight. 2.1 g (74% yield) of 5- (morpholinosulfonyl) -2-oxindole are obtained.

6- trifluormethyl-2-oxindol6-Trifluoromethyl-2-oxindole

Dimethylsulfoxid (330 ml) se přidá do 7,9 g hydridu sodného, poté se po kapkách přidá 43,6 g diethyloxalátu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 1 hodiny a zchladí se na pokojovou teplotu. Přidá se 2-nitro-4-trifluormethyltoluen (31,3 g). Reakce se míchá po dobu 30 minut při pokojové teplotě a poté se zahřívá při 100°C po dobu 1 hodiny. Reakce se ochladí a přelije do směsi saturovaného vodného chloridu amonného, ethylacetátu a hexanu. Organická vrstva se promyje saturovaným chloridem amonným, vodou a solankou. Suší se a koncentruje, čímž se získá dimethyl 2-(2-nitro-4trifluormethylfenyljmalonát.Dimethylsulfoxide (330 mL) was added to 7.9 g of sodium hydride, followed by dropwise addition of 43.6 g of diethyl oxalate. The mixture was heated at 100 ° C for 1 hour and cooled to room temperature. 2-Nitro-4-trifluoromethyltoluene (31.3 g) was added. The reaction was stirred for 30 minutes at room temperature and then heated at 100 ° C for 1 hour. The reaction was cooled and poured into a mixture of saturated aqueous ammonium chloride, ethyl acetate, and hexane. The organic layer was washed with saturated ammonium chloride, water, and brine. Dry and concentrate to give dimethyl 2- (2-nitro-4-trifluoromethylphenyl) malalonate.

Diester se rozpustí ve směsi 6,4 g chloridu litného a 2,7 ml vody ve 100 ml dimethylsulfoxidu a zahřívá se při 100°C po dobu 3 • » • 9Diester is dissolved in a mixture of 6.4 g of lithium chloride and 2.7 ml of water in 100 ml of dimethylsulfoxide and heated at 100 ° C for 3 hours.

0 • · 00 »000 • · 0 0 0 • 0 0 0 0 0 0 » 0 0 0 • 000 000 00 000« hodiny. Reakce se ochladí a přelije do směsy ethylacetátu a solanky. Organická fáze se promyje solankou, suší se síranem sodným, koncentruje a chromatografuje na silikagelu (10 % ethylacetát v hexanu). Frakce obsahující produkt se odpaří, čímž se získá 25,7 g methyl 2-n i tr o-4-trifluormethyl feny lacetátu.0 • 00 00 000 • 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 000 000 000 000 hours. The reaction was cooled and poured into a mixture of ethyl acetate and brine. The organic phase was washed with brine, dried with sodium sulfate, concentrated and chromatographed on silica gel (10% ethyl acetate in hexane). The product containing fractions were evaporated to give 25.7 g of methyl 2-nitro-4-trifluoromethylphenylacetate.

Methyl 2-nitro-4-trifluormethylfenylacetát (26 mg) se hydrogenuje přes 10 % paladium na aktivním uhlí a poté se zahřívá při 100°C po dobu 3 hodiny. Katalyzátor se odstraní filtrací a rozpouštědlo se odpaří, čímž se získá požadovaná sloučenina.Methyl 2-nitro-4-trifluoromethylphenylacetate (26 mg) was hydrogenated over 10% palladium on charcoal and then heated at 100 ° C for 3 hours. The catalyst was removed by filtration and the solvent was evaporated to give the title compound.

5-(2-chlorethyl) oxindol5- (2-chloroethyl) oxindole

5-chloracetyl-2-oxindol (4,18 g) ve 30 ml trifluoroctvé kyseliny v ledové lázni se nechá působit s 4,65 g triethylsilanu a míchá se při pokojové teplotě po dobu 3 hodiny. Směs se nalije do 150 ml vody a precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 50 ml vody a usuší, čímž se získá 2,53 g (65% výtěžek) 5-(2-chlorethyl)-2-oxindolu jako ěervenohnědé pevné látky.5-Chloroacetyl-2-oxindole (4.18 g) in 30 ml of trifluoroacetic acid in an ice bath was treated with 4.65 g of triethylsilane and stirred at room temperature for 3 hours. The mixture was poured into 150 ml of water and the precipitate was collected by vacuum filtration, washed with 50 ml of water and dried to give 2.53 g (65% yield) of 5- (2-chloroethyl) -2-oxindole as a red-brown solid.

5-methoxykar bony 1-2-oxindol5-methoxycarbonyl-2-oxindole

5-jod-2-oxindol (17 g) se refluxuje se 2 g diacetátu paladia, 18,2 g triethylaminu, 150 ml methanol, 15 ml dimethylsulfoxidu a 2,6 g DPPP v atmosféře saturované oxidem uhelnatým. Po 24 hodinách se z reakční směsi odstraní katalyzátor filtrací a filtrát se koncentruje. Koncentrát se chromatografuje na silikagelu (30 % ethylacetát v hexanu). Frakce obsahující produkt se koncentrují a nechají se stát. Precipitát produktu se shromáždí vakuovou filtrací, čímž se získá 0,8 g (7%) požadované sloučeniny jako šedá pevná látka.5-Iodo-2-oxindole (17 g) was refluxed with 2 g of palladium diacetate, 18.2 g of triethylamine, 150 ml of methanol, 15 ml of dimethylsulfoxide and 2.6 g of DPPP in an atmosphere saturated with carbon monoxide. After 24 hours, the catalyst was removed from the reaction mixture by filtration and the filtrate was concentrated. The concentrate was chromatographed on silica gel (30% ethyl acetate in hexane). Product containing fractions were concentrated and allowed to stand. The product precipitate was collected by vacuum filtration to give 0.8 g (7%) of the title compound as a gray solid.

4-karboxy-2 -oxindol4-carboxy-2-oxindole

Roztok trimethylsilyldiazomethanu v hexanu (2M) se přidává po kapkách do roztoku 2,01 g 2-chlor-3-karboxy-nitrobenzenu ve 20 ml • 9 * t 9 99 • 9 • · • · • 999 999A solution of trimethylsilyldiazomethane in hexane (2M) was added dropwise to a solution of 2.01 g of 2-chloro-3-carboxynitrobenzene in 20 ml.

9 9 9 • · 99 9 9 • 9

9 9 9 ·· 9 •9 9999 « 99 9 9 ·· 9 • 9 9999

9 • 99 • 9

99

-199 methanolu při pokojové teplotě dokud se nepřestane uvolňovat plyn. Přebytek trimethylsilyldiazo-methanu se odstraní octovou kyselinou. Reakční směs se suší na rotační pumpě a zbytek se dále suší ve vakuové peci přes noc. Získá se produkt (2 chlor-3-methoxykarbonylnitrobenzen) dostatečně čistý pro další reakci.-199 methanol at room temperature until gas evolution ceased. Excess trimethylsilyldiazomethane was removed with acetic acid. The reaction mixture was dried on a rotary pump and the residue was further dried in a vacuum oven overnight. The product (2 chloro-3-methoxycarbonylnitrobenzene) was obtained sufficiently pure for the next reaction.

Dimethyl malonát (6,0 ml) se přidá do ledově studené suspenze 2,1 g hydridu sodného v 15 ml DMSO. Reakční směs se poté míchá při 100°C po dobu 1 hodiny a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Do této směsi se v jedné dávce přidá 2-chlor-3methoxykarbonylnitrobenzen (2,15 g) a směs se zahřívá při 100°C po dobu 1,5 hodiny. Reakční směs se zchladí na pokojovou teplotu a přelije se do ledové vody.Okyselí se na pH 5 a extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje, čímž se získají 3,0 g dimethyl 2-methoxykarbony 1-6-nitrofenylmalonátu.Dimethyl malonate (6.0 mL) was added to an ice-cold suspension of 2.1 g sodium hydride in 15 mL DMSO. The reaction mixture was then stirred at 100 ° C for 1 hour and then cooled to room temperature. To this mixture was added 2-chloro-3-methoxycarbonylnitrobenzene (2.15 g) in one portion and the mixture was heated at 100 ° C for 1.5 hours. The reaction mixture was cooled to room temperature and poured into ice water. Acidified to pH 5 and extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with brine, dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated to give 3.0 g of dimethyl 2-methoxycarbonyl-1-6-nitrophenylmalonate.

Dimethyl 2-methoxykarbonyl-6-nitrofenylmalonát (3,0 g) se refluxuje v 50 ml 6 N chlorovodíkové kyseliny přes noc. Směs se koncentruje do sucha a refluxuje po dobu 2 hodiny s 1,1 g chloridu cínatého ve 20 ml ethanolu. Směs se zfiltruje přes Celit, koncentruje a chromatografuje na silikagelu (ethylacetát: hexan: octová kyselina), čímž se získá 0,65 g (37% výtěžek) 4-karboxy-2-oxindolu jako bílé pevné látky.Dimethyl 2-methoxycarbonyl-6-nitrophenylmalonate (3.0 g) was refluxed in 50 mL of 6 N hydrochloric acid overnight. The mixture is concentrated to dryness and refluxed for 2 hours with 1.1 g of stannous chloride in 20 ml of ethanol. The mixture was filtered through Celite, concentrated and chromatographed on silica gel (ethyl acetate: hexane: acetic acid) to afford 0.65 g (37% yield) of 4-carboxy-2-oxindole as a white solid.

5-karboxy-2-oxindol5-carboxy-2-oxindole

2-oxindol (6,7 g) se přidá do míchané suspenze 23 g chloridu hlinitého ve 30 ml dichlorethanu v ledové lázni. Pomalu se přidá chloracetyl chlorid (11,3 g) a začne se vyvíjet plynný chlorovodík. Po deseti minutách míchání se reakce zahřívá na teplotu 40 až 50°C po dobu 1,5 hodiny. Tenkovrstvá chromatografie (ethylacetát, silikagel) neprokáže žádný zbývající výchozí materiál. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a přelije do ledové vody. Precipitát se shromáždí • · zrn · · · · · · · ···· ··· ·· ···· ·· vakuovou filtrací, promyje vodou a usuší po vakuem, čímž se získálO,3 g (98%) 5-chloracetyl-2-oxindolu jako šedé pevné látky.2-Oxindole (6.7 g) was added to a stirred suspension of 23 g of aluminum chloride in 30 ml of dichloroethane in an ice bath. Chloroacetyl chloride (11.3 g) was added slowly and hydrogen chloride gas evolved. After stirring for 10 minutes, the reaction is heated to 40-50 ° C for 1.5 hours. Thin layer chromatography (ethyl acetate, silica gel) showed no remaining starting material. The mixture was cooled to room temperature and poured into ice water. The precipitate was collected by grain filtration by vacuum filtration, washed with water and dried under vacuum to give 0.3 g (98%) 5- chloroacetyl-2-oxindole as a gray solid.

Suspenze 9,3 g 5-chloracetyl-2-oxindolu se míchá v 90 ml pyridinu při 80 až 90°C po dobu 3 hodiny a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací a promyje 20 ml ethanolu. Pevná látka se rozpustí v 90 ml 2,5N hydroxidu sodného a míchá se při 70 až 80°C po dobu 3 hodiny. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a okyselí se 0,5 N kyselinou chlorovodíkovou na pH 2. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací a důkladně promyje vodou, čímž se získá surový 5-karboxy-2-oxindol jako tmavě hnědá pevná látka. Filtrát se ponechá stát přes noc, čímž se získají 2 g 5-karboxy-2-oxindolu jako žluté pevné látky. Surový tmavě hnědý produkt se rozpustí v horkém methanolu, nerozpustný materiál se odstraní filtrací a filtrát se koncentruje,čímž se získá 5,6 g 5karboxy-2-oxindolu jako hnědé pevné látky. Spojené výtěžky činí 97%.A suspension of 9.3 g of 5-chloroacetyl-2-oxindole is stirred in 90 ml of pyridine at 80-90 ° C for 3 hours and then cooled to room temperature. The precipitate was collected by vacuum filtration and washed with 20 mL of ethanol. The solid was dissolved in 90 mL of 2.5 N sodium hydroxide and stirred at 70-80 ° C for 3 hours. The mixture was cooled to room temperature and acidified with 0.5 N hydrochloric acid to pH 2. The precipitate was collected by vacuum filtration and washed thoroughly with water to give crude 5-carboxy-2-oxindole as a dark brown solid. The filtrate was allowed to stand overnight to give 2 g of 5-carboxy-2-oxindole as a yellow solid. The crude dark brown product was dissolved in hot methanol, insoluble material was removed by filtration, and the filtrate was concentrated to give 5.6 g of 5-carboxy-2-oxindole as a brown solid. The combined yields were 97%.

5-karboxyethyl-2-oxindol5-carboxyethyl-2-oxindole

5-kyanoethyl-2-oxindol (4,02 g) v 10 ml vody obsahující 25 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové se refluxuje po dobu 4 hodiny. Směs se ochladí, přidá se voda a výsledná pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací. Promyje se vodou a usuší, čímž se získá 1,9 g (44% výtěžek) požadované sloučeniny jako pevné žluté látky.5-Cyanoethyl-2-oxindole (4.02 g) in 10 mL of water containing 25 mL of concentrated hydrochloric acid was refluxed for 4 hours. The mixture was cooled, water was added and the resulting solid was collected by vacuum filtration. Wash with water and dry to give 1.9 g (44% yield) of the title compound as a yellow solid.

5-jod-4-methyl-2-oxindol5-Iodo-4-methyl-2-oxindole

Do 2 g 4-methyl-2-oxindolu ve 40 ml ledové kyseliny octové v ledové lázni se přidá 3,67 g N-jodsukcinimidu. Směs se míchá po dobu 1 hodiny, zředí se 100 ml 50 % octové kyseliny ve vodě a zfiltruje se. Výsledná bílá pevná látka se suší pod vysokým vakuem, čímž se získá 3,27 g (88% výtěžek) požadované sloučeniny jako šedé pevné látky.3.67 g of N-iodosuccinimide are added to 2 g of 4-methyl-2-oxindole in 40 ml of glacial acetic acid in an ice bath. The mixture was stirred for 1 hour, diluted with 100 mL of 50% acetic acid in water and filtered. The resulting white solid was dried under high vacuum to give 3.27 g (88% yield) of the title compound as a gray solid.

• ·• ·

5-chlor-4-methyl-2-oxindol5-chloro-4-methyl-2-oxindole

Suspenze 3,0 g 4-methyl-2-oxindolu se míchá v 50 ml acetonitrilu při pokojové teplotě a mezí tím se po dávkách přidá 3,3 g N-chlorsukcinimidu. Poté se přidá trifluoroctová kyselina (1 ml). Suspenze se míchá při pokojové teplotě po dobu 3 dny, během nichž je pevná látka stále přítomna. Bílá pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje malým množstvím studeného acetonu a suší přes noc ve vakuové peci při teplotě 40°C. Získá se 2,5 g (68 %) 5-chlor-4methy 1-2-oxindolu.A suspension of 3.0 g of 4-methyl-2-oxindole is stirred in 50 ml of acetonitrile at room temperature, while 3.3 g of N-chlorosuccinimide are added in portions. Trifluoroacetic acid (1 mL) was then added. The suspension is stirred at room temperature for 3 days, during which the solid is still present. The white solid was collected by vacuum filtration, washed with a small amount of cold acetone, and dried overnight in a vacuum oven at 40 ° C. 2.5 g (68%) of 5-chloro-4-methyl-2-oxindole are obtained.

5-butyl-2-oxindol5-Butyl-2-oxindole

Triethylsilan (2,3 g) se přidá do 2 g 4-butanoyl-2-oxindolu ve 20 ml trifluoroctové kyseliny při pokojové teplotě a roztok se míchá po dobu 3 hodiny. Směs se nalije do ledové vody, čímž vznikne červený olej, který postupně ztuhne. Pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se vodou, hexanem a usuší se. Získá se 1,7 g (91% výtěžek) požadované sloučeniny jako šedé pevné látky.Triethylsilane (2.3 g) was added to 2 g of 4-butanoyl-2-oxindole in 20 ml of trifluoroacetic acid at room temperature and the solution was stirred for 3 hours. The mixture was poured into ice water to give a red oil which gradually solidified. The solid was collected by vacuum filtration, washed with water, hexane, and dried. 1.7 g (91% yield) of the title compound are obtained as a gray solid.

5-ethyl-2-oxindol5-ethyl-2-oxindole

Do 5-acetyl-2-oxindolu (2 g) v 15 ml trifluoroctové kyseliny v ledové lázni se pomalu přidá 1,8 g triethylsilanu, reakce se míchá při pokojové teplotě po dobu 5 hodin. Přidá se jeden ml triethylsilanu a míchání pokračuje přes noc. Reakční směs se nalije do ledové vody a výsledný precipitát se shromáždí vakuovou filtrací. Řádně se promyje vodou a suší se pod vakuem, čímž se získá 1,3 g (71% výtěžek) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.To 5-acetyl-2-oxindole (2 g) in 15 mL of trifluoroacetic acid in an ice bath was slowly added 1.8 g of triethylsilane, the reaction was stirred at room temperature for 5 hours. One ml of triethylsilane was added and stirring continued overnight. The reaction mixture was poured into ice water and the resulting precipitate was collected by vacuum filtration. Wash thoroughly with water and dry under vacuum to give 1.3 g (71% yield) of the title compound as a yellow solid.

5-(morfolin-4-ethyl)-2-oxindol5- (Morpholin-4-ethyl) -2-oxindole

5-Chlorethyl-2-oxindol (2,3 g), 1,2 ml morfolinu a 1,2 ml diizopropylethylaminu se zahřívá přes noc při 100°C v 10 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zchladí, přelije do vody a extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje solankou, usuší a odpaří. Zbytek se chromatografuje na silikagelu (5 % methanol v chloroformu), čímž se získá 0,9 g (31%) požadované sloučeniny jako bílé pevné látky.5-Chloroethyl-2-oxindole (2.3 g), 1.2 ml morpholine and 1.2 ml diisopropylethylamine were heated at 100 ° C overnight in 10 ml dimethylsulfoxide. The mixture was cooled, poured into water and extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with brine, dried and evaporated. The residue was chromatographed on silica gel (5% methanol in chloroform) to give 0.9 g (31%) of the title compound as a white solid.

-(4-methoxy karbony lbenzamido)-2-oxindol- (4-methoxycarbonylbenzamido) -2-oxindole

Směs 82,0 mg 5-amino-2-oxindol a 131,0 mg 4methoxykarbonylbenzoylchloridu v pyridinu se míchá při pokojové teplotě po dobu 3 hodiny a přelije do ledové vody. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou a usuší ve vakuové peci. Získá se 138,0 mg 5(4-methoxykarbonylbenzamido)-2-oxindolu (81 % výtěžek).A mixture of 82.0 mg of 5-amino-2-oxindole and 131.0 mg of 4-methoxycarbonylbenzoyl chloride in pyridine was stirred at room temperature for 3 hours and poured into ice water. The precipitate is filtered, washed with water and dried in a vacuum oven. 138.0 mg of 5- (4-methoxycarbonylbenzamido) -2-oxindole was obtained (81% yield).

5-(4-karboxybenzamido)-2-oxindol5- (4-carboxybenzamido) -2-oxindole

5-(4-methoxykarbonylbenzamido)-2-oxindol (0,9 g) a 0,4 g hydroxidu sodného v 25 ml methanolu se refluxují po dobu 3 hodiny. Směs se koncentruje, přidá se voda a směs se okyselí 6N chlorovodíkovou kyselinou. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, čímž se získá 0,75 g (87%) požadované sloučeniny jako bílé pevné látky.5- (4-methoxycarbonylbenzamido) -2-oxindole (0.9 g) and 0.4 g of sodium hydroxide in 25 ml of methanol were refluxed for 3 hours. The mixture was concentrated, water was added and the mixture was acidified with 6N hydrochloric acid. The precipitate was collected by vacuum filtration to give 0.75 g (87%) of the title compound as a white solid.

5-methoxy-2-oxindol5-methoxy-2-oxindole

Chloral hydrát (9,6 g) se rozpustí ve 200 ml vody obsahující 83 g síranu sodného. Roztok se zahřeje na teplotu 60°C a přidá se roztok 11,4 g hydroxylamin hydrochloridu v 50 ml vody a směs se udržuje při teplotě 60°C. V oddělené baňce se na teplotu 80°C zahřeje 6,4 gChloral hydrate (9.6 g) was dissolved in 200 ml of water containing 83 g of sodium sulfate. The solution is heated to 60 ° C and a solution of 11.4 g of hydroxylamine hydrochloride in 50 ml of water is added and the mixture is maintained at 60 ° C. Heat 6.4 g in a separate flask to 80 ° C

4-anisidinu a 4,3 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové v 80 ml vody. První roztok se přidá do druhého a směs se refluxuje po dobu 2 minuty. Poté se pomalu zchladí na pokojovou teplotu a následně se vloží do ledové lázně. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, • · *70 · · · · · · · / Z, ···· ··· ·· ···· ·· promyje vodou a usuší pod vakuem, čímž se získá 8,6 g ( 86 % výtěžek)N-(hydroxyiminoacetyl)anisidinu.Of 4-anisidine and 4.3 ml of concentrated hydrochloric acid in 80 ml of water. The first solution was added to the second and the mixture was refluxed for 2 minutes. It is then slowly cooled to room temperature and then placed in an ice bath. The precipitate is collected by vacuum filtration, washed with water and dried under vacuum to give 8.6 g (m.p. 86% yield of N- (hydroxyiminoacetyl) anisidine.

Koncentrovaná kyselina sírová (45 ml) obsahující 5 ml vody se zahřeje na teplotu 60°C a přidá se 8,6 g N(hydroxyiminoacetyl)anisidinu v jedné dávce. Míchaná směs se zahřívá při teplotě 93°C po dobu 10 minut a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Směs se nalije do 500 g ledu a extrahuje 3 krát ethylacetátem. Spojené extrakty se suší nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se, čímž se získá 5,1 g (65 % výtěžek) 5-methoxyisatinu jako tmavě červené pevné látky. 5-Methoxyisatin (5,0 g) a 30 ml hydrátu hydrazinu se zahřívá při refluxu po dobu 15 minut. Reakční směs se ochladí na pokojovou teplotu a přidá se 50 ml vody. Směs se 3 krát extrahuje pokaždé 25 ml ethylacetátu, organické vrstvy se spojí, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se do vzniku žluté pevné látky. Pevná látka se míchá v ethylacetátu a 1,1 g nerozpustného materiálu se odstraní vakuovou filtrací a uschová. Tento materiál je 2hydrazinokarbonylmethyl-4-anisidin. Filtrát se koncentruje a chromatografuje na silikágelu mobilní fází ethylacetát : hexan (1: 1), čímž se získá 0,7 g 5-methoxy-2-oxindolu jako žluté pevné látky. 1,1 g 2-hydrazino-karbonylmethyl-4-anisidinu se refluxuje po dobu 1 hodiny ve 20 ml IN hydroxidu sodného. Směs se ochladí, okyselí se na pH 2 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a extrahuje se 3 krát pokaždé 25 ml ethylacetát. Organické extrakty se spojí, promyjí solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují, čímž se získá 0,8 g 5-methoxy-2-oxindolu jako žluté pevné látky. Spojený výtěžek činí 1,5 g 33%.Concentrated sulfuric acid (45 mL) containing 5 mL of water was heated to 60 ° C and 8.6 g of N (hydroxyiminoacetyl) anisidine was added in one portion. The stirred mixture was heated at 93 ° C for 10 minutes and then cooled to room temperature. The mixture was poured into 500 g of ice and extracted 3 times with ethyl acetate. The combined extracts were dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated to give 5.1 g (65% yield) of 5-methoxyisatin as a dark red solid. 5-Methoxyisatin (5.0 g) and 30 mL of hydrazine hydrate were heated at reflux for 15 minutes. The reaction mixture was cooled to room temperature and water (50 ml) was added. The mixture was extracted 3 times with 25 mL of ethyl acetate each time, the organic layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated to give a yellow solid. The solid was stirred in ethyl acetate and 1.1 g of insoluble material was removed by vacuum filtration and stored. This material is 2hydrazinocarbonylmethyl-4-anisidine. The filtrate was concentrated and chromatographed on silica gel eluting with ethyl acetate: hexane (1: 1) to give 0.7 g of 5-methoxy-2-oxindole as a yellow solid. 1.1 g of 2-hydrazino-carbonylmethyl-4-anisidine was refluxed for 1 hour in 20 ml of 1N sodium hydroxide. The mixture was cooled, acidified to pH 2 with concentrated hydrochloric acid and extracted 3 times with 25 ml of ethyl acetate each time. The organic extracts were combined, washed with brine, dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated to give 0.8 g of 5-methoxy-2-oxindole as a yellow solid. The combined yield was 1.5 g 33%.

7-azaoxindol7-Azaoxindole

3,3-dibrom-7-azaoxindol (2,9 g) se rozpustí ve směsi 20 ml octové kyseliny a 30 ml acetonitrilu. Do roztoku se přidá 6,5 g zinkového prachu. Směs se míchá po dobu 2 hodiny při pokojové teplotě. Pevná látka se odfiltruje ze směsi a rozpouštědlo se odpaří.3,3-Dibromo-7-azaoxindole (2.9 g) was dissolved in a mixture of 20 ml acetic acid and 30 ml acetonitrile. 6.5 g of zinc dust are added to the solution. The mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The solid was filtered from the mixture and the solvent was evaporated.

··· · ···· · ·

Zbytek se rozmělní s ethylacetátem. Ethylacetátový roztok obsahující nerozpustnou pevnou látku se nechá projít krátkou kolonou silikagelu. Spojené ethylacetátové roztoky se odpaří a zbytek se usuší pod vakuem, čímž se získá 1,8 g (výtěžek 91%) soli 7-azaoxindol octové kyseliny.The residue was triturated with ethyl acetate. The ethyl acetate solution containing the insoluble solid was passed through a short silica gel column. The combined ethyl acetate solutions were evaporated and the residue was dried under vacuum to give 1.8 g (91% yield) of the 7-azaoxindole acetic acid salt.

5- dimethylaminosulfonyl-2-oxindol5-dimethylaminosulfonyl-2-oxindole

Suspenze 2,3 g 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu v 10 ml 2M dimethylaminu v methanolu se míchá při pokojové teplotě po dobu 4 hodiny. Během této doby se utvoří bílá pevná látka. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 5 ml IN hydroxidu sodného a 5 ml IN chlorovodíkové kyseliny. Suší se přes noc pod vakuem při 40°C, čímž se získáA suspension of 2.3 g of 5-chlorosulfonyl-2-oxindole in 10 ml of 2M dimethylamine in methanol is stirred at room temperature for 4 hours. During this time a white solid formed. The precipitate was collected by vacuum filtration, washed with 5 ml of 1N sodium hydroxide and 5 ml of 1N hydrochloric acid. Dry overnight under vacuum at 40 ° C to yield

1,9 g (79 % výtěžek) 5-dimethylamino-sulfonyl-2-oxindolu.1.9 g (79% yield) of 5-dimethylamino-sulfonyl-2-oxindole.

6- fenyl-2-oxindol6-phenyl-2-oxindole

Dimethyl malonát (10 ml) ve 25 ml dimethylsulfoxidu se přidá po kápkách do 3,5 g hydridu sodného suspendovaného v 25 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 10 minut. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a přidá se 4,7 g 4-fluor-3nitrobifenylu ve 25 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny, zchladí se a reakce se potlačí roztokem 300 ml saturovaného chloridu amonného. Směs se třikrát extrahuje ethylacetátem a spojené organické vrstvy se promyjí vodou a solankou. Odpaří se, čímž se získá surový dimethyl-3-nitrobifenyl-4malonát jako žlutý olej.Dimethyl malonate (10 mL) in 25 mL of dimethylsulfoxide was added dropwise to 3.5 g of sodium hydride suspended in 25 mL of dimethylsulfoxide and the mixture was heated at 100 ° C for 10 minutes. The mixture was cooled to room temperature and 4.7 g of 4-fluoro-3-nitrobiphenyl in 25 ml of dimethylsulfoxide was added. The mixture was heated at 100 ° C for 2 hours, cooled and quenched with a solution of 300 mL saturated ammonium chloride. The mixture was extracted three times with ethyl acetate and the combined organic layers were washed with water and brine. Evaporate to give crude dimethyl 3-nitrobiphenyl-4-malonate as a yellow oil.

Surový dimethyl-3-nitrobifenyl-4-malonát se refluxuje ve 30 ml 6 N chlorovodíkové kyseliny po dobu 24 hodiny. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a usuší, čímž se získá 4,5 g 3-nitrobifenyl-4-octové kyseliny jako krémově zbarvené pevné látky.The crude dimethyl 3-nitrobiphenyl-4-malonate was refluxed in 30 ml of 6 N hydrochloric acid for 24 hours. The precipitate was collected by vacuum filtration, washed with water and dried to give 4.5 g of 3-nitrobiphenyl-4-acetic acid as a cream colored solid.

Železný prášek (2,6 g) se přidá všechen najednou do 4,5 g 3nitrobifenyl-4-octové kyseliny ve 40 ml octové kyseliny. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, koncentruje do sucha a vloží do ethylacetátu. Pevné látky se odstraní filtrací a filtrát se dvakrát promyje IN chlorovodíkovou kyselinou a solankou a suší se nad bezvodým síranem sodným. Filtrát se koncentruje, čímž se získá 3,4 g (93 % výtěžek) 6-fenyl-2-oxindolu jako světlehnědé pevné látky.Iron powder (2.6 g) was added all at once to 4.5 g of 3-nitrobiphenyl-4-acetic acid in 40 ml of acetic acid. The mixture was refluxed for 2 hours, concentrated to dryness and taken up in ethyl acetate. The solids were removed by filtration and the filtrate was washed twice with 1N hydrochloric acid and brine, and dried over anhydrous sodium sulfate. The filtrate was concentrated to give 3.4 g (93% yield) of 6-phenyl-2-oxindole as a light brown solid.

6-(2-methoxyfenyl)-2-oxindol6- (2-methoxyphenyl) -2-oxindole

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (1 g) se přidá do směsi 5 gTetrakis (triphenylphosphine) palladium (1 g) was added to the mixture of 5 g

2-methoxyfenylborité kyseliny, 6,6 g 5-brom-2-fluornitrobenzenu a 30 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluenu a 50 ml ethanolu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, koncentruje a zbytek se dvakrát extrahuje ethylacetátem. Ethylacetátová vrstva se promyje vodou a solankou. Poté se suší a koncentruje , čímž se získá tmavě zelený olej, který stáním tuhne, surový 4-fluor-2'-methoxy-3-nitrobifenyl.2-methoxyphenylboronic acid, 6.6 g of 5-bromo-2-fluoronitrobenzene and 30 ml of a 2 M solution of sodium carbonate in 50 ml of toluene and 50 ml of ethanol. The mixture was refluxed for 2 hours, concentrated and the residue was extracted twice with ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with water and brine. It was then dried and concentrated to give a dark green oil which solidified on standing, crude 4-fluoro-2'-methoxy-3-nitrobiphenyl.

Dimethyl malonát (14 ml) se přidá po kapkách do 2,9 g hydridu sodného suspendovaného v 50 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 15 minut a zchladí se na pokojovou teplotu. Přidá se surový 4-fluor-2'-methoxy-3-nitrobifenyl v 60 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakční směs se ochladí, ustálí se 300 ml roztoku saturovaného chloridu sodného a dvakrát se extrahuje ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí saturovaným chloridem amonným, vodou a solankou. Suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují, čímž vznikne surový dimethyl 2'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát jako žlutý olej.Dimethyl malonate (14 ml) was added dropwise to 2.9 g of sodium hydride suspended in 50 ml of dimethyl sulfoxide. The mixture was heated at 100 ° C for 15 minutes and cooled to room temperature. Crude 4-fluoro-2'-methoxy-3-nitrobiphenyl in 60 mL of dimethylsulfoxide was added and the mixture was heated at 100 ° C for 2 hours. The reaction mixture was cooled, stabilized with saturated sodium chloride solution (300 ml) and extracted twice with ethyl acetate. The combined extracts were washed with saturated ammonium chloride, water, and brine. Dry over anhydrous sodium sulfate and concentrate to give crude dimethyl 2'-methoxy-3-nitrobiphenyl-4-malonate as a yellow oil.

Surový dimethyl 2'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát se zahřívá při 100°C v 50 ml 6 N chlorovodíkové kyseliny po dobu 24 hodiny a zchladí se. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a hexanem a usuší. Získá se 9,8 g 2'- methoxy-2-nitrobifenyl-4-octové kyseliny jako světle zbarvené pevné látky.The crude dimethyl 2'-methoxy-3-nitrobiphenyl-4-malonate was heated at 100 ° C in 50 ml of 6 N hydrochloric acid for 24 hours and cooled. The precipitate was collected by vacuum filtration, washed with water and hexane and dried. 9.8 g of 2'-methoxy-2-nitrobiphenyl-4-acetic acid are obtained as a light colored solid.

······

Železný prášek (5 g) se přidá v jedné dávce do 9,8 g 2'-methoxy3-nitrobifenyl-4-octové kyseliny v 50 ml ledové kyseliny octové a zahřívá se při 100°C po dobu 3 hodiny. Reakční směs se koncentruje do sucha, sonikuje v ethylacetátu a zfiltruje se nerozpustitelný podíl. Filtrát se dvakrát promyje IN chlorovodíkovou kyselinou, vodou a poté solankou. Suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje. Zbytek se chromatografuje na silikagelu ethylacetát : hexanem (1: 2), čímž se získá 5,4 g 6-(2-methoxyfenyl)-2-oxindolu jako růžově zbarvená pevná látka.Iron powder (5 g) was added in one portion to 9.8 g of 2'-methoxy-3-nitrobiphenyl-4-acetic acid in 50 ml of glacial acetic acid and heated at 100 ° C for 3 hours. The reaction mixture was concentrated to dryness, sonicated in ethyl acetate, and the insoluble material was filtered. The filtrate was washed twice with 1N hydrochloric acid, water and then brine. Dry over anhydrous sodium sulfate and concentrate. The residue was chromatographed on silica gel with ethyl acetate: hexane (1: 2) to give 5.4 g of 6- (2-methoxyphenyl) -2-oxindole as a pink solid.

6-(3-methoxyfenyl)-2-oxindol6- (3-methoxyphenyl) -2-oxindole

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (0,8 g) se přidá do směsi 5 g 3methoxyfenylborité kyseliny, 5 g 5-brom-2-fluor-nitrobenzenu a 11 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného ve 100 ml toluenu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, zředí se vodou a extrahuje ethylacetátem. Ethylacetát se promyje saturovaným hydrogenuhličitanem sodným a solankou a poté se suší a koncentruje, čímž se získá olejovitá pevná látka. Pevná látka se chromatografuje na silikagelu (ethylacetát: hexan (1: 6)), čímž se získá 4,3 g (77% výtěžek) 4-fluor-3'-methoxy-3nitrobifenylu.Tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0.8 g) was added to a mixture of 5 g of 3-methoxyphenylboronic acid, 5 g of 5-bromo-2-fluoronitrobenzene and 11 ml of a 2 M solution of sodium carbonate in 100 ml of toluene. The mixture was refluxed for 2 hours, diluted with water and extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate was washed with saturated sodium bicarbonate and brine and then dried and concentrated to give an oily solid. The solid was chromatographed on silica gel (ethyl acetate: hexane (1: 6)) to give 4.3 g (77% yield) of 4-fluoro-3'-methoxy-3-nitrobiphenyl.

Dimethyl malonát (9,7 ml) se přidá po kapkách do 2,0 g hydridu sodného suspendovaného v 50 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 35 minut a zchladí se na pokojovou teplotu. Přidá se 4-fluor-2'-methoxy-3-nitrobifenyl (4,2 g) v 50 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při teplotě 100°C po dobu 1 hodiny. Reakční směs se ochladí a ustálí 300 ml roztokem saturovaného chloridu amonného a dvakrát se extrahuje ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují, čímž se získá surový dimethyl 3'-methoxy-3nitrobifenyl-4-malonát jako světle žlutá pevná látka.Dimethyl malonate (9.7 ml) was added dropwise to 2.0 g of sodium hydride suspended in 50 ml of dimethyl sulfoxide. The mixture was heated at 100 ° C for 35 minutes and cooled to room temperature. Add 4-fluoro-2'-methoxy-3-nitrobiphenyl (4.2 g) in 50 mL dimethylsulfoxide and heat at 100 ° C for 1 hour. The reaction mixture was cooled and quenched with 300 mL of saturated ammonium chloride solution and extracted twice with ethyl acetate. The combined extracts were washed with brine, dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated to give crude dimethyl 3'-methoxy-3-nitrobiphenyl-4-malonate as a pale yellow solid.

Surový dimethyl 3'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát se zahřívá při 110°C ve 45 ml 6N chlorovodíkové kyseliny po dobu 4 dny a poté φφ φφ φφ φφφ φφφ φ φφφ φ φφφφ φ φ φ φ φφ φφφφ φφ · φφφφ se zchladí. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a hexanem a usuší. Získá se 5,3 g 3'- methoxy-2-nitrobifenyl-4-octové kyseliny jako světle zbarvené pevné látky.The crude dimethyl 3'-methoxy-3-nitrobiphenyl-4-malonate was heated at 110 ° C in 45 mL of 6N hydrochloric acid for 4 days and then stirred at room temperature for 4 days and then stirred. cools down. The precipitate was collected by vacuum filtration, washed with water and hexane and dried. 5.3 g of 3'-methoxy-2-nitrobiphenyl-4-acetic acid are obtained as a pale colored solid.

3'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-octová kyseliny (5,2 g) se rozpustí v methanolu a hydrogenuje se přes 0,8 g 10% paladia na aktivním uhlí po dobu 3 hodiny při pokojové teplotě. Katalyzátor se odstraní filtrací, promyje se methanolem a spojené filtráty se koncentrují, čímž se získá hnědá pevná látka. Pevná látka se chromatografuje na silikagelu ethylacetát: hexan: octovou kyselinou (33: 66: 1). Získají se 3,0 g 6-(3-methoxyfeny)-2-oxindolu jako růžové pevné látky.3'-Methoxy-3-nitrobiphenyl-4-acetic acid (5.2 g) was dissolved in methanol and hydrogenated over 0.8 g of 10% palladium on charcoal for 3 hours at room temperature. The catalyst was removed by filtration, washed with methanol, and the combined filtrates were concentrated to give a brown solid. The solid is chromatographed on silica gel with ethyl acetate: hexane: acetic acid (33: 66: 1). 3.0 g of 6- (3-methoxyphenyl) -2-oxindole are obtained as a pink solid.

6-(4-meth oxy fenyl)-2-oxindol6- (4-Methoxyphenyl) -2-oxindole

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (I g) se přidá do směsi 5 g 4methoxyfenylborité kyseliny, 6,6 g 5-brom-2-fluornitrobenzenu a 30 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v ml toluenu a 50 ml ethanolu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, koncentruje a zbytek se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Ethylacetátová vrstva se promyje vodou a solankou, usuší se a koncentruje. Získá se hnědá olejovitá látka. Látka se chromatografuje na silikagelu (5 % ethylacetát v hexanu), získá se surový 4- fluor-4'methoxy-3-nitrobifenyl jako světložlutá pevná látka.Tetrakis (triphenylphosphine) palladium (1 g) was added to a mixture of 5 g of 4-methoxyphenylboronic acid, 6.6 g of 5-bromo-2-fluoronitrobenzene and 30 ml of 2 M sodium carbonate solution in ml of toluene and 50 ml of ethanol. The mixture was refluxed for 2 hours, concentrated and the residue was extracted twice with ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with water and brine, dried and concentrated. A brown oil is obtained. Chromatograph on silica gel (5% ethyl acetate in hexane) to give crude 4-fluoro-4'-methoxy-3-nitrobiphenyl as a pale yellow solid.

Dimethylmalonát (10 ml) se přidá po kapkách do 2,0 g hydridu sodného suspendovaného v 60 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 10 minut a zchladí se na pokojovou teplotu. Přidá se surový 4-fluor-2'-methoxy-3-nitrobifenyl (5,2 g) v 50 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakční směs se ochladí a ustálí přídavkem 300 ml roztoku saturovaného chloridu sodného a extrahuje se třikrát ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí saturovaným chloridem amonným, vodou a solankou. Suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se surový dimethyl-4'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát jako žlutý olej.Dimethyl malonate (10 ml) was added dropwise to 2.0 g of sodium hydride suspended in 60 ml of dimethyl sulfoxide. The mixture was heated at 100 ° C for 10 minutes and cooled to room temperature. Crude 4-fluoro-2'-methoxy-3-nitrobiphenyl (5.2 g) in 50 mL of dimethylsulfoxide was added and the mixture was heated at 100 ° C for 2 hours. The reaction mixture was cooled and stabilized by the addition of 300 ml of saturated sodium chloride solution and extracted three times with ethyl acetate. The combined extracts were washed with saturated ammonium chloride, water, and brine. Dry over anhydrous sodium sulfate and concentrate. The crude dimethyl 4'-methoxy-3-nitrobiphenyl-4-malonate was obtained as a yellow oil.

49« 949 «9

9 99 9

9« 99999 «9999

Surový dimethyl- 4'-methoxy-3-nitro-bifenyl-4-malonát se zahřívá při 100°C v 60 ml 6N kyseliny chlorovodíkové po dobu 15 hodin a zchladí se. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a hexanem a usuší. Získá se 7,2 g surového 4'-methoxy-3nitrobifenyl-4-octové kyseliny jako světle zbarvené pevné látky.The crude dimethyl 4'-methoxy-3-nitro-biphenyl-4-malonate was heated at 100 ° C in 60 ml of 6N hydrochloric acid for 15 hours and cooled. The precipitate was collected by vacuum filtration, washed with water and hexane and dried. 7.2 g of crude 4'-methoxy-3-nitrobiphenyl-4-acetic acid are obtained as a light colored solid.

Železný prášek (3,6 g) se přidá v jedné dávce do 7,2 g 4'methoxy-3-nitrobifenyl-4-octové kyseliny v 50 ml ledové kyseliny octové a zahřívá se přes noc při 100°C. Reakční směs se koncentruje do sucha, sonikuje v ethylacetátu a nerozpustné látky se odstraní filtrací. Filtrát se promyje dvakrát IN kyselinou chlorovodíkovou a solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje. Získá se 2,7 g 6-(4-methoxyfenyl)-2-oxindolu jako růžově zbarvené pevné látky.Iron powder (3.6 g) was added in one portion to 7.2 g of 4'-methoxy-3-nitrobiphenyl-4-acetic acid in 50 ml of glacial acetic acid and heated at 100 ° C overnight. The reaction mixture was concentrated to dryness, sonicated in ethyl acetate, and insoluble materials were removed by filtration. The filtrate was washed twice with 1N hydrochloric acid and brine, dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated. 2.7 g of 6- (4-methoxyphenyl) -2-oxindole are obtained as a pink solid.

6-(3-ethoxyfenyl)-2-oxindol6- (3-ethoxyphenyl) -2-oxindole

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (0,8 g) se přidá do směsi 4,2 g 3-ethoxyfenylborité kyseliny, 5,0 g 5-brom-2-fluornitrobenzenu a 22 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluenu a 50 ml ethanolu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, koncentruje, přidá se voda a směs se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Ethylacetátová vrstva se promyje vodou a solankou. Poté se usuší a koncentruje. Zbytek se chromatografuje na silikagelu (5 % ethylacetát v hexanu). Získá se 5,3 g (90 % výtěžek) surového 4-fluor-3'-ethoxy-3-nitrobifenylu jako žlutého oleje.Tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0.8 g) was added to a mixture of 4.2 g of 3-ethoxyphenylboronic acid, 5.0 g of 5-bromo-2-fluoronitrobenzene and 22 ml of a 2 M solution of sodium carbonate in 50 ml of toluene and 50 ml. ethanol. The mixture was refluxed for 2 hours, concentrated, water was added and the mixture was extracted twice with ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with water and brine. It is then dried and concentrated. The residue was chromatographed on silica gel (5% ethyl acetate in hexane). 5.3 g (90% yield) of crude 4-fluoro-3'-ethoxy-3-nitrobiphenyl are obtained as a yellow oil.

Dimethylmalonát (11,4 ml) se přidá po kapkách do 4,0 g hydridu sodného suspendovaného ve 20 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 10 minut a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Přidá se surový 4-fluor-3'-ethoxy-3-nitrobifenyl (5,3 g) ve 25 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C o dobu 2 hodiny. Reakční směs se ochladí a ustálí přídavkem 300 ml roztoku saturovaného chloridu amonného a extrahuje se třikrát ethylacetátem.Spojené extrakty se promyjí vodou a solankou a poté se .5 ♦Dimethyl malonate (11.4 mL) was added dropwise to 4.0 g of sodium hydride suspended in 20 mL of dimethyl sulfoxide. The mixture was heated at 100 ° C for 10 minutes and then cooled to room temperature. Crude 4-fluoro-3'-ethoxy-3-nitrobiphenyl (5.3 g) in 25 mL of dimethylsulfoxide was added and the mixture was heated at 100 ° C for 2 hours. The reaction mixture is cooled and stabilized by the addition of 300 ml of saturated ammonium chloride solution and extracted three times with ethyl acetate. The combined extracts are washed with water and brine and then washed with water.

• 4• 4

• φ suší nad bezvodým síranem sodným. Po zakoncentrování se získá surový dimethyl-3'-ethoxy-3-nitrobifenyl- 4-malonát jako žlutý olej.• H dried over anhydrous sodium sulfate. After concentration, crude dimethyl 3'-ethoxy-3-nitrobiphenyl-4-malonate is obtained as a yellow oil.

Surový dimethyl-3'-ethoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát se zahřívá při 100°C v 60 ml 6N kyseliny chlorovodíkové po dobu 4 dny a poté se zchladí. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a hexanem a usuší. Získá se 4,7 g surové 3 '-ethoxy-3-ni tr ob i feny 1-4octové kyseliny jako světle zbarvené pevné látky.The crude dimethyl 3'-ethoxy-3-nitrobiphenyl-4-malonate was heated at 100 ° C in 60 mL of 6N hydrochloric acid for 4 days and then cooled. The precipitate was collected by vacuum filtration, washed with water and hexane and dried. 4.7 g of crude 3'-ethoxy-3-nitrophenyl-4-acetic acid are obtained as a light-colored solid.

Železný prášek (2,4 g) se přidá v jedné dávce do 4,6 g 3'-ethoxy3-nitrobifenyl-4-octové kyseliny ve 40 ml ledové kyseliny octové a refluxuje se po dobu 2 hodiny. Reakční směs se koncentruje do sucha, znovu se nechá působit s ethylacetátem a nerozpustné látky se odstraní filtrací. Filtrát se dvakrát promyje IN kyselinou chlorovodíkovou a solankou a poté se suší nad bezvodým síranem sodným. Po zakoncentrování se získá 3,5 g (91 % výtěžek) 6-(3-ethoxyfenyl)-2oxindolu jako světlehnědé pevné látky.Iron powder (2.4 g) is added in one portion to 4.6 g of 3'-ethoxy-3-nitrobiphenyl-4-acetic acid in 40 ml of glacial acetic acid and refluxed for 2 hours. The reaction mixture was concentrated to dryness, treated again with ethyl acetate, and insoluble materials were removed by filtration. The filtrate was washed twice with 1N hydrochloric acid and brine and then dried over anhydrous sodium sulfate. After concentration, 3.5 g (91% yield) of 6- (3-ethoxyphenyl) -2-oxindole was obtained as a light brown solid.

6-brom-2-oxindol6-bromo-2-oxindole

Dimethylmalonát (13 ml) se přidá po kapkách do 2,7 g hydridu sodného suspendovaného ve 20 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 10 minut a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Přidá se 5-brom-2-fluornitrobenzen (5,0 g) ve 25 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakční směs se ochladí a ustálí přídavkem 300 ml roztoku saturovaného chloridu amonného a třikrát se extrahuje ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí saturovaným chloridem sodným, vodou a solankou. Suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se surový dimethyl-4-brom-2-nitrofenylmalonát jako světle žlutý olej.Dimethyl malonate (13 ml) was added dropwise to 2.7 g of sodium hydride suspended in 20 ml of dimethyl sulfoxide. The mixture was heated at 100 ° C for 10 minutes and then cooled to room temperature. Add 5-bromo-2-fluoronitrobenzene (5.0 g) in 25 mL of dimethylsulfoxide and heat the mixture at 100 ° C for 2 hours. The reaction mixture is cooled and stabilized by the addition of 300 ml of saturated ammonium chloride solution and extracted three times with ethyl acetate. The combined extracts were washed with saturated sodium chloride, water, and brine. Dry over anhydrous sodium sulfate and concentrate. The crude dimethyl 4-bromo-2-nitrophenylmalonate was obtained as a pale yellow oil.

Surový dimethyl-4-brom-2-nitrofenylmalonát se zahřívá při 110°C ve 40 ml 6N kyseliny chlorovodíkové po dobu 24 hodin a poté se zchladí. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a usuší. Získá se 5,3 g (89 % výtěžek) 4-brom-2-nitro-fenyloctové kyseliny jako šedé pevné látky.The crude dimethyl 4-bromo-2-nitrophenylmalonate was heated at 110 ° C in 40 mL of 6N hydrochloric acid for 24 hours and then cooled. The precipitate was collected by vacuum filtration, washed with water and dried. 5.3 g (89% yield) of 4-bromo-2-nitro-phenylacetic acid are obtained as a gray solid.

• · ♦ · * · * * · · · I * · ; · nc\ · · · · · * - * /y · Z · · ··· ·· ···· ··• I * I * I *; · Nc \ · · · · * - * / y · Z · · ··· ·· ······

4-brom-2-nitrofenyloctová kyselina (0,26 g), 0,26 g zinkového prachu a 3 ml 50 % kyseliny sírové v 5 ml ethanolu se zahřívá přes noc při teplotě 100°C. Reakční směs se zfiltruje, zředí se malým množstvím kyseliny octové, odstraní se ethanol, zředí se vodou a dvakrát se extrahuje ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se 0,19 g (90 % výtěžek) 6-brom-2-oxindolu jako žluté pevné látky.4-Bromo-2-nitrophenylacetic acid (0.26 g), 0.26 g of zinc dust and 3 ml of 50% sulfuric acid in 5 ml of ethanol were heated at 100 ° C overnight. The reaction mixture was filtered, diluted with a small amount of acetic acid, ethanol was removed, diluted with water and extracted twice with ethyl acetate. The combined extracts were washed with brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated. 0.19 g (90% yield) of 6-bromo-2-oxindole was obtained as a yellow solid.

5-acetyl-2-oxindol5-acetyl-2-oxindole

2-oxindol (3 g) se suspenduje v 1,2-dichlorethanu a pomalu se přidá 3,2 ml acetylchloridu. Výsledná suspenze se zahřívá při 50°C po dobu 5 hodin, zchladí se a přelije do vody. Výsledný precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, řádně se promyje vodou a usuší se pod vakuem. Získá se 2,9 g (73 % výtěžek) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.2-Oxindole (3 g) was suspended in 1,2-dichloroethane and 3.2 mL of acetyl chloride was added slowly. The resulting suspension was heated at 50 ° C for 5 hours, cooled and poured into water. The resulting precipitate was collected by vacuum filtration, washed well with water, and dried under vacuum. 2.9 g (73% yield) of the title compound are obtained as a brown solid.

5-butanoyl-2-oxindol5-Butanoyl-2-oxindole

Do 15 g chloridu hlinitého suspendovaného ve 30 ml 1,2-dichlorethanu v ledové lázni se přidá 7,5 g 2-oxindolu a poté 12 g butanoylchloridu. Výsledná suspenze se zahřívá přes noc při 50°C. Směs se nalije do ledové vody a třikrát se extrahuje ethylacetátem. Spojené ethylacetátové vrstvy se promyjí solankou, suší se nad síranem sodným a koncentrují do sucha. Získá se hnědá pevná látka, která se chromatografuje na silikagelu (50 % ethylacetát v hexanu). Získají se 3 g (25%) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.To 15 g of aluminum chloride suspended in 30 ml of 1,2-dichloroethane in an ice bath was added 7.5 g of 2-oxindole followed by 12 g of butanoyl chloride. The resulting suspension was heated at 50 ° C overnight. The mixture was poured into ice water and extracted three times with ethyl acetate. The combined ethyl acetate layers were washed with brine, dried over sodium sulfate and concentrated to dryness. A brown solid is obtained which is chromatographed on silica gel (50% ethyl acetate in hexane). 3 g (25%) of the desired compound is obtained as a yellow solid.

5-kyanoethyl-2-oxindol5-Cyanoethyl-2-oxindole

Kyanid draselný (2,0 g) se přidá do 15 ml dimethylsulfoxidu a zahřeje se na 90°C. Za stálého míchání se pomalu přidá 5-chlorethyl2-oxindol (3,0 g) rozpuštěný v 5 ml dimethylsulfoxidu a reakce se zahřívá při 150°C po dobu 2 hodiny. Směs se ochladí, přelije do ledové vody a precipitát se shromáždí vakuovou filtrací. Promyje se vodou, usuší a poté se chromatografuje na silikagelu (5 % méthanol v chloroformu). Získá se 1,2 g (42 % výtěžek) požadované sloučeniny.Potassium cyanide (2.0 g) was added to 15 mL of dimethyl sulfoxide and heated to 90 ° C. While stirring, 5-chloroethyl 2-oxindole (3.0 g) dissolved in 5 ml of dimethylsulfoxide is slowly added and the reaction is heated at 150 ° C for 2 hours. The mixture was cooled, poured into ice water and the precipitate collected by vacuum filtration. It is washed with water, dried and then chromatographed on silica gel (5% methanol in chloroform). 1.2 g (42% yield) of the title compound are obtained.

6-morfolino-4-yl-2-oxindol6-Morpholino-4-yl-2-oxindole

6-amino-2-oxindol (2,2 g), 4,0 g 2,2'-dibromethyletheru a 7,9 g uhličitanu sodného se přes noc refluxuje ve 20 ml ethanolu, koncentruje se a zředí 50 ml vody. Směs se třikrát extrahuje 50 ml ethylacetátu a spojené organické extrakty se promyjí 20 ml solanky, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se do sucha. Pevná látka se chromatografuje na sloupci silikagelu (ethylacetát: hexan (1: 1) obsahující 0,7 % kyseliny octové). Získá se 1,2 g (37 % výtěžek) požadované sloučeniny jako béžové pevné látky.6-Amino-2-oxindole (2.2 g), 4.0 g of 2,2'-dibromoethyl ether and 7.9 g of sodium carbonate were refluxed overnight in 20 ml of ethanol, concentrated and diluted with 50 ml of water. The mixture was extracted three times with 50 ml of ethyl acetate and the combined organic extracts were washed with 20 ml of brine, dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated to dryness. The solid is chromatographed on a silica gel column (ethyl acetate: hexane (1: 1) containing 0.7% acetic acid). 1.2 g (37% yield) of the title compound are obtained as a beige solid.

6-(3-trifluoracetylfenyl)-2-oxindol6- (3-Trifluoroacetylphenyl) -2-oxindole

3-aminofenylboritá kyselina (3,9 g), 5 g 5-brom-2fluornitrobenzenu, 0,8 g tetrakis(trifenylfosfin)paladia a 23 ml 2 M roztoku hydrogenuhličitanu sodného v 50 ml toluenu se refluxuje pod dusíkem po dobu 2,5 hodiny. Reakční směs se nalije do 200 ml ledové vody a směs se třikrát extrahuje 50 ml ethylacetátu. Spojené organické vrstvy se promyjí 50 ml vody a 20 ml solanky, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se 9,7 g (92 % výtěžek) 2-fluor-5-(3-aminofenyl)nitrobenzenu jako tmavě hnědého o 1 e j e.3-Aminophenylboronic acid (3.9 g), 5 g of 5-bromo-2-fluoronitrobenzene, 0.8 g of tetrakis (triphenylphosphine) palladium and 23 ml of a 2M solution of sodium bicarbonate in 50 ml of toluene are refluxed under nitrogen for 2.5 hours . The reaction mixture was poured into 200 ml of ice-water and extracted three times with 50 ml of ethyl acetate. The combined organic layers were washed with 50 mL water and 20 mL brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated. 9.7 g (92% yield) of 2-fluoro-5- (3-aminophenyl) nitrobenzene are obtained as a dark brown oil.

Anhydrid trifluoroctové kyseliny (5,4 ml) se pomalu přidá do míchaného roztoku 9,7 g 2-fluor-5-(3-aminofenyl)-nitrobenzenu a 5,3 ml triethylaminu v 50 ml dichlormethanu za teploty 0°C a směs se míchá po dobu dalších 20 minut. Směs se koncentruje a zbytek se chromatografuje na sloupci silikagelu (10 % ethylacetát v hexanu). Získá se 8,6 g (65 % výtěžek) 2-fluor-5-(3« · • · · • · • · • · · · · ♦ · • i · · • 4 · * · • I 1· · ♦ «··· ··· ·· · · trifluoracetamidofenyl)nitrobenzenu jako světle oranžového oleje, který stáním tuhne.Trifluoroacetic anhydride (5.4 ml) was slowly added to a stirred solution of 9.7 g of 2-fluoro-5- (3-aminophenyl) -nitrobenzene and 5.3 ml of triethylamine in 50 ml of dichloromethane at 0 ° C and the mixture was stirred at room temperature. Stir for another 20 minutes. The mixture was concentrated and the residue was chromatographed on a silica gel column (10% ethyl acetate in hexane). 8.6 g (65% yield) of 2-fluoro-5- (3%) are obtained. Trifluoroacetamidophenyl) nitrobenzene as a pale orange oil which solidifies on standing.

Dimethylmalonát (9,6 ml) se přidá po kapkách do míchané suspenze 3,2 g 60 % hydridu sodného v minerálním oleji ve 40 ml bezvodého dimethylsulfoxidu pod dusíkem. Směs se míchá po dobu 10 minut a přidá se 2-fluor-5-(3-trifluoracetamido-fenyl)nitrobenzen ve 20 ml dimethylsulfoxidu. Výsledná tmavoěervená směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakce se zhasne přelitím do roztoku 100 ml saturovaného chloridu amonného a dvakrát se extrahuje 50 ml ethylacetátu. Organická fáze se promyje roztokem saturovaného chloridu amonného, vodou a solankou, vždy 50 ml. Suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje. Získaný žlutý olej se chromatografuje na sloupci silikagelu (ethylacetát: hexan (1: 4)). Získá se 4,4 g (50 % výtěžek) dimethyl-2-[2-nitro-4-(3trifluoracetamidofenyl)fenyl]-malonátu jako světložluté látky.Dimethyl malonate (9.6 ml) was added dropwise to a stirred suspension of 3.2 g of 60% sodium hydride in mineral oil in 40 ml of anhydrous dimethylsulfoxide under nitrogen. The mixture was stirred for 10 minutes and 2-fluoro-5- (3-trifluoroacetamido-phenyl) nitrobenzene in 20 mL of dimethyl sulfoxide was added. The resulting dark red mixture was heated at 100 ° C for 2 hours. The reaction was quenched by pouring into a solution of 100 mL of saturated ammonium chloride and extracted twice with 50 mL of ethyl acetate. The organic phase was washed with saturated ammonium chloride solution, water and brine, each with 50 ml. Dry over anhydrous sodium sulfate and concentrate. The resulting yellow oil is chromatographed on a silica gel column (ethyl acetate: hexane (1: 4)). 4.4 g (50% yield) of dimethyl 2- [2-nitro-4- (3-trifluoroacetamidophenyl) phenyl] malonate are obtained as a pale yellow solid.

Dimethyl-2- [2 -nitro-4-(3 -tri fluor ac etami do fenyl)-feny ljmal on át (4,4 g) se refluxuje přes noc v 50 ml 6N kyseliny chlorovodíkové. Reakění směs se ochladí na pokojovou teplotu a pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a suší pod vakuem. Získá se 2,7 g (73 % výtěžek) 2-[2-nitro-4-(3tr i fl uor ace tam i do fenyl) fenyl] octové kyseliny.Dimethyl 2- [2-nitro-4- (3-trifluoroacetylphenyl) phenyl] phthalate (4.4 g) was refluxed overnight in 50 ml of 6N hydrochloric acid. The reaction mixture was cooled to room temperature and the solid was collected by vacuum filtration, washed with water and dried under vacuum. 2.7 g (73% yield) of 2- [2-nitro-4- (3-trifluoromethylphenyl) phenyl] acetic acid are obtained.

2- [2-nitro-4-(3-trifluoracetamidofenyl)fenyl] octová kyseliny (100 mg) a 50 mg železného prášku ve 3 ml kyseliny octové se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakční směs se koncentruje a zbytek se sonikuje v 5 ml ethylacetátu. Nerozpustné látky se odstraní vakuovou filtrací a filtrát se promyje IN kyselinou chlorovodíkovou, vodou a solankou. Suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje. Získá se 10 mg (14 % výtěžek) požadované sloučeniny jako růžově zbarvené pevné látky.2- [2-nitro-4- (3-trifluoroacetamidophenyl) phenyl] acetic acid (100 mg) and 50 mg of iron powder in 3 mL acetic acid were heated at 100 ° C for 2 hours. The reaction mixture was concentrated and the residue was sonicated in 5 mL of ethyl acetate. Insoluble materials were removed by vacuum filtration and the filtrate was washed with 1N hydrochloric acid, water and brine. Dry over anhydrous sodium sulfate and concentrate. This gave 10 mg (14% yield) of the title compound as a pink solid.

í * .: í ‘í *.: í ‘

I « « · a ·· «··» »» · ·*I «« «and» «»

B. AldehydyB. Aldehydes

5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-karboxylová kyselina t-butyl-3-oxobutyrát (158 g, 1 mol) se rozpustí ve 200 ml kyseliny octové v 500 ml trojhrdlé baňky s kulatým dnem vybavené teploměrem, přídavnou nálevkou a mechanickým míchadlem. Směs se ochladí v ledové lázni na teplotu okolo 10°C. Dusitan sodný (69 g, 1 mol) se přidává 75 minut za teploty udržované pod 15°C. Ledová lázeň se odstraní a směs se míchá po dobu 30 minut a nechá se stát po dobu 3,5 hodiny. Získá se t-butyl-2-hydroximino-3-oxobutyrát.5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxylic acid t-butyl-3-oxobutyrate (158 g, 1 mol) is dissolved in 200 ml acetic acid in a 500 ml three-necked round-bottom flask equipped with a thermometer, additional funnel and mechanical stirrer. The mixture was cooled in an ice bath to about 10 ° C. Sodium nitrite (69 g, 1 mol) was added over 75 minutes at a temperature maintained below 15 ° C. The ice bath was removed and the mixture stirred for 30 minutes and allowed to stand for 3.5 hours. T-Butyl 2-hydroximino-3-oxobutyrate is obtained.

Ethyl-3-oxobutyrát (130 g, 1 mol) se rozpustí ve 400 ml kyseliny octové v 2 L trojhrdlé baňce s kulatým dnem vybavené teploměrem, přídavnou nálevkou, mechanickým míchadlem a umístí se do olejové lázně. Přidá se zinkový prach (50 g, 0,76 mol) a směs se za stálého míchání zahřívá při 60°C. Pomalu se přidá dříve připravený roztok tbutyl-2-hydroximino-3-oxobutyrátu, teplota reakční směsi se udržuje okolo 65°C. Poté se přidá další zinkový prach (4 x 50 g, 3,06 mol), přičemž poslední dávka se přidá poté, co byl přidán všechen tbutylester. Na konci přidávání je teplota 64°C. Teplota se zvýší na 70 až 75°C, míchá se po dobu jedné hodiny a poté se přelije do 5 L vody.Ethyl 3-oxobutyrate (130 g, 1 mol) was dissolved in 400 mL of acetic acid in a 2 L three-necked round bottom flask equipped with a thermometer, an addition funnel, a mechanical stirrer, and placed in an oil bath. Zinc dust (50 g, 0.76 mol) was added and the mixture was heated to 60 ° C with stirring. The previously prepared t-butyl-2-hydroximino-3-oxobutyrate solution was added slowly, maintaining the temperature of the reaction mixture at about 65 ° C. Additional zinc dust (4 x 50 g, 3.06 mol) was then added, the last portion being added after all the t-butyl ester was added. At the end of the addition, the temperature was 64 ° C. The temperature is raised to 70-75 ° C, stirred for one hour and then poured into 5 L of water.

Šedý vznášející se precipitát se shromáždí vakuovou filtrací a promyje 2 L vody. Získá se 354 g mokrého surového produktu. Surový produkt se rozpustí v 1 L horkého methanolu a zinek se odstraní filtrací za horka. Filtrát se ochladí, čímž se utvoří precipitát. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací a usuší. Získá se 118 g produktu. Filtrát se ponechá přes noc v chladničce, vytvoří se další část precipitátu. Dohromady se získá 173,2 g 2-tert-butylesteru 4ethylesteru 3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2,4-dikarboxylové kyseliny.The gray floating precipitate was collected by vacuum filtration and washed with 2 L of water. 354 g of wet crude product is obtained. The crude product was dissolved in 1 L of hot methanol and the zinc was removed by hot filtration. The filtrate was cooled to form a precipitate. The precipitate was collected by vacuum filtration and dried. 118 g of product are obtained. The filtrate is left in the refrigerator overnight to form another portion of the precipitate. Together, 173.2 g of 3,5-dimethyl-1H-pyrrole-2,4-dicarboxylic acid 2-tert-butyl ester 4-ethyl ester 4-ethyl ester are obtained.

2-tert-butylester 4-ethylester 3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2,4dikarboxylové kyseliny (80,1 g, 0,3 mol) a 400 ml kyseliny trifluoroctové se míchá po dobu 5 minut v 2 L trojhrdlé baňce s kulatým dnem vybavené mechanickým míchadlem a zahřáté na 40°C t··· ·ΦΦ • ΦΦ φ» ·Φ··3,5-Dimethyl-1H-pyrrole-2,4-dicarboxylic acid 2-tert-butyl ester 4-ethyl ester (80.1 g, 0.3 mol) and 400 ml of trifluoroacetic acid are stirred for 5 minutes in a 2 L three-necked flask with round bottom equipped with mechanical stirrer and heated to 40 ° C t ··· · ΦΦ • ΦΦ φ »· Φ ··

100 ml vody. Tmavý zbytek se v olejové lázni. Směs se poté zchladí na -5°C a najednou se přidá a triethylorthoformiát (67,0 g, 0,45 mol). Teplota se zvýší na 15°C. Směs se míchá 1 minutu, odstraní se z ledové lázně a míchá se po dobu 1 hodiny. Trifluoroctová kyselina se odstraní na rotační odparce a zbytek se vloží do chladničky, kde ztuhne. Pevná látka se zahřátím rozpustí a přelije do 500 g ledu. Směs se extrahuje 800 ml dichlormethanu . Získá se červený roztok a hnědý precipitát, obojí se uschová. Precipitát se izoluje a promyje 150 ml roztoku saturovaného hydrogenuhličitanu sodného . Dichloromethanová fáze se také promyje 150 ml hydrogenuhličitanu sodného. Dichlormethanový roztok se poté promyje nejméně třikrát100 ml water. The dark residue is in an oil bath. The mixture was then cooled to -5 ° C and triethyl orthoformate (67.0 g, 0.45 mol) was added all at once. The temperature is raised to 15 ° C. The mixture was stirred for 1 minute, removed from the ice bath and stirred for 1 hour. The trifluoroacetic acid was removed on a rotary evaporator and the residue was placed in a refrigerator where it solidified. The solid dissolved by heating and poured into 500 g of ice. The mixture is extracted with 800 ml of dichloromethane. A red solution and a brown precipitate are obtained, and both are stored. The precipitate is isolated and washed with 150 ml of saturated sodium bicarbonate solution. The dichloromethane phase was also washed with 150 ml of sodium bicarbonate. The dichloromethane solution is then washed at least three times

Dichlormethanový roztok se odpaří do sucha, dvakrát rekrystalizuje z ethylacetátu obsahujícího Darko černý uhlík. Získají se zlatě žluté jehličky. Hnědý precipitát se rekrystalizuje z 350 ml ethylacetátu také obsahující Darko. Získá se červenožlutá pevná látka. Všechny rekrystalizované látky se spojí a rekrystalizují z 500 ml ethanolu. Získá se 37,4 g (63,9 %) ethylesteru 5-formyl-2,4dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny jako žlutých jehliček (bod tání 165,6-166,3°C, lit. 163-164°C). Zbytky získané odpařením ethylacetátového a ethanolového matečného roztoku se spojí a rekrystalizují z 500 ml ethanol. Získá se druhá část produktu (10,1 g) jako špinavé žluté jehličky.The dichloromethane solution was evaporated to dryness, recrystallized twice from ethyl acetate containing Darko black carbon. Golden yellow needles are obtained. The brown precipitate is recrystallized from 350 ml of ethyl acetate also containing Darko. A red-yellow solid is obtained. All recrystallized substances were combined and recrystallized from 500 ml of ethanol. 37.4 g (63.9%) of 5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxylic acid ethyl ester are obtained as yellow needles (m.p. 165.6-166.3 ° C, lit. 163-164). ° C). The residues obtained by evaporating the ethyl acetate and ethanol mother liquors were combined and recrystallized from 500 ml of ethanol. A second crop of product (10.1 g) was obtained as dirty yellow needles.

Ethylester 5-formy 1-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (2 g, 10 mmol) se přidá do roztoku hydroxidu sodného (3 g, 53 mmol) rozpuštěného v methanolu (3 ml) a vodě (10 ml). Směs se refluxuje po dobu 3 hodiny, zchladí se na pokojovou teplotu a okyselí se 6 N kyselinou chlorovodíkovou na pH 3. Utvoří se pevná látka, která se shromáždí filtrací, promyje vodou a suší se přes noc ve vakuové peci. Získá se 1,6 g (93 %) 5-formyl-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny.Add 5-form 1-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxylic acid ethyl ester (2 g, 10 mmol) to a solution of sodium hydroxide (3 g, 53 mmol) dissolved in methanol (3 mL) and water ( 10 ml). The mixture was refluxed for 3 hours, cooled to room temperature and acidified to pH 3 with 6 N hydrochloric acid. A solid formed which was collected by filtration, washed with water and dried in a vacuum oven overnight. 1.6 g (93%) of 5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxylic acid are obtained.

‘HNMR (300 MHz, DMSO-ds) δ: 12,09 (s, br, 2H, NH & COOH), 9,59 (s, 1H, CHO), 2,44 (s, 3H, CH₃), 2,40 (s, 3H, CH₃).1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ: 12.09 (s, br, 2H, NH & COOH), 9.59 (s, 1H, CHO), 2.44 (s, 3H, CH ₃ ), 2.40 (s, 3H, CH _3).

··· · 4 • » · ···· · 4

(2-dimethylaminoethyl)amid 5-formy 1-2,4-dimethy 1-1 H-pyrrol-3karboxylové kyseliny5-Form 1-2,4-Dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxylic acid (2-dimethylamino-ethyl) -amide

Do směsi 5-formyl-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (1,67 g, 10 mmol) v dimethylforamidu (10 ml) se přidá benzo triazol -1 -yloxytris(dimethylamino)fosfoniumhexafluorfosfát (BOP činidlo, 6 g, 13,5 mmol) , poté 3 ml diizopropylthylaminu. Po 5 minutách míchání se přidá 1 ml N, N-dimethylthylndiaminu a směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 24 hodin. Do reakční směsi se přidá 25 ml IN hydroxidu sodného a 25 ml solanky. Po 30 minutách míchání se reakční směs nalije do vody (100 ml) a extrahuje (3 x 200 ml) 10 % methanolem v dichlormethanu. Spojené organické vrstvy se suší nad bezvodým síranem sodným a odpaří na rotační odparce. Zbytek se přečistí kolonovou chromatografií (silikagel, 5 %-10 % methanol v dichlormethanu). Získá se 1 g (42 %) 5-formyl-2,4dimethyl -1 H-pyrro 1-3-karboxylové kyseliny (2-dimethylamino-ethyl)amidu.To a mixture of 5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxylic acid (1.67 g, 10 mmol) in dimethylformamide (10 mL) was added benzotriazole-1-yloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP reagent) (6 g, 13.5 mmol) followed by 3 mL of diisopropylthylamine. After stirring for 5 minutes, 1 ml of N, N-dimethylthylenediamine was added and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. To the reaction mixture were added 25 ml of 1N sodium hydroxide and 25 ml of brine. After stirring for 30 minutes, the reaction mixture was poured into water (100 mL) and extracted (3 x 200 mL) with 10% methanol in dichloromethane. The combined organic layers were dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated on a rotary evaporator. The residue was purified by column chromatography (silica gel, 5% -10% methanol in dichloromethane). 1 g (42%) of 5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrole of 1-3-carboxylic acid (2-dimethylamino-ethyl) -amide is obtained.

'H NMR (360 MHz, DMSO-d₆)d: 11,77 (s, 1H, NH), 9,53 (s, 1H, CHO), 7,34 (t, J = 5,6 Hz, 1H, CONH), 3,27 (m, 2H, CONCH2CH2), 2,37 (t, J - 6,8 Hz, 2H, CONCH2CH2), 2,35 (s, 3H, CH₃), 2,3 (s, 3H, CH₃), 2,17 (s, 6H, 2 x CH₃), MS m/z 238,3 [M+l] ⁺ 1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ) d: 11.77 (s, 1H, NH), 9.53 (s, 1H, CHO), 7.34 (t, J = 5.6 Hz, 1H) (CONH), 3.27 (m, 2H, CONCH 2 CH 2), 2.37 (t, J = 6.8 Hz, 2H, CONCH 2 CH 2), 2.35 (s, 3H, CH ₃ ), 2.3 (s 3H, CH ₃ ), 2.17 (s, 6H, 2 x CH ₃ ), MS m / z 238.3 [M + 1] ⁺

3,5-dimethyl-4- (4-methyl-piperazin -1 -karbonyl)-1 H-pyrrol-2karboxaldehyd3,5-Dimethyl-4- (4-methyl-piperazine-1-carbonyl) -1H-pyrrole-2-carboxaldehyde

Do směsi 5-formyl-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-karboxylové kyseliny (1,67 g, 10 mmol) v dimethylformamidu (10 ml) se přidá benzotriazol-1-yloxytris (dimethylamino)- fosfonium hexafluorfosfát (BOP činidlo, 6 g, 13,5 mmol) , poté 3 ml diizopropylthylaminu. Po 5 minutách míchání se přidají 2 ml 1-methylpiperazinu a směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 24 hodin. Do směsi se poté přidá 25 ml IN hydroxidu sodného a 25 ml solanky. Po 30 minutách mícháni se reakční směs nalije do vody (100 ml) a extrahuje (3x 200 ml) 10 % methanolem v dichlormethanu. Spojené organické vrstvy se suší nad bezvodým síranem sodným a odpaří se na rotační odparce. Zbytek se přečistí kolonovou chromatografií (silikagel, 5 % - 10 % methanol v dichlormethanu). Získá se 1 g (40 %) 3,5-dimethyl-4-(4-methylpiperazin-1 -karbony l)-lH-pyrrol-2-karboxaldehydu.To a mixture of 5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxylic acid (1.67 g, 10 mmol) in dimethylformamide (10 mL) was added benzotriazol-1-yloxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP). reagent, 6 g, 13.5 mmol) then 3 mL of diisopropylthylamine. After stirring for 5 minutes, 2 ml of 1-methylpiperazine was added and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. 25 ml of 1N sodium hydroxide and 25 ml of brine are then added to the mixture. After stirring for 30 minutes, the reaction mixture was poured into water (100 mL) and extracted (3 x 200 mL) with 10% methanol in dichloromethane. The combined organic layers were dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated on a rotary evaporator. The residue was purified by column chromatography (silica gel, 5% -10% methanol in dichloromethane). 1 g (40%) of 3,5-dimethyl-4- (4-methylpiperazine-1-carbonyl) -1H-pyrrole-2-carboxaldehyde is obtained.

*H NMR (360 MHz, DMSO-dg) δ: 11,82 (s, 1H, NH), 9,50 (s, 1H, CHO), 3,14 (br m, 4H, 2xCH₂), 2,29 (br m, 4H, 2xCH₂), 2,19 (s, 3H, CH₃), 2,17 (s, 3H, CH₃), 2,14 (s, 3H, CH₃),1 H NMR (360 MHz, DMSO-d 6) δ: 11.82 (s, 1H, NH), 9.50 (s, 1H, CHO), 3.14 (br m, 4H, 2xCH ₂ ), 2, 29 (br m, 4H, 2xCH _2), 2.19 (s, 3H, _CH3), 2.17 (s, 3H, _CH3), 2.14 (s, 3H, _CH3);

MS El 249 [M] ⁺.MS EI 249 [M] ⁺ .

C. Příklady- syntézy pyrrolem substituovaných 2-indolinonůC. Examples - Synthesis of pyrrole substituted 2-indolinones

Následující syntézy representativních sloučenin tohoto vynálezu ukazují pouze příklady přípravy a nejsou konstruovány tak, aby omezovali rozsah tohoto vynálezu jako je syntetický přístup nebo sloučeniny obsažené v tomto vynálezu.The following syntheses of representative compounds of the invention show only examples of preparation and are not designed to limit the scope of the invention, such as the synthetic approach or compounds of the invention.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Příklad 1Example 1

3- [5-(5-chlor-2-oxo-l ,2 -dihydro indol-3-y li denmethy l)-4-methyllH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-chloro-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylmethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (4,5 g), 4,2 g 5chlor-2-oxindolu, a 2,9 ml piperidinu v 50 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v acetonu a žlutý precipitát se zfiltruje, promyje studeným ethanolem, 2 N vodnou kyselinou chlorovodíkovou a vodou na pH 6. Poté se suší přes noc ve vakuové peci. Získá se 7,2 g požadované sloučeniny (88 %) jako žluté pevné látky 'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,31 (s, br, 1H, NH-1'), 12,06 (s, br, 1H, COOH), 10,88 (s, br, 1H, NH-1), 7,93 (d, J = 1,88 Hz, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-vinyl), 7,19 (d, J = 3,1 Hz, 1H, H-2'), 7,1 (dd, b, J = 1,88, 8,40 Hz, 1H, H-6), 6,84 (d, J - 8,40 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,44 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,44 Hz, 2H,4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (4.5 g), 4.2 g of 5-chloro-2-oxindole, and 2.9 mL of piperidine in 50 mL of ethanol are heated at 95 ° C for 5 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in acetone and the yellow precipitate was filtered, washed with cold ethanol, 2 N aqueous hydrochloric acid and water to pH 6. It was then dried overnight in a vacuum oven. 7.2 g of the desired compound (88%) are obtained as a yellow solid. 1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.31 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.06 (s) , br, 1H, COOH), 10.88 (s, br, 1H, NH-1), 7.93 (d, J = 1.88 Hz, 1H, H-4), 7.75 (s, 1H H-vinyl), 7.19 (d, J = 3.1 Hz, 1H, H-2 '), 7.1 (dd, b, J = 1.88, 8.40 Hz, 1H, H- 6), 6.84 (d, J - 8.40 Hz, 1H, H-7), 2.65 (t, J = 7.44 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.46 (t J = 7.44 Hz 2H

CH₂CH₂COOH), 2,28 (s, 3H, CH₃);CH ₂ CH ₂ COOH), 2.28 (s, 3H, CH ₃ );

Příklad 2Example 2

3- [5-(6-methoxy-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (6-Methoxy-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (190 mg), 163 mg 6-methoxy-2-indolu a 2 kapky piperidinu se zahřívají ve 2 ml ethanolu při 90°C po dobu 3 hodiny. Reakční směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší ve vakuové peci. Získá se 140 mg požadované sloučeniny (43%) jako hnědé pevné látky.4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (190 mg), 163 mg of 6-methoxy-2-indole and 2 drops of piperidine were heated in 2 ml of ethanol at 90 ° C for 3 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate is filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven. 140 mg of the desired compound (43%) are obtained as a brown solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,1 (s, br, 1H, NH-1'), 12,04 (s, br, 1H, COOH), 10,76 (s, br, 1H, NH-1), 7,63 (d, J = 8,29 Hz, 1H, H-4), 7,46 (s, 1H, H-vinyl), 7,07 (d, J = 3,03 Hz, 1H, H-2'), 6,55 (dd, J = 2,32, 8,29 Hz, 1H, H-5), 6,43 (d, J = 2,32 Hz, 1H, H-7), 3,74 (s, 3H, OCH₃), 2,63 (t, J = 7,31 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,45 (t, J = 7,31 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,23 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 327 ([M+l] ⁺, 100).1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.1 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.04 (s, br, 1H, COOH), 10.76 (s, br, 1H, NH-1), 7.63 (d, J = 8.29Hz, 1H, H-4), 7.46 (s, 1H, H-vinyl), 7.07 (d, J = 3, 03 Hz, 1H, H-2 &apos;), 6.55 (dd, J = 2.32, 8.29 Hz, 1H, H-5), 6.43 (d, J = 2.32 Hz, 1H, H-7), 3.74 (s, 3H, _OCH3), 2.63 (t, J = 7.31 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.45 (t, J = 7.31 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.23 (s, 3H, CH _3); MS m / z (relative intensity,%) 327 ([M + 1] ⁺ , 100).

Příklad 3Example 3

3-[5-(5-chlor-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethy 1-1H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-Chloro-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (220 mg), 147 mg 5-chlor-2-oxindolu a 2 kapky piperidinu se zahřívají ve 2 ml ethanolu při 90°C po dobu 3 hodiny. Reakční směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci . Získá se 172 mg požadované sloučeniny (50 %) jako hnědé pevné látky.3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole (220 mg), 147 mg of 5-chloro-2-oxindole and 2 drops of piperidine were heated in 2 ml of ethanol at 90 ° C for 3 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate is filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven. 172 mg of the desired compound (50%) are obtained as a brown solid.

^lHNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,42 (s, br, 1H, NH-1’), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,80 (s, br, 1H, NH-1), 7,87 (d, J = 2,06 Hz, 1H, H-4), 7,67 (s, 1H, H-vinyl), 7,06 (dd, J = 2,06, 8,3 Hz, 1H, H-6), 6,83 (d, J = 8,3 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J - 7,6 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,6 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2,27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 345 ( [M+l] ⁺ , 64). ¹ HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.42 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.03 (s, br, 1H, COOH), 10.80 (s, br, 1H, NH-1), 7.87 (d, J = 2.06 Hz, 1H, H-4), 7.67 (s, 1H, H-vinyl), 7.06 (dd, J = 2, 06, 8.3 Hz, 1H, H-6), 6.83 (d, J = 8.3 Hz, 1H, H-7), 2.64 (t, J = 7.6 Hz, 2H, CH) ₂ CH ₂ COOH), 2.34 (t, J = 7.6 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.29 (s, 3H, CH ₃ ), 2.27 (s, 3H, CH ₃₎ ); MS m / z (relative intensity,%) 345 ([M + 1] ⁺ , 64).

Příklad 4Example 4

3-[4-methyl-5-(2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-lHpyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [4-Methyl-5- (2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

Kovový sodík (1,5 g) se vloží do 3 L trojhrdlé baňky s kulatým dnem vybavené teploměrem, refluxním kondenzátorem a mechanickým míchadlem umístěné v olejové lázni. Za stálého míchání se přidá absolutní ethanol (1 L). Když se sodík rozpustí, přidá se najednou 350 g pentan-2,4-dionu a poté se v průběhu 30 minut přidá 310 g ethylakrylátu. Směs se refluxuje po dobu 2,5 hodiny a poté se přes noc zchladí na pokojovou teplotu. Přidá se ledová kyselina octová (3 ml) a rozpouštědlo se odstraní na rotační odparce. Zbytek se zfiltruje přes vrstvu křemeliny a destiluje v koloně s tenkým filmem při 0,1 mm. Destilát se redestiluje použitím 10 palcové vakuové opláštěné Vigreux kolony, čímž se získá 518 g ethyl-5-acetyl-4-oxohexanoátu, bod tání 84-92°C při 0,2 - 0,7 mm.Sodium metal (1.5 g) was placed in a 3 L three-necked round-bottom flask equipped with a thermometer, reflux condenser and mechanical stirrer placed in an oil bath. Absolute ethanol (1 L) was added with stirring. When the sodium is dissolved, 350 g of pentane-2,4-dione are added in one portion, followed by 310 g of ethyl acrylate over 30 minutes. The mixture was refluxed for 2.5 hours and then cooled to room temperature overnight. Glacial acetic acid (3 mL) was added and the solvent was removed on a rotary evaporator. The residue is filtered through a pad of diatomaceous earth and distilled in a thin film column at 0.1 mm. The distillate was redistilled using a 10 inch vacuum jacketed Vigreux column to give 518 g of ethyl 5-acetyl-4-oxohexanoate, mp 84-92 ° C at 0.2-0.7 mm.

Do 5 L trojhrdlé baňky vybavené teploměrem a mechanickým míchadlem zahřívané na parní lázni se přidá 350 g ethyl-5-acetyl-4oxohexanoátu, 329 g ethylaminomalonátu hydrochloridu, 133 g octanu sodného a 1,2 L kyseliny octové. Směs se zahřívá při 99°C přes 37 minut. Při teplotě 62°C už dochází k rychlému vyvíjení oxidu uhličitého. Po 35 minutách při 99°C se vývin oxidu uhličitého rapidně zpomalí. Po hodině se směs ochladí, chlorid sodný se odstraní vakuovou filtrací a rozpouštědlo se odpaří . Zbytek se smísí s 1 L studené vody. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 400 ml vody a rozpustí v 1 L horkého 95 % ethanolu. Roztok se nechá ·To a 5 L three necked flask equipped with a thermometer and a mechanical stirrer heated on a steam bath was added 350 g of ethyl 5-acetyl-4-hexohexanoate, 329 g of ethylaminomalonate hydrochloride, 133 g of sodium acetate and 1.2 L of acetic acid. The mixture was heated at 99 ° C for 37 minutes. At 62 ° C, carbon dioxide is rapidly evolving. After 35 minutes at 99 ° C, the development of carbon dioxide rapidly decelerates. After 1 hour, the mixture was cooled, sodium chloride was removed by vacuum filtration and the solvent was evaporated. The residue was mixed with 1 L of cold water. The precipitate was collected by vacuum filtration, washed with 400 mL of water and dissolved in 1 L of hot 95% ethanol. Leave the solution ·

<· ♦<· ♦

* Λ působit s 20 g Darko G-60, za horka zfiltruje a zchladí se na pokojovou teplotu. Krystalická pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, dvakrát promyje na filtru 200 ml 50 % ethanolu a suší se pod vakuem při 70°C. Získá se 285 g (64 % výtěžek) 2-ethoxykarbonyl-4(2-ethoxykarbonylthyl)-3,5-dimethylpyrrolu. Filtrát se ponechá přes noc v chladničce, čímž se získá dalších 53,1 g (11,9 % výtěžek) produktu. Spojený výtěžek činí 75,9 %.* Λ treated with 20 g Darko G-60, hot filtered and cooled to room temperature. The crystalline solid was collected by vacuum filtration, washed twice on a filter with 200 mL of 50% ethanol, and dried under vacuum at 70 ° C. 285 g (64% yield) of 2-ethoxycarbonyl-4- (2-ethoxycarbonylthyl) -3,5-dimethylpyrrole were obtained. The filtrate was left in the refrigerator overnight to give an additional 53.1 g (11.9% yield) of the product. The combined yield was 75.9%.

- eth oxy karbony 1-4-(2-ethoxykarbonyl ethyl)-3,5-dimethylpyrr o 1 (285 g) a 3500 ml ethyletheru se vloží do 5 L, trojhrdlé baňky vybavené mechanickým míchadlem, refluxním kondenzátorem a přídavnou nálevkou. Baňka je umístěna v ledové lázni. V průběhu 145 minut se po kapkách přidává sulfurylchlorid (435 g). Přidáváním se směs zakalí a zezelená a poté vyjasní. Na konci přídavku se směs pročistí a zbarví do slabě žluté barvy. Směs se míchá další 1 hodinu a poté se zahřívá pod refluxem po dobu 1 hodiny. Směs se ochladí a odpaří na rotační odparce, zředí se 1500 ml etheru a znovu odpaří na rotační odparce. Zředění a odpaření se provede ještě jednou. Zbytek se přidá do 8 L vody obsahující 802 g kyseliny octové a 535 g hydroxidu sodného. Směs se krátce zahřeje na 85°C a poté se za stálého míchání nechá přes noc chladnout. Vodná vrstva obsahující sole se separuje a extrahuje 800 ml etheru. Pevný podíl a etherová vrstva se přidají do 2,5 L vody obsahující 300 g uhličitanu sodného. Míchá se po dobu 1 hodiny a filtrací se odstraní malé množství (~7 g) pevné látky. Do směsi se přidá kyselina siřičitá (137 g) a výsledný precipitát se dvakrát promyje 250 ml vody a suší se pod vakuem, čímž se získá 56,4 g produktu. Do filtrátu se přidá kyselina siřičitá (92 g) a výsledný precipitát se dvakrát promyje 0,5 L vody a suší se pod vakuem. Získá se 220 g produktu, což dohromady činí 276,4 g (86,8 % výtěžek) 2karboxy-5-ethoxy karbony 1-3-(2 -ethoxy karbony 1 ethyl)-4methylpyrrolu.- Ethyloxycarbones of 1-4- (2-ethoxycarbonyl ethyl) -3,5-dimethylpyrrole (285 g) and 3500 ml of ethyl ether are placed in a 5 L, three-necked flask equipped with a mechanical stirrer, a reflux condenser and an addition funnel. The flask is placed in an ice bath. Sulfuryl chloride (435 g) was added dropwise over 145 minutes. Addition makes the mixture cloudy and green and then brightens. At the end of the addition, the mixture was clarified and turned slightly yellow. The mixture was stirred for an additional 1 hour and then heated under reflux for 1 hour. The mixture was cooled and evaporated on a rotary evaporator, diluted with 1500 ml of ether and again evaporated on a rotary evaporator. Dilute and evaporate again. The residue was added to 8 L of water containing 802 g of acetic acid and 535 g of sodium hydroxide. The mixture was briefly heated to 85 ° C and then allowed to cool overnight with stirring. The aqueous layer containing the salts was separated and extracted with 800 mL of ether. The solid and ether layer were added to 2.5 L of water containing 300 g of sodium carbonate. Stir for 1 hour and remove a small amount (~ 7 g) of solid by filtration. Sulfuric acid (137 g) was added to the mixture and the resulting precipitate was washed twice with 250 ml of water and dried under vacuum to give 56.4 g of product. Sulfuric acid (92 g) was added to the filtrate and the resulting precipitate was washed twice with 0.5 L of water and dried under vacuum. 220 g of product are obtained, which together amounts to 276.4 g (86.8% yield) of 2-carboxy-5-ethoxycarbones of 1-3- (2-ethoxycarbonyl-ethyl) -4-methylpyrrole.

2-karboxy-5-ethoxykarbony 1-3-(2-ethoxykarbonyl ethy 1)-4 methylpyrrol (50,5 g) a 400 ml 10 % hydroxidu sodného se zahřívá při 180°C v Parr autoklávu po dobu 90 minut. Tento proces se ještě • · · · « φ • · · * · φ · φ φ · · · • φ φ φ φ φ · φφφ φ φ2-Carboxy-5-ethoxycarbones of 1-3- (2-ethoxycarbonyl-ethyl) -4-methylpyrrole (50.5 g) and 400 ml of 10% sodium hydroxide were heated at 180 ° C in a Parr autoclave for 90 minutes. This process is still • · · · · * · · · • · • φ φ φ ·

-a* ·»·» φ *Φ Φ čtyřikrát opakuje, dokud se nezpracuje všech 252,5 g 2-karboxy-5ethoxykarbonyl-3-(2-ethoxykarbonylethyl)-4-methylpyrrolu. Pět roztoků se spojí a odpaří se na rotační odparce na množství 1,8 L hustého černého zbytku. Směs se ochladí na 10°C ve vodní lázni a pomalu se přidává 50 % kyselina siřičitá tak, aby teplota nepřesáhla 20°C a dokud pH není 2. Přidá se ethylether (1400 ml), směs se zfiltruje a precipitát se uschová. Precipitát se extrahuje v Soxhlet extraktoru 500 ml etheru. Spojené etherové vrstvy se promyjí 250 ml vody a poté 150 ml vody. Spojené vodné vrstvy se zpátky extrahují 150 ml etheru. Všechny etherové vrstvy se odpaří na rotační odparce a zbytek se usuší. Získá se 123,5 g 3-(2-karboxyethyl)-4-methylpyrrolu.Repeat four times until all 252.5 g of 2-carboxy-5-ethoxycarbonyl-3- (2-ethoxycarbonylethyl) -4-methylpyrrole were treated. The five solutions were combined and evaporated on a rotary evaporator to a 1.8 L thick black residue. The mixture was cooled to 10 ° C in a water bath and 50% sulfuric acid was added slowly such that the temperature did not exceed 20 ° C until pH was 2. Ethyl ether (1400 mL) was added, the mixture was filtered and the precipitate was stored. The precipitate is extracted in a Soxhlet extractor with 500 ml of ether. The combined ether layers were washed with 250 mL water and then 150 mL water. The combined aqueous layers are back extracted with 150 mL of ether. All ether layers were evaporated on a rotary evaporator and the residue was dried. 123.5 g of 3- (2-carboxyethyl) -4-methylpyrrole are obtained.

3-(2-karboxyethyl)-4-methylpyrrol (123 g) se smíchá s 1500 ml ethyletheru a 250 ml methanolu v magneticky míchané jímací baňce. Do 3 L, trojhrdlé baňky s kulatým dnem vybavené magnetickým míchadlem, destilačním nástavcem a kondenzátorem vedoucím do vstupu do jímací baňky a zahřívané na vodní lázni se umístí 240 g Diazaldu rozpuštěného v 1800 ml ethyletheru, roztok 73 g hydroxidu sodného rozpuštěného v 360 ml 95 % ethanolu a 112 ml vody. 3 L baňka se míchá a zahřívá při 65-75°C na vodní lázni a diazomethanetherová směs se destiluje do míchané jímací baňky po dobu přes 2,5 hodiny. Přidá se ethylether (200 ml) a destilace pokračuje dokud není kompletní. Jímací baňka se míchá po dobu dalších 30 minut a poté se přidá 10 ml kyseliny octové. Směs se dvakrát extrahuje 500 ml vody, poté dvakrát 200 ml saturovaného hydrogenuhličitanu sodného. Etherová vrstva se suší nad bezvodým síranem sodným a destiluje, čímž vznikne tmavý tekutý zbytek. Zbytek se dvakrát destiluje přes 4 palcovou Vigreux kolonu a jednou přes 10 palcovou vakuovouopláštěnou Vigreux kolonu. Získá se 108 g (80,6 % výtěžek) 3-(2ethoxykarbonylethyl)-4-methylpyrrolu. BP 108-113°C při 0,5 mm.3- (2-carboxyethyl) -4-methylpyrrole (123 g) was mixed with 1500 ml ethyl ether and 250 ml methanol in a magnetically stirred receiving flask. 240 g of Diazald dissolved in 1800 ml of ethyl ether, a solution of 73 g of sodium hydroxide dissolved in 360 ml of 95% are placed in a 3 L, three-necked round-bottomed flask equipped with a magnetic stirrer, distillation head and condenser leading to the inlet of the receiving flask and heated in a water bath. ethanol and 112 ml of water. The 3 L flask was stirred and heated at 65-75 ° C in a water bath and the diazomethanether mixture was distilled into the stirred receiving flask for over 2.5 hours. Ethyl ether (200 mL) was added and distillation continued until complete. The flask was stirred for an additional 30 minutes and then 10 ml of acetic acid was added. The mixture is extracted twice with 500 ml of water, then twice with 200 ml of saturated sodium bicarbonate. The ether layer was dried over anhydrous sodium sulfate and distilled to give a dark liquid residue. The residue was distilled twice through a 4 inch Vigreux column and once through a 10 inch vacuum jacketed Vigreux column. Yield: 108 g (80.6% yield) of 3- (2-ethoxycarbonylethyl) -4-methylpyrrole. BP 108-113 ° C at 0.5 mm.

Dimethylformamid v 500 ml, trojhrdlé baňce s kulatým dnem vybavené mechanickým míchadlem, teploměrem a přikapávací nálevkou se udržuje pod atmosférou dusíku. Baňka se ochladí na 0°C a po kapkách v průběhu 80 minut se přidává 58,4 ml oxychloriduDimethylformamide in a 500 ml three-necked round-bottom flask equipped with a mechanical stirrer, thermometer and dropping funnel is kept under a nitrogen atmosphere. The flask was cooled to 0 ° C and 58.4 ml of oxychloride was added dropwise over 80 minutes

Φ φφφ • · » φ φ ·· Φφφ · · »φ φ ·

Η ΦΦΦ fosforečného. Přidá se dichlorethan (280 ml) a směs se ohřeje na pokojovou teplotu a poté se zchladí na -10°C. Po kapkách se přes hodinu přidává 3-(2-methoxykarbonyl-ethyl)-4-methylpyrrol (55,7 g) rozpuštěný v 80 ml dichlorethanu a směs se míchá dalších 35 minut. Směs se odpaří na rotační odparce při teplotě < 30°C. Tekutý zbytek se nalije do 2700 ml ledově studeného 2 N roztoku hydroxidu sodného. Výsledný roztok se zahřívá na 88°C přes 20 minut a poté se na této teplotě udržuje po dalších 30 minut. Roztok se ochladí na teplotu okolí a extrahuje se 200 ml ethyletheru. Vodný roztok se ochladí na 0°C a okyselí se na pH 3,5 pomalým přidáváním přibližně 1350 ml 5 N kyseliny chlorovodíkové. Žlutý precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, čtyřikrát promyje 100 ml vody a suší se ve vakuové peci při okolní teplotě. Získá se 54,4 g (90,2 % výtěžek) surového 4-(2kar boxy ethyl)-2-formy 1-3-methy lpyrrolu.Phosphorus Dichloroethane (280 mL) was added and the mixture was allowed to warm to room temperature and then cooled to -10 ° C. 3- (2-Methoxycarbonyl-ethyl) -4-methylpyrrole (55.7 g) dissolved in 80 ml of dichloroethane was added dropwise over an hour and the mixture was stirred for an additional 35 minutes. The mixture was concentrated on a rotary evaporator at < 30 ° C. The liquid residue is poured into 2700 ml of ice-cold 2 N sodium hydroxide solution. The resulting solution was heated to 88 ° C for 20 minutes and then held at that temperature for an additional 30 minutes. The solution was cooled to ambient temperature and extracted with 200 mL of ethyl ether. The aqueous solution was cooled to 0 ° C and acidified to pH 3.5 by slowly adding approximately 1350 mL of 5 N hydrochloric acid. The yellow precipitate was collected by vacuum filtration, washed four times with 100 ml of water and dried in a vacuum oven at ambient temperature. Yield: 54.4 g (90.2% yield) of crude 4- (2-carboxyethyl) -2-form of 1-3-methylpyrrole.

Surový materiál se umístí do refluxující se směsi 425 ml ethanolu a 700 ml ethyletheru a za horka se zfiltruje nerozpustný zbytek. Filtrát se vloží do mrazáku a výsledný precipitát se shromáždí vakuovou filtrací a promyje 50 ml etheru. Filtrát se znovu použije pro extrakci nerozpustitelného zbytku, za horka zfiltruje a vloží do mrazáku. Výsledný precipitát a první precipitát se spojí, čímž se získá 26,1 g 4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrolu jako hnědého prášku. Teplota tání 149,0-150, 3°C. Filtrát se spojí s filtrátem z předchozí přípravy a koncentruje se, čímž se získá 43 g hnědé pevné látky. Pevná látka se vloží do refluxující se směsi 500 ml etheru a 100 ml ethanolu a zfiltruje. Filtrát se nechá působit s Noritem při refluxu a znovu se za horka zfiltruje. Filtrát se vloží do mrazáku, čímž se získají 3 dávky 4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-ethylpyrrolu, 7,7 g, teplota tání 148-151°C, 3,2 g, teplota tání 128-134°C a 4,1 g, teplota tání 148,2-150,0°C.The crude material is placed in a refluxing mixture of 425 ml of ethanol and 700 ml of ethyl ether and the insoluble residue is filtered while hot. The filtrate was placed in a freezer and the resulting precipitate was collected by vacuum filtration and washed with 50 mL of ether. The filtrate is reused to extract the insoluble residue, filtered hot and placed in the freezer. The resulting precipitate and the first precipitate were combined to give 26.1 g of 4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole as a brown powder. Mp 149.0-150.3 ° C. The filtrate was combined with the filtrate from the previous preparation and concentrated to give 43 g of a brown solid. The solid is taken up in a refluxing mixture of 500 ml of ether and 100 ml of ethanol and filtered. The filtrate is treated with Norite at reflux and filtered hot again. The filtrate was placed in a freezer to give 3 portions of 4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-ethylpyrrole, 7.7 g, mp 148-151 ° C, 3.2 g, mp 128-134 And 4.1 g, mp 148.2-150.0 ° C.

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (9,0 g) a 6,0 g 2oxindolu v 50 ml ethanolu se zahřívá na 70°C v 250 ml, trojhrdlé baňce s kulatým dnem vybavené teploměrem, refluxním kondenzátorem a mechanickým míchadlem. Když se většina pevné ο» ··»· *· látky rozpustí pomalu se přidá 4,5 g piperidinu a směs se refluxuje po dobu 4 hodiny. Pomalu se přidá kyselina octová (12 ml), čímž vznikne vydatný precipitát. Směs se refluxuje po dobu 5 minut, zchladí se na pokojovou teplotu a precipitát se shromáždí vakuovou filtrací a promyje 30 ml ethanolu. Precipitát se rozmělní pod refluxem v 30 ml ethanolu, zchladí se na pokojovou teplotu, shromáždí vakuovou filtrací, promyje 20 ml ethanolu a suší se pod vakuem. Získá se 11,9 g (80 % výtěžek) 3-[4-(2-karboxyethyl)-3-methylpyrrol-2-methylidenyl]2-indolinonu, SU6663, jako oranžové pevné látky.4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (9.0 g) and 6.0 g of 2oxindole in 50 ml of ethanol are heated at 70 ° C in a 250 ml, three-necked round-bottom flask equipped with a thermometer, reflux condenser and mechanical stirrer. When most of the solid dissolved, 4.5 g piperidine was added slowly and the mixture was refluxed for 4 hours. Acetic acid (12 mL) was added slowly to form a rich precipitate. The mixture was refluxed for 5 minutes, cooled to room temperature, and the precipitate was collected by vacuum filtration and washed with 30 mL of ethanol. The precipitate is triturated under reflux in 30 ml of ethanol, cooled to room temperature, collected by vacuum filtration, washed with 20 ml of ethanol and dried under vacuum. There was obtained 11.9 g (80% yield) of 3- [4- (2-carboxyethyl) -3-methylpyrrole-2-methylidenyl] -2-indolinone, SU6663, as an orange solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,29 (s, br, ΙΗ, NH-1'), 12,05 (s, br, 1H, COOH), 10,78 (s, br, 1H, NH-1), 7,73 (d, J = 7,43 Hz, 1H, H-4), 7,61 (s, 1H, H-vinyl), 7,13 (d, J = 2,75 Hz, 1H, H-2'), 7,10 (t, J = 7,43 Hz, 1H, H-6), 6,97 (t, J = 7,43 Hz, 1H, H-5), 6,85 (d, J = 7,43 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,38 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,38 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,25 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 297 ( [M + l] ⁺ , 100).1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.29 (s, br, ΙΗ, NH-1 '), 12.05 (s, br, 1 H, COOH), 10.78 (s, br, 1H, NH-1), 7.73 (d, J = 7.43Hz, 1H, H-4), 7.61 (s, 1H, H-vinyl), 7.13 (d, J = 2, 75 Hz, 1H, H-2 &apos;), 7.10 (t, J = 7.43 Hz, 1H, H-6), 6.97 (t, J = 7.43 Hz, 1H, H-5) , 6.85 (d, J = 7.43 Hz, 1H, H-7), 2.64 (t, J = 7.38 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.46 (t, J = 7.38 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.25 (s, 3H, CH _3); MS m / z (relative intensity,%) 297 ([M + 1] ⁺ , 100).

Příklad 5Example 5

3-[2,4-dimethyl-5-(2-oxo -1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl) -1Hpyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [2,4-Dimethyl-5- (2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

2,4-dimethyl-5-ethoxykarbonyl-3-(2-ethoxykarbonylethyl)pyrrol (1,07 kg) a 3,2 L 5 N hydroxidu sodného se mechanicky míchá ve 12 L trojhrdlé baňce s kulatým dnem vybavené refluxním kondenzátorem, přídavnou nálevkou a zahřívá se v olejové lázni. Směs se refluxuje po dobu 3 hodiny a po této době je vnitřní teplota 96°C, všechna pevná látka je rozpuštěna a tenkovrstvá chromatografie ukáže hydrolýzu jako kompletní. Odstraní se varná lázeň a směs se zchladí na 50°C ve vodní lázni. Pomalu se přidá 12 N kyselina chlorovodíková (~1,3 L). Poté co se přidá asi 50 % kyseliny se začne vyvíjet plyn a teplota se zvýší na 60°C. Jak se přidává další kyselina, vyvíjení zesiluje a začne se tvořit žlutý precipitát. Kyselinou chlorovodíkovou se pH upraví na konečnou hodnotu 3,5. Směs se ochladí v ledové lázni na 8°C. Pevné • ·· * látky se shromáždí vakuovou filtrací, dvakrát se promyjí 0,5 L destilované vody a suší se po dobu 48 hodiny ve vakuové peci při 5560°C. Získá se 677 g (101% výtěžek) 3-(2-karboxyethyl)-2,4dimethylpyrrolu.2,4-Dimethyl-5-ethoxycarbonyl-3- (2-ethoxycarbonylethyl) pyrrole (1.07 kg) and 3.2 L of 5 N sodium hydroxide were mechanically stirred in a 12 L three-necked round bottom flask equipped with a reflux condenser, an additional funnel. and heated in an oil bath. The mixture was refluxed for 3 hours, after which time the internal temperature was 96 ° C, all solid was dissolved and thin layer chromatography showed complete hydrolysis. Remove the boiling bath and cool to 50 ° C in a water bath. 12 N hydrochloric acid (~ 1.3 L) was added slowly. After about 50% of the acid was added, gas evolution began and the temperature was raised to 60 ° C. As additional acid is added, the development intensifies and a yellow precipitate begins to form. The pH was adjusted to a final pH of 3.5 with hydrochloric acid. The mixture was cooled to 8 ° C in an ice bath. The solids were collected by vacuum filtration, washed twice with 0.5 L of distilled water, and dried in a vacuum oven at 5560 ° C for 48 hours. 677 g (101% yield) of 3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethylpyrrole are obtained.

'HNMR (de-DMSO) Ó 11,9 (s, ÍH, COOH), 9,9 (s, ÍH, NH), 6,2 (s, ÍH, aromatika), 2,5 (t, 2H, CH₂), 2,2 (t, 2H, CH₂), 2,0 (s, 3H, CH₃), 1,9 (s, 3H, CH₃); Teplota tání 134-136°C.1 H NMR (d 6 -DMSO) δ 11.9 (s, 1H, COOH), 9.9 (s, 1H, NH), 6.2 (s, 1H, aromatics), 2.5 (t, 2H, CH ₂ ), 2.2 (t, 2H, CH ₂ ), 2.0 (s, 3H, CH ₃ ), 1.9 (s, 3H, CH ₃ ); Melting point 134-136 ° C.

Dimethylformamid (28,5 g) ve 250 ml dichlormethanu v 1 L trojhrdlé baňce s kulatým dnem vybavené magnetickým míchadlem, teploměrem a přikapávací nálevkou se ochladí v ledové solné lázni na teplotu -1°C. Oxichlorid fosforečný (59,3 g) se z přikapávací nálevky pomalu přikapává do reakční směsi. Oxichlorid fosforečný se z nálevky vypláchne 25 ml dichlormethanu. Směs dosáhne teploty maximálně 5°C. Směs se míchá po dobu 15 minut, během kterých je teplota -3°C. Pevný 3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethylpyrrol (32,6 g) se přidává po dávkách v průběhu 15 minut. Směs dosáhne teploty maximálně 7°C. Červenohnědá směs se míchá přes 30 minut a poté se refluxuje po dobu 1 hodiny. Směs se ochladí na 15°C a přidá se 300 ml vody, což má za následek prudkou reakci a zvýšení teploty. Směs se míchá a zchladí se na 22°C, vrstvy se separují a uschovají. Organická vrstva se extrahuje 100 ml vody a vodné vrstvy se spojí a promyjí 50 ml dichlormethanu. Organické vrstvy se vylijí. Vodná vrstva se upraví na pH 11 ~180 ml 10 N hydroxidu sodného. Teplota se zvýší na 40°C. Směs se míchá po dobu 30 minut za teploty 27°C. Směs se okyselí na pH 2 ~1 20 ml 10 N kyseliny chlorovodíkové. Teplota se zvýší na 30°C. Přidá se ethylacetát (150 ml) a směs se míchá, čímž se získá produkt. Během míchání se navrchu vodné vrstvy objeví značné množství černé pevné látky. Ethylacetátová vrstva se oddělí a vodná vrstva a pevná látka se dvakrát extrahují 100 ml ethylacetátu. Stále přítomná pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, důkladně se promyje vodou a suší se pod vakuem při 40°C. Získá se 12 g (31 % výtěžek) 3-(2karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrolu jako hnědočerné pevné látky. Tenkovrstvá chromatografie (dichlormethan: octová kyselina,Dimethylformamide (28.5 g) in 250 mL of dichloromethane in a 1 L three-necked round bottom flask equipped with a magnetic stirrer, thermometer, and dropping funnel was cooled to -1 ° C in an ice salt bath. Phosphorus pentoxide (59.3 g) was slowly added dropwise from the addition funnel to the reaction mixture. Rinse the phosphorous trichloride from the funnel with 25 ml of dichloromethane. The temperature reaches a maximum of 5 ° C. The mixture was stirred for 15 minutes during which the temperature was -3 ° C. Solid 3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethylpyrrole (32.6 g) was added in portions over 15 minutes. The mixture reaches a maximum temperature of 7 ° C. The red-brown mixture was stirred for over 30 minutes and then refluxed for 1 hour. The mixture was cooled to 15 ° C and 300 mL of water was added resulting in a violent reaction and an increase in temperature. The mixture was stirred and cooled to 22 ° C, the layers separated and stored. The organic layer was extracted with 100 mL of water and the aqueous layers were combined and washed with 50 mL of dichloromethane. The organic layers were discarded. The aqueous layer was adjusted to pH 11 ~ 180 mL of 10 N sodium hydroxide. The temperature was raised to 40 ° C. The mixture was stirred for 30 minutes at 27 ° C. The mixture was acidified to pH 2 ~ 1 with 20 ml of 10 N hydrochloric acid. The temperature is raised to 30 ° C. Ethyl acetate (150 mL) was added and the mixture was stirred to give the product. During stirring, a considerable amount of black solid appears on top of the aqueous layer. The ethyl acetate layer was separated and the aqueous layer and solid were extracted twice with 100 mL of ethyl acetate. The still present solid was collected by vacuum filtration, washed thoroughly with water, and dried under vacuum at 40 ° C. 12 g (31% yield) of 3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole were obtained as a brown-black solid. Thin-layer chromatography (dichloromethane: acetic acid,

ΦΦ «φ φφ Φ φ φ φ · φ φ ΦΦ φ φ φφφφ φ · φφφφ φ • φ φ « φ · φφ φφφφ φφ φφ φ φ φφφΦΦ φ φ φ φ · · · φ φ φ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ · · · · · · · · · ·

ΦΦΦ φ φΦΦΦ φ φ

95: 5, silikagel) ukáže skvrnu na Rf 0,7 a zabarvenou skvrnu na počátku. Ethylacetátové vrstvy se spojí, suší se nad bezvodým síranem sodným, odpaří se do vzniku hnědočerné pevné látky, která se suší pod vakuem při 40°C. Získá se 21 g (55 % výtěžek, celkový výtěžek 86 %)95: 5, silica gel) shows a spot at Rf 0.7 and a colored spot at the beginning. The ethyl acetate layers were combined, dried over anhydrous sodium sulfate, evaporated to give a brown-black solid, which was dried under vacuum at 40 ° C. 21 g (55% yield, total yield 86%) are obtained.

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrolu, na tenkovrstvé chromatografii identického vzhledu jako předchozí pevná látka.3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole, by thin-layer chromatography identical in appearance to the previous solid.

Alternativní postup: dimethylformamid (124 ml) v 750 ml dichlormethanu v 5 L trojhrdlé baňce s kulatým dnem vybavené mechanickým míchadlem, teploměrem a přikapávací nálevkou se ochladí v ledové-solné lázni na -9°C. Oxichlorid fosforečný (114 ml) se rychle přidává z přikapávací nálevky a spláchne se do reakčni směsi 50 ml dichlormethanu. Maximální dosažená teplota směsi je -4°C. Pevný 3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethylpyrrol (133,6 g) se přidává po dávkách 20 minut. Maximální dosažená teplota směsi je 3°C. Tmavě červená směs se zahřívá pod refluxem 1 minutu a poté se zchladí na 1°C. Směs se ochladí na 1°C a rychle se přidá 800 ml ledové vody. Maximální dosažená teplota je 15°C. Organická vrstva se separuje a odstraní. Vodná vrstva se upraví na pH 12-13 pomocí 800 ml 10 N hydroxidu sodného, pro upravování teploty se přidává led. Teplota stoupne na 37°C. Směs se míchá po dobu 90 minut při teplotě okolí a během této doby tenkovrstvá chromatografie ukáže pouze stopy světle zbarvené látky na počátku a produkt na Rf 0,3. Směs se ochladí na 0°C. Směs se okyselí na pH 3 pomocí 600 ml 10 N kyseliny chlorovodíkové, pro upravování teploty se přidává led. Maximální dosažená teplota je 10°C. Směs se míchá v chladnu po dobu 1 hodiny. Pevná látka se shromáždi vakuovou filtrací, čtyřikrát promyje 100 ml vody a suší se pod vakuem při 50-60°C, čímž se získá 140,6 g (90 % výtěžek) 3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrolu jako hnědé pevné látky.Alternative Procedure: Dimethylformamide (124 mL) in 750 mL of dichloromethane in a 5 L 3-neck round bottom flask equipped with a mechanical stirrer, thermometer, and addition funnel was cooled to -9 ° C in an ice-salt bath. Phosphorus pentoxide (114 ml) was quickly added from a dropping funnel and rinsed into the reaction mixture with 50 ml of dichloromethane. The maximum temperature of the mixture is -4 ° C. Solid 3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethylpyrrole (133.6 g) was added in portions over 20 minutes. The maximum temperature reached is 3 ° C. The dark red mixture was heated at reflux for 1 minute and then cooled to 1 ° C. The mixture was cooled to 1 ° C and 800 ml of ice water was added rapidly. The maximum temperature reached is 15 ° C. The organic layer was separated and discarded. The aqueous layer was adjusted to pH 12-13 with 800 mL of 10 N sodium hydroxide, ice was added to adjust the temperature. The temperature rose to 37 ° C. The mixture was stirred for 90 minutes at ambient temperature, during which time thin layer chromatography showed only traces of light colored initially and the product to Rf 0.3. The mixture was cooled to 0 ° C. The mixture was acidified to pH 3 with 600 ml of 10 N hydrochloric acid, ice was added to adjust the temperature. The maximum temperature reached is 10 ° C. The mixture was stirred in the cold for 1 hour. The solid was collected by vacuum filtration, washed four times with 100 mL of water and dried under vacuum at 50-60 ° C to give 140.6 g (90% yield) of 3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl- 5-formylpyrrole as a brown solid.

'HNMR (dg-DMSO): δ 12,0 (s, 1H, COOH), 11,3 (s, 1H, NH), 9,4 (s, 1H, CHO), 2,6 (t, 2H, CH₂), 2,3 (t, 2H, CH₂), 2,2 (s, 3H, CH₃), 2,1 (s, 3H, CH₃), Teplota tání 145-147°C.1 H NMR (d 6 -DMSO): δ 12.0 (s, 1H, COOH), 11.3 (s, 1H, NH), 9.4 (s, 1H, CHO), 2.6 (t, 2H, CH ₂ ), 2.3 (t, 2H, CH ₂ ), 2.2 (s, 3H, CH ₃ ), 2.1 (s, 3H, CH ₃ ), mp 145-147 ° C.

• · ♦ 9 • • · ♦ 9 • • • Φ ♦ • • Φ ♦ * • * • ·· ·· • · 9 9 9 • · 9 9 9 • · • · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • • • • • • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·♦·· · ♦ ·· ··· ··· ♦ ♦ ♦ ♦ 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (18,2 g) a 11,7 g 2-oxindolu se rozpustí ve 100 ml ethanolu zahříváním v 250 ml baňce s kulatým dnem vybavené magnetickým míchadlem a refluxním kondenzátorem v olejové lázni. Přidá se pyrrolidin (7,0 g) a reakční směs se refluxuje po dobu 2 hodiny. Během této doby je přítomno velké množství hnědočerné pevné látky. Tenkovrstvá chromatografie (ethylacetát: ethanol: octová kyselina 96: 2: 2, silikagel) neukáže žádný výchozí oxindol. Přidá se 8 ml kyseliny octové a směs se refluxuje po dobu 15 minut. Hustá směs se zředí 50 ml ethanolu a zchladí se na 10°C. Pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací a promyje 50 ml ethanolu. Dále se míchá ve 125 ml ethanolu pod refluxem po dobu 10 minut, zchladí se na 10°C, shromáždí se vakuovou filtrací a promyje se 50 ml ethanolu. Produkt se suší přes noc při 45°C pod vakuem, čímž se získá 25,5 g (88 % výtěžek) 3[2,4-dimethy 1-3 -(2-karboxy ethyl)pyrrol-5-methy lidenyl] -2-indolinon jako oranžové pevné látky.3- (2-Carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole (18.2 g) and 11.7 g of 2-oxindole were dissolved in 100 ml of ethanol by heating in a 250 ml round-bottom flask equipped with a magnetic stirrer and reflux. condenser in oil bath. Pyrrolidine (7.0 g) was added and the reaction mixture was refluxed for 2 hours. During this time a large amount of brown-black solid is present. Thin layer chromatography (ethyl acetate: ethanol: acetic acid 96: 2: 2, silica gel) showed no starting oxindole. 8 ml of acetic acid are added and the mixture is refluxed for 15 minutes. The thick mixture is diluted with 50 ml of ethanol and cooled to 10 ° C. The solid was collected by vacuum filtration and washed with 50 mL ethanol. It is further stirred in 125 ml of ethanol under reflux for 10 minutes, cooled to 10 ° C, collected by vacuum filtration and washed with 50 ml of ethanol. The product was dried overnight at 45 ° C under vacuum to give 25.5 g (88% yield) of 3 [2,4-Dimethyl-3- (2-carboxyethyl) pyrrole-5-methylphenyl] -2 -indolinone as an orange solid.

Alternativní postup: směs 3-(5-formyl-2,4-dimethyl-1 H-pyrrol-3yl)-propionové kyseliny (10 g, 51 mmol), 2-oxindolu (6,5 g, 49 mmol) a hydroxidu sodného (40 g, 58 mmol) se rozpustí v 50 ml vody a míchá se při 50°C po dobu 4 hodiny. Reakční směs se ochladí na pokojovou teplotu, zfiltruje a filtrát se okyselí 12 N kyselinou chlorovodíkovou na pH 3. Precipitovaná pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 10 ml vody a suší se pod vakuem přes noc. Surová pevná látka se dvakrát rozmělní s horkým ethanolem, poté se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se 10 ml ethanol a suší se pod vakuem. Získá se 13,8 g (91%) 3-[2,4-dimethyl-5-(2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionové kyseliny.Alternative procedure: a mixture of 3- (5-formyl-2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl) -propionic acid (10 g, 51 mmol), 2-oxindole (6.5 g, 49 mmol) and sodium hydroxide (40 g, 58 mmol) was dissolved in 50 mL of water and stirred at 50 ° C for 4 hours. The reaction mixture was cooled to room temperature, filtered, and the filtrate was acidified to pH 3 with 12 N hydrochloric acid. The precipitated solid was collected by vacuum filtration, washed with 10 mL of water, and dried under vacuum overnight. The crude solid was triturated twice with hot ethanol, then collected by vacuum filtration, washed with 10 mL ethanol and dried under vacuum. 13.8 g (91%) of 3- [2,4-dimethyl-5- (2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid are obtained.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, 1H, NH-1'), 12,05 (s, br, 1H, COOH), 10,70 (s, br, 1H, NH-1), 7,69 (d, J = 7, 39 Hz, 1H, H-4), 7,53 (s, 1H, H-vinyl), 7,06 (t, J = 7,39 Hz, 1H, H-6), 6,95 (t, J = 7,39 Hz, 1H, H-5), 6,85 (d, J = 7,39 Hz, 1H, H-7), 2,63 (t, J = 7,45 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,45 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), ·· * ·· ·· ·· ♦ 9 *··· ·1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.38 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.05 (s, br, 1H, COOH), 10.70 (s, br, 1H, NH-1), 7.69 (d, J = 7.39 Hz, 1H, H-4), 7.53 (s, 1H, H-vinyl), 7.06 (t, J = 7, 39 Hz, 1H, H-6), 6.95 (t, J = 7.39 Hz, 1H, H-5), 6.85 (d, J = 7.39 Hz, 1H, H-7), 2.63 (t, J = 7.45 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.34 (t, J = 7.45 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), ·· ·· · * · ··· 9 * ··· ·

9 9 9 · · · • · · · · »··· · · · · 9 99 9 9 9 9

9999 999 99 ♦ ··· »·9999 999 99 ♦ ··· »·

2,28 (s, 3Η, CH3), 2,24 (s, 3Η, CH3); MS m/z (relativní intenzita, %) 311 ([M+lf, 100).2.28 (s, 3Η, CH3); 2.24 (s, 3Η, CH3); MS m / z (relative intensity,%) 311 ([M + 1] +, 100).

Příklad 6Example 6

3- [5-(5-brom-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyllH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-Bromo-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

2-oxindol (53,3 g) se suspenduje v 640 ml acetonitrilu a směs se zchladí na 7°C v ledové lázni za stálého míchání. Během 20 minut se v dávkách přidá pevný N-bromsukcinimid (74,8 g). Poté co se přidá zhruba jedna třetina N-bromsukcinimidu teplota stoupne na 12°C. Přidávání se pozastaví dokud teplota směsi neopadne na 10°C.2-Oxindole (53.3 g) was suspended in 640 mL of acetonitrile and the mixture was cooled to 7 ° C in an ice bath with stirring. Solid N-bromosuccinimide (74.8 g) was added in portions over 20 minutes. After about one-third of N-bromosuccinimide was added, the temperature rose to 12 ° C. The addition was stopped until the temperature of the mixture fell to 10 ° C.

V přidávání se pokračuje za teploty pod 12°C. Poté, co se dokončí přidávání, se směs míchá po dobu 1 hodiny při 10°C. Během další hodiny míchání se směs nechá ohřát na teplotu okolí. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje 80 ml ethanolu a 20 minut se odsává do sucha na filtrační nálevce. Získá se produkt podle HPLC obsahující 6,4 % 2-oxindolu. Pevná látka se suspenduje v 1440 ml denaturovaného ethanolu a rozmělní se mícháním a refluxováním po dobu 5 minut. Během této doby se většina pevné látky rozpustí. Směs se ochladí v ledové lázni na 13°C. Pevný produkt se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se 80 ml ethanolu a suší se pod vakuem , čímž se získá 5 7,7 g (68,0 %) 5-brom-2-oxindolu podle HPLC obsahujícího 1,13 % 2-oxindolu. Rozmělněním s menším množstvím 30 % ethanolu se získá lepší výtěžek (88 %), ale obsahující více 2oxindolu (1,76 %).The addition was continued at a temperature below 12 ° C. After the addition is complete, the mixture is stirred for 1 hour at 10 ° C. The mixture was allowed to warm to ambient temperature over an additional hour of stirring. The precipitate is collected by vacuum filtration, washed with 80 ml of ethanol and sucked dry on a filter funnel for 20 minutes. The product was obtained by HPLC containing 6.4% 2-oxindole. The solid is suspended in 1440 ml of denatured ethanol and ground by stirring and refluxing for 5 minutes. During this time, most of the solid dissolved. The mixture was cooled in an ice bath to 13 ° C. The solid product was collected by vacuum filtration, washed with 80 mL of ethanol and dried under vacuum to give δ 7.7 g (68.0%) of 5-bromo-2-oxindole according to HPLC containing 1.13% 2-oxindole. Grinding with a smaller amount of 30% ethanol gave a better yield (88%) but containing more 2-oxindole (1.76%).

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,44 (s, br, 1H, NH-1), 7,327,36 (m, 2H), 6,76 (d, J = 8,50 Hz, 1H, H-7), 3,5 (s, 2H, CH₂); MS m/z 212,1/214,1 (M⁺/ [M+2]⁺)·1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 10.44 (s, br, 1H, NH-1), 7.327.36 (m, 2H), 6.76 (d, J = 8.50 Hz), 1H, H-7), 3.5 (s, 2H, _CH2); MS m / z 212.1 / 214.1 (M ⁺ / [M + 2] ⁺ ) &lt; - &^gt;

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90 mg), 106 mg 5brom-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívá při 95°C po dobu 5 hodin. Reakění směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 2 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se • ♦ · · · 0· 000» 00» ·» ·»·· 00 0 zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci. Získá se 120 mg (64 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (90 mg), 106 mg of 5-bromo-2-oxindole and 75 µL of piperidine in 2 mL of ethanol was heated at 95 ° C for 5 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 2 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate is filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven. 120 mg (64%) of the desired compound is obtained as a brown solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,31 (s, br, 1H, NH-1’), 12,06 (s, br, 1H, COOH), 10,90 (s, br, 1H, NH-1), 8,06 (s, br, 1H, H-4), 7,75 (s, 1H, H-vinyl), 7,23 (d, br, J = 8,50 Hz, 1H, H-6), 7,19 (d, J = 2,84 Hz, 1H, H-2'), 6,80 (d, br, J = 8,50 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,65 Hz,1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.31 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.06 (s, br, 1H, COOH), 10.90 (s, br, 1H, NH-1), 8.06 (s, br, 1H, H-4), 7.75 (s, 1H, H-vinyl), 7.23 (d, br, J = 8.50 Hz, 1H, H-6), 7.19 (d, J = 2.84 Hz, 1H, H-2 '), 6.80 (d, br, J = 8.50 Hz, 1H, H-7), 2.65 (t, J = 7.65Hz,

2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,65 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,28 (s,2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.46 (t, J = 7.65 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.28 (s,

3H, CH₃) ; MS m/z 375,1/ 377,2 (M⁺/ [M+2]⁺)·3H, CH _3); MS m / z 375.1 / 377.2 (M ⁺ / [M + 2] ⁺ ) &lt; ⁺ &^gt;

Příklad 7Example 7

3- [5-(5-jod-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyllH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-Iodo-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

2-oxindol (82,9 g) se suspenduje v 630 ml kyseliny octové, směs se mechanicky míchá a zchladí se na 10°C v ledové vodní lázni. Běhen 10 minut se po dávkách přidá N-jodsukcinimid (175 g). Poté se směs míchá po dobu 1 hodiny při 10°C. Přítomná suspendovaná látka během této doby zhoustne. Pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se 100 ml 50 % kyseliny octové ve vodě, poté 200 ml vody a 20 minut se odsává do sucha na filtrační nálevce. Produkt se suší pod vakuem, čímž se získá 93,5 g (36 %) 5-jod-2-oxindolu podle protonové NMR obsahujícího 5 % 2-oxindolu.2-Oxindole (82.9 g) was suspended in 630 mL of acetic acid, stirred mechanically and cooled to 10 ° C in an ice water bath. N-iodosuccinimide (175 g) was added portionwise over 10 minutes. Then the mixture was stirred for 1 hour at 10 ° C. The suspended substance present thickens during this time. The solid was collected by vacuum filtration, washed with 100 mL of 50% acetic acid in water, then 200 mL of water, and sucked dry on a filter funnel for 20 minutes. The product was dried under vacuum to give 93.5 g (36%) of 5-iodo-2-oxindole by proton NMR containing 5% 2-oxindole.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆),: δ 10,45 (s, 1H, NH-1), 7,49 (s,1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 10.45 (s, 1H, NH-1), 7.49 (s,

1H, H-4), 7,48 (d, J = 8,10 Hz, 1H, H-6), 6,64 (d, J = 8,10 Hz, 1H, H7) a 3,46 (s, 2H, CH₂-3); MS m/z 258 [M-l] ⁺ .1H, H-4), 7.48 (d, J = 8.10Hz, 1H, H-6), 6.64 (d, J = 8.10Hz, 1H, H7) and 3.46 (s) , 2H, CH ₂ -3); MS m / z 258 [M ⁺ ] ⁺ .

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90 mg), 130 mg 5jod-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při teplotě 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 2 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci, čímž se získá 162 mg (77 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (90 mg), 130 mg of 5-iodo-2-oxindole and 75 µL of piperidine in 2 ml of ethanol were heated at 95 ° C for 5 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 2 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven to give 162 mg (77%) of the title compound as a brown solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,30 (s, br, 1H, NH-1’), 12,06 (s, br, 1H, COOH), 10,88 (s, br, 1H, NH-1), 8,18 (s, br, 1H, H-4), 7,731 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.30 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.06 (s, br, 1H, COOH), 10.88 (s, br, 1H, NH-1), 8.18 (s, br, 1H, H-4), 7.73

• * • * • 9 · • 9 · 9 · • 9 9 · • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 9 999 9 9 9 9 9 9 9 9 9 99*9 9 99 * 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

(s, 1H, H-vinyl), 7,40 (d, br, J = 8,03 Hz, 1H, H-6), 7,19 (d, J = 2,94 Hz, 1H, H-2'), 6,69 (d, br, J = 8,03 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,40 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,40 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,28 (s, 3H, CH₃); MS m/z 423 [M+lf.(s, 1H, H-vinyl), 7.40 (d, br, J = 8.03 Hz, 1H, H-6), 7.19 (d, J = 2.94 Hz, 1H, H-2) '), 6.69 (d, br, J = 8.03 Hz, 1H, H-7), 2.65 (t, J = 7.40 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.46 (t, J = 7.40 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.28 (s, 3H, CH _3); MS m / z 423 [M + 1] +.

Příklad 8Example 8

3- [4-methyl-5-(4-methyl-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [4-Methyl-5- (4-methyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

Diethyloxalát (30 ml) ve 20 ml suchého etheru se za stálého míchání přidá do 19 g ethoxidu draselného suspendovaného v 50 ml suchého etheru. Směs se ochladí v ledové lázni a pomalu se přidá 20 ml 3-nitro-o-xylenu ve 20 ml suchého etheru. Hustá tmavě červená směs se zahřívá pod refluxem po dobu 0,5 hodiny, zakoncentruje se do tmavě červené pevné látky a nechá se působit s 10 % hydroxidem sodným, dokud se téměř všechna pevná látka nerozpustí. Tmavě červená směs se nechá působit s 30 % peroxidem vodíku, dokud se červená barva nezmění na žlutou. Nebo se směs nechá působit s 10% hydroxidem sodným a 30% peroxidem vodíku, dokud nevymizí červené zbarvení. Pevná látka se zfiltruje a filtrát se okyselí 6 N kyselinou chlorovodíkovou. Výsledný precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se vodou a suší se pod vakuem. Získá se 9,8 g ( 45 % výtěžek) 2-methyl-6-nitrofenyloctové kyseliny jako šedé pevné látky. Pevná látka se hydrogenuje v methanolu přes 10 % paladium na aktivním uhlí, čímž se získá 9,04 g 4-methyl-2-oxindolu jako bílé pevné látky.Diethyl oxalate (30 mL) in 20 mL dry ether was added with stirring to 19 g of potassium ethoxide suspended in 50 mL dry ether. The mixture was cooled in an ice bath and 20 mL of 3-nitro-o-xylene in 20 mL of dry ether was slowly added. The dense dark red mixture was heated under reflux for 0.5 h, concentrated to a dark red solid and treated with 10% sodium hydroxide until almost all solids dissolved. The dark red mixture is treated with 30% hydrogen peroxide until the red color turns yellow. Alternatively, the mixture is treated with 10% sodium hydroxide and 30% hydrogen peroxide until the red color disappears. The solid was filtered and the filtrate was acidified with 6 N hydrochloric acid. The resulting precipitate was collected by vacuum filtration, washed with water, and dried under vacuum. 9.8 g (45% yield) of 2-methyl-6-nitrophenylacetic acid are obtained as a gray solid. The solid was hydrogenated in methanol over 10% palladium on charcoal to give 9.04 g of 4-methyl-2-oxindole as a white solid.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,27 (s, br, 1H, NH-1), 7,06 (t, J = 7,71 Hz, 1H, H-6), 6,74 (d, J = 7,73 Hz, H-5), 6,63 (d, J = 7,73 Hz, 1H, H-7), 3,36 (s, 2H, CH₂), 2,18 (s, 3H, CH₃).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 10.27 (s, br, 1H, NH-1), 7.06 (t, J = 7.71 Hz, 1H, H-6), 6, 74 (d, J = 7.73 Hz, H-5), 6.63 (d, J = 7.73 Hz, 1H, H-7), 3.36 (s, 2H, CH ₂₎ 2, 18 (s, 3H, CH ₃ ).

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90 mg), 74 mg 4methyl-2-oxindol a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívá při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se zchladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se •Φ φ φφ φφ φφ φφφφ φφφφ φφ • φ φ φ φφφ φ φ · φ φ φφφφ φ φ φφφ φ φ φφφφ φφφ φφ φφφφ φφ zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci. Získá se 80 mg (52 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (90 mg), 74 mg of 4-methyl-2-oxindole and 75 µL of piperidine in 2 mL of ethanol was heated at 95 ° C for 5 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate is Φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ • • • • φ φ φ · · · φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ z 80 mg (52%) of the title compound is obtained as a brown solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO- d6): δ 13,33 (s, br, IH, NH-1'), 10,84 (s, br, IH, NH-1), 7,54 (s, IH, H-vinyl), 7,12 (d, J = 2,0 Hz, IH, H-2'), 7,01 (t, J - 7,75 Hz, IH, H-6), 6,79 (d, J - 7,75 Hz, H-5), 6,74 (d, J - 7,75 Hz, IH, H-7), 2,64 (t, J - 7,65 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,57 (s, 3H, CH₃), 2,42 (t, J = 7,65 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,19 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 311 ( [M+l] ⁺ , 100).1 H NMR (360 MHz, DMSO- d 6): δ 13.33 (s, br, 1H, NH-1 '), 10.84 (s, br, 1H, NH-1), 7.54 (s, IH) H-vinyl), 7.12 (d, J = 2.0 Hz, 1H, H-2 '), 7.01 (t, J = 7.75 Hz, 1H, H-6), 6.79 (d, J = 7.75 Hz, H-5), 6.74 (d, J = 7.75 Hz, 1H, H-7), 2.64 (t, J = 7.65 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.57 (s, 3H, CH ₃ ), 2.42 (t, J = 7.65 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.19 (s, 3H, CH ₃ ); MS m / z (relative intensity,%) 311 ([M + 1] ⁺ , 100).

Příklad 9Example 9

3- [4-methyl-5-(5-methy 1-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [4-Methyl-5- (5-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

5-methylisatin (15,0 g) a 60 ml hydrátu hydrazinu se zahřívá při 140-160°C po dobu 4 hodiny. Tenkovrstvá chromatografie (ethylacetát: hexan 1: 2, silikagel) neukáže žádný zbývající výchozí materiál. Reakční směs se ochladí na pokojovou teplotu, přelije do 300 ml ledové vody a okyselí se na pH 2 kyselinou chlorovodíkovou. Dva dny se nechá stát při pokojové teplotě, precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a suší se pod vakuem, čímž se získá 6,5 g (47 % výtěžek) 5-methyl-2-oxindolu.5-Methylisatin (15.0 g) and 60 mL of hydrazine hydrate were heated at 140-160 ° C for 4 hours. Thin layer chromatography (ethyl acetate: hexane 1: 2, silica gel) showed no remaining starting material. The reaction mixture was cooled to room temperature, poured into 300 mL of ice water and acidified to pH 2 with hydrochloric acid. After standing for two days at room temperature, the precipitate was collected by vacuum filtration, washed with water and dried under vacuum to give 6.5 g (47% yield) of 5-methyl-2-oxindole.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,20 (s, br, IH, NH-1), 6,99 (s, IH, H-4), 6,94 (d, J = 8,11 Hz, IH, H-6), 6,68 (d, J - 8,11 Hz, IH, H-7), 3,39 (s, 2H, CH₂-3), a 2,22 (s, 3H, CH₃-5).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 10.20 (s, br, 1H, NH-1), 6.99 (s, 1H, H-4), 6.94 (d, J = 8) , 11 Hz, IH, H-6), 6.68 (d, J - 8.11 Hz, IH, H-7), 3.39 (s, 2H, CH ₂ -3), and 2.22 ( s, 3H, CH ₃ -5).

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90 mg), 74 mg 5methyl-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se zchladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci, čímž se získá 65 mg (42%) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (90 mg), 74 mg of 5-methyl-2-oxindole and 75 µL of piperidine in 2 mL of ethanol were heated at 95 ° C for 5 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven to give 65 mg (42%) of the title compound as a brown solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,30 (s, br, IH, NH-1'), 12,05 (s, br, 1 H, COOH), 10,67 (s, br, IH, NH-1), 7,57 (s, 2H, H-vinyl, H4), 7,12 (d, J = 2,65 Hz, IH, H-2’), 6,91 (d, J = 7,82 Hz, IH, H-6),1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.30 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.05 (s, br, 1H, COOH), 10.67 (s, br 1 H, NH-1), 7.57 (s, 2H, H-vinyl, H 4), 7.12 (d, J = 2.65 Hz, 1H, H-2 '), 6.91 (d, J = 7.82 Hz, 1H, H-6),

6,74 (d, J = 7,82 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 6,94 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 6,94 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,30 (s, 3H, CH3), 2,25 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 311 ( [M+l] ⁺ , 100).6.74 (d, J = 7.82 Hz, 1H, H-7), 2.65 (t, J = 6.94 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.46 (t, J = 6.94 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.30 (s, 3H, CH3), 2.25 (s, 3H, CH _3); MS m / z (relative intensity,%) 311 ([M + 1] ⁺ , 100).

Příklad 10Example 10

3- [5-(5,6-dimethoxy-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5,6-Dimethoxy-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90 mg), 97 mg 5,6dimethoxy-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci, čímž se získá 104 mg (58%) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (90 mg), 97 mg of 5,6-dimethoxy-2-oxindole and 75 µL of piperidine in 2 mL of ethanol were heated at 95 ° C for 5 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven to give 104 mg (58%) of the title compound as a brown solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,19 (s, br, 1H, NH-1’), 12,05 (s, br, 1 H, COOH), 10,53 (s, br, 1H, NH-1), 7,46 (s, 1H), 7,41 (s, 1H), 7,02 (s, 1H, H-2'), 6,45 (s, 1H), 3,74 (s, 3H, OCH₃), 3,70 (s, 3H, OCH₃), 2,59 (t, J = 7,43 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,44 (t, J = 7,43 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,22 (s, 3H, CH₃); MS m/z 357 [M+lf.1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.19 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.05 (s, br, 1H, COOH), 10.53 (s, br 1 H, NH-1), 7.46 (s, 1 H), 7.41 (s, 1 H), 7.02 (s, 1 H, H-2 '), 6.45 (s, 1 H), 3 74 (s, 3H, _OCH3), 3.70 (s, 3H, _OCH3), 2.59 (t, J = 7.43 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.44 (t , J = 7.43 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.22 (s, 3H, CH _3); MS m / z 357 [M + 1] +.

Příklad 11Example 11

3- [5-(6-chlor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyl1H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (6-Chloro-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (200 mg), 167,6 mg4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (200 mg), 167.6 mg

6-chlor-2-oxindolu a 166 pL piperidinu ve 2 ml ethanol se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci, čímž se získá 246 mg (74%) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.6-chloro-2-oxindole and 166 µL piperidine in 2 mL ethanol were heated at 95 ° C for 5 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven to give 246 mg (74%) of the title compound as a brown solid.

φφ φφ φ« φφ ♦ ΦΦΦ φ φ φ φ · · « φφφφ ΦΦΦ ΦΦΦ φ φ φ · · ·

100 φφφφ φ • φ φ φ φ • φ φ · φφφ φφ 'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,22 (s, br, 1H, NH-1'), 12,09 (s, br, 1 H, COOH), 10,95 (s, br, 1H, NH-1), 7,78 (d, J = 7,95 Hz, 1H, H-4), 7,66 (s, 1H, H-vinyl), 7,18 (d, J = 2,64 Hz, 1H, H-2’), 7,01 (dd,100 HφMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.22 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.09 (s, br) 1 H, COOH), 10.95 (s, br, 1 H, NH-1), 7.78 (d, J = 7.95 Hz, 1 H, H-4), 7.66 (s, 1 H, H-vinyl), 7.18 (d, J = 2.64 Hz, 1H, H-2 &apos;), 7.01 (dd,

J = 1,90, 7,95 Hz, 1H, H-5), 6,86 (d, J = 1,90 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J= 7,14 Hz , 2H, CH2CH2COOH), 2,45 (t, J = 7,14 Hz, 2H,J = 1.90, 7.95 Hz, 1H, H-5), 6.86 (d, J = 1.90 Hz, 1H, H-7), 2.65 (t, J = 7.14 Hz) 2H, CH2CH2COOH) 2.45 (t, J = 7.14 Hz, 2H,

CH2CH2COOH), 2,26 (s, 3H, CH₃).CH ₂ CH ₂ COOH), 2.26 (s, 3H, CH ₃ ).

Příklad 12Example 12

Methyl ester 3-[4-(2-karboxyethyl)-3-methyl-lH-pyrrol-2y lmethy len]-2-oxo-2,3-dihydro -1 H-indol-5-karboxylové kyseliny3- [4- (2-Carboxyethyl) -3-methyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -2-oxo-2,3-dihydro-1H-indole-5-carboxylic acid methyl ester

5-jod-2-oxindol (17 g) se refluxuje s 2 g paladium diacetátem, 18,2 triethylaminu, 150 ml methanolu, 15 ml dimethylsulfoxidu a 2,6 g DPPP v atmosféře oxidu uhelnatého. Po 24 hodinách se z reakční směsi zfiltruje katalyzátor a filtrát se koncentruje. Koncentrát se chromatografuje na silikagelu použitím 30% ethylacetátu v hexanu. Frakce obsahující produkt se koncentrují a ponechají se stát. Precipitovaný produkt se shromáždí vakuovou filtrací , čímž se získá 0,8 g (7 %) 5-methoxykarbonyl-2-oxindolu jako šedé pevné látky.5-Iodo-2-oxindole (17 g) was refluxed with 2 g of palladium diacetate, 18.2 triethylamine, 150 ml of methanol, 15 ml of dimethylsulfoxide and 2.6 g of DPPP under a carbon monoxide atmosphere. After 24 hours, the catalyst was filtered from the reaction mixture and the filtrate was concentrated. The concentrate is chromatographed on silica gel using 30% ethyl acetate in hexane. Product containing fractions were concentrated and allowed to stand. The precipitated product was collected by vacuum filtration to give 0.8 g (7%) of 5-methoxycarbonyl-2-oxindole as a gray solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d_ó) δ 10,70 (s, br, 1H, NH-1), 7,83 (dd, J = 1,77, 8,29 Hz, 1H, H-6), 7,77 (s, br, 1H, H-4), 6,89 (d, J = 8,29 (Hz, 1H, H-7), 3,80 (s, 3H, COOCH₃-5), 3,51 (s, 2H, CH₂-3).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 10.70 (s, br, 1H, NH-1), 7.83 (dd, J = 1.77, 8.29 Hz, 1H, H-6) 7.77 (s, br, 1H, H-4), 6.89 (d, J = 8.29 (Hz, 1H, H-7)), 3.80 (s, 3H, COOCH ₃ -5) , 3.51 (s, 2H, CH ₂ -3).

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,6 mg), 88,6 mg4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (90.6 mg), 88.6 mg

5-methoxykarbonyl-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci, čímž se získá 123 mg (69%) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.Of 5-methoxycarbonyl-2-oxindole and 75 µL of piperidine in 2 ml of ethanol are heated at 95 ° C for 5 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven to give 123 mg (69%) of the title compound as a yellow solid.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,27 (s, br, 1H, NH-1'), 12,0 (s, vbr, 1H, COOH), 11,16 (s, br, 1H, NH-1), 8,36 (s, br, 1H, H-4), 7,80 (s, 1H, H-vinyl), 7,40 (dd, J = 1,80, 8,14 Hz, 1H, H-6), 7,20 (d, J = 2,91 Hz, 1H, H-5'), 6,96 (d, J = 8,14 Hz, 1H, H-7), 3,84 (s, 3H, ·'·1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.27 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.0 (s, brbr, 1H, COOH), 11.16 (s, br, 1H, NH-1), 8.36 (s, br, 1H, H-4), 7.80 (s, 1H, H-vinyl), 7.40 (dd, J = 1.80, 8.14) Hz, 1H, H-6), 7.20 (d, J = 2.91 Hz, 1H, H-5 '), 6.96 (d, J = 8.14 Hz, 1H, H-7), 3.84 (s, 3H, · · ·

9 99 9

9 99 9

101101

99

9999 9999999 999

9999

9 9 99 9 9

9 ·9 ·

9 99 9

9999 • · · • 9 9 999999 • 9 9 99

COOCH₃), 2,66 (t, J = 7,55 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,55 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,30 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 355 ( [M+l] ⁺ , 100).COOCH ₃ ), 2.66 (t, J = 7.55 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.46 (t, J = 7.55 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2, 30 (s, 3H, CH ₃ ); MS m / z (relative intensity,%) 355 ([M + 1] ⁺ , 100).

Příklad 13Example 13

3-[4-(2-karboxy-ethyl)-3-methyl-lH-pyrrol-2-ylmethylen]-2-oxo2,3-dihydro-ΙΗ-indol-5-karboxy lová kyselina3- [4- (2-carboxy-ethyl) -3-methyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -2-oxo-2,3-dihydro-4-indole-5-carboxylic acid

2-oxindol (6,7 g) se přidá do míchané suspenze 23 g chloridu hlinitého ve 30 ml dichlorethanu v ledové lázni. Pomalu se přidá chloracetylchlorid (11,3 g) a začne se vyvíjet plynný chlorovodík. Po deseti minutách míchání se reakční směs zahřívá při 40-50°C po dobu 1,5 hodiny. Tenkovrstvá chromatografie (ethylacetát, silikagel) neukáže žádnou výchozí látku. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a přelije se do ledové vody. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a suší se pod vakuem. Získá se 10,3 g (98 %) 5chloracetyl-2-oxindolu jako šedé pevné látky.2-Oxindole (6.7 g) was added to a stirred suspension of 23 g of aluminum chloride in 30 ml of dichloroethane in an ice bath. Chloroacetyl chloride (11.3 g) was added slowly and hydrogen chloride gas evolved. After stirring for 10 minutes, the reaction mixture is heated at 40-50 ° C for 1.5 hours. Thin layer chromatography (ethyl acetate, silica gel) showed no starting material. The mixture was cooled to room temperature and poured into ice water. The precipitate was collected by vacuum filtration, washed with water and dried under vacuum. 10.3 g (98%) of 5-chloroacetyl-2-oxindole are obtained as a gray solid.

Suspenze 9,3 g 5-chloracetyl-2-oxindolu se míchá v 90 ml pyridinu při 80-90°C po dobu 3 hodiny a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací a promyje 20 ml ethanolu. Pevná látka se rozpustí v 90 ml 2,5 N hyroxidu sodného a míchá se při 70 -80°C po dobu 3 hodiny. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a okyselí se na pH 2 pomocí 0,5 N kyseliny chlorovodíkové. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací a řádně se promyje vodou. Získá se surový 5-karboxy-2-oxindol jako tmavě hnědá pevná látka. Nechá se stát přes noc, čímž vzniknou 2 g 5-karboxy-2oxindol jako žluté pevné látky. Surová tmavě hnědá látka se rozpustí v horkém methanolu, nerozpustný podíl se odstraní filtrací a filtrát se koncentruje. Získá se 5,6 g 5-karboxy-2-oxindolu jako hnědé pevné látky. Spojený výtěžek činí 97 %.A suspension of 9.3 g of 5-chloroacetyl-2-oxindole is stirred in 90 ml of pyridine at 80-90 ° C for 3 hours and then cooled to room temperature. The precipitate was collected by vacuum filtration and washed with 20 mL of ethanol. The solid was dissolved in 90 mL of 2.5 N sodium hydroxide and stirred at 70-80 ° C for 3 hours. The mixture was cooled to room temperature and acidified to pH 2 with 0.5 N hydrochloric acid. The precipitate was collected by vacuum filtration and washed well with water. The crude 5-carboxy-2-oxindole was obtained as a dark brown solid. Allow to stand overnight to give 2 g of 5-carboxy-2-oxindole as a yellow solid. The crude dark brown material was dissolved in hot methanol, the insoluble matter was removed by filtration, and the filtrate was concentrated. 5.6 g of 5-carboxy-2-oxindole are obtained as a brown solid. The combined yield was 97%.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 12,56 (s, br, 1H, COOH-5), 10,70 (s, 1H, NH-1), 7,82 (dd, J = 1,57, 7,79 Hz, 1H, H-6), 7,74 (s, br,1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 12.56 (s, br, 1H, COOH-5), 10.70 (s, 1H, NH-1), 7.82 (dd, J = 1, 57, 7.79 Hz, 1 H, H-6), 7.74 (s, br,

ΦΦ • ·ΦΦ • ·

102 • ·· φφ φφ φφ φφφφ φφφ » φ φ φ φφφ φ φφφφ φφφφ φ φ φφφ φ φ φφφ φφφ φφ φφφφ φφ φ102 • ·· φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ

1Η, Η-4), 6,87 (d, J - 7,79 Hz, 1Η, Η-7), a 3,53 (s, 2H, CH₂-3). MS m/z (relativní intenzita, %) 178 ([M+l] ⁺ , 100).1Η, 4 Η), 6.87 (d, J - 7.79 Hz, 1Η, Η-7), 3.53 (s, 2H, CH ₂ -3). MS m / z (relative intensity,%) 178 ([M + 1] ⁺ , 100).

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,6 mg), 88,6 mg4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (90.6 mg), 88.6 mg

5-karboxy-2-oxindolu a 75 pL piperidinu v 2 ml ethanol se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakčni směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje , promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci. Surový produkt se přečistí kolonovou chromatografií na silikagelu použitím ethylacetát-hexan-octové kyseliny jako eluentu. Získá se 51 mg (30%) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.Of 5-carboxy-2-oxindole and 75 µL of piperidine in 2 mL of ethanol are heated at 95 ° C for 5 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate is filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven. The crude product was purified by silica gel column chromatography using ethyl acetate-hexane-acetic acid as eluent. 51 mg (30%) of the title compound is obtained as a yellow solid.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,27 (s, br, 1H, NH-1), 12,28 (s, vbr, 2H, 2xCOOH), 11,11 (s, br, 1H, NH-1), 8,34 (d, J = 1,36 Hz,1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.27 (s, br, 1H, NH-1), 12.28 (s, brbr, 2H, 2xCOOH), 11.11 (s, br, 1H NH-1) 8.34 (d, J = 1.36 Hz)

1H, H-4), 7,78 (s, 1H, H-vinyl), 7,40 (dd, J = 1,36, 8,20 Hz, 1H, H-6), 7,19 (d, J = 3,07 Hz, 1H, H-5'), 6,93 (d, J = 8,20 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,56 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,56 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃); MS m/z 341,0 [M+l] ⁺ .1H, H-4), 7.78 (s, 1H, H-vinyl), 7.40 (dd, J = 1.36, 8.20 Hz, 1H, H-6), 7.19 (d, J = 3.07 Hz, 1H, H-5 '), 6.93 (d, J = 8.20 Hz, 1H, H-7), 2.65 (t, J = 7.56 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.46 (t, J = 7.56 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.29 (s, 3H, CH ₃ ); MS m / z 341.0 [M + 1] <^+> .

Příklad 14Example 14

3-[4-methy 1-5-(2-oxo-5-sulfamoyl -1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [4-Methyl-5- (2-oxo-5-sulfamoyl-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

Do 100 ml baňky naplněné 27 ml kyseliny chlorsírové se pomalu přidá 13,3 g 2-oxindolu. Během přidávání se teplota reakce udržuje pod 30°C. Poté se reakčni směs míchá při pokojové teplotě po dobu 1,5 hodiny, zahřívá se při 68°C po dobu 1 hodiny, zchladí se a přelije do vody. Precipitát se promyje vodou a suší se ve vakuové peci, čímž se získá 11,0 g 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu (50 % výtěžek), který se použije bez dalšího čištění.To a 100 mL flask filled with 27 mL of chlorosulfuric acid was slowly added 13.3 g of 2-oxindole. During the addition, the reaction temperature is kept below 30 ° C. Then, the reaction mixture was stirred at room temperature for 1.5 hours, heated at 68 ° C for 1 hour, cooled and poured into water. The precipitate was washed with water and dried in a vacuum oven to give 11.0 g of 5-chlorosulfonyl-2-oxindole (50% yield), which was used without further purification.

5- chlorsulfonyl-2-oxindol (2,1 g) se přidá do 10 ml hydroxidu amonného v 10 ml ethanolu a míchá se při pokojové teplotě přes noc. Směs se koncentruje a pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací. Získá se 0,4 g (20 % výtěžek) 5-aminosulfonyl-2-oxindolu jako šedé pevné látky.Add 5-chlorosulfonyl-2-oxindole (2.1 g) to 10 mL of ammonium hydroxide in 10 mL of ethanol and stir at room temperature overnight. The mixture was concentrated and the solid was collected by vacuum filtration. 0.4 g (20% yield) of 5-aminosulfonyl-2-oxindole was obtained as a gray solid.

« • » • · • · 'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆); δ 10,67 (s, 1H, NH-1), 7,63-7,66 (m, 2H, H-4,6), 7,13 (s, 2H, 5-SO₂NH₂), 6,91 (d, J = 8,04 Hz, 1H, H7), a 3,56 (s, 2H, CH₂-3); MS m/z (relativní intenzita, %) 211 ( [ΜΙ]¹, 100).1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ); δ 10.67 (s, 1H, NH-1), 7.63-7.66 (m, 2H, H-4,6), 7.13 (s, 2H, 5-SO ₂ NH _2), 6 , 91 (d, J = 8.04 Hz, 1H, H7), and 3.56 (s, 2H, _CH2 -3); MS m / z (relative intensity,%) 211 ([ΜΙ] ^1, 100).

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,6 mg), 106 mg4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (90.6 mg), 106 mg

5-aminosulfonyl-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanol se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci. Získá se 132 mg (70%) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.5-Aminosulfonyl-2-oxindole and 75 µL piperidine in 2 mL ethanol were heated at 95 ° C for 5 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate is filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven. 132 mg (70%) of the title compound are obtained as a yellow solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆); δ 13,28 (s, br, 1H, NH-1'), 12,0 (s, vbr, 1H, COOH), 11,15 (s, br, 1H, NH-1), 8,20 (d, J = 1,60 Hz, 1H, H-4), 7,73 (s, 1H, H-vinyl), 7,59 (dd, J = 1,60, 8,17 Hz, 1H, H-6), 7,22 (d, J = 2,85 Hz, 1H, H-2'), 7,10 (s, 2H, NH₂), 6,98 (d, J - 8,17 Hz, 1H, H-7), 2,67 (t, J = 7,41 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,41 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH) a 2,29 (s, 3H, CH₃).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ); δ 13.28 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.0 (s, brbr, 1H, COOH), 11.15 (s, br, 1H, NH-1'), 8.20 (d J = 1.60 Hz, 1H, H-4), 7.73 (s, 1H, H-vinyl), 7.59 (dd, J = 1.60, 8.17 Hz, 1H, H-6) ), 7.22 (d, J = 2.85 Hz, 1H, H-2 '), 7.10 (s, 2H, _NH2), 6.98 (d, J - 8.17 Hz, 1H, H-7), 2.67 (t, J = 7.41 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.46 (t, J = 7.41 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH) 2 and 29 (s, 3H, CH _3).

Příklad 15Example 15

3-[4-methyl-5-(5-methylsulfamoyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [4-Methyl-5- (5-methylsulfamoyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

Suspenze 3,38 g 5-chlorsulfonyl-2-oxindolu v 10 ml 2 M methylaminu v tetrahydrofuranu se míchá při pokojové teplotě po dobu 4 hodiny. Během této doby je bílá pevná látka stále přítomná. Precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje dvakrát 5 ml vody a suší se pod vakuem při 40°C přes noc. Získají se 3,0 g (88 % výtěžek) 5 - methy lam i no sul fonyl-2-oxindolu.A suspension of 3.38 g of 5-chlorosulfonyl-2-oxindole in 10 ml of 2M methylamine in tetrahydrofuran was stirred at room temperature for 4 hours. During this time, a white solid is still present. The precipitate was collected by vacuum filtration, washed twice with 5 mL of water and dried under vacuum at 40 ° C overnight. 3.0 g (88% yield) of 5-methylamino-sulfonyl-2-oxindole are obtained.

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆): δ 10,87 (s, br, 1H, NH-1), 7,86 (s, br, 1H, 5-SO₂NHCH₃), 7,61 (d, J = 7,80 Hz 1H, H-6), 7,32 (d, J = 4,67 Hz, 1H, H-4), 6,97 (d, J- 7,80 Hz, 1H, H-7), 2,53 (s, 2H, CH₂-3), a 2,36 (s, 3H, 5-SO₂NHCH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 226 (M⁺, 100).1 H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 10.87 (s, br, 1H, NH-1), 7.86 (s, br, 1H, 5-SO ₂ NHCH ₃ ), 7.61 ( d, J = 7.80 Hz 1H, H-6), 7.32 (d, J = 4.67 Hz, 1H, H-4), 6.97 (d, J = 7.80 Hz, 1H, H-7), 2.53 (s, 2H, CH ₂ -3), 2.36 (s, 3H, 5-SO ₂ NHCH _3); MS m / z (relative intensity,%) 226 (M ^& lt ^{; +} &^gt;, 100).

104104

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,6 mg), 113 mg4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (90.6 mg), 113 mg

5-methylaminosulfonyl-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci. Získá se 163 mg (83%) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.The 5-methylaminosulfonyl-2-oxindole and 75 µL piperidine in 2 mL ethanol were heated at 95 ° C for 5 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate is filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven. 163 mg (83%) of the title compound are obtained as a yellow solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,30 (s, br, 1H, NH-1'), 12,0 (s, vbr, 1H, COOH), 11,19 (s, br, 1H, NH-1), 8,18 (d, J = 1,64 Hz, 1H, H-4), 7,80 (s, 1H, H-vinyl), 7,53 (dd, J = 1,64, 8,17 Hz, 1H, H-6), 7,23 (d, J = 2,80 Hz, 1H, H-2'), 7,13 (q, J = 5,15 Hz, 1H, NHCH₃), 7,02 (d, J = 8,17 Hz, 1H, H-7), 3,84 (s, 3H, COOCH₃), 2,66 (t, J 7,54 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,47 (t, J = 7,54 Hz, 2H,1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.30 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.0 (s, brbr, 1H, COOH), 11.19 (s, br, 1H, NH-1), 8.18 (d, J = 1.64 Hz, 1H, H-4), 7.80 (s, 1H, H-vinyl), 7.53 (dd, J = 1, 64, 8.17 Hz, 1H, H-6), 7.23 (d, J = 2.80 Hz, 1H, H-2 &apos;), 7.13 (q, J = 5.15 Hz, 1H, NHCH _3), 7.02 (d, J = 8.17 Hz, 1H, H-7), 3.84 (s, 3H, _COOCH3), 2.66 (t, J 7.54 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.47 (t, J = 7.54 Hz, 2H,

CH₂CH₂COOH), 2,41 (d, J = 5,15 Hz, 3H, NCH₃), 2,30 (s, 3H, CH₃); MS m/z 390 [M+1 ] ⁺ .CH ₂ CH ₂ COOH), 2.41 (d, J = 5.15 Hz, 3H, NCH ₃ ), 2.30 (s, 3H, CH ₃ ); MS m / z 390 [M + 1] ^<+> .

Příklad 16Example 16

3-{3-[4-(2-karboxy-ethyl)-3-methyl-lH-pyrrol-2-ylmethylen]-2oxo-2,3-dihydro-lH-indol-5-yl}-propionová kyselina3- {3- [4- (2-Carboxy-ethyl) -3-methyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -2-oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-yl} -propionic acid

5- chloracetyl-2-oxindol (4,18 g) ve 30 ml trifluoroctové kyseliny v ledové lázni se nechá působit s 4,65 g triethylsilanu a míchá se při pokojové teplotě po dobu 3 hodiny. Směs se nalije do 150 ml vody a precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se 50 ml vody a suší se. Získá se 2,53 g (65 % výtěžek) 5-(2-chlorethyl)-2-oxindolu jako červenohnědé pevné látky.5-Chloroacetyl-2-oxindole (4.18 g) in 30 ml of trifluoroacetic acid in an ice bath was treated with 4.65 g of triethylsilane and stirred at room temperature for 3 hours. The mixture was poured into 150 ml of water and the precipitate was collected by vacuum filtration, washed with 50 ml of water and dried. 2.53 g (65% yield) of 5- (2-chloroethyl) -2-oxindole were obtained as a red-brown solid.

Kyanid draselný (2,0 g) se přidá do 15 ml dimethylsulfoxidu a zahřeje se na 90°C. 5-chlorethyl-2-oxindol (3,0 g) rozpuštěný v 5 ml dimethylsulfoxidu se pomalu přidává za stálého míchání a reakce se zahřívá při 150°C po dobu 2 hodiny. Směs se ochladí, přelije se do ledové vody a precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se vodou a suší se. Získaná surová látka se chromatografuje na silikágelu • · « ·» ·« ·· ··· · * t> · · · · • · ♦ · * · ♦Potassium cyanide (2.0 g) was added to 15 mL of dimethyl sulfoxide and heated to 90 ° C. 5-Chloroethyl-2-oxindole (3.0 g) dissolved in 5 mL of dimethylsulfoxide was slowly added with stirring and the reaction was heated at 150 ° C for 2 hours. The mixture was cooled, poured into ice water and the precipitate was collected by vacuum filtration, washed with water and dried. The crude material obtained is chromatographed on silica gel. T sil t t t t t t t t t

5% methanolem v chloroformu. Získá se 1,2 g (42% výtěžek) požadované sloučeniny.5% methanol in chloroform. 1.2 g (42% yield) of the title compound are obtained.

5-kyanoethyl-2-oxindol (4,02 g) v 10 ml vody obsahující 25 ml koncentrované kyseliny octové se refluxuje po dobu 4 hodiny. Směs se ochladí, přidá se voda a výsledná pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje vodou a suší se. Získá se 1,9 g (44 % výtěžek) 5-karboxyethyl-2-oxindolu jako žluté pevné látky.5-Cyanoethyl-2-oxindole (4.02 g) in 10 mL of water containing 25 mL of concentrated acetic acid was refluxed for 4 hours. The mixture was cooled, water was added, and the resulting solid was collected by vacuum filtration, washed with water, and dried. 1.9 g (44% yield) of 5-carboxyethyl-2-oxindole are obtained as a yellow solid.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 12,00 (s, br, ÍH, 5CH₂CH₂COOH), 10,21 (s, ÍH, NH-1), 7,05 (s, ÍH, H-4), 6,99 (d, J 8,68 Hz, ÍH, H-6), 6,69 (d, J = 8,68 Hz, ÍH, H-7), 3,40 (s, 2H, CH₂3), 2,74 (t, J = 7,44 Hz, 2H, 5-CH₂CH₂COOH) a 2,46 (t, J = 7,44 Hz, 2H,-CH₂CH₂COOH).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 12.00 (s, br, 1H, 5CH ₂ CH ₂ COOH), 10.21 (s, 1H, NH-1), 7.05 (s, 1H) H-4), 6.99 (d, J 8.68 Hz, 1H, H-6), 6.69 (d, J = 8.68 Hz, 1H, H-7), 3.40 (s , 2H, _CH2 3), 2.74 (t, J = 7.44 Hz, 2H, 5-CH ₂ CH ₂ COOH) and 2.46 (t, J = 7.44 Hz, 2H, -CH ₂ CH _{2 (} COOH).

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,6 mg), 102,6 mg4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (90.6 mg), 102.6 mg

5-karboxyethyl-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Surová pevná látka se přečistí kolonovou chromatografií na silikagelu mobilní fází ethylacetát-hexan-octová kyselina. Získá se 121 mg (66%) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.Of 5-carboxyethyl-2-oxindole and 75 µL of piperidine in 2 ml of ethanol are heated at 95 ° C for 5 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. The crude solid was purified by column chromatography on silica gel eluting with ethyl acetate-hexane-acetic acid. 121 mg (66%) of the title compound is obtained as a yellow solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,30 (d, J = 2,38 Hz, ÍH, NH1'), 12,03 (s, vbr, 2H, 2xCOOH), 10,68 (s, br, ÍH, NH-1), 7,63 (s, ÍH, H-4), 7,59 (s, ÍH, H-vinyl), 7,12 (d, J = 2,64 Hz, ÍH, H-2'), 6,96 (dd, J = 1, 22, 7,93 Hz, ÍH, H-6), 6, 75 (d, J = 7,93 Hz, ÍH, H-7), 2,81 (t, J = 7,75Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,65 (t, J = 7,75Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,55 (t, J = 7,75 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,42 Hz, CH₂CH₂COOH) a 2,26 (s, 3H, CH₃).1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.30 (d, J = 2.38 Hz, 1H, NH 1 '), 12.03 (s, vbr, 2H, 2xCOOH), 10.68 (s , br, 1H, NH-1), 7.63 (s, 1H, H-4), 7.59 (s, 1H, H-vinyl), 7.12 (d, J = 2.64 Hz, 1H) H-2 '), 6.96 (dd, J = 1.22, 7.93 Hz, 1H, H-6), 6.75 (d, J = 7.93 Hz, 1H, H-7) , 2.81 (t, J = 7,75Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.65 (t, J = 7,75Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.55 (t, J = 7.75 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.46 (t, J = 7.42 Hz, CH ₂ CH ₂ COOH) and 2.26 (s, 3H, CH _3).

Příklad 17Example 17

3-[5-(5-ethyl-2-oxo -1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-4-methyllH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-ethyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

2-oxindol (3 g) se suspenduje v 1,2-dichlorethanu a pomalu se nechá působit s 3,2 ml acetylchloridu. Výsledná suspenze se zahřívá při 50°C po dobu 5 hodin, zchladí se a přelije se do vody. Získaný precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, řádně se promyje vodou a suší se pod vakuem. Získá se 2,9 g (73 % výtěžek) 5-acetyl-2-oxindolu jako hnědé pevné látky.2-Oxindole (3 g) was suspended in 1,2-dichloroethane and treated slowly with 3.2 mL of acetyl chloride. The resulting suspension was heated at 50 ° C for 5 hours, cooled and poured into water. The precipitate obtained is collected by vacuum filtration, washed thoroughly with water and dried under vacuum. 2.9 g (73% yield) of 5-acetyl-2-oxindole were obtained as a brown solid.

5-acetyl-2-oxindol (2 g) v 15 ml trifluoroctové kyseliny v ledové lázni se nechá pomalu působit s 1,8 g triethylsilanu a poté se míchá při pokojové teplotě po dobu 5 hodin. Přidá se jeden ml triethylsilanu a míchání pokračuje přes noc. Reakční směs se nalije do ledové vody a výsledný precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, řádně se promyje vodou a suší se pod vakuem. Získá se 1,3 g (71 % výtěžek) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.5-Acetyl-2-oxindole (2 g) in 15 ml of trifluoroacetic acid in an ice bath was slowly treated with 1.8 g of triethylsilane and then stirred at room temperature for 5 hours. One ml of triethylsilane was added and stirring continued overnight. The reaction mixture was poured into ice water and the resulting precipitate was collected by vacuum filtration, washed thoroughly with water and dried under vacuum. 1.3 g (71% yield) of the title compound are obtained as a yellow solid.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,25 (s, br, NH-1), 7,03 (s, 1H, H-4), 6,97 (d, J = 8,05 Hz, 1H, H-6), 6,69 (d, J = 8,05 Hz, 1H, H7), 3,40 (s, 2H, CH₂-3), 2,51 (q, J = 7,69 Hz, 2H, CH₂CH₃-5) a 1,12 (t, J = 7,42 Hz, 3H, CH₂CH₃-5).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 10.25 (s, br, NH-1), 7.03 (s, 1H, H-4), 6.97 (d, J = 8.05) Hz, 1H, H-6), 6.69 (d, J = 8.05 Hz, 1H, H7), 3.40 (s, 2H, CH ₂ -3), 2.51 (q, J = 7 , 69 Hz, 2H, CH ₂ CH ₃ -5) and 1.12 (t, J = 7.42 Hz, 3H, CH ₂ CH ₃ -5).

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,6 mg), 80,5 mg4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (90.6 mg), 80.5 mg

5-ethyl-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Surová pevná látka se přečistí chromatografií na silikagelu mobilní fází ethylacetát-hexan-octová kyselina. Získá se 52 mg (32%) požadované sloučeniny.Of 5-ethyl-2-oxindole and 75 µL of piperidine in 2 ml of ethanol are heated at 95 ° C for 5 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. The crude solid was purified by chromatography on silica gel using ethyl acetate-hexane-acetic acid as the eluent. 52 mg (32%) of the title compound are obtained.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,31 (s, br, 1H, NH-1'), 12,04 (s, vbr, 1H, COOH), 10,66 (s, 1H, NH-1), 7,59 (s, 2H, H-4 a H-vinyl), 7,11 (d, J = 3,29 Hz, 1H, H-2’), 6,94 (d, J = 7, 85 Hz, 1H, H-6), 6,75 (d, J = 7,85 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,66 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,57 (q, J = 7,83 Hz, 2H, CH₃CH₂), 2,46 (t, J = 7,66 Hz, CH₂CH₂COOH), 1,20 (t, J = 7,83, 3H, CH₃CH₂), 2,26 (s, 3H, CH₃); MS m/z 325 [M+l] ⁺ .1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.31 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.04 (s, brbr, 1H, COOH), 10.66 (s, 1H, NH-1), 7.59 (s, 2H, H-4 and H-vinyl), 7.11 (d, J = 3.29 Hz, 1H, H-2 '), 6.94 (d, J = 7.85 Hz, 1H, H-6), 6.75 (d, J = 7.85 Hz, 1H, H-7), 2.65 (t, J = 7.66 Hz, 2H, CH2 ₎ CH ₂ COOH), 2.57 (q, J = 7.83 Hz, 2H, CH ₃ CH ₂ ), 2.46 (t, J = 7.66 Hz, CH ₂ CH ₂ COOH), 1.20 ( t, J = 7.83, 3H, CH ₃ CH ₂ ), 2.26 (s, 3H, CH ₃ ); MS m / z 325 [M + 1] &lt; ^{+ &gt;} .

107 • ·107 • ·

0 « 0 • 0 «0 «1 • 0«

Příklad 18Example 18

3-[5-(5-methoxy-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl-ΙΗ-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-Methoxy-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-4-pyrrol-3-yl] -propionic acid

Chloralhydrát (9,6 g) se rozpustí ve 200 ml vody obsahující 83 g síranu sodného. Roztok se ohřeje na 60°C a přidá se roztok 11,4 g hydroxylaminhydrochloridu v 50 ml vody a směs se udržuje při 60°C. V oddělené baňce se na 80°C ohřeje 6,4 g 4-anisidinu a 4,3 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové v 80 ml vody . První roztok se přidá do druhého a výsledná směs se refluxuje po dobu 2 minuty, pomalu se zchladí na pokojovou teplotu a poté se zchladí v ledové lázni. Zabarvený precipitát se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se vodou a suší se pod vakuem. Získá se 8,6 g (85% výtěžek) N-(2hydroximinoacetyl)anisidinu.Chloral hydrate (9.6 g) was dissolved in 200 ml of water containing 83 g of sodium sulfate. The solution is warmed to 60 ° C and a solution of 11.4 g of hydroxylamine hydrochloride in 50 ml of water is added and the mixture is maintained at 60 ° C. In a separate flask, 6.4 g of 4-anisidine and 4.3 ml of concentrated hydrochloric acid are heated to 80 ° C in 80 ml of water. The first solution was added to the second and the resulting mixture was refluxed for 2 minutes, slowly cooled to room temperature and then cooled in an ice bath. The colored precipitate was collected by vacuum filtration, washed with water and dried under vacuum. 8.6 g (85% yield) of N- (2-hydroxyiminoacetyl) anisidine are obtained.

Koncentrovaná kyselina sírová (45 ml) obsahující 5 ml vody se ohřeje na 60°C a v jedné dávce se přidá 8,6 g N-(2hydroximinoacetyl)anisidinu. Míchaná směs se zahřívá při 93°C po dobu 10 minut a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Směs se nalije do 500 g ledu a extrahuje se třikrát ethylacetátem. Spojené extrakty se suší nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se 5,1 g (65 % výtěžek) 5-methoxyisatinu jako tmavě červené pevné látky.Concentrated sulfuric acid (45 mL) containing 5 mL of water was heated to 60 ° C and 8.6 g of N- (2-hydroxyiminoacetyl) anisidine was added in one portion. The stirred mixture was heated at 93 ° C for 10 minutes and then cooled to room temperature. The mixture was poured into 500 g of ice and extracted three times with ethyl acetate. The combined extracts were dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated. 5.1 g (65% yield) of 5-methoxyisatin are obtained as a dark red solid.

5-methoxyisatin (5,0 g) a 30 ml hydrátu hydrazinu se zahřívá na refluxu po dobu 15 minut. Reakční směs se ochladí na pokojovou teplotu a přidá se 50 ml vody. Směs se třikrát extrahuje 25 ml ethylacetátu, organické vrstvy se spojí a suší se nad bezvodým síranem sodným. Poté se koncentrují, čímž vznikne žlutá pevná látka. Pevná látka se míchá v ethylacetátu a 1,1 g nerozpustného materiálu se odstraní vakuovou filtrací a uschová se. Tato látka je 2-hydrazinokarbonylmethyl-4-anisidin. Filtrát se koncentruje a chromatografuje na silikagelu mobilní fází ethylacetát: hexan 1: 1, čímž se získá 0,7 g 5methoxy-2-oxindol jako špinavě žluté pevné látky. 1,1 g 2hydrazinokarbonylmethyl-4-anisidinu se refluxuje po dobu 1 hodiny ve 20 ml 1 N hydroxidu sodného. Směs se ochladí, okyselí se na pH 25-methoxyisatin (5.0 g) and 30 ml of hydrazine hydrate were heated at reflux for 15 minutes. The reaction mixture was cooled to room temperature and water (50 ml) was added. The mixture was extracted three times with 25 mL of ethyl acetate, the organic layers were combined and dried over anhydrous sodium sulfate. They were then concentrated to give a yellow solid. The solid was stirred in ethyl acetate and 1.1 g of insoluble material was removed by vacuum filtration and stored. This substance is 2-hydrazinocarbonylmethyl-4-anisidine. The filtrate was concentrated and chromatographed on silica gel with ethyl acetate: hexane 1: 1 to give 0.7 g of 5-methoxy-2-oxindole as an off-yellow solid. 1.1 g of 2hydrazinocarbonylmethyl-4-anisidine was refluxed for 1 hour in 20 ml of 1 N sodium hydroxide. The mixture was cooled, acidified to pH 2

108 ·108 ·

•» 0 0 0 · • 000 0 0 · « 0 · · 00 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 * · · • · 0 0 00 0 0 *

0000 · 0 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a třikrát se extrahuje 25 ml ethylacetátu. Organické extrakty se spojí, promyjí se solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se 0,8 g 5methoxy-2-oxindolu jako špinavě žluté pevné látky. Spojený výtěžek činí 1,5 g, což je 33 %.Concentrated hydrochloric acid and extracted three times with 25 ml of ethyl acetate. The organic extracts were combined, washed with brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated. 0.8 g of 5-methoxy-2-oxindole is obtained as an off-yellow solid. The combined yield was 1.5 g, which is 33%.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,13 (s, ÍH, NH-1), 6,84 (s, ÍH, H-4), 6,72 (d, J - 8,68 Hz, ÍH, H-6), 6,69 (d, J - 8,68 Hz, ÍH, H7), 3,68 (s, 3H, OCH₃-5), 3,41 (s, 2H, CH₂-3), MS m/z (relativní intenzita, %) 163 ( [M+l]⁺, 100).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 10.13 (s, 1H, NH-1), 6.84 (s, 1H, H-4), 6.72 (d, J = 8.68) Hz, Ih, H-6), 6.69 (d, J - 8.68 Hz, Ih H7), 3.68 (s, 3H, OCH ₃ -5), 3.41 (s, 2H, CH ₂ -3), MS m / z (relative intensity,%) 163 ([m + l] ^+, 100).

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90 mg), 82 mg 5methoxy-2-oxindolu a 2 kapky piperidinu ve 2 ml ethanol se zahřívají při 95°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 110 mg (67%) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (90 mg), 82 mg of 5-methoxy-2-oxindole and 2 drops of piperidine in 2 mL of ethanol were heated at 95 ° C overnight. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 110 mg (67%) of the title compound are obtained as a brown solid.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, ÍH, NH-1'), 12,03 (s, vbr, ÍH, COOH), 10,57 (s, ÍH, NH-1), 7,63 (s, ÍH, H-vinyl), 7,42 (d, J = 2,46 Hz, ÍH, H-4), 7,12 (d, J = 3,08 Hz, ÍH, H-2'), 6,74 (d, J = 8,26 Hz, ÍH, H-6), 6,75 (dd, J = 2,46, 8,26 Hz, ÍH, H-7), 3,77 (s, 3H, OCH₃), 2,65 (t, J = 7,40Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,40 Hz, CH₂CH₂COOH), 2,27 (s, 3H, CH₃) ; MS m/z (relativní intenzita, %) 327 ( [M + l] ⁺ , 100).1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.38 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.03 (s, br, 1H, COOH), 10.57 (s, 1H, NH-1), 7.63 (s, 1H, H-vinyl), 7.42 (d, J = 2.46 Hz, 1H, H-4), 7.12 (d, J = 3.08 Hz) 1 H, H-2 '), 6.74 (d, J = 8.26 Hz, 1 H, H-6), 6.75 (dd, J = 2.46, 8.26 Hz, 1 H, H- 7), 3.77 (s, 3H, _OCH3), 2.65 (t, J = 7,40Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.46 (t, J = 7.40 Hz, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.27 (s, 3H, CH ₃ ); MS m / z (relative intensity,%) 327 ([M + 1] ⁺ , 100).

Příklad 19Example 19

3-[5-(5-brom-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-Bromo-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

3-2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (97,5 mg), 106 mg 5-brom-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 3 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině3-2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole (97.5 mg), 106 mg of 5-bromo-2-oxindole and 75 µL of piperidine in 3 mL of ethanol are heated at 95 ° C for 5 hours . The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous acid

109 chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 171 mg (88%) požadované sloučeniny jako oranžové pevné látky.109 hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 171 mg (88%) of the title compound are obtained as an orange solid.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 12,04 (s, vbr, 1H, COOH), 10,80 (s, br, 1H, NH-1), 8,0 (d, J = 2,06 Hz, 1H, H-4), 7,67 (s, 1H, Hvinyl), 7,19 (dd, J - 2,06, 8,40 Hz, 1H, H-6), 6,79 (d, J = 8,40 Hz, 1H, H-7), 2,65 (t, J = 7,63 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,35 (t, J - 7,63 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2,27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 389 ( [M+l]⁺ 100).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 12.04 (s, vbr, 1H, COOH), 10.80 (s, br, 1H, NH-1), 8.0 (d, J = 2) 10 Hz, 1H, H-4), 7.67 (s, 1H, vinyl), 7.19 (dd, J = 2.06, 8.40 Hz, 1H, H-6), 6.79 (s) d, J = 8.40 Hz, 1H, H-7), 2.65 (t, J = 7.63 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.35 (t, J - 7.63 Hz 2 H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.29 (s, 3H, CH ₃ ), 2.27 (s, 3H, CH ₃ ); MS m / z (relative intensity,%) 389 ([M + 1] ⁺ 100).

3-[5-(5-jod-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethy 1)-2,4dimethyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-Iodo-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (97,5 mg), 130 mg 5-jod-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 3 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 155 mg (71%) požadované sloučeniny jako oranžové pevné látky.3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole (97.5 mg), 130 mg of 5-iodo-2-oxindole and 75 µL of piperidine in 3 ml of ethanol are heated at 95 ° C for 5 hours. hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 155 mg (71%) of the title compound are obtained as an orange solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,41 (s, br, 1H, NH-1'), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,79 (s, br, 1H, NH-1), 8,12 (d, J = 1,70 Hz, 1H, H-4), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,36 (dd, J = 1,70, 7,93 Hz, 1H, H-6), 6,79 (d, J - 7,93 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2, 27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 437 ([M+l] ⁺ , 100).1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.41 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.03 (s, br, 1H, COOH), 10.79 (s, br, 1H, NH-1), 8.12 (d, J = 1.70 Hz, 1H, H-4), 7.65 (s, 1H, H-vinyl), 7.36 (dd, J = 1, 70, 7.93 Hz, 1H, H-6), 6.79 (d, J = 7.93 Hz, 1H, H-7), 2.64 (t, J = 7.76 Hz, 2H, CH) ₂ CH ₂ COOH), 2.34 (t, J = 7.76 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.29 (s, 3H, CH _3), 2. 27 (s, 3H, CH ₃ ); MS m / z (relative intensity,%) 437 ([M + 1] ⁺ , 100).

Příklad 20Example 20

3-[5-(5-jod-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-Iodo-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (97,5 mg), 130 mg 5-jod-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 3 ml ethanolu se míchají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se.3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole (97.5 mg), 130 mg of 5-iodo-2-oxindole and 75 µL of piperidine in 3 ml of ethanol are stirred at 95 ° C for 5 hours. hours. The reaction mixture was cooled and concentrated.

110 • · · · φ φ · * φ φ · φ φ φ φ110 • · · · φ φ · · φ φ

11 φ • · Φφφ φφφφ φφφ φφ φφφφ11 φ • · Φφφ φφφφ φφφ φφ φφφφ

Zbytek se suspenduje v 6 Ν vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 155 mg požadované sloučeniny (71 %) jako oranžové pevné látky.The residue was suspended in 6 Ν aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 155 mg of the desired compound (71%) are obtained as an orange solid.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,41 (s, br, 1H, NH-1'), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,79 (s, br, 1H, NH-1), 8,12 (d, J = 1,70 Hz, 1H, H-4), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,36 (dd, J = 1,70, 7,93 Hz, 1H, H-6), 6,79 (d, J = 7,93 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2, 27 (s, 3H, CH₃), MS m/z (relativní intenzita, %) 437 ( [M+l] ⁺ , 100).1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.41 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.03 (s, br, 1H, COOH), 10.79 (s, br, 1H, NH-1), 8.12 (d, J = 1.70 Hz, 1H, H-4), 7.65 (s, 1H, H-vinyl), 7.36 (dd, J = 1, 70, 7.93 Hz, 1H, H-6), 6.79 (d, J = 7.93 Hz, 1H, H-7), 2.64 (t, J = 7.76 Hz, 2H, CH) ₂ CH ₂ COOH), 2.34 (t, J = 7.76 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.29 (s, 3H, CH _3), 2. 27 (s, 3H, CH ₃ MS, m / z (relative intensity,%) 437 ([M + 1] ⁺ , 100).

Příklad 21Example 21

3-[2,4-dimethyl-5-(4-methyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [2,4-Dimethyl-5- (4-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (97,5 mg), 74 mg 4-methyl-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 3 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 60 mg (37 %) požadované sloučeniny jako zelené pevné látky.3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole (97.5 mg), 74 mg of 4-methyl-2-oxindole and 75 µL of piperidine in 3 ml of ethanol are heated at 95 ° C for 5 hours. hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 60 mg (37%) of the title compound are obtained as a green solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d_ó): δ 13,41 (s, br, 1H, NH-1'), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,72 (s, br, 1H, NH-1), 7,50 (s, 1H, H-vinyl), 7,01 (t, J = 7, 82 Hz, 1H, H-6), 6, 79 (d, J = 7,82 Hz, H-5), 6,74 (d, J = 7,82 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,56 (s, 3H, CH₃), 2,34 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2,18 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 325 ( [M+l] ⁺ , 100).1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.41 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.03 (s, br, 1H, COOH), 10.72 (s, br, 1H, NH-1), 7.50 (s, 1H, H-vinyl), 7.01 (t, J = 7.82 Hz, 1H, H-6), 6.79 (d, J = 7, 82 Hz, H-5), 6.74 (d, J = 7.82 Hz, 1H, H-7), 2.64 (t, J = 7.76 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH); 2.56 (s, 3H, CH ₃ ), 2.34 (t, J = 7.76 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.29 (s, 3H, CH ₃ ), 2.18 ( s, 3H, CH ₃ ); MS m / z (relative intensity,%) 325 ([M + 1] ⁺ , 100).

111111

Příklad 22Example 22

3-[2,4-dimethyl-5-(5-methyl-2-oxo- l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [2,4-Dimethyl-5- (5-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (97,5 mg), 74 mg 5-methyl-2-oxindolu a 75 pL piperidinu ve 3 ml ethanolu se zahřívají při 95°C po dobu 5 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 104 mg (64 %) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole (97.5 mg), 74 mg of 5-methyl-2-oxindole and 75 µL of piperidine in 3 ml of ethanol are heated at 95 ° C for 5 hours. hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 104 mg (64%) of the title compound are obtained as a yellow solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, 1H, NH-1'), 12,02 (s, br, 1H, COOH), 10,57 (s, br, 1H, NH-1), 7,52 (s, br, 1H, H-4), 7,50 (s, 1H, H-vinyl), 6,87 (d, J = 7,86 Hz, 1H, H6), 6,73 (d, J = 7,86 Hz, 1H, H-7), 2,63 (t, J = 7,49 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,49 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2,28 (s, 3H, CH₃), a 2,24 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 325 ([M+1 ] ⁺ , 66).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.38 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.02 (s, br, 1H, COOH), 10.57 (s, br, 1H, NH-1), 7.52 (s, br, 1H, H-4), 7.50 (s, 1H, H-vinyl), 6.87 (d, J = 7.86 Hz, 1H, H6), 6.73 (d, J = 7.86 Hz, 1H, H-7), 2.63 (t, J = 7.49 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.34 (t , J = 7.49 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.29 (s, 3H, _CH3), 2.28 (s, 3H, _CH3) and 2.24 (s, 3H, CH ₃ ); MS m / z (relative intensity,%) 325 ([M + 1] ⁺ , 66).

Příklad 23Example 23

3-[5-(6-hydroxy-2-oxo -1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (6-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

3,26 g 6-methoxy-2-oxindol v 60 ml dichlormethanu se ochladí na -2°C a po kapkách se přidá roztok 40 ml 1 M boridu bromitého. Reakční směs se míchá v ledové lázni po dobu 1 hodiny a poté při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Poté se přelije do ledové vody a extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou a solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným, koncentruje se a precipitát, který se utvoří se zfiltruje a poté se suší ve vakuové peci přes noc. Získá se 2,56 g 6-hydroxy-2-oxindolu (86% výtěžek).6-Methoxy-2-oxindole (3.26 g) in dichloromethane (60 ml) was cooled to -2 ° C and a solution of 1 M bromide boron (40 ml) was added dropwise. The reaction mixture was stirred in an ice bath for 1 hour and then at room temperature for 1 hour. It was then poured into ice water and extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with water and brine, dried over anhydrous sodium sulfate, concentrated, and the precipitate that formed was filtered and then dried in a vacuum oven overnight. 2.56 g of 6-hydroxy-2-oxindole are obtained (86% yield).

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,13 (s, 1H, NH-1), 9,22 (s, 1H, OH-6), 6,93 (d, J - 7,76 Hz, 1H, H-4), 6,27-6,31 (m, 2H, H-5,7) a 3,29 (s, 2H, CH₂-3); MS m/z 150 [M+l] ⁺ .1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 10.13 (s, 1H, NH-1), 9.22 (s, 1H, OH-6), 6.93 (d, J = 7.76) Hz, 1H, H-4), 6.27-6.31 (m, 2H, H-5,7), and 3.29 (s, 2H, _CH2 -3); MS m / z 150 [M + 1] &lt; ^{+ &gt;} .

112 φ · * · · ·«·· ««· φφ · ·· ·112 φ · · φ φ φ φ

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (82 mg), 63 mg 6-hydroxy-2-oxindolu a 48 pL piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C po dobu dvou dnů. Reakčni směs se ochladí, koncentruje se a přečistí se na silikagelu kolonovou chromatografií mobilní fází ethylacetát-hexan-octová kyselina. Získá se 55 mg (40%) požadované sloučeniny jako tmavě hnědé pevné látky.3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole (82 mg), 63 mg of 6-hydroxy-2-oxindole and 48 µL of piperidine in 2 mL of ethanol were heated at 90 ° C for two days. The reaction mixture was cooled, concentrated and purified on silica gel by column chromatography eluting with ethyl acetate-hexane-acetic acid. 55 mg (40%) of the title compound are obtained as a dark brown solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,10 (s, br, 1H, NH-1'), 12,0 (s, vbr, 1H, COOH), 10,51 (s, br, 1H, NH-1), 9,41 (s, 1H, OH), 7,44 (d, J = 7,83,1H, H-4), 7,29 (s, 1H, H-vinyl), 6,37 (dd, J - 2,16, 7,83 Hz, 1H, H-5), 6,33 (d, J = 2,16 Hz, 1H, H-7), 2,62 (t, J = 7,75 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,32 (t, J = 7,75 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,25 (s, 3H, CH₃), 2, 20 (s, 3H, CH₃); MS m/z 325 [M+1 ] ⁺ .1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.10 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.0 (s, brbr, 1H, COOH), 10.51 (s, br, 1H, NH-1), 9.41 (s, 1H, OH), 7.44 (d, J = 7.83, 1H, H-4), 7.29 (s, 1H, H-vinyl), 6.37 (dd, J = 2.16, 7.83 Hz, 1H, H-5), 6.33 (d, J = 2.16 Hz, 1H, H-7), 2.62 (t, J = 7.75 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.32 (t, J = 7.75 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.25 (s, 3H, _CH3); 2, 20 (s, 3H, CH _3); MS m / z 325 [M + 1] ^<+> .

Příklad 24Example 24

3-[5-(6-methoxy-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (6-methoxy-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (97,5 mg), 82 mg 6-methoxy-2-oxindolu a 2 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 95°C přes noc. Reakčni směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 2 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 130 mg (76%) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole (97.5 mg), 82 mg of 6-methoxy-2-oxindole and 2 drops of piperidine in 2 ml of ethanol were heated at 95 ° C overnight. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 2 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 130 mg (76%) of the title compound are obtained as a yellow solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,15 (s, br, 1H, NH-1'), 11,75 (s, vbr, 1H, COOH), 10,65 (s, br, 1H, NH-1), 7,58 (d, J = 8,27,1H, H-4), 7,29 (s, 1H, H-vinyl), 6,37 (dd, J = 2,26, 8,27 Hz, 1H, H-5), 6,33 (d, J = 2,26 Hz, 1H, H-7), 3,74 (s, 3H, OCH₃), 2,62 (t, J = 7,67 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,33 (t, J = 7,67 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,26 (s, 3H, CH₃), a 2,22 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 341 ( [M+l] ⁺ , 100) • ·1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.15 (s, br, 1H, NH-1 '), 11.75 (s, br, 1H, COOH), 10.65 (s, br, 1H, NH-1), 7.58 (d, J = 8.27, 1H, H-4), 7.29 (s, 1H, H-vinyl), 6.37 (dd, J = 2.26) , 8.27 Hz, 1H, H-5), 6.33 (d, J = 2.26 Hz, 1H, H-7), 3.74 (s, 3H, _OCH3), 2.62 (t , J = 7.67 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.33 (t, J = 7.67 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.26 (s, 3H, CH ₃₎ , and 2.22 (s, 3H, CH ₃ ); MS m / z (relative intensity,%) 341 ([M + 1] ⁺ , 100).

113113

Příklad 25Example 25

3- [5-(6-hydroxy-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (6-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (543 mg), 450 mg 6-hydroxy-2-oxindolu a 450 pL piperidinu v 10 ml ethanol se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 2 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se hnědá pevná látka.4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (543 mg), 450 mg of 6-hydroxy-2-oxindole and 450 µL of piperidine in 10 mL of ethanol were heated at 90 ° C overnight. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 2 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. A brown solid is obtained.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d_ó): δ 13,05 (s, br, IH, NH-1'), 10,60 (s, br, IH, NH-1), 9,4 (s, IH, OH), 7,49 (d, J = 8,08, IH, H-4), 7,35 (s, IH, H-vinyl), 7,02 (d, J = 3,22 Hz, IH, H2'), 6,38 (dd, J = 2,28, 8,08 Hz, IH, H-5), 6,32 (d, J = 2,28 Hz, IH, H-7), 2,62 (t, J = 7,67 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,44 (t, J = 7,67 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH) a 2,21 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 313 ( [M+l] ⁺ , 60).1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.05 (s, br, 1H, NH-1 '), 10.60 (s, br, 1H, NH-1), 9.4 (s, 1H, OH), 7.49 (d, J = 8.08, 1H, H-4), 7.35 (s, 1H, H-vinyl), 7.02 (d, J = 3.22 Hz, 1 H, H 2 '), 6.38 (dd, J = 2.28, 8.08 Hz, IH, H-5), 6.32 (d, J = 2.28 Hz, IH, H-7), 2.62 (t, J = 7.67 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.44 (t, J = 7.67 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH) and 2.21 (s, 3H, CH _3); MS m / z (relative intensity,%) 313 ([M + 1] ⁺ , 60).

Příklad 26Example 26

3,5-dimethoxy-benzyl ester 3-[5-(6-hydroxy-2-oxo-1,2dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionové kyseliny3- [5- (6-Hydroxy-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3,5-dimethoxy-benzyl ester

3-[5-(6-hydroxy-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina (100 mg), 56 mg 3,5dimethoxy-benzylchloridu a 207 mg uhličitanu draselného ve 2 ml bezvodého dimethylformamidu se zahřívají při 90°C přes noc.3- [5- (6-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid (100 mg), 56 mg of 3,5-dimethoxy-benzyl chloride and 207 mg of potassium carbonate in 2 ml of anhydrous dimethylformamide were heated at 90 ° C overnight.

Reakční směs se ochladí, přelije se do vody a extrahuje se ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou a solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje se. Surový produkt se přečistí kolonovou chromatografií na silikagelu mobilní fází ethylacetát-hexan-octová kyselina. Získá se 39 mg požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.The reaction mixture was cooled, poured into water and extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with water and brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated. The crude product was purified by silica gel column chromatography using ethyl acetate-hexane-acetic acid as the eluent. 39 mg of the desired compound is obtained as a brown solid.

114 • · · ·· ·· · · ··«· · · ♦ » · * · « · * · · * · ···· ··« 9· ···· ·· ·114 · · * * * 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

1HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,06 (s, br, 1H, NH-1’), 10,60 (s, br, 1H, NH-1), 9,4 (s, br, 1H, OH), 7,49 (d, J - 8,03, 1H, H-4), 7,35 (s, 1H, H-vinyl), 7,01 (d, J = 3,08 Hz, 1H, H-2'), 6,47 (d, J = 2,29 Hz, 2H, aromatika), 6,42 (t, J = 2,29Hz, 1H, aromatika), 6,38 (dd, J = 2,15, 8,03 Hz, 1H, H-5), 6,33 (d, J = 2,15 Hz, 1H, H-7), 5,01 (s, 2H, CH₂-F), 3,70 (s, 6H, 2xOCH₃), 2,59-2,72 (m, 4H,1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.06 (s, br, 1H, NH-1 '), 10.60 (s, br, 1H, NH-1), 9.4 (s, br 1 H, OH), 7.49 (d, J = 8.03, 1H, H-4), 7.35 (s, 1H, H-vinyl), 7.01 (d, J = 3.08 Hz) 1H, H-2 '), 6.47 (d, J = 2.29Hz, 2H, aromatics), 6.42 (t, J = 2.29Hz, 1H, aromatics), 6.38 (dd, J = 2.15, 8.03 Hz, 1H, H-5), 6.33 (d, J = 2.15 Hz, 1H, H-7), 5.01 (s, 2H, _CH2 -F ), 3.70 (s, 6H, 2xOCH _3), 2.59-2.72 (m, 4H,

CH₂CH₂COOH) a 2,20 (s, 3H, CH₃).CH ₂ CH ₂ COOH) and 2.20 (s, 3H, CH ₃ ).

Příklad 27Example 27

- {5-[6-(3-methoxy-fenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1 H-pyrrol-3-yl} -pr op i onová kyselina- {5- [6- (3-Methoxy-phenyl) -2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl] -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl} -propionic acid

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (0,7 g) se přidá do směsi 5 g 3methoxyfenylborité kyseliny, 3,8 g 5-brom-2-fluornitrobenzenu a 11 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného ve 100 ml toluenu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, zředí se vodou a extrahuje se ethylacetátem. Ethylacetát se promyje saturovaným hydrogenuhliěitanem sodným a poté solankou, suší se a koncentruje se. Vznikne olejovitá pevná látka. Pevná látka se chromatografuje na silikagelu ethylacetát: hexanem (1: 6). Získá se 4,3 g (77 % výtěžek) 4-fluor-3'-methoxy-3-nitrobifenylu.Tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0.7 g) was added to a mixture of 5 g of 3-methoxyphenylboronic acid, 3.8 g of 5-bromo-2-fluoronitrobenzene and 11 ml of a 2M solution of sodium carbonate in 100 ml of toluene. The mixture was refluxed for 2 hours, diluted with water and extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate was washed with saturated sodium bicarbonate and then brine, dried and concentrated. An oily solid is formed. The solid is chromatographed on silica gel with ethyl acetate: hexane (1: 6). 4.3 g (77% yield) of 4-fluoro-3'-methoxy-3-nitrobiphenyl are obtained.

Dimethylmalonát (9,7 ml) se přidá po kapkách do 2,0 g hydridu sodného suspendovaného v 50 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 35 minut a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Přidá se 4-fluor-2'-methoxy-3-nitrobifenyl (4,2 g) v 50 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 1 hodiny. Reakční směs se ochladí, ustálí se roztokem 300 ml saturovaného chloridu amonného a extrahuje se dvakrát ethylacetátem. Extrakty se spojí, promyjí se solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se surový dimethyl-3'-methoxy-3-nitrobifenyl-4malonát jako bledě žlutá pevná látka.Dimethyl malonate (9.7 ml) was added dropwise to 2.0 g of sodium hydride suspended in 50 ml of dimethyl sulfoxide. The mixture was heated at 100 ° C for 35 minutes and then cooled to room temperature. 4-Fluoro-2'-methoxy-3-nitrobiphenyl (4.2 g) in 50 mL of dimethylsulfoxide was added and the mixture was heated at 100 ° C for 1 hour. The reaction mixture was cooled, quenched with saturated ammonium chloride (300 mL) and extracted twice with ethyl acetate. The extracts were combined, washed with brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated. The crude dimethyl 3'-methoxy-3-nitrobiphenyl-4-malonate was obtained as a pale yellow solid.

Surový 3'-methoxy-3-nitro-bifenyl-4-malonát se zahřívá při 110°C ve 45 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové po dobu 4 dny a zchladí • 0 » 0The crude 3'-methoxy-3-nitro-biphenyl-4-malonate was heated at 110 ° C in 45 ml of 6 N hydrochloric acid for 4 days and cooled.

115115

00·· se. Precipitát se shromáždí filtrací, promyje se vodou a hexanem a suší se. Získá se 5,3 g 3'-methoxy-2-nitrobifenyl-4-octové kyseliny jako světlehnědé pevné látky.00 ·· se. The precipitate was collected by filtration, washed with water and hexane, and dried. 5.3 g of 3'-methoxy-2-nitrobiphenyl-4-acetic acid are obtained as a light brown solid.

3'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-octová kyselina (5,2 g) se rozpustí v methanolu a hydrogenuje se přes 0,8 g 10 % paladia na aktivním uhlí po dobu 3 hodiny při pokojové teplotě. Katalyzátor se odstraní filtrací, promyje se methanolem, filtráty se spojí a koncentrují se do vzniku hnědé pevné látky. Pevná látka se chromatografuje na silikagelu ethylacetát: hexan: octovou kyselinou 33: 66: 1. Získá se 3,0 g (75 % výtěžek založený na 4-fluor-3'-methoxy-3-nitrobifenylu) 6-(3-methoxyfenyl)-2-oxindolu jako růžové pevné látky.3'-Methoxy-3-nitrobiphenyl-4-acetic acid (5.2 g) was dissolved in methanol and hydrogenated over 0.8 g of 10% palladium on charcoal for 3 hours at room temperature. The catalyst was removed by filtration, washed with methanol, the filtrates combined and concentrated to give a brown solid. The solid is chromatographed on silica gel with ethyl acetate: hexane: acetic acid 33: 66: 1 to give 3.0 g (75% yield based on 4-fluoro-3'-methoxy-3-nitrobiphenyl) 6- (3-methoxyphenyl) -2-oxindole as a pink solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,39 (s, br, 1H, NH), 7,35 (t, J = 7,85 Hz, 1H), 7,26 (d, J = 7,78 Hz, 1H), 7,19 (dd, J = 1,22, 7,8 HZ, 1H), 7,13-7,16 (m, 1H), 7,09-7,1 (m, 1H), 7,01 (d, J = 1,48 Hz, 1H), 6,90-6,93 (m, 1H), 3,8 (s, 3H, OCH₃), 3,49 (s, 2H, CH₂); MS m/z (relativní intenzita, %) 240,0 ( [M+l] ⁺ , 100).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 10.39 (s, br, 1H, NH), 7.35 (t, J = 7.85 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 7.78 Hz, 1H), 7.19 (dd, J = 1.22, 7.8 Hz, 1H), 7.13-7.16 (m, 1H), 7.09-7.1 (m 1 H, 7.01 (d, J = 1.48 Hz, 1 H), 6.90-6.93 (m, 1 H), 3.8 (s, 3H, OCH ₃ ), 3.49 (s , 2H, CH _2); MS m / z (relative intensity,%) 240.0 ([M + 1] ⁺ , 100).

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (117 mg), 120 mg 6-(3-methoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kapky piperidinu ve 3 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 190 mg (91 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole (117 mg), 120 mg of 6- (3-methoxyphenyl) -2-oxindole and 3 drops of piperidine in 3 ml of ethanol are heated at 90 ° C through night. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 190 mg (91%) of the title compound are obtained as a brown solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, 1H, NH-1'), 12,04 (s, br, 1H, COOH), 10,79 (s, br, 1H, NH-1), 7,77 (d, J = 8,05,1H, H4), 7,58 (s, 1H, H-vinyl), 7,27 (dd, J = 1,49, 8,05 Hz, 1H, H-5), 7,09 (d, J = 1,49 Hz, 1H, H-7), 6,89-7,59 (m, 4H), 3,81 (s, 3H, OCH₃), 2,65 (t, J = 7,62 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,35 (t, J = 7,62 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,30 (s, 3H, CH₃) a 2,27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 417 ( [M+l] ⁺ ,75).1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.38 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.04 (s, br, 1H, COOH), 10.79 (s, br, 1H, NH-1), 7.77 (d, J = 8.05, 1H, H4), 7.58 (s, 1H, H-vinyl), 7.27 (dd, J = 1.49, 8) 0.05 Hz, 1H, H-5), 7.09 (d, J = 1.49 Hz, 1H, H-7), 6.89-7.59 (m, 4H), 3.81 (s, 3H, _OCH3), 2.65 (t, J = 7.62 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.35 (t, J = 7.62 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH); 2.30 (s, 3H, _CH3) and 2.27 (s, 3H, CH _3); MS m / z (relative intensity,%) 417 ([M + 1] ⁺ , 75).

• ·• ·

116 » 4 44116 »44

44

44

44

4444 4444444 444

4 44 4

44444444

Příklad 28Example 28

3- [5-(6-brom-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyl1 H-pyrrol -3-yl]-prop i on ová kyselina3- [5- (6-Bromo-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

Dimethylmalonát (13 ml) se přidá po kapkách do 2,7 g hydridu sodného suspendovaného ve 20 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 10 minut a zchladí se na pokojovou teplotu. Přidá se 5-brom-2-fluornitrobenzen (5,0 g) ve 25 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakční směs se ochladí a ustálí se roztokem 300 ml saturovaného chloridu amonného a extrahuje třikrát ethylacetátem. Extrakty se spojí, promyjí se saturovaným chloridem amonným, vodou a solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se surový dimethyl4-brom-2-nitrofenylmalonát jako bledě žlutý olej.Dimethyl malonate (13 ml) was added dropwise to 2.7 g of sodium hydride suspended in 20 ml of dimethyl sulfoxide. The mixture was heated at 100 ° C for 10 minutes and cooled to room temperature. Add 5-bromo-2-fluoronitrobenzene (5.0 g) in 25 mL of dimethylsulfoxide and heat the mixture at 100 ° C for 2 hours. The reaction mixture was cooled and quenched with saturated ammonium chloride (300 ml) and extracted three times with ethyl acetate. The extracts were combined, washed with saturated ammonium chloride, water, and brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated. The crude dimethyl 4-bromo-2-nitrophenylmalonate was obtained as a pale yellow oil.

Surový dimethyl-4-brom-2-nitrofenylmalonát se zahřívá při 110°C ve 40 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové po dobu 24 hodiny a zchladí se. Precipitát se shromáždí filtrací, promyje se vodou a suší se. Získá se 5,3 g (89 % výtěžek) 4-brom-2-nitrofenyloctové kyseliny jako šedé pevné látky.The crude dimethyl 4-bromo-2-nitrophenylmalonate was heated at 110 ° C in 40 ml of 6 N hydrochloric acid for 24 hours and cooled. The precipitate was collected by filtration, washed with water and dried. 5.3 g (89% yield) of 4-bromo-2-nitrophenylacetic acid are obtained as a gray solid.

4- brom-2-nitrofenyloctová kyselina 0,26 g), 0,26 g zinkového prášku a 3 ml 50 % kyseliny sírové v 5 ml ethanolu se zahřívají při 100°C přes noc. Reakční směs se zfiltruje, zředí se malým množstvím kyseliny octové, koncentruje se, čímž se odstraní ethanol, zředí se vodou a extrahuje se dvakrát ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se 0,19 g (90 % výtěžek) 6-brom-2-oxindolu jako žluté pevné látky.4-bromo-2-nitrophenylacetic acid (0.26 g), 0.26 g of zinc powder and 3 ml of 50% sulfuric acid in 5 ml of ethanol are heated at 100 ° C overnight. The reaction mixture was filtered, diluted with a small amount of acetic acid, concentrated to remove ethanol, diluted with water and extracted twice with ethyl acetate. The combined extracts were washed with brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated. 0.19 g (90% yield) of 6-bromo-2-oxindole was obtained as a yellow solid.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,45 (s, br, 1H, NH-1), 7,14 (d, J = 7,89 Hz, 1H, H-4), 7,09 (dd, J - 1,53, 7,89 Hz, 1H, H-5), 6,93 (d, J = 1,53 Hz, 1H, H-7) a 3,43 (s, 2H, CH₂-3); MS m/z (relativní intenzita, %) 210 ( [M-2] ⁺ , 100) a 212 (M⁺, 100).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 10.45 (s, br, 1H, NH-1), 7.14 (d, J = 7.89 Hz, 1H, H-4), 7, 09 (dd, J = 1.53, 7.89 Hz, 1H, H-5), 6.93 (d, J = 1.53 Hz, 1H, H-7) and 3.43 (s, 2H, CH ₂ -3); MS m / z (relative intensity,%) 210 ([M-2] ⁺ , 100) and 212 (M ⁺ , 100).

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90 mg), 106 mg 6brom-2-oxindol a 3 kapky piperidinu ve 3 ml ethanolu se zahřívají při4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (90 mg), 106 mg of 6-bromo-2-oxindole and 3 drops of piperidine in 3 ml of ethanol are heated at

117 flfl · flfl flfl flfl flflflfl · · · · flflfl • · flfl flflfl fl · flflfl flfl • flflfl flflfl flfl flflflfl flfl fl117 flfl · flfl flfl flfl flflflfl · · · · flflfl • · flfl flflfl fl · flflfl flfl • flflfl flflfl flfl flflflfl flfl fl

90°C po dobu 4 hodiny. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 172 mg (92%) požadované sloučeniny jako žluté pevné látky.90 ° C for 4 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 172 mg (92%) of the title compound are obtained as a yellow solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,22 (s, br, 1H, NH-1'), 12,04 (s, br, 1H, COOH), 10,92 (s, br, 1H, NH-1), 7,73 (d, J = 8,37,1H, H4), 7,67 (s, 1H, H-vinyl), 7,18 (d, J = 3,22 Hz, 1H, H-2’), 7,14 (dd, J = 1,33, 8,37 Hz, 1H, H-5), 6,99 (d, J = 1,33 Hz, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,39 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,39 Hz, 2H,1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.22 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.04 (s, br, 1H, COOH), 10.92 (s, br, 1H, NH-1), 7.73 (d, J = 8.37, 1H, H4), 7.67 (s, 1H, H-vinyl), 7.18 (d, J = 3.22 Hz, 1H, H-2 '), 7.14 (dd, J = 1.33, 8.37 Hz, 1H, H-5), 6.99 (d, J = 1.33 Hz, 1H, H-7) ), 2.64 (t, J = 7.39 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.46 (t, J = 7.39 Hz, 2H,

CH2CH2COOH), 2,25 (s, 3H, CH₃); MS (APCI) m/z 375,0 [M+l] ⁺ .CH ₂ CH ₂ COOH), 2.25 (s, 3H, CH ₃ ); MS (APCI) mlz 375.0 [M + 1] ⁺ .

Příklad 29Example 29

- {5-[6-(3-methoxy-fenyl)-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-4-methyl -1 H-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina- {5- [6- (3-Methoxy-phenyl) -2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl] -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl} -propionic acid

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,5 mg), 120 mg 6-(3-methoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kapky piperidinu ve 3 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 195 mg (97%) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (90.5 mg), 120 mg of 6- (3-methoxyphenyl) -2-oxindole and 3 drops of piperidine in 3 ml of ethanol are heated at 90 ° C through night. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 195 mg (97%) of the desired compound is obtained as a brown solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,29 (s, br, 1H, NH-1'), 12,07 (s, br, 1H, COOH), 10,88 (s, br, 1H, NH-1), 7,82 (d, J = 7,77 Hz, 1H, H-4), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,27 (dd, J = 1,41, 7,77 Hz, 1H, H-5), 7,09 (d, J = 1,41 Hz, 1H, H-7), 6,89-7,36 (m, 5H), 3,82 (s, 3H, OCH₃), 2,65 (t, J = 7,55 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,47 (t, J = 7,55 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,27 (s, 3H, CH₃); MS (APCI) m/z 401 [M-l] ⁺ .1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.29 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.07 (s, br, 1 H, COOH), 10.88 (s, br, 1H, NH-1), 7.82 (d, J = 7.77Hz, 1H, H-4), 7.65 (s, 1H, H-vinyl), 7.27 (dd, J = 1, 41.77 Hz, 1H, H-5), 7.09 (d, J = 1.41 Hz, 1H, H-7), 6.89-7.36 (m, 5H), 3.82 (s, 3H, _OCH3), 2.65 (t, J = 7.55 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.47 (t, J = 7.55 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.27 (s, 3H, CH ₃ ); MS (APCI) m / z 401 [M ⁺ ] ⁺ .

9999 9 99 9 9 99 • 9 9 9 9 9 99999 9 99 9 9 99

ΙΟ 9 99999999ΙΟ 9 99999999

1 Ο 9 9999 991 Ο 9 9999 99

9999 999 99 9999 99 99999 999 99

Příklad 30Example 30

3-5-[6-(3-ethoxy-fenyl)-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-1 H-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina3-5- [6- (3-ethoxy-phenyl) -2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl] -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl} -propionic acid

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (0,8 g) se přidá do směsi 4,2 g 3-ethoxyfenylborité kyseliny, 5,0 g 5-brom-2-fluornitrobenzenu a 22 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluenu a 50 ml ethanolu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny a poté se koncentruje. Přidá se voda a směs se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Spojené ethylacetátové vrstvy se promyjí vodou a solankou, poté se suší a koncentrují. Zbytek se chromatografuje na silikagelu 5 % ethylacetátem v hexanu. Získá se 5,3 g (90 % výtěžek) surového 4fluor-3'-ethoxy-3-nitrobifenylu jako žlutého oleje.Tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0.8 g) was added to a mixture of 4.2 g of 3-ethoxyphenylboronic acid, 5.0 g of 5-bromo-2-fluoronitrobenzene and 22 ml of a 2 M solution of sodium carbonate in 50 ml of toluene and 50 ml. ethanol. The mixture was refluxed for 2 hours and then concentrated. Water was added and the mixture was extracted twice with ethyl acetate. The combined ethyl acetate layers were washed with water and brine, then dried and concentrated. The residue is chromatographed on silica gel with 5% ethyl acetate in hexane. 5.3 g (90% yield) of crude 4-fluoro-3'-ethoxy-3-nitrobiphenyl are obtained as a yellow oil.

Dimethylmalonát (11,4 ml) se přidá po kapkách do 4,0 g hydridu sodného suspendovaného ve 20 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 10 minut a zchladí se na pokojovou teplotu. Přidá se surový 4-fluor-3'-ethoxy-3-nitrobifenyl (5,3 g) ve 25 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakční směs se ochladí, ustálí se roztokem 300 ml saturovaného chloridu amonného a extrahuje třikrát ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí vodou a solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se surový dimethyl-3'-ethoxy-3-nitrobifenyl-4malonát jako žlutý olej.Dimethyl malonate (11.4 mL) was added dropwise to 4.0 g of sodium hydride suspended in 20 mL of dimethyl sulfoxide. The mixture was heated at 100 ° C for 10 minutes and cooled to room temperature. Crude 4-fluoro-3'-ethoxy-3-nitrobiphenyl (5.3 g) in 25 mL of dimethyl sulfoxide was added and the mixture was heated at 100 ° C for 2 hours. The reaction mixture was cooled, quenched with saturated ammonium chloride (300 ml) and extracted three times with ethyl acetate. The combined extracts were washed with water and brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated. The crude dimethyl 3'-ethoxy-3-nitrobiphenyl-4-malonate was obtained as a yellow oil.

Surový dimethyl-3'-ethoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát se zahřívá při 100°C v 60 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové celkem 4 dny a zchladí se. Precipitát se shromáždí filtrací, promyje se vodou a hexanem a suší se. Získá se 4,7 g (77 % výtěžek založený na 5-brom-2fluornitrobenzenu) surové 3'-ethoxy-3-nitrobifenyl-4-octové kyseliny jako světlehnědé pevné látky.The crude dimethyl 3'-ethoxy-3-nitrobiphenyl-4-malonate was heated at 100 ° C in 60 mL of 6 N hydrochloric acid for a total of 4 days and cooled. The precipitate was collected by filtration, washed with water and hexane, and dried. 4.7 g (77% yield based on 5-bromo-2-fluoronitrobenzene) of crude 3'-ethoxy-3-nitrobiphenyl-4-acetic acid are obtained as a light brown solid.

Železné úlomky (2,4 g) se přidají v jedné dávce do 4,6 g 3'ethoxy-3-nitrobifenyl-4-octové kyseliny ve 40 ml ledové kyselině octové a směs se refluxuje po dobu 2 hodiny. Reakční směs se koncentruje do sucha, znovu se nechá působit s ethylacetátem aIron fragments (2.4 g) are added in one portion to 4.6 g of 3'-ethoxy-3-nitrobiphenyl-4-acetic acid in 40 ml of glacial acetic acid and the mixture is refluxed for 2 hours. The reaction mixture was concentrated to dryness, treated again with ethyl acetate and ethyl acetate

119119

ΦΦΦ · φφ φφφφ zfiltruje se nerozpustný materiál. Filtrát se promyje dvakrát 1 N kyselinou chlorovodíkovou a poté solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje se. Získá se 3,5 g (91 % výtěžek) 6-(3ethoxyfenyl)-2-oxindolu jako hnědé pevné látky.Neroz · φφ φφφφ insoluble material is filtered. The filtrate was washed twice with 1 N hydrochloric acid and then brine, dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated. 3.5 g (91% yield) of 6- (3-ethoxyphenyl) -2-oxindole were obtained as a brown solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,4 (s, br, 1H, NH), 7,33 (t, J = 8,4 Hz, 1H, H-3'), 7,35 (d, J = 7,77 Hz, 1H), 7,19 (dd, J = 1,3, 7,66 HZ, 1H), 7,13 (d, J = 7,69 Hz, 1H), 7,07-7,08 (m, 1H), 7,0 (s, br, 1H), 6,9 (dd, J = 2,82, 8,08 Hz, 1H), 4,08 (q, J = 7 Hz, 2H, OEt), 3,49 (s, 2H, CH2), 1,34 (t, J = 7Hz, 3H, OEt); MS m/z (relativní intenzita, %) 254,2 ([M+l]⁺, 100).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 10.4 (s, br, 1H, NH), 7.33 (t, J = 8.4 Hz, 1H, H-3 '), 7.35 (d, J = 7.77 Hz, 1 H), 7.19 (dd, J = 1.3, 7.66 Hz, 1 H), 7.13 (d, J = 7.69 Hz, 1 H), 7 07-7.08 (m, 1H), 7.0 (s, br, 1H), 6.9 (dd, J = 2.82, 8.08 Hz, 1H), 4.08 (q, J) = 7 Hz, 2H, OEt), 3.49 (s, 2H, CH2), 1.34 (t, J = 7 Hz, 3H, OEt); MS m / z (relative intensity,%) 254.2 ([M + 1] ⁺ , 100).

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (97,6 mg), 127 mg 6-(3-ethoxyfenyl)-2-oxindol a 2 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 227 mg požadované sloučeniny (-100%) jako hnědé pevné látky.3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole (97.6 mg), 127 mg of 6- (3-ethoxyphenyl) -2-oxindole and 2 drops of piperidine in 2 ml of ethanol are heated at 90 ° C overnight. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 227 mg of the desired compound (00100%) are obtained as a brown solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, 1H, NH-1'), 12,06 (s, br, 1H, COOH), 10,81 (s, br, 1H, NH-1), 7,77 (d, J = 7,97,1H, H4), 7,58 (s, 1H, H-vinyl), 7,26 (dd, J = 1,35, 7,97 Hz, 1H, H-5), 7,08 (d, J = 1,35 Hz, 1H, H-7), 6,87-7,36 (m, 4H), 4,09 (q, J = 7,0 Hz, 2H, CH₃CH₂), 2,65 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,47 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2,30 (s, 3H, CH₃), 2,26 (s, 3H, CH₃), 1, 34 (t, J = 7,0 Hz, 3H, CH3CH3); MS m/z (relativní intenzita, %) 431 ( [M+l] ⁺ , 21).1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.38 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.06 (s, br, 1H, COOH), 10.81 (s, br, 1H, NH-1), 7.77 (d, J = 7.97, 1H, H4), 7.58 (s, 1H, H-vinyl), 7.26 (dd, J = 1.35, 7) 97 Hz, 1H, H-5), 7.08 (d, J = 1.35 Hz, 1H, H-7), 6.87-7.36 (m, 4H), 4.09 (q, J = 7.0 Hz, 2H, CH ₃ CH _2), 2.65 (t, J = 7.54 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.47 (t, J = 7.54 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.30 (s, 3H, _CH3), 2.26 (s, 3H, CH _3), 1. 34 (t, J = 7.0 Hz, 3H, CH3CH3); MS m / z (relative intensity,%) 431 ([M + 1] ⁺ , 21).

Příklad 31Example 31

- {5-[6-(3-ethoxy-fenyl)-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-4-methyl - lH-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina- {5- [6- (3-Ethoxy-phenyl) -2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl] -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl} -propionic acid

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,5 mg), 127 mg 6-(3-ethoxyfenyl)-2-oxindol a 2 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se.4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (90.5 mg), 127 mg of 6- (3-ethoxyphenyl) -2-oxindole and 2 drops of piperidine in 2 ml of ethanol are heated at 90 ° C through night. The reaction mixture was cooled and concentrated.

120120

ΦΦ φ φφ φφ φφφφ φφφ • φ φ » * φφφφ φ φ φ φφφ φφφφ φφφ φφ φφφ φφφ φ φΦΦ φ φ φ φ φ φ • • • * * * * φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ

Zbytek se suspenduje v 6 Ν vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 200 mg (96 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.The residue was suspended in 6 Ν aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 200 mg (96%) of the desired compound is obtained as a brown solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,29 (s, br, 1H, NH-1'), 12,07 (s, vbr, 1H, COOH), 10,88 (s, br, 1H, NH-1), 7,82 (d, J = 7,97,1H, H4), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,28 (dd, J - 1,20, 7,97 Hz, 1H, H-5), 7,08 (d, J = 1,20 Hz, 1H, H-7), 6,87 - 7,36 (m, 5H), 4,09 (q, J = 6,98 Hz, 2H, CH3CH2), 2, 65 (t, J = 7,47 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,47 (t, J = 7,47 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,27 (s, 3H, CH₃), 1,34 (t, J = 6,98Hz, 3H, CH₃CH₂).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.29 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.07 (s, br, 1H, COOH), 10.88 (s, br, 1H, NH-1), 7.82 (d, J = 7.97, 1H, H4), 7.65 (s, 1H, H-vinyl), 7.28 (dd, J = 1.20, 7) 97 Hz, 1H, H-5), 7.08 (d, J = 1.20 Hz, 1H, H-7), 6.87-7.36 (m, 5H), 4.09 (q, J = 6.98 Hz, 2H, CH ₃ CH ₂ ), 2.65 (t, J = 7.47 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.47 (t, J = 7.47 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.27 (s, 3H, CH ₃ ), 1.34 (t, J = 6.98Hz, 3H, CH ₃ CH ₂ ).

Příklad 32Example 32

3-[2,4-di methy 1-5-(2-oxo-6-fenyl -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [2,4-Dimethyl-5- (2-oxo-6-phenyl-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (0,8 g) se přidá do směsi 3,1 g benzenborité kyseliny, 5 g 5-brom-2-fluornitrobenzenu a 22 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluenu a 50 ml ethanolu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, koncentruje se a zbytek se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Ethylacetátová vrstva se promyje vodou a solankou, suší se a koncentruje se. Vznikne žlutý olej. Olej se chromatografuje na silikagelu 5 % ethylacetátem v hexanu. Získá se 4,75 g (96 % výtěžek) 4-fluor-3-nitrobifenylu jako žlutého oleje.Tetrakis (triphenylphosphine) palladium (0.8 g) was added to a mixture of 3.1 g of benzeneboronic acid, 5 g of 5-bromo-2-fluoronitrobenzene and 22 ml of a 2M solution of sodium carbonate in 50 ml of toluene and 50 ml of ethanol. The mixture was refluxed for 2 hours, concentrated and the residue was extracted twice with ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with water and brine, dried and concentrated. A yellow oil is formed. The oil was chromatographed on silica gel with 5% ethyl acetate in hexane. 4.75 g (96% yield) of 4-fluoro-3-nitrobiphenyl are obtained as a yellow oil.

Dimethylmalonát (10 ml) ve 25 ml dimethylsulfoxid se přidá po kapkách do 3,5 g hydridu sodného suspendovaného ve 25 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 10 minut. Směs se ochladí na pokojovou teplotu a přidá se 4,7 g 4-fluor-3nitrobifenylu ve 25 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny, zchladí se a ustálí se roztokem 300 ml saturovaného chloridu amonného. Směs se třikrát extrahuje ethylacetátem a spojené organické vrstvy se promyjí vodou a solankou a odpaří se. Vznikne žlutý olej, surový dimethyl-3-nitrobifenyl-4-malonát.Dimethyl malonate (10 mL) in 25 mL of dimethylsulfoxide was added dropwise to 3.5 g of sodium hydride suspended in 25 mL of dimethylsulfoxide and the mixture was heated at 100 ° C for 10 minutes. The mixture was cooled to room temperature and 4.7 g of 4-fluoro-3-nitrobiphenyl in 25 ml of dimethylsulfoxide was added. The mixture was heated at 100 ° C for 2 hours, cooled and quenched with a solution of 300 mL saturated ammonium chloride. The mixture was extracted three times with ethyl acetate and the combined organic layers were washed with water and brine and evaporated. A yellow oil is obtained, crude dimethyl 3-nitrobiphenyl-4-malonate.

121 ·· » ·« ·· • * · · 9 · · · • · · · · • ♦ · · · » • 9 9 9 9121 · 9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 999 99 999 9999 9,999 99,999 9

Surový dimethyl-3-nitrobifenyl-4-malonát se refluxuje ve 30 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové po dobu 24 hodiny. Precipitát se shromáždí filtrací, promyje vodou a suší se. Získá se 4,5 g (80 % založený na 4-fluor-3-nitrobifenylu) 3-nitrobifenyl-4-octová kyseliny jako krémově zbarvené pevné látky.The crude dimethyl 3-nitrobiphenyl-4-malonate was refluxed in 30 ml of 6 N hydrochloric acid for 24 hours. The precipitate was collected by filtration, washed with water and dried. 4.5 g (80% based on 4-fluoro-3-nitrobiphenyl) of 3-nitrobiphenyl-4-acetic acid are obtained as a cream colored solid.

V jedné dávce se přidají železné úlomky (2,6 g) do 4,5 g 3nitrobifenyl-4-octové kyseliny ve 40 ml kyseliny octové. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, koncentruje se do sucha a vloží do ethylacetátu. Pevné látky se odstraní filtrací a filtrát se dvakrát promyje 1 N kyselinou chlorovodíkovou a solankou a suší nad bezvodým síranem sodným. Filtrát se koncentruje, čímž vznikne 3,4 g (93 % výtěžek) 6-fenyl-2-oxindolu jako světlehnědé pevné látky.Iron fragments (2.6 g) were added in one portion to 4.5 g of 3-nitrobiphenyl-4-acetic acid in 40 ml of acetic acid. The mixture was refluxed for 2 hours, concentrated to dryness and taken up in ethyl acetate. The solids were removed by filtration and the filtrate was washed twice with 1 N hydrochloric acid and brine and dried over anhydrous sodium sulfate. The filtrate was concentrated to give 3.4 g (93% yield) of 6-phenyl-2-oxindole as a light brown solid.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,4 (s, br, 1H, NH-1), 7,57-7,6 (m, 2H), 7,42 - 7,46 (m, 2H), 7,32 - 7,37 (m, 1H), 7,27 (d, J = 7,7, 1H, H-4), 7,19 (dd, J = 1,6,7,7Hz, 1H, H-5), 7,01 (d, J = 1,6Hz, 1H, H-7), 3,49 (s, 2H, CH2); MS m/z (relativní intenzita, %) 210 ([M+lf, 100).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 10.4 (s, br, 1H, NH-1), 7.57-7.6 (m, 2H), 7.42-7.46 (m (2H), 7.32-7.37 (m, 1H), 7.27 (d, J = 7.7, 1H, H-4), 7.19 (dd, J = 1.6.7, 7Hz, 1H, H-5), 7.01 (d, J = 1.6Hz, 1H, H-7), 3.49 (s, 2H, CH2); MS m / z (relative intensity,%) 210 ([M + 1] +, 100).

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (97,6 mg), 105 mg 6-fenyl-2-oxindolu a 2 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 138 mg (71 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole (97.6 mg), 105 mg of 6-phenyl-2-oxindole and 2 drops of piperidine in 2 ml of ethanol were heated at 90 ° C overnight. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 138 mg (71%) of the title compound are obtained as a brown solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, 1H, NH-1'), 12,05 (s, br, 1H, COOH), 10,81 (s, br, 1H, NH-1), 7,78 (d, J = 7,84,1H, H4), 7,58 (s, 1H, H-vinyl), 7,25 - 7,63 (m, 6H), 7,09 (s, br, 1H, H-7), 2,64 (t, J = 7,71 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,35 (t, J = 7,71 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,30 (s, 3H, CH₃) a 2,26 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 387 ([M+l] ⁺ , 100).1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.38 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.05 (s, br, 1H, COOH), 10.81 (s, br, 1H, NH-1), 7.78 (d, J = 7.84, 1H, H4), 7.58 (s, 1H, H-vinyl), 7.25-7.63 (m, 6H), 7.09 (s, br, 1H, H-7), 2.64 (t, J = 7.71 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.35 (t, J = 7.71 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.30 (s, 3H, _CH3) and 2.26 (s, 3H, CH _3); MS m / z (relative intensity,%) 387 ([M + 1] ⁺ , 100).

122 ·* · «9 ·· ·· # * » » 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9122 · * · «9 ·· ·· # *» »9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 99 9 9 9 9

9999 999 99 9999 99 99999 999 99

Příklad 33Example 33

3- [4-methyl-5-(2-oxo-6-fenyl-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)1 H-pyrro 1-3-yl]-propionová kyselina3- [4-Methyl-5- (2-oxo-6-phenyl-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrro-3-yl] -propionic acid

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,5 mg), 105 mg 6-fenyl-2-oxindolu a 2 kapky piperidinu ve 2 ml ethanol se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 146 mg (78 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (90.5 mg), 105 mg of 6-phenyl-2-oxindole and 2 drops of piperidine in 2 mL of ethanol were heated at 90 ° C overnight. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 146 mg (78%) of the title compound are obtained as a brown solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,29 (s, br, 1H, NH-1'), 12,01 (s, vbr, 1H, COOH), 10,89 (s, br, 1H, NH-1), 7,83 (d, J = 7,92,1H, H4), 7,65 (s, 1H, H-vinyl), 7,30 - 7,65 (m, 5H), 7,16 (d, J = 2,83 Hz, 1H, H-2'), 7,28 (dd, J = 1,58, 7,92 Hz, 1H, H-5), 7,09 (d, J = 1,58 Hz, 1H, H-7), 2,66 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,45 (t, J = 7,76 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), a 2,27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 373 ( [M+l]⁺, 100).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.29 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.01 (s, brbr, 1H, COOH), 10.89 (s, br, 1H, NH-1), 7.83 (d, J = 7.92, 1H, H4), 7.65 (s, 1H, H-vinyl), 7.30-7.65 (m, 5H), 7.16 (d, J = 2.83 Hz, 1H, H-2 '), 7.28 (dd, J = 1.58, 7.92 Hz, 1H, H-5), 7.09 (d J = 1.58 Hz, 1H, H-7), 2.66 (t, J = 7.76 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.45 (t, J = 7.76 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), and 2.27 (s, 3H, CH _3); MS m / z (relative intensity,%) 373 ([M + 1] ⁺ , 100).

Příklad 34Example 34

3-5-[6-(4-methoxy-fenyl)-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-4-methyl -1 H-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina3-5- [6- (4-Methoxy-phenyl) -2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl] -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl} -propionic acid

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (1 g) se přidá do směsi 5 g 4methoxyfenylborité kyseliny, 6,6 g 5-brom-2-fluornitrobenzenu a 30 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluenu a 50 ml ethanolu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, koncentruje se a zbytek se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Ethylacetátová vrstva se promyje vodou a solankou, suší se a koncentruje se. Získá se hnědá olejovitá látka. Tato látka se chromatografuje na silikagelu 5 % ethylacetátem v hexanu. Získá se surový 4-fluor-4'-methoxy-3- nitrobifenyl jako bledě žlutá pevná látka.Tetrakis (triphenylphosphine) palladium (1 g) was added to a mixture of 5 g of 4-methoxyphenylboronic acid, 6.6 g of 5-bromo-2-fluoronitrobenzene and 30 ml of 2M sodium carbonate solution in 50 ml of toluene and 50 ml of ethanol. The mixture was refluxed for 2 hours, concentrated and the residue was extracted twice with ethyl acetate. The ethyl acetate layer was washed with water and brine, dried and concentrated. A brown oil is obtained. This material was chromatographed on silica gel with 5% ethyl acetate in hexane. Crude 4-fluoro-4'-methoxy-3-nitrobiphenyl was obtained as a pale yellow solid.

Dimethylmalonát (10 ml) se přidá po kapkách do 2,0 g hydridu sodného suspendovaného v 60 ml dimethylsulfoxidu. Směs zahřívá přiDimethyl malonate (10 ml) was added dropwise to 2.0 g of sodium hydride suspended in 60 ml of dimethyl sulfoxide. The mixture is heated at

123 ·· · ·* ·9 ·· • · ·· · · · · ··· • · · · · · · • · · · · ···· • · · · · · 9123 9 9 9 9 9 9 9

9··Φ ··· 9· ···· ·· ·9 ··· 9 · ···· ·· ·

100°C po dobu 10 minut a zchladí se na pokojovou teplotu. Přidá se surový 4-fluor-2'-methoxy-3-nitrobifenyl (5,2 g) v 50 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakční směs se ochladí, ustálí se roztokem 300 ml saturovaného chloridu amonného a extrahuje se třikrát ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí saturovaným chloridem amonným, vodou a solankou, suší nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se. Získá se surový dimethyl-4'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát jako žlutý olej.100 ° C for 10 minutes and cooled to room temperature. Crude 4-fluoro-2'-methoxy-3-nitrobiphenyl (5.2 g) in 50 mL of dimethylsulfoxide was added and the mixture was heated at 100 ° C for 2 hours. The reaction mixture was cooled, quenched with saturated ammonium chloride (300 mL) and extracted three times with ethyl acetate. The combined extracts were washed with saturated ammonium chloride, water, and brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated. The crude dimethyl 4'-methoxy-3-nitrobiphenyl-4-malonate was obtained as a yellow oil.

Surový 4'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát se zahřívá při 100° C v 60 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové po dobu 15 hodiny a zchladí se. Utvořený precipitát se shromáždí filtrací, promyje se vodou a hexanem a suší se. Získá se 7,2 g surového 4'-methoxy-3-nitrobifenyl4-octové kyseliny jako světle nahnědlé pevné látky.The crude 4'-methoxy-3-nitrobiphenyl-4-malonate was heated at 100 ° C in 60 ml of 6 N hydrochloric acid for 15 hours and cooled. The precipitate formed was collected by filtration, washed with water and hexane, and dried. 7.2 g of crude 4'-methoxy-3-nitrobiphenyl-4-acetic acid are obtained as a light brown solid.

Železné úlomky (3,6 g) se přidají v jedné dávce do 7,2 g 4'methoxy-3-nitrobifenyl-4-octové kyseliny v 50 ml ledové kyseliny octové a zahřívá se při 100°C přes noc. Reakční směs se koncentruje do sucha, sonikuje se v ethylacetátu a filtrací se odstraní nerozpustný materiál. Filtrát se promyje dvakrát 1 N kyselinou chlorovodíkovou, poté solankou, suší nad bezvodým síranem sodným a koncentruje se. Získá se 2,7 g (54 % výtěžek založený na 5-brom-2-fluornitrobenzenu) 6-(4-methoxyfenyl)-2-oxindolu jako růžově zbarvené pevné látky.Iron fragments (3.6 g) are added in one portion to 7.2 g of 4'-methoxy-3-nitrobiphenyl-4-acetic acid in 50 ml of glacial acetic acid and heated at 100 ° C overnight. The reaction mixture was concentrated to dryness, sonicated in ethyl acetate and filtered to remove insoluble material. The filtrate was washed twice with 1 N hydrochloric acid, then brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated. 2.7 g (54% yield based on 5-bromo-2-fluoronitrobenzene) of 6- (4-methoxyphenyl) -2-oxindole were obtained as a pink colored solid.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,38 (s, br, 1H, NH-1), 7,52 (d, J = 9 Hz, 2H,), 7,23 (d, J = 7,3 Hz, 1H, H-4), 7,14 (d, d, J = 1,38, 7,3Hz, 1H, H-5), 7,0 (d, J = 9 Hz, 2H), 6,96 (d, J = 1,38 Hz, 1H, H-7), 3,78 (s, 3H, OCH3), 3,47 (s, 2H, CH₂); MS m/z (relativní intenzita, %) 214,0 ( [M+l ] ⁺ , 100).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 10.38 (s, br, 1H, NH-1), 7.52 (d, J = 9 Hz, 2H,), 7.23 (d, J = 7.3 Hz, 1H, H-4), 7.14 (d, d, J = 1.38, 7.3 Hz, 1H, H-5), 7.0 (d, J = 9 Hz, 2H) 1.96 (d, J = 1.38 Hz, 1H, H-7), 3.78 (s, 3H, OCH 3), 3.47 (s, 2H, CH ₂ ); MS m / z (relative intensity,%) 214.0 ([M + 1] ⁺ , 100).

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (90,5 mg), 120 mg 6-(4-methoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (90.5 mg), 120 mg of 6- (4-methoxyphenyl) -2-oxindole and 3 drops of piperidine in 2 ml of ethanol are heated at 90 ° C through night. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate is filtered, washed with water to pH 6 and dried in vacuo

124 peci přes noc. Získá se 118 mg (59 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.124 ovens overnight. 118 mg (59%) of the title compound are obtained as a brown solid.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) : δ 13,26 (s, br, ÍH, NH-1'), 10,83 (s, br, ÍH, NH-1), 7,78 (d, J = 8,07 Hz, ÍH, H-4), 7,61 (s, ÍH, Hvinyl), 7,56 (d, J - 8,97 Hz, 2H), 7, 22 (dd, J = 1,44, 8,07 Hz, ÍH, H5), 7,13 (d, J - 3,09 Hz, ÍH, H-2’), 7,04 (d, J - 1,44 Hz, ÍH, H-7), 7,0 (d, J = 8,97 Hz, 2H), 3,79 (s, 3H, OCH₃), 2,65 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,44 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), a 2,27 (s, 3H, CH₃); MS m/z, (relativní intenzita, %) 404 ( [M+l] ⁺ , 100).1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.26 (s, br, 1H, NH-1 '), 10.83 (s, br, 1H, NH-1), 7.78 (d, J = 8.07 Hz, 1H, H-4), 7.61 (s, 1H, vinyl), 7.56 (d, J = 8.97 Hz, 2H), 7.22 (dd, J = 1) , 44, 8.07 Hz, 1H, H5), 7.13 (d, J = 3.09 Hz, 1H, H-2 '), 7.04 (d, J = 1.44 Hz, 1H, H) -7), 7.0 (d, J = 8.97 Hz, 2H), 3.79 (s, 3H, OCH ₃ ), 2.65 (t, J = 7.54 Hz, 2H, CH ₂ CH) ₂ COOH), 2.44 (t, J = 7.54 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), and 2.27 (s, 3H, CH ₃ ); MS m / z, (relative intensity,%) 404 ([M + 1] ⁺ , 100).

Příklad 35Example 35

3-{5-[6-(4-methoxy-fenyl)-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina3- {5- [6- (4-Methoxy-phenyl) -2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl] -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl} -propionic acid

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (98 mg), 120 mg 6-(4-methoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje s vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 118 mg (57 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole (98 mg), 120 mg of 6- (4-methoxyphenyl) -2-oxindole and 3 drops of piperidine in 2 ml of ethanol are heated at 90 ° C through night. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 118 mg (57%) of the title compound are obtained as a brown solid.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,35 (s, br, ÍH, NH-1’), 12,02 (s, br, ÍH, COOH), 10,75 (s, br, ÍH, NH-1), 7,73 (d, J = 6,75 Hz, ÍH, H-4), 7,56 (d, J = 9, 01 Hz, 2H), 7,54 (s, ÍH, H-vinyl) , 7,21 (dd, J = 1,59, 6,75 Hz, ÍH, H-5), 7,04 (d, J = 1,59 Hz, ÍH, H-7), 7,01 (d, J = 9,01 Hz, 2H), 3,79 (s, 3H, OCH₃ ), 2,65 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH2COOH), 2,35 (t, J = 7,54 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,29 (s, 3H, CH₃), a 2,26 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 417 ([M+l] ⁺ , 100).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.35 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.02 (s, br, 1H, COOH), 10.75 (s, br, 1 H, NH-1), 7.73 (d, J = 6.75 Hz, 1 H, H-4), 7.56 (d, J = 9.01 Hz, 2H), 7.54 (s, 1 H) H-vinyl), 7.21 (dd, J = 1.59, 6.75 Hz, 1H, H-5), 7.04 (d, J = 1.59 Hz, 1H, H-7), 7.01 (d, J = 9.01 Hz, 2H), 3.79 (s, 3H, _OCH3), 2.65 (t, J = 7.54 Hz, 2H, CH ₂ CH 2 COOH) 2, 35 (t, J = 7.54 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.29 (s, 3H, _CH3) and 2.26 (s, 3H, CH _3); MS m / z (relative intensity,%) 417 ([M + 1] ⁺ , 100).

125125

Příklad 36Example 36

3-5-[6-(2-methoxy-fenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3yliden methyl]-4-methyl -1 H-pyrrol-3-yl} -pr opi onová kyselina3-5- [6- (2-methoxy-phenyl) -2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidene methyl] -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl} -propionic acid

Tetrakis(trifenylfosfin)paladium (1 g) se přidá do směsi 5 g 2methoxyfenylborité kyseliny, 6,6 g 5-brom-2-fluornitrobenzenu a 30 ml 2 M roztoku uhličitanu sodného v 50 ml toluenu a 50 ml ethanolu. Směs se refluxuje po dobu 2 hodiny, koncentruje se a zbytek se extrahuje dvakrát ethylacetátem. Spojené ethylacetátové vrstvy se promyjí vodou a solankou, suší se a koncentrují se. Získá se tmavě zelený olej, který stáním tuhne na surový 4-fluor-2'-methoxy-3nitrobifenyl.Tetrakis (triphenylphosphine) palladium (1 g) was added to a mixture of 5 g of 2-methoxyphenylboronic acid, 6.6 g of 5-bromo-2-fluoronitrobenzene and 30 ml of 2M sodium carbonate solution in 50 ml of toluene and 50 ml of ethanol. The mixture was refluxed for 2 hours, concentrated and the residue was extracted twice with ethyl acetate. The combined ethyl acetate layers were washed with water and brine, dried and concentrated. A dark green oil is obtained which solidifies on standing to give crude 4-fluoro-2'-methoxy-3-nitrobiphenyl.

Dimethylmalonát (14 ml) se přidá po kapkách do 2,9 g hydridu sodného suspendovaného v 50 ml dimethylsulfoxidu. Směs se zahřívá při 100°C po dobu 15 minut a zchladí se na pokojovou teplotu.Dimethyl malonate (14 ml) was added dropwise to 2.9 g of sodium hydride suspended in 50 ml of dimethyl sulfoxide. The mixture was heated at 100 ° C for 15 minutes and cooled to room temperature.

Přidá se surový 4-fluor-2'-methoxy-3-nitrobifenyl v 60 ml dimethylsulfoxidu a směs se zahřívá při 100°C po dobu 2 hodiny. Reakční směs se ochladí, ustálí se roztokem 300 ml saturovaného chloridu amonného a extrahuje dvakrát ethylacetátem. Spojené extrakty se promyjí saturovaným chloridem sodným, vodou, solankou a suší nad bezvodým síranem sodným. Koncentrují se, čímž se získá surový dimethyl-2'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát jako žlutý olej.Crude 4-fluoro-2'-methoxy-3-nitrobiphenyl in 60 mL of dimethylsulfoxide was added and the mixture was heated at 100 ° C for 2 hours. The reaction mixture was cooled, quenched with saturated ammonium chloride (300 mL) and extracted twice with ethyl acetate. The combined extracts were washed with saturated sodium chloride, water, brine and dried over anhydrous sodium sulfate. Concentrate to give crude dimethyl 2'-methoxy-3-nitrobiphenyl-4-malonate as a yellow oil.

Surový 2'-methoxy-3-nitrobifenyl-4-malonát se zahřívá při 100°C v 50 ml 6 N kyseliny chlorovodíkové po dobu 24 hodiny a zchladí se. Precipitát se shromáždí filtrací, promyje se vodou, hexanem a suší se. Získá se 9,8 g 2'-methoxy-2-nitrobifenyl-4-octové kyseliny jako světlehnědé pevné látky.The crude 2'-methoxy-3-nitrobiphenyl-4-malonate was heated at 100 ° C in 50 mL of 6 N hydrochloric acid for 24 hours and cooled. The precipitate was collected by filtration, washed with water, hexane and dried. 9.8 g of 2'-methoxy-2-nitrobiphenyl-4-acetic acid are obtained as a light brown solid.

Železné úlomky (5 g) se přidají v jedné dávce do 9,8 g 2'methoxy-3-nitrobifenyl-4-octové kyseliny v 50 ml ledové kyseliny octové a směs se zahřívá při 100°C po dobu 3 hodiny. Reakční směs se koncentruje do sucha, sonikuje se v ethylacetátu a filtrací se odstraní nerozpustný materiál. Filtrát se promyje dvakrát 1 N kyselinou chlorovodíkovou, vodou, solankou a suší se nad bezvodým síranemIron fragments (5 g) are added in one portion to 9.8 g of 2'-methoxy-3-nitrobiphenyl-4-acetic acid in 50 ml of glacial acetic acid and the mixture is heated at 100 ° C for 3 hours. The reaction mixture was concentrated to dryness, sonicated in ethyl acetate and filtered to remove insoluble material. The filtrate was washed twice with 1 N hydrochloric acid, water, brine and dried over anhydrous sulfate.

126126

sodným a koncentruje se. Zbytek se chromatografuje na silikagelu ethylacetát : hexanem 1: 2. Získá se 5,4 g (69 % výtěžek založený nasodium and concentrated. The residue is chromatographed on silica gel with ethyl acetate: hexane 1: 2 to give 5.4 g (69% yield based on

5- brom-2-fluornitrobenzenu) 6-(2-methoxyfenyl)-2-oxindolu jako růžově zbarvené pevné látky.5-bromo-2-fluoronitrobenzene) 6- (2-methoxyphenyl) -2-oxindole as a pink solid.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,32 (s, br, 1H, NH), 7,297,34 (m, 1H), 7,19 -7,25 (m, 2H), 7,08 (d, J = 8Hz, 1H, H-4), 6,97 7,02 (m, 2H), 6,91 (d, J = 1,05 Hz, 1H, H-7), 3,8 (s, 3H, OCH₃), 3,47 (s, 2H, CH₂); MS m/z (relativní intenzita, %) 239,8 (100, [M+l]⁺).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 10.32 (s, br, 1H, NH), 7.297.34 (m, 1H), 7.19-7.25 (m, 2H), 7, 08 (d, J = 8 Hz, 1H, H-4), 6.97 7.02 (m, 2H), 6.91 (d, J = 1.05 Hz, 1H, H-7), 3.8 (s, 3H, _OCH3), 3.47 (s, 2H, _CH2); MS m / z (relative intensity,%) 239.8 (100, [M + 1] ⁺ ).

4-(2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (217 mg), 239 mg4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (217 mg), 239 mg

6- (2-methoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakčni směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 348 mg (86 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.6- (2-methoxyphenyl) -2-oxindole and 3 drops of piperidine in 2 ml of ethanol are heated at 90 ° C overnight. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 348 mg (86%) of the title compound is obtained as a brown solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,29 (s, br, 1H, NH-1'), 11,59 (s, br, 1H, COOH), 10,78 (s, br, 1H, NH-1), 7,75 (d, J = 8,13 Hz, 1H, H-4), 7,62 (s, 1H, H-vinyl), 7,0-7,34 (m, 7H), 3,76 (s, 3H, OCH₃), 2,66 (t, J = 7,46 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,46 (t, J = 7,46 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH) a 2,27 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 401 ( [M + l] ⁺ , 100).1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.29 (s, br, 1H, NH-1 '), 11.59 (s, br, 1H, COOH), 10.78 (s, br, 1H, NH-1), 7.75 (d, J = 8.13Hz, 1H, H-4), 7.62 (s, 1H, H-vinyl), 7.0-7.34 (m, 7H), 3.76 (s, 3H, _OCH3), 2.66 (t, J = 7.46 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.46 (t, J = 7.46 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH) and 2.27 (s, 3H, CH _3); MS m / z (relative intensity,%) 401 ([M + 1] ⁺ , 100).

Příklad 37Example 37

3-5-[6-(2-methoxy-fenyl)-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina3-5- [6- (2-Methoxy-phenyl) -2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl] -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl} -propionic acid

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (234 mg), 239 mg 6-(2-methoxyfenyl)-2-oxindolu a 3 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C přes noc. Reakčni směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc.3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole (234 mg), 239 mg of 6- (2-methoxyphenyl) -2-oxindole and 3 drops of piperidine in 2 ml of ethanol are heated at 90 ° C through night. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight.

127 ··· ·127 ··· ·

Surová pevná látka se přečistí kolonovou chromatografií na silikagelu mobilní fází ethylacetát : hexan 1: 1 obsahující 0,1 % kyseliny octové. Získá se 182 mg (44 %) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.The crude solid was purified by column chromatography on silica gel eluting with ethyl acetate: hexane 1: 1 containing 0.1% acetic acid. 182 mg (44%) of the title compound are obtained as a brown solid.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,38 (s, br, 1H, NH-1’), 12,0 (s, br, 1H, COOH), 10,7 (s, br, 1H, NH-1), 7,71 (d, J = 7,74 Hz, 1H, H-4), 7,55 (s, 1H, H-vinyl), 7,0-7,33 (m, 6H), 3,76 (s, 3H, OCH₃), 2,65 (t, J = 7,6 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,35 (t, J = 7,6 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,3 (s, 3H, CH₃), a 2,26 (s, 3H, CH₃); MS (APCI neg) m/z (relativní intenzita, %) 415 ([M-l], 100).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.38 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.0 (s, br, 1 H, COOH), 10.7 (s, br, 1H, NH-1), 7.71 (d, J = 7.74Hz, 1H, H-4), 7.55 (s, 1H, H-vinyl), 7.0-7.33 (m, 6H), 3.76 (s, 3H, _OCH3), 2.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.35 (t, J = 7.6 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.3 (s, 3H, _CH3) and 2.26 (s, 3H, CH _3); MS (APCI neg) m / z (relative intensity,%) 415 ([M-1], 100).

Příklad 38Example 38

3-[2,4-dimethyl-5-(6-morfolin-4-yl-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [2,4-Dimethyl-5- (6-morpholin-4-yl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

Dihydrát chloridu cínu (225 g) se přidá do roztoku 2,4dinitrofenyloctové kyseliny (22,6 g) v ethanolu (450ml). Směs se zahřívá při 90°C po dobu 10 hodin. Reakční směs se ochladí a 12 M hydroxidem sodným se upraví pH na 11. Pevné látky se odstraní filtrací a filtrát se koncentruje. Zbytek se nechá působit s ethanolem (300 ml). Nerozpustné látky se zfiltrují a promyjí ethanolem (5x 60ml). Spojené ethanolové podíly se odpaří a suší se pod vakuem. Získá se 15g 6-amino-2-oxindolu jako hnědého prášku.Tin chloride dihydrate (225 g) was added to a solution of 2,4-dinitrophenylacetic acid (22.6 g) in ethanol (450 ml). The mixture was heated at 90 ° C for 10 hours. The reaction mixture was cooled and adjusted to pH 11 with 12M sodium hydroxide. The solids were removed by filtration and the filtrate was concentrated. The residue was treated with ethanol (300 mL). Insoluble materials were filtered and washed with ethanol (5x 60ml). The combined ethanol fractions were evaporated and dried under vacuum. 15g of 6-amino-2-oxindole is obtained as a brown powder.

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,03 (s, br, NH), 6,78 (d, J = 8,55 Hz, 1H, H-4), 6,09-6,11 (m, 2H), 4,95 (s, br, 2H, NH₂), 3,22 (s, 2H, H-3); MS (+ APCI) m/z (relativní intenzita, %) 147 ([ΜΙ ] ⁺ , 100).1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 10.03 (s, br, NH), 6.78 (d, J = 8.55 Hz, 1H, H-4), 6.09-6, 11 (m, 2H), 4.95 (s, br, 2H, _NH2), 3.22 (s, 2H, H-3); MS (+ APCI) m / z (relative intensity,%) 147 ([ΜΙ] ⁺ , 100).

6-amino-2-oxindol (2,2 g), 4,0 g 2,2'-dibromethyletheru a 7,9 g uhličitanu sodného se refluxují přes noc ve 20 ml ethanol, koncentrují se a zředí se 50 ml vody. Směs se extrahuje třikrát 50 ml ethylacetátu, organické extrakty se spojí , promyjí se 20 ml solanky, suší nad bezvodým síranem sodným a koncentrují se do sucha. Pevná látka se chromatografuje na sloupci silikagelu mobilní fází ethylacetát6-Amino-2-oxindole (2.2 g), 4.0 g of 2,2'-dibromoethyl ether and 7.9 g of sodium carbonate were refluxed overnight in 20 ml of ethanol, concentrated and diluted with 50 ml of water. The mixture was extracted three times with 50 mL ethyl acetate, the organic extracts were combined, washed with 20 mL brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated to dryness. The solid is chromatographed on a silica gel column using ethyl acetate as the eluent

128 : hexan 1: 1 obsahující 0,7 % kyseliny octové. Získá se 1,2 g (37 % výtěžek) 6-(morfolin-4-yl)-2-oxindolu jako béžové pevné látky.128: hexane 1: 1 containing 0.7% acetic acid. 1.2 g (37% yield) of 6- (morpholin-4-yl) -2-oxindole were obtained as a beige solid.

HNMR (360 MHz, DMSO-d6): δ 10,2 (s, br, 1H, NH-1), 7,02 (d, J = 7,87 Hz, 1H, H-4), 6,47 (dd, J = 2,11, 7,87 Hz, 1H, H5), 6,37 (d, J = 2,11 Hz, 1H, H-7), 3,69-3,72 (m, 4H), 3,32 (s, 2H, CH₂), 3,01-3,04 (m, 4H); MS m/z (relativní intenzita, %) 219 ([M+l]⁺, 100).1 HNMR (360 MHz, DMSO-d 6): δ 10.2 (s, br, 1H, NH-1), 7.02 (d, J = 7.87 Hz, 1H, H-4), 6.47 ( dd, J = 2.11, 7.87 Hz, 1H, H5), 6.37 (d, J = 2.11 Hz, 1H, H-7), 3.69-3.72 (m, 4H) , 3.32 (s, 2H, _CH2), 3.01-3.04 (m, 4H); MS m / z (relative intensity,%) 219 ([M + 1] ⁺ , 100).

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (3,3 g), 4 g 6(morfolin-4-yl)-2-oxindolu a 1,8 ml piperidinu v 60 ml ethanolu se zahřívají při 90oC po dobu 7 hodin. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Výsledná pevná látka se přečistí kolonovou chromatografií na silikagelu mobilní fází ethylacetát hexan - octová kyselina. Získá se 2,78 g (38 % výtěžek) požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky.3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole (3.3 g), 4 g of 6 (morpholin-4-yl) -2-oxindole and 1.8 ml of piperidine in 60 ml of ethanol are heated at 90 ° C for 7 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. The resulting solid was purified by column chromatography on silica gel eluting with ethyl acetate: hexane-acetic acid. 2.78 g (38% yield) of the title compound are obtained as a brown solid.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d6): δ 13,13 (s, br, 1H, NH-1'), 12,02 (s, br, 1H, COOH), 10,57 (s, br, 1H, NH-1), 7,52 (d, J = 8,46 Hz, 1H, H-4), 7,32 (s, 1H, H-vinyl), 6,58 (dd, J = 1,99, 8,46 Hz, 1H, H-5), 6,41 (d, J - 1,99 Hz, 1H, H-7), 3,71-3,74 (m, 4H), 3,06-3,09 (m, 4H), 2,62 (t, J = 7, 57 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,33 (t, J = 7,57 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,26 (s, 3H, CH₃), a 2,21 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 396 ([M+l]⁺, 100).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d 6): δ 13.13 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.02 (s, br, 1 H, COOH), 10.57 (s, br, 1 H) NH-1), 7.52 (d, J = 8.46Hz, 1H, H-4), 7.32 (s, 1H, H-vinyl), 6.58 (dd, J = 1.99) 8.46 Hz, 1H, H-5), 6.41 (d, J = 1.99 Hz, 1H, H-7), 3.71-3.74 (m, 4H), 3.06- 3.09 (m, 4H), 2.62 (t, J = 7, 57 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.33 (t, J = 7.57 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.26 (s, 3H, CH ₃ ), and 2.21 (s, 3H, CH ₃ ); MS m / z (relative intensity,%) 396 ([M + 1] ⁺ , 100).

Příklad 39Example 39

3-[5-(5-chlor-4-methyl-2-oxo -1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-chloro-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) 2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

Suspenze 3,0 g 4-methyl-2-oxindolu se míchá v 50 ml acetonitrilu při pokojové teplotě a po dávkách se přidá 3,3 g Nchlor-sukcinimidu. Poté se přidá trifluoroctová kyselina (1 ml). Suspenze se míchá při pokojové teplotě po dobu 3 dnů, během kterých je pevná látka stále přítomná. Bílá pevná látka se shromáždí vakuovou filtrací, promyje se malým množstvím studeného acetonu a suší se přesA suspension of 3.0 g of 4-methyl-2-oxindole is stirred in 50 ml of acetonitrile at room temperature and 3.3 g of N-chlorosuccinimide are added in portions. Trifluoroacetic acid (1 mL) was then added. The suspension is stirred at room temperature for 3 days, during which the solid is still present. The white solid was collected by vacuum filtration, washed with a small amount of cold acetone, and dried over

129 noc ve vakuové peci při 40°C. Získá se 2,5 g (68 %) 5-chlor-4-methyl2-oxindolu.129 overnight in a vacuum oven at 40 ° C. 2.5 g (68%) of 5-chloro-4-methyl-2-oxindole are obtained.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 10,38 (s, br, 1H, NH), 7,19 (d,1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 10.38 (s, br, 1H, NH), 7.19 (d,

J = 8Hz, 1H, aromatika), 6,64 (d, J = 8 Hz, 1H, aromatika), 3,46 (s,J = 8Hz, 1H, aromatics), 6.64 (d, J = 8Hz, 1H, aromatics), 3.46 (s,

2H, H-3), 2,19 (s, 3H, CH₃).2H, H-3), 2.19 (s, 3H, CH _3).

3-(2-karboxyethyl)-2,4-dimethyl-5-formylpyrrol (98 mg), 91 mg3- (2-carboxyethyl) -2,4-dimethyl-5-formylpyrrole (98 mg), 91 mg

5-chlor-4-methyl-2-oxindolu a 2 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C po dobu 4 hodiny. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 100 mg požadované sloučeniny.Of 5-chloro-4-methyl-2-oxindole and 2 drops of piperidine in 2 ml of ethanol are heated at 90 ° C for 4 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 100 mg of the desired compound is obtained.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d_ó): δ 13,47 (s, br, 1H, NH-1'), 12,03 (s, br, 1H, COOH), 10,83 (s, br, 1H, NH-1), 7,61 (s, 1H, H-vinyl), 7,14 (d, J = 8,17 Hz, 1H, aromatika), 6,74 (d, J = 8,17 Hz, 1H, aromatika), 2,64 (s, 3H, CH₃), 2,64 (t, J = 7,62 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,34 (t, J = 7,62 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,3 (s, 3H, CH₃) a 2,20 (s, 3H, CH₃).1 HNMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.47 (s, br, 1H, NH-1 '), 12.03 (s, br, 1H, COOH), 10.83 (s, br, 1H, NH-1), 7.61 (s, 1H, H-vinyl), 7.14 (d, J = 8.17 Hz, 1H, aromatics), 6.74 (d, J = 8.17 Hz) 1 H, aromatics), 2.64 (s, 3H, CH ₃ ), 2.64 (t, J = 7.62 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.34 (t, J = 7, 62 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.3 (s, 3H, _CH3) and 2.20 (s, 3H, CH _3).

Příklad 40Example 40

3- [5-(5-chlor-4-methyl-2-oxo -1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)4-methyl -lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-chloro-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) 4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid

4- (2-karboxyethyl)-2-formyl-3-methylpyrrol (91 mg), 91 mg 5chlor-4-methyl-2-oxindolu a 2 kapky piperidinu ve 2 ml ethanolu se zahřívají při 90°C po dobu 4 hodiny. Reakční směs se ochladí a koncentruje se. Zbytek se suspenduje v 6 N vodné kyselině chlorovodíkové. Precipitát se zfiltruje, promyje se vodou na pH 6 a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 95 mg požadované sloučeniny.4- (2-carboxyethyl) -2-formyl-3-methylpyrrole (91 mg), 91 mg of 5-chloro-4-methyl-2-oxindole and 2 drops of piperidine in 2 ml of ethanol were heated at 90 ° C for 4 hours. The reaction mixture was cooled and concentrated. The residue was suspended in 6 N aqueous hydrochloric acid. The precipitate was filtered, washed with water to pH 6 and dried in a vacuum oven overnight. 95 mg of the title compound are obtained.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,36 (s, br, 1H, NH-1'), 11,98 (s, br, 1H, COOH), br, 1H, NH-1), 7,68 (s, 1H), 7,19 (d, J = 7,14Hz, 1H, aromatika), 7,17 (s, 1H), 6,75 (d, J = 7,14 Hz, 1H, aromatika),1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.36 (s, br, 1H, NH-1 '), 11.98 (s, br, 1H, COOH), br, 1H, NH-1) 7.68 (s, 1H), 7.19 (d, J = 7.14Hz, 1H, aromatics), 7.17 (s, 1H), 6.75 (d, J = 7.14Hz, 1H , aromatics),

130130

2,66 (s, 3H, CH₃-4), 2,66 (t, J = 7,51 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,45 (t, J = 7,51 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,21 (s, 3H, CH₃); MS m/z (relativní intenzita, %) 345 ([M+lf, 100).2.66 (s, 3H, CH ₃ -4), 2.66 (t, J = 7.51 Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.45 (t, J = 7.51 Hz, 2H CH ₂ CH _{2 (} COOH), 2.21 (s, 3H, CH ₃ ); MS m / z (relative intensity,%) 345 ([M + 1] +, 100).

Příklad 41Example 41

Sodná sůl 3-[2,4-dimethyl-5-(2-oxo-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-lH-pyrrol-3-yl]-propionové kyseliny3- [2,4-Dimethyl-5- (2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid, sodium salt

Suspenze 8 g 3-[2,4-dimethyl-5-(2-oxo-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl)-1 H-pyrrol-3-yl]-propionové kyseliny v 60 ml vody se přidá do 0,98 g hydroxidu sodného v 10 ml vody. Směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 30 minut a zfiltruje se. Filtrát se zmrazí a lyofilizuje se. Získá se 8 g požadované sloučeniny.A suspension of 8 g of 3- [2,4-dimethyl-5- (2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid in 60 ml of water is added to 0.98 g of sodium hydroxide in 10 ml of water. The mixture was stirred at room temperature for 30 minutes and filtered. The filtrate is frozen and lyophilized. 8 g of the desired compound are obtained.

Nebo jiným způsobem: suspenze 117g 318-005 ve 470 ml vody se přidá 16,47 g hydroxidu sodného v 74 ml vody. Směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 15 minut a zfiltruje se. Filtrát se přidá do 210 ml ethanolu a výsledný precipitát, který se utvoří se shromáždí podtlakovou filtrací. Po usušení se získá konečných 106 g požadované sloučeniny.Or in another way: a suspension of 117g 318-005 in 470 ml water is added 16.47 g sodium hydroxide in 74 ml water. The mixture was stirred at room temperature for 15 minutes and filtered. The filtrate was added to 210 ml of ethanol and the resulting precipitate which formed was collected by suction filtration. After drying, a final 106 g of the desired compound is obtained.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆): δ 13,34 (s, br, 1H, NH-1’), 10,82 (s, br, 1H, NH-1), 7,65 (d, J = 7,52 Hz, 1H, H-4), 7,5 (s, 1H, H-vinyl), 7,04 (t, J = 7,52 Hz, 1H, H-6), 6,93 (t, J = 7,52 Hz, 1H, H-5), 6,85 (d, J = 7,52 Hz, 1H, H-7), 2,55 (t, J = 6,95 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH), 2,28 (s, 3H, CH₃), 2,24 (s, 3H, CH₃) a 1,99 (t, J = 6,95 Hz, 2H, CH₂CH₂COOH).1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ): δ 13.34 (s, br, 1H, NH-1 '), 10.82 (s, br, 1 H, NH-1), 7.65 (d, J = 7.52Hz, 1H, H-4), 7.5 (s, 1H, H-vinyl), 7.04 (t, J = 7.52Hz, 1H, H-6), 6.93 (t, J = 7.52Hz, 1H, H-5), 6.85 (d, J = 7.52Hz, 1H, H-7), 2.55 (t, J = 6.95Hz, 2H, CH ₂ CH ₂ COOH), 2.28 (s, 3H, _CH3), 2.24 (s, 3H, _CH3) and 1.99 (t, J = 6.95 Hz, 2H, CH ₂ CH _{2 (} COOH).

Příklad 42Example 42

-[3,5-dimethy 1-4-(3 -morfolin-4-ylpropyl)-lH-pyrrol2ylmethylen]-l ,3-dihydroindol-2-on- [3,5-Dimethyl-4- (3-morpholin-4-ylpropyl) -1H-pyrrolylmethylene] -1,3-dihydroindol-2-one

Krok 1: Do suspenze 3-(2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-yl)propionové kyseliny (10 g, 60,8 mmol) v 60 ml dichlormethanu se přidá 1,1'-karbonyldiimidazol (11,6 g, 71,8 mmol) a následně morfolinStep 1: To a suspension of 3- (2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl) propionic acid (10 g, 60.8 mmol) in 60 mL of dichloromethane is added 1,1'-carbonyldiimidazole (11.6 g) , 71.8 mmol) followed by morpholine

99

99 9999 99

9 9 9 9 9 99 9 9 9 9

9 9 9 99

131 «99 9131 «99 8

9 9 9 9 99

99 9999 99 999 (5,5 ml, 60,8 mmol) a Ν,Ν-diizopropylethylamin (Hunigova báze, 10 ml, 60,8 mmol). Tmavočervená reakční směs se míchá při pokojové teplotě přes noc a přelije se do ledové vody. Organická vrstva se promývá solankou až do pH 6, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje se. Surový produkt se přečistí na koloně silikagelu mobilní fází dichlormethan-methanol (98: 2). Získá se 13,84 g (96 %) 3-(2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3-yl) -1 -mor folin-4-yl-propan -1 - on.99.9999 99.999 (5.5 mL, 60.8 mmol) and Ν, Ν-diisopropylethylamine (Hunig's base, 10 mL, 60.8 mmol). The dark red reaction mixture was stirred at room temperature overnight and poured into ice water. Wash the organic layer with brine until pH 6, dry over anhydrous sodium sulfate, and concentrate. The crude product was purified on a silica gel column eluting with dichloromethane-methanol (98: 2). 13.84 g (96%) of 3- (2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl) -1-morpholin-4-yl-propan-1-one are obtained.

Krok 2: Do suspenze L1AIH4 (2,67 g, 70 mmol) v tetrahydrofuranu (100 ml) se přidá po kapkách roztok 3-(2,4-dimethyl1 H-pyrrol-3-yl)-1-morfolin-4-yl-propan-1-onu (13,84 g, 59 mmol) v tetrahydrofuranu (50 ml). Reakční směs se míchá při 80°C po dobu 1 hodiny a zchladí se v ledové lázni. Do reakční směsi se pomalu přidává led dokud nepřestane unikat plyn. Přidá se pár kapek 2N hydroxidu sodného a reakční směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 30 minut. Poté se reakční směs extrahuje ethylacetátem, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje se. Získá se 10,37 g (79 %) 4-[3-(2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-yl)-propyl]-morfolinu jako světlehnědého oleje, který se použije bez dalšího čištění.Step 2: To a suspension of L1AlH4 (2.67 g, 70 mmol) in tetrahydrofuran (100 mL) was added dropwise a solution of 3- (2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl) -1-morpholin-4-yl -propan-1-one (13.84 g, 59 mmol) in tetrahydrofuran (50 mL). The reaction mixture was stirred at 80 ° C for 1 hour and cooled in an ice bath. Ice is slowly added to the reaction mixture until no more gas escapes. A few drops of 2N sodium hydroxide was added and the reaction mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. Then, the reaction mixture was extracted with ethyl acetate, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated. 10.37 g (79%) of 4- [3- (2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl) -propyl] -morpholine were obtained as a light brown oil which was used without further purification.

Krok 3: Do ledově studeného roztoku N,N-dimethylformamid (5,5 ml, 70 mmol) v dichlormethanu (30 ml) se po kapkách přidá oxychlorid fosforečný (6,5 ml, 70 mmol).Poté se reakční směs míchá při pokojové teplotě po dobu 15 minut. Následně se po kapkách při teplotě 0°C přidá roztok 3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH pyrrol-2-karboxaldehydu (10,37 g, 46,6 mmol) v dichlormethanu (20 ml). Finální reakční směs se refluxuje při 60°C po dobu 4 hodiny a zchladí se v ledové lázni. Do reakční směsi se pomalu přidává led a následně 2 N hydroxid sodný dokud pH nedosáhne hodnoty 12. Reakční směs se míchá při pokojové teplotě po dobu 30 minut a poté se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje solankou, suší se nad bezvodým síranem sodným a koncentruje se. Surový produkt se přečistí na koloně silikagelu mobilní fází dichlormethan methanol - hydroxid amonný (9,5: 0,5). Získá se 4,57 g (39 %) 3,5132Step 3: To an ice-cold solution of N, N-dimethylformamide (5.5 mL, 70 mmol) in dichloromethane (30 mL) was added dropwise phosphorus oxychloride (6.5 mL, 70 mmol). temperature for 15 minutes. A solution of 3,5-dimethyl-4- (3-morpholin-4-yl-propyl) -1H-pyrrole-2-carboxaldehyde (10.37 g, 46.6 mmol) in dichloromethane was then added dropwise at 0 ° C. (20 mL). The final reaction mixture was refluxed at 60 ° C for 4 hours and cooled in an ice bath. Ice was slowly added to the reaction mixture followed by 2 N sodium hydroxide until the pH reached 12. The reaction mixture was stirred at room temperature for 30 minutes and then extracted with ethyl acetate. The organic layer was washed with brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated. The crude product was purified on a silica gel column eluting with methanol: ammonium hydroxide (9.5: 0.5). 4.57 g (39%) of 3.5132 were obtained

dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH pyrrol-2-karbaldehydu jako tmavě červeného oleje:dimethyl-4- (3-morpholin-4-yl-propyl) -1H-pyrrole-2-carbaldehyde as a dark red oil:

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 11,34 (s, br, 1H, NH-1), 9,40 (s, 1H, CHO-2), 3,55 (t, J = 4,68 Hz, 4H, O(CH2CH₂)2NCH2CH₂CH2-4), 2,28-2,34 (m, 6H, O(CH2CH₂)2NCH₂CH₂CH₂-4), 2,21 (t, 2H, J = 7,10 Hz, 2H, O(CH₂CH2)2NCH2CH₂CH2-4) CH₃-3), 2,19 (s, 3H, CH₃-5), 2,14 (s, 3H, CH₃-3), 1,51 (kvintet, J = 7,10 Hz, 2H,1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 11.34 (s, br, 1H, NH-1), 9.40 (s, 1H, CHO-2), 3.55 (t, J = 4, 68 Hz, 4H, O (CH ₂ CH ₂ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4), 2.28-2.34 (m, 6H, O (CH ₂ CH ₂ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4), 2.21 (t, 2H, J = 7.10 Hz, 2H, O (CH ₂ CH 2) ₂ 2NCH2CH CH2-4) CH ₃ -3), 2.19 (s, 3H, _CH3 -5), 2.14 (s, 3H , CH ₃ -3), 1.51 (quintet, J = 7.10 Hz, 2H,

O(CH₂CH2)2NCH₂CH2CH2-4), MS m/z (relativní intenzita, %) 251 ([M+lf, 100).O (CH ₂ CH 2) 2 NCH ₂ CH2CH2-4), MS m / z (relative intensity,%) 251 ([M + lf, 100).

Krok 4: Směs 1,3-dihydroindol-2-onu (133 mg, 1,0 mmol), 3,5dimethyl-4-H-pyrrol-2-karboxaldehydu (250 mg, 1, 0 mmol) a 3 tří kapek pyrrolidinu ve 2,0 ml ethanol se refluxuje při 90°C po dobu 4 hodiny a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Precipitát se zfiltruje, promyje studeným ethanolem a hexanem a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 308,9 mg (85 %) 3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl) -1 H-pyrrol-2-ylmethylen]-1,3-dihydroindol-2-onu jako žluté pevné látky:Step 4: A mixture of 1,3-dihydroindol-2-one (133 mg, 1.0 mmol), 3,5-dimethyl-4-H-pyrrole-2-carboxaldehyde (250 mg, 1.0 mmol) and 3 drops of pyrrolidine in 2.0 mL ethanol was refluxed at 90 ° C for 4 hours and then cooled to room temperature. The precipitate was filtered, washed with cold ethanol and hexane and dried in a vacuum oven overnight. 308.9 mg (85%) of 3- [3,5-dimethyl-4- (3-morpholin-4-ylpropyl) -1H-pyrrol-2-ylmethylene] -1,3-dihydroindol-2-one is obtained. as yellow solids:

‘HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,37 (s, 1H, NH-1'), 10,71 (s, 1H, NH-1), 7,68 (d, J = 7,47 Hz, 1H, H-4), 7,53 (s, 1H, H-vinyl), 7,06 (dt, J = 7,47 Hz, 1H, H-6), 6,94 (dt, J = 7,74 Hz, 1H, H-5), 6,84 (d, J1 H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.37 (s, 1H, NH-1 '), 10.71 (s, 1H, NH-1), 7.68 (d, J = 7.47) Hz, 1H, H-4), 7.53 (s, 1H, H-vinyl), 7.06 (dt, J = 7.47Hz, 1H, H-6), 6.94 (dt, J = 7.74 Hz, 1H, H-5), 6.84 (d, J)

= 7,47 Hz, 1H, H-7), = 7.47 Hz, 1H, H-7), 3,55 3.55 (t, (t, J = 4,37 Hz, J = 4.37 Hz, 4H, 4H, O(CH2CH2)2NCH2CH₂CH2-4'),O (CH ₂ CH ₂ ) ₂ N CH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2,40 2.40 (t, (t, J = 7,31 Hz, J = 7.31 Hz, 2H, 2H, O(CH₂CH2)2NCH2CH₂CH2-4'),O (CH ₂ CH 2) ₂ 2NCH2CH CH2-4 '), 2,31 2.31 (t, (t, J = 4,37 Hz, J = 4.37 Hz, 4H, 4H, O(CH2CH2)2NCH2CH₂CH₂-4'),O (CH ₂ CH ₂ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2,28 (s, 2.28 (s, 3H, 3H, CH₃-3'), 2,23 (s, 3H,CH ₃ -3 '), 2.23 (s, 3H, ch₃-ch ₃ -

5'), 2,23 (t, J = 7,31 Hz, 2H, O(CH₂CH2)2NCH2CH2CH₂-4'), 1,56 (kvintet, J = 7,3 1 Hz, 2H, O(CH₂CH2)2NCH₂CH2CH2-4'), MS m/e (relativní intenzita, %) 365 (M⁺,100).5 '), 2.23 (t, J = 7.31 Hz, 2H, O (CH ₂ CH 2) 2NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4'), 1.56 (quintet, J = 7.3 1 Hz, 2H, O ( CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), MS m / e (relative intensity,%) 365 (M ⁺ , 100).

Příklad 43Example 43

5-brom-3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2yl methy len] -1,3-dihydroindol-2-on φ φ5-Bromo-3- [3,5-dimethyl-4- (3-morpholin-4-yl-propyl) -1H-pyrrol-2-ylmethylene] -1,3-dihydroindol-2-one

133133

Směs 5-brom-1,3-dihydroindol-2-onu (212 mg, 1,0 mmol), 3,5di methy 1-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2-karbaldehydu (250 mg, 1,0 mmol) a 3 kapek pyrrolidinu ve 2,0 ml ethanolu se refluxuje při 90°C po dobu 4 hodiny a poté se zchladí na pokojovou teplotu. Precipitát se zfiltruje, promyje se studeným ethanolem a hexanem a suší se ve vakuové peci přes noc. Získá se 399,8 mg (90 %) 5-brom-3[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2-ylmethylen]1,3-dihydroindol-2-onu jako červené pevné látky:A mixture of 5-bromo-1,3-dihydroindol-2-one (212 mg, 1.0 mmol), 3,5di methyl-4- (3-morpholin-4-yl-propyl) -1H-pyrrol-2- of carbaldehyde (250 mg, 1.0 mmol) and 3 drops of pyrrolidine in 2.0 mL of ethanol were refluxed at 90 ° C for 4 hours and then cooled to room temperature. The precipitate was filtered, washed with cold ethanol and hexane and dried in a vacuum oven overnight. 399.8 mg (90%) of 5-bromo-3- [3,5-dimethyl-4- (3-morpholin-4-yl-propyl) -1H-pyrrol-2-ylmethylene] 1,3-dihydroindole- 2-one as red solids:

1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 13,43 (s, IH, NH-1'), 10,81 (s, IH, NH-1), 7,99 (d, J = 2,07 Hz, IH, H-4), 7,66 (s, IH, Hvinyl), 7,18 (dd, J = 2,07, 7,58 Hz, IH, H-6), 6,79 (d, J - 7,58 Hz, IH, H-7), 3,55 (t, J = 4,39 Hz, 4H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,40 (t, J = 7,32 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,31 (t, J = 4,39 Hz, 4H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 2,29 (s, 3H, CH3-3'), 2,26 (s, 3H, CH3-5'), 2,23 (t, J = 7,32 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), 1,56 (kvintet, J = 7,32 Hz, 2H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'),1 H NMR (300 MHz, DMSO-d 6) δ 13.43 (s, 1H, NH-1 '), 10.81 (s, 1H, NH-1), 7.99 (d, J = 2.07 Hz, 1H, H-4), 7.66 (s, 1H, vinyl), 7.18 (dd, J = 2.07, 7.58 Hz, IH, H-6), 6.79 (d, J- 7.58 Hz, 1H, H-7), 3.55 (t, J = 4.39 Hz, 4H, O (CH 2 CH 2) 2 NCH 2 CH 2 CH 2 -4 '), 2.40 (t, J = 7.32 Hz, 2H, O (CH2CH2) 2NCH2CH2CH2-4 '), 2.31 (t, J = 4.39 Hz, 4H, O (CH2CH2) 2NCH2CH2CH2-4 '), 2.29 (s, 3H, CH3-3 ') 2.26 (s, 3H, CH 3 -5 '), 2.23 (t, J = 7.32 Hz, 2H, O (CH 2 CH 2) 2 NCH 2 CH 2 CH 2 -4'), 1.56 (quintet, J = 7, 32 Hz, 2H, O (CH 2 CH 2) 2 NCH 2 CH 2 CH 2 -4 '),

MS m/e (relativní intenzita, %) 443 (M+, 100), 445 ([M+2] ⁺ ,MS m / e (relative intensity,%) 443 (M +, 100), 445 ([M + 2] ⁺ ,

100).100).

Příklad 44Example 44

3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2yl methy len]-6-fenyl-1,3-dihydroindol-2-on3- [3,5-dimethyl-4- (3-morpholin-4-yl-propyl) -1H-pyrrol-2-ylmethylene] -6-phenyl-1,3-dihydroindol-2-one

Postupem z Příkladu 2 se získá 88 % výtěžek požadované sloučeniny jako žluté pevné látky:Following the procedure of Example 2, 88% yield of the title compound was obtained as a yellow solid:

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13, 37 (s, IH, NH-1'), 10,81 (s, IH, NH-1), 7,77 (d, J = 8,20 Hz, IH, H-4), 7,62 (d, J = 7,39 Hz, 2H, H-2, 6), 7,58 (s, IH, H-vinyl), 7,44 (t, J = 7,39 Hz, 2H, H-3, 5),1 H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.37 (s, 1H, NH-1 '), 10.81 (s, 1H, NH-1), 7.77 (d, J = 8.20) Hz, 1H, H-4), 7.62 (d, J = 7.39 Hz, 2H, H-2.6), 7.58 (s, 1H, H-vinyl), 7.44 (t, J = 7.39 Hz, 2H, H-3,5)

7,32 (t, br, J = 7,39 Hz, IH, H-4), 7,26 (dd, J = 1,49, 8,29 Ηζ,ΙΗ, H5), 7,09 (d, J = 1,49 Hz, IH, H-7), 3,56 (t, J = 4,48 Hz, 4H, O(CH2CH2)2NCH2CH₂CH2-4'), 2,41 (t, J = 7,18 Hz, 2H,7.32 (t, br, J = 7.39 Hz, 1H, H-4), 7.26 (dd, J = 1.49, 8.29 .delta., H5), 7.09 (d, J = 1.49 Hz, IH, H-7), 3.56 (t, J = 4.48 Hz, 4H, O (CH2CH2) ₂ 2NCH2CH CH2-4 '), 2.41 (t, J = 7 18 Hz 2H

O(CH₂CH2)2NCH2CH₂CH2-4'), 2,31 (t, J = 4,48 Hz, 4H,O (CH ₂ CH 2) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.31 (t, J = 4.48 Hz, 4H,

O(CH₂CH2)2NCH₂CH₂CH2-4'), 2,29 (s, 3H, CH₃-3'), 2,26 (s, 3H, CH₃134O (CH ₂ CH 2) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.29 (s, 3H, CH ₃ -3'), 2.26 (s, 3H, CH ₃ 134)

5’), 2,24 (t, J = 7,18 Hz, 2H, CKCHzCH^NCíhCHzCH^'), 1,56 (kvintet, J = 7,18 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH2CH₂-4'),5 '), 2.24 (t, J = 7.18 Hz, 2H, ^ CKCHzCH NCíhCHzCH ^'), 1.56 (quintet, J = 7.18 Hz, 2H, O (CH ₂ CH _{2) 2} NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '),

MS m/e (relativní intenzita, %) 441 (M⁺, 100).MS m / e (relative intensity,%) 441 (M ^& lt ^{; +} &^gt;, 100).

Příklad 44Example 44

3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2ylmethylen]-6-fenyl -1,3-dihydro indol-2-on3- [3,5-dimethyl-4- (3-morpholin-4-yl-propyl) -1H-pyrrol-2-ylmethylene] -6-phenyl-1,3-dihydro-indol-2-one

Postupem z Příkladu 2 se získá 88 % výtěžek požadované sloučeniny jako žluté pevné látky:Following the procedure of Example 2, 88% yield of the title compound was obtained as a yellow solid:

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13, 37 (s, 1H, NH-1'), 10,81 (s, 1H, NH-1), 7,77 (d, J = 8,20 Hz, 1H, H-4), 7,62 (d, J = 7,39 Hz, 2H, H-2, 6), 7,58 (s, 1H, H-vinyl), 7,44 (t, J = 7,39 Hz, 2H, H-3, 5),1 H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.37 (s, 1H, NH-1 '), 10.81 (s, 1H, NH-1), 7.77 (d, J = 8.20) Hz, 1H, H-4), 7.62 (d, J = 7.39 Hz, 2H, H-2.6), 7.58 (s, 1H, H-vinyl), 7.44 (t, J = 7.39 Hz, 2H, H-3,5)

7,32 (t, br, J = 7,39 Hz, 1H, H-4), 7,26 (dd, J = 1,49, 8,29 Ηζ,ΙΗ, H5), 7,09 (d, J = 1,49 Hz, 1H, H-7), 3,56 (t, J = 4,48 Hz, 4H, O(CH_₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,41 (t, J = 7,18 Hz, 2H,7.32 (t, br. J = 7.39 Hz, 1H, H-4), 7.26 (dd, J = 1.49, 8.29 .delta., H5), 7.09 (d, J = 1.49 Hz, 1H, H-7), 3.56 (t, J = 4.48 Hz, 4H, O (CH- ₂ CH ₂ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 41 (t, J = 7.18Hz, 2H)

O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH2-4'), 2,31 (t, J = 4,48 Hz, 4H,O (CH ₂ CH ₂ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.31 (t, J = 4.48 Hz, 4H,

O(CH₂CH2)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,29 (s, 3H, CH₃-3'), 2,26 (s, 3H, CH₃5'), 2,24 (t, J = 7,18 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 1,56 (kvintet, J = 7,18 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'),O (CH ₂ CH 2) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.29 (s, 3H, CH ₃ -3'), 2.26 (s, 3H, CH ₃ 5 '), 2.24 (t, J = 7.18 Hz, 2H, O (CH ₂ CH ₂ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 1.56 (quintet, J = 7.18 Hz, 2H, O (CH ₂₎ CH ₂ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '),

MS m/e (relativní intenzita, %) 441 (M⁺, 100).MS m / e (relative intensity,%) 441 (M ^& lt ^{; +} &^gt;, 100).

Příklad 45Example 45

3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2ylmethylen]-6-(2-metoxyfenyl) -1,3-dihydroindol-2-on3- [3,5-dimethyl-4- (3-morpholin-4-yl-propyl) -1H-pyrrol-2-ylmethylene] -6- (2-methoxyphenyl) -1,3-dihydroindol-2-one

Postupem z Příkladu 2 se získá 86 % výtěžek požadované sloučeniny jako žluté pevné látky:Following the procedure of Example 2, 86% yield of the title compound was obtained as a yellow solid:

‘HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,37 (s, 1H, NH-1'), 10,72 (s, 1H, NH-1), 7,71 (d, J = 7,79 Hz, 1H, H-4), 7,55 (s, 1H, H-vinyl), 7,27-7,34 (m, 2H), 6,98-7,10 (m, 4H), 3,76(s, 3H, OCH₃-2), 3,56 (t, J = 4,50 Hz, 4H, O(CH2CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,41 (t, J = 7,12 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,21-2,31 (m, 6H,1 H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.37 (s, 1H, NH-1 '), 10.72 (s, 1H, NH-1), 7.71 (d, J = 7.79) Hz, 1H, H-4), 7.55 (s, 1H, H-vinyl), 7.27-7.34 (m, 2H), 6.98-7.10 (m, 4H), 3, 76 (s, 3H, OCH ₃ -2), 3.56 (t, J = 4.50 Hz, 4H, O (CH ₂ CH ₂ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.41 (t, J = 7.12 Hz, 2H, O (CH ₂ CH _{2) 2} NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.21-2.31 (m, 6H,

135135

0· ····0 · ····

O(CH₂CH2)2NCH₂CH2CH2-4'), 2,29 (s, 3H, CH₃-3'), 2,25 (s, 3H, CH₃5'), 1,57 (kvintet, J = 7,12 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH2CH2-4'),O (CH ₂ CH 2) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.29 (s, 3H, CH ₃ -3'), 2.25 (s, 3H, CH ₃ 5 '), 1.57 (quintet, J = 7.12 Hz, 2H, O (CH ₂ CH ₂ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '),

MS m/e (relativní intenzita, %) 471 (M⁺, 100).MS m / e (relative intensity,%) 471 (M ^& lt ^{; +} &^gt;, 100).

Příklad 46Example 46

3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2ylmethylen]-6-(3-metoxyfenyl)-1,3-di hydro indol-2-on3- [3,5-dimethyl-4- (3-morpholin-4-yl-propyl) -1H-pyrrol-2-ylmethylene] -6- (3-methoxyphenyl) -1,3-dihydro-indol-2-one

Postupem z Příkladu 2 se získá 87% výtěžek požadované sloučeniny jako žluté pevné látky:Following the procedure of Example 2, 87% yield of the title compound was obtained as a yellow solid:

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13, 38 (s, ÍH, NH-1'), 10,80 (s, ÍH, NH-1), 7,76 (d, J = 7,93 Hz, ÍH, H-4), 7,57 (s, ÍH, H-vinyl), 7,35 (t, J = 8,08 Hz, ÍH, H-5), 7,26 (dd, J = 1,73, 7,93 Ηζ,ΙΗ, H-5), 7,18 ( d, br, J = 8,08 Hz, ÍH, H-4), 7,13 ( d, br, J = 1,94 Hz, ÍH, H-2), 7,08 (d, J = 1,73 Hz, ÍH, H-7), 6,90 (dd, J = 1,94, 8,08 Hz, ÍH, H-6),1 H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.38 (s, 1H, NH-1 '), 10.80 (s, 1H, NH-1), 7.76 (d, J = 7.93) Hz, 1H, H-4), 7.57 (s, 1H, H-vinyl), 7.35 (t, J = 8.08 Hz, 1H, H-5), 7.26 (dd, J = 1.73, 7.93 Ηζ, ΙΗ, H-5), 7.18 (d, br, J = 8.08 Hz, 1H, H-4), 7.13 (d, br, J = 1, 94 Hz, 1H, H-2), 7.08 (d, J = 1.73 Hz, 1H, H-7), 6.90 (dd, J = 1.94, 8.08 Hz, 1H, H -6),

3,81 (s, 3H, OCH₃-3),3.81 (s, 3H, OCH ₃ -3) 3,56 3.56 (t, (t, J = 4,38 J = 4.38 Hz, Hz, 4H, 4H, O(CH2CH2)2NCH2CH2CH2-4'), O (CH2CH2) 2NCH2CH2CH2-4 '), 2,41 2.41 (t, (t, J = 7,19 J = 7.19 Hz, Hz, 2H, 2H, O(CH2CH2)2NCH₂CH2CH2-4'),O (CH ₂ CH ₂ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2,31 2.31 (t, (t, J = 4,38 J = 4.38 Hz, Hz, 4H, 4H, O(CH2CH2)2NCH2CH₂CH₂-4'),O (CH ₂ CH ₂ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2,29 (s, 2.29 (s, 3H, 3H, CH₃-3'), 2,26 (s,CH ₃ -3 '), 2.26 (s, 3H, 3H, CH₃-CH ₃ -

5’), 2,24 (t, J = 7,19 Hz, 2H, O(CH₂CH2)2NCH2CH₂CH2-4'), 1,56 (kvintet, J = 7,19 Hz, 2H, CXC^C^hNCHsCjhC^^'),5 '), 2.24 (t, J = 7.19 Hz, 2H, O (CH ₂ CH 2) 2NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4'), 1.56 (quintet, J = 7.19 Hz, 2H, CXCl ₂ ); C ^ hNCH5CjhC ^^ '),

MS m/e (relativní intenzita, %) 471 (M⁺, 100).MS m / e (relative intensity,%) 471 (M ^& lt ^{; +} &^gt;, 100).

Příklad 47Example 47

3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-yl-propyl)-lH-pyrrol-2ylmethylen]-6-(4-methoxyfenyl)-l,3-dihydroindol-2-on3- [3,5-dimethyl-4- (3-morpholin-4-yl-propyl) -1H-pyrrol-2-ylmethylene] -6- (4-methoxyphenyl) -1,3-dihydroindol-2-one

Postupem z Příkladu 2 se získá 52 % výtěžek požadované sloučeniny jako žluté pevné látky:Following the procedure of Example 2, 52% yield of the title compound was obtained as a yellow solid:

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,35 (s, ÍH, NH-1’), 10,77 (s, ÍH, NH-1), 7,72 (d, J = 7,97 Hz, ÍH, H-4), 7,55 (d, J = 8,57 Hz, 2H, H-2, 6), 7,54 (s, ÍH, H-vinyl), 7,20 (dd, J = 1,35, 7,97 Hz, ÍH, H-5), 7,04 (d, J = 1,35 Hz, ÍH, H-7), 6,99 (d, J = 8,57 Hz, ÍH, H-3, 5), « ·1 H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.35 (s, 1H, NH-1 '), 10.77 (s, 1H, NH-1), 7.72 (d, J = 7.97) Hz, 1H, H-4), 7.55 (d, J = 8.57 Hz, 2H, H-2,6), 7.54 (s, 1H, H-vinyl), 7.20 (dd, J = 1.35, 7.97 Hz, 1H, H-5), 7.04 (d, J = 1.35 Hz, 1H, H-7), 6.99 (d, J = 8.57 Hz) , E, H-3, 5), «·

136 136 • · Φ « · · • · Φ «· · • • · • • · • · • • · • ··♦· ··· ··· · ··· *· ··♦· ·· * · ·· ♦ · ·· 3,78 (s, 3H, OCH₃-4), 3,553.78 (s, 3H, _OCH3 -4), 3.55 (t, (t, J = 4,57 J = 4.57 Hz, Hz, 4H, 4H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,40O (CH ₂ CH ₂ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.40 (t, (t, J = 6,97 J = 6.97 Hz, Hz, 2H, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH2-4'), 2,30O (CH ₂ CH ₂ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.30 (t, (t, J = 4,57 J = 4.57 Hz, Hz, 4H, 4H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4’), 2,28 (s,O (CH ₂ CH ₂ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.28 (s, 3H, 3H, CH₃-3'), 2,24 (s,CH ₃ -3 '), 2.24 (s, 3H, 3H, ch₃-ch ₃ - 5'), 2,23 (t, J = 6,97 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4’),5 '), 2.23 (t, J = 6.97 Hz, 2H, O (CH ₂ CH ₂ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4'), 1,55 1.55

(kvintet, J = 6,97 Hz, 2H, O(CH₂CH₂)₂NCH₂CH₂CH₂-4’),(quintet, J = 6.97 Hz, 2H, O (CH ₂ CH _{2) 2} NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '),

MS m/e (relativní intenzita, %) 471 (M⁺, 100).MS m / e (relative intensity,%) 471 (M ^& lt ^{; +} &^gt;, 100).

Příklad 48Example 48

3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol2ylmethylen]-1,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrolylmethylene] -1,3-dihydroindol-2-one

Podle kroků 1,2, a 3 z Příkladu lse získá 63 % výtěžek 4-(3di methylaminopropy 1)-3,5-dimethyl -1 H-pyrrol-2-karboxaldehydu jako tmavěčerveného oleje:Following steps 1,2, and 3 of Example 1, a 63% yield of 4- (3di methylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrole-2-carboxaldehyde was obtained as a dark red oil:

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 11,33 (s, br, 1H, NH-1), 9,40 (s, 1H, CHO-2), 2,30 (t, J - 7,42 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH2-4), 2,18 (s, 3H, CH₃-3), 2,15 (t, J = 7,42 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH2CH₂CH₂-4), 2,14 (s, 3H, CH₃-5), 2,10 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4), 1,47 (kvintet, J = 7,42 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH2CH₂-4),1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 11.33 (s, br, 1H, NH-1), 9.40 (s, 1H, CHO-2), 2.30 (t, J = 7, 42 Hz, 2H, (CH _{3) 2} NCH ₂ CH ₂ CH2-4), 2.18 (s, 3H, _CH3 -3), 2.15 (t, J = 7.42 Hz, 2H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4), 2.14 (s, 3H, CH ₃ -5), 2.10 (s, 6H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4), 1, 47 (quintet, J = 7.42 Hz, 2H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4),

MS m/z (relativní intenzita, %) 208 ([M+l]⁺, 100).MS m / z (relative intensity,%) 208 ([M + 1] ⁺ , 100).

Podle kroku 4 z Příkladu 1 se získá 52 % výtěžek požadované sloučeniny jako žluté pevné látky:According to Step 4 of Example 1, a 52% yield of the title compound is obtained as a yellow solid:

'HNMR (360 MHz, DMSO-d_ó) δ 13,38 (s, 1H, NH-1'), 10,70 (s, 1H, NH-1), 7,68 (d, J = 7,54 Hz, 1H, H-4), 7,53 (s, 1H, H- vinyl), 7,06 (t, J = 7,54 Hz, 1H, H-6), 6,94 (t, J = 7,54 Hz, 1H, H-5), 6,85 (d, J = 7,54 Hz, 1H, H-7), 2,38 (t, J = 7,25 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH2-4'), 2,27 (s, 3H, CH₃-3'), 2,23 (s, 3H, CH₃-5'), 2,17 (t, J = 7,25 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,11 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH2-4'), 1,52 (chint, J = 7,25 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH2CH₂-4’),1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.38 (s, 1H, NH-1 '), 10.70 (s, 1H, NH-1), 7.68 (d, J = 7.54) Hz, 1H, H-4), 7.53 (s, 1H, H-vinyl), 7.06 (t, J = 7.54Hz, 1H, H-6), 6.94 (t, J = 7.54 Hz, 1H, H-5), 6.85 (d, J = 7.54 Hz, 1H, H-7), 2.38 (t, J = 7.25 Hz, 2H, (CH3 _{) 12} NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.27 (s, 3H, CH ₃ -3'), 2.23 (s, 3H, CH ₃ -5 '), 2.17 (t, J = 7.25 Hz, 2H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.11 (s, 6H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4'), 1.52 ( quint, J = 7.25 Hz, 2H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '),

MS m/z (relativní intenzita, %) 323 (M⁺, 100),MS m / z (relative intensity,%) 323 (M ^& lt ^{; +} &^gt;, 100),

137 ·· · ·· ·♦ ·« • · · · · · · · · · · • · · 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9137 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 9999 999999 999 99

Příklad 49Example 49

5-brom-3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2yl methy len] -1,3-dihydroindol-2-on5-Bromo-3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -1,3-dihydroindol-2-one

Postupem z Příkladu 2 se získá 71% výtěžek požadované sloučeniny jako červené pevné látky:Following the procedure of Example 2, a 71% yield of the title compound was obtained as a red solid:

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,42 (s, 1H, NH-1'), 10,81 (s, 1H, NH-1), 7,98 (d, J = 1,89 Hz, 1H, H-4), 7,66 (s, 1H, Hvinyl), 7,17 (dd, J - 1,89, 8,23 Hz, 1H, H-6), 6,79 (d, J = 8,23 Hz, 1H, H-7), 2,38 (t, J = 7,23 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH2- 4'), 2,27 (s, 3H, CH₃-3'), 2,25 (s, 3H, CH₃-5'), 2,16 (t, J - 7,23 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH2CH₂CH₂4'), 2,10 (s, 6H, (CH3)₂NCH₂CH₂CH₂- 4'), 1,51 (kvintet, J = 7,23 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH2CH₂-4’),1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.42 (s, 1H, NH-1 '), 10.81 (s, 1H, NH-1), 7.98 (d, J = 1.89) Hz, 1H, H-4), 7.66 (s, 1H, vinyl), 7.17 (dd, J = 1.89, 8.23 Hz, 1H, H-6), 6.79 (d, J = 8.23 Hz, 1H, H-7), 2.38 (t, J = 7.23 Hz, 2H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.27 (s, 3H, CH ₃ -3 '), 2.25 (s, 3H, CH ₃ -5'), 2.16 (t, J = 7.23 Hz, 2H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ ') ), 2.10 (s, 6H, (CH 3) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ - 4 '), 1.51 (quintet, J = 7.23 Hz, 2H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ - 4 '),

MS m/z (relativní intenzita, %) 401 ([M-l] ⁺ , 100) a 403 ([M+l]⁺,MS m / z (relative intensity,%) 401 ([MI] ^+, 100) and 403 ([M + l] ^+,

100).100).

Příklad 50Example 50

3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl -1 H-pyrrol-2ylmethylen]-6-fenyl -1,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -6-phenyl-1,3-dihydroindol-2-one

Postupem z Příkladu 2 se získá 83 % výtěžek požadované sloučeniny jako oranžové pevné látky:Following the procedure of Example 2, 83% yield of the title compound was obtained as an orange solid:

'HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,38 (s, 1H, NH-1'), 10,81 (s, 1H, NH-1), 7,77 (d, J = 7,82 Hz, 1H, H-4), 7,62 (d, J = 7,59 Hz, 2H, H-2, 6), 7,58 (s, 1H, H-vinyl), 7,44 (t, J = 7,59 Hz, 2H, H-3, 5),1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.38 (s, 1H, NH-1 '), 10.81 (s, 1H, NH-1), 7.77 (d, J = 7.82) Hz, 1H, H-4), 7.62 (d, J = 7.59 Hz, 2H, H-2.6), 7.58 (s, 1H, H-vinyl), 7.44 (t, J = 7.59 Hz, 2H, H-3,5),

7,32 (t, J - 7,59 Hz, 1H, H-4), 7,27 (dd, J = 1,11, 7,82 Hz, 1H, H-5), 7,09 (d, J = 1,11 Hz, 1H, H-7), 2,39 (t, J - 7,18 Hz, 2H, (CH₂)₂NCH₂CH₂CH2-4'), 2,29 (s, 3H, CH₃-3'), 2,25 (s, 3H, CH₃-5’), 2,17 (t, J = 7,18 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH2CH₂CH₂- 4’), 2,11 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 1,53 (kvintet, J = 7,18 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH2CH₂-4),7.32 (t, J = 7.59 Hz, 1H, H-4), 7.27 (dd, J = 1.11, 7.82 Hz, 1H, H-5), 7.09 (d, J = 1.11 Hz, 1H, H-7), 2.39 (t, J - 7.18 Hz, 2H, (CH _{2) 2} NCH ₂ CH ₂ CH2-4 '), 2.29 (s, 3H, CH ₃ -3 '), 2.25 (s, 3H, CH ₃ -5'), 2.17 (t, J = 7.18 Hz, 2H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ - 4 2.11 (s, 6H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 1.53 (quintet, J = 7.18 Hz, 2H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH) ₂ -4),

MS m/z (relativní intenzita, %) 399 (M⁺, 100).MS m / z (relative intensity,%) 399 (M ^& lt ^{; +} &^gt;, 100).

• ·• ·

138138

Příklad 51Example 51

3-[4-(3-di methy laminopr opy 1)-3,5-dimethyl - 1 H-pyrrol-2yl methylen] -6-(2-methoxy feny 1)-1,3 -dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -6- (2-methoxyphenyl) -1,3-dihydroindol-2-one

Postupem z Příkladu 2 se získá 83 % výtěžek požadované sloučeniny jako žluté pevné látky:Following the procedure of Example 2, 83% yield of the title compound was obtained as a yellow solid:

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,38 (s, 1H, NH-1'), 10,72 (s, 1H, NH-1), 7,70 (d, J = 8,06 Hz, 1H, H-4), 7,55 (s, 1H, Hvinyl), 7,287,36 (m, 2H, H-4, 5), 7,14 (d, J = 8,32 Hz, 1H, H-6), 7,04 (dd, J = 1,21, 8,06 Hz, 1H, H-5), 6,99 (d, J = 7,42 Hz, 1H, H-3), 6,99 (d, J = 1,21 Hz, 1H, H-7) 3,76 (s, 3H, OCH₃-2), 2,39 (t, J = 7,24 Hz, 2H, (CH3)₂NCH₂CH₂CH2-4'), 2,28 (s, 3H, CH₃-3'), 2,25 (s, 3H, CH₃-5'), 2,18 (t, J = 7,24 Hz, 2H, (CH3)₂NCH2CH₂CH₂-4'), 2,11 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 1,53 (kvintet, J = 7,24 Hz, 2H, (CH3)₂NCH₂CH2CH₂-4'),1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.38 (s, 1H, NH-1 '), 10.72 (s, 1H, NH-1), 7.70 (d, J = 8.06) Hz, 1H, H-4), 7.55 (s, 1H, H-vinyl), 7.287.36 (m, 2H, H-4, 5), 7.14 (d, J = 8.32 Hz, 1H, H-6), 7.04 (dd, J = 1.21, 8.06 Hz, 1H, H-5), 6.99 (d, J = 7.42 Hz, 1H, H-3), 6 99 (d, J = 1.21 Hz, 1H, H-7), 3.76 (s, 3H, OCH ₃ -2), 2.39 (t, J = 7.24 Hz, 2H, (CH3) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.28 (s, 3H, CH ₃ -3'), 2.25 (s, 3H, CH ₃ -5 '), 2.18 (t, J = 7 24 Hz, 2H, (CH 3) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.11 (s, 6H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4'), 1.53 (quintet, J = 7.24 Hz, 2H, (CH 3) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '),

MS m/z (relativní intenzita, %) 429 (M⁺, 100).MS m / z (relative intensity,%) 429 (M ^& lt ^{; +} &^gt;, 100).

Příklad 52Example 52

3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2y Imethy len]-6-(3-methoxy fenyl) -1,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylethylene] -6- (3-methoxyphenyl) -1,3-dihydroindol-2-one

Postupem z Příkladu 2 se získá 83 % výtěžek požadované sloučeniny jako červené pevné látky:Following the procedure of Example 2, 83% yield of the title compound was obtained as a red solid:

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d_ó) δ 13,38 (s, 1H, NH-1’), 10,80 (s, 1H, NH-1), 7,60 (d, J = 8,06 Hz, 1H, H-4), 7,57 (s, 1H, H- vinyl), 7,35 (t, J - 8, 15 Hz, 1H, H-5), 7,26 (dd, J = 1,39, 8,06 Hz, 1H, H-5), 7,19 (d, br, J = 8,15 Hz, H-6), 7,13 (m, 1H, H-2), 7,09 (d, J = 1,39 Hz, 1H, H-7), 6,90 (dd, J = 2,57, 8,15 Hz, 1H, H-4), 3,81 (s, 3H, OCH₃3), 2,39 (t, J = 7,17 Hz, 2H, (CH3)₂NCH₂CH₂CH2-4'), 2,29 (s, 3H, CH₃-3’), 2,25 (s, 3H, CH₃-5'), 2,17 (t, J = 7,17 Hz, 2H, (CH3)₂NCH2CH₂CH₂-4'), 2,11 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 1,53 (kvintet, J = 7,17 Hz, 2H, (CH₃)2NCH₂CH2CH₂-4'),1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.38 (s, 1H, NH-1 '), 10.80 (s, 1H, NH-1), 7.60 (d, J = 8.06) Hz, 1H, H-4), 7.57 (s, 1H, H-vinyl), 7.35 (t, J = 8, 15 Hz, 1H, H-5), 7.26 (dd, J = 1.39, 8.06 Hz, 1H, H-5), 7.19 (d, br, J = 8.15 Hz, H-6), 7.13 (m, 1H, H-2), 7 10.09 (d, J = 1.39 Hz, 1H, H-7), 6.90 (dd, J = 2.57, 8.15 Hz, 1H, H-4), 3.81 (s, 3H) OCH _{3 (} 3), 2.39 (t, J = 7.17 Hz, 2H, (CH 3) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.29 (s, 3H, CH ₃ -3'), 2.25 (s, 3H, CH ₃ -5 '), 2.17 (t, J = 7.17 Hz, 2H, (CH 3) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4'), 2.11 (s, 6H _{(CH3) 2} NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 1.53 (quintet, J = 7.17 Hz, 2H, (CH ₃₎ 2 NCH ₂ CH 2 CH ₂ -4'),

MS m/z (relativní intenzita, %) 429 (M⁺, 100).MS m / z (relative intensity,%) 429 (M ^& lt ^{; +} &^gt;, 100).

4 44 4

44

44

4 ·4 ·

139 ·· ·φ • · ♦ · • ♦ ♦ · · *139 ·· · φ · · ♦ · · * · · *

4 44 4

44 444444 4444

Příklad 53Example 53

3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2y lmethy len]-6-(4-methoxy feny 1)-1,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -6- (4-methoxyphenyl) -1,3-dihydroindol-2-one

Postupem z Příkladu 2 se získá 83 % výtěžek požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky:Following the procedure of Example 2, 83% yield of the title compound was obtained as a brown solid:

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d6) δ 13,35 (s, ÍH, NH-1'), 10,77 (s, ÍH, NH-1), 7,73 (d, J = 7,82 Hz, ÍH, H-4), 7,56 (d, J = 8,83 Hz, 2H, H-2, 6), 7,54 (s, ÍH, H-vinyl), 7,20 (dd, J = 1,64, 7,82 Hz, ÍH, H-5), 7,04 (d, J = 1,64 Hz, H-7), 7,00 (d, J = 8,83 Hz, 2H, H-3, 5), 3,78 (s, 3H, OCH₃-4), 2,39 (t, J = 7,24 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH2-4'), 2, 28 (s, 3H, CH₃-3'), 2,25 (s, 3H, CH₃-5'), 2,17 (t, J = 7,24 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH2CH₂CH₂-4'), 2,11 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4) 1,52 (kvintet, J = 7,24 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH2-4')1 H NMR (360 MHz, DMSO-d 6) δ 13.35 (s, 1H, NH-1 '), 10.77 (s, 1H, NH-1), 7.73 (d, J = 7.82 Hz) 1 H, H-4), 7.56 (d, J = 8.83 Hz, 2H, H-2,6), 7.54 (s, 1H, H-vinyl), 7.20 (dd, J = 1.64, 7.82 Hz, 1H, H-5), 7.04 (d, J = 1.64 Hz, H-7), 7.00 (d, J = 8.83 Hz, 2H, 3 H-5), 3.78 (s, 3H, _OCH3 -4), 2.39 (t, J = 7.24 Hz, 2H, (CH _{3) 2} NCH ₂ CH ₂ CH2-4 ') 2.22 (s, 3H, CH ₃ -3 '), 2.25 (s, 3H, CH ₃ -5'), 2.17 (t, J = 7.24 Hz, 2H, (CH ₃ )) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.11 (s, 6H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4) 1.52 (quintet, J = 7.24 Hz, 2H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH _{2 -} 4 ')

MS m/z (relativní intenzita, %) 429 (M+, 100),MS m / z (relative intensity,%) 429 (M &lt; + &gt;, 100),

Příklad 54Example 54

5- chlor-3-[4-(3-dimethylaminopropy 1)-3,5-dimethyl -1 Hpyrrol-2y lmethy len] -1,3-dihydroindol-2-on5-Chloro-3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1 H -pyrrol-2-ylmethyl] -1,3-dihydroindol-2-one

Postupem z Příkladu 2 se získá 53 % výtěžek požadované sloučeniny jako hnědé pevné látky:Following the procedure of Example 2, a 53% yield of the title compound was obtained as a brown solid:

‘HNMR (360 MHz, DMSO-d₆) δ 13,43 (s, ÍH, NH-1'), 10,84 (s, ÍH, NH-1), 7,87 (d, J = 1,85 Hz, ÍH, H-4), 7,66 (s, ÍH, H-vinyl), 7,05 (dd, J = 1,85, 8,15 Hz, ÍH, H-6), 6,83 (d, J = 8,15 Hz, ÍH, H-7), 2,362,45 (m, 4H, (CH₃)₂NCH2CH₂CH2-4'), 2,30 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,28 (s, 3H, CH₃-3’), 2,26 (s, 3H,CH₃-5'), 1,58 (kvintet, J = 7,52 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH2CH₂-4'),1 H NMR (360 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.43 (s, 1H, NH-1 '), 10.84 (s, 1H, NH-1), 7.87 (d, J = 1.85) Hz, 1H, H-4), 7.66 (s, 1H, H-vinyl), 7.05 (dd, J = 1.85, 8.15 Hz, 1H, H-6), 6.83 ( d, J = 8.15 Hz, Ih H-7), 2362.45 (m, 4H, (CH _{3) 2} NCH 2 ₂ CH2-4 '), 2.30 (s, 6H, (CH _{3) 2} NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.28 (s, 3H, CH ₃ -3'), 2.26 (s, 3H, CH ₃ -5 '), 1.58 (quintet, J = 7 , 52 Hz, 2H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '),

MS m/z (relativní intenzita, %) 357 ( [M-l]⁺, 100).MS m / z (relative intensity,%) 357 ([M] ⁺ , 100).

Příklad 55Example 55

6- chlor-3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl- lH-pyrrol-2y lmethy len] -1,3-dihydroindol-2-on ·· ·· 9«6-chloro-3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -1,3-dihydroindol-2-one

9 9 9 · · · • 9 9 · ·9 9 9 · · · 9 9 · ·

140 • 9 9 9 9140 • 9 9 9 9

9 · ·« 9 99 · · «9

Postupem z Příkladu 2 se získá 77 % výtěžek požadované sloučeniny:Following the procedure of Example 2, a 77% yield of the desired compound is obtained:

MS El 357 [M-l] ⁺ .MS EI 357 [M ⁺ ] ⁺ .

Příklad 56Example 56

3-[4-(3-dimethy laminopropy 1)-3,5-dimethyl- 1H-pyrro 1-2ylmethylen]-5-methoxy-1,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylamino-propyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrro-2-ylmethylene] -5-methoxy-1,3-dihydroindol-2-one

Postupem z Příkladu 2 se získá 77 % výtěžek požadované sloučeniny:Following the procedure of Example 2, a 77% yield of the desired compound is obtained:

MS El 353 [M] ⁺ .MS EI 353 [M] ⁺ .

Příklad 57Example 57

3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2ylme thyl en]-6-me thoxy-1,3-d i hydro indol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -6-methoxy-1,3-dihydro-indol-2-one

Postupem z Příkladu 2 se získá 74 % výtěžek požadované sloučeniny.Following the procedure of Example 2, 74% yield of the title compound was obtained.

Příklad 58Example 58

- [4-(3-dimethy laminopropy l)-3,5-dimethyl-lH-pyrr o 1-2ylmethylen]-5-methyl-l,3-dihydroindol-2-on- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrolo-2-ylmethylene] -5-methyl-1,3-dihydroindol-2-one

Postupem z Příkladu 2 se získá 45 % výtěžek požadované sloučeniny :Following the procedure of Example 2, a 45% yield of the desired compound is obtained:

MS El 337 [M] ⁺ .MS EI 337 [M] ⁺ .

Příklad 59Example 59

3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2yl methy len] -4-methyl -1,3-d i hydro indol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -4-methyl-1,3-dihydro-indol-2-one

Postupem z Příkladu 2 se získá 99 % výtěžek požadované sloučeniny:Following the procedure of Example 2, 99% yield of the desired compound was obtained:

·· ·» ·· • · · · · « ♦ · · * ·· »· · · · · ·

141 • · ···· 'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,45 (s, br, 1H, NH), 10,78 (s, br, 1H, NH), 7,50 (s, 1H, H-vinyl), 6,98 (t, J = 8,1 Hz, 1H, H-6), 6,76 (t, J = 8,1 Hz, 2H, H-5 & H-7), 2,88 (m, 2H, CH₂), 2,64 (s, 6H, 2xCH₃), 2,56 (s, 3H, CH₃), 2, 43 (t, J = 7,4 Hz, 2H, CH₂), 2,29 (s, 3H, CH₃), 2, 19 (s, 3H, CH₃), 1,65-1,75 (m, 2H, CH₂),141 · H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.45 (s, br, 1H, NH), 10.78 (s, br, 1H, NH), 7.50 (s , 1H, H-vinyl), 6.98 (t, J = 8.1Hz, 1H, H-6), 6.76 (t, J = 8.1Hz, 2H, H-5 & H-7) ), 2.88 (m, 2H, _CH2), 2.64 (s, 6H, 2xCH _3), 2.56 (s, 3H, CH _3), 2. 43 (t, J = 7.4 Hz , 2H, CH _2), 2.29 (s, 3H, CH _3), 2. 19 (s, 3H, CH _3), 1.65-1.75 (m, 2H, _CH2);

MS El 337 [M] ⁺ .MS EI 337 [M] ⁺ .

Příklad 60Example 60

3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2y lmethy len]-4-(2-hydroxy-ethyl) -1,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -4- (2-hydroxyethyl) -1,3-dihydroindol-2-one

Postupem z Příkladu 2 se získá 98 % výtěžek požadované sloučeniny.Following the procedure of Example 2, 98% yield of the title compound was obtained.

Příklad 61Example 61

Amid 3-[4-(3-dimethy laminopropy 1)-3,5-dimethyl -1 H-pyrrol-2y lmethy len]-2-oxo-2,3 -dihy dro-1 H-indol-5 -sul fonové kyseliny3- [4- (3-Dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -2-oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-sulfonic amide acid

Postupem z Příkladu 2 se získá 59 % výtěžek požadované sloučeniny :Following the procedure of Example 2, a 59% yield of the desired compound was obtained:

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,41 (s, 1H, NH-1'), 11,12 (s, 1H, NH-1), 8,16 (d, J = 1,78 Hz, 1H, H-4), 7,66 (s, 1H, H-vinyl), 7,55 (dd, J = 1,78, 8,18 Hz, 1H, H-6), 7,11 (s, br, 2H, H^NSO^), 6,98 (d, J = 8,18 Hz, 1H, H-7), 2,47-2,50 (m, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH2-4’), 2,41 (t, J = 7,37 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,36 (s, 6H, (CH₃)₂NCH₂CH₂CH₂-4'), 2,30 (s, 3H, CH₃-3'), 2,28 (s, 3H, CH₃-5'), 1,61 (kvintet, J = 7, 37 Hz, 2H, (CH₃)₂NCH₂CH2CH₂-4').1 H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.41 (s, 1H, NH-1 '), 11.12 (s, 1H, NH-1), 8.16 (d, J = 1.78) Hz, 1H, H-4), 7.66 (s, 1H, H-vinyl), 7.55 (dd, J = 1.78, 8.18 Hz, 1H, H-6), 7.11 ( s, br, 2H, H ^ ^ NSO), 6.98 (d, J = 8.18 Hz, 1H, H-7), 2.47-2.50 (m, 2H, (CH _{3) 2} NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.41 (t, J = 7.37 Hz, 2H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4'), 2.36 (s, 6H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 '), 2.30 (s, 3H, CH ₃ -3'), 2.28 (s, 3H, CH ₃ -5 '), 1.61 (quintet, J = 7.37 Hz, 2H, (CH ₃ ) ₂ NCH ₂ CH ₂ CH ₂ -4 ').

Příklad 62Example 62

Izopropylamid 3 - [ 4 - (3 - dimethylaminopropyl) -3,5dimethyl- 1H - pyrrol - 2 - ylmethylen]-2-oxo-2,3-dihydro-lH-indol5-sulfonové kyseliny3- [4- (3-Dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -2-oxo-2,3-dihydro-1H-indole-5-sulfonic acid isopropylamide

142 ·· · ·» ·· ·· • · ·· «*·· · · · ♦ · · · · · • · · · · · · ···· ··· ·» ···» ··142 · »* * * *

Postupem z Příkladu 2 se získá 64 % výtěžek požadované sloučeniny:Following the procedure of Example 2, 64% yield of the desired compound was obtained:

MS El 444 [M]⁺·MS El 444 [M] ⁺

Příklad 63Example 63

3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl - lH-pyrrol-2yl methylen]-5-(morfolin-4-sulfonyl)-l ,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -5- (morpholine-4-sulfonyl) -1,3-dihydroindol-2-one

Postupem z Příkladu 2 se získá 90 % výtěžek požadované sloučeniny,Following the procedure of Example 2, a 90% yield of the title compound is obtained,

MS El 472 [M] ⁺ .MS EI 472 [M] ⁺ .

Příklad 64Example 64

Diethylamid 3- [4- (3- dimethylaminopropyl)- 3,5- dimethyl- 1Hpyrrol- 2- ylmethylen]-2-oxo-2,3-dihydro-lH-indol-5-sulfonové kyseliny3- [4- (3-Dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -2-oxo-2,3-dihydro-1H-indole-5-sulfonic acid diethylamide

Postupem z Příkladu 2 se získá 92 % výtěžek požadované sloučeniny:Following the procedure of Example 2, 92% yield of the desired compound was obtained:

'HNMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 13,5 (s, br, 1H, NH), 12,21 (s, br, 1H, NH), 8,18 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H-4), 7,84 (s, 1H, H-vinyl), 7,44 (dd, J = 1,8,8,4 Hz, 1H, H-6), 7,05 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-7), 2,59 (s, 6H, 2xCH₃), 2,59-2,64 (m, 2H, CH₂), 2,44 (s, 6H, 2xCH₃), 2,38-2,44 (m, 2H, CH₂), 2,31 (s, 6H, 2xCH₃), 1,59-1,69 (m, 2H, CH₂),1 H NMR (300 MHz, DMSO-d ₆ ) δ 13.5 (s, br, 1H, NH), 12.21 (s, br, 1H, NH), 8.18 (d, J = 1.8 Hz) 1H, H-4), 7.84 (s, 1H, H-vinyl), 7.44 (dd, J = 1.8.8.4 Hz, 1H, H-6), 7.05 (d , J = 8.4 Hz, 1H, H-7), 2.59 (s, 6H, 2xCH _3), 2.59-2.64 (m, 2H, _CH2), 2.44 (s, 6H , 2 x CH _3), 2.38-2.44 (m, 2H, _CH2), 2.31 (s, 6H, 2xCH _3), 1.59-1.69 (m, 2H, _CH2);

MS El 430 [M] ⁺ .MS EI 430 [M] ⁺ .

7. Biologické hodnocení7. Biological evaluation

Přínosem tohoto vynálezu je dosažení spektra biologické aktivity kterékoli dané série sloučenin. Ve svých současných výhodných provedeních se tento vynález vztahuje na nové pyrol substituující 2indolinony vykazující schopnost modulovat aktivitu RTK, CTK a STK. Následující testy jsou použity pro výběr těch sloučenin, které vykazují optimální stupeň požadované aktivity.It is a benefit of the invention to achieve a spectrum of biological activity for any given series of compounds. In its presently preferred embodiments, the present invention relates to a novel pyrrole-substituted 2-indolinone having the ability to modulate RTK, CTK and STK activity. The following assays are used to select those compounds that exhibit the optimal degree of activity desired.

φ φ · • · • · • · φφ ·φ · · · · · φ ·

143 ·· ·« » • · ·· • · • φ • φ φφφφ φφφ »· φφ e « · φ • · φ *φφ φφφ φφ φ·φ·143 ·· · »· · · • · · φ · φ · φ · φ · φ ·

A. Postupy testůA. Test Procedures

Následující in vitro testy lze použít ke stanovení úrovně aktivity a účinku různých sloučenin tohoto vynálezu na jednu nebo více proteinkináz. Podobné testy mohou být podobným způsobem použity pro jakékoli proteinkinázy s použitím technik, které jsou pracovníkům v oboru dobře známé.The following in vitro assays can be used to determine the level of activity and effect of various compounds of the invention on one or more protein kinases. Similar assays can be used in a similar manner for any protein kinases using techniques well known to those skilled in the art.

Zde popsaný buněčný/katalytický test je proveden na formátu ELISA testu. Obecný postup je následující: sloučenina se vpraví do buňky exprimující testovanou kinázu, ať již přirozeně, nebo v důsledku rekombinace, po určitou zvolenou dobu, po které, je-li testovanou kinázou receptor, se přidá ligand známý pro aktivaci tohoto receptorů. Buňky se lyžují a lyzát je přenesen do jamek ELISA destičky, která byla nejdřív povlečena specifickou protilátkou rozpoznávající substrát této enzymatické fosforylační reakce. Bezsubstrátové složky buněčného lyzátu jsou odmyty a množství fosforylace substrátu je určeno pomocí protilátky specificky rozpoznávající fosfotyrosin v porovnání s kontrolními buňkami, které nepřišly do styku s testovanou sloučeninou. Zde popsaný buněčný/biologický test měří množství DNA vytvořené jako odpověď na aktivaci testované kinázy, která je obecně mírou proliferační odpovědi. Obecný postup tohoto testu je následující: sloučenina je vpravena do buněk exprimujících testovanou kinázu, ať již přirozeně, nebo v důsledku rekombinace, na vybrané časové období, po kterém, je-li testovaná kináza receptorem, je přidán ligand známý pro aktivaci tohoto receptorů. Po inkubaci nejméně přes noc je přidáno činidlo pro značení DNA, jako bromdeoxyuridin (BrdU) nebo 3H-thymidin. Množství značené DNA se určí buď protilátkou proti BrdU nebo měřením radioaktivity v porovnáni s kontrolními buňkami, které nepřišly do kontaktu s testovanou sloučeninou.The cellular / catalytic assay described herein is performed using an ELISA assay format. The general procedure is as follows: the compound is introduced into a cell expressing the test kinase, either naturally or as a result of recombination, for a selected period of time, during which, if the test kinase is a receptor, a ligand known to activate this receptor is added. The cells are lysed and the lysate is transferred to the wells of an ELISA plate that has been first coated with a specific antibody recognizing the substrate of this enzymatic phosphorylation reaction. The lossless components of the cell lysate are washed off and the amount of phosphorylation of the substrate is determined by an antibody specifically recognizing phosphotyrosine as compared to control cells that did not come into contact with the test compound. The cellular / biological assay described herein measures the amount of DNA generated in response to activation of a test kinase, which is generally a measure of a proliferative response. The general procedure for this assay is as follows: the compound is introduced into cells expressing the test kinase, either naturally or as a result of recombination, for a selected period of time after which, when the test kinase is a receptor, a ligand known to activate this receptor is added. After incubation at least overnight, a DNA labeling agent such as bromodeoxyuridine (BrdU) or 3H-thymidine is added. The amount of labeled DNA is determined by either an anti-BrdU antibody or by measuring radioactivity compared to control cells that have not come into contact with the test compound.

• ·• ·

144144

Buněčné/katalytické testyCell / catalytic tests

K detekci a měření přítomnosti aktivity PK lze použít ELISA test (Enzyme linked immunosorbent assay). ELISA se provede podle známých protokolů, které jsou popsány např. v Voliér, et. al., 1980, Enzyme- Linked Immunosorbent Assay, v: Manual of Clinical Immunology, 2.vyd., editované Rose a Friedmanem, str. 359-371 Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C.An Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) can be used to detect and measure the presence of PK activity. The ELISA is performed according to known protocols as described, for example, in Aviary, et. al., 1980, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, in: Manual of Clinical Immunology, 2nd Ed., edited by Rose and Friedman, pp. 359-371 Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C.

Uvedený protokol může být upraven pro určení aktivity s ohledem na specifickou PK. To jest, výhodný protokol pro provedení ELISA experimentů pro specifické protein kinázy je uveden níže. Nicméně úpravy těchto protokolů pro určení aktivity sloučeniny ostatních členů rodiny RTK, stejně tak jako pro CTK a STK, jsou pracovníkům v oboru dobře známy.Said protocol may be adapted to determine activity with respect to a specific PK. That is, a preferred protocol for performing ELISA experiments for specific protein kinases is given below. However, modifications of these protocols to determine the activity of a compound of other RTK family members as well as for CTK and STK are well known to those skilled in the art.

Test FLK-1FLK-1 test

Provede se ELISA test pro měření kinázové aktivity receptorů FLK-1 a specifičtěji inhibice nebo aktivace tyrosinkinázové aktivity receptorů FLK-1. Specificky může být následující test proveden pro měření kinázové aktivity receptorů FLK-1 v buňkách geneticky upravených pro expresi Flk-1.An ELISA assay is performed to measure the FLK-1 receptor kinase activity and more specifically the inhibition or activation of the FLK-1 receptor tyrosine kinase activity. Specifically, the following assay may be performed to measure the kinase activity of FLK-1 receptors in cells genetically engineered to express Flk-1.

Látky a činidla.Substances and reagents.

a. 96ti-jamkové ELISA destičky Corning (Corning Katalog ě. 25805-96),Corning 96-well ELISA plates (Corning Catalog No. 25805-96),

b. Cappelovo kozí proti králičí IgG (katalog, ě. 55641),b. Cappel's goat anti-rabbit IgG (Catalog No. 55641);

c. PBS (Gibco katalog, č. 450-1300EB),c. PBS (Gibco Catalog, No. 450-1300EB),

d. TBSW pufr (50 mM Tris (pH 7,2), 150 mM NaCl a 0,1 % Tween-20).d. TBSW buffer (50 mM Tris (pH 7.2), 150 mM NaCl and 0.1% Tween-20).

e. Zásobní ethanolamin (10 - ethanolamin (pH 7,0), skladovaný při 4°C, ·e. Stock ethanolamine (10-ethanolamine (pH 7.0), stored at 4 ° C);

145145

99 • · t *99 • t *

• 9• 9

9 99 9

99999999

9 99 9

9 99 9

f. HNTG pufr (20 mM HEPES pufr (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,2 % Triton X-100 a 10 % glycerol),f. HNTG buffer (20 mM HEPES buffer (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.2% Triton X-100 and 10% glycerol),

g. EDTA (0,5 M (pH 7,0) jako zásobní 100X),g. EDTA (0.5 M (pH 7.0) as 100X stock),

h. Ortovanadičnan sodný (0,5 M jako zásobní 100X),h. Sodium orthovanadate (0.5 M as stock 100X);

i. Pyrofosfát sodný (0,2 M jako zásobní 100X),i. Sodium pyrophosphate (0.2 M stock 100X);

j. Polypropylénové 96ti-jamkové destičky NUNC se dnem ve tvaru V (Applied Scientific Catalog. č. AS-72092),j. NUNC V-bottom polypropylene 96-well plates (Applied Scientific Catalog # AS-72092)

k. Buňky NIH3T3 C7#3 (buňky exprimující FLK-1),NIH3T3 C7 # 3 cells (cells expressing FLK-1)

l. DMEM s IX vysokým glukózo L-glutaminem (katalog, č. 1 1965-050),l. DMEM with IX high glucose L-glutamine (catalog, No. 1 1965-050),

m. FBS, Gibco (katalog č. 16000-028),m. FBS, Gibco (Catalog No. 16000-028),

n. L-glutamin, Gibco (katalog, č. 25030-016),n. L-glutamine, Gibco (Catalog No. 25030-016)

o. VEGF, PeproTech, lne. (katalog, č. 100-20) (uchovávaný jako 1 pg/100 μΐ zásobní roztok v Milli-Q dH₂O a skladovaný přiVEGF, PeproTech, Inc. (catalog no. 100-20) (stored as 1 pg / 100 μΐ stock in Milli-Q dH ₂ O and stored at

-20°C),-20 ° C)

p. Afinitně purifikované anti-FLK-1 antisérum,p. Affinity purified anti-FLK-1 antiserum,

q. UB40 monoklonální protilátka proti fosfotyrosinu (viz Fendley, et. al., 1990, Cancer Research 50:1550-1558),q. UB40 monoclonal antibody against phosphotyrosine (see Fendley, et. Al., 1990, Cancer Research 50: 1550-1558),

r. EIA stupeň kozí proti králičí IgG-POD (BioRad katalog, č. 1721011),r. EIA grade goat against rabbit IgG-POD (BioRad catalog, No. 1721011),

s. Roztok 2,2-azino-bis(3-ethylbenz-thiazolin-6-kyseliny sulfonové (ABTS) (100 mM kyselina citrónová (bezvodá), 250 mM Na₂HPC>4 (pH 4,0), 0,5 mg/ml ABTS (Sigma katalog, č. A1888), roztok se až do použití uchovává v temnu při 4°C,Solution of 2,2-azino-bis (3-ethylbenz-thiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (100 mM citric acid (anhydrous), 250 mM Na ₂ HPC> 4 (pH 4.0), 0.5 mg / ml ABTS (Sigma Catalog # A1888), stored in the dark at 4 ° C until use,

t. H₂O₂ (30 % roztok) (Fischer katalog, č. H325),t. H ₂ O ₂ (30% solution) (Fischer catalog no. H325),

u. ABTS/ H₂O₂ (15 ml roztoku ABTS, 2 μΐ H₂O₂) připravené 5 minut před použitím a ponecháno při pokojové teplotě,u. ABTS / H ₂ O ₂ (15 ml ABTS solution, 2 μΐ H ₂ O ₂ ) prepared 5 minutes before use and kept at room temperature,

v. 0,2 M zásoba HCI v H₂O,v. 0,2 M stock of HCl in H ₂ O,

w. dimetylsulfoxid (100 %) (Sigma katalog, č. D-8418) aw. dimethylsulfoxide (100%) (Sigma Catalog No. D-8418) a

x. Trypsin-EDTA (Gibco BRL katalog, č. 25200-049).x. Trypsin-EDTA (Gibco BRL Catalog # 25200-049).

146146

ProtokolProtocol

1. Corningovy 96ti-jamkové ELISA destičky se povlečou s 1,0 pg Cappelova protikráličiho IgG antiséra v 0,1 M Na₂CO₃ pH 9,6 v každé jamce. Povlečené destičky se uchovají přes noc při 4°C. Jsou-li destičky skladovány při teplotě 4°C, mohou být uchovávány až dva týdny.1. Corning 96-well ELISA plates are coated with 1.0 µg Cappel anti-rabbit IgG antiserum in 0.1 M Na ₂ CO ₃ pH 9.6 in each well. The coated plates are stored overnight at 4 ° C. If stored at 4 ° C, the plates may be stored for up to two weeks.

2. Buňky se pěstují v růstovém médiu (DMEM, doplněný 2,0 mM Lglutaminem, 10 % FBS) ve vhodných kultivačních miskách až do souvislého pokrytí při 37°C, v 5 % CO₂.2. Cells are grown in growth medium (DMEM, supplemented with 2.0 mM Lglutamine, 10% FBS) in suitable culture dishes until continuous coverage at 37 ° C, 5% CO ₂ .

3. Buňky se sklidí trypsinizací a vysejou do 96ti-jamkových Corningových 25850 polystyrénových destiček s kulatým dnem v množství 25 000 buněk/jamka ve 200 pL růstového média.3. Cells are harvested by trypsinization and seeded into 96-well Corning 25850 round bottom polystyrene plates at 25,000 cells / well in 200 µL growth medium.

4. Buňky se pěstují alespoň jeden den při teplotě 37°C, 5 % CO₂.4. Cells are grown for at least one day at 37 ° C, 5% CO ₂ .

5. Buňky se omyjí IX D-PBS.5. Wash cells with 1X D-PBS.

6. Do každé jamky se přidá 200 pl hladového média (DMEM, 2,0 mM L-glutamin, 0,1 % FBS). Inkubuje se přes noc při 37°C v 5 % CO₂.6. Add 200 µl of fasted medium (DMEM, 2.0 mM L-glutamine, 0.1% FBS) to each well. Incubate overnight at 37 ° C in 5% CO ₂ .

7. Sloučeniny se naředí 1:20 na 96ti-jamkové polypropylenové destičce s použitím hladového média. Pro použití na kontrolní buňky se naředí dimethylsulfoxid 1:20.7. Compounds are diluted 1:20 in a 96-well polypropylene plate using hungry medium. For use on control cells, dilute dimethylsulfoxide 1:20.

8. Z kultivačních 96ti-jamkovýh destiček s buňkami se odstraní hladové médium a do každé jamky se přidá 162 pl čerstvého hladového média.8. Remove the starvation medium from 96-well cell culture plates and add 162 µl of fresh starvation medium to each well.

9. Do každé jamky se přidá 18 pl ředění sloučeniny ředěné 1:20 (z kroku 7) a ředění 1:20 dimethylsulfoxidu ke kontrolním buňkám (+/VEGF), pro konečné ředění 1:2000 po stimulaci buněk. Konečná koncentrace dimethylsulfoxidu je 0,5 %. Destička se inkubuje při 37°C v 5 % CO₂ po dobu dvou hodin.9. Add 18 µl of 1:20 dilution of compound (from step 7) and 1:20 dilution of dimethyl sulfoxide to control cells (+ / VEGF) to each well, for a final dilution of 1: 2000 after stimulation of the cells. The final dimethyl sulfoxide concentration is 0.5%. The plate is incubated at 37 ° C in 5% CO ₂ for two hours.

10. Nenavázaná protilátka se s ELISA destiček odstraní jejich převrácením, aby tekutina vytekla. Destičky se třikrát omyjí TBSW + 0,5 % ethanolamin, pH 7,0. Přebytečná tekutina a bubliny se odstraní vytřepáním destičky na papírový ručník.10. Unbound antibody is removed from the ELISA plates by inverting them to allow fluid to flow. Plates are washed three times with TBSW + 0.5% ethanolamine, pH 7.0. Excess liquid and bubbles are removed by shaking the plate on a paper towel.

• 4 ··· • 4• 4 ··· • 3

147147

11. Destičky se blokují TBSW + 0,5 % ethanolamin, pH 7,0 v množství 150 μΐ na každou jamku. Destička se inkubuje třicet minut za stálého třepání na třepačce pro mikrotitrační destičky.11. Block plates with TBSW + 0.5% ethanolamine, pH 7.0 at 150 μΐ per well. The plate is incubated for 30 minutes with shaking on a microplate shaker.

12. Destičky se třikrát omyjí postupem popsaným v kroku 10.12. Wash plates three times as described in step 10.

13. Do každé jamky se přidá 0,5 μΐ afinitně purifikovaného anti-FLU-1 polyklonálního králičího antiséra. Každá jamka se doplní do konečného objemu 150 μΐ TBSW + 0,5 % ethanolamin pH 7,0. Destička se inkubuje třicet minut za stálého třepání.13. Add 0.5 μΐ of affinity purified anti-FLU-1 polyclonal rabbit antiserum to each well. Add each well to a final volume of 150 μΐ TBSW + 0.5% ethanolamine pH 7.0. The plate is incubated for 30 minutes with shaking.

14. K buňkám se přidá 180 μΐ hladového média a buňky se stimulují 20 μΐ/jamka 10,0 mM ortovanadičnanem sodným a 500 ng/ml VEGF (čímž se dosáhne konečné koncentrace 1,0 mM orthovanadičnanu sodného a 50 ng/ml VEGF v každé jamce) po dobu 8 minut při 37°C, 5 % CO2. Jamky s negativní kontrolou obdrží pouze hladové médium.14. Add 180 μΐ of fasted medium to the cells and stimulate the cells with 20 μΐ / well of 10.0 mM sodium orthovanadate and 500 ng / ml VEGF (resulting in a final concentration of 1.0 mM sodium orthovanadate and 50 ng / ml VEGF in each). well) for 8 minutes at 37 ° C, 5% CO 2. Negative control wells receive only fasted medium.

15. Po osmi minutách se médium s buněk odstraní a destička se jednou omyje 200 μΐ/jamka PBS.15. After eight minutes, the cell medium is removed and the plate is washed once with 200 μΐ / well PBS.

16. Buňky se lyžují v 150 μΐ/jamka HNTG za stálého třepání při pokojové teplotě po dobu pěti minut. HNTG formulace zahrnuje orthovanadičnan sodný, pyrofosfát sodný a EDTA.16. Cells are lysed at 150 μΐ / well HNTG with constant shaking at room temperature for five minutes. The HNTG formulation includes sodium orthovanadate, sodium pyrophosphate and EDTA.

17. ELISA destička se třikrát omyje způsobem popsaným v kroku 10.17. Wash the ELISA plate three times as described in step 10.

18. Buněčný lyzát se s kultivační destičky přenese na ELISA destičku a inkubuje se za stálého třepání dvě hodiny. Pro přenesení buněčného lyzátu se při seškrabování jamek vypouští a nasává obsah pipety.18. Transfer the cell lysate from the culture plate to an ELISA plate and incubate with shaking for two hours. To transfer the cell lysate, scrape the wells and drain the contents of the pipette.

19. Destička se třikrát omyje způsobem popsaným v kroku 10.19. Wash plate three times as described in step 10.

20. ELISA destička se inkubuje s 0,02 pg/jamka UB40 v TBSW + 0,5 % ethanolamin. Jamky se doplní do končeného objemu 150 μΐ/jamka. Inkubuje se za stálého třepání 30 minut.20. The ELISA plate is incubated with 0.02 µg / well UB40 in TBSW + 0.5% ethanolamine. Fill the wells to a final volume of 150 μΐ / well. Incubate with shaking for 30 minutes.

21. Destička se třikrát omyje způsobem popsaným v kroku 10.21. Wash plate three times as described in step 10.

22. ELISA destička se inkubuje s 1 : 10 000 ředěným EIA kozím antimyším IgG konjugovaným křenovou peroxidázou v TBSW + 0,5 % ethanolamin, pH 7,0. Doplní se do konečného objemu 150 μΐ/jamka. Inkubuje se za stálého třepání třicet minut.22. The ELISA plate is incubated with 1: 10,000 diluted EIA goat anti-mouse IgG conjugated horseradish peroxidase in TBSW + 0.5% ethanolamine, pH 7.0. Make up to a final volume of 150 μΐ / well. Incubate with shaking for thirty minutes.

23. Destička se třikrát omyje způsobem popsaným v kroku 10.23. Wash the plate three times as described in step 10.

148 »··· ··» ·» ···· ** *148 »··· ··»

24. Do každé jamky se přidá 100 μΐ ABTS/H2O2. Inkubuje se deset minut za stálého třepání.24. Add 100 μΐ ABTS / H2O2 to each well. Incubate for 10 minutes with constant shaking.

25. Přidá se 100 μΐ 0,2 M HCI do konečné koncentrace 0,1 M HCI, aby se zastavil vývoj barevné reakce. Třepe se 1 minutu při pokojové teplotě. Bubliny se odstraní slabým proudem vzduchu a ELISA destička se odečte na mikrofotometru pro ELISA mikrotitrační destičky při 410 nm.25. Add 100 μΐ 0.2 M HCl to a final concentration of 0.1 M HCl to stop color development. Shake for 1 minute at room temperature. Remove the bubbles with a weak air stream and read the ELISA plate on an ELISA microplate at 410 nm.

Test na EGF receptor - HER2 chimérický receptor v celých buňkáchEGF Receptor Assay - HER2 chimeric receptor in whole cells

Kinázová aktivita HER2 v celých buňkách EGFR-NIH3T3 se měří následujícím způsobem:HER2 kinase activity in whole EGFR-NIH3T3 cells is measured as follows:

Látky a činidlaSubstances and reagents

a. EGF: zásobní koncentrace: 16,5 ILM, EGF 201, TOYBO, Co. Ltd. Japan.EGF: stock concentration: 16.5 ILM, EGF 201, TOYBO, Co. Ltd. Japan.

b. 05-101 (UBI) (monoklonální protilátka rozpoznávající extracelulární doménu EGFR).b. 05-101 (UBI) (monoclonal antibody recognizing the extracellular domain of EGFR).

c. Protilátka proti fosfotyrosinu (anti-Ptyr) (polyklonální) (viz Fendley, et al., supra).c. Anti-phosphotyrosine (anti-Ptyr) antibody (polyclonal) (see Fendley, et al., supra).

d. Detekční protilátka: kozí protikráliěí IgG konjugovaný křenovou peroxidázou, TÁGO, lne., Burlingame, CA.d. Detection antibody: Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG, TAGO, Inc., Burlingame, CA.

e. TBST pufr:e. TBST buffer:

Tris-HCl, pH 7,2 50 mM NaCl 150 mMTris-HCl, pH 7.2 50 mM NaCl 150 mM

Triton X-100 0,1Triton X-100 0.1

f. HNTG 5X zásobníf. HNTG 5X Stock

HEPES 0,1 MHEPES 0.1 M

NaCl 0,75 MNaCl 0.75 M

Glycerol 50 %Glycerol 50%

Triton X-100Triton X-100

1,0 %1.0%

149 • »149 • »

g. ABTS zásobní:g. ABTS stock:

Kyselina citrónová Na₂HPO₄ HCI, koncentr. ABTS*Citric acid Na ₂ HPO ₄ HCl, conc. ABTS *

100 mM100 mM

250 mM 0,5 mM 0,5 mg/ml * (2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazolinsulfonová kyselina)250 mM 0.5 mM 0.5 mg / ml * (2,2'-azinobis (3-ethylbenzthiazolinesulfonic acid))

h. Zásobní roztoky:h. Stock solutions:

EDTA 100 mM pH 7,0 Na₃VO₄ 0,5 M Na₄(P₂O₇) 0,2 MEDTA 100 mM pH 7.0 Na ₃ VO ₄ 0.5 M Na ₄ (P ₂ O ₇ ) 0.2 M

PostupMethod

Předpovlečení ELISA destičkyELISA pads

1. ELISA destičky (Corning, 96ti-jamkové, katalog. #25805-96) se povlečou protilátkou 05-101 v množství 0,5 pg na jamku v PBS, konečný objem 100 pl/jamka a uskladní se přes noc při teplotě 4°C. Povlečené destičky jsou k použitelné až 10 dnů, jsou-li skladovány při teplotě 4°C.1. ELISA plates (Corning, 96-well, catalog # 25805-96) were coated with 0.5-1 µg per well in PBS, final volume 100 µl / well and stored overnight at 4 ° C. The coated plates can be used for up to 10 days when stored at 4 ° C.

2. V den použití se odstraní povlékací pufr a nahradí se 100 pl blokovacího pufru (5 % Carnation instantní odtučněné sušené mléko v PBS). Destička se inkubuje a třepe při pokojové teplotě (kolem 23°C až 25°C) po dobu 30 minut. Těsně před použitím se odstraní blokovací pufr a destička se čtyřikrát omyje TBST pufrem.2. On the day of use, the coating buffer is removed and replaced with 100 µl blocking buffer (5% Carnation Instant Skimmed Powdered Milk in PBS). The plate is incubated and shaken at room temperature (about 23 ° C to 25 ° C) for 30 minutes. Just prior to use, the blocking buffer is removed and the plate is washed four times with TBST buffer.

Vysévání buněkSowing cells

1. Pro tento test může být použita buněčná linie NIH3T3 se zvýšenou expresí chimérického receptorů obsahujícího EGFR extracelulární doménu a intracelulární kinázovou doménu HER2.1. An NIH3T3 overexpressed chimeric receptor cell line comprising the EGFR extracellular domain and the intracellular kinase domain of HER2 may be used for this assay.

• ·• ·

Φ «Φ «

150150

2. Pro experiment se vyberou misky s 80-90 % souvislým pokryvem. Buňky se trypsinizují a reakce se zastaví přidáním 10 % fetálního hovězího séra. Buňky se suspendují v DMEM médiu (10 % CS DMEM médium) a centrifugují se jednou při 1500 rpm při pokojové teplotě po dobu 5 minut.2. Plates with 80-90% continuous coverage are selected for the experiment. Cells are trypsinized and the reaction is stopped by adding 10% fetal bovine serum. Cells are suspended in DMEM medium (10% CS DMEM medium) and centrifuged once at 1500 rpm at room temperature for 5 minutes.

3. Buňky se resuspendují ve vysévacím médiu (DMEM, 0,5 % hovězí sérum) a spočítají použitím trypanové modři. Přijatelná je životnost přes 90 %. Buňky se vysejí v DMEM médiu (0,5 % hovězí sérum) v hustotě 10 000 buněk na jamku, 100 μΐ na jamku na 96ti-jamkové mikrotitrační destičce. Vyseté buňky se inkubují v 5 % CO2 při 37°C po dobu přibližně 40 hodin.3. Resuspend cells in seed medium (DMEM, 0.5% bovine serum) and count using trypan blue. A service life of over 90% is acceptable. Cells are seeded in DMEM medium (0.5% bovine serum) at a density of 10,000 cells per well, 100 μΐ per well in a 96-well microtiter plate. The seeded cells are incubated in 5% CO 2 at 37 ° C for approximately 40 hours.

Postupy testuTest procedures

1. Vyseté buňky se zkontrolují, zdali nejsou kontaminovány, pod invertovaným mikroskopem. Zásobní léčivo (10 mg/ml v DMSO) se naředí DMEM médiem 1 : 10, pak se přenese 5 μΐ do jamky TBST do konečného ředění léčiva 1 : 200 a konečné koncentrace DMSO 1 %. Kontrolní jamky obdrží pouze DMSO. Inkubuje se dvě hodiny v 5 % CO₂ při 37°C.1. Sown cells are checked for contamination under an inverted microscope. The stock drug (10 mg / ml in DMSO) is diluted 1: 10 with DMEM medium, then transferred 5 μΐ into the TBST well to a final drug dilution of 1: 200 and a final DMSO concentration of 1%. Control wells only receive DMSO. Incubate for two hours in 5% CO ₂ at 37 ° C.

2. Připraví se EGF ligand: zásobní EGF v DMEM se naředí tak, aby se při přenosu 10 μΐ ředěného EGF (ředění 1:12) dosáhlo konečné koncentrace 100 nM.2. Prepare EGF Ligand: Dilute EGF stock in DMEM to achieve a final concentration of 100 nM with 10 μΐ diluted EGF (1:12 dilution).

3. Připraví se čerstvé HNTG* v množství dostatečném na 100 μΐ do každé jamky a umístí se na led.3. Prepare fresh HNTG * sufficient to 100 μΐ per well and place on ice.

HNTG* (10 ml): zásobní HNTG Milli-Q H2OHNTG * (10 mL): stock HNTG Milli-Q H2O

2,0 ml2.0 ml

7,3 ml7.3 ml

EDTA, 100 mM, pH 7,0 0,5 mlEDTA, 100 mM, pH 7.0 0.5 mL

Na₃VO₄ (0,5 M) 0,1 mlNa ₃ VO ₄ (0,5 M) 0,1 ml

Na₄(P₂O₇) (0,2 M) 0,1 mlNa ₄ (P ₂ O ₇ ) (0.2 M) 0.1 ml

4. Po 120 minutách inkubace s léčivem se k buňkám přidá připravený ligand SGF v množství 10 μΐ na jamku do konečné koncentrace 100 «<? ·· ·· • flfl * • fl4. After 120 minutes of incubation with the drug, the prepared SGF ligand is added to the cells at 10 μΐ per well to a final concentration of 100? ·· ·· • flfl * • fl

151 • ·»· X· ·151 • · »· X · ·

I fl ♦ fl ♦I fl ♦ fl ♦

I · fl 4 «· flfl X flfl nM. Kontrolní jamky obdrží pouze DMEM. Inkubuje se za stálého třepání při pokojové teplotě po dobu 5 minut.I · fl 4 · · flfl X flfl nM. Control wells only receive DMEM. Incubate with shaking at room temperature for 5 minutes.

5. Léčivo, EGF a DMEM se odstraní. Buňky se dvakrát omyjí PBS. K buňkám se v množství 100 μΐ na jamku přenese HNTG*. Umístí se na led na 5 minut. Mezitím se z jiné ELISA destičky odstraní blokovací pufr a omyje se TBST výše popsaným způsobem.5. Remove the drug, EGF and DMEM. The cells are washed twice with PBS. HNTG * is transferred to the cells at 100 μΐ / well. Place on ice for 5 minutes. Meanwhile, the blocking buffer is removed from another ELISA plate and washed with TBST as described above.

6. Pipetovací špičkou pevně nasazenou na mikropipetu se buňky seškrabují s destičky a homogenizují se opakovaným nasáváním a vypouštěním HNTG* lyzovacího pufru pipetou. Lyzát se přenese na povlečenou, blokovanou a omytou ELISA destičku. Inkubuje se při pokojové teplotě jednu hodinu.6. Using a pipet tip fixed to the micropipette, the cells are scraped from the plates and homogenized by repeatedly aspirating and draining the HNTG * lysis buffer with a pipette. The lysate is transferred to a coated, blocked, and washed ELISA plate. Incubate at room temperature for one hour.

7. Lyzát se odstraní a destička se čtyřikrát omyje TBST. Na destičku se přenese čerstvě naředěná protilátka proti fosfotyrosinu v množství 100 μΐ na jamku. Inkubuje se za stálého třepání při pokojové teplotě po dobu 30 minut za přítomnosti protilátky proti fosfotyrosinu (ředění 1:3000 v TBST).7. Discard the lysate and wash the plate four times with TBST. Transfer freshly diluted 100 μΐ per well anti-phosphotyrosine antibody to the plate. Incubate with constant shaking at room temperature for 30 minutes in the presence of anti-phosphotyrosine antibody (1: 3000 dilution in TBST).

8. Protilátka proti fosfotyrosinu se odstraní a destička se čtyřikrát omyje TBST. Na destičku se přenese čerstvě naředěná TÁGO protikráličí IgG protilátka v množství 100 μΐ na jamku. Inkubuje se za stálého třepání při pokojové teplotě 30 minut (ředění protikráličí IgG protilátky 1 : 3000 v TBST).8. Remove the phosphotyrosine antibody and wash the plate four times with TBST. Freshly diluted TAGO anti-rabbit IgG antibody is transferred to the plate at 100 μΐ per well. Incubate with constant shaking at room temperature for 30 minutes (1: 3000 dilution of anti-rabbit IgG antibody in TBST).

9. Odstraní se detekční TÁGO protilátka a destička se omyje čtyřikrát TBST. Na destičku se přenese čerstvě naředěný roztok ABTS/H2O2 v množství 100 μΐ na jamku. Inkubuje se za stálého třepání při pokojové teplotě po dobu 20 minut, (roztok ABTS/H₂O₂: 1,0 μΐ 30 % H₂O₂ v 10 ml zásobního ABTS).9. Detect TAGO antibody and wash plate four times with TBST. Transfer freshly diluted ABTS / H2O2 solution at 100 μ množství per well to the plate. Incubate with constant shaking at room temperature for 20 minutes (ABTS / H ₂ O ₂ solution: 1,0 μΐ 30% H ₂ O ₂ in 10 ml stock ABTS).

10. Reakce se zastaví přidáním 50 μΐ 5 N H2SO4 (volitelné), a určí se optická denzita při 410.10. Stop the reaction by adding 50 μΐ 5 N H2SO4 (optional) and determine the optical density at 410.

11. Maximální fosfotyrosinový signál je určen odečtením hodnot negativních kontrol od pozitivních kontrol. Procento inhibice fosfotyrosinového obsahu pro extrakt obsahující buňky se pak vypočítá po odečtení negativních kontrol.11. Maximum phosphotyrosine signal is determined by subtracting negative control values from positive controls. The percent inhibition of phosphotyrosine content for the cell-containing extract is then calculated after deduction of the negative controls.

♦ * ♦♦ * ♦

152152

•··· ·*· • · · t • · 4 t 4 • 9 · * ·»···>* ·.* *• t · 4 t 4 • 9 · * · »···> * ·. * *

Test PDGF-RPDGF-R test

Všechna buněčná kultivační média, glutamin a fetální hovězí sérum je nakoupeno od Gibco Life Technologies (Grand Island, NY), pokud není určeno jinak. Všechny buňky jsou pěstovány ve vlhké atmosféře 90-95 % vzduchu a 5-10 % CO₂ při 37°C. Všechny buněčné linie se rutinně přesazují dvakrát týdně a určuje se nepřítomnost mykoplazmat metodou mykotestu (Gibco).All cell culture media, glutamine and fetal bovine serum are purchased from Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) unless otherwise specified. All cells are grown in a humid atmosphere of 90-95% air and 5-10% CO ₂ at 37 ° C. All cell lines are routinely transplanted twice a week and the absence of mycoplasmas is determined by the mycotest method (Gibco).

Pro ELISA testy se pěstují buňky (U1242, získané od Josepha Schlessingera, NYU) do souvislého pokrytí 80 - 90 % v růstovém médiu (MEM s 10 % FBS, NEAA, 1 mM NaPyr a 2 mM GLN) a vysévají se na 96ti-jamkové destičky pro tkáňové kultury v 0,5 % séru v množství 25 000 až 30 000 buněk na jamku. Po inkubaci přes noc v médiu obsahujícím 0,5 % sérum je buňkám médium zaměněno za bezsérové médium a buňky jsou ošetřeny testovanou sloučeninou po dobu 2 hodin v 5 % CO₂ při 37°C v inkubátoru. Buňky se potom stimulují ligandem 5-10 minut, po čemž následuje lýza pomocí HNTG (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 10 % glycerol, 5 mM EDTA, 5 mM Na₃VO4, 0,2 % Triton X-100 a 2 mM NaPyr). Buněčný lyzát (0,5 mg/jamka v PBS) se přenese na ELISA destičky, které byly předem povlečeny protilátkou specifickou na receptor a která byla blokována 5 % mlékem v TBST (50 mM Tris-HCl pH 7,2, 150 mM NaCl a 0,1 % Triton X-100) při pokojové teplotě 30 minut. Lyzáty se inkubují za stálého třepání při pokojové teplotě jednu hodinu. Destičky se čtyřikrát omyjí TBST a pak se inkubují s polyklonální protilátkou proti fosfotyrosinu při pokojové teplotě 30 minut. Přebytečná protilátka proti fosfotyrosinu se odstraní čtyřnásobným opláchnutím destičky TBST. Na ELISA destičku se přidá kozí protikráličí IgG protilátka na dobu 30 minut při pokojové teplotě, po čemž následuje opět čtyřnásobné omytí TBST. Pro spuštění barevné reakce se na ELISA destičku přidá ABTS (100 mM kyselina citrónová, 250 mM Na₂HPO4 a 0,5 mg/ml 2,2 '-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6sulfonová kyselina)) plus H₂O₂ (1,2 ml 30 % H₂O₂ do 10 ml ABTS).For ELISA, cells (U1242, obtained from Joseph Schlessinger, NYU) are grown to a continuous coverage of 80-90% in growth medium (MEM with 10% FBS, NEAA, 1 mM NaPyr and 2 mM GLN) and seeded in 96-wells. tissue culture plates in 0.5% serum at 25,000 to 30,000 cells per well. After incubation overnight in medium containing 0.5% serum, the cells are changed to serum free medium and the cells are treated with test compound for 2 hours in 5% CO ₂ at 37 ° C in an incubator. Cells are then stimulated with ligand for 5-10 minutes, followed by lysis with HNTG (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 5 mM EDTA, 5 mM Na ₃ VO4, 0.2% Triton X-100 and 2 mM NaPyr). Cell lysate (0.5 mg / well in PBS) was transferred to ELISA plates that had been pre-coated with receptor-specific antibody and blocked with 5% milk in TBST (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl and 0.1% Triton X-100) at room temperature for 30 minutes. The lysates are incubated with shaking at room temperature for one hour. Plates are washed four times with TBST and then incubated with polyclonal anti-phosphotyrosine antibody at room temperature for 30 minutes. Excess phosphotyrosine antibody is removed by washing the TBST plate four times. Goat anti-rabbit IgG antibody is added to the ELISA plate for 30 minutes at room temperature, followed by a four-fold TBST wash. ABTS (100 mM citric acid, 250 mM Na ₂ HPO4 and 0.5 mg / ml 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6sulfonic acid)) plus H ₂ O _{2 is} added to the ELISA plate to start the color reaction. (1.2 mL 30% H ₂ O ₂ to 10 mL ABTS).

« t«T

153 ·· »153 ·· »

* ·* ·

Patnáct až třicet minut po přidání ABTS se zaznamená absorbance při 410 nm s referenční vlnovou délkou 630 nm.Fifteen to thirty minutes after the addition of ABTS, absorbance at 410 nm with a reference wavelength of 630 nm is recorded.

Test receptorů IGF-1IGF-1 Receptor Assay

Následující protokol může být použit pro měření hladiny fosfotyrosinu na receptorů IGF-1, která indikuje tyrozinkinázovou aktivitu IGF-1 receptorů.The following protocol can be used to measure the level of phosphotyrosine at IGF-1 receptors, which indicates the tyrosine kinase activity of IGF-1 receptors.

Látky a činidla.Substances and reagents.

a. Buněčnou linií použitou v tomto testuje 3T3/IGF-1R, buněčná linie geneticky upravená pro zvýšenou expresi IGF-1 receptorů.a. The cell line used in this assay is 3T3 / IGF-1R, a cell line genetically engineered for overexpression of IGF-1 receptors.

b. NIH3T3/IGF-IR se pěstuje v inkubátoru s 5 % CO₂ při 37°C. Růstovým médiem je DMEM + 10 % FBS (tepelně inaktivované) + 2 mM L-glutamin.b. NIH3T3 / IGF-IR is grown in a 5% CO ₂ incubator at 37 ° C. The growth medium is DMEM + 10% FBS (heat inactivated) + 2 mM L-glutamine.

c. Afinitně purifikovaná anti-IGF-lR protilátka 17-69.c. Affinity purified anti-IGF-1R antibody 17-69.

d. D-PBS:d. D-PBS:

0,20 g/1 2,16 g/10.20 g / L 2.16 g / L

0,20 g/10.20 g / l

8,00 g/1 (pH 7,2)8.00 g / l (pH 7.2)

TBST plus 5 % mléko (Carnation instantníTBST plus 5% Milk (Carnation Instant

KH₂PO₄ KH₂PO₄ KC1 NaClKH ₂ PO ₄ KH ₂ PO ₄ KCl NaCl

e. Blokovací pufr:e. Blocking Buffer:

odtučněné sušené mléko)skimmed milk powder)

f. TBST pufr:f. TBST buffer:

Tris- HCI NaCl glycerol Triton X-100Tris-HCl NaCl glycerol Triton X-100

g. HNTG pufr:g. HNTG buffer:

HEPES NaCl glycerol mMHEPES NaCl glycerol mM

150 mM (pH 7,2/HCl 1 N) %150 mM (pH 7.2 / HCl 1 N)%

0,2 % mM0.2% mM

150 mM (pH 7,2/HCl 1 N) %150 mM (pH 7.2 / HCl 1 N)%

154154

Triton X-100 0,2 %Triton X-100 0.2%

Připraví se zásobní roztok (5X) a uchovává se při 4°C.Prepare a stock solution (5X) and store at 4 ° C.

h. EDTA/HC1: 0,5 M pH 7,0 (NaOH) jako 100X zásobní roztok.h. EDTA / HCl: 0.5 M pH 7.0 (NaOH) as a 100X stock solution.

i. Na₃VO4: 0,5 M jako 100X zásobní. Alikvótní množství se uchovávají při 80°C.i. On ₃ VO4: 0.5 M as 100X stock. Aliquots are stored at 80 ° C.

j. Na4P2O7: 0,2 M jako 100X zásobní.j. Na4P2O7: 0.2 M as 100X stock.

k. Insulinu podobný růstový faktor 1 od Promegy (kat. # G5111).Insulin-like growth factor 1 from Promega (Cat # G5111).

l. Králičí polyklonální antisérum proti fosfotyrosinu.Rabbit polyclonal antisera against phosphotyrosine.

m. Kozí protikráličí IgG, POD konjugát (detekční protilátka), TÁGO, lne., Burlingame, CA.m. Goat anti-rabbit IgG, POD conjugate (detection antibody), TAGO, Inc., Burlingame, CA.

n. ABTS roztok (2,2 '-azinobis(3-ethylbenzthiazolinsulfonové kyseliny):n. ABTS solution (2,2'-azinobis (3-ethylbenzthiazolinesulfonic acid):

Kyselina citrónová 100 mMCitric acid 100 mM

Na₂HPO₄ 250 mM (pH 4,0/1 N HC1)Na ₂ HPO ₄ 250 mM (pH 4.0 / HC1 1N)

ABTS 0,5 mg/ml roztok ABTS je nutno uchovávat v temnu při 4°C. Jakmile roztok zezelená, měl by se vyřadit.ABTS 0.5 mg / ml ABTS solution should be stored in the dark at 4 ° C. Once the solution turns green, it should be discarded.

o. Peroxid vodíku: 30 % roztok se uchovává v temnu při 4°C.Hydrogen Peroxide: The 30% solution is stored in the dark at 4 ° C.

PostupMethod

Pokud není uvedeno jinak, provádějí se všechny následující kroky při pokojové teplotě. Všechny oplachy ELISA destiček jsou provedeny tak, že destičky jsou třikrát opláchnuty vodou z vodovodu a poté jednou opláchnuty TBST. Destičky se suší vytřepáním na papírový ručník.Unless otherwise indicated, all subsequent steps are performed at room temperature. All ELISA plate washes are performed so that the plates are rinsed three times with tap water and then rinsed once with TBST. The plates are dried by shaking on a paper towel.

Vysetí buněk:Cell sowing:

1. Buňky se pěstují v miskách na tkáňové kultury (Corning 25020-100) do souvislého pokryvu 80 - 90 %, sklidí se Trypsin-EDTA (0,25 %, 0,5 ml/D-100, GIBCO).1. Cells are grown in tissue culture dishes (Corning 25020-100) to a continuous coverage of 80-90%, harvested with Trypsin-EDTA (0.25%, 0.5 mL / D-100, GIBCO).

• » φ ·• »φ ·

Φ · ΦΦ · Φ

155155

• Φ » · «» ♦• Φ »Φ» ♦

ΦΦΦΦ

2. Buňky se resuspendují v čerstvém DMEM + 10 % FBS + 2 mM LGlutamin a přenesou na 96ti-jamkovou destičku na tkáňové kultury (Corning, 25806-96) v množství 20 000 buněk/jamka (100 μΐ/jamka). Inkubuje se 1 den, a pak se médium nahradí bezsérovým médiem (90 μΐ) a inkubuje přes noc v 5 % CO₂ při 37°C.2. Resuspend cells in fresh DMEM + 10% FBS + 2 mM LGlutamine and transfer to a 96-well tissue culture plate (Corning, 25806-96) at 20,000 cells / well (100 μΐ / well). Incubate for 1 day, then replace the medium with serum-free medium (90 μΐ) and incubate overnight in 5% CO ₂ at 37 ° C.

Povlékání a blokování ELISA destiček:Coating and blocking ELISA plates:

1. ELISA destička (Corning 25805-96) se povléká protilátkou antiIGF-1R v množství 0,5 pg/jamka v 100 μΐ PBS nejméně 2 hodiny.1. The ELISA plate (Corning 25805-96) is coated with 0.5 µg / well antiIGF-1R antibody in 100 μΐ PBS for at least 2 hours.

2. Zásobní léčivo (ve 100 % DMEM) se naředí DMEM 1 : 10 na 96tijamkové polypropylenové destičce a do každé jamky se k buňkám přenese 10 μΐ tohoto roztoku, aby se dosáhlo konečného ředění léčiva 1 : 100 a konečné koncentrace DMSO 1, %. Buňky se inkubují v 5 % CO₂ při 37°C dvě hodiny.2. Drug stock (in 100% DMEM) is diluted 1: 10 in DMEM in a 96-well polypropylene plate and 10 μΐ of this solution is transferred to each well to obtain a final drug dilution of 1: 100 and a final DMSO concentration of 1%. Cells are incubated in 5% CO ₂ at 37 ° C for two hours.

3. Připraví se 3. Prepare čerstvý lyzovací pufr na buňky (HNTG*) fresh cell lysis buffer (HNTG *) HNTG HNTG 2 ml 2 ml EDTA EDTA 0,1 ml 0.1 ml Na₃VO₄ For ₃ VO ₄ 0,1 ml 0.1 ml Na₄ (P₂O₇)Na ₄ (P ₂ O ₇ ) 0,1 ml 0.1 ml H2O H2O 7,3 ml 7.3 ml

4. Po inkubaci léčiva po dvě hodiny se k buňkám přenese v množství 10 μΐ/jamka 200 nM ligand IGF-1 v PBS (konečná koncentrace je 20 nM) a inkubuje se v 5 % CO₂ při 37°C 10 minut.4. After incubating the drug for two hours, 200 µM IGF-1 ligand in PBS (final concentration is 20 nM) is transferred to the cells at 10 µΐ / well and incubated in 5% CO ₂ at 37 ° C for 10 minutes.

5. Médium se odstraní a přidá se do každé jamky 100 μΐ HNTG* a třepe se 10 minut. Buňky se prohlédnou pod mikroskopem, zda jsou adekvátně lyžovány.5. Remove media and add 100 μΐ HNTG * to each well and shake for 10 minutes. Cells are examined under a microscope to see if they are adequately lysed.

6. Na seškrábání buněk s destičky se použije 12ti-nástavcová pipeta. Lyzát se homogenizuje opakovaným nasáváním a vypouštěním. Veškerý lyzát se přenese na ELISA destičku povlečenou protilátkou a třepe se 1 hodinu.6. Use a 12-well pipette to scrape the cells from the plate. The lysate is homogenized by repeated suction and discharge. All lysate was transferred to an antibody coated ELISA plate and shaken for 1 hour.

4 ·4 ·

44

156 ♦ · »·»· 444156 ♦ · · · · »· 444

7. Lyzát se odstraní, destička se omyje a přenese se protilátka proti fosfotyrosinu (1:3000 v TBST) v množství 100 μΙ/jamka a třepe se 30 minut.7. Remove the lysate, wash the plate and transfer the anti-phosphotyrosine antibody (1: 3000 in TBST) at 100 μΙ / well and shake for 30 minutes.

8. Detekční protilátka se odstraní, destička omyje a přenese se čerstvý roztok ABTS/H2O2 (1,2 μΐ H2O2 do 10 ml ABTS) v množství 100 μΙ/jamka, aby se nastartovala barevná reakce.8. Remove the detection antibody, wash the plate and transfer fresh ABTS / H2O2 solution (1.2 μΐ H2O2 to 10 ml ABTS) at 100 μ jam / well to initiate the color reaction.

Změří se O.D. při 410 nm s referenční vlnovou délkou 630 nm naO.D. at 410 nm with a reference wavelength of 630 nm at

Dynatec MR5000.Dynatec MR5000.

Test EGFREGFR test

Kinázová aktivita receptoru EGF v buňkách geneticky upravených pro expresi lidského EGF-R se může měřit následujícím způsobem:EGF receptor kinase activity in cells engineered to express human EGF-R can be measured as follows:

Látky a činidla.Substances and reagents.

a. Ligand EGF: zásobní koncentrace = 16,5 μΜ, EGF 201, TOYOBO, Co. Ltd. Japan.EGF ligand: stock concentration = 16.5 μΜ, EGF 201, TOYOBO, Co. Ltd. Japan.

b. 05-101 (UBI) (monoklonální protilátka rozpoznávající extracelulární doménu EGFR).b. 05-101 (UBI) (monoclonal antibody recognizing the extracellular domain of EGFR).

c. Protilátka proti fosfotyrosinu (anti-Ptyr) (polyklonální).c. Phosphotyrosine (anti-Ptyr) antibody (polyclonal).

d. Detekční protilátka: kozí protikráličí IgG konjugovaná křenovou peroxidázou, TÁGO, lne., Burlingame, CA.d. Detection antibody: horseradish peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG, TAGO, Inc., Burlingame, CA.

e. TBST pufr: Tris-HCl, pH 7 NaCle. TBST buffer: Tris-HCl, pH 7 NaCl

Triton X-100 mMTriton X-100 mM

150 mM150 mM

0,10.1

f. HNTG 5X zásobníf. HNTG 5X Stock

HEPESHEPES

0,1 M0.1 M

NaClNaCl

0,75 M glycerol Triton X-1000.75 M glycerol Triton X-100

1,0 % ··1,0% ··

157157

g. ABTS zásobní: kyselina citrónová Na₃VO₄ HCI, koncentr. ABTS*g. ABTS stock: citric acid Na ₃ VO ₄ HCl, conc. ABTS *

100 mM 250 mM 4,0 pH 0,5 mg/ml100 mM 250 mM 4.0 pH 0.5 mg / ml

Uchovávejte roztok až do použití v temnu při 4°C.Store the solution in the dark at 4 ° C until use.

h. Zásobní činidlah. Stock reagents

EDTA 100 mM pH 7,0 Na₃VO₄ 0,5 M Na₄ (P₂O₇) 0,2 MEDTA 100 mM pH 7.0 Na ₃ VO ₄ 0.5 M Na ₄ (P ₂ O ₇ ) 0.2 M

PostupMethod

Předpovlékání ELISA destičkyPrecoating ELISA plates

1. ELISA destičky (Corning, 96ti-jamkové, katalog, č. 25805-96) se povlékají protilátkou 05-101 v množství 0,5 pg na jamku v PBS, konečný objem jamky 150 pl. Uskladní se přes noc při 4°C. Povlečené destičky jsou vhodné k upotřebení až 10 dnů, jsou-li uchovávány v 4°C.1. ELISA plates (Corning, 96-well, catalog, # 25805-96) are coated with antibody 05-101 at 0.5 µg per well in PBS, final well volume 150 µl. Store overnight at 4 ° C. The coated plates are suitable for up to 10 days when stored at 4 ° C.

2. V den použití se povlékací pufr odstraní a nahradí se blokovacím pufrem (5 % Carnation instantní odtučněné sušené mléko v PBS). Destička se inkubuje a třepe při pokojové teplotě (kolem 23°C až 25°C) třicet minut. Těsně před použitím se odstraní blokovací pufr a destička se čtyřikrát omyje TBST pufrem.2. On the day of use, the coating buffer is removed and replaced with blocking buffer (5% Carnation Instant Skimmed Milk Powder in PBS). The plate is incubated and shaken at room temperature (about 23 ° C to 25 ° C) for thirty minutes. Just prior to use, the blocking buffer is removed and the plate is washed four times with TBST buffer.

Vysévání buněkSowing cells

1. Pro tento test může být použita buněčná linie NIH3T3/C7 (Honegger, et al., Cell 51:199-209, 1987).1. The NIH3T3 / C7 cell line can be used for this assay (Honegger, et al., Cell 51: 199-209, 1987).

2. Pro experiment se vyberou destičky, které mají souvislý pokryv 80 90 %. Buňky se trypsinizují a reakce se zastaví přidáním 10 % CS DMEM média. Buňky se resuspendují v DMEM médiu (10 % CS φ · ·· ♦ φφφ ♦ φφφ φ φφφφ φφφ φ φ «φ φφφφ φφ ·2. Plates having a continuous coverage of 80 90% are selected for the experiment. Cells are trypsinized and the reaction is stopped by adding 10% CS DMEM medium. Cells are resuspended in DMEM medium (10% CS φ · ♦ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ

Β ·Β ·

158158

DMEM médium) a centrifugují se jednou při 1000 rpm při pokojové teplotě po dobu 5 minut.DMEM medium) and centrifuged once at 1000 rpm at room temperature for 5 minutes.

3. Buňky se resuspendují ve vysévacím médiu (DMEM, 0,5 % hovězí sérum) a buňky se spočítají s použitím trypanové modři. Je přijatelná životnost nad 90 %. Buňky se vysejí v médiu DMEM (0,5 % hovězí sérum) v hustotě 10 000 buněk na jamku, 100 μΐ na jamku, na 96ti-jamkovou destičku. Buňky se inkubují v 5 % CO₂ při 37°C po dobu 40 hodin.3. Cells are resuspended in seed medium (DMEM, 0.5% bovine serum) and cells are counted using trypan blue. A service life above 90% is acceptable. Cells are seeded in DMEM medium (0.5% bovine serum) at a density of 10,000 cells per well, 100 μΐ per well, in a 96-well plate. Cells are incubated in 5% CO ₂ at 37 ° C for 40 hours.

Postupy testuTest procedures

1. Vyseté buňky se zkontrolují na kontaminaci s použitím invertovaného mikroskopu. Zásoba testovaných sloučenin se naředí (10 mg/ml v DMSO) 1:10 v DMEM médiu, pak se přenese 5 μΐ do testovacích jamek pro ředění testovaných sloučenin léčiv 1 : 200 a konečné koncentrace DMSO 1 %. Kontrolní jamky obdrží pouze DMSO. Inkubuje se v 5 % CO₂ při 37°C po dobu jedné hodiny.1. Sowed cells are checked for contamination using an inverted microscope. The test compound stock is diluted (10 mg / ml in DMSO) 1:10 in DMEM medium, then transferred 5 μΐ to test wells for 1: 200 drug test compound dilutions and a final DMSO concentration of 1%. Control wells only receive DMSO. Incubate in 5% CO ₂ at 37 ° C for one hour.

2. Připraví se ligand EGF: zásobní EGF se naředí DMEM, aby se při přenosu dosáhlo 10 μΐ ředěného EGF (1:12 ředění), finální koncentrace 25 nM,2. Prepare EGF ligand: dilute the stock EGF with DMEM to achieve 10 μΐ diluted EGF (1:12 dilution) at a final concentration of 25 nM,

3. Připraví se 10 ml HNTG* dostatečné pro 100 μΐ na jamku, přičemž HNTG* obsahuje: zásobní HNTG (2,0 ml), Milli-Q H2O (7,3 ml), EDTA, 100 mM, pH 7,0 (0,5 ml), Na₃VO₄ 0,5 M (0,1 ml) a Na₄(P₂O₇), 0,2 M (0,1 ml).3. Prepare 10 ml of HNTG * sufficient for 100 μΐ per well, the HNTG * containing: stock HNTG (2.0 ml), Milli-Q H2O (7.3 ml), EDTA, 100 mM, pH 7.0 ( 0.5 ml), Na ₃ VO ₄ 0.5 M (0.1 ml) and Na ₄ (P ₂ O ₇ ), 0.2 M (0.1 ml).

4. Umístí se na led.4. Place on ice.

5. Po dvou hodinách inkubace s léčivem se k buňkám přidá připravený ligand EGF v množství 10 μΐ na jamku, aby se dosáhlo konečné koncentrace 25 nM. Kontrolní jamky obdrží pouze DMEM. Inkubuje se za stálého třepání při pokojové teplotě 5 minut.5. After two hours incubation with the drug, the prepared EGF ligand is added to the cells at 10 μΐ per well to give a final concentration of 25 nM. Control wells only receive DMEM. Incubate with shaking at room temperature for 5 minutes.

6. Odstraní se testovaná sloučenina, EGF, a DMEM. Buňky se dvakrát omyji PBS. K buňkám se přenese HNTG* v množství 100 μΙ/jamka. Umístí se na 5 minut na led. Mezitím se s jiné ELISA destičky • 0 • 06. Remove test compound, EGF, and DMEM. The cells are washed twice with PBS. HNTG * is transferred to the cells at 100 μΙ / well. Place on ice for 5 minutes. Meanwhile, with other ELISA plates • 0 • 0

159 » · 0*9 00 0000 odstraní blokovací pufr a destička se omyje TBST výše popsaným způsobem.The blocking buffer is removed and the plate is washed with TBST as described above.

7. Buňky se seškrábou s destičky špičkou pipety pevně nasazenou na mikropipetu a buněčný materiál se homogenizuje opakovaným nasáváním a vypouštěním lyzovacího HNTG pufru. Lyzát se přenese na povlečenou, blokovanou a omytou ELISA destičku. Inkubuje se za stálého třepání při pokojové teplotě jednu hodinu.7. Scrape the cells with the pipette tip firmly mounted on the micropipette and homogenize the cell material by repeatedly aspirating and draining the lysis HNTG buffer. The lysate is transferred to a coated, blocked, and washed ELISA plate. Incubate with shaking at room temperature for one hour.

8. Lyzát se odstraní a destička se čtyřikrát omyje TBST. Na destičku se přenese čerstvě naředěná protilátka proti fosfotyrosinu v množství 100 μΐ/jamka. Inkubuje se za stálého třepání při pokojové teplotě 30 minut za přítomnosti protilátky proti fosfotyrosinu (ředění 1:3000 v TBST).8. Remove the lysate and wash the plate four times with TBST. Transfer freshly diluted 100 μΐ / well anti-phosphotyrosine antibody to the plate. Incubate with constant shaking at room temperature for 30 minutes in the presence of anti-phosphotyrosine antibody (1: 3000 dilution in TBST).

9. Odstraní se protilátka proti fosfotyrosinu a destička se čtyřikrát omyje TBST. Přenese se čerstvě naředěná TÁGO 30 protikráličí IgG protilátka na ELISA destičku v množství 100 μΐ. Inkubuje se za stálého třepání při pokojové teplotě 30 minut (protikráličí IgG protilátka: ředění 1:3000 v TBST).9. Remove the phosphotyrosine antibody and wash the plate four times with TBST. Transfer freshly diluted TAGO 30 anti-rabbit IgG antibody to the ELISA plate at 100 μΐ. Incubate with constant shaking at room temperature for 30 minutes (anti-rabbit IgG antibody: 1: 3000 dilution in TBST).

10.Odstraní se detekční protilátka a destička se čtyřikrát omyje TBST. Přenese se čerstvě připravený roztok ABTS/H2O2 na ELISA destičku v množství 100 μΐ/jamka. Inkubuje se při pokojové teplotě 20 minut. Roztok ABTS/H2O2: 1,2 μΐ 30 % H₂O₂ v 10 ml zásobního ABTS.10. Remove the detection antibody and wash the plate four times with TBST. Transfer freshly prepared ABTS / H2O2 solution to the ELISA plate at 100 μΐ / well. Incubate at room temperature for 20 minutes. ABTS / H2O2 solution: 1.2 μΐ 30% H ₂ O ₂ in 10 ml stock ABTS.

11. Reakce se zastaví přidáním 50 μΐ 5 N H₂SO₄ (volitelné) a určí se O.D. při 410 nm.11. Stop reaction by adding 50 μΐ 5 NH ₂ SO ₄ (optional) and determine OD at 410 nm.

12. Maximální fosfotyrosinový signál je určen odečtením hodnoty negativních kontrol od pozitivních kontrol. Procento inhibice obsahu fosfotyrosinu v extraktu obsahujícím buňky se pak spočítá po odečtení negativních kontrol.12. The maximum phosphotyrosine signal is determined by subtracting the value of the negative controls from the positive controls. The percent inhibition of the phosphotyrosine content of the cell-containing extract is then calculated after deduction of the negative controls.

Test autofosforylace MetAutophosphorylation Test Met

Tento test určuje aktivitu Met tyrozinkinázy analýzou hladiny Met proteintyrozinkinázy na Met receptorů.This assay determines Met tyrosine kinase activity by analyzing the level of Met protein tyrosine kinase at Met receptors.

160 ·· ·· ♦· • · ♦ ♦ · · • · · • * · · · • · · · «· 9 9 9 9 ·9 9160 · · • * * * * 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

ČinidlaReagents

a. HNTG (5X zásobní roztok): rozpustí se 23,83 g HEPES a 43,83 g NaCl v přibližně 350 ml dH₂O. Upraví se pH HC1 nebo NaOH na 7,2, přidá se 500 ml glycerolu a 10 ml Triton X-100, smíchá se a do celkové objemu 1 L se doplní dH₂O. Pro přípravu 1 L IX pracovního roztoku se přidá 200 ml 5X zásobního roztoku do 800 ml dH₂O, v případě potřeby se zkontroluje a upraví pH, uskladní se v 4°C.HNTG (5X stock solution): dissolve 23.83 g HEPES and 43.83 g NaCl in approximately 350 mL dH ₂ O. Adjust the pH of HCl or NaOH to 7.2, add 500 mL glycerol and 10 mL Triton X-100, mixed and made up to a total volume of 1 L with dH ₂ O. To prepare 1 L of IX working solution add 200 ml of 5X stock solution to 800 ml dH ₂ O, check and adjust pH if necessary, store at 4 ° C.

b. PBS (Dulbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok), Gibco katalog, č. 450-1300EB (IX roztok).b. PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline), Gibco Catalog, No. 450-1300EB (1X solution).

c. Blokovací pufr: do 500 ml dH₂O se dá 100 g BSA, 12,1 g Tris-pH 7,5; 58,44 g NaCl a 10 ml Tween-20, naředí se do konečného objemu 1 1.c. Blocking buffer: 100 g of BSA, 12.1 g of Tris-pH 7.5 are added to 500 ml of dH ₂ O; 58.44 g NaCl and 10 ml Tween-20, diluted to a final volume of 1 L.

d. Kinázový pufr: do 500 ml dH2O se přidá 12,1 g TRIS (pH 7,2), 58,4 g NaCl, 40,7 g MgCl₂ a 1,9 g EGTA, do konečného objemu 1 L se doplní dH₂O.d. Kinase Buffer: 12.1 g of TRIS (pH 7.2), 58.4 g of NaCl, 40.7 g of MgCl ₂ and 1.9 g of EGTA are added to 500 ml of dH2O, and dH is added to a final volume of 1 L. ₂ O.

e. PMSF (fenylmethylsulfonylfluorid), Sigma kat. č. P-7626, k 435,5 mg se přidá 100 % ethanol do celkového objemu 25 ml, vortexuje se.e. PMSF (Phenylmethylsulfonylfluoride), Sigma Cat. No. P-7626, to 435.5 mg, add 100% ethanol to a total volume of 25 mL, vortex.

f. ATP (bakteriální zdroj), Sigma kat. č. A-7699, prášek se uskladňuje při -20°C. Pro přípravu roztoku k použití se rozpustí 3,31 mg v 1 ml dH₂O.f. ATP (bacterial source), Sigma Cat. No. A-7699, powder is stored at -20 ° C. To prepare a solution for use, dissolve 3.31 mg in 1 ml dH ₂ O.

g. RC-20H HRPO konjugovaná proti fosfotyrosinu, Transduction Laboratories Cat. č. E120H.g. RC-20H HRPO conjugated to phosphotyrosine, Transduction Laboratories Cat. No. E120H.

h. Pierce 1-Step™ Turbo TMB-ELISA (3,3',5,5'- tetramethylbenzidin, Pierce Kat. ě. 34022.h. Pierce 1-Step (TM) Turbo TMB-ELISA (3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine, Pierce Cat. No. 34022).

i. H₂SO4, přidá se 1 ml koncentr. (18 N) do 35 ml dH₂O.i. H ₂ SO 4, add 1 mL of conc. (18 N) to 35 ml dH ₂ O.

j. TRIS HCL, Fischer kat. č. BP152-5, do 121,14 g látky se přidá 600 ml MilliQ H₂O, upraví se pH na 7,5 (nebo 7,2) HC1, do celkového objemu 1 1 se doplní MilliQ H₂O.j. TRIS HCL, Fischer Cat. No. BP152-5, 600 ml of MilliQ H ₂ O are added to 121.14 g of the substance, the pH is adjusted to 7.5 (or 7.2) HCl, to a total volume of 1 liter. replenishes MilliQ H ₂ O.

k. NaCl, Fischer kat. č. S271-10, připraví se 5 M roztok.NaCl, Fischer Cat No. S271-10, a 5 M solution was prepared.

l. Tween-20, Fischer kat. č. S337-500.1. Tween-20, Fischer Cat. No. S337-500.

m. Na3VO4, Fischer kat. č. S454-50, k 1,8 g látky se přidá 80 ml MilliQ H₂O, pH se upraví HC1 nebo NaOH na 10,0, povaří se v ♦ 4 9 • ·Na3VO4, Fischer Cat. No. S454-50, 80 ml of MilliQ H ₂ O are added to 1.8 g of the substance, adjusted to pH 10.0 with HCl or NaOH, boiled in ♦ 4 9 · ·

161161

9 · 9 •9 · 9 •

• 9 9 • 9 9 · 4 mikrovlnné troubě, ochladí, zkontroluje se pH. Postup se opakuje, dokud není pH stabilně na 10,0. Do celkového objemu 100 ml se doplní MilliQ H₂O, připraví se alikvóty 1 ml, které se uskladní v• 9 9 • 9 9 · 4 microwave, cool, check pH. The procedure is repeated until the pH is stable at 10.0. MilliQ H ₂ O is made up to a total volume of 100 ml, aliquots of 1 ml are prepared and stored in

-80°C.-80 ° C.

n. MgC12, Fischer kat. č. M33-500, připraví se 1 M roztok.MgCl 2, Fischer Cat. No. M33-500, 1 M solution was prepared.

o. HEPES, Fischer kat. č. BP310-500, do 200 ml MilliQ H₂O se přidá 59,5 g látky, upraví se pH na 7,5, doplní se do celkového objemu 250 ml, sterilně se sfiltruje.HEPES, Fischer Cat. No. BP310-500, add 59.5 g of the substance to 200 ml of MilliQ H ₂ O, adjust the pH to 7.5, make up to a total volume of 250 ml, filter sterile.

p. Albumin, hovězí (BSA), Sigma kat. ě. A-4503, ke 30 g látky se přidá sterilní destilovaná voda do celkového objemu 300 ml, uskladní se při 4°C.p. Albumin, beef (BSA), Sigma cat. A-4503, sterile distilled water was added to 30 g of the substance to a total volume of 300 mL, stored at 4 ° C.

q. TBST pufr: k přibližně 900 ml dH₂O v jednolitrovém kalibrovaném válci se přidá 6,057 g TRIS a 8,766 g NaCl. Jakmile se rozpustí, upraví se pH na 7,2 HC1, přidá se 1,0 ml Triton X-100 a do konečného objemu 1 L se doplní dH₂O.q. TBST buffer: To approximately 900 ml dH ₂ O in a 1 liter calibrated cylinder, add 6.057 g TRIS and 8.766 g NaCl. Once dissolved, adjust the pH to 7.2 HCl, add 1.0 mL of Triton X-100 and make up to a final volume of 1 L with dH ₂ O.

r. Kozí afinitně purifikovaná protikráličí IgG (celé molekuly), Cappel Cat. č 55641.r. Goat affinity purified anti-rabbit IgG (whole molecules), Cappel Cat. No. 55641.

s. Anti h-Met (C-28) králičí polyklonální IgG protilátka, Santa Cruz Chemical Cat. č. SC-161.Anti-h-Met (C-28) rabbit polyclonal IgG antibody, Santa Cruz Chemical Cat. No. SC-161.

t. Dočasně transfekované chimérické buňky EGFR/Met (EMR) (Komada, et al., Oncogene, 8:2381-2390 (1993).Temporarily transfected chimeric EGFR / Met (EMR) cells (Komada, et al., Oncogene, 8: 2381-2390 (1993)).

u. Pufr uhličitanu sodného (Na₂CC>4, Fischer kat. č. S495): k 10,6 g látky se přidá 800 ml MilliQ H₂O. Jakmile se rozpustí, upraví se pH na 9,6 pomocí NaOH, do celkového objemu se doplní MilliQ H₂O, sfiltruje a uskladní při 4°C.Sodium carbonate buffer (Na ₂ CC> 4, Fischer Cat. No. S495): To 10.6 g of the substance is added 800 ml of MilliQ H ₂ O. Once dissolved, the pH is adjusted to 9.6 with NaOH, make up the total volume with MilliQ H ₂ O, filter and store at 4 ° C.

PostupMethod

Pokud není uvedeno jinak, provádějí se všechny následující kroky při pokojové teplotě. Všechny ELISA destičky se omývají 4X opláchnutím TBST.Unless otherwise indicated, all subsequent steps are performed at room temperature. All ELISA plates are washed 4X with TBST.

9 99 9999 9999,999,999,999

9 9 9 9 9 9 , ♦ 99·· *9··9 9 9 9 9 9, ♦ 99

162 ,;.. ,:, ·..· .162,; ..,:, · .. ·.

Lyže EMRSki EMR

Tento postup lze použít noc před nebo bezprostředně před započetím záchytu receptoru.This procedure can be used the night before or immediately prior to the start of receptor capture.

1. Lyzát se rychle roztaví ve vodní lázni mající teplotu 37°C při současném promíchávání lázně až do roztátí posledního krystalu.1. The lysate is quickly melted in a water bath at 37 ° C while stirring the bath until the last crystal melts.

2. Buněčná peleta se lyžuje IX HNTG obsahujícím 1 mM PMSF. Na každou 15 cm misku na buněčné kultury se použije 3 ml HNTG. Přidá se 1/2 vypočteného objemu HNTG, zkumavka se vortexuje 1 minutu, přidá se zbylý objem HNTG a vortexuje se další minutu.2. The cell pellet is lysed with 1X HNTG containing 1 mM PMSF. 3 ml of HNTG is used for each 15 cm cell culture dish. Add 1/2 of the calculated volume of HNTG, vortex for 1 minute, add the remaining volume of HNTG and vortex for another minute.

3. Zkumavky se vyrovnají, centrifugují při 10 000 x g po dobu 10 minut při 4°C.3. Align the tubes, centrifuge at 10,000 x g for 10 minutes at 4 ° C.

4. Supernatanty se spojí, odstraní se alikvot pro určení proteinu.4. Combine supernatants, remove aliquot for protein determination.

5. Vzorek se rychle zmrazí v lázni suchý led/ethanol. Tento krok se provádí bez ohledu na to, zda bude lyzát skladován přes noc, nebo bude určení proteinu následovat ihned.5. Quickly freeze the sample in a dry ice / ethanol bath. This step is performed regardless of whether the lysate is stored overnight or the protein determination is followed immediately.

6. Provede se určení proteinu použitím standardní metody kyseliny bicinchoninové (BCA) (BCA testovací souprava od Pierce Chemical kat. č. 23225).6. Protein determination is performed using the standard bicinchoninic acid (BCA) method (BCA assay kit from Pierce Chemical Cat. No. 23225).

Postup ELISA testuELISA Assay Procedure

1. Každá jamka 96ti-jamkových ELISA destiček se povlékají 5 pg kozí protikráličí protilátkou v uhličitanovém pufru v celkovém objemu 50 μΐ. Destičky se uchovají přes noc v teplotě 4°C.1. Each well of 96-well ELISA plates is coated with 5 µg of goat anti-rabbit antibody in carbonate buffer in a total volume of 50 µΐ. The plates are stored overnight at 4 ° C.

2. Tekutina s nenavázanými kozími protikráličími protilátkami se odstraní překlopením destičky dnem vzhůru.2. Remove liquid with unbound goat anti-rabbit antibodies by flipping the plate upside down.

3. Do každé jamky se přidá 150 μΐ blokovacího pufru. Destička se inkubuje 30 minut za stálého třepání.3. Add 150 μΐ blocking buffer to each well. The plate is incubated for 30 minutes with shaking.

4. Destička se 4x omyje TBST. Bubliny a přebytečná tekutina se odstraní vytřepáním destičky na papírový ručník.4. Wash plate 4 times with TBST. Bubbles and excess liquid are removed by shaking the plate on a paper towel.

5. Do každé jamky se přidá 1 pg králičí protilátky anti-Met naředěné v TBST do celkovém objemu 100 μΐ na jamku.5. Add 1 µg of rabbit anti-Met antibody diluted in TBST to each well to a total volume of 100 μΐ per well.

• ·• ·

6. Lyzát se rozředí HNTG (90 pg lyzátu/100 μΐ).6. Dilute the lysate with HNTG (90 pg lysate / 100 μΐ).

7. Do každé jamky se přidá 100 μΐ rozředěného lyzátu. Třepe se 60 minut.7. Add 100 μΐ of diluted lysate to each well. Shake for 60 minutes.

8. Destička se 4x omyje TBST. Bubliny a přebytečná tekutina se odstraní vytřepáním desky na papírový ručník.8. Wash plate 4 times with TBST. Bubbles and excess liquid are removed by shaking the plate on a paper towel.

9. Do každé jamky se přidá 50 μΐ IX lyzovacího pufru.9. Add 50 μL of lysis buffer to each well.

10. Provede se ředění sloučeniny/extrakty 1 : 10 v IX kinázovém pufru na 96ti-jamkové destičce.10. Dilute compound / extracts 1: 10 in 1X kinase buffer in a 96-well plate.

11. Do jamek ELISA destičky se přenese 5,5 μΐ rozředěné sloučeniny. Za stálého třepání se inkubuje při pokojové teplotě 20 min.11. Transfer 5.5 μΐ of the diluted compound to the wells of the ELISA plate. Incubate with constant shaking at room temperature for 20 min.

12. Do každé jamky se přidá 5,5 μΐ 60 μΜ roztoku ATP. Negativní kontrola neobsahuje žádné ATP. Inkubuje se 90 minut za stálého třepání.12. Add 5.5 μΐ 60 μΜ of ATP solution to each well. The negative control contains no ATP. Incubate for 90 minutes with constant shaking.

13. Destička se 4x omyje TBST. Bubliny a přebytečná tekutina se odstraní vytřepáním destičky na papírový ručník.13. Wash plate 4 times with TBST. Bubbles and excess liquid are removed by shaking the plate on a paper towel.

14. Do každé jamky se přidá 100 μΐ RC20 (v ředění 1 : 3 000 v blokovacím pufru). Za stálého třepání se inkubuje 30 minut.14. Add 100 μΐ RC20 (diluted 1: 3,000 in blocking buffer) to each well. Incubate for 30 minutes while shaking.

15. Destička se 4x omyje TBST. Bubliny a přebytečná tekutina se odstraní vytřepáním destičky na papírový ručník.15. Wash plate 4 times with TBST. Bubbles and excess liquid are removed by shaking the plate on a paper towel.

16. Do každé jamky se přidá 100 μΐ Turbo-TMB. Za stálého třepání se inkubuje 30 - 60 minut.16. Add 100 μΐ Turbo-TMB to each well. Incubate for 30 - 60 minutes while shaking.

17. Do každé jamky se přidá 100 μΐ IM H2SO4, aby se zastavila reakce.17. Add 100 μΐ IM H2SO4 to each well to stop the reaction.

18. Test se vyhodnotí na ELISA mikrofotometru Dynatech MR7000. Testovací filtr - 450 nm, referenční filtr = 410 nm.18. The assay is evaluated on a Dynatech MR7000 ELISA Microphotometer. Test filter - 450 nm, reference filter = 410 nm.

Biochemický src testBiochemical src test

Tento test se používá pro stanovení aktivity src proteinkinázy měřením fosforylace biotinylovaného peptidu jako detekční reakce.This assay is used to determine src protein kinase activity by measuring phosphorylation of a biotinylated peptide as a detection reaction.

• ·• ·

164 • · · · • 9 9 · • 9 9 9 ·164 • 9 9 9 9 9

9 · ♦··· 99 99 · ♦ ··· 98 9

Látky a činidla:Substances and Reagents:

a. Kvasinky transformované src (Sugen, lne., Redwood City, California).a. Yeast transformed src (Sugen, Inc., Redwood City, California).

b. Buněčné lyzáty: kvasinkové buňku exprimující srs se peletují, jednou omyji vodou, opět peletují a uskladní až do upotřebení při teplotě - 80°C.b. Cell lysates: yeast cell expressing hair is pelleted, washed once with water, pelleted again and stored at -80 ° C until use.

c. N-konec biotinylovaný EEEYEEYEEEYEEEYEEEY se připraví standardním postupem pracovníkům v této oblasti dobře známým.c. The N-terminal biotinylated EEEYEEYEEEYEEEYEEEY is prepared by standard procedures well known to those skilled in the art.

d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO.d. DMSO: Sigma, St. St. Louis, MO.

e. 96ti-jamková ELISA destička s plochým dnem: Corning 96 Well Easy Wash, Modified fiat Bottom Plate, Corning kat. #25805-96.e. 96-well flat bottom ELISA plate: Corning 96 Well Easy Wash, Modified fiat Bottom Plate, Corning # 25805-96.

f. 96ti-jamkové destičky NUNC na ředění sloučenin se dnem ve tvaru V: Applied Scientific Cat. #A-72092.f. NUNC 96-well plates for diluting V-bottomed compounds: Applied Scientific Cat. # A-72092.

g. Činidlo Vecastain ELITE ABC: Vector, Burlingame, CA.g. Vecastain ELITE ABC Reagent: Vector, Burlingame, CA.

h. Anti-src (327) monoklonální protilátka. Pro expresi rekombinantního Src se používá Schizosaccharomyces Pombe (Superti-Furga, et al., EMBO J., 12:2625-2634). Kmen S. Pombe SP200 (h-s leul. 32 ura4 ade210) se pěstuje popsaným způsobem a transformace pRSP exprimujících plazmidů jsou provedeny metodou lithium acetátu (Superti-Furga, supra). Buňky jsou pěstovány v přítomnosti 1 μΜ thiaminu k potlačení exprese z nmtl promotoru nebo v nepřítomnosti thiaminu pro indukci exprese.h. Anti-src (327) monoclonal antibody. Schizosaccharomyces Pombe (Superti-Furga, et al., EMBO J., 12: 2625-2634) is used to express recombinant Src. The S. Pombe SP200 strain (h-leul. 32 ura4 ade210) was grown as described, and transformations of pRSP expressing plasmids were performed by the lithium acetate method (Superti-Furga, supra). Cells are cultured in the presence of 1 μΜ thiamine to suppress expression from the nmtl promoter or in the absence of thiamine to induce expression.

i. Monoklonální protilátka proti fosfotyrosinu, UBI 05-321 (místo toho může být použita UB40).i. Monoclonal anti-phosphotyrosine antibody, UBI 05-321 (UB40 may be used instead).

j. Peroxidázový substrát Turbo TMB-ELISA: Pierce Chemical.j. Turbo TMB-ELISA Peroxidase Substrate: Pierce Chemical.

Roztoky pufrůBuffer solutions

a. PBS (Dulbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok): GIBCO PBS, GIBCO kat. # 450-1300EB.PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline): GIBCO PBS, GIBCO Cat # 450-1300EB.

b. Blokovací pufr: 5 % odtučněné mléko (Carnation) v PBS.b. Blocking Buffer: 5% Skimmed Milk (Carnation) in PBS.

165165

999 9 999999 9,999

9 9 9 9 99

9999 99 9999999 99 999

c. Uhličitanový pufr: Na₂CO₄ od Fischera, kat. # S495, připraví se 100 mM zásobní roztok.c. Carbonate Buffer: Na ₂ CO ₄ from Fischer, Cat # S495, was prepared with a 100 mM stock solution.

d. Kinázový pufr: 1,0 ml (z IM zásobního roztoku) MgCl₂, 0,2 ml (z IM zásobního roztoku) MnCl₂, 0,2 ml (z IM zásobního roztoku) DTT, 5,0 ml (z IM zásobního roztoku) HEPES, 0,1 ml TX-100 se do celkového objemu 10 ml doplní MilliQ H₂O.d. Kinase buffer: 1.0 mL (from IM stock) MgCl ₂ , 0.2 mL (from IM stock) MnCl ₂ , 0.2 mL (from IM stock) DTT, 5.0 mL (from IM stock solution) HEPES, 0.1 ml TX-100 was added to a total volume of 10 ml with MilliQ H ₂ O.

e. Lyzovací pufr: 5,0 HEPES (z IM zásobního roztoku), 2,74 ml NaCl (z 5M zásobního roztoku), 10 ml glycerolu, 0,1 ml TX-100, 0,4 ml EDTA (z 100 mM zásobního roztoku), 1,0 ml PMSF (z 100 mM zásobního roztoku), 0,1 ml Na₃VO₄ (z 0,1 M zásobního roztoku) se do celkového objemu 100 ml doplní MilliQ H₂O.e. Lysis Buffer: 5.0 HEPES (from IM stock), 2.74 mL NaCl (from 5M stock), 10 mL glycerol, 0.1 mL TX-100, 0.4 mL EDTA (from 100 mM stock) solution), 1.0 ml PMSF (from 100 mM stock solution), 0.1 ml Na ₃ VO ₄ (from 0.1 M stock solution) was added to a total volume of 100 ml with MilliQ H ₂ O.

f. ATP: Sigma kat. # A-7699, připraví se 10 mM zásobní roztok (5,51 mg/ml).f. ATP: Sigma Cat # A-7699, 10 mM stock solution (5.51 mg / ml) was prepared.

g. TRIS-HCl: Fischer kat. # BP 152-5, do 600 ml MilliQ H₂O se přidá 121,14 g materiálu, pH se upraví na 7,5 HCI a do celkového objemu 1 L se doplní MilliQ H₂O.g. TRIS-HCl: Fischer Cat. # BP 152-5, to 600 ml MilliQ _H2O add 121.14 g material, adjust pH to 7.5 with HCl and the total volume to 1 L with MilliQ supplemented H ₂ O .

h. NaCl: Fischer kat. # S271-10, připraví se 5M zásobní roztok s použitím MilliQ H₂O.h. NaCl: Fischer Cat # S271-10, a 5M stock solution was prepared using MilliQ H ₂ O.

i. Na₃VO₄: Fischer kat. # S454-50, do 80 ml MilliQ H₂O se přidá 1,8 g materiálu, pH se upraví HCI nebo NaOH na 10,0, vaří se v mikrovlnné troubě, ochladí, zkontroluje se pH, úprava pH se opakuje, dokud nezůstává po cyklu vaření a chlazení stabilní. Do celkového objemu 100 ml se doplní MilliQ H₂O, připraví se alikvotní množství 1 ml a skladuje se při teplotě - 80°C.i. On ₃ VO ₄ : Fischer cat # S454-50, to 80 ml MilliQ H ₂ O add 1.8 g of material, adjust pH to HCl or NaOH to 10.0, cook in microwave, cool, check The pH adjustment is repeated until it remains stable after the cooking and cooling cycle. MilliQ H ₂ O was added to a total volume of 100 ml, an aliquot of 1 ml was prepared and stored at -80 ° C.

j. MgCl₂: Fischer kat. # M33-500, připraví se IM zásobní roztok s použitím MilliQ H₂O.j. MgCl ₂ : Fischer Cat # M33-500, IM stock solution was prepared using MilliQ H ₂ O.

k. HEPES: Fischer kat. # BP 310-500, do 200 ml MilliQ H₂O se přidá 59,6 g materiálu, upraví se pH na 7,5, do celkového objemu 250 ml se doplní MilliQ H₂O, sterilně filtruje (IM zásobní roztok).HEPES: Fischer Cat # BP 310-500, add 59.6 g of material to 200 ml of MilliQ H ₂ O, adjust the pH to 7.5, add MilliQ H ₂ O to a total volume of 250 ml, filter sterile (IM stock solution).

l. TBST pufr: TBST pufr: do 900 ml dH₂O se přidá 6,057 g TRIS a 8,766 g NaCl, pH se upraví na 7,2 Hel, přidá se 1,0 ml Triton-X100. Do celkového objemu 1 L se doplní dH₂O.TBST buffer: TBST buffer: 6.057 g of TRIS and 8.766 g of NaCl are added to 900 ml of dH ₂ O, the pH is adjusted to 7.2 Hel, 1.0 ml of Triton-X100 is added. To a total volume of 1 L, add dH ₂ O.

166 ·<166 · <

m. MnCQ: Fischer kat. # M87-100, připraví se 1M zásobní roztok s použitím MilliQ HýO.MnCQ: Fischer Cat # M87-100, 1M stock solution was prepared using MilliQ H10.

n. DTT: Fischer kat. # BP172-5.DTT: Fischer Cat # BP172-5.

o. TBS (TRISem pufrovaný fyziologický roztok): do 900 ml MilliQ H2O se přidá 6,057 g TRIS a 8,777 g NaCl, do celkového objemu 1 L se doplní MilliQ H2O.TBS (TRIS buffered saline): add 6.057 g of TRIS and 8.777 g of NaCl to 900 ml of MilliQ H2O and make up to a total volume of 1 L with MilliQ H2O.

p. Kinázová reakční směs: množství na testovací destičku (100 jamek): 1,0 ml kinázového pufru, 200 pg GST-ζ, do celkového objemu 8,0 ml se doplní MilliQ H2O.p. Kinase Reaction Mixture: amount per assay plate (100 wells): 1.0 mL kinase buffer, 200 µg GST-do, to a total volume of 8.0 mL was supplemented with MilliQ H2O.

q. Biotin značený EEEYEEYEEEYEEEYEEEY: připraví se zásobní peptidový roztok (lmM, 2,98 mg/ml) ve vodě vždy čerstvě před upotřebením.q. Biotin labeled EEEYEEYEEEYEEEYEEEY: Prepare a stock peptide solution (1mM, 2.98 mg / ml) in water freshly before use.

r. Vectastain ELITE ABC činidlo: k přípravě 14 ml pracovního činidla se přidá 1 kapka činidla A do 15 ml TBST a promíchá se několikerým převrácením zkumavky. Pak se přidá 1 kapka činidlar. Vectastain ELITE ABC Reagent: To prepare 14 mL of working reagent, add 1 drop of Reagent A to 15 mL of TBST and mix by inverting the tube several times. Then add 1 drop of reagent

B. Zkumavka se vloží do orbitální třepačky a při pokojové teplotě se třepe po dobu 30 minut.B. Place the tube in an orbital shaker and shake at room temperature for 30 minutes.

Postupy:Progresses:

Příprava ELISA destičky povlečené src.Preparation of src coated ELISA plate.

1. ELISA destička se povléká 0,5 pg/jamka monoklonální protilátkou anti-src ve 100 μΐ uhličitanového pufru o pH 9,6 a ponechá přes noc při teplotě 4°C.1. Coat the ELISA plate with 0.5 µg / well anti-src monoclonal antibody in 100 μΐ carbonate buffer pH 9.6 and leave overnight at 4 ° C.

2. Jamky se jednou omyjí PBS.2. Wash wells once with PBS.

3. Destička se blokuje 0,15 ml 5 % mléka v PBS po dobu 30 minut při pokojové teplotě.3. Block the plate with 0.15 ml of 5% milk in PBS for 30 minutes at room temperature.

4. Destička se 5x omyje PBS.4. Wash plate 5X with PBS.

5. Do každé jamky se přidá 10 pg lyzátu kvasinek transformovaných src ředěného lyzovacím pufrem (0,1 ml celkové množství na jamku). (Množství lyzátu se může v jednotlivých várkách lišit.) Destička se třepe 20 minut při pokojové teplotě.5. Add 10 µg lysate of yeast transformed src diluted with lysis buffer (0.1 ml total per well) to each well. (The amount of lysate may vary from batch to batch.) The plate is shaken for 20 minutes at room temperature.

φφ • φ φφ φφφφ φφφ • · φ φ φφφ i srn · φφφφ φφφφφ • • • • • • • • i i i i

10/ φ φφφφ φ « φφφφ φφφ φφ φφφφ φφ φ10 / φ φφφφφφ «φφ φφφφφφφφφφφ

Příprava ELISA destičky povlečené fosfotyrosinovou protilátkou.Preparation of phosphotyrosine antibody coated ELISA plate.

1.4G10 deska: každá komůrka se pokryje 0,5 pg 4G10 v 100 μΐ PBS přes noc při teplotě 4°C a blokuje se 150 μΐ 5 % mléka v PBS po dobu 30 minut při pokojové teplotě.1.4G10 plate: cover each chamber with 0.5 µg 4G10 in 100 μΐ PBS overnight at 4 ° C and block with 150 μΐ 5% milk in PBS for 30 minutes at room temperature.

Postup kinázového testu.Kinase assay procedure.

1. Nenavázané proteiny se s destiček odstraní a destičky se 5x omyjí PBS.1. Unbound proteins are removed from the plates and the plates are washed 5 times with PBS.

2. Do každé jamky se přidá 0,08 ml kinázové reakční směsi (obsahující 10 μΐ 10X kinázového pufru a 10 μΜ (konečná koncentrace) biotinuEEEYEEYEEEYEEEYEEEY na jamku, ředěné vodou.2. Add 0.08 ml of kinase reaction mixture (containing 10 μΐ 10X kinase buffer and 10 μΜ (final concentration) of biotinEEEYEEYEEEYEEEYEEEY per well diluted with water to each well.

3. Přidá se 10 μΐ sloučeniny ředěné vodou obsahující 10 % DMSO a preinkubuje se 15 minut při pokojové teplotě.3. Add 10 μΐ of compound diluted with water containing 10% DMSO and preincubate for 15 minutes at room temperature.

4. Kinázová reakce se nastartuje přidáním 10 μΐ 0,05 mM ATP ve vodě do každé jamky (konečná koncentrace 5 μΜ ATP).4. Start the kinase reaction by adding 10 μΐ 0.05 mM ATP in water to each well (final concentration 5 μΜ ATP).

5. ELISA destička se třepe při pokojové teplotě 15 minut.5. Shake the ELISA plate at room temperature for 15 minutes.

6. Kinázová reakce se zastaví přidáním 10 μΐ 0,5 M EDTA do každé jamky.6. Stop the kinase reaction by adding 10 μΐ 0.5 M EDTA to each well.

7.90 μΐ supernatantu se přenese na povlečenou ELISA destičku blokovanou 4G 1 0.7.90 μΐ of the supernatant is transferred to a coated 4G 10 blocked ELISA plate.

8. Inkubuje se za stálého třepání 30 minut při pokojové teplotě.8. Incubate for 30 minutes at room temperature with shaking.

9. Destička se 5x omyje TBST.9. Wash plate 5X with TBST.

10. Inkubuje se s činidlem Vectastain ELITE ABC (100 μΙ/jamka) po dobu 30 minut při pokojové teplotě.10. Incubate with Vectastain ELITE ABC (100 μΙ / well) for 30 minutes at room temperature.

11. Jamky se 5x omyjí TBST.11. Wash wells 5 times with TBST.

12. Vyvine se pomocí Turbo TMB.12. Develops with Turbo TMB.

Biochemický lek testBiochemical drug test

Tento test se používá ke stanovení aktivity lek protein kinázy měřením fosforylace GST-ζ jako detekční reakce.This assay is used to determine the activity of a protein kinase by measuring the phosphorylation of GST-ζ as a detection reaction.

·· 00 • · * • 0·· 00 • · * 0

168 • · ·168 • · ·

00000000

0 0 0 00 0 0 0

0 0 0 00 0 0 0

00

Látky a činidla:Substances and Reagents:

a. Kvasinky transformované lek. K expresi rekombinantní Lek se použije Schizosaccaromyces Pombe (Superti-Furga, et al., EMBO J, 12:2625-2634, Superti-Furga, et al., Nátuře Biotech., 14:600-605). S. Pombe kmen SP200 (h-s leul. 32 ura4 ade 210) se pěstuje popsaným způsobem a transformace plazmidy exprimujícími pRSP se provede metodou lithium acetátu (Superti-Furga, supra). Buňky se pěstují v přítomnosti 1 μΜ thiaminu k indukci exprese.a. Yeast transformed with lek. Schizosaccaromyces Pombe (Superti-Furga, et al., EMBO J, 12: 2625-2634, Superti-Furga, et al., Nature Biotech., 14: 600-605) is used to express recombinant Lck. S. Pombe strain SP200 (h-leul. 32 ura4 ade 210) was grown as described, and transformation of plasmids expressing pRSP was performed by the lithium acetate method (Superti-Furga, supra). Cells are grown in the presence of 1 μΜ of thiamine to induce expression.

b. Buněčné lyzáty: kvasinkové buňky exprimující lek se peletují, jednou omyjí vodou, opět peletují a uskladní zmrazené až do upotřebení při teplotě -80°C.b. Cell lysates: yeast-expressing yeast cells are pelleted, washed once with water, pelleted again, and stored frozen at -80 ° C until use.

c. GST-ζ: DNA kódující GST-ζ fúzní protein pro expresi v bakteriích získaná od Arthura Weisse z Howard Hughes Medical Institute na University of California, San Francisco. Transformované bakterie se pěstují přes noc za stálého třepání při teplotě 25°C. GST-ζ se purifikuje glutathionovou afinitní chromatografií, Pharmacia, Alameda, CA.c. GST-ζ: DNA encoding a GST-bakter fusion protein for bacterial expression obtained from Arthur Weiss of Howard Hughes Medical Institute at the University of California, San Francisco. Transformed bacteria are grown overnight with shaking at 25 ° C. GST-ζ is purified by glutathione affinity chromatography, Pharmacia, Alameda, CA.

d. DMSO: Sigma, St. Louis, MO.d. DMSO: Sigma, St. St. Louis, MO.

e. 96ti-jamkové ELISA destičky s plochým dnem: Corning 96 Well Easy Wash, Modified Fiat Bottom Plate, Corning kat. #25805-96.e. Flat bottom 96-well ELISA plates: Corning 96 Well Easy Wash, Modified Fiat Bottom Plate, Corning # 25805-96.

f. NUNC 96ti-jamkové polypropylenové desky pro ředění sloučenin se dnem ve tvaru V: Applied Scientific Cat. # AS-72092.f. NUNC 96-well polypropylene V-bottom compound dilution plates: Applied Scientific Cat. AS-72092.

g. Purifikované králičí anti-GST antisérum: Amrad Corporation (Australia) kat. #90001605.g. Purified rabbit anti-GST antiserum: Amrad Corporation (Australia) cat. # 90001605.

h. Kozí protikráliěí protilátka (anti-Rabbit-IgG-HRP): Amersham kat. # V010301.h. Goat anti-rabbit antibody (anti-Rabbit-IgG-HRP): Amersham cat. # V010301.

i. Ovčí protimyší IgG (H+L): Jackson Labs kat. # 5215-005-003.i. Sheep anti-mouse IgG (H + L): Jackson Labs Cat # 5215-005-003.

j. Monoklonální protilátka proti Lek (3A5): Santa Cruz Biotechnology kat # sc-433.j. Monoclonal anti-Lck antibody (3A5): Santa Cruz Biotechnology cat # sc-433.

k. Monoklonální protilátka proti fosfotyrosin UBI 05-321 (místo toho může být použita UB40).Monoclonal anti-phosphotyrosine antibody UBI 05-321 (UB40 may be used instead).

• fl fl flfl• fl fl flfl

169169

Roztoky pufrů:Buffer solutions:

a. PBS (Dulbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) IX roztok: GIBCO PBS, GIBCO kat. # 450-1300EB.PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) IX solution: GIBCO PBS, GIBCO Cat # 450-1300EB.

b. Blokovací pufr: 100 g BSA, 12,1 g TRIS (pH 7,5), 58,44 g NaCl, 10 ml Tween-20, do celkového objemu 1 L se doplní MilliQ H2O.b. Blocking buffer: 100 g BSA, 12.1 g TRIS (pH 7.5), 58.44 g NaCl, 10 ml Tween-20, make up to 1 L with MilliQ H2O.

c. Uhličitanový pufr: Na₃CO₃ od Fischera, kat. # S495, připraví se 100 mM roztok s použitím MilliQ H2O.c. Carbonate Buffer: Na ₃ CO ₃ from Fischer, Cat # S495, prepare a 100 mM solution using MilliQ H2O.

d. Kinázový pufr: 1,0 ml MgCU (ze zásobního IM roztoku), 0,2 ml MnCU (ze zásobního IM roztoku), 0,2 ml DTT (ze zásobního IM roztoku), 5,0 ml HEPES (ze zásobního IM roztoku), 0,1 ml TX-100, do celkového objemu 10 ml se doplní MilliQ H2O.d. Kinase Buffer: 1.0 ml MgCU (from IM stock), 0.2 ml MnCU (from IM stock), 0.2 ml DTT (from IM stock), 5.0 ml HEPES (from IM stock) solution), 0.1 ml TX-100, to a total volume of 10 ml was added MilliQ H2O.

e. Lyzovací pufr: 5,0 HEPES (ze zásobního IM roztoku), 2,74 ml NaCl (ze zásobního 5M roztoku), 10 ml glycerolu, 1,0 ml TX-100, 0,4 ml EDTA (ze zásobního 100 mM roztoku), 1,0 ml PMSF (ze zásobního 100 mM roztoku), 0,1 ml Na₃VO4 (ze zásobního 0,1 M roztoku), do celkového objemu 100 ml se doplní MilliQ H2O.e. Lysis Buffer: 5.0 HEPES (from IM stock), 2.74 ml NaCl (from 5M stock), 10 ml glycerol, 1.0 ml TX-100, 0.4 ml EDTA (from 100 mM stock) of solution), 1.0 ml of PMSF (from a stock of 100 mM solution), 0.1 ml of Na ₃ VO4 (from a stock of 0.1 M solution), make up to a total volume of 100 ml with MilliQ H2O.

f. ATP: Sigma kat. # A-7699, připraví se 10 mM zásobní roztok (5,51 mg/ml).f. ATP: Sigma Cat # A-7699, 10 mM stock solution (5.51 mg / ml) was prepared.

g. TRIS-HCl: Fischer kat. # BP 152-5, do 600 ml MilliQ H₂O se přidá 121,14 g látky, pH se upraví HCI na 7,5, do celkového objemu 1 L se doplní MilliQ H2O.g. TRIS-HCl: Fischer Cat. # BP 152-5, to 600 ml MilliQ _H2O add 121.14 g material, adjust pH with HCl to 7.5, to 1 L total volume with MilliQ H2O completed.

h. NaCl: Fischer kat. # S271-10, připraví se 5M zásobní roztok s použitím MilliQ H2O.h. NaCl: Fischer Cat # S271-10, a 5M stock solution was prepared using MilliQ H2O.

i. Na₃VO4: Fischer kat. # S454-50, do 80 ml MilliQ H2O se přidá 1,8 g látky, pH se upraví HCI nebo NaOH na 10,0, vaří se v mikrovlnné troubě, ochladí, zkontroluje se pH a opět se upraví, dokud nezůstane po cyklu vaření a chlazení stabilní, do celkového objemu 100 ml se doplní MilliQ H2O, připraví se alikvótní množství 1 ml a skladuje se při teplotě -80°C.i. On ₃ VO4: Fischer Cat # S454-50, 1.8 g of substance are added to 80 ml of MilliQ H2O, adjusted to pH 10 with HCl or NaOH, cooked in the microwave, cooled, pH checked and readjust until stable after a cooking and cooling cycle, make up to a total volume of 100 ml with MilliQ H2O, prepare an aliquot of 1 ml and store at -80 ° C.

j. MgC12: Fischer kat. # M33-5OO, připraví se IM zásobní roztok s použitím MilliQ H2O.j. MgCl 2: Fischer Cat. # M33-500, IM stock solution was prepared using MilliQ H 2 O.

·· · ·· • ··» · ·· · · »·· • · · η · · · ············

170 .· : · : ί .· · » : ι ·♦·· ··· ·· ·*·· ·· ·4170.::: Ί. ·: Ι · · ·············· 4 4

k. HEPES: Fischer kat. # BP 310-500, do 150 ml MilliQ H₂O se přidá 30 g látky, do celkového množství 300 ml se doplní MilliQ H₂O, sterilně se filtruje (IM zásobní roztok).HEPES: Fischer Cat # BP 310-500, add 30 g of substance to 150 ml of MilliQ H ₂ O, make up to 300 ml with MilliQ H ₂ O, filter sterile (IM stock solution).

l. Albumin, hovězí (BSA), Sigma kat. # A4503, do 150 ml MilliQ H₂O se přidá 30 g látky, do celkového objemu se doplní MilliQ H₂O, filtruje přes 0,22 pm filtr, skladuje se při 4°C.Albumin, Bovine (BSA), Sigma Cat # A4503, add 30 g of substance to 150 ml of MilliQ H ₂ O, make up to volume with MilliQ H ₂ O, filter through a 0.22 µm filter, store at 4 Deň: 32 ° C.

m. TBST pufr: do 900 ml dH₂O se přidá 6,057 g TRIS a 8,766 g NaCl, pH se upraví HCI na 7,2, přidá se 1,0 ml Triton-XlOO, do celkového objemu 1 L se doplní dH₂O.TBST buffer: 6.057 g of TRIS and 8.766 g of NaCl are added to 900 ml of dH ₂ O, the pH is adjusted to 7.2 with HCl, 1.0 ml of Triton-X100 is added, and dH ₂ O is added to a total volume of 1 L. .

n. MnCl₂: Fischer kat. # M87-100, připraví se IM zásobní roztok s použitím MilliQ H₂O.n. MnCl ₂ : Fischer Cat # M87-100, IM stock solution was prepared using MilliQ H ₂ O.

o. DTT: Fischer kat. # BP172-5.DTT: Fischer Cat # BP172-5.

p. TBS (TRISem pufrovaný fyziologický roztok): do 900 ml MilliQ H₂O se přidá 6,057 g TRIS a 8,777 g NaCl, do celkového objemu 1 L se doplní MilliQ H₂O.p. TBS (TRIS Buffered Saline): to 900 ml MilliQ H ₂ O were added 6,057 g 8,777 g TRIS and NaCl to 1 L total volume with MilliQ H ₂ supplemented O.

q. Kinázová reakční směs: množství na jednu testovací destičku (100 jamek): 1,0 ml Kinázového pufru, 200 pg GST-ζ, do celkového objemu 8,0 ml se doplní MilliQ H₂O.q. Kinase reaction mixture: amount per test plate (100 wells): 1.0 mL Kinase Buffer, 200 µg GST-ζ, to a total volume of 8.0 mL, add MilliQ H ₂ O.

Postupy:Progresses:

Příprava ELISA destičky povlečené Lek.Preparation of Lek coated ELISA plates.

1. Destička se povleče ovčím protimyším IgG v množství 2,0 pg/jamka v 100 pl uhličitanového pufru o pH 9,6 a ponechá se přes noc.1. Plate 2.0 µg / well of sheep anti-mouse IgG in 100 µl of carbonate buffer pH 9.6 and leave overnight.

2. Destička se jednou omyje PBS.2. Wash plate once with PBS.

3. Destička se blokuje 0,15 ml blokovacího pufru po dobu 30 minut při pokojové teplotě.3. Block the plate with 0.15 ml blocking buffer for 30 minutes at room temperature.

4. Destička se 5x omyje PBS.4. Wash plate 5X with PBS.

5. Do každé jamky se přidá 0,5 pg anti-lck (monoklonální protilátka 3A5) v 0,1 ml PBS a ponechá 1-2 hodiny při pokojové teplotě.5. Add 0.5 µg anti-lck (monoclonal antibody 3A5) in 0.1 ml PBS to each well and leave at room temperature for 1-2 hours.

6. Destička se 5x omyje PBS.6. Wash plate 5x with PBS.

7. Do každé jamky se přidá 20 pg lyzátu kvasinek transformovaných lek v lyzovacím pufru (0,1 ml celkový objem na komůrku).7. Add 20 µg of transformed drug lysate lysate in lysis buffer (0.1 ml total volume per well) to each well.

» · • · i»· • · i

171171

C* 9 · · «>C * 9

Destička se třepe při teplotě 4°C přes noc, aby se zabránilo ztrátě aktivity.The plate was shaken at 4 ° C overnight to prevent loss of activity.

Příprava ELISA destičky povlečené fosfothyrosinovou protilátkou.Preparation of a phosphothyrosine antibody coated ELISA plate.

1.UB40 destička: 1,0 pg/jamka UB40 ve 100 μΐ PBS se ponechá přes noc při teplotě 4°C a blokuje se 150 μΐ blokovacího pufru po dobu nejméně 1 hodiny.1.UB40 plate: 1.0 µg / well UB40 in 100 μΐ PBS is left overnight at 4 ° C and blocked with 150 μΐ blocking buffer for at least 1 hour.

Postup kinázového testu:Kinase assay procedure:

1. Nenavázané proteiny se odstraní z destiček a destičky se 5x omyjí PBS.1. Unbound proteins are removed from the plates and the plates are washed 5 times with PBS.

2. Do každé jamky se přidá 0,08 ml kinázové reakění směsi (obsahující 10 μΐ 10X kinázového pufru a 2 pg GST-ζ na jamku ředěné vodou).2. Add 0.08 ml of the kinase reaction mixture (containing 10 μ 10 10X kinase buffer and 2 µg GST-ζ per well diluted with water) to each well.

3. Přidá se 10 μΐ sloučeniny ředěné vodou obsahující 10 % DMSO a preinkubuje se 15 minut při pokojové teplotě.3. Add 10 μΐ of compound diluted with water containing 10% DMSO and preincubate for 15 minutes at room temperature.

4. Nastartuje se kinázová reakce přidáním 10 μΐ/jamka 0,1 mM ATP ve vodě (konečná koncentrace 10 μΜ ATP).4. Start the kinase reaction by adding 10 μΐ / well 0.1 mM ATP in water (final concentration 10 μΜ ATP).

5. ELISA destička se třepe 60 minut při pokojové teplotě.5. Shake the ELISA plate at room temperature for 60 minutes.

6. Kinázová reakce se zastaví přidáním 10 μΐ 0,5 M EDTA do každé jamky.6. Stop the kinase reaction by adding 10 μΐ 0.5 M EDTA to each well.

7. 90 μΐ supernatantu se přenese do ELISA destičky povlečené blokovanou 4G10 podle výše uvedené části B.7. Transfer 90 μΐ of the supernatant to the blocked 4G10 coated ELISA plate according to Part B above.

8. Inkubuje se za stálého třepání 30 minut při pokojové teplotě.8. Incubate for 30 minutes at room temperature with shaking.

9. Destička se 5x omyje TBST.9. Wash plate 5X with TBST.

10.Inkubuje se s králičí anti-GST protilátkou v ředění 1:5000 ve 100 μΐ TBST po dobu 30 minut při pokojové teplotě.10. Incubate with a 1: 5000 dilution of rabbit anti-GST antibody at 100 μΐ TBST for 30 minutes at room temperature.

11. Jamky se 5x omyjí TBST.11. Wash wells 5 times with TBST.

12. Inkubuje se s kozí protikráličí protilátkou (anti-Rabbit-IgG-HRP) v ředění 1:20 000 ve 100 μΐ TBST po dobu 30 minut při pokojové teplotě.12. Incubate with a goat anti-rabbit antibody (anti-Rabbit-IgG-HRP) at a dilution of 1:20 000 in 100 μΐ TBST for 30 minutes at room temperature.

13. Jamky se 5x omyjí TBST.13. Wash wells 5 times with TBST.

172 . i : . : i i172. i:. : i i

I · · · t I ·· ···«> ·· 99I · · · t I ·· ··· «> ·· 99

14.Vyvine se pomocí Turbo TMB.14. Wrap with Turbo TMB.

Test měřením fosforylační funkce RAF.Test by measuring the phosphorylation function of RAF.

Následující test popisuje množství RAF katalyzované fosforylace svého cílového proteinu MEK a cílový MAPK tohoto MEK proteinu. Sekvence genu RAF je popsána v Bonner et al., 1985, Molec. Cell. Biol., 5:1400-1407, a je snadno dostupná v četných databankách genových sekvencí. Konstrukce vektoru nukleové kyseliny a buněčných linií použitých v této části vynálezu jsou podrobně popsány v Morrison et al., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci._USA, 85:8855-8859.The following assay describes the amount of RAF catalyzed phosphorylation of its target MEK protein and the target MAPK of that MEK protein. The sequence of the RAF gene is described in Bonner et al., 1985, Molec. Cell. Biol., 5: 1400-1407, and is readily available in numerous gene sequence databases. The construction of the nucleic acid vector and cell lines used in this part of the invention are described in detail in Morrison et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 8855-8859.

Látky a činidla:Substances and Reagents:

1. Buňky Sf9 (Spodoptera frugiperda), GIBCO-BRL, Gainthersburg,1. Sf9 cells (Spodoptera frugiperda), GIBCO-BRL, Gainthersburg,

MD.MD.

2. RIPA pufr: 20 mM TRIS/HC1 pH 7,4, 137 mM NaCI, 10 % glycerol, mM PMSF, 5 mg/L Aprotein, 0,5 % Triton X-100.2. RIPA buffer: 20 mM TRIS / HCl pH 7.4, 137 mM NaCl, 10% glycerol, mM PMSF, 5 mg / L Aprotein, 0.5% Triton X-100.

3. Thioredoxin - MEK fúzní protein (T-MEK): exprese T-MEK a purifikace afinitní chromatografií se provedou podle návodu výrobce. Katalogové # 350-01 a R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.3. Thioredoxin-MEK fusion protein (T-MEK): T-MEK expression and affinity chromatography purification were performed according to the manufacturer's instructions. Catalog # 350-01 and R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA.

4. His-MAPK (ERK 2), MAPK s navázaným histidinem jsou exprimovány v modrých buňkách XL1 transformovaných vektorem pUC18 kódujícím His-MAPK. His-MAPK se purifikuje Ni-afinitní chromatografií. Kat # 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA, jak je zde popsáno.4. His-MAPK (ERK 2), histidine-bound MAPKs are expressed in XL1 blue cells transformed with the pUC18 vector encoding His-MAPK. His-MAPK is purified by Ni-affinity chromatography. Cat # 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA as described herein.

5. Ovčí protimyši IgG: Jackson laboratiories, West Grove, PA. Katalog, # 515-006-008, Lot # 28563.5. Sheep anti-mouse IgG: Jackson laboratiories, West Grove, PA. Catalog # 515-006-008, Lot # 28563.

6. RAF-1 proteinkinázová specifická protilátka: URP2653 z UBI.6. RAF-1 protein kinase specific antibody: URP2653 from UBI.

7. Povlékací pufr: PBS, fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.7. Coating buffer: PBS, phosphate buffered saline, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD.

·· ···· ··

173173

8. Omývací pufr: TBST (50 mM Tris/HCl pH 7,2, 150 mM NaCI, 0,1 % Triton X-100).8. Wash Buffer: TBST (50 mM Tris / HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100).

9. Blokovací pufr: TBST, 0,1 % ethanolamin pH 7,49. Blocking Buffer: TBST, 0.1% ethanolamine pH 7.4

10. DMSO, Sigma, St. Louis, MO10. DMSO, Sigma. St. Louis, MO

11. Kinázový pufr (KB): 20 mM HEPES/HC1 pH 7,2, 150 mM NaCI, 0,1 % Triton X-100, 1 mM PMSF, 5 g/L A protein, 75 mM orthovanadičnan sodný, 0,5 MM DTT a 10 mM MgCl₂.11. Kinase Buffer (KB): 20 mM HEPES / HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 5 g / LA protein, 75 mM sodium orthovanadate, 0.5 MM DTT and 10 mM MgCl ₂ .

12. Směs ATP: 100 mM MgCl₂, 300 mM ATP, 10 mCi γ³³Ρ ATP (Dupont-NEN)/ml.12. Mixture of ATP: 100 mM MgCl ₂ , 300 mM ATP, 10 mCi γ ³³ Ρ ATP (Dupont-NEN) / ml.

13.Stopovací roztok: 1 % kyselina fosforečná , Fischer, Pittsburg, PA.13. Track solution: 1% phosphoric acid, Fischer, Pittsburg, PA.

14. Fosfocelulosové filtry Wallac, Wallac, Turku, Finsko.14. Phosphocellulose filters Wallac, Wallac, Turku, Finland.

15. Roztok na oplachování filtrů: 1 % kyselina fosforečná, Fischer, Pittsburgh, PA.15. Filter rinse solution: 1% phosphoric acid, Fischer, Pittsburgh, PA.

16.Sklízeči stroj Tomtec pro sklízení destiček, Wallac, Turku, Finsko.16. Tomtec plate harvesting machine, Wallac, Turku, Finland.

17. Wallac scintilační spektrofotometr na destičky, kat. # 1205,17. Wallac plate scintillation spectrophotometer, Cat # 1205,

Wallac, Turku, Finsko.Wallac, Turku, Finland.

18. NUNC 96ti-jamkové polypropylénové desky na ředění sloučenin se dnem ve tvaru V, Applied Scientific Catalog # AS-72092.18. NUNC 96-well polypropylene V-bottom compound dilution plates, Applied Scientific Catalog # AS-72092.

PostupMethod

Pokud není uvedeno jinak, provádějí se všechny následující kroky při pokojové teplotě.Unless otherwise indicated, all subsequent steps are performed at room temperature.

1. Povlékání ELISA destičky: ELISA jamky se povlékají 100 ml purifikovaného ovčího antisera s protimyší afinitou (1 mg/100 ml povlékací pufr) a ponechají přes noc při teplotě 4°C. ELISA destičky se mohou použít dva týdny, jsou-li skladovány při 4°C.1. Coating ELISA plates: ELISA wells are coated with 100 ml of purified sheep antiserum with anti-mouse affinity (1 mg / 100 ml coating buffer) and left overnight at 4 ° C. ELISA plates can be used for two weeks when stored at 4 ° C.

2. Destička se obrátí vzhůru dnem a tekutina se odstraní. Přidá se 100 ml blokovacího roztoku a inkubuje se 30 minut.2. Turn the plate upside down and discard the fluid. Add 100 ml blocking solution and incubate for 30 minutes.

3. Blokovací roztok se odstraní a destička se 4x omyje omývacím pufrem. Přebytečná tekutina se odstraní poklepáním destičky na papírový ručník.3. Remove blocking solution and wash plate 4 times with wash buffer. Excess fluid is removed by tapping the plate on a paper towel.

• · ·· ί* · * · ·'• · ·· ί * · * · · '

174 : ’ ϊ t .* · i : i <4·· ··» ·· ♦·*♦ ·* ·*174: ’.... 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4. Do každé jamky se přidá 1 mg RAF-1 specifické protilátky a inkubuje se 1 hodinu. Omyje se jako v kroku 3.4. Add 1 mg of RAF-1 specific antibody to each well and incubate for 1 hour. Wash as in step 3.

5. Lyzáty Sf9 buněk infikovaných RAS/RAF se rozmrazí a naředí TBST na 10 mg/100 ml. Do jamek se přidá 10 mg ředěného lyzátu a inkubuje se 1 hodinu. Během inkubace se deska třepe. Negativní kontrola neobsahuje žádný lyzát. Lyzáty Sf9 buněk infikovaných RAS/RAF se připraví poté, co se buňky infikují rekombinantním bakulovirem při MOI 5 pro každý virus a sklidí se po 48 hodinách. Buňky se jednou omyjí PBS a lyžují v RIPA pufru. Nerozpustné látky se odstraní centrifugací (5 minut při 10 000 x g). Alikvótní množství lyzátu se zmrazí na suchém ledu/etanolu a skladují do upotřebení při teplotě -80°C.5. Thaw Lysates of Sf9 cells infected with RAS / RAF are thawed and diluted with TBST to 10 mg / 100 ml. 10 mg of diluted lysate is added to the wells and incubated for 1 hour. The plate is shaken during incubation. The negative control contains no lysate. Lysates of Sf9 cells infected with RAS / RAF are prepared after cells are infected with recombinant baculovirus at MOI 5 for each virus and harvested after 48 hours. Cells are washed once with PBS and lysed in RIPA buffer. Insoluble matter was removed by centrifugation (5 minutes at 10,000 x g). Aliquots of lysate are frozen on dry ice / ethanol and stored at -80 ° C until use.

6. Nenavázané látky se odstraní a destička se omyje podle výše uvedeného postupu (krok 3).6. Remove unbound material and wash plate as described above (step 3).

7. Do každé jamky se přidá 2 mg T-MEK a 2 mg His-MAEPK a objem se upraví na 40 ml kinázovým pufrem. Metody purifikace T-MEK a MAPK z buněčných extraktů jsou zde popsány v příkladu.7. Add 2 mg of T-MEK and 2 mg of His-MAEPK to each well and adjust the volume to 40 ml with kinase buffer. Methods for purifying T-MEK and MAPK from cell extracts are described herein in the Example.

8. Předředí se sloučeniny (zásobní roztok 10 mg/ml DMSO) nebo extrakty 20 x v TBST s 1 % DMSO. Do každé jamky se přidá 5 ml předředěných sloučenin/extraktů postupem popsaným v kroku 6. Inkubuje se 20 minut. Kontroly neobsahují žádné léčivo.8. Dilute compounds (10 mg / mL DMSO stock) or extracts 20X in TBST with 1% DMSO. 5 ml of the pre-diluted compounds / extracts were added to each well as described in step 6. Incubate for 20 minutes. Controls contain no drug.

9. Kinázová reakce se odstartuje přidáním 5 ml směsi ATP. ELISA destičky se během inkubace třepají na ELISA třepačce.9. Start the kinase reaction by adding 5 ml of ATP mixture. ELISA plates are shaken on an ELISA shaker during incubation.

10. Kinázová reakce se zastaví po 60 minutách přidáním 30 ml stopovacího roztoku do každé jamky.10. The kinase reaction is stopped after 60 minutes by adding 30 ml of stop solution to each well.

11. Na ELISA destičku se v Tomtec sklízecím zařízení umístí fosfocelulosový filtr. Deska se sklidí a filtr se omyje roztokem na omývání filtru podle doporučení výrobce. Filtry se usuší. Filtry se upevní do držáku. Držák se vloží do přístroje na detekci radioaktivity a kvantifikuje se radioaktivní fosfor na filtrech.11. Place a phosphocellulose filter in an Tomtec Harvester on an ELISA plate. Harvest the plate and wash the filter with a filter wash solution as recommended by the manufacturer. The filters are dried. The filters are mounted in the holder. The holder is placed in a radioactivity detector and the radioactive phosphorus on the filters is quantified.

Může se rovněž postupovat tak, že se 40 ml alikvóty z jednotlivých jamek testovací destičky přenesou na odpovídající místo na fosfocelulosovém filtru. Po vysušení filtrů vzduchem se filtry položí • · na tác. Tác se jemně kývá, omývací roztok se vyměňuje každých 15 minut po dobu 1 hodiny. Filtry se osuší vzduchem, upevní se do držáku vhodného pro měření radioaktivního fosforu ve vzorcích. Držák se vloží do detekčního zařízení a kvantifikuje se radioaktivní fosfor na filtrech.Alternatively, 40 ml aliquots from individual wells of the assay plate are transferred to the appropriate location on the phosphocellulose filter. After air drying the filters, place the filters on a • tray. The tray is rocked gently, and the wash solution is changed every 15 minutes for 1 hour. The filters are air dried, mounted in a holder suitable for measuring radioactive phosphorus in the samples. The holder is placed in a detection device and the radioactive phosphorus on the filters is quantified.

CDK2/Cyklin A - Inhibiční testCDK2 / Cyclin A - Inhibition test

Tento test analyzuje proteinkinázovou aktivitu CDK2 v exogenním substrátu.This assay analyzes the protein kinase activity of CDK2 in an exogenous substrate.

Činidla:Reagents:

A. Pufr A: (80 mMTris (pH 7,2), 40 mM MgCl₂), 4,84 g Tris (F.W. = 121,1 g/mol), 4,07 g MgCl₂ (F.W. = 203,31 g/mol) rozpuštěné v 500 ml H₂O. Hodnota pH se upraví HC1 na 7,2.A. Buffer A: (80 mM Tris (pH 7.2), 40 mM MgCl ₂ ), 4.84 g Tris (FW = 121.1 g / mol), 4.07 g MgCl ₂ (FW = 203.31 g) dissolved in 500 ml H ₂ O. The pH is adjusted to 7.2 with HCl.

B. Roztok histonu H1 (0,45 mg/ml histonu H1 a 20 mM HEPES pH 7,2 (477 mg HEPES (F.W. = 238,3 g/mol) rozpuštěné v 100 ml ddH₂O, uskladněný v 1 ml alikvótech při teplotě -80°C.B. Histone H1 solution (0.45 mg / ml histone H1 and 20 mM HEPES pH 7.2) (477 mg HEPES (FW = 238.3 g / mol) dissolved in 100 ml ddH ₂ O, stored in 1 ml aliquots at temperature -80 ° C.

C. Roztok ATP (60 μΜ ATP, 300 pg/ml BSA, 3 mM DTT): 120 μΐ 10 mM ATP, 600 μΐ 10 mg/ml BSA do 20 ml, uskladněný v 1 ml alikvótech při teplotě -80°C.C. ATP solution (60 μΜ ATP, 300 µg / ml BSA, 3 mM DTT): 120 μΐ 10 mM ATP, 600 μΐ 10 mg / ml BSA to 20 ml, stored in 1 ml aliquots at -80 ° C.

D. Roztok CDK2: cdk2/cyklin A v 10 mM HEPES pH 7,2, 25 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 10 % glycerol, uskladněný v 9 μΐ alikvótech při teplotě -80°C.D. CDK2: cdk2 / cyclin A solution in 10 mM HEPES pH 7.2, 25 mM NaCl, 0.5 mM DTT, 10% glycerol, stored in 9 μ 9 aliquots at -80 ° C.

ProtokolProtocol

1. Připraví se trojnásobný objem roztoků inhibitorů v požadované konečné koncentraci v ddH₂O/15 % DMSO.1. Prepare three times the volume of inhibitor solutions at the desired final concentration in ddH ₂ O / 15% DMSO.

2. Do jamek 96ti-jamkových destiček se vpraví 20 μΐ inhibitorů (nebo 20 μΐ 15 % DMSO pro pozitivní a negativní kontrolu).2. Add 20 μΐ inhibitors (or 20 μΐ 15% DMSO for positive and negative controls) to the wells of 96-well plates.

176 · 9 9176 · 9 9

14« 1»13 «1»

9 9 9-99 49 9 9-99 4

3. Rozmrazí se roztok histonu HI (1 ml/destička), roztok ATP (1 ml/destička plus 1 alikvót pro negativní kontrolu) a roztok CDK2 (9 μΐ/destička). CDK2 se uchovává až do použití na ledu. Správné rozdělení roztoku CDK2 na alikvótní množství zamezí opakování cyklu zmrazení - rozmražení.3. Thaw histone HI solution (1 ml / plate), ATP solution (1 ml / plate plus 1 negative control aliquot) and CDK2 solution (9 μΐ / plate). CDK2 is stored on ice until use. Properly dividing the CDK2 solution into an aliquot avoids repeating the freeze-thaw cycle.

4.9 μΐ roztoku CDK2 se rozředí 2,1 ml pufru A (na každou destičku). Roztok se míchá a do každé jamky se vpraví 20 μΐ.Dilute 4.9 μΐ of CDK2 solution with 2.1 ml of buffer A (per plate). Stir the solution and introduce 20 μΐ into each well.

5. 1 ml roztoku histonu HI se smíchá s 1 ml roztoku ATP (na jednu destičku) ve zkumavce se šroubovacím uzávěrem. Přidá se γ P ATP do koncentrace 0,15 pCi/20 μΐ. (0,15 pCi na každou jamku v testu). Zpěnění BSA se zamezí opatrným mícháním. Do příslušných jamek se přidá 20 μΐ. Desky se promíchají na deskové třepačce. Pro negativní kontrolu se smíchá roztok ATP se stejným množstvím 20 mM HEPES pH 7,2 a přidá se γ³³Ρ ATP do koncentrace 0,15 pCi/20 μΐ roztoku. Do příslušných jamek se přidá 20 μΐ.5. Mix 1 ml of histone HI solution with 1 ml of ATP solution (per plate) in a screw cap tube. Add γ P ATP to a concentration of 0.15 pCi / 20 μΐ. (0.15 pCi per well in the assay). BSA foaming is avoided by careful mixing. Add 20 μΐ to the appropriate wells. The plates are mixed on a plate shaker. For negative control, mix the ATP solution with an equal amount of 20 mM HEPES pH 7.2 and add γ ³³ Ρ ATP to a concentration of 0.15 pCi / 20 μΐ of solution. Add 20 μΐ to the appropriate wells.

6. Reakce se nechá probíhat 60 minut.6. Allow the reaction to proceed for 60 minutes.

7. Do každé jamky se přidá 35 μΐ 10 % TCA. Destičky se míchají na deskové třepačce.7. Add 35 μΐ 10% TCA to each well. The plates are mixed on a plate shaker.

8. Na čtvercové filtry P30 se umístí z každého vzorku 40 μΐ. Filtry se nechají uschnout (přibližně 10-20 minut).8. Place 40 μΐ of each sample on the P30 square filters. The filters are allowed to dry (approximately 10-20 minutes).

9. Filtry se omývají 4 x 10 minut 250 ml 1 % kyseliny fosforečné (10 ml kyseliny fosforečné na litr ddH₂O).9. Wash the filters for 4 x 10 minutes with 250 ml of 1% phosphoric acid (10 ml of phosphoric acid per liter of ddH ₂ O).

10. Filtry se odečtou pomocí scintilačního spektrofotometru na odečítání destiček.10. Read the filters using a plate reader scintillation counter.

Buněčné/biologické testyCellular / biological tests

PDGF-Indukovaný BrdU Inkorporační testPDGF-Induced BrdU Incorporation Test

Látky a činidla:Substances and Reagents:

(1) Lidský PDGF B/B, 1276-956, Boehringer Mannheim, Německo.(1) Human PDGF B / B, 1276-956, Boehringer Mannheim, Germany.

(2) BfrU značící činidlo: 10 mM, v PBS (pH 7,4), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.(2) BfrU labeling reagent: 10 mM, in PBS (pH 7.4), Cat. No. 1,647,229, Boehringer Mannheim, Germany.

177 (3) FixDenat: fixační roztok (připravený k použití), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo..177 (3) FixDenat: fixative solution (ready to use), Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(4) Anti-BrdU-POD: myší monoklonální protilátka konjugovaná peroxidázou, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo..(4) Anti-BrdU-POD: mouse peroxidase-conjugated mouse monoclonal antibody, Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(5) TMB substrátový roztok: tetramethylbenzidin (TMB), připravený k použití, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo..(5) TMB substrate solution: tetramethylbenzidine (TMB), ready to use, Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(6) PBS omývací roztok: 1XPBS, pH 7,4 (Sugen, Include, Redwood City, California).(6) PBS wash solution: 1XPBS, pH 7.4 (Sugen, Include, Redwood City, California).

(7) Albumin, hovězí (BSA): prášková V, frakce, A-8551, Sigma Chemical Co., USA.(7) Albumin, bovine (BSA): powder V, fraction, A-8551, Sigma Chemical Co., USA.

(8) 3T3 buněčná linie geneticky upravená pro expresi lidského PDGFR.(8) A 3T3 cell line genetically engineered to express human PDGFR.

Protokol (1) Buňky se vysejí v množství 8000 buněk/jamka v DMEM, 10 % CS, 2 mM Gin na 96ti-jamkovou destičku. Buňky se inkubují přes noc při teplotě 37°C v 5 % CO₂.Protocol (1) Cells are seeded at 8000 cells / well in DMEM, 10% CS, 2 mM Gln per 96-well plate. Cells are incubated overnight at 37 ° C in 5% CO ₂ .

(2) Po 24 hodinách se buňky omyjí PBS, poté se nechají hladovět v bezsérovém mediu 24 hodiny (0 % CS DMEM s 0,1 % BSA).(2) After 24 hours, cells are washed with PBS, then starved in serum-free medium for 24 hours (0% CS DMEM with 0.1% BSA).

(3) Třetí den se k buňkám přidá současně ligand (PDGF, 3,8 nM, připravený v DMEM s 0,1 % BSA) a testované sloučeniny. Do komůrek s negativní kontrolou se dá pouze bezsérové DMEM s 0,1 % BSA, do komůrek s pozitivní kontrolou se dá ligand (PDGF), ale nedá se žádná testovaná sloučenina. Testované sloučeniny jsou připraveny v bezsérovém DMEM s ligandem na 96ti-jamkové destičce a postupně ředěny do 7 testovaných koncentrací.(3) On day 3, ligand (PDGF, 3.8 nM, prepared in DMEM with 0.1% BSA) and test compound were added simultaneously to the cells. Only serum-free DMEM with 0.1% BSA is added to the negative control wells, and the ligand (PDGF) is added to the positive control wells, but no test compound is given. Test compounds are prepared in serum-free DMEM with a 96-well ligand and serially diluted to 7 test concentrations.

(4) Po 20 hodinách aktivace ligandu se přidá ředěné BrdU značící činidlo (1:100 v DMEM, 0,1 % BSA) a buňky se inkubují s BrdU (konečná koncentrace = 10 mM) po dobu 1,5 hodiny.(4) After 20 hours of ligand activation, diluted BrdU labeling reagent (1: 100 in DMEM, 0.1% BSA) is added and the cells are incubated with BrdU (final concentration = 10 mM) for 1.5 hours.

(5) Po inkubací se značícím činidlem se medium odstraní dekantací a vytřepáním obrácené destičky na papírový ručník. Přidá se(5) After incubation with the labeling reagent, the medium is removed by decanting and shaking the inverted plate onto a paper towel. It will be added

178 * · · « φ ·· 9» • * « · « · · * Φ · Φ * · · · φφφ • · φ · · · φ · ·178 * · · · 9 · * · φ · φ · φ · φ · φ · φ ·

Φ · · Φ « φ φ ·<►*· ··· ·* ««»» «· φΦ · Φ <<► ► ► ► ► ► ► ► ►

FixDenat roztok (50 μΙ/komůrka) a destičky se inkubují při pokojové teplotě 45 minut na deskové třepačce.FixDenat solution (50 μΙ / well) and plates are incubated at room temperature for 45 minutes on a plate shaker.

(6) FixDenat roztok se důkladně odstraní dekantací a vytřepáním obrácené destičky na papírový ručník. Přidá se mléko (5 % dehydratované mléko v PBS, 200 μΙ/jamka) jako blokovací pufr a destička se inkubuje 30 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.(6) FixDenat solution is thoroughly removed by decanting and shaking the inverted plate onto a paper towel. Milk (5% dehydrated milk in PBS, 200 μΙ / well) is added as blocking buffer and the plate is incubated for 30 minutes at room temperature on a plate shaker.

(7) Blokovací roztok se odstraní dekantací a buňky se jednou omyjí PBS. Přidá se roztok anti-BrdU-POD (ředění 1:100 v PBS, 1 % BSA) a destička se inkubuje 90 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.(7) The blocking solution is removed by decantation and the cells are washed once with PBS. Anti-BrdU-POD solution (1: 100 dilution in PBS, 1% BSA) is added and the plate is incubated for 90 minutes at room temperature on a plate shaker.

(8) Konjugovaná protilátka se důkladně odstraní dekantací a jamky se 5 x smočí PBS, destička se vysuší překlopením a vytřepáním na papírový ručník.(8) The conjugated antibody is removed thoroughly by decantation and the wells are wetted 5 times with PBS, the plate is dried by flipping and shaking on a paper towel.

(9) Přidá se TMB substrátový roztok (100 μΙ/jamka) a inkubuje se 20 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce, dokud se nevyvine zabarvení dostatečné pro fotometrickou detekci.(9) Add TMB substrate solution (100 μΙ / well) and incubate for 20 minutes at room temperature on a plate shaker until a sufficient color for photometric detection is developed.

(10) Absorbance vzorků se měří při 410 nm (jako referenční vlnová délka v modu dvojité vlnové délky se čtecím filtrem 490 nm) na Dynatech čtecím zařízení pro destičky ELISA.(10) The absorbance of the samples is measured at 410 nm (as a reference wavelength in double wavelength mode with a 490 nm read filter) on a Dynat ELISA plate reader.

EGF-indukovaný BrdU inkorporační testEGF-induced BrdU incorporation assay

Látky a činidla (1) EGF: myší EGF, 201, Toyobo, Co., Ltd. Japonsko.Substances and Reagents (1) EGF: Mouse EGF, 201, Toyobo, Co., Ltd. Japan.

(2) BrdU značící činidlo: 10 mM, v PBS (pH 7,4), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.(2) BrdU labeling reagent: 10 mM, in PBS (pH 7.4), Cat. No. 1,647,229, Boehringer Mannheim, Germany.

(3) FixDenat: fixační roztok (připravený k použití), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.(3) FixDenat: fixative solution (ready to use), Cat. No. 1,647,229, Boehringer Mannheim, Germany.

(4) Anti-BrdU-POD: myší monoklonální protilátka konjugovaná peroxidázou, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo..(4) Anti-BrdU-POD: mouse peroxidase-conjugated mouse monoclonal antibody, Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

(5) TMB substrátový roztok: tetramethylbenzidin (TMB), připravený k použití, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Něšmecko.(5) TMB substrate solution: tetramethylbenzidine (TMB), ready to use, Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany.

179179

··*>·· *>

(6) PBS omývací roztok: IX PBS, pH 7,4 (Sugen, lne., Redwood City, California).(6) PBS wash solution: 1X PBS, pH 7.4 (Sugen, Inc., Redwood City, California).

(7) Albumin, hovězí (BSA): prášková V. frakce, A-855 1, Sigma Chemical Co., USA.(7) Albumin, bovine (BSA): powdered V fraction, A-855 1, Sigma Chemical Co., USA.

(8) 3T3 buněčná linie geneticky upravená pro expresi lidské EGF-R.(8) A 3T3 cell line engineered to express human EGF-R.

Protokol (1) Buňky se vysejí na 96ti-jamkovou destičku v množství 8 000 buněk/jamka v 10 % CS, 2 mM Gin v DMEM. Buňky se inkubují přes noc při teplotě 37°C v 5 % CO₂.Protocol (1) Cells are seeded in a 96-well plate at 8,000 cells / well in 10% CS, 2 mM Gln in DMEM. Cells are incubated overnight at 37 ° C in 5% CO ₂ .

(2) Po 24 hodinách se buňky omyjí PBS a poté se nechají hladovět v bezsérovém mediu (0 % CS DMEM s 0,1 % BSA) po dobu 24 hodin.(2) After 24 hours, cells are washed with PBS and then starved in serum-free medium (0% CS DMEM with 0.1% BSA) for 24 hours.

(3) Třetí den se k buňkám současně přidá ligand (EGF, 2 nM, připravený v DMEM s 0,1 % BSA) a testované sloučeniny. Do jamek s negativní kontrolou se dá pouze ligand (EGF) bez testovaných sloučenin. Testované sloučeniny jsou připraveny v bezsérovém DMEM s ligandem na 96ti-jamkové destičce a postupně ředěny na 7 testovaných koncentrací.(3) On day 3, ligand (EGF, 2 nM, prepared in DMEM with 0.1% BSA) and test compounds were added simultaneously to the cells. Only ligand (EGF) without test compounds is added to the negative control wells. Test compounds are prepared in serum-free DMEM with a ligand in a 96-well plate and serially diluted to 7 test concentrations.

(4) Po 20 hodinách aktivace ligandem se přidá ředěné BrdU značící činidlo (1:100 v DMEM, 0,1 % BSA) a buňky se inkubují s BrdU (konečná koncentrace = 10 μΜ) po dobu 1,5 hodiny.(4) After 20 hours of ligand activation, dilute BrdU labeling reagent (1: 100 in DMEM, 0.1% BSA) is added and the cells are incubated with BrdU (final concentration = 10 μΜ) for 1.5 hours.

(5) Po inkubaci se značícím činidlem se medium odstraní dekantací, převrácením a vytřepáním destičky na papírový ručník. Přidá se roztok FixDenat (50 μΐ/jamka) a destičky se inkubují při pokojové teplotě 45 minut na deskové třepačce.(5) After incubation with the labeling reagent, the medium is removed by decanting, inverting and shaking the plate onto a paper towel. FixDenat solution (50 μΐ / well) is added and the plates are incubated at room temperature for 45 minutes on a plate shaker.

(6) Roztok FixDenat se důkladně odstraní dekantací a vytřepáním převrácené destičky na papírový ručník. Jako blokovací pufr se přidá mléko (5 % dehydratované mléko v PBS, 200 μΐ/jamka) a deska se inkubuje 30 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.(6) Remove FixDenat solution thoroughly by decanting and shaking the inverted plate onto a paper towel. Milk (5% dehydrated milk in PBS, 200 μΐ / well) is added as blocking buffer and the plate is incubated for 30 minutes at room temperature on a plate shaker.

(7) Blokovací pufr se odstraní dekantací a jamky se jednou opláchnou PBS. Přidá se (100 μΐ/jamka) roztok anti-BrdU-POD (ředění 1:100(7) Blocking buffer is removed by decantation and the wells are rinsed once with PBS. Add (100 μΐ / well) anti-BrdU-POD solution (1: 100 dilution)

Φ · · « •ΦΦ · · • Φ

Φ ΦΦ Φ

ΦΦ

Φ 4 • ΦΦ 4 • Φ

180180

Φ* v PBS), 1 % BSA) a destička se inkubuje 90 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.PBS * in PBS), 1% BSA) and the plate is incubated for 90 minutes at room temperature on a plate shaker.

(8) Konjugovaná protilátka se důkladně odstraní dekantací a 5 x omytím jamek PBS. Destička se usuší převrácením a vyklepáním na papírový ručník.(8) The conjugated antibody is removed thoroughly by decanting and washing the wells 5 times with PBS. The plate is dried by inverting and tapping on a paper towel.

(9) Přidá se substrátový roztok TMB (100 μΐ/jamka) a inkubuje se 20 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce, dokud se nevyvine zabarvení dostatečné pro fotometrickou detekci.(9) Add TMB substrate solution (100 μΐ / well) and incubate for 20 minutes at room temperature on a plate shaker until sufficient color for photometric detection is developed.

(10) Absorbance vzorků se měří při 410 nm (v modu dvojité vlnové délky se čtecím filtrem při 490 nm jako referenční vlnové délce) na Dynatech mikrofotometru pro ELISA destičky.(10) The absorbance of the samples is measured at 410 nm (in double-wavelength mode with a read filter at 490 nm as reference wavelength) on a Dynatech Microphotometer for ELISA plates.

EGF-indukovaná Her2-řízená inkorporace BrdUEGF-induced Her2-driven BrdU incorporation

Látky a činidla (1) EGF: myší EGF, 201, Tyobo, Co. Ltd. Japonsko.Agents and Reagents (1) EGF: Mouse EGF, 201, Tyobo, Co. Ltd. Japan.

(2) BrdU značící činidlo: 10 mM, v PBS (pH 7,4), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.(2) BrdU labeling reagent: 10 mM, in PBS (pH 7.4), Cat. No. 1,647,229, Boehringer Mannheim, Germany.

(3) FixDenat: fixační roztok (připravený k použití), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.(3) FixDenat: fixative solution (ready to use), Cat. No. 1,647,229, Boehringer Mannheim, Germany.

(4) Anti-BrdU-POD: myší monoklonální protilátka konjugovaná peroxidázou, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.(4) Anti-BrdU-POD: mouse peroxidase-conjugated mouse monoclonal antibody, Cat. No. 1,647,229, Boehringer Mannheim, Germany.

(5) TMB substrátový roztok: tetramethylbenzidin (TMB), připravený k použití, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.(5) TMB substrate solution: tetramethylbenzidine (TMB), ready to use, Cat. No. 1,647,229, Boehringer Mannheim, Germany.

(6) PBS omývací roztok: IX PBS, pH 7,4, připravený na místě.(6) PBS wash solution: 1X PBS, pH 7.4, prepared on site.

(7) Albumin, hovězí (BSA): prášková V. frakce, A-855 1, Sigma Chemical Co., USA.(7) Albumin, bovine (BSA): powdered V fraction, A-855 1, Sigma Chemical Co., USA.

(8) 3T3 buněčná linie geneticky upravená pro expresi chimérického receptoru majícího extracelulární doménu EGR-R a intracelulámí doménu Her2.(8) a 3T3 cell line genetically engineered to express a chimeric receptor having the extracellular domain of EGR-R and the intracellular domain of Her2.

• · φ ♦• · φ ♦

181 • »181 • »

Protokol (1) Buňky se vysejí na 96ti-jamkovou destičku v množství 8000 buněk/jamka, 10 % CS, 2 mM Gin. Buňky se inkubují přes noc při teplotě 37°C v 5 % CO₂.Protocol (1) Cells are seeded in a 96-well plate at 8000 cells / well, 10% CS, 2 mM Gln. Cells are incubated overnight at 37 ° C in 5% CO ₂ .

(2) Po 24 hodinách se buňky opláchnou PBS a nechají se hladovět v bezsérovém mediu (0 % CS DMEM s 0,1 % BSA) 24 hodin.(2) After 24 hours, cells are rinsed with PBS and starved in serum-free medium (0% CS DMEM with 0.1% BSA) for 24 hours.

(3) Třetí den se k buňkám současně přidá ligand (EGF = 2 nM, připravený v DMEM s 0,1 % BSA) a testované sloučeniny. Do jamek s negativní kontrolou se přidá pouze bezsérové DMEM s 0,1 % BSA, do jamek s pozitivní kontrolou se přidá ligand (EGF), ale nepřidají se žádné testované sloučeniny. Testované sloučeniny se připraví v bezsérovém DMEM s ligandem na 96ti-jamkové destičce a postupně se ředí do 7 testovaných koncentrací.(3) On day 3, ligand (EGF = 2 nM, prepared in DMEM with 0.1% BSA) and test compounds were added simultaneously to the cells. Only serum-free DMEM with 0.1% BSA is added to the negative control wells, ligand (EGF) is added to the positive control wells, but no test compounds are added. Test compounds are prepared in serum-free DMEM with a ligand in a 96-well plate and are serially diluted to 7 test concentrations.

(4) Po 20 hodinách aktivace ligandem se přidá ředěné značící činidlo BrdU (1:100 v DMEM, 0,1 % BSA) a buňky se inkubují s BrdU (konečná koncentrace = 10 μΜ) po dobu 1,5 hodiny.(4) After 20 hours of ligand activation, dilute BrdU labeling reagent (1: 100 in DMEM, 0.1% BSA) is added and the cells are incubated with BrdU (final concentration = 10 μΜ) for 1.5 hours.

(5) Po inkubaci se značícím činidlem se medium odstraní dekantací, vytřepáním a vyklepáním destičky na papírový ručník. Přidá se roztok FixDenat (50 μΐ/jamka) a destičky se inkubují při pokojové teplotě 45 minut na deskové třepačce.(5) After incubation with the labeling reagent, the medium is removed by decanting, shaking and tapping the plate onto a paper towel. FixDenat solution (50 μΐ / well) is added and the plates are incubated at room temperature for 45 minutes on a plate shaker.

(6) Roztok FixDenat se důkladně odstraní dekantací a vytřepáním převrácené destičky na papírový ručník. Přidá se mléko jako blokovací pufr (5 % dehydratované mléko v PBS, 200 μΐ/jamka) a destička se inkubuje 30 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.(6) Remove FixDenat solution thoroughly by decanting and shaking the inverted plate onto a paper towel. Add milk as blocking buffer (5% dehydrated milk in PBS, 200 μΐ / well) and incubate the plate for 30 minutes at room temperature on a plate shaker.

(7) Blokovací roztok se odstraní dekantací a jamky se jednou opláchnou PBS. Přidá se roztok (100 μΐ/jamka) anti-BrdU-POD (ředění 1:100, 1% BSA) a destička se inkubuje při pokojové teplotě 90 minut na deskové třepačce.(7) The blocking solution is removed by decantation and the wells are rinsed once with PBS. Add anti-BrdU-POD solution (100 μΐ / well) (1: 100 dilution, 1% BSA) and incubate the plate at room temperature for 90 minutes on a plate shaker.

(8) Konjugovaná protilátka se důkladně odstraní dekantací a 5x opláchnutím komůrek PBS, destička se osuší převrácením a vyklepáním na papírový ručník.(8) The conjugated antibody is removed thoroughly by decanting and rinsing the PBS wells 5 times, the plate is dried by inverting and tapping on a paper towel.

182182

(9) Přidá se TMB substrátový roztok (100 μΐ/jamka) a inkubuje se 20 minut při pokojové teplotě na destičkové třepačce, dokud se nevyvine zabarvení dostatečné pro fotometrickou detekci.(9) Add TMB substrate solution (100 μ 100 / well) and incubate for 20 minutes at room temperature on a plate shaker until a sufficient color for photometric detection is developed.

(10) Absorbance vzorků se měří při 410 nm (v modu dvojité vlnové délky se čtecím filtrem při 490 nm jako referenční vlnové délky) na Dynatech mikrofotometru pro ELISA destičky.(10) The absorbance of the samples is measured at 410 nm (in a double wavelength mode with a read filter at 490 nm as reference wavelength) on a Dynatech Microphotometer for ELISA plates.

IGF 1-indukovaný BrdU inkorporační testIGF 1-induced BrdU incorporation assay

Látky a činidla (1) IGF1 ligand: lidský rekombinantní G51 1, Promega Corp. USA.Substances & Reagents (1) IGF1 Ligand: Human Recombinant G51 1, Promega Corp. USA.

(2) BrdU značící činidlo: 10 mM v PBS (pH 7,4), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.(2) BrdU labeling reagent: 10 mM in PBS (pH 7.4), Cat. No. 1,647,229, Boehringer Mannheim, Germany.

(3) FixDenat: fixační roztok (připravený k použití), Kat. ě. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.(3) FixDenat: fixative solution (ready to use), Cat. E. 1,647,229, Boehringer Mannheim, Germany.

(4) Anti-BrdU-POD: myší monoklonální protilátka konjugovaná peroxidázou, Kat. ě. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.(4) Anti-BrdU-POD: mouse peroxidase-conjugated mouse monoclonal antibody, Cat. E. 1,647,229, Boehringer Mannheim, Germany.

(5) TMB substrátový roztok: tetramethylbenzidin (TMB), připravený k použití, Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo.(5) TMB substrate solution: tetramethylbenzidine (TMB), ready to use, Cat. No. 1,647,229, Boehringer Mannheim, Germany.

(6) PBS omývací roztok: IX PBS, pH 7,4, (Sugen, lne. Redwooed City, California).(6) PBS wash solution: 1X PBS, pH 7.4, (Sugen, Inc., Redwooed City, California).

(7) Albumin hovězí (BSA): prášková V. frakce, A-855 1, Sigma Chemical Co., USA.(7) Bovine albumin (BSA): powdered V fraction, A-855 1, Sigma Chemical Co., USA.

(8) 3T3 buněčná linie geneticky upravená pro expresi lidského IGF-1 receptoru.(8) A 3T3 cell line genetically engineered to express the human IGF-1 receptor.

Protokol (1) Buňky se vysejí na 96ti-jamkovou desku v množství 8000 buněk/jamka v DMEM, 10 % CS, 2 mM Gin. Buňky se inkubují přes noc při 37°C v 5 % CO₂.Protocol (1) Cells are plated in a 96-well plate at 8000 cells / well in DMEM, 10% CS, 2 mM Gln. Cells are incubated overnight at 37 ° C in 5% CO ₂ .

(2) Po 24 hodinách se buňky omyjí PBS a nechají se hladovět v bezsérovém mediu (0 % CS DMEM s 0,1 % BSA) 24 hodin.(2) After 24 hours, cells are washed with PBS and starved in serum-free medium (0% CS DMEM with 0.1% BSA) for 24 hours.

183 • · · · « ♦ · ··«» «*» *· ·«·· «t (3) Třetí den se k buňkám přidá společně ligand (IGF1 = 3,3 nM připravený v DMEM s 0,1 % BSA) a testovací sloučeniny. Do jamek s negativní kontrolou se dá pouze bezsérové DMEM s 0,1 % BSA, do jamek s pozitivní kontrolou se dá ligand (IGF 1), ale nedají se žádné testované sloučeniny. Testované sloučeniny se připraví v bezsérovém DMEM s ligandem na 96ti-jamkové destičce a postupně se ředí do 7 testovaných koncentrací.183 (3) On day 3, a ligand (IGF1 = 3.3 nM prepared in DMEM with 0.1% BSA) was added to the cells together. ) and test compounds. Only serum-free DMEM with 0.1% BSA is added to the negative control wells, the ligand (IGF 1) is added to the positive control wells, but no test compounds are given. Test compounds are prepared in serum-free DMEM with a ligand in a 96-well plate and are serially diluted to 7 test concentrations.

(4) Po 16 hodinách aktivace ligandem se přidá ředěné značící činidlo BrdU (1:100 v DMEM, 0,1 % BSA) a buňky se inkubují s BrdU (konečná koncentrace = 10 mM) po dobu 1,5 hodiny.(4) After 16 hours of ligand activation, diluted BrdU labeling reagent (1: 100 in DMEM, 0.1% BSA) is added and the cells are incubated with BrdU (final concentration = 10 mM) for 1.5 hours.

(5) Po inkubaci se značícím činidlem se medium odstraní dekantací a vytřepáním převrácené destičky na papírový ručník. Přidá se FixDenat roztok (50 μΐ/jamka) a destička se inkubuje při pokojové teplotě 45 minut na deskové třepačce.(5) After incubation with the labeling reagent, the medium is removed by decanting and shaking the inverted plate onto a paper towel. FixDenat solution (50 μΐ / well) is added and the plate is incubated at room temperature for 45 minutes on a plate shaker.

(6) Roztok FixDenat se důkladně odstraní dekantací a vytřepáním převrácené destičky na papírový ručník. Přidá se mléko (5 % dehydratované mléko v PBS, 200 μΐ/jamka) jako blokovací pufr a destička se inkubuje 30 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.(6) Remove FixDenat solution thoroughly by decanting and shaking the inverted plate onto a paper towel. Milk (5% dehydrated milk in PBS, 200 μΐ / well) is added as blocking buffer and the plate is incubated for 30 minutes at room temperature on a plate shaker.

(7) Blokovací roztok se odstraní dekantací a jamky se jednou omyjí PBS. Přidá se roztok anti-BrdU-POD (v ředění 1:100 v PBS, 1 % BSA, a objemu 100 μΐ/jamka) a destička se inkubuje 90 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.(7) The blocking solution is removed by decantation and the wells are washed once with PBS. Anti-BrdU-POD solution (1: 100 dilution in PBS, 1% BSA, and a volume of 100 μΐ / well) is added and the plate is incubated for 90 minutes at room temperature on a plate shaker.

(8) Konjugát protilátky se důkladně odstraní dekantací a 5x opláchnutím jamek PBS. Destička se osuší překlopením a vytřepáním na papírový ručník.(8) The antibody conjugate is thoroughly removed by decanting and rinsing the wells with PBS 5 times. The plate is dried by flipping and shaking it on a paper towel.

(9) Přidá se TMB substrátový roztok (100 μΐ/jamka) a inkubuje se 20 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce, dokud se nevyvine zabarvení dostatečné pro fotometrickou detekci.(9) Add TMB substrate solution (100 μΐ / well) and incubate for 20 minutes at room temperature on a plate shaker until a sufficient color for photometric detection is developed.

(10) Absorbance vzorku se měří pri 410 nm (v modu dvojité vlnové délky se čtecím filtrem při 490 nm jako referenční vlnové délky) na Dynatech mikrofotometru pro ELISA destičky.(10) The absorbance of the sample is measured at 410 nm (in a double wavelength mode with a read filter at 490 nm as reference wavelength) on an ELISA plate microscope.

111111

11

184 *· * 9 1 11184 * · * 9 11

1 11 lili » 1 11 111 11 lili »11 11 1

91199119

FGF-indukovaný BrdU inkorporační testFGF-induced BrdU incorporation assay

Tento test měří syntézu FGF-indukované DNA v buňkách 3Tc7/EGFr, které exprimují endogenní FGF receptory.This assay measures the synthesis of FGF-induced DNA in 3Tc7 / EGFr cells that express endogenous FGF receptors.

Látky a činidla (1) FGF: lidský FGF2/bFGF (Gibco BRL, č. 13256-029).Substances and Reagents (1) FGF: human FGF2 / bFGF (Gibco BRL, # 13256-029).

(2) BrdU značící činidlo: (10 mM v PBS (pH 7,4), Kat. č. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Německo).(2) BrdU labeling reagent: (10 mM in PBS (pH 7.4), Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Germany).

(3) FixDenat: fixační roztok (Boehringer Mannheim, kat. č. 1 647 229) (4) Anti-BrdU-POD (myší monoklonální protilátka konjugovaná peroxidázou, Boehringer Mannheim, kat. č. 1 647 229,).(3) FixDenat: fixative solution (Boehringer Mannheim, Cat. No. 1 647 229). (4) Anti-BrdU-POD (mouse peroxidase-conjugated mouse monoclonal antibody, Boehringer Mannheim, Cat. No. 1 647 229,).

(5) TMB (tetramethylbenzidin, Boehringer Mannheim, kat. č. 1 647 229).(5) TMB (tetramethylbenzidine, Boehringer Mannheim, Cat. No. 1 647 229).

(6) PBS omývací roztok, pH 7,4 (Sugen, lne.).(6) PBS wash solution, pH 7.4 (Sugen, Inc).

(7) Albumin hovězí (BSA): prášková V. frakce, Sigma Chemical Co., kat. č. A-855 1).(7) Bovine albumin (BSA): powdered V fraction, Sigma Chemical Co., Cat. No. A-855 1).

PostupMethod

1. 3T3 geneticky upravená buněčná linie: 3T3c7/EGFr.1. 3T3 genetically engineered cell line: 3T3c7 / EGFr.

2. Buňky se vysejí na 96ti-jamkovou destičku v množství 8000 buněk/jamka v DMEM, 10 % CS a 2 mM Gin. Buňky se inkubují 24 hodin při 37°C v 5 % CO₂.2. Cells are plated in a 96-well plate at 8000 cells / well in DMEM, 10% CS and 2 mM Gln. The cells were incubated for 24 hours at 37 ° C in 5% CO ₂ .

3. Po 24 hodinách se buňky omyjí PBS a nechají se hladovět v bezsérovém mediu (0 % DMEM, 0,1 % BSA) 24 hodin.3. After 24 hours, cells are washed with PBS and starved in serum-free medium (0% DMEM, 0.1% BSA) for 24 hours.

4. K buňkám se přidá společně ligand (FGF2 (1,5 nM v DMEM s 0,1%4. Add ligand (FGF2 (1.5 nM in DMEM with 0.1%)

BSA) a testovací sloučeniny. Do jamek s negativní kontrolou se dá pouze bezsérové DMEM s 0,1 % BSA, do jamek s pozitivní kontrolou se dá ligand (FGF2), ale nedají se žádné testované sloučeniny. Testované sloučeniny se připraví v bezsérovém DMEM s ligandem na 96ti-jamkové destičce a postupně se ředí do sedmi (7) testovaných koncentrací.BSA) and test compounds. Only serum-free DMEM with 0.1% BSA is added to the negative control wells, the ligand (FGF2) is added to the positive control wells, but no test compounds are given. Test compounds were prepared in serum-free DMEM with a 96-well plate and serially diluted to seven (7) test concentrations.

185185

(1) Po 20 hodinách aktivace ligandem se k buňkám přidá ředěné značící činidlo BrdU (1:100 v DMEM, 0,1 % BSA, konečná koncentrace je 10 nM) a buňky se inkubují po dobu 1,5 hodiny.(1) After 20 hours of ligand activation, diluted BrdU labeling reagent (1: 100 in DMEM, 0.1% BSA, final concentration is 10 nM) was added to the cells and incubated for 1.5 hours.

(2) Medium se dekantuje. Zbytky látek se odstraní papírovým ručníkem. Přidá se FixDenat roztok (50 μΙ/jamka) a destička se inkubuje při pokojové teplotě 45 minut na deskové třepačce.(2) Decant the medium. Remnants of fabric are removed with a paper towel. FixDenat solution (50 μΙ / well) is added and the plate is incubated at room temperature for 45 minutes on a plate shaker.

(3) Odstraní se roztok FixDenat. Přidá se mléko (5 % dehydratované mléko v PBS, 200 μΙ/jamka) jako blokovací pufr a destička se inkubuje 30 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.(3) Remove FixDenat solution. Milk (5% dehydrated milk in PBS, 200 μΙ / well) is added as blocking buffer and the plate is incubated for 30 minutes at room temperature on a plate shaker.

(4) Blokovací roztok se dekantuje a jamky se jednou omyjí PBS. Přidá se roztok anti-BrdU-POD (v ředění 1:100 v PBS, 1 % BSA) a destička se inkubuje 90 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce.(4) Decant the blocking solution and wash the wells once with PBS. Anti-BrdU-POD solution (1: 100 dilution in PBS, 1% BSA) is added and the plate is incubated for 90 minutes at room temperature on a plate shaker.

(5) Konjugát protilátky se dekantuje, jamky se 5x opláchnou PBS. Destička se osuší překlopením a vytřepáním na papírový ručník.(5) Decant antibody conjugate, wash wells 5 times with PBS. The plate is dried by flipping and shaking it on a paper towel.

(6) Přidá se TMB substrátový roztok (100 μΙ/jamka) a inkubuje se 20 minut při pokojové teplotě na deskové třepačce, dokud se nevyvine zabarvení dostatečné pro fotometrickou detekci.(6) Add TMB substrate solution (100 μ 100 / well) and incubate for 20 minutes at room temperature on a plate shaker until a sufficient color for photometric detection is developed.

(7) Absorbance vzorku se měří při 410 nm na Dynatech mikrofotometru pro ELISA destičky při použití modu dvojité vlnové délky se čtecím filtrem při 490 nm.(7) The absorbance of the sample is measured at 410 nm on a Dynatech Microphotometer for ELISA plates using a double wavelength mode with a read filter at 490 nm.

Biochemický EGFR testBiochemical EGFR test

Tento test měří in vitro kinázovou aktivitu EGFR při použití ELISA.This assay measures the in vitro kinase activity of EGFR using an ELISA.

Látky a činidlaSubstances and reagents

1. Corning 96ti-jamkové ELISA destičky (Corning katalog č. 2580596).1. Corning 96-well ELISA plates (Corning Catalog # 2580596).

2.SUMO1 monoklonální anti-EGFR protilátka (Biochemistry Lab, SUGEN, lne.).2. SUMO1 monoclonal anti-EGFR antibody (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc).

186 * 99 99 99186 * 99 99 99

9 *9 9*99 9 9 9 • · 9 9 9 9 99 * 9 9 * 99 9 9 9 • 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 ···· 999 99 999* 999 9 9 9 9 ····

3. PBS (Dulbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, Gibco katalog č. 450-1300EB).3. PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco Catalog # 450-1300EB).

4. TBST pufr4. TBST buffer

činidlo agent mol. hmotn mol. wt pracovní koncentrace na 1 working concentration at 1 množství l L amount l L TRIS TRIS 121,44 121.44 50 mM 50 mM 6,057 g 6.057 g NaCl NaCl 58,44 58.44 50 mM 50 mM 8,766 g 8.766 g Triton X- Triton X- 100 NA 100 NA 0,1 % 1,0 ml 0.1% 1.0 ml 5. Blokovací pufr: 5. Blocking buffer: činidlo agent mol. hmotn mol. wt pracovní working množství amount koncentrace concentration na 1 1 to 1 1 Instantní Instant odtučněné defatted 5 % 5% 5,0 g 5.0 g mléko Carnation Milk Carnation PBS PBS NA ON NA ON 100 ml 100 ml 6. A431 buněčný lyzát (Screening Lab, SUGEN, lne.) 6. A431 Cell Lysate (Screening Lab, SUGEN, Inc.) 7. TBS pufr: 7. TBS buffer: činidlo agent mol. hmotn mol. wt pracovní working množství amount koncentrace concentration na 1 1 to 1 1 TRIS TRIS 121,14 121.14 50 mM 50 mM 6,057 g 6.057 g NaCl NaCl 58,44 58.44 150 mM 150 mM 8,766 g 8.766 g 8. TBS + 10 % 8. TBS + 10% DMSO DMSO činidlo agent mol. hmotn mol. wt pracovní working množství amount koncentrace concentration na 1 1 to 1 1 TRIS TRIS 121,14 121.14 50 mM 50 mM 1,514 g 1.514 g NaCl NaCl 58,44 58.44 150 mM 150 mM 2,192 g 2.192 g DMSO DMSO NA ON 10 % 10% 25 ml 25 ml

9. Adenosin-5'-trifosfát (ATP, z koňského svalu, Sigma kat. č. A5394).9. Adenosine 5'-triphosphate (ATP, from horse muscle, Sigma Cat # A5394).

Připraví se 1,0 mM roztok v dH₂O. Toto činidlo by mělo být připraveno bezprostředně před použitím a mělo by být drženo na ledu.A 1.0 mM solution in dH ₂ O is prepared. This reagent should be prepared immediately before use and kept on ice.

10. MnCl₂.10. MnCl ₂ .

Připraví se 1,0 M zásobní roztok v dH₂O.Prepare a 1.0 M stock solution in dH ₂ O.

11. ATP/MnCl₂, fosforylační směs11. ATP / MnCl ₂ , phosphorylation mixture

99

187 ♦ · činidlo zásobní roztok pracovní množství koncentrace na 10 ml187 ♦ reagent stock working concentration of 10 ml

ATP ,0 mM 0 μΜ 300 μΐATP, 0 mM 0 μΜ 300 μΐ

MnCl₂ 1,0 M 0 mM 500 μΐ dH₂O 9,2 mlMnCl ₂ 1.0 M 0 mM 500 μΐ dH ₂ O 9.2 ml

Toto činidlo by mělo být připraveno bezprostředně před použitím a mělo by být drženo na ledu.This reagent should be prepared immediately before use and kept on ice.

12. NUNC 96ti-jamkové polypropylenové destičky se dnem ve tvaru V (Applied Scientific Cat. č. AS-72092.12. NUNC 96-well V-bottom polypropylene plates (Applied Scientific Cat. No. AS-72092).

13. Kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA)13. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)

Připraví se 200 mM pracovního roztoku v dH₂O. Upraví se pH na 8,0 pomocí 10 N NaOH.Prepare 200 mM working solution in dH ₂ O. Adjust pH to 8.0 with 10 N NaOH.

14. Králičí polyklonální antiserum proti fosfotyrozinu (Biochemistry Lab, SUGEN, lne.)14. Rabbit polyclonal antiserum against phosphotyrosine (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc.)

15. Kozí protikráličí IgG konjugovaný peroxidázou (Biosource kat. č.15. Peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (Biosource Cat.

ALI0404).ALI0404).

16. ABTS (2,2'- azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina), Sigma kat. ě. A-1888).16. ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid), Sigma Cat. No. A-1888).

činidlo agent mol. hmotn. mol. wt. pracovní koncentrace working concentration množství na 11 amount on 11 Kyselina Acid 192,12 192.12 100 mM 100 mM 19,21 g 19,21 g citrónová lemon Na₂HPO₄ Na ₂ HPO ₄ 141,96 141.96 250 mM 250 mM 35,49 g 35,49 g ABTS ABTS NA ON 0,5 mg/ml 0.5 mg / ml 500 mg 500 mg

První dvě složky se smíchají v přibližně 900 ml dH2O, upraví se kyselinou fosforečnou pH na 4,0. Přidá se ABTS, zakryje, nechá stát přibližně 0,5 hodiny, filtruje. Roztok by se měl až do použití uchovávat v temnu a při teplotě 4°C.The first two components are mixed in approximately 900 mL dH2O, adjusted to pH 4.0 with phosphoric acid. Add ABTS, cover, allow to stand for about 0.5 hours, filter. The solution should be stored in the dark at 4 ° C until use.

17. 30 % roztok peroxidu vodíku (Fischer kat. ě. H325).17. 30% hydrogen peroxide solution (Fischer Cat. No. H325).

18. ABTS/H₂O₂ 18. ABTS / H ₂ O ₂

Smíchá se 15 ml roztoku ABTS a 2,0 μΐ H₂O₂. Připraví se 5 minut před použitím.Mix 15 ml of ABTS solution and 2,0 μΐ H ₂ O ₂ . Prepare 5 minutes before use.

19. 0,2 M Hel.19. 0.2 M Hel.

188 ♦ ·188 ♦ ·

• · 0• · 0

PostupMethod

1. Corningovy 96ti-jamkové ELISA destičky se povlečou 0,5 pg SUMO1 v 100 μΐ PBS na jednu jamku, uskladní se přes noc při 4°C.1. Coat Corning 96-well ELISA plates with 0.5 µg SUMO1 in 100 µl PBS per well, store overnight at 4 ° C.

2. Nenavázaná SUMO1 se z jamek odstraní převrácením destičky a odstraněním tekutiny. Jamky se jedenkrát omyjí dH₂O. Přebytečná tekutina se odstraní vytřepáním destičky na papírový ručník.2. Unbound SUMO1 is removed from the wells by inverting the plate and removing the liquid. Wash wells once with dH ₂ O. Remove excess liquid by shaking the plate on a paper towel.

3. Do každé jamky se přidá 150 μΐ blokovacího pufru. Inkubuje se 30 minut při pokojové teplotě za stálého třepání.3. Add 150 μΐ blocking buffer to each well. Incubate for 30 minutes at room temperature with shaking.

4. Destička se 3x omyje dionizovanou vodou, pak jednou TBST. Přebytečná tekutina a bubliny se odstraní převrácením a vytřepáním destičky na papírový ručník.4. Wash plate 3 times with dionized water, then once with TBST. Excess liquid and bubbles are removed by inverting and shaking the paper towel.

5. Lyzát se zředí PBS (7pg lyzátu/100 μΐ PBS).5. Dilute the lysate with PBS (7pg lysate / 100 μΐ PBS).

6. Do každé jamky se přidá 100 μΐ ředěného lyzátu. Třepe se při pokojové teplotě 60 minut.6. Add 100 μΐ of diluted lysate to each well. Shake at room temperature for 60 minutes.

7. Destičky se omyjí podle výše uvedeného bodu 4.7. Wash plates according to section 4 above.

8. Na ELISA destičku obsahující zachycený EGFR se přidá 120 μΐ TBS.8. Add 120 μΐ TBS to the ELISA plate containing the captured EGFR.

9. Testované sloučeniny se zředí TBS 1:10 na 96ti-jamkových polypropylenových destičkách (tj. 10 μΐ sloučeniny + 90 μΐ TBS).9. Dilute test compounds 1:10 in 96-well polypropylene plates (ie 10 μΐ compound + 90 μΐ TBS).

10. Na ELISA destičku se přidá 13,5 μΐ ředěných testovaných sloučenin. Do kontrolních jamek (jamky neobsahující žádné testované sloučeniny) se přidá 13,5 μΐ TBS + 10 % DMSO.10. Add 13.5 μΐ of diluted test compounds to the ELISA plate. Add 13.5 μΐ TBS + 10% DMSO to control wells (wells containing no test compounds).

11. Inkubuje se 30 minut při pokojové teplotě za stálého třepání.11. Incubate for 30 minutes at room temperature with shaking.

12. Do všech jamek kromě jamek pro negativní kontrolu, které neobsahují ATP/MnCl₂ (konečný objem jamek by měl být přibližně 150 μΐ se 3 μΜ ATP/5 mM MnC12, konečná koncentrace v každé jamce) se přímo přidá 15 μΐ fosforylační směsi. Inkubuje se 5 minut za stálého třepání.12. Add 15 μΐ phosphorylation mixture directly to all wells except negative control wells that do not contain ATP / MnCl ₂ (final well volume should be approximately 150 μΐ with 3 μΜ ATP / 5 mM MnCl 2, final concentration in each well). Incubate for 5 minutes with shaking.

13. Po 5 minutách se reakce zastaví přidáním 16,5 μΐ 200 mM EDTA (pH 8,0) do každé jamky za stálého třepání. Po přidání EDTA se třepe další 1 minutu.13. After 5 minutes, stop the reaction by adding 16.5 μΐ 200 mM EDTA (pH 8.0) to each well with shaking. After addition of EDTA, shake for a further 1 minute.

14. Destička se 4x omyje deionizovanou vodou, dvakrát TBST.14. Wash plate 4 times with deionized water, twice with TBST.

189 · 9999 99189 · 9900 99

9 99 9 9 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 99 99 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 9

9999 999 99 9999 99 9999999 999 99

15. Do každé jamky se přidá 100 μΐ protilátky proti fosfotyrozinu (1:3000 ředění v TBST). Inkubuje se 30-45 minut při pokojové teplotě za stálého třepání.15. Add 100 μΐ of anti-phosphotyrosine antibody (1: 3000 dilution in TBST) to each well. Incubate for 30-45 minutes at room temperature with shaking.

16. Omyje se podle výše popsaného bodu 4.16. Wash according to item 4 above.

17. Do každé jamky se přidá 100 μΐ Biosource kozího anti-králičího IgG konjugovaného peroxidázou (ředění 1:2000 v TBST). Inkubuje se 30 minut při pokojové teplotě za stálého třepání.17. Add 100 μΐ peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (1: 2000 dilution in TBST) to each well. Incubate for 30 minutes at room temperature with shaking.

18. Omyje se podle výše popsaného bodu 4.18. Wash according to item 4 above.

19. Do každé jamky se přidá 100 μΐ roztoku ABTS/H2O2.19. Add 100 μΐ of ABTS / H2O2 solution to each well.

20. Inkubuje se 5 až 10 minut za stálého třepání. Odstraní se veškeré bubliny.20. Incubate for 5 to 10 minutes with shaking. All bubbles are removed.

21. V případě nutnosti se reakce zastaví přidáním 100 μΐ 0,2 M HC1 do každé jamky.21. If necessary, stop the reaction by adding 100 μΐ 0.2 M HCl to each well.

22. Destička se odečte na Dynatech MR7000 ELISA mikrofotometru. Testovací filtr: 410 nM, referenční filtr: 630 nM.22. Read the plate on a Dynatech MR7000 ELISA Microphotometer. Test filter: 410 nM, reference filter: 630 nM.

Biochemický PDGFR testBiochemical PDGFR test

Tento test měří in vitro kinázovou aktivitu PDGFR pomocí ELISA.This assay measures the in vitro kinase activity of PDGFR by ELISA.

Látky a činidlaSubstances and reagents

Pokud není uvedeno jinak, připraví se pracovní roztoky následujících činidel stejným způsobem, jako ve výše uvedeném biochemickém EGFR testu.Unless otherwise stated, working solutions of the following reagents were prepared in the same manner as in the above-mentioned biochemical EGFR assay.

1. Corning 96ti-jamkové ELISA destičky (Corning kat. č. 25805-96). 2.28D4C10 monoklonální anti-PDGFR protilátka (Biochemistry Lab.,1. Corning 96-well ELISA plates (Corning Cat. No. 25805-96). 2.28D4C10 monoclonal anti-PDGFR antibody (Biochemistry Lab.,

SUGEN, lne.).SUGEN, Inc.).

3. PBS (Dulbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, Gibco kat. č. 450-1300EB).3. PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco Cat. # 450-1300EB).

4. TBST puft.4. TBST buffer.

5. Blokovací pufr.5. Blocking buffer.

• « φ» φφ • · · φ φ φ φ• »· · · · · φ φ

190 φφφ • · »»··190 φφφ • · »» ··

6. PDGFR-β lyzát 3Τ3 buněk exprimujících ΝΙΗ (Screening Lab, SUGEN, lne.).6. PDGFR-β lysate of 3Τ cells expressing ΝΙΗ (Screening Lab, SUGEN, Inc).

7. TBS pufr.7. TBS buffer.

8. TBS + 10 % DMSO.8. TBS + 10% DMSO.

9. Adenosin-5'-trifosfát (ATP, z koňského svalu, Sigma kat. č. A5394).9. Adenosine 5'-triphosphate (ATP, from horse muscle, Sigma Cat # A5394).

10. MnCl₂.10. MnCl ₂ .

11. Kinázová pufrovací fosforylaění směs.11. Kinase buffer phosphorylation mixture.

činidlo agent zásobní roztok stock solution pracovní koncentrace working concentration množství na 10 ml amount to 10 ml TRIS TRIS 1 M 1 M 25 mM 25 mM 250 μΐ 250 μΐ NaCI NaCl 5 M 5 M 100 mM 100 mM 200 μΐ 200 μΐ MnCl₂ MnCl ₂ 1 M 1 M 10 mM 10 mM 100 μΐ 100 μΐ TX-100 TX-100 100 mM 100 mM 0,5 mM 0.5 mM 50 μΐ 50 μΐ

12. NUNC 96ti-jamkové polypropylenové destičky se dnem ve tvaru V(Applied Scientific kat. ě. AS-72092).12. NUNC 96-well V-bottom polypropylene plates (Applied Scientific Cat. No. AS-72092).

13. Kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA).13. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).

14. Králičí polyklonální antiserum proti fosfotyrozinu (Biochemistry Lab., SUGEN, lne.).14. Rabbit polyclonal antiserum against phosphotyrosine (Biochemistry Lab., SUGEN, Inc.).

15. Kozí anti-králičí IgG konjugovaný peroxidázou (Biosource kat. č. ALI0404).15. Peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (Biosource Cat. No. ALI0404).

16. 2,2'-azino-bis(3-ethylenbenzthiazolin-6-sulfonová kyselina) (ATBS, Sigma kat. č. A-1888).16. 2,2'-Azino-bis (3-ethylenebenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ATBS, Sigma Cat. No. A-1888).

17. 30 % roztok peroxidu vodíku (Fisher kat. č. H325).17. 30% hydrogen peroxide solution (Fisher Cat # H325).

18. ABTS/H₂O₂.18. ABTS / H ₂ O ₂ .

19. 0,2 M HC1.19. 0.2 M HCl.

• · • · ♦ · φφ « · · • ·• · · · · · · · ·

VIN

191 ····191 ····

PostupMethod

1. Corningovy 96ti-jamkové ELISA destičky se povlečou 0,5 pg 28D4C10 ve 100 μΐ PBS na jamku a ponechají přes noc při teplotě 4°C.1. Coat Corning 96-well ELISA plates with 0.5 µg 28D4C10 in 100 µl PBS per well and leave overnight at 4 ° C.

2. Nenavázaná 28D4C10 se z jamek odstraní překlopením destičky. Jamky se lx omyjí dH2O. Přebytečná tekutina se odstraní vytřepáním destičky na papírový ručník.2. Unbound 28D4C10 is removed from the wells by inverting the plate. The wells are washed 1x with dH2O. Excess liquid is removed by shaking the plate on a paper towel.

3. Do každé jamky se přidá 150 μΐ blokovacího pufru. Inkubuje se 30 minut při pokojové teplotě za stálého třepání.3. Add 150 μΐ blocking buffer to each well. Incubate for 30 minutes at room temperature with shaking.

4. Destička se 3x omyje deionizovanou vodou, pak lx TBST. Přebytečná tekutina a bubliny se odstraní vyklepáním destičky na papírový ručník.4. Wash plate 3x with deionized water, then 1x TBST. Excess liquid and bubbles are removed by tapping the plate on a paper towel.

5. Lyzát se zředí HNTG (10 pg lyzátu/100 μΐ HNTG).5. Dilute the lysate with HNTG (10 pg lysate / 100 μΐ HNTG).

6. Do každé jamky se přidá 100 μΐ ředěného lyzátu. Při pokojové teplotě se třepe 60 minut.6. Add 100 μΐ of diluted lysate to each well. Shake at room temperature for 60 minutes.

7. Destička se omyje postupem popsaným v bodě 4.7. Wash the plate as described under 4.

8. Na ELISA destičku obsahující zachycený PDGFR se přidá 80 μΐ pracovní kinázové pufrovací směsi.8. Add 80 μΐ working kinase buffer mixture to the ELISA plate containing the captured PDGFR.

9. Testované sloučeniny se zředí TBS 1:10 na 96ti-jamkové polypropylenové destičce (tj. 10 μΐ sloučeniny + 90 μΐ TBS).9. Dilute test compounds 1:10 in a 96-well polypropylene plate (ie 10 μΐ compound + 90 μΐ TBS).

10. Na ELISA destičku se přidá 10 μΐ ředěné testované sloučeniny. Do kontrolních jamek (tj. jamky, které neobsahují žádnou testovanou sloučeninu) se přidá 10 μΐ TBS + 10 % DMSO.10. Add 10 μΐ of the diluted test compound to the ELISA plate. Add 10 μΐ TBS + 10% DMSO to control wells (ie wells containing no test compound).

11. Inkubuje se 30 minut při pokojové teplotě za stálého třepání.11. Incubate for 30 minutes at room temperature with shaking.

12. Přímo do každé jamky, kromě negativních kontrol, se přidá 10 μΐ ATP (konečný objem jamek by měl být přibližně 100 μΐ s 20 μΜ ATP v každé jamce). Ikubuje se 30 minut za stálého třepání.12. Add 10 μΐ ATP directly to each well, except the negative controls (final volume of wells should be approximately 100 μΐ with 20 μΜ ATP in each well). Incubate for 30 minutes with shaking.

13. Po 30 minutách se reakce zastaví přidáním 10 μΐ 200 mM EDTA do každé jamky (pH 8,0).13. After 30 minutes, stop the reaction by adding 10 μΐ 200 mM EDTA to each well (pH 8.0).

14. Destička se 4x omyje deionizovanou vodou, 2x TBST.14. Wash plate 4x with deionized water, 2x TBST.

192 • >192 •>

Φ » *···Φ »* ···

15. Do každé jamky se přidá 100 μΐ protilátky proti fosfotyrozinu (ředění 1:3000 v TBST). Inkubuje se při pokojové teplotě za stálého třepání.15. Add 100 μΐ of anti-phosphotyrosine antibody (1: 3000 dilution in TBST) to each well. Incubate at room temperature with shaking.

16. Destička se omyje způsobem popsaným v bodě 4 výše.16. Wash the plate as described under 4 above.

17. Do každé jamky se přidá 100 μΐ Biosource kozího protikráličího IgG konjugovaného peroxidázou (ředění 1:2000 v TBST). Inkubuje se při pokojové teplotě za stálého třepání.17. Add 100 μΐ Peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (1: 2000 dilution in TBST) to each well. Incubate at room temperature with shaking.

18. Destička se omyje podle výše uvedeného bodu 4.18. Wash the plate as described in section 4 above.

19. Do každé jamky se přidá 100 μΐ roztoku ABTS/H2O2.19. Add 100 μΐ of ABTS / H2O2 solution to each well.

20. Inkubuje se 10 až 30 minut za stálého třepání. Odstraní se bubliny.20. Incubate for 10 to 30 minutes with shaking. The bubbles are removed.

21. V případě nutnosti se reakce zastaví přidáním 100 μΐ 0,2 M HC1 do každé jamky.21. If necessary, stop the reaction by adding 100 μΐ 0.2 M HCl to each well.

22. Destička se odečte na Dynatech MR7000 ELISA mikrofotometru: testovací filtr: 410 nM, referenční filtr: 630 nM.22. Read the plate on a Dynatech MR7000 ELISA Microphotometer: Test Filter: 410 nM, Reference Filter: 630 nM.

Biochemický FGFR testBiochemical FGFR test

Tento test měří in vitro kinázovou aktivitu fúzního proteinu MycGyrB-FGFR s použitím ELISA.This assay measures the in vitro kinase activity of a MycGyrB-FGFR fusion protein using ELISA.

Látky a činidlaSubstances and reagents

1. HNTG činidlo mol. hmotnost 5 x zásobní množství lx pracovní koncentrace na 1 1 koncentraceHNTG reagent mol. weight 5 x stock quantity 1 x working concentration per 1 l concentration

HEPES HEPES 238,3 238.3 100 mM 100 mM 23,83 g 23.83 g 20 mM 20 mM NaCl NaCl 58,44 58.44 750 mM 750 mM 43,83 g 43.83 g 150 mM 150 mM Glycerol Glycerol NA ON 50 % 50% 500 ml 500 ml 10 % 10% Triton X-100 Triton X-100 NA ON 5 % 5% 10 ml 10 ml 1,0 % 1.0%

Pro přípravu 1 L 5x zásobního roztoku se rozpustí HEPES a NaCl v přibližně 350 ml dH₂O, pH se upraví HC1 nebo NaOH na 7,2 (podleTo prepare a 1 L 5x stock solution, dissolve HEPES and NaCl in approximately 350 mL dH ₂ O, adjust the pH to 7.2 with HCl or NaOH (according to

ΦΦ • · · • ΦΦΦ ·ΦΦ · ·

193 ·· ·· ·· • φ · φ · φ φ • € · Φ · • · · ΦΦΦΦ • · · · ·193 ·· ·· ·· · φ · φ · € · Φ · · · · · · · ·

ΦΦ Φ··· «Φ φ toho, který HEPES se použije), přidá se glycerol, Triton X-100 a objem se doplní dH₂O.(Which HEPES is used), add glycerol, Triton X-100 and make up to volume dH ₂ O.

2. PBS (Dulbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok, Gibco katalog, č. 450-1300EB).2. PBS (Dulbecco's phosphate buffered saline, Gibco Catalog, # 450-1300EB).

3. Blokovací pufr.3. Blocking buffer.

4. Kinázový pufr.4. Kinase buffer.

činidlo mol. hmotnost lOx zásobní lx pracovní koncentrace koncentracereagent mol. weight 10x stock 1x working concentration concentration

HEPES (pH 7,2) HEPES (pH 7.2) 238,3 238.3 500 mM 500 mM 50 mM 50 mM MnCl₂ MnCl ₂ 20 mM 20 mM 2 mM 2 mM MgCl₂ MgCl ₂ 203,32 203.32 200 mM 200 mM 10 mM 10 mM Triton-X-100 Triton X-100 1 % 1% 0,1 % 0.1% DTT DTT 380,35 380.35 5 mM 5 mM 0,5 mM 0.5 mM

5. Fenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF, Sigma, Kat. č. P-7626):5. Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF, Sigma, Cat. No. P-7626):

Pracovní koncentrace: 100 mM v ethanolu.Working concentration: 100 mM in ethanol.

6. ATP (bakteriální zdroj, Sigma kat. č. A-7699).6. ATP (bacterial source, Sigma Cat. No. A-7699).

Pro pracovní koncentraci 6 mM se použije 3,31 mg na 1 ml MilliQ H₂O.For a working concentration of 6 mM, 3.31 mg per ml of MilliQ H ₂ O was used.

7. Biotinem konjugovaná monoklonální protilátka proti fosfotyrozinu (klon 4G10, Upstate Biotechnology lne. kat. č. 16-103, ser. č. 14495).7. Biotin-conjugated monoclonal antibody to phosphotyrosine (clone 4G10, Upstate Biotechnology Inc. Cat. No. 16-103, Ser. No. 14495).

8. Vectastain Elitě ABC činidlo (Avidin konjugovaný peroxidázou, Vector Laboratories kat. č. PK-6 100).8. Vectastain Elite ABC Reagent (Avidin-conjugated peroxidase, Vector Laboratories Cat. No. PK-6 100).

9. Roztok ABTS.9. ABTS Solution.

10.30 % roztok peroxidu vodíku (Fischer katalog č. H325).10.30% hydrogen peroxide solution (Fischer catalog no. H325).

11. ABTS/H₂O₂.11. ABTS / H ₂ O ₂ .

12. 0,2 M HC1.12. 0.2 M HCl.

13. TRIS Hel (Fischer kat. č. BP 152-5).13. TRIS Hel (Fischer cat. No. BP 152-5).

Připraví se 1,0 mM roztok v MilliQ H2O, pH se upraví HC1 na 7,2.A 1.0 mM solution in MilliQ H 2 O was prepared, pH adjusted to 7.2 with HCl.

14. NaCI (Fischer kat. č. S271-10).14. NaCl (Fischer Cat. No. S271-10).

Připraví se 5 M roztok v MilliQ H₂O.Prepare 5 M solution in MilliQ H ₂ O.

15. MgC12 (Fischer kat .č. M33-500).15. MgCl 2 (Fischer Cat. No. M33-500).

Připraví se IM roztok v MilliQ H₂O.Prepare an IM solution in MilliQ H ₂ O.

194194

16. HEPES (Fischer kat. č. BP310-500).16. HEPES (Fischer cat. No. BP310-500).

Připraví se 1 M roztok v MilliQ H₂O, pH se upraví 7,5 a sterilně sfiltruje.A 1 M solution in MilliQ H ₂ O is prepared, the pH is adjusted to 7.5 and sterile filtered.

17. TBST pufr.17. TBST buffer.

18. Pufr uhličitanu sodného (Fischer kat. č. S495).18. Sodium carbonate buffer (Fischer Cat. No. S495).

Připraví se 0,1 M roztok v MilliQ H₂O, pH se upraví NaOH na 9,6 a sfiltruje.Prepare a 0.1 M solution in MilliQ H ₂ O, adjust the pH to 9.6 with NaOH and filter.

19. Dithiothreitol (DTT, Fischer kat. č. BP172-25).19. Dithiothreitol (DTT, Fischer Cat No. BP172-25).

Připraví se 0,5 mM pracovní roztok v MilliQ H₂O bezprostředně před upotřebením. Do použití se uchovává při teplotě -20°C. Veškeré zbytky se vyhodí.Prepare 0.5 mM working solution in MilliQ H ₂ O immediately before use. Store at -20 ° C until use. Any residues are discarded.

20. MnCl₂.20. MnCl ₂ .

1. Triton X-100.Triton X-100.

22. Kozí α-králičí IgG (Cappel).22. Goat α-rabbit IgG (Cappel).

23. Afinitně purifikovaný králičí a GST GyrB (Biochemistry Lab. SUGEN, lne.).23. Affinity purified rabbit and GST GyrB (Biochemistry Lab. SUGEN, Inc).

PostupMethod

Pokud není uvedeno jinak, provádí se všechny následující kroky při pokojové teplotě.Unless otherwise stated, all subsequent steps are performed at room temperature.

1. Corningovy 96ti-jamkové ELISA destičky se povlečou 2 pg kozí akráličí protilátkou v uhličitanovém pufru do každé jamky tak, aby celkový objem jamky byl 100 μΐ. Destička se uchová přes noc v teplotě 4°C.1. Coat Corning 96-well ELISA plates with 2 µg of goat antibody in carbonate buffer into each well to obtain a total well volume of 100 μΐ. The plate is stored overnight at 4 ° C.

2. Nenavázaná kozí a-králičí protilátka se odstraní převrácením destičky. Přebytečná tekutina a bubliny se odstraní vytřepáním destičky na papírový ručník.2. Unbound goat α-rabbit antibody is removed by inverting the plate. Excess liquid and bubbles are removed by shaking the plate on a paper towel.

3. Do každé jamky se přidá 150 μΐ blokovacího pufru (5 % nízkotučného mléka v PBS). Za stálého míchání se inkubuje na deskové třepačce.3. Add 150 μΐ blocking buffer (5% low-fat milk in PBS) to each well. Incubate, with stirring, on a plate shaker.

4. Omyje se 4x TBST. Destička se vyklepe na papírový ručník, aby se odstranila přebytečná tekutina a bubliny.4. Wash 4x TBST. The plate is knocked on a paper towel to remove excess liquid and bubbles.

195 • ·195 • ·

5. Do každé jamky se přidá 0,5 pg králičí a-GyrB. Protilátka se ředí PDBS do konečného objemu 100 pl na každou jamku. Inkubuje se za stálého třepání na deskové třepačce při pokojové teplotě 1 hodinu.5. Add 0.5 µg of rabbit α-GyrB to each well. The antibody is diluted with PDBS to a final volume of 100 µl per well. Incubate with shaking on a plate shaker at room temperature for 1 hour.

6. Destička se 4x omyje TBST postupem popsaným v bodě 4 výše.6. Wash plate 4 times with TBST as described in section 4 above.

7. Do každé jamky se přidá 2 pg COS/FGFR buněčného lyzátu (zdroj Myc-GyrB-FGFR) v HNTG do konečného objemu 100 pl na jamku. Za stálého třepání se inkubuje na deskové třepačce po dobu 1 hodiny.7. Add 2 µg of COS / FGFR cell lysate (source Myc-GyrB-FGFR) in HNTG to each well to a final volume of 100 µl per well. Incubate on a plate shaker for 1 hour while shaking.

8. Omyje se 4x TBST postupem popsaným v kroku 4.8. Wash 4x TBST as described in step 4.

9. Do každé jamky se přidá 80 pl kinázového pufru.9. Add 80 µl kinase buffer to each well.

10. Testované sloučeniny se naředí na polypropylenové 96ti-jamkové destičce lx kinázovým pufrem v poměru 1:10.10. Test compounds are diluted 1:10 in polypropylene 96-well plate with 1X Kinase Buffer.

11. 10 pl ředěného roztoku testovaných sloučenin a obsah kontrolních jamek se z polypropylénové destičky přenese do odpovídajících jamek ELISA destičky, inkubuje se za stálého třepání na mikrotitrační desce 20 minut.11. 10 µl of diluted test compound solution and control well contents are transferred from the polypropylene plate to the corresponding wells of the ELISA plate, incubated with shaking on a microtiter plate for 20 minutes.

12. Do jamek s pozitivní kontrolou a testovaných jamek se přidá 10 pl 70 pM ATP ředěného v kinázovém pufru (konečná koncentrace ATP je 7 pM/jamka). Inkubuje se za stálého třepání na deskové třepačce 1 5 minut.12. Add 10 µl of 70 pM ATP diluted in kinase buffer (final ATP concentration is 7 pM / well) to the positive control and test wells. Incubate with shaking on a plate shaker for 15 minutes.

13. Kinázová reakce se zastaví přidáním 5 pl 0,5 M EDTA do každé jamky.13. Stop the kinase reaction by adding 5 µl of 0.5 M EDTA to each well.

14. Omyje se 4x TBST podle postupu popsaného v bodu 4.14. Wash 4x TBST according to the procedure described in 4.

15. Do každé jamky se přidá 100 pl biotinem konjugované afosfotyrozin monoklonální protilátky (b4G10). Inkubuje se za stálého třepání na deskové třepačce 30 minut.15. Add 100 µl of biotin-conjugated aphosphotyrosine monoclonal antibody (b4G10) to each well. Incubate with shaking on a plate shaker for 30 minutes.

16. Připraví se Vectastain ABC činidlo. Do 15 ml TBST se přidá 1 kapka činidla A. Promíchá se několikerým převrácením zkumavky. Do směsi se dále přidá 1 kapka činidla B.16. Prepare Vectastain ABC Reagent. Add 1 drop of Reagent A to 15 ml TBST. Mix by inverting the tube several times. Add 1 drop of Reagent B to the mixture.

17. Omyje se 4x TBST postupem podle kroku 4.17. Wash 4x TBST according to step 4.

196 • · • · ·196

18. Do každé jamky se přidá 100 pl ABC HRP činidla. Inkubuje se za stálého třepání na deskové třepačce 30 minut.18. Add 100 µl of ABC HRP reagent to each well. Incubate with shaking on a plate shaker for 30 minutes.

19. Omyje se 4x TBST postupem popsaným v kroku 4.19. Wash 4x TBST as described in step 4.

20. Do každé jamky se přidá 100 pl ABTS/H2O2.20. Add 100 µl ABTS / H2O2 to each well.

21. Inkubuje se 5 až 15 minut za stálého třepání. Veškeré bubliny se odstraní.21. Incubate for 5 to 15 minutes with shaking. Any bubbles are removed.

22. V případě nutnosti se reakce zastaví přidáním 100 μΐ 0,2 M HCl/jamka.22. If necessary, stop the reaction by adding 100 μΐ 0.2 M HCl / well.

23. Deska se odečte na Dynetech MR7000 ELISA mikrofotometru, testovací filtr: 410 nM, referenční filtr: 630 nM.23. Read the plate on a Dynetech MR7000 ELISA Microphotometer, Test Filter: 410 nM, Reference Filter: 630 nM.

Biochemický FLK-1 testBiochemical FLK-1 test

Tento test vyhodnocuje in vitro autofosforylační aktivitu flk-1 s použitím ELISA.This assay evaluates the in vitro autophosphorylation activity of flk-1 using ELISA.

Látky a činidlaSubstances and reagents

1.15 cm misky na tkáňové kultury.1.15 cm tissue culture dishes.

2. Buňky Flk-1: NIH fibroblastoidní linie exprimující lidský flk-1 klon 3 (SUGEN, lne., získaný z MPI, Marinsried, Německo).2. Flk-1 cells: NIH fibroblastoid line expressing human flk-1 clone 3 (SUGEN, Inc, obtained from MPI, Marinsried, Germany).

3. Růstové medium: DMEM s teplotně inaktivovaným 10 % FBS a 2 mM glutamin (Gibco - BRL).3. Growth Medium: DMEM with heat-inactivated 10% FBS and 2 mM glutamine (Gibco-BRL).

4. Hladové medium: DMEM a 0,5 % teplotně inaktivovaný 0,5 % FBS, 2 mM glutamin (Gibco-BRL).4. Hungry medium: DMEM and 0.5% heat inactivated 0.5% FBS, 2 mM glutamine (Gibco-BRL).

5. Corning 96ti-jamkové ELISA destičky (Corning kat. č. 25805-96).5. Corning 96-well ELISA plates (Corning cat. No. 25805-96).

6. Monoklonální protilátka L4 nebo E38 specifická na flk-1, purifikovaná afinitní chromatografií na protein-A agarose (SUGEN, lne.).6. Flk-1 specific monoclonal antibody L4 or E38, purified by protein-A agarose affinity chromatography (SUGEN, Inc).

7. PBS (Dublbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok), Gibco kat.č. 450-1300EB).7. PBS (Dublbecco's Phosphate Buffered Saline), Gibco Cat. 450-1300EB).

8. HNTG (viz příprava v Biochemickém FGFR).8. HNTG (see preparation in Biochemical FGFR).

9. Pierce BCA detekční souprava.9. Pierce BCA detection kit.

197 • 9 9 · · * · · ·· ···· 4 4 · · ·197 • 9 9 · · 4 · · ·

10. Blokovací pufr.10. Blocking buffer.

11. TBST (pH 7,0).11. TBST (pH 7.0).

12. Kinázový pufr.12. Kinase buffer.

13. Stopovací kinázový roztok: 200 mM EDTA.13. Stop Kinase Solution: 200 mM EDTA.

14. Biotinovaná 4G10, specifická na fosfotyrozin (UBI, kat. č. 16103).14. Biotinated 4G10, specific for phosphotyrosine (UBI, Cat. No. 16103).

15. AB souprava (Vector Laboratories kat. č. PK 4000).15. AB kit (Vector Laboratories Cat. No. PK 4000).

16. DMSO.16. DMSO.

17. NUNC 96ti-jamkové polypropylenové destičky (V-dno) (Applied Scientific kat. ě. AS-72092).17. NUNC 96-well polypropylene plates (V-bottom) (Applied Scientific Cat. No. AS-72092).

18. Turbo-TMB (Pierce).18. Turbo-TMB (Pierce).

19. Turbo-TMB stopovací roztok: 1 M H2SO4.19. Turbo-TMB Tracer Solution: 1 M H2SO4.

20. ATP (Sigma kat. ě. A-7699).20. ATP (Sigma Cat. No. A-7699).

21. 20 % DMSO v TBS (pH 7,0).21. 20% DMSO in TBS (pH 7.0).

PostupMethod

Pěstování buněk a příprava lyzátu.Cell cultivation and preparation of lysate.

1. Buňky se vysejí do růstového media a pěstují 2-3 dny do 90-100 % pokryvu při 37°C a 5 % CO₂. Počet pasáží nesmí překročit 20.1. Cells are seeded in growth medium and grown for 2-3 days in 90-100% cover at 37 ° C and 5% CO ₂ . The number of passages must not exceed 20.

2. Medium se odstraní a buňky se 2x omyjí PBS. Buňky se lyžují HNTG lyzovacím pufrem. Všechen lyzát se shromáždí a vortexuje 20-30 minut.2. Remove the medium and wash the cells twice with PBS. Cells are lysed with HNTG lysis buffer. All lysate is collected and vortexed for 20-30 minutes.

3. Nerozpustný materiál se odstraní centrifugací (5-10 minut při cca 10 000 xg).3. Insoluble material is removed by centrifugation (5-10 minutes at about 10,000 xg).

4. Koncentrace proteinu se určí pomocí BCA soupravy.4. Protein concentrations are determined using a BCA kit.

5. Lyzát se rozdělí do 1 mg alikvótů a uskladní při -80°C.5. The lysate is divided into 1 mg aliquots and stored at -80 ° C.

Postup testuTest procedure

1. Corning 96ti-jamkové ELISA destičky se koutují 2 pg/jamka purifikované L4 (nebo E 38) v 100 pl PBS. Uskladní se při teplotě 4°C přes noc.1. Corning 96-well ELISA plates are coated with 2 µg / well purified L4 (or E 38) in 100 µl PBS. Store at 4 ° C overnight.

·* ·· ··· * ·· ··

2. Nenavážené proteiny se z jamek odstraní převrácením destičky, aby se odstranila tekutina. Destička se jednou omyje dH₂O, přebytečná tekutina se z destičky vytřepe na papírový ručník.2. Unbound proteins are removed from the wells by inverting the plate to remove liquid. Wash the plate once with dH ₂ O, shake excess liquid from the plate on a paper towel.

3. Destičky se blokují 150 μΐ blokovacího pufru do každé jamky. Inkubuje se 45-60 minut za stálého třepání při teplotě 4°C.3. Block plates with 150 μΐ blocking buffer per well. Incubate for 45-60 minutes with shaking at 4 ° C.

4. Blokovací pufr se odstraní a ELISA destička se třikrát omyje dH₂O a jednou TBST. Přebytečná tekutina se odstraní vytřepáním destičky na papírový ručník.4. Remove blocking buffer and wash ELISA plate three times with dH ₂ O and once with TBST. Excess liquid is removed by shaking the plate on a paper towel.

5. Lyzát se zředí PBS do konečné koncentrace 50 pg/100 μΐ. Do každé jamky se přidá 100 μΐ ředěného lyzátu. Inkubuje se přes noc při teplotě 4°C za stálého třepání.5. Dilute the lysate with PBS to a final concentration of 50 pg / 100 μΐ. Add 100 μΐ of diluted lysate to each well. Incubate overnight at 4 ° C with shaking.

6. Nenavázané proteiny se z jamek odstraní překlopením destičky. Destička se omyje postupem stejným jako v kroku 4.6. Unbound proteins are removed from the wells by inverting the plate. Wash the plate as described in step 4.

7. Do každé jamky se přidá 80 μΐ kinázového pufru (90 μΐ do jamek s negativní kontrolou).7. Add 80 μΐ of kinase buffer (90 μΐ to negative control wells) to each well.

8. Testované sloučeniny se rozředí (obvykle lOx) do jamek na polypropylenové destičce obsahující 20 % DMSO v TBS.8. Test compounds are diluted (usually 10x) into wells in a polypropylene plate containing 20% DMSO in TBS.

9. Do komůrek ELISA destičky obsahujících imobilizovaný flk-1 se přidá 10 μΐ ředěných sloučenin a třepe se. Kontrolní jamky neobsahují žádné sloučeniny.9. Add 10 μΐ of diluted compounds to the ELISA plates containing immobilized flk-1 and shake. Control wells contain no compounds.

10. Ze zásobního 1 mM roztoku ATP se připraví 0,3 mM roztok ATP v dH₂O (může se rovněž použít kinázový pufr).10. Prepare a 0.3 mM ATP solution in dH ₂ O from a stock of 1 mM ATP solution (kinase buffer may also be used).

11. Do každé jamky, kromě negativních kontrol, se přidá 10 μΐ 0,3 mM ATP. Inkubuje se 60 minut při pokojové teplotě za stálého třepání.11. Add 10 μΐ 0.3 mM ATP to each well, except the negative controls. Incubate for 60 minutes at room temperature with shaking.

12. Po 1 hodině se reakce zastaví přidáním 11 μΐ 200 mM EDTA. Třepe se 1-2 minuty.12. After 1 hour, stop the reaction by adding 11 μΐ 200 mM EDTA. Shake for 1-2 minutes.

13. ELISA destička se 4x omyje dH₂O a 2x TBST.13. Wash the ELISA plate 4 times with dH ₂ O and 2 times with TBST.

14. Do každé jamky se přidá 100 μΐ 1:5000 biotinylované 4G10:TBST. Inkubuje se 45 minut při pokojové teplotě za stálého třepání.14. Add 100 μΐ 1: 5000 biotinylated 4G10: TBST to each well. Incubate for 45 minutes at room temperature with shaking.

199 • ·199 • ·

15. Zatímco se výše uvedená destička inkubuje, přidá se do 10 ml TBST 50 μΐ roztoků A & B z ABC soupravy. Tyto roztoky se musí míchat přibližně 30 minut před použitím.15. While incubating the above plate, add 50 μΐ of A & B solutions from the ABC kit to 10 ml TBST. These solutions must be mixed approximately 30 minutes before use.

16. Destičky se omyjí postupem uvedeným v kroku 4.16. Wash the plates as described in step 4.

17. Do každé jamky se přidá 100 μΐ předem připraveného A & B komplexu. Inkubuje se 30 minut za stálého třepání při pokojové teplotě.17. Add 100 μΐ of the previously prepared A & B complex to each well. Incubate for 30 minutes with constant shaking at room temperature.

18. Destičky se omyjí postupem uvedeným v kroku 4.18. Wash the plates as described in step 4.

19. Přidá se 100 μΐ turbo-TMB. Třepe se při pokojové teplotě 10-15 minut.19. Add 100 μΐ turbo-TMB. Shake at room temperature for 10-15 minutes.

20. Jakmile zabarvení jamek s pozitivní kontrolou dosáhne absorbance kolem 0,35-0,4, reakce se zastaví 100 μΐ turbo-TMB stopovacího roztoku.20. When the color of the positive control wells reaches an absorbance of about 0.35-0.4, the reaction is stopped with 100 μΐ of turbo-TMB stop solution.

21. Destičky se odečtou na Dynatech MR7000 ELISA mikrofotometru, testovací filtr: 450 nM, referenční filtr: 410 nM.21. Plates are read on a Dynatech MR7000 ELISA Microphotometer, Test Filter: 450 nM, Reference Filter: 410 nM.

HUV-EC-C testHUV-EC-C test

Následující protokol může být rovněž použit pro měření aktivity sloučeniny proti PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF nebo Flk-1/KDR, které jsou všechny přirozeně exprimovány buňkami HUV-EC.The following protocol can also be used to measure the activity of a compound against PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF or Flk-1 / KDR, all of which are naturally expressed by HUV-EC cells.

Den 0Day 0

1. HUV-EC-C buňky se omyjí a trypsinizují, (American Type Culture Collection, (ATCC) kat. č. 1730 CRL). Omyjí se Dulbeccovým fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem (D-PBS, získaný od Gibco BRL, kat. č. 14190-029) 2x v množství 1 ml/10 cm² láhve na tkáňové kultury. Trypsinizují se 0,05 % trypsin-EDTA v neenzymatickém buňky disociujícím roztoku (Sigma Chemical Company, kat. č. C-1544). 0,05 % trypsin se připraví ředěním 0,25 % trypsin/1 mM EDTA (Gibco, katalogové č. 25200-049) buňky disociujícím roztokem. Trypsinizuje se asi 1 ml/25-30 cm láhve na1. HUV-EC-C cells are washed and trypsinized, (American Type Culture Collection, (ATCC) Cat. No. 1730 CRL). Wash with Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS, obtained from Gibco BRL, Cat. No. 14190-029) 2x in a 1 ml / 10 cm ² tissue culture flask. Trypsinize with 0.05% trypsin-EDTA in a non-enzymatic cell dissociating solution (Sigma Chemical Company, Cat. No. C-1544). 0.05% trypsin was prepared by diluting 0.25% trypsin / 1 mM EDTA (Gibco, Catalog # 25200-049) of the cell with dissociating solution. Trypsinize about 1 ml / 25-30 cm flask per

200200

tkáňové kultury po dobu 5 minut při teplotě 37°C. Jakmile se buňky oddělí od láhve, přidá se ekvivalentní objem testovacího media a přenese se do sterilní 50 ml centrifugační zkumavky (Fischer Scientific, katalogové č. 05-539-6).tissue culture for 5 minutes at 37 ° C. Once the cells were separated from the flask, an equivalent volume of assay medium was added and transferred to a sterile 50 ml centrifuge tube (Fischer Scientific, Catalog No. 05-539-6).

2. Buňky se omyjí asi 35 ml testovacího media ve sterilní 50 ml centrifugační zkumavce přidáním tohoto testovacího media, centrifugují se 10 minut při rychlosti přibližně 200xg, supernatant se odsaje, buňky se resuspendují 35 ml D-PBS. Omytí se opakuje ještě 2x s D-PBS, buňky se resuspendují asi v 1 ml testovacího media/15 cm² láhve na tkáňové kultury. Testovací medium se skládá z media F12K (Gibco BRL, katalogové č. 21127-014) a 0,5 % teplem inaktivovaného fetálního hovězího séra. Buňky se spočítají pomocí Coulter Counter® (Coulter Electronics, lne.) a k buňkám se přidá testovací medium, aby se získala koncentrace 0,81,0 x 10⁵ buněk/ml.2. Wash the cells with about 35 ml of test medium in a sterile 50 ml centrifuge tube by adding this test medium, centrifuge at approximately 200xg for 10 minutes, aspirate the supernatant, and resuspend the cells with 35 ml of D-PBS. Washing is repeated two more times with D-PBS, cells are resuspended in about 1 ml assay medium / 15 cm ² tissue culture flask. The assay medium consists of F12K medium (Gibco BRL, Catalog No. 21127-014) and 0.5% heat-inactivated fetal bovine serum. Cells are counted with Coulter Counter® (Coulter Electronics, Inc) and assay medium is added to the cells to obtain a concentration of 0.81.0 x 10 ⁵ cells / ml.

3. Buňky se přidají do 96ti-jamkových destiček s plochým dnem v množství 100 μΐ/jamka nebo 0,8-1,0 x 10⁴ buněk/jamka, inkubují se přibližně 24 hodin při teplotě 37°C v 5 % CO₂.3. Add cells to 100-well flat-bottom 96-well plates or 0.8-1.0 x 10 ⁴ cells / well, incubate for approximately 24 hours at 37 ° C in 5% CO ₂ .

Den 1Day 1

1. Připraví se dvojnásobné titrace testovacích sloučenin v samostatných 96ti-jamkových destičkách, obvykle od 50 mM dolů k 0 mM. Použije se stejné testovací medium jako pro den 0, krok 2 výše. Titrace se provedou přidáním 90 μΐ/jamka testovací sloučeniny v 200 μΜ (4x konečná koncentrace v jamce) do horní jamky příslušného sloupce na destičce. Protože zásobní testovaná sloučenina je obvykle 20 mM v DMSO, obsahuje 200 μΜ koncentrace látky 2 % DMSO.1. Prepare two-fold titrations of test compounds in separate 96-well plates, usually from 50 mM down to 0 mM. Use the same assay medium as for day 0, step 2 above. Titrations are performed by adding 90 μΐ / well of test compound at 200 μΜ (4x final concentration per well) to the upper well of the appropriate column on the plate. Because the stock test compound is usually 20 mM in DMSO, it contains 200 μΜ of 2% DMSO.

Ředidlo s koncentrací 2 % DMSO v testovacím mediu (F12K + 0,5 % fetální hovězí sérum) se použije jako ředidlo pro titrace testovaných sloučenin, aby se testované sloučeniny naředily a přitom uchovala stálá koncentrace DMSO. Toto ředidlo se přidá ke zbývajícím jamkámA 2% DMSO diluent in assay medium (F12K + 0.5% fetal bovine serum) is used as a diluent for titration of test compounds to dilute test compounds while maintaining a constant DMSO concentration. This diluent was added to the remaining wells

201201

99 9 ve sloupci v množství 60 μΙ/jamka. Vezme se 60 μΐ ze 120 μΐ 200 μΜ ředění testované sloučeniny na počátku sloupce jamek a smíchá se s 60 μΐ ve druhé jamce téhož sloupce. Vezme se 60 μΐ z této jamky a smíchá se 60 μΐ ve třetí jamce téhož sloupce a tak dále, dokud se neprovede dvojí titrace. Jakmile se smíchá předposlední jamka, vezme se 60 μΐ ze 120 μΐ v této jamce a dá se stranou. Poslední jamka se ponechá se 60 μΐ DMSO/ředící medium jako kontrola neobsahující testovanou sloučeninu. Připraví se 9 sloupců titrací testovaných sloučenin pro trojice jamek každá pro: (1) VEGF (získané of Pepro Tech lne., katalogové č. 100-200, (2) růstový faktor endoteliálních buněk (ECGF), (rovněž známý jako kyselý fibroblastový růstový faktor nebo aFGF) (získaný od Boehringer Mannheim Biochemica, katalogové č. 1439 600) nebo (3) lidský PDGF B/B (1276-956), Boehringer Mannheim, Německo) a kontrola s testovacím mediem. ECGF se připravuje s heparinem sodným.99 9 in the column at 60 μΙ / well. Take 60 μΐ of the 120 μΐ 200 μΜ dilution of the test compound at the beginning of the well column and mix with 60 μΐ in the second well of the same column. Take 60 μΐ from this well and mix 60 μΐ in the third well of the same column and so on until double titration. Once the penultimate well is mixed, take 60 μΐ of 120 μΐ in that well and set aside. Leave the last well with 60 μΐ DMSO / Dilution Medium as a control without test compound. Nine columns of test compounds are prepared for triplicate wells each for: (1) VEGF (obtained from Pepro Tech Inc., Catalog No. 100-200, (2) Endothelial Cell Growth Factor (ECGF) (also known as Acid Fibroblast Growth) Factor or aFGF) (obtained from Boehringer Mannheim Biochemica, Cat. No. 1439 600) or (3) human PDGF B / B (1276-956), Boehringer Mannheim, Germany) and control with test medium. ECGF is prepared with sodium heparin.

2. Do každé jamky 96ti-jamkové testovací destičky, která v každé jamce obsahuje ve 100 μΐ 0,8-l,0xl0⁴ HUV-EC-C buněk ze dne 0, se přenese 50 μΐ naředěných testovaných sloučenin a inkubuje se přibližně 2 hodiny při teplotě 37°C a 5 % CO₂.2. To each well of a 96-well assay plate containing 100 μΐ of 0.8-l, 0x10 ⁴ HUV-EC-C cells from day 0, 50 μΐ of diluted test compounds are transferred and incubated for approximately 2 hours at 37 ° C and 5% CO ₂ .

3. Do trojic jamek se přidá 50 μΙ/jamka z 80 μg/ml VEGF, 20 ng/ml ECGF nebo kontrolního media ke každé testované sloučenině. S testovanými sloučeninami mají růstové faktory 4X požadovanou konečnou koncentraci. K přípravě koncentrací růstových faktorů se použije testovací medium ze dne 0 kroku 2. Inkubuje se přibližně 24 hodin při 37°C, 5 % CO₂. Každá jamka bude mít 50 μΐ ředěné testované sloučeniny, 50 μΐ růstového faktoru nebo media, 100 μΐ buněk, což dohromady dělá 200 μΐ v každé jamce. Jakmile se vše přidá do jamek, dosáhne se 4X koncentrace testovaných sloučenin a růstových faktorů IX.3. Add 50 μΙ / well of 80 μg / ml VEGF, 20 ng / ml ECGF or control medium to each test compound in triplicate wells. With the test compounds, growth factors 4X have the desired final concentration. Test medium from step 2 is used to prepare growth factor concentrations. Incubate for approximately 24 hours at 37 ° C, 5% CO ₂ . Each well will have 50 μΐ of diluted test compound, 50 μΐ of growth factor or medium, 100 μ, of cells, which together makes 200 μΐ in each well. Once everything is added to the wells, a 4X concentration of test compounds and growth factors IX is achieved.

zuzzuz

Den 2Day 2

l.Do každé jamky se přidá H-thymidin (Amersham, katalog, č. TRK686) v 1 pCi/jamka (10 μΙ/jamka roztoku 100 pCi/ml připraveného v RPMI mediu + 10 % teplotně inaktivované fetální hovězí sérum) a inkubuje se asi 24 hodin při teplotě 37°C, 5 % CO₂. RPMI se získá of Gibco BRL, katalog, č. 1 1875-051.1. Add H-thymidine (Amersham, catalog # TRK686) to each well at 1 pCi / well (10 μΙ / well of 100 pCi / ml solution prepared in RPMI medium + 10% heat-inactivated fetal bovine serum) and incubate. about 24 hours at 37 ° C, 5% CO ₂ . RPMI was obtained from Gibco BRL, Catalog No. 1 1875-051.

Den 3Day 3

1. Destičky se zmrazí přes noc při teplotě -20°C.1. Plates are frozen overnight at -20 ° C.

Den 4Day 4

Destičky se rozmrazí a sklidí na sklízecím zařízení pro 96ti-jamkové destičky (Tomtec Harvester 96®) na filtry (Wallac, katalog, č. 1205401), rozpady se odečtou v tekutinovém scintilačním spektrofotometru Wallac Betaplate™.The plates are thawed and harvested on a 96-well plate harvesting machine (Tomtec Harvester 96®) for filter filters (Wallac, catalog # 1205401), and counts are counted in a Wallac Betaplate ™ liquid scintillation spectrophotometer.

In vivo živočišné modelyIn vivo animal models

Modely štěpů živočišných tkáníAnimal tissue graft models

Schopnost lidských nádorů růst na tkáňových štěpech na athymovaných myších (např. Balb/c, nu/nu) poskytuje užitečný in vivo model pro studium biologické odpovědi na léčbu lidských nádorů. Od dob první úspěšné xenotransplantace lidského nádoru do athymovaných myší (Rygaard and Povlsen, 1969, Acta Patho. Microbial. Scand. 77:758-760), bylo holým myším transplantováno a na nich pěstováno mnoho různých lidských nádorových buněčných linií (např. buňky mléčných žláz, plic, močopohlavního traktu, gastrointestinální, hlavy a krku, glioblastomy, kostí a buňky maligních melanomů). Následující test lze použít k určení hladiny aktivity, specifity a účinku různých sloučenin předkládaného vynálezu. Pro hodnocení sloučenin jsou vhodné tři základní typy testů:The ability of human tumors to grow on tissue grafts in athymic mice (eg, Balb / c, nu / nu) provides a useful in vivo model for studying the biological response to the treatment of human tumors. Since the first successful xenotransplantation of a human tumor into athymic mice (Rygaard and Povlsen, 1969, Acta Patho. Microbial. Scand. 77: 758-760), many different human tumor cell lines (eg, milk cells) have been transplanted and grown on nude mice. glands, lungs, gastrointestinal tract, gastrointestinal, head and neck, glioblastomas, bone and malignant melanoma cells). The following assay can be used to determine the level of activity, specificity and effect of various compounds of the present invention. Three basic types of tests are suitable for evaluating compounds:

203203

9999 buněčný/katalytický, buněčný/biologický a in vivo. Předmětem buněěného/katalytického testu je určení účinku sloučeniny na schopnost TK fosforylovat tyroziny na známém substrátu v buňce. Předmětem buněčného/biologického testu je určení účinku sloučeniny na biologickou odpověď stimulovanou TK v buňce. Předmětem in vivo testů je určení účinku sloučeniny v živočišném modelu určitého onemocnění, jako je rakovina.9999 cellular / catalytic, cellular / biological and in vivo. The object of a cellular / catalytic assay is to determine the effect of a compound on the ability of TK to phosphorylate tyrosines on a known substrate in a cell. The object of a cellular / biological assay is to determine the effect of a compound on a TK-stimulated biological response in a cell. The subject of in vivo assays is to determine the effect of a compound in an animal model of a disease, such as cancer.

Vhodné buněčné linie pro experimenty se subkutánními cizorodými štěpy zahrnuji buňky C6 (gliom, ATCC # CCL 107), buňky A375 (melanom, ATCC # CRL 1 555), buňky Calu 6 (plíce, ATCC # HTB 56), buňky PC3 (prostata, ATCC # CRL 1435), buňky SKOV3TP5 a NIH 3T3 fibroblasty geneticky upravené pro zvýšenou expresi EGFR, PDGFR, IGF-1R nebo kterékoli testované kinázy. K provedení experimentů s cizorodými štěpy lze použít následující protokol:Suitable cell lines for experiments with subcutaneous foreign grafts include C6 cells (glioma, ATCC # CCL 107), A375 cells (melanoma, ATCC # CRL 1555), Calu 6 cells (lung, ATCC # HTB 56), PC3 cells (prostate, ATCC # CRL 1435), SKOV3TP5 cells and NIH 3T3 fibroblasts engineered for overexpression of EGFR, PDGFR, IGF-1R, or any kinase tested. The following protocol can be used to conduct experiments with foreign grafts:

Samice athymovaných myší (BALB/c, nu/nu) se získají od Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). Všechna zvířata jsou udržována ve sterilních podmínkách v klecích Micro-isolator na podestýlce Alpha-dri. Dostávají sterilní krmivo pro hlodavce a vodu podle libosti.Female athymic mice (BALB / c, nu / nu) are obtained from Simonsen Laboratories (Gilroy, CA). All animals are maintained under sterile conditions in Micro-isolator cages on Alpha-dri bedding. They receive sterile food for rodents and water ad libitum.

Buněčné linie jsou pěstovány na vhodném mediu (například MEM, DMEM, Hamovo F10 nebo Hamovo F12 s přídavkem 5 % - 10 % fetálního hovězího séra (FBS) a 2 mM glutaminem (GLN) ). Pokud není uvedeno jinak, jsou všechna media pro buněčné kultury, glutamin a fetální hovězí sérum nakupovány od Gibco Life Technologies (Grand Island, NY). Všechny buňky jsou pěstovány ve vlhké atmosféře 90 95 % vzduchu a 5 - 10 % CO₂ při 37°C. Všechny buněčné linie jsou rutinně pasážovány dvakrát týdně a negativní na mykoplazmy, což se určí metodou Mycotest (Gibco).Cell lines are cultured on a suitable medium (e.g., MEM, DMEM, Ham's F10 or Ham's F12 with the addition of 5% -10% fetal bovine serum (FBS) and 2 mM glutamine (GLN)). Unless otherwise noted, all cell culture media, glutamine and fetal bovine serum are purchased from Gibco Life Technologies (Grand Island, NY). All cells are grown in a humid atmosphere of 90 95% air and 5-10% CO ₂ at 37 ° C. All cell lines are routinely passaged twice a week and negative for mycoplasmas, as determined by the Mycotest method (Gibco).

Buňky se sklízejí při plném či téměř plném pokryvu 0,05 % Trypsin-EDTA a peletují při 450 x g po dobu 10 minut. Pelety se resuspendují ve sterilním PBS nebo v médiu (bez PBS) do určité koncentrace a buňky se implantují do zadní části boku myši (8-10 myší ve skupině, 2-10xl0⁶ buněk/zvíře). Růst nádoru se měří po 3 až 6Cells are harvested at 0.05% Trypsin-EDTA full or near full coverage and pelleted at 450 xg for 10 minutes. The pellets are resuspended in sterile PBS or in medium (without PBS) to a certain concentration and the cells are implanted in the back of the flank of the mouse (8-10 mice per group, 2-10x10 ⁶ cells / animal). Tumor growth is measured after 3 to 6

204 týdnech s použitím plášťových kaliperů. Pokud není uvedeno jinak, jsou objemy nádorů vypočítány jako součin délka x šířka x výška. P hodnoty jsou vypočítávány pomocí Studentského t-testu. Testované sloučeniny ve 50 - 100 μΐ vehikula (DMSO nebo VPD:D5W) mohou být vpraveny IP injekcí v různých koncentracích aplikovaných první den po implantaci.204 weeks using jacketed calipers. Unless otherwise stated, tumor volumes are calculated as the product of length x width x height. P values are calculated using Student's t-test. Test compounds in 50-100 μΐ vehicle (DMSO or VPD: D5W) can be injected IP at various concentrations applied on the first day after implantation.

Nádorový invazivní modelTumor invasive model

Následující nádorový invazivní model byl vyvinut pro vyhodnocení léčebné hodnoty a účinku sloučenin selektivně inhibujících receptor KDR/FLK-1.The following tumor invasive model was developed to evaluate the therapeutic value and effect of compounds selectively inhibiting the KDR / FLK-1 receptor.

PostupMethod

Jako pokusná zvířata jsou použity osmitýdenní holé myši (samice) (Simonsen lne.). Implantace nádorových buněk může být provedena v laminárním boxu. Jako anestetikum se podává intraperitoneálně Xylazin/Ketamin koktejl (100 mg/kg ketaminu a 5mg/kg Xylazinu). Odkrytí břišní dutiny se provádí středním řezem (přibližně 1,5 cm dlouhým), do dutiny se injikuje 100 μΐ media s 10⁷ nádorových buněk. Buňky se vstřikují buď do duodenálního laloku, nebo do serózní blány tlustého střeva. Peritoneum a svaly se uzavřou hedvábím 6-0 pokračovacím stehem a kůže je uzavřena použitím svorek. Zvířata jsou denně pozorována.Eight-week-old nude mice (female) (Simonsen Inc) are used as test animals. Implantation of tumor cells can be performed in a laminar box. Xylazine / Ketamine cocktail (100 mg / kg ketamine and 5mg / kg Xylazine) is administered intraperitoneally as an anesthetic. The abdominal cavity is uncovered by a medium incision (approximately 1.5 cm long), injecting 100 μΐ medium with 10 ⁷ tumor cells into the cavity. Cells are injected either into the duodenal lobe or into the serous colon membrane. The peritoneum and muscles are closed with a 6-0 silk continuation stitch and the skin is closed using clamps. Animals are observed daily.

AnalýzaAnalysis

Po 2 - 6 týdnech, podle výsledků pozorování pokusných zvířat, jsou myši utraceny a metastázy lokálních nádorů do různých orgánů (plíce, játra, mozek, žaludek, slezina, srdce, svaly) jsou vyjmuty a analyzovány (měření velikosti nádory, stupeň invaze, imunochemie, hybridizační testy in šitu atd.).After 2-6 weeks, according to the observations of the experimental animals, mice are sacrificed and local tumor metastases to various organs (lungs, liver, brain, stomach, spleen, heart, muscles) are removed and analyzed (tumor size measurement, degree of invasion, immunochemistry) , in situ hybridization tests, etc.).

• 9 ·· • 9 9 9• 9 9 • 9 • 9

9 99 9

205 • 999205 • 999

Měření buněčné toxicityMeasurement of cell toxicity

Léčebné sloučeniny by se měly spíše účastnit inhibice aktivity tyrozinkinázy než vykazovat cytotoxický účinek. Měření účinnosti a buněčné toxicity sloučeniny se může získat určením léčebného indexu, tj. IC50/LD50. IC50, dávka potřebná k dosažení 50 % inhibice, se může měřit použitím standardních technik, které jsou zde popsány. LD50, dávka vedoucí k 50 % toxicitě, může být rovněž měřena standardními postupy (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65:55-63), měřením množství uvolněného LDH (Korzeniewski a Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64:313, Decker a Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods, 115-61) nebo měřením letální dávky v živočišných modelech. Dává se přednost sloučeninám s velkým léčebným indexem. Léčebný index by měl být větší než 2, nejlépe alespoň 10 a ještě lépe alespoň 50.Therapeutic compounds should be involved in inhibiting tyrosine kinase activity rather than exhibiting a cytotoxic effect. Measurement of potency and cellular toxicity of a compound can be obtained by determining the treatment index, i.e., the IC50 / LD50. The IC 50, the dose required to achieve 50% inhibition, can be measured using standard techniques described herein. LD50, a dose resulting in 50% toxicity, can also be measured by standard procedures (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65: 55-63), by measuring the amount of LDH released (Korzeniewski and Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64: 313, Decker and Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods, 115-61) or by measuring lethal dose in animal models. Compounds with a large therapeutic index are preferred. The treatment index should be greater than 2, preferably at least 10, more preferably at least 50.

B. Příklady - Biologická aktivita.B. Examples - Biological activity.

Příklady in vitro účinnosti sloučenin tohoto vynálezu jsou uvedeny v Tabulce 1 a 2. Údaje ukazují, že tyto sloučeny jsou obecně účinné vůči různým PTK in vitro. Například několik sloučenin tohoto vynálezu, jsou-li podávány orálně, vykazuje značně redukovanou průměrnou velikost nádorů typu gliom C6 subkutánně implantovaných do myší. Nicméně sloučenina 5 se v porovnání s ostatními sloučeninami tohoto vynálezu projevuje výrazně nejlépe. V jednom experimentu se samicím myší BALB/c nu/nu v den 0 implantují subkutánně do zadního boku buňky lidského gliomu C6 (3 x 10⁶ buněk, n = 10 - 20 zvířat/skupina). Den po implantaci se myším orálně podávají sloučeniny 3, 5, 19 a 20 ve vodném labrasolu v dávce 200 mg/kg/den. Růst nádoru se měří pomocí kaliperů a objemy nádorů se vypočítají jako součin délka x šířka x výška.Examples of in vitro potency of the compounds of this invention are shown in Tables 1 and 2. The data show that these compounds are generally effective against various PTKs in vitro. For example, several compounds of the invention, when administered orally, exhibit a significantly reduced average size of C6 glioma tumors subcutaneously implanted in mice. However, Compound 5 is significantly superior to other compounds of the invention. In one experiment, female BALB / c nu / nu mice were implanted subcutaneously on the posterior flank of human C6 glioma cells (3 x 10 ⁶ cells, n = 10-20 animals / group) on day 0. The day after implantation, mice were orally administered compounds 3, 5, 19 and 20 in aqueous labrasol at a dose of 200 mg / kg / day. Tumor growth is measured by calipers and tumor volumes are calculated as the product of length x width x height.

Jak je uvedeno v následujícím grafu, vykazují všechny testované sloučeniny značnou inhibici ve srovnání s kontrolou obsahující pouze vehikulum. Avšak, přestože má sloučenina 5 strukturu podobnou ostatním testovaným sloučeninám, jsou její účinky výrazně odlišné. To jest, zatímco inhibice nádorového růstu sloučeninami 3, 19 a 21 je 18.den po implantaci kolem 40 - 45 %, sloučenina 5 inhibuje růst nádoru v této době 80 - 85 %.As shown in the following graph, all test compounds show significant inhibition compared to vehicle-only control. However, although Compound 5 has a structure similar to the other compounds tested, its effects are significantly different. That is, while inhibition of tumor growth by compounds 3, 19, and 21 is about 40-45% on the 18th day after implantation, compound 5 inhibits tumor growth at this time by 80-85%.

207 • ••4 «207 • •• 3 «

Tato neočekávaná účinnost sloučeniny 5 in vivo, zvláště po orálním použití, se dále projevuje v porovnání se sloučeninou 65:This unexpected efficacy of compound 5 in vivo, especially after oral use, is further demonstrated in comparison to compound 65:

Sloučenina 65 vykazuje téměř řádově vyšší účinek in vitro než sloučenina 5 (data nejsou uvedena). Nicméně, je-li testována interperitoneálně v myších proti různým liniím nádorových buněk, SF763T a SF767T, vykazuje sloučenina 5 mírně vyšší (5 % vyšší inhibice po 21 dnech) až značně vyšší (14 % vyšší inhibice po 21 dnech) účinek než sloučenina 65.Compound 65 exhibits almost an order of magnitude greater in vitro effect than compound 5 (data not shown). However, when tested interperitoneally in mice against different tumor cell lines, SF763T and SF767T, Compound 5 shows a slightly higher (5% higher inhibition after 21 days) to a significantly higher (14% higher inhibition after 21 days) effect than Compound 65.

9» « 9 «9

208 • 9*9 ·· ·208 • 9 * 9 ·· ·

9 99 • 9 ** 9 • 99 99 • 9 ** 9 • 9

99·· 999 »· 9 «99 • 9 · • 99 999 ·· 999 9 9 99 9 9

9 99 9

9 9 99 9 9

Rozdíl v aktivitě sloučeniny 5 a 65 je ještě vyšší, když jsou tyto sloučeniny podávány orálně. Orální účinek sloučeniny 65 a několika jejích analogů, sloučenin 66 - 69, je uveden v následujícím grafu.The difference in activity of compounds 5 and 65 is even greater when these compounds are administered orally. The oral effect of compound 65 and several analogues thereof, compounds 66-69, is shown in the following graph.

25002000f15001000 —O— • o25002000f15001000 —O— • o

Dny po implantaci sloučenina 66 sloučenina 67 sloučenina 68 sloučenina 69 sloučenina 65 vodný labarsol neošetrovaný sub • * * · 4 4 • 4 · 4 4Days after implantation compound 66 compound 67 compound 68 compound 69 compound 65 aqueous labarsol untreated sub • * * · 4 4 • 4 · 4 4

4 4 4 4 *4 4 4 4

4 4 4 4 ·· 4444 44 444 «4 4 4 4 ·· 4444 44 444 «

ϊϊ

209 ♦ 444 · · ·209 ♦ 445 · · ·

££67 68£ 68

Jak je vidět na grafu, sloučenina 65 podávaná orálně v množství 200 mg/kg/den vykazuje přibližně 65 % inhibici nádorů C6 18 dnů po subkutánní implantaci do myší, což je jasně více v porovnání s analogy této sloučeniny, které vykazují v průměru 14 - 16 % inhibici nádorového růstu. Nicméně je překvapivé, že orální účinek sloučeniny 65 je přesto značně nižší než sloučeniny 5, která, jak je uvedeno výše, vykazuje 80 - 85 % inhibici ve stejné době a ve stejném nádorovém modelu.As shown in the graph, compound 65 administered orally at 200 mg / kg / day exhibits approximately 65% inhibition of C6 tumors 18 days after subcutaneous implantation in mice, which is clearly more compared to analogues of this compound which exhibit an average of 14- 16% inhibition of tumor growth. However, it is surprising that the oral effect of Compound 65 is still considerably lower than Compound 5, which, as noted above, exhibits 80-85% inhibition at the same time and in the same tumor model.

Ve srovnání se sloučeninou 70 vykazuje sloučenina 5 značně menší K/s (tj. větší účinek) (inhibiční konstantu) proti FGR-R1 (1,2 pro sloučeninu 5 oproti 19,49 pro sloučeninu 70) a PDGFR (data nejsou uvedena).Compared to compound 70, compound 5 exhibits a significantly smaller K / s (ie greater effect) (inhibitory constant) against FGR-R1 (1.2 for compound 5 versus 19.49 for compound 70) and PDGFR (data not shown).

• ·• ·

210210

ZQ.ZQ.

Neočekávaná kvalita sloučeniny 5 je dále prokázána, je-li její účinek porovnán s účinkem jejího blízkého analogu, sloučeniny 71:The unexpected quality of compound 5 is further demonstrated when its effect is compared to that of its close analogue, compound 71:

Přes strukturální podobnost vykazuje sloučenina 71, je-li testována orálně při 200 mg/kg/den proti C6 lidským melanomům implantovaným subkutánně myším BALB/c nu/nu 18 dní po implantaci, pouze 57 % inhibici nádorového růstu (data nejsou uvedena) opět ve srovnání s 80 85 % inhibici, kterou vykazuje sloučenina 5.Despite structural similarity, compound 71, when tested orally at 200 mg / kg / day against C6 human melanomas implanted subcutaneously in BALB / c nu / nu mice 18 days after implantation, showed only 57% inhibition of tumor growth (data not shown) again in compared to 80 with 85% inhibition of compound 5.

Na základě výše uvedeného účinku sloučeniny 5 při orálním podávání je sloučenina 5 v současné době výhodným provedením tohoto vynálezu.Based on the above effect of Compound 5 when administered orally, Compound 5 is currently a preferred embodiment of the present invention.

ZÁVĚRCONCLUSION

Přínosem tohoto vynálezu je tedy to, že sloučeniny, metody a farmaceutická kompozice podle tohoto vynálezu jsou účinné v modulaci aktivity PK a tudíž se očekává jejich terapeutický účinek proti onemocnění v souvislosti s RTK, CTK- a STK.It is therefore a benefit of the present invention that the compounds, methods, and pharmaceutical compositions of the present invention are effective in modulating PK activity and hence expected to have a therapeutic effect against RTK, CTK- and STK-related diseases.

• ·• ·

211 • 9 · · » · · · ···· ··· ·· ···· ·· ···211 • 9 · »· · · · · · · · · · ·

Pracovníci v oboru rychle ocení, že tento vynález je dobře adaptován na provedení cílů a k dosažení konců a uvedených výhod včetně těch, které jsou součástí vynálezu. Molekulové komplexy a metody, postupy, léčby, molekuly, specifické sloučeniny zde popsané jsou v současnosti představiteli výhodných provedení, jsou exemplární a nejsou zamýšleny jako omezení rozsahu tohoto vynálezu. Jejich změny a další využití, ke kterým pracovníci v oboru znalí povahy tohoto vynálezu dospějí, jsou definovány rozsahem patentových nároků.Those skilled in the art will readily appreciate that the present invention is well adapted to accomplish the objectives and to achieve the ends and said advantages, including those which are part of the invention. The molecular complexes and methods, procedures, treatments, molecules, specific compounds described herein are presently representative of preferred embodiments, are exemplary and are not intended to limit the scope of the invention. Their changes and other uses, as will be understood by those skilled in the art, will be defined by the scope of the claims.

Pracovníkům v oboru bude jasně zřejmé, že variace substitucí a modifikací mohou být provedeny ve zde předkládaném vynálezu bez odklonu od jeho povahy a rozsahu.It will be apparent to those skilled in the art that variations in substitutions and modifications may be made in the present invention without departing from the nature and scope thereof.

Veškeré patenty a publikace uvedené ve specifikaci jsou příznačné pro úroveň pracovníků v oboru, kterých se tento vynález týká. Všechny patenty a publikace jsou zde začleněny pomocí odkazů ve stejném rozsahu, v jakém by byla každá jednotlivá publikace specificky a individuálně označena pro začlenění odkazem.All patents and publications mentioned in the specification are representative of the level of those skilled in the art to which this invention pertains. All patents and publications are incorporated herein by reference to the same extent that each individual publication would be specifically and individually designated for inclusion by reference.

Tento vynález zde vhodně a názorně popsán může být prováděn v nepřítomnosti jakéhokoli prvku či prvků, jednoho či více omezení, které zde nejsou specificky určeny. Tak, například, v každé situaci může zde být jakýkoli z termínů obsahující, sestávající zejména z a sestávající z nahrazen kterýmkoli z ostatních dvou termínů. Termíny a výrazy, které byly použity, jsou používány jako termíny popisné nikoli omezující, a neexistuje záměr, aby z použití takových termínů a výrazů byly vyjímány jakékoli ekvivalenty vlastností ukázaných a zde popsaných nebo jejich částí, ale uznává se, že v rozsahu nárokovaného vynálezu jsou možné různé modifikace. Tím by mělo být srozuměno, že ačkoli je tento současný vynález specificky určen výhodnými provedeními a libovolnými vlastnostmi, modifikace a variace obsahu zde uvedeného, ke kterým se pracovníci v oboru mohou uchýlit, jsou považovány za součást rozsahu tohoto vynálezu, jak je definováno v patentových nárocích v dodatku.The present invention suitably and exemplified herein may be practiced in the absence of any element or elements, one or more of the limitations not specifically set forth herein. Thus, for example, in any situation, any of the terms comprising, consisting essentially of, and consisting of, may be replaced by any of the other two terms. The terms and expressions used herein are used as descriptive, not limiting, and there is no intention to exclude from the use of such terms and expressions any equivalents of the properties shown and described herein or parts thereof, but it is recognized that within the scope of the claimed invention various modifications possible. It should be understood that although the present invention is specifically determined by the preferred embodiments and arbitrary features, modifications and variations of the content herein to which the skilled artisan can resort are considered to be within the scope of the invention as defined in the claims in the Appendix.

Dále tam, kde jsou vlastnosti či aspekty tohoto vynálezu popisovány v termínech Markushových skupin, budou pracovníci vFurther, where the features or aspects of the present invention are described in terms of the Markush groups, the workers of the &quot;

212 oboru uznávat, že tento vynález je tímto také popisován v termínech kteréhokoli individuálního člena nebo podskupiny členů této Markushovy skupiny. Například, jestliže X je popisován a vybírán ze skupiny skládající se z bromu, chloru a jódu, jsou nároky na X, který je bromem, a nároky na X, který je bromem a chlorem, plně popsány.212 of the art will recognize that the present invention is also described herein in the terms of any individual member or subgroup of members of this Markush group. For example, when X is described and selected from the group consisting of bromine, chlorine, and iodine, the claims for X, which is bromine, and the claims for X, which is bromine and chlorine, are fully described.

Další provedení jsou mezi následujícími nároky.Further embodiments are among the following claims.

Claims (24)

PATENTOVÉ NÁROKYPATENT CLAIMS 1. Pyrrolem substituovaný 2-indolinon mající chemickou strukturu:1. Pyrrole substituted 2-indolinone having a chemical structure: kde:where: R¹ je vybrán ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, alkenylu, alkynylu, cykloalkylu, arylu, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, Ckarboxy skupiny, O-karboxy skupiny , acetylu, C-amidu, C-thioamidu, sulfonylu a trihalogenmethansulfonylu;R ¹ is selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, alkenyl, alkynyl, cycloalkyl, aryl, hydroxy, alkoxy, Ccarboxy, O-carboxy, acetyl, C-amide, C-thioamide, sulfonyl, and trihalomethanesulfonyl; R² je vybrán ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, halogenu, alkylu, cykloalkylu, arylu, heteroarylu a heteroalicyklů;R ² is selected from the group consisting of hydrogen, halogen, alkyl, cycloalkyl, aryl, heteroaryl and heteroalicyclic; R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, trihalogenalkylu, cykloalkylu, alkenylu, alkynylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklické skupiny, hydroxy skupiny , alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkylthio skupiny, arylthio skupiny , sulfinylu, sulfonylu, S-sulfonamidu, Nsulfonamidu, trihalogenmethansulfonamidu, karbonylu, C-karboxy skupiny , O-karboxy skupiny , C-amidu, N-amidu, kyano skupiny , nitro skupiny , halogenu, O-karbamylu, N-karbamylu, O-thiokarbamylu, N-thiokarbamylu, aminu a -NR^HR¹² ;R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are independently selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, trihaloalkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, heteroalicyclic, hydroxy, alkoxy, aryloxy, mercapto , alkylthio, arylthio, sulfinyl, sulfonyl, S-sulfonamide, Nsulfonamide, trihalomethanesulfonamide, carbonyl, C-carboxy, O-carboxy, C-amide, N-amide, cyano, nitro, halogen, O-carbamyl N-carbamyl, O-thiocarbamyl, N-thiocarbamyl, amino and -NR ^H R ^12; 'Zfy eil&i cP 214 iZfy eil & i cP 214 i R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, cykloalkylu, arylu, karbonylu, acetylu, sulfonylu, trifluormethansulfonylu a kombinovaných pěti- nebo šesti-ělenných heteroalicyklů;R ¹¹ and R ¹² are independently selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, cycloalkyl, aryl, carbonyl, acetyl, sulfonyl, trifluoromethanesulfonyl, and combined five- or six-membered heteroalicyclic; R³ a R⁴, R⁴ a R⁵, nebo R⁴ a R⁵ se mohou spojit a utvořit šesti-členný arylový kruh, methylendioxy skupinu nebo ethylendioxy skupinu;R ³ and R ⁴ , R ⁴ and R ⁵ , or R ⁴ and R ⁵ may combine to form a six-membered aryl ring, a methylenedioxy group or an ethylenedioxy group; R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, alkylu, cykloalkylu, alkenylu, alkynylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklů, hydroxy skupiny , alkoxy skupiny , aryloxy skupiny , karbonylu, acetylu, C-amidu, C-thioamidu, amidinu, C-karboxy skupiny, Okarboxy skupiny, sulfonylu a trihalogenmethan-sulfonylu;R ⁷ is selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, heteroalicyclic, hydroxy, alkoxy, aryloxy, carbonyl, acetyl, C-amide, C-thioamide, amidine, C -carboxy groups, ocarboxy groups, sulfonyl and trihalomethanesulfonyl; R⁸, R⁹ a R¹⁰ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atom vodíku, alkylu, trihalogenalkylu, cykloalkylu, alkenylu, alkynylu, arylu, heteroarylu, heteroalicyklů, hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, aryloxy skupiny, merkapto skupiny, alkylthio skupiny, arylthio skupiny, sulfinylu, sulfonylu, S-sulfonamidu, N-sulfonamidu, karbonylu, Ckarboxy skupiny, O-karboxy skupiny, kyano skupiny, nitro skupiny, halogenu, O-karbamylu, N-karbamylu, O- thiokarbamylu, Nthiokarbamylu, C-amidu, N-amidu, amino skupiny a NR^hR¹², za předpokladu, že nejméně jeden z R⁸, R⁹ nebo R¹⁰ je skupina mající vzorec -(alki)Z kde:R ⁸ , R ⁹ and R ¹⁰ are independently selected from the group consisting of hydrogen, alkyl, trihaloalkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, heteroalicyclic, hydroxy, alkoxy, aryloxy, mercapto, alkylthio, arylthio, sulfinyl, sulfonyl, S-sulfonamide, N-sulfonamide, carbonyl, C-carboxy, O-carboxy, cyano, nitro, halogen, O-carbamyl, N-carbamyl, O-thiocarbamyl, Nthiocarbamyl, C-amide , N-amide, amino groups and NR ^h R ¹² , provided that at least one of R ⁸ , R ⁹ or R ¹⁰ is a group having the formula - (alki) Z wherein: Alk) je vybrán ze skupiny sestávající se z alkylu, alkenylu nebo alkynylu;Alk) is selected from the group consisting of alkyl, alkenyl or alkynyl; a Z je a polární skupina, s výhradou, že je vyloučena sloučenina 6-nitro-3-(lH-pyrrol-2ylmetylen)-! ,3-dihydro-indol-2-on vzorceand Z is a polar group, with the proviso that 6-nitro-3- (1H-pyrrol-2-ylmethylene) - is excluded. 3-dihydro-indol-2-one of the formula NN HH 215 ·· · ·· ·· ·· • · · · ···» • · · « · ···* · • · · · · · ·« ··«< ··· tt <··· «· ···215 · · · t • t <t t t t t <<<t t t t t t t t t t t t t ··· 2. Sloučeniny podle nároku 1, kde R¹, R² a R⁷ jsou atomy vodíku.Compounds according to claim 1, wherein R ¹ , R ² and R ⁷ are hydrogen atoms. 3. Sloučeniny podle nároku 2, kde jeden z R⁸, R⁹ nebo R¹⁰ je alkiZ kde:Compounds according to claim 2, wherein one of R ⁸ , R ⁹ or R ¹⁰ is alkiZ wherein: alki je vybrán ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, nesubstituovaného nižšího alkenylu a nesubstituovaného nižšího alkynylu;alki is selected from the group consisting of unsubstituted lower alkyl, unsubstituted lower alkenyl and unsubstituted lower alkynyl; a Z je polární skupina vybrána ze skupiny sestávající se z hydroxy skupiny, alkoxy skupiny, C-karboxy skupiny, karbonylu, nitro skupiny, kyano skupiny, amino skupiny, amonium skupiny, -NRⁿR¹², C-amidu, S-sulfonamidu, sulfinylu, sulfonylu, fosfonylu, ureido skupiny, amidinu, guanidinylu, morfolinu, piperidinylu a tetrazolu.and Z is a polar group selected from the group consisting of hydroxy, alkoxy, C-carboxy, carbonyl, nitro, cyano, amino groups, ammonium groups, -NR ⁿ R ^12, C-amide, S-sulfonamide, sulfinyl, sulfonyl, phosphonyl, ureido, amidine, guanidinyl, morpholine, piperidinyl and tetrazole. 4. Sloučeniny podle nároku 1, kde R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z :Compounds according to claim 1, wherein R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are independently selected from the group consisting of: atomu vodíku; halogenu;a hydrogen atom; halogen; nesubstituovaného nižšího alkylu;unsubstituted lower alkyl; nižšího alkylu substituovaného jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z:lower alkyl substituted with one or more groups selected from the group consisting of: hydroxy skupiny; halogenu;hydroxy groups; halogen; C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z:C-carboxy groups substituted with a group selected from the group consisting of: atomu vodíku; nebo, nesubstituovaného nižšího alkylu;a hydrogen atom; or, unsubstituted lower alkyl; amino skupiny; nebo,amino groups; or, -NRR¹²;-NRR ¹² ; nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny;unsubstituted lower alkylalkoxy groups; nižší alkylalkoxy skupiny substituované jedním nebo více halogeny; nesubstituované aryloxy skupiny;lower alkylalkoxy groups substituted with one or more halogens; unsubstituted aryloxy groups; aryloxy skupiny substituované jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z:aryloxy groups substituted with one or more groups independently selected from the group consisting of: ·· • · · φ ♦·· · · φ ♦ 216 φφφ • · ·· · nesubstituovaného nižšího alkylu;216 unsubstituted lower alkyl; nižšího alkyl substituovaného jedním nebo více halogeny; hydroxy skupiny;lower alkyl substituted with one or more halogens; hydroxy groups; nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny; halogenu;unsubstituted lower alkylalkoxy groups; halogen; amino skupiny; nebo,amino groups; or, -NR¹^¹²;-NR ¹ = ¹² ; 11 1911 19 S-sulfonamidu kde R a R jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku a nesubstituovaného nižšího alkylu; nesubstituovaného arylu;S-sulfonamide wherein R and R are independently selected from the group consisting of hydrogen and unsubstituted lower alkyl; unsubstituted aryl; arylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybraným ze skupiny sestávající se z :aryl substituted with one or more groups independently selected from the group consisting of: halogenu;halogen; nesubstituovaného nižšího alkylu;unsubstituted lower alkyl; nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny; nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny; amino skupiny; nebo,lower alkyl substituted with one or more halogens; unsubstituted lower alkylalkoxy groups; amino groups; or, -NR^UR¹²; ^For -NR ¹² R; nesubstituovaného heteroarylu;unsubstituted heteroaryl; heteroarylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z :heteroaryl substituted with one or more groups independently selected from the group consisting of: nesubstituovaného nižšího alkyl;unsubstituted lower alkyl; nižšího alkylu substituovaného jedním nebo vícehalogeny; nesubstituované nižší alkyl alkoxy skupiny; hydroxy skupiny;lower alkyl substituted with one or more halogens; unsubstituted lower alkyl alkoxy groups; hydroxy groups; halogenu;halogen; amino skupiny; nebo,amino groups; or, -NRR¹²;-NRR ¹² ; nesubstituovaného heteroalicyklu;unsubstituted heteroalicyclic; heteroalicyklu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z:heteroalkyl substituted by one or more groups independently selected from the group consisting of: halogenu; hydroxy skupiny;halogen; hydroxy groups; 0 « 0 40 «0 3 0 0 « >000 000 0 «> 000 00 217 nesubstituovaného nižšího alkylu;217 unsubstituted lower alkyl; nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny; nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny; amino skupiny; nebo,lower alkyl substituted with one or more halogens; unsubstituted lower alkylalkoxy groups; amino groups; or, RR¹²;RR ¹² ; nesubstituované nižší alkyl O-karboxy skupiny ;unsubstituted lower alkyl O-carboxy groups; C-amidu, kde R a R jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a nesubstituovaného arylu;A C-amide wherein R and R are independently selected from the group consisting of hydrogen, unsubstituted lower alkyl and unsubstituted aryl; a N-amidu kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a nesubstituovaného arylu.and an N-amide wherein R ¹¹ and R ¹² are independently selected from the group consisting of hydrogen, unsubstituted lower alkyl and unsubstituted aryl. 5. Sloučenina podle nároku 3, kde R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou vybrány ze skupiny sestávající se z : atomu vodíku;The compound of claim 3, wherein R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are selected from the group consisting of: a hydrogen atom; halogenu;halogen; nesubstituovaného nižšího alkylu;unsubstituted lower alkyl; nižšího alkylu substituovaného jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z:lower alkyl substituted with one or more groups selected from the group consisting of: hydroxy skupiny; halogenu;hydroxy groups; halogen; C-karboxy skupiny substituované skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z:C-carboxy groups substituted with a group selected from the group consisting of: atomu vodíku; nebo, nesubstituovaného nižšího alkylu;a hydrogen atom; or, unsubstituted lower alkyl; amino skupiny; nebo,amino groups; or, -NRR¹²;-NRR ¹² ; nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny;unsubstituted lower alkylalkoxy groups; nižší alkylalkoxy skupiny substituované jedním nebo více halogeny; nesubstituované aryloxy skupiny;lower alkylalkoxy groups substituted with one or more halogens; unsubstituted aryloxy groups; aryloxy skupiny substituované jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z:aryloxy groups substituted with one or more groups independently selected from the group consisting of: • ·• · 218 ·«· * · · · · * · · « · · • ·· 1 1»1 11 111 nesubstituovaného nižšího alkylu;218 unsubstituted lower alkyl; nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny; hydroxy skupiny;lower alkyl substituted with one or more halogens; hydroxy groups; nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny; halogenu;unsubstituted lower alkylalkoxy groups; halogen; amino skupiny; nebo,amino groups; or, -NR¹¹R¹²;-NR ¹¹ R ¹² ; S-sulfonamidu, kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku a nesubstituovaného nižšího alkylu; nesubstituovaného arylu;S-sulfonamide wherein R ¹¹ and R ¹² are independently selected from the group consisting of hydrogen and unsubstituted lower alkyl; unsubstituted aryl; arylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z:aryl substituted with one or more groups independently selected from the group consisting of: halogenu;halogen; nesubstituovaného nižšího alkylu;unsubstituted lower alkyl; nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny; nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny; amino skupiny; nebo,lower alkyl substituted with one or more halogens; unsubstituted lower alkylalkoxy groups; amino groups; or, -NR“R¹²;-NR ¹¹ R ¹² ; nesubstituovaného heteroarylu;unsubstituted heteroaryl; heteroarylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z:heteroaryl substituted with one or more groups independently selected from the group consisting of: nesubstituovaného nižšího alkylu;unsubstituted lower alkyl; nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny; nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny; hydroxy skupiny;lower alkyl substituted with one or more halogens; unsubstituted lower alkylalkoxy groups; hydroxy groups; halogenu;halogen; amino skupiny; nebo,amino groups; or, -NRⁿR¹²;-NR ⁿ R ^12; nesubstituovaného heteroalicyklu;unsubstituted heteroalicyclic; heteroalicyklu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z:heteroalkyl substituted by one or more groups independently selected from the group consisting of: halogenu; hydroxy skupiny;halogen; hydroxy groups; 219 nesubstituovaného nižšího alkylu;219 unsubstituted lower alkyl; nižšího alkylu substituovaného jedním nebo více halogeny; nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny; amino skupiny; nebo,lower alkyl substituted with one or more halogens; unsubstituted lower alkylalkoxy groups; amino groups; or, R^UR¹²;R ^U R ^12; nesubstituované nižší alkyl O-karboxy skupiny;unsubstituted lower alkyl O-carboxy groups; C-amidu, kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a nesubstituovaného arylu;A C-amide wherein R ¹¹ and R ¹² are independently selected from the group consisting of hydrogen, unsubstituted lower alkyl, and unsubstituted aryl; a N-amidu, kde R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a nesubstituovaného arylu.and an N-amide wherein R ¹¹ and R ¹² are independently selected from the group consisting of hydrogen, unsubstituted lower alkyl, and unsubstituted aryl. 6. Sloučenina podle nároku 1, kde:The compound of claim 1, wherein: R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ a R⁷ jsou atom vodíku;R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ , R ⁶ and R ⁷ are hydrogen; R⁸ a R¹⁰ jsou methyl;R ⁸ and R ¹⁰ are methyl; a R⁹ je -(CH₂)(CH₂)C(=O)OH.and R ⁹ is - (CH ₂ ) (CH ₂ ) C (= O) OH. 7. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje: uvedenou sloučeninu podle nároku 6;A pharmaceutical composition comprising: said compound according to claim 6; a fyziologicky akceptovatelný nosič nebo vehikulum.and a physiologically acceptable carrier or vehicle. 8. Sloučenina podle nároku 1, kde:The compound of claim 1, wherein: R¹, R² a R⁷ jsou atom vodíku;R ¹ , R ² and R ⁷ are hydrogen; R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z: atomu vodíku; hydroxy skupiny; halogenu;R ³ , R ⁴ , R ⁵ and R ⁶ are independently selected from the group consisting of: hydrogen; hydroxy groups; halogen; nesubstituovaného nižšího alkylu;unsubstituted lower alkyl; nižšího alkylu substituovaného karboxylovou kyselinou;lower alkyl substituted with carboxylic acid; nesubstituované nižší alkoxy skupiny;unsubstituted lower alkoxy groups; karboxylové kyseliny;carboxylic acids; nesubstituovaného arylu;unsubstituted aryl; 220 ·· * Μ Φ· ΦΦ • Φ Φ · φφφφ ΦΦΦ220 ·· Μ Φ · ΦΦ ΦΦ Φ · φφφφ ΦΦΦ Φ Φ Φ Φ ΦΦΦΦΦΦ Φ Φ Φ ΦΦΦ Φ · ΦΦΦ φφφ • ΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦΦ arylu substituovaného jednou nebo více nesubstituovanými nižšími alkylalkoxy skupinami; nebo, morfolinem;Aryl substituted with one or more unsubstituted lower alkyl alkoxy groups; or, morpholine; R⁸ je vybrán ze skupiny sestávající se z atomu vodíku a nesubstituovaného nižšího alkylu;R ⁸ is selected from the group consisting of hydrogen and unsubstituted lower alkyl; R⁹ je -(CH₂)(CH₂)C(=O)OH;R ⁹ is - (CH ₂ ) (CH ₂ ) C (= O) OH; a R^{10 *} je nesubstituovaný nižší alkyl.and R10 ^* is unsubstituted lower alkyl. 9. Sloučenina podle nároku 2, kde R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající se z:The compound of claim 2, wherein R ⁷ is selected from the group consisting of: atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu, a nižšího alkylu substituovaného skupinou vybranou ze skupiny sestávající se z:a hydrogen atom, an unsubstituted lower alkyl, and a lower alkyl substituted with a group selected from the group consisting of: nesubstituovaného cykloalkylu, nesubstituovaného arylu, a arylu substituovaného skupinou vybranou z hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny a halogenu.unsubstituted cycloalkyl, unsubstituted aryl, and aryl substituted with a group selected from hydroxy, unsubstituted lower alkyl alkoxy and halogen. 10. Sloučenina podle nároku 2, kde Z je vybráno ze skupiny sestávající se z:The compound of claim 2, wherein Z is selected from the group consisting of: -C(=O)NR¹³R¹⁴, kde R¹³ a R¹⁴ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z:-C (= O) NR ¹³ R ¹⁴ , wherein R ¹³ and R ¹⁴ are independently selected from the group consisting of: atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného skupinou vybranou ze skupiny sestávsjící se z:a hydrogen atom, an unsubstituted lower alkyl, a lower alkyl substituted by a group selected from the group consisting of: amino skupiny a -NR^HR¹², nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z halogenu, hydroxy skupiny, nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny a trihalogenmethylu, φ φamino groups and -NR ^H R ¹² , unsubstituted aryl, aryl substituted with one or more groups selected from the group consisting of halogen, hydroxy, unsubstituted lower alkyl alkoxy and trihalomethyl, φ φ 221 • φ φφ φφφφ φφ φφφ φ φ φφφ φ φ · φ φ • φ φ φ φφ φφφφ φ φ nesubstituovaného heteroarylu, ne substituovaného heteroalicyklu, a kombinovaných, pěti-členných nebo šesti-členných ne substituovaných heteroalicyklů, a -NR“R¹², kde,221 • φ φφ φφφφ φφ φφφ φ φ φφφ φ φ · φ φ • φ φ φ φφ φφφφ φ φ unsubstituted heteroaryl, not substituted heteroalicyclic, and combined, a five-membered or six-membered heteroalicyclic not substituted, and NR "R ¹² where, R a R jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu a, kombinovaných pěti-členných nebo šesti-členných nesubstituovaných heteroalicyklů.R and R are independently selected from the group consisting of unsubstituted lower alkyl and, combined five-membered or six-membered unsubstituted heteroalicyclic. 11. Sloučenina podle nároku 1, kde:The compound of claim 1, wherein: R⁷ je vybrán ze skupiny sestávající se z nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jednou nebo více skupinami vybranými ze skupiny sestávající se z:R ⁷ is selected from the group consisting of unsubstituted lower alkyl, lower alkyl substituted with one or more groups selected from the group consisting of: nesubstituovaného cykloalkylu, nesubstituovaného arylu, arylu substituovaného jednou nebo více skupinami nezávisle vybranými ze skupiny sestávající se z halogenu a nesubstituované nižší alkylalkoxy skupiny a nesubstituovaného nižšího alkyl karboxyalkylu, a Z je vybráno ze skupiny sestávající se z nesubstituované C-karboxy skupiny a nesubstituované nižší alkyl C-karboxy skupiny.unsubstituted cycloalkyl, unsubstituted aryl, aryl substituted with one or more groups independently selected from the group consisting of halogen and unsubstituted lower alkyl alkoxy and unsubstituted lower alkyl carboxyalkyl, and Z is selected from the group consisting of unsubstituted C-carboxy alkyl and unsubstituted lower -carboxy groups. 12. Sloučenina podle nároku 1, kde:The compound of claim 1, wherein: R³, R⁴, R⁵, a R⁶ jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z: atomu vodíku, halogenu, nesubstituovaného nižšího alkylu, nižšího alkylu substituovaného jednou nebo více hydroxy skupinami, nesubstituované nižší alkoxy skupiny, nesubstituovaného arylu,R ³ , R ⁴ , R ⁵ , and R ⁶ are independently selected from the group consisting of: hydrogen, halogen, unsubstituted lower alkyl, lower alkyl substituted with one or more hydroxy groups, unsubstituted lower alkoxy groups, unsubstituted aryl, 222 •9 9 99 99 99 • 9 99 99*9 999 • 9 9 9 9 9 9222 • 99 99 99 99 • 99 99 * 9 999 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9*9 9999 9 9 * 9 999 9999 999 99 9999 99 999 arylu substituovaného jednou nebo více nesubstituovanými nižšími alkoxy skupinami, a S(O)₂NR¹¹R¹²,9999 999 99 9999 99 999 aryl substituted with one or more unsubstituted lower alkoxy groups, and S (O) ₂ NR ¹¹ R ¹² , R⁵ je atom vodíku,R ⁵ is a hydrogen atom, R⁶ je NRⁿR¹², a R¹¹ a R¹² jsou nezávisle vybrány ze skupiny sestávající se z atomu vodíku, nesubstituovaného nižšího alkylu a kombinovaných pětičlenných nebo šesti-členných nesubstituovaných heteroalicyklů.R ⁶ is NR ⁿ R ^12, and R ¹¹ and R ¹² are independently selected from the group consisting of hydrogen, unsubstituted lower alkyl and, combined five- or six-member unsubstituted heteroalicyclic. 13. Způsob modulace katalytické aktivity proteinkinázy, vyznačující se tím, že zahrnuje kontakt řečené proteinkinázy se sloučeninou, solí nebo proléčivem nároku 1.13. A method of modulating the catalytic activity of a protein kinase comprising contacting said protein kinase with a compound, salt or prodrug of claim 1. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že řečená proteinkináza je vybraná ze skupiny sestávající se z receptorové tyrozinkinázy, nereceptorové tyrozinkinázy a serin-threoninkinázy.14. The method of claim 13, wherein said protein kinase is selected from the group consisting of receptor tyrosine kinase, non-receptor tyrosine kinase, and serine-threonine kinase. 15. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje: sloučeninu, sůl nebo proléčivo nároku 1; a fyziologicky akceptovatelný nosič nebo vehikulum.15. A pharmaceutical composition comprising: the compound, salt or prodrug of claim 1; and a physiologically acceptable carrier or vehicle. 16. Způsob ošetření nebo prevence poruch týkajících se proteinkinázy v organizmu, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci terapeuticky efektivního množství sloučeniny, soli nebo proléčiva nároku 1 do uvedeného organizmu.16. A method of treating or preventing a protein kinase-related disorder in an organism, comprising administering to said organism a therapeutically effective amount of a compound, salt or prodrug thereof. 17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci terapeuticky efektivního množství17. The method of claim 16, comprising administering a therapeutically effective amount 3-[2,4-dimethyl-5-(2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-lH-pyrrol3-yl]-propionové kyseliny do uvedeného organizmu.3- [2,4-dimethyl-5- (2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid to said organism. 18. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že porucha spojená s proteinkinázou je vybraná ze skupiny sestávající se z poruchy • ·The method of claim 16, wherein the protein kinase-associated disorder is selected from the group consisting of a disorder. 223223 4 44 4 44 44 4444 44 44 4 4 4 4 4 44 4 4 4 4 5 44 4444 44 ·♦· týkající se receptorové tyrozinkinázy, z poruchy týkající se nereceptorové tyrozinkinázy a z poruchy týkající se serinthreoninkinázy.Receptor tyrosine kinase, a non-receptor tyrosine kinase related disorder, and a serinthreonine kinase related disorder. 19. Způsob podlenároku 16, vyznačující se tím, že uvedená porucha spojená s proteinkinázou je vybraná ze skupiny sestávající se z poruchy spojené s EGFR, z poruchy spojené s PDGFR, z poruchy spojené s IGFR a z poruchy spojené s flk.19. The method of claim 16, wherein said protein kinase-associated disorder is selected from the group consisting of an EGFR-associated disorder, a PDGFR-associated disorder, an IGFR-associated disorder, and a flk-related disorder. 20. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedená porucha spojená s proteinkinázou je rakovina vybraná ze skupiny sestávající se z spinocelulárního karcinomu, astrocytomu, Kaposiho sarkomu, glioblastomů, rakoviny plic, rakoviny močového měchýře, rakoviny hlavy a krku, melanomů, rakoviny vaječníků, rakoviny prostaty, rakoviny prsu, rakoviny malých plicních buňek, gliomu, rakoviny tlustého střeva, moěo-pohlavní rakoviny a gastrointestinální rakoviny.20. The method of claim 16, wherein said protein kinase-associated disorder is a cancer selected from the group consisting of squamous cell carcinoma, astrocytoma, Kaposi's sarcoma, glioblastomas, lung cancer, bladder cancer, head and neck cancer, melanomas, cancer ovarian cancer, prostate cancer, breast cancer, small lung cell cancer, glioma, colon cancer, moi-sex cancer, and gastrointestinal cancer. 21. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že řečená porucha spojená s proteinkinázou je vybranán ze skupiny sestávající se z diabetů, auto-immunitní poruchy, hyperproliferační poruchy, restenózy, fibrosy, psoriasy, osteo-artritidy, revmatické artritidy, angiogenze, zánětlivých poruch, imunologických poruch a kardiovasculárních poruch.21. The method of claim 16, wherein said protein kinase-associated disorder is selected from the group consisting of diabetes, auto-immune disorder, hyperproliferative disorder, restenosis, fibrosis, psoriasis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, angiogenesis, inflammatory disorders, immunological disorders, and cardiovascular disorders. 22. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že řečený organizmus je lidský.22. The method of claim 16, wherein said organism is human. 23. Sloučenina ze skupiny sestávající se z:23. A compound selected from the group consisting of: 3-[5-(5-chlor-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyl1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-Chloro-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[5-(6-methoxy-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl-1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (6-Methoxy-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 224224 3-[5-(5-chlor-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4dimethyl -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-Chloro-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[4-methyl-5-(2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-1Hpyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [4-Methyl-5- (2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[2,4-dimethyl-5-(2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl) - 1Hpyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [2,4-Dimethyl-5- (2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[5-( 5-brom-2-oxo- 1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyllH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-Bromo-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[5-(5-jod-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyl-1H pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-Iodo-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[4-methy 1-5-(4-methyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl) lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [4-Methyl-5- (4-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[4-methyl-5-(5-methyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl) 1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [4-Methyl-5- (5-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[5-(5,6-dimethoxy-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl-1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5,6-Dimethoxy-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[5-(6-chlor-2-oxo-l ,2-dihydro indol-3-yl i denmethyl)-4-methyl1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (6-chloro-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid Methyl ester 3-[4-(2-karboxyethyl)-3-methyl-lH-pyrrol-2y 1 methy len]-2-oxo-2,3-dihydro- 1H- indol- 5-karboxylové kyseliny3- [4- (2-Carboxyethyl) -3-methyl-1H-pyrrol-2-ylmethyl] -2-oxo-2,3-dihydro-1H-indole-5-carboxylic acid methyl ester 3-[4-(2-karboxy-ethyl)-3-methyl-lH-pyrrol-2-ylmethylen]-2-oxo2,3-dihydro-1 H-indol-5-karboxylová kyselina3- [4- (2-carboxy-ethyl) -3-methyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -2-oxo-2,3-dihydro-1H-indole-5-carboxylic acid 3 -[4-methy 1-5-(2-oxo-5 -sulfamoy 1-1,2-dihydro indol- 3-yl i denmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [4-Methyl-5- (2-oxo-5-sulfamoyl-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3 -[4-methyl-5 -(5-methyl sulfamoy 1-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [4-Methyl-5- (5-methylsulfamoyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-{3-[4-(2-karboxy-ethyl)-3-methyl-lH-pyrrol-2- ylmethylen]-2oxo-2,3-dihydro-1 H-indol-5-yl}-propionová kyselina3- {3- [4- (2-Carboxy-ethyl) -3-methyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -2-oxo-2,3-dihydro-1H-indol-5-yl} -propionic acid 3-[5-(5-ethyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)-4-methyl1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-Ethyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[5-(5-methoxy-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl-1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-Methoxy-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 225 «0 0 «0*0 ·« «000 0 · · · «09225 «0 0« 0 * 0 · «« 000 0 · · · 09 9 9 0 9 9 9 « • 0 «00 «90 • «0« ·«« 00 0000 00 «009 9 0 9 9 9 0 0 00 00 00 00 00 00 00 00 00 3-[5-(5-brom-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4d i methyl -1 H-pyrrol-3-yl]-pr opi onová kyselina3- [5- (5-bromo-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[5-(5-jod-2-oxo-l,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-2,4d i methyl -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-Iodo-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[2,4-dimethy 1-5-(4-methy 1-2-oxo -1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-pr opi onová kyselina3- [2,4-Dimethyl-5- (4-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[2,4-dimethy 1-5-(5-methy 1-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [2,4-Dimethyl-5- (5-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[5-(6-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydro indol-3-y li denmethy 1)-2,4dimethy 1- 1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (6-Hydroxy-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylmethyl) -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[5-(6-methoxy-2-oxo -1,2-dihydroindol-3-ylidenmethy 1)-2,4dimethy 1-1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (6-Methoxy-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[5-(6-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4methyl-1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (6-hydroxy-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3,5-dimethoxy-benzylester 3-[5-(6-hydroxy-2-oxo -1,2d ihydroindol-3-y li denmethy 1)-4-methy 1-1 H-pyrrol-3-yl]-propionové kyseliny3- [5- (6-Hydroxy-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylmethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3,5-dimethoxy-benzyl ester acid 3- {5-[6-(3-methoxy-fenyl)-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylindenmenthyl]-2,4-dimethy 1-1 H-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina3- {5- [6- (3-Methoxy-phenyl) -2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylindenmenthyl] -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl} -propionic acid 3-[5-(6-brom-2-oxo-l ,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)-4-methyl1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (6-Bromo-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-{5-[6-(3-methoxy-fenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-4-methy 1-lH-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina3- {5- [6- (3-Methoxy-phenyl) -2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl] -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl} -propionic acid 3 - {5-[6-(3-ethoxy-fenyl)-2-oxo -1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina3- {5- [6- (3-ethoxy-phenyl) -2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl] -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl} -propionic acid 3-{5-[6-(3-ethoxy-fenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-4-methyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina3- {5- [6- (3-Ethoxy-phenyl) -2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl] -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl} -propionic acid 3-[2,4-dimethy 1-5-(2-oxo-6-fenyl-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [2,4-Dimethyl-5- (2-oxo-6-phenyl-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3 -[4-methyl -5-(2-oxo-6-fenyl -1,2-dihydro-indol-3-ylidenmethyl)1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [4-Methyl-5- (2-oxo-6-phenyl-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3 - {5-[6-(4-methoxy-fenyl)-2-oxo-1,2-dihydro indol-3ylidenmethyl]-4-methyl-1 H-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina3- {5- [6- (4-Methoxy-phenyl) -2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl] -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl} -propionic acid 226226 3- {5-[6-(4-methoxy-fenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina3- {5- [6- (4-Methoxy-phenyl) -2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl] -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl} -propionic acid 3 - {5-[6-(2-methoxy-fenyl)-2-oxo-1,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-4-methyl -1 H-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina3- {5- [6- (2-Methoxy-phenyl) -2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl] -4-methyl-1H-pyrrol-3-yl} -propionic acid 3-{5-[6-(2-methoxy-fenyl)-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl]-2,4-dimethyl -1 H-pyrrol-3-yl}-propionová kyselina3- {5- [6- (2-Methoxy-phenyl) -2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl] -2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl} -propionic acid 3-[2,4-dimethyl-5-(6-morfolin-4-yl-2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [2,4-Dimethyl-5- (6-morpholin-4-yl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[5-(5-chlor-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenmethyl)2,4-dimethyl-lH-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina3- [5- (5-Chloro-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-indol-3-ylidenemethyl) 2,4-dimethyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid 3-[5-(5-chlor-4-methyl-2-oxo-l,2-dihydroindol-3- ylidenmethyl)3- [5- (5-chloro-4-methyl-2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) 4-methyl -1 H-pyrrol-3-yl]-propionová kyselina4-Methyl-1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid Sodná sůl 3-[2,4-dimethyl-5-(2-oxo-l,2-dihydroindol-3ylidenmethyl) -1 H-pyrrol-3-yl]-propionové kyseliny3- [2,4-Dimethyl-5- (2-oxo-1,2-dihydroindol-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propionic acid, sodium salt 24. Sloučenina vybraná ze skupiny sestávající se z: 3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl)-1 H-pyrrol-2ylmethylen]-l ,3-dihydroindol-2-onA compound selected from the group consisting of: 3- [3,5-dimethyl-4- (3-morpholin-4-ylpropyl) -1H-pyrrol-2-ylmethylene] -1,3-dihydroindol-2-one 5-brom-3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl)-l H-pyrrol-2yl methy len]-1,3-dihydroindol-2-on5-Bromo-3- [3,5-dimethyl-4- (3-morpholin-4-ylpropyl) -1H-pyrrol-2-ylmethylene] -1,3-dihydroindol-2-one 3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl) - lH-pyrrol-2ylmethylen]-6-fenyl -1,3-dihydroindol-2-on3- [3,5-dimethyl-4- (3-morpholin-4-ylpropyl) -1H-pyrrol-2-ylmethylene] -6-phenyl-1,3-dihydroindol-2-one 3-[3,5-di methy 1-4-(3-mor fol in-4-y lpropy 1) -1 H-pyrrol-2ylmethy len]-6-(2-methoxy fenyl) -1,3-dihydroindol-2-on3- [3,5-Dimethyl-4- (3-morpholin-4-ylpropyl) -1H-pyrrol-2-ylmethylene] -6- (2-methoxyphenyl) -1,3-dihydroindole -2-on 3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl) - 1 H-pyrrol 2ylmethy len]-6-(3-methoxy fenyl) -1,3-dihydroindol-2-on3- [3,5-dimethyl-4- (3-morpholin-4-ylpropyl) -1H-pyrrolylmethyl] -6- (3-methoxyphenyl) -1,3-dihydroindol-2-one 3-[3,5-dimethyl-4-(3-morfolin-4-ylpropyl)-lH-pyrrol-2ylmethy len]-6-(4-methoxyfenyl) -1,3-dihydroindol-2-on3- [3,5-dimethyl-4- (3-morpholin-4-ylpropyl) -1H-pyrrol-2-ylmethylene] -6- (4-methoxyphenyl) -1,3-dihydroindol-2-one 3-[4-(3-dimethy laminopropy 1)-3,5-dimethyl -1 H-pyrrol-2ylmethy len]-1,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -1,3-dihydroindol-2-one 5-brom-3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH pyrro 1-2 ylmethylen]-1,3-dihydroindol-2-on5-Bromo-3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrro-2-ylmethylene] -1,3-dihydroindol-2-one 227 • · • · ·<227 • • · · « · 99 9 9 99 9 9 99 999999 9999 3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2y Imethy len]-6-fenyl -1,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylethylene] -6-phenyl-1,3-dihydroindol-2-one 3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl - 1 H-pyrrol-2ylmethylen]-6-(2-methoxy fenyl) -1,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -6- (2-methoxyphenyl) -1,3-dihydroindol-2-one 3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2y 1 methy len ]-6-(3-methoxy fenyl) -1,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethyl] -6- (3-methoxyphenyl) -1,3-dihydroindol-2-one 3-[4-(3-dimethylaminopropy 1)-3,5-dimethyl -1 H-pyrrol-2y Imethy len]-6-(4-methoxy feny 1)-1,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylethylene] -6- (4-methoxyphenyl) -1,3-dihydroindol-2-one 5- chlor-3 -[4-(3-dimethylaminopropy 1)-3,5 -dimethyl-1 H-pyrrol-2y Imethy len]-1,3-dihydroindol-2-on5-chloro-3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylethylene] -1,3-dihydroindol-2-one 6- chlor-3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl -1 H-pyrrol-2y Imethy len]-l ,3-dihydroindol-2-on6-chloro-3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylethylene] -1,3-dihydroindol-2-one 3 -[4-(3-dimethyl aminopropy 1)-3,5 -dimethyl -1 H-pyrrol-2y Imethy len]-5-methoxy-1,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethyl-aminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylethylene] -5-methoxy-1,3-dihydroindol-2-one 3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl - lH-pyrrol-2y Imethy len]-6-methoxy-1,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylethylene] -6-methoxy-1,3-dihydroindol-2-one 3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl -1 H-pyrrol-2ylmethylen]-5-methyl -1,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -5-methyl-1,3-dihydroindol-2-one 3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2y Imethy len]-4-methyl-1,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylethylene] -4-methyl-1,3-dihydroindol-2-one 3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl - lH-pyrrol-2y Imethy len]-4-(2- hydr oxy ethyl)-1,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylethylene] -4- (2-hydroxyethyl) -1,3-dihydroindol-2-one 3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2ylmethylen]-2-oxo-2,3-dihydro -1 H-indol-5-sulfonová kyselina3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -2-oxo-2,3-dihydro-1H-indole-5-sulfonic acid Izopropylamid 3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-1Hpyrrol-2-ylmethylen]-2-oxo-2,3-dihydro -ÍH-indol-5-sulfonové kyseliny3- [4- (3-Dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -2-oxo-2,3-dihydro-1H-indole-5-sulfonic acid isopropylamide 3-[4-(3-dimethylaminopropyl)-3,5-dimethyl-lH-pyrrol-2ylmethylen]-5-(morfolin-4-sulfonyl)-l ,3-dihydroindol-2-on3- [4- (3-dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-pyrrol-2-ylmethylene] -5- (morpholine-4-sulfonyl) -1,3-dihydroindol-2-one Dimethylamid 3-[4-(3-dimethylaminopropy 1)-3,5-dimethyl-1 tipy rro 1-2-y Imethy len]-2-oxo-2,3-dihydro- 1 H-indol-5-sulfonové kyseliny.3- [4- (3-Dimethylaminopropyl) -3,5-dimethyl-1H-indol-2-ylethylene] -2-oxo-2,3-dihydro-1H-indole-5-sulfonic acid dimethylamide .