CZ158895A3 - Insulin analog, process of its preparation and pharmaceutical composition containing thereof - Google Patents

Description

I

Analog inzulínu, způsob jeho přípravy a farmaceutický prostředek, který ho obsahuje

Oblast.....techn i ky

Vynález se týká oblasti liská medicíny, zejména prostředků pro léčení cukrovky. Zvláště se týká analogů molekuly lidského inzulínu, způsob používání těchto analogů a farmaceutických prostředků obsahujících tyto analogy.

Dosavadní___stav techniky

Diabetes mellitus je metabolickou poruchou charakterizovanou neschopností lidských tkání oxidovat uhlohydráty normální rychlostí. Nedostatek inzulínu je nevýznamnějším činitelem ve stavu onemocnění cukrovkou. V posledních sedmdesáti letech se lidem, trpícím touto chorobou velmi pomohlo tím, že dostávali řízené množství inzulínu. Od osmdesátých let byl inzulín izolován ze zvířecího pankreasu, obvykle z hovězího nebo z vepřového. Zavedením rekombi nantní DNA technologie se umožnilo vytvářet velká množství lidského inzulínu stejně jako přírodně i nepřírodně se vyskytujících analogů lidského inzulínu. Tyto analogy inzulínu mají rozdílné chemické a fyzikální vlastnosti ve srovnání s přírodním lidským inzulínem. Přírodní lidský inzulín obsahuje tyrosinový zbytek v poloze 26 B-řetězce. Nahražením tohoto tyrcsinového zbytku slaninovým zbytkem se vytváří analog Ala (E26) lidského inzulínu, který vykazuje menší sklon ke spontánní asociaci v roztoku, než jaký mé přírodní lidský inzulín. Tento analog Ala (B26) lidského inzulínu je také stálejší a má větší rychlost působení, než jakou má normální lidský inzulín. Zbytek B26 může být také nahražen glycinem, valinem, leucinem, isoleucinem a prolinem. pod sta ť. vynález u

Analog inzulínu vzorce SEQ ID č . : 1 , vhodně zesítěný na SEQ ID č.:2 nebo jeho farmaceuticky vhodné soli spočívá podle vynálezu v tom, že Xaa v poloze 21 SEQ ID č.:1 je volena ze souboru zahrnujícího Asn, Asp, Glu, Gin, Ala, Gly a Ser, Xaa v poloze 1 SEQ ID č.:2 je volena ze souboru zahrnujícího Asp a Phe; Xaa v poloze 3 SEQ ID č:2 je volena ze souboru zahrnující ho Asp a Asn a Xaa v poloze 26 SEQ ID č.:2 je volena ze souboru zahrnujícího Ala, Gly, Val, Leu, I1e a Pro.

Vynález se tedy týká analogu lidského inzulínu modifikovaného záměnou aminokyseliny 26 B-řetězce nativního lidského inzulínu z tyrosinu na alanin, glycin, valin, eucin, isoleucin nebo pro-lin. Tato molekula může být také modifikována v poloze 21 A-řetězce nativního lidského inzulínu a v obou polohách 1 a 3 B-řetězce nativního lidského inzulínu. Uvedené analogy inzulínu jsou stálejší a méně náchylné k dimerizaci nebo spontánní asociaci na tvary s vyšší molekulovou hmotností a tím mají poměrně rychlejší náběh účinku při uchování biologické aktivity nativního lidského inzulínu.

Vynález se také týká způsobu ošetřování hyperg1ycemie podáváním účinného množství analogů podle vynálezu jedincům, kteří to potřebují. Dále je vynalezen farmaceutický prostředek obsahující účinné množství analogu inzulínu podle vynálezu spolu s jedním nebo s několika faramaceuticky přijatelnými excipienty. Následně se zde používá pojmů a zkratek, které mají dále u-vedený význam:

Ala(B26) HI - analog liského inzulínu, kde tyrosinový zbytek v poloze 26 B-řetězce nativního lidského inzulínu byl zaměněn za a 1an i nový zbytek. BHI - biosyntetický lidský inzulín.

Zesítění - vytváření disu1fi dových vazeb mezi cysteinovými zbytky. Správně zesítěný nativní lidský inzulín nebo analog inzulínu obsahuje tři disulfidové můstky. První disulfidový můstek je mezi cysteinovými zbytky v poloze 6 a 11 A-řetězce. Druhý disul- 3 fidový můstek spojuje cystein v poloze 7 A-řetězce s cysteinem v poloze 7 B-řetězce. Třetí disulfidový můstek spojuje cystein v poloze 20 A-řetězce s cysteinem v poloze 19 B-řetězce.

Gly(B26) HI - analog liského inzulínu, kde tyrosinový zbytek v poloze 26 B-řetězce nativního lidského inzulínu byl zaměněn za g1yc i nový zbytek. I1e(B26) HI - analog liského inzulínu, kde tyrosinový zbytek v poloze 26 B-řetězce nativního lidského inzulinu byl zaměněn za isoleucinový zbytek.

Leu(B26) HI - analog liského inzulinu, kde tyrosinový zbytek v poloze 26 B-řetězce nativního lidského inzulinu byl zaměněn za leucinový zbytek.

Pro(B26) HI - analog liského inzulinu, kde tyrosinový zbytek v poloze 26 B-řetězce nativního lidského inzulinu byl zaměněn za pro 1 i nový zbytek. SEQ ID č. 1: - první sekvence v seznamu sekvencí, která je analogem lidského inzulinu A-řetězce se sekvencí

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 12 10 15

Glu Asn Tyr Cys Xaa 20 kde Xaa je Asn, Asp, Glu, Gin, Ala, Gly nebo Ser. SEQ ID č. 2: - druhá sekvence v seznamu sekvencí, která je analogem lidského inzulinu B-řetězce se sekvencí Xaa Val Xaa Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val 61u Ala Leu 12 10 15

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Giy Phe Phe Xaa Thr Pro Lys Thr 20 25 kde Xaa v poloze 1 je Phe nebo Asp, Xaa v poloze 3 je Asn nebo

Asp a Xaa v poloze 26 je Ala, Gly, Val, Leu, Ile nebo Pro.

Val(B26) HI - analog liského inzulinu, kde tyrosinový zbytek v poloze 26 B-řetězce nativního lidského inzulinu byl zaměněn za va1 i nový zbytek. Všechny zkratky aminokyselin použité v tomto vynálezu odpovídají zkratkám přijatým úřadem United States Patent and 4

Trademark Office, jak stanoveno v zákoně 37 C.F.h. § i,322 (b)(2) (1990).

Vynález se týká analogů inzulínu vzorce SEO ID č.:1 (Gly I1e Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 1 2 10 15

Glu Asn Tyr Cys Xaa) 20 správně zesítěných na SEQ ID č.:2 (Xaa Val Xaa Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu 12 10 15

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Thr Pro Lys Thr) 20 25 nebo jejich farmaceuticky vhodných solí, kde Xaa v poloze 21 sekvence SEO ID č.:1 (A-řetězce inzulínu) je Asn, Asp, Glu, Gin, Ala, Gly nebo Ser; Xaa v poloze 1 sekvence SEO ID č.:2 (B-řetězce inzulínu) je Phe nebo Asp; Xaa v poloze 3 sekvence SEQ ID č:2 je Asn nebo Asp a Xaa v poloze 23 sekvence SEQ ID č.:2 je Ala, Gly, Val, Leu, Ile nebo Pro. S výhodou je Xaa v poloze 21 sekvence SEQ ID č.:1 Gly, Ala, Ser nebo Asn. Vhodnými zbytky aminokyselin v poloze 26 B-řetězce (SEQ ID č.:2) jsou Ala a Gly, přičemž nejvýhodnější zbytek v této poloze je Ala. Asparagin je nejvýhodnější aminokyselinou v poloze 21. Jeden analog podle vynálezu lze vytvořit odstraněním aminokyselinového zbytku normálně se nacházejícího v poloze 1 B-řetězce inzulínu (SEQ ID č.2). Výhodnou aminokyselinou v poloze 1 sekvence SEQ ID č.:2 ; e Phe a nejvýhodnějším zbytkem v poloze 3 sekvence SEQ ID č . :2 je Asn. Obzvlášť výhodným analogem inzulínu podle vynálezu je analog, ve kterém je Xaa v poloze 21 sekvence SEQ ID č.1 Asn, Xaa v poloze 1 sekvence SEQ ID č.:2 je Phe, Xaa v poloze 3 sekvence SEQ ID c.:2 je Asn a Xaa v poloze 26 sekvence SEQ ID č.:2 je Ala. Ve standardních biochemických termínech, známých pracovníkům v oboru je uvedeným obzvlášť výhodným analogem Ala (B25) lidského inzulínu.

Analogy inzulínu podle vynálezu mají snížený sklon k dimeri- 3 zac i nebo k jinak spontánní asociaci na tvary s vyšší molekulovou hmotností buď v roztoku obsahujícím zinek nebo v roztoku zinku prostém. Tím, že jsou analogy obecně mono měrní v roztoku, dosahuje se při podávání rychlého náběhu aktivity.

Jak shora uvedeno, zahrnuje vynález také farmaceuticky vhodné soli analogů inzulínu. Takovými výhodnými solemi jsou soli z i -nečnaté, sodné, draselné, hořčnaté, vápenaté nebo jejich směsi.

Analogy inzulínu podle vynálezu lze připravovat kterýmkoli z rozmanitých známých způsobů přípravy peptidů včetně klasických (roztokových) způsobů, způsobů v pevné fázi, semisynthetických způsobů a v poslední době dostupných rekombinantních DNA způsobů. Při způsobu přípravy v pevné fázi se aminokyselinová sekvece vytváří postupně z počáteční, nerozpustné pryskyřicí nesené C-koncové aminokyseliny. Způsoby přípravy v pevné fázi popsal J. Stewart a kol. Solid-Phase Peptide Synthesis, Freeman a Co., San Franc i sco, 1969.

Obecně se při způsobu v pevné fázi zakotví aminokyselina odpovídající C-koncovému aminokyselinovému zbytku žádaného peptidu v nosné nerozpustné pryskyřici a peptidový řetězec se pak vytváří na C-koncové aminokyselině nesené pryskyřicí. Postupně se zavádějí jednotlivé aminokyseliny dokud se nedosáhne požadované sekvence aminokyselin. Nebo je možno připravit malé peptidové fragmenty a zavést je do peptidového řetězce v žádaném pořadí. Peptidový řetězec zůstane připojen po celou dobu synthese a po dokončení řetězce se peptid od pryskyřice odštěpí.

Peptidový řetězec je připojen k polystyrénové pryskyřici esterovou vazbou vytvořenou mezi ksrboxylovou skupinou C-koncového podílu a specifickou methylenovou skupinou přítomnou na pryskyřičné matrici jako místo pro takové připojení.

Aminokyseliny se kopulují o sobě známými způsoby ze stavu techniky pro vytváření peptidových vazeb. Jedním takovým způsobem je převádění aminokyseliny na derivát, který učiní karboxylo-vou skupinu způsobilejší k reakci s volnou aminoskupinou N-konco-vého peptidového fragmentu. Například může být aminokyselina převedena na směsný anhydrid reakcí chráněné aminokyseliny s ethyl- 6 chlorformátem, s fenylchlorformátem, se sek.-butylchlorformátem nebo s isobuty!ch1 orformátem. Nebo může být aminokyselina převedena na aktivní ester, například na 2,4,5-trichlorfenylester, pentachlorfenylester a p-nitrofenylester, N-hydroxysuccinimidester, nebo na ester vytvořený z 1-hydroxybenzotri a z o 1u.

Jiný kopulační způsob pouzívá vhodného kopulačního činidla, jako je například Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimid (DCC) nebo N,N'-diisopropylkarbodiimid (DIC). Další vhodná kopulační činidla jsou pracovníkům v oboru známá (Schroder a Lubke, The Peptides, Academie Press, 1965, kapitola III).

Je třeba připomenout, že α-aminoskupi na každé aminokyseliny, použité v peptidové synthese, musí být chráněna v průběhu kopulační reakce, aby se zabránilo vedlejším reakcím zahrnujícím reaktivní α-ami noskupi nu. Je třeba také uvážit, že některé aminokyseliny obsahují reaktivní skupiny bočních řetězců (například s u 1 f hydr y 1 o vo u skupinu, e-aminos kup i nu, skupinu ft-a gama-karboxy-lovou, i midazo1y1ovou, quanidoskupi nu a hydroxylovou skupinu), přičemž takové funkční skupiny musejí být také chráněny, jak při počátečních, tak při závěrečných kopulačních krocích. Vhodné chránící skupiny jsou v oboru známy (například Protective Groups In Organic Chemistry, McOmie, vydavatel, Plenům Press, N.Y., 1973 a americký patentový spis číslo 4 617149). Při volbě jednotlivých chránících skupin je třeba dbát určitých podmínek. Skupina chránící α-aminoskupi nu musí (1) učinit α-aminovou funkci inertní za podmínek použitých v kopulační reakci, (2) musí být snadno odstranitelná po kopulační reakci za podmínek, které neodstraní chránící skupiny bočních řetězců a nezmění strukturu peptidového fragmentu, a (3) musí vyloučit možnost racemizace při aktivaci bezprostředně před kopulací. Chrániči skupina bočního řetězce musí (1) učinit funkční skupinu bočního řetězce inertní za podmínek použitých v kopulační reakci, (2) musí být stálá za podmínek použitých k odstranění skupiny chránící α-aminoskpi nu a (3) musí být snadno odstranitelná po ukončení požadované aminokyselinové sekvence za reakčních podmínek, které nezmění strukturu peptidového řetězce. 7

Pracovníkům v oboru je zřejmé, že chránící skupiny, o nichž je známo, že jsou vhodné k peptidové synthese, se budou lišit reaktivitou vůči činidlům, použitým k jejich odstranění. Například určité chránící skupiny, jako skupina trifeny1methy1 ová a 2 — (p — bifeny1y1)isopropy1 oxykarbony1 ová, jsou velmi labilní a mohou se odštěpit při mírně kyselých podmínkách. Jiné chránící skupiny, jako skupina terč.-buty1oxykarbony1 ová , terc.-amyloxykarbony1 ová, adamanty1oxykarbony 1ová a p-methoxybenzy1 oxykarbony1 ová, jsou méně labilní a vyžadují použití středně silné kyseliny, jako je kyselina trif1uoroctová, chlorovodíková nebo trifluorid boru v kyselině octové ke svému odstranění. Ještě jiné chránící skupiny, jako jsou skupina benzyloxykarbony 1ová, ha 1 ogenbenzy1karbony 1 ová, p-nitrobeny 1oxykarbony1ová, cyk 1 oa 1 ky 1 oxykarbonylová a isopropyl-oxykarbony1ová jsou ještě méně labilní a vyžadují použití silnější kyseliny, jako je kyselina fluorovodíková, bromovodíková nebo trif1uoracetát boru v kyselině trif1uoroctové ke svému odstranění Při ukončení žádané peptidové sekvence musí být chráněný peptid od pryskyřičného nosiče odštěpen a všechny chránící skupiny musejí být odstraněny. Odštěpovací reakce a odstranění chránících skupin může být prováděno současně nebo po krocích. Je-li pryskyřičným nosičem ch1 ormethy1 ovaná polystyrénová pryskyřice, je vazbou ukotvující peptid na pryskyřici esterová vazba vytvořená mezi volnou karboxylovou skupinou a C-koncovým podílem a jednou z četných chlormethylových skupin přítomných na pryskyřičné matrici. Je zřejmé, že ukotvovací vazba může být odštěpena reakč-ními činidly, o nichž je známo, že jsou schopná rozrušit esterovou vazbu a proniknout do pryskyřičné matrice. Jedním obzvlášť vhodným Způsobem je zpracování tekutým bezvodým fluorovodíkem. Toto reakční činidlo nejenom odštěpí peptid od pryskyřice, ale také odstraní všechny chránící skupiny. Použití tohoto reakčního činidla tudíž přímo poskytuje plně nechráněný peptid. Má-li se peptid odštěpit bez odstranění chránících skupin, může pryskyřice s chráněným peptidem být podrobena methanolyse k získání chráněného peptidu, v němž je C-koncová karboxylová skupina methylová-na. Methylester se pak může hydrolyzovat za mírně alkalických 8 podmínek k získání volné C-koncové karboxylové skupiny. Chránící skupiny peptidového řetězce mohou pak být odstraněny zpracováním silnou kyselinou, jako je tekutý fluorovodík. Obzvlášť vhodnou technikou methanolysy je způsob, který popsal 6. Moore a kol. (Peptides Proč. 5. Amer. Pept. Symp., vydavatelé M.Goodman a j. Meienhofer, John Wiley, N.Y. 1977, str. 518 až 521), přičemž se pryskyřice s chráněným peptidem zpracovává methanolem a kyanidem draselným v přítomnosti crownetheru.

Jiným způsobem odštěpení chráněného peptidu od pryskyřice je ammonolysa nebo zpracování hydrazinem. Popřípadě může být výsledný C-koncový amid nebo hydrazid hydrolyzován na volný C-koncový karboxyl a chránící skupina může být odstraněna o sobě známým způsobem.

Je také zřejmé, že chránící skup i na přítomná na N-koncové α-aminoskupi ně může být s výhodou odstraněna buď před odštěpením chráněného peptidu od pryskyřičného- nosiče nebo současně s tímto odštěpení m. A a B-řetězce analogu inzulínu podle vynálezu mohou být připraveny také rekombinantním DNA způsobem. Při jejich přípravě se nukleotidová sekvence, kódující požadovaný peptid A-žetězce nebo B-řetězce připraví dnes běžnými zůsoby takové synthesy. Tyto způsoby obecně zahrnují přípravu o 1 igonuk1eotidů kódujících jak fragmenty požadované kódovací sekvence, tak jejich komplementární sekvence. Ol igonuk1eotidy jsou konstruovány k překrývání fragmentu kódovací sekvence se dvěma fragmenty komplementární sekvence a naopak. Oligonukleotidy se spárují a spojí, čímž v závěru vytvoří žádanou genovou sekvenci.

Sekvence se vloží do klonovacího vektoru v místě, které připouští expresi peptidového produktu, pro který kóduje. Konstrukce plasmidů schopných exprese proinzulinu a pro inzu1 i nových analogů je popsána v evropské přihlášce vynálezu číslo O 383472 (Chance a kol.), zveřejněné 22. srpna 1990. A a B- řetězce analogu inzulínu podle vynálezu mohou být připraveny také cestou prekurzorové molekuly podobné proinzulinu pomocí rekombinantním DNA způsobem (Frank a kol. Peptides: Syn- 9 thesis-Structure-Functi on, Proč 7. Am. Pept. Symp., vydavatelé D. Rich a E. Gross, 1981).

Operace kombinování jednotlivých A a B-řetězců, jakkoli vytvořených, může být dosaženo způsobem podle Chance a kol. (Pepti-des: Synthesis-Structure-Functi on, Proč 7. Am. Pept. Symp.,1981)· Následující příklady vynález blíže objasňují aniž ho jakkoli omezují. P_ř í k 1 a d y p r o v e d e n j___vyná lezu Příklad 1

Ala (B26) lidský inzulín

Analog lidského inzulínu Ala (B26) se připraví enzymatickou semisynthesou (reversní proteolysou) pomocí despentapeptidu (B26-30) lidského inzulínu a syntetického pentapeptidu Ala-Thr-Pro-Lys-Thr. Pentapeptid se připraví peptidovou synthesou v pevné fázi, zatímco pentapeptid lidského inzulínu se odvodí z biosynte-tického lidského inzulínu (Eli Lilly and Company, Indi a na po 1 is) hydrolysní reakcí pepsinu, která odstraňuje sekvenci 26-30 v podstatě způsobem, který popsal Gattner H.G. (Hoppe-Sey1er's 2. Phy-s i o 1 . Chem., 356, str. 1 397 až 1404, 1975).

Syntéza peptidu se provede buď na syntetizátoru ABI 430A nebo ACT I model 200. Jak pryskyřice t-Boc-Thr (Bz1)0CH2-PAM, tak chráněné t-Boc-aminokyse1 iny a většina předem připravených reak-čních činidel k synteze peptidů jsou obchodními produkty společnosti Applied BioSystems, lne. Pentapeptiay se od pryskyřice odštěpí obvyklým fluorovodíkovým štěpením. Štěpení se provádí v 90 % fluorovodíku a v 10 % m-kresolu při teplotě O °C po dobu jedné hodiny fluorovodík se odpaří ve vakuu. Peptid se okamžitě vysráží zchlazeným bezvodým etherem a promývá se několikrát opět zchlazeným bezvodým etherem a nakonec se rozpustí v 10% kyselině octové a lyofilizuje se. K přípravě analogu lidského inzulínu Ala (B26) se smísí 400 mg des-pentapeptidu lidského inzulínu a 730 mg syntetického pen- tapeptidu AIa-?hr-?ro-Lys-Thr v 35 ml roztoku obsahujícím 85 % 1,4-butandiolu a 15 ¾ 1M Tris a hodnota pH se nastaví na 7,0 až 7,1 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou. Rozpustí se 40 mg chymotripsi nu ve 400 μΐ 0,01 N kyselině chlorovodíkové před přidáním do proteinového roztoku. Kopu lační reakční směs se udržuje na teplotě 25 *C po dobu 4,5 hodin a monitoruje se reversní fázovou chromatografií HPLC a ukončí se pak přidáním 10 objemů chlazeného acetonu. Sraženina se oddělí odstředěním, promy je se etherem, rozpustí se v 25 ml 10¾ kyseliny octové obsahující dostatečné množství quanidin HC1 pro rozpuštění, pak se vnese do sloupce Sephadexu G50 (Superfine, 5 x 200 cm) a eluuje se molární kyselinou octovou při teplotě 4 °C. Žádané frakce se shromáždí a podrobí se reversní fázové chromatografi i HPLC na sloupci Zorbax C8 puf - (2,12 x25 cm) za eluování lineárním gradientem 45 až 70 S i u 7,24 (7 ) , Cys 5,24 (5), Tyr 2,8 3 (3) , Arg 1,00 (1). ru v 750 minutách při průtoku 2,5 ml/min. Elučními pufry jsou pufr A obsahující 0,1 M natriumdihydrogenfosfát, hodnota pH 2,1 a pufr B obsahující 50 % pufru A a 50 ¾ acetonitrilu. Další čištění se provádí na sloupci Vydac C18 (2,12 x 25 cm) za eluování lineárním gradientem 45 až 70 % pufru B při průtoku 2,5 ml/min. Mobilní fáze sestává z roztoků 0,1¾ TFA jako pufru A a 0,1¾ TFA/5G% acetonitril jako pufru B. Nakonec se získá 38 mg 1yofi 1 izovaného proteinu a podrobí se různým analýzám. Podle hmotové spektrometrie (FAB/MS) po bombardování rychlými atomy je molekulová hmotnost 5715,6 (očekávaná 5715,4). Aminokyselinové složení, vztažené ke kyselině asparagové jakožto molární jednotce, (teoretické poměry aminokyselin v závorkách) je Asp 3,00 (3), Thr 2,89 (3), Ser 2,75 (3)

Pro 1,06 (1), Gly 4,00 (4), Ala 2,00 (2)

Val 3,35 (4), I1e 1,41 (2), Leu 6,12 (6)

Phe 2,87 (3), His 2,22 (2), Lys 0,99 (1)

Ostatní analogy inzulínu podle vynálezu se připravují v podstatě stejným způsobem, jak shora uvedeno. Při použití pentapep-tidu G1y—Thr—Pro-Lys-Thr jako výchozího materiálu se připraví inzulínový analog Gly(B26) HI. Při použití pentapeptidu Val-Thr-Pro — Lys—Thr jako výchozího materiálu se připraví inzulínový a n a — log Val(B26) HI . Při použití pentapeptidu Leu-Thr-Pro-Lys-Thr jako výchozího materiálu se připraví inzulínový analog Leu(B26)HI. Při použití pentapeptidu I1e-Thr-Pro-Lys-Thr jako výchozího materiálu se připraví inzulínový analog Ile(B26) HI. Při použití pentapeptidu Pro-Thr-Pro-Lys-Thr j3ko výchozího materiálu se připraví inzulínový analog Pro(B26) HI. Testy všech těchto analogů ukazují, že tyto sloučeniny jsou užitečné jako rychle působící analogy inzulínu. Příklad 2

Velikostní vylučovací HPLC ("size-exc1usi on HPLC") Různé koncentrace Ala(B26) HI se chromatografují na sloupci DuPont Zorbax GF-250 (0,94 x 25 cm) za eluování mobilní fází obsahující 0,2 M chloridu sodného, 20mM natriumdihydrofosfátu a 0,001¾ nitrid sodný, při hodnotě pH 7,5. Sloupec se provozuje při průtoku 1 ml/min při teplotě 24 'C. Distribuční koeficient (Kd) je asociován se středním poloměrem molekuly. V rovnici

Kd=(Ve-Vo)/(Vi-Vo) je Ve eluční objem vzorku, Vo je vyloučený objem určený elucí Blue Dextranu a Vi je zahrnutý objem stanovený elucí DL-dithio-threitolu. Distribuční koeficient (Kd) inzulínu klesá výrazně s rostoucí koncentrací inzulínu, což značí, že inzulín má sklon vytvářet agregát při vysokých koncentracích. Náhrada tyrosinového zbytku při B26 inzulínu s alaninovým zbytkem vytváří inzulínový analog, který jak se zdá, eliminuje agregaci za určitých podmínek a vede k distribučnímu koeficientu Kd nezávislém na koncentraci. Příklad 3

Rovnovážná denaturace

Pokusy s rovnovážnou denaturací se provádějí podle Bremse a kol. (Biochemistry 29, str. 9289 až 9293, 1990). Rovnovážná de

naturace se zjišťuje ultrafialovým cirkulárním dichroismem s rostoucími koncentracemi guanidinu. Denaturační přechod Ala(B26) HI začíná při 3,3 M Gdn kyseliny chlorovodíkové. Volná energie η εν lásenko vání (delta G) je 4,5 18,355 kJ/mol pro Ala(B26)HI, což je totéž jako u BHI. Koncentrace Gdn kyseliny chlorovodíkové středu ([denaturovný]/[nativní]=1) pro A!a(526) HI je 5,3 M ve srovnání s 5,0 M pro lidský inzulín, jak dříve zjistil Brems a kol. (J. B i o 1 . Chem. 266 , str.1511 až 1615, 1991). Příklad 4

Rovnovážné u 1 t r a o ds t ř e ďo vá n í

Agregační chování inzulínu se zjišťuje sedimentačním rovnovážným u 1 traodstřeďováním. Asociační stav každého analogu se měří způsobem, který popsal Pekar A.H. a Frank B.H. (Biochemistry 22, str. 4013 až 4016, 1972). Proteiny se rozpustí v pufru 50 mM chlorid sodný - 50 mM fosfát sodný a hodnota pH se nastaví na 7,2. Koncentrace proteinů se zjišťují spektrofotometrem Aviv 14 DS ( Lakewood,N.J.). Na bázi poměru mg/ml je extinkční koeficient BHI je 1,05, zatímco pro Ala(B26) HI je 0,800. Molekulová hmotnost monomeru BHI je 5808 pro BHI a 5716 pro Ala(B26) HI. Zinek se přidává do podílů roztoků pomocí zásobního roztoku chloridu zinečnatého, jehož koncentrace byla stanovena atomovou spektroskopií. Poměr mol zinku k mol proteinu je vždy 0,5. Pokusy rovnovážné sedimentace se provádějí při teplotě 22 *0 na analytické u1traodstředivce Spinco modle E se 6-děrovým titanovým rotorem a s optickým systémem fotoe1ektrického snímání absorpce. Techniky urychlování se použije tak, že rovnováhy se dosáhne před zapečetím rovnovážného snímání pči 25 hodinách. Pro více zředěné roztoky se použije 12 mm středových kusů a pro koncentovanéjší roztoky se použije středových kusů 3 mm plněných aktivním uhlím. Předpokládá se ideální sedimentace a hmotnostní střední molekulové hmotnosti pro různé poloměry se vypočtou z výrazu:

Mw - RT/(1-vp(w2.1/r.1/c.dC/dr, kde znamená R plynovou konstantu, T absolutní teplotu, w rychlost, r poloměr, C koncentraci a p hustotu roztoku. Předpokládá se, že Ala(B26) HI má stejný parciální specifický objem jako BHI, totiž 13 0,73 ml/g. Hmotnostní střední molekulová hmotnost se dělí molekulovou hmotností monomeru a porovná se s celkovou koncentrací proteinu. Ala(B26) HI vykazuje menší sklon ke spontánní asociaci než BHI. Například při 3,5 mg/ml (nebo 100 jednotek/ml) má inzulín hmotnostní střední molekulovou hmotnost přibližně 5,5-náscbncu o-proti molekulové hmotnosti monomeru. Ala(B2S) HI vykazuje hmotnostní střední molekulovou hmotnost přibližně 3,2-.násobnou oproti molekulové hmotnosti monomeru. V přítomnosti 0,5 mol zinku na mol proteinu, je inzulín především hexamer s 0,5 mg/ml. Na rozdíl od toho je Ala(B26) HI značně méně asociován. S rostoucí koncentrací proteinu Ala(B26) HI asociuje na druhy v molekulové hmotnosti nad hexamerem. Příklad 5

Vazba receptoru

Fyziologické účinky analogů inzulínu podle vynálezu se dokládají následujícím testem inzulínové receptorové vazby in v i t -ro. Lidská placentální membrána a test vázání se připraví modifikovaným postupem, který popsal Gruppuso a kol. ( J. Clin. Endo-c r i n a 1 . Metab. 67, str. 184 až 1 97 , 1 988). Při použitém postupu se inkubuje 30 až 50 pg proteinu lidské placentální membrány s přibližně 10 fmo 1 125J-inzu1 i nu a s různými koncentracemi ne značeného inzulínu nebo analogů v konečném objemu 500 μΐ if 100 mM HEPES, hodnota pH 7,8, 120 mM chloridu sodného, 5 mM chloridu draselného, 1,2 mM síranu horečnatého, 8 mM glukosy a 0,25 % ΒΞΑ po dobu 18 hodin při teplotě 4 'C. Membrány se shromáždi na filtrech ze skleněných vláken, předzpracují se 0,1 % polyethylen! rn i — nem pomocí zařízení na oddělování buněk (Skarton, Líer, Norsko). Vazební údaje se analyzují porovnáním s křivkami pro čtyřparamet-rový model za použití Prefit/Allfit ke stanovení hodnot tCso (dávka potřebná k náhradě poloviny maximální vazby).Údaje ze čtyř pokusů ukazují, že lidský inzulín má E C 5 o 0,34 ± 0,05 η M, žatí mc o A1 a(B26) HI vykazuje 0,39 ± 0,02 nM, což představuje 89 % účinnosti inzulínu. 1 Příklad 6

Studie na zvířatech

FvzioloQické účinky s n a 1 o 5 ů inzulínu podle vynálezu úkaze is následující systém testů in vivo.

Jako zkušebních zvířat se použije krysích samců Sprague Daw-ley z Charles River Laboratories (Portage, MI). Získaná zvířata mají hmotnost 150 až 180 g a chovají se jeden týden v klecích při teplotě 20 °C s řízeným cyklem osvětlování (světlo zapnuto cd 7,00 do 19,00 hodin, světlo vypnuto od 19,00 do 7,00 hodin). Zvířata se krmí podle libosti krmivek pro krysy Purina 5001. Krysy, určené pro každý test, se před testem na 16 hodin postí. Jejich hmotnost je přibližně 200 g při prvním použití. Při dosažení přibližné hmotnosti na lačno 275 g (v průběhu třech týdnů), už se jich nepoužije.Ke každému testu se použije pět kontrolních zvířat a pět zvířat pokusných. Proteiny se rozpustí v 0,05 N kyselině chlorovodíkové (hodnota pH 1,6) k získání zásobního roztosu :00 pg na ml. Ze zásobního roztoku se připraví řada zředění v normální solance, která se krysám injek tují subkutánně. Z ocasní žíly každé krysy se odeberou 100 μΐ vzorky krve v čase 0,30 minut, 1 hodina, 2 hodiny, 3 hodiny a 4 hodiny po podání. Glukóza se změří kolorimetricky glukozovým oxidázovým způsobem (Sigma Chemical Co.). Percentuální změna glukózy v krvi oproti hodnotě v čase nula se vypočte pro každou krysu a konečné výsledky se vyjádří jako střední percentuální změna ± SEM v pokusné skupině opravené pro střední změnu v kontrolní skupině pro ten den. Křivka odezvy r.a dávku se vynese z údajů s různou koncentra. c i zkoušené sloučeniny vyjadřuje procento g!úkosové změny v hladině glukózy pro každou dávku. Z této křivky se stanoví hodnota EDso jakožto subkutánní dávka (pg/kg) proteinu, jež dává polovinu maximální hypog1ycemické odezvy. Hodnota ED50 lidského inzulínu je 7,8 ± 0,1 (n=3), zatímco EDso pro Ala(B26) HI je 8,9 ± 0,7 (n = 2), což představuje 88 % účinnosti inzulínu.

Studie provedené na vepřích také ukazuje, že analog Ala(326) HI je užitečný jako rychle působící innzulin. Ve srovnání s lidským inzulínem se absorbuje téměř dvojnásobně množství Ala(B26)HI ve 40 až 60 minutách po subkutánní injekci.

Jak shora uvedeno, mají analogy inzulínu podle vynálezu sníženou náchylnost k dimerizaci nebo k jiné spontánní asociaci na tvary s vyšší molekulovou hmotností. Tudíž po podání jednoho nebo několika těchto analogů se dosahuje rychlého náběhu účinku. Analogy inzulínu podle vynálezu jsou účinné v léčení hyperg 1 ycemie podáváním účinného množství analogů inzulínu obsahujících slaninový zbytek v poloze 26 B-řetězce jedincům, kteří to potřebují. Zde používaným výrazem "účinné množství" se míní množství jednoho nebo několika analogů inzulínu podle vynálezu, potřebné ke snížení nebo udržení hladiny cukru v krvi buď terapeuticky nebo profy-laticky. Toto množství je typicky přibližně 10 jednotek ažo přibližně 60 jednotek nebo více jednotek denně (nebo přibližně 0,3 až 2 mg za předpokladu přibližně 29 jednotek na mg). Je však zřejmé, že množ sví analogu nebo analogů inzulínu aktuálně podané určí lékař v závislosti na závažných okolnostech včetně léčeného stavu (to je příčiny hyperglycemie), v závislosti na příslušném podávaném analogu, zvolené parenterální cestě podání, věku, hmotnosti a odezvi jednotlivého pacienta a závažnosti pacientových symptomů. Proto uvedený rozsah dávkování nemá nikterak omezovat rozsah vynálezu.

Analogy inzulínu podle vynálezu se podávají pacientům, kteří to potřebují (to je pacientům trpícím hyperg1ycemií), ve formě farmaceutických prostředků obsahujících účinné množství nejméně jednoho analogu inzulínu s alani novým zbytkem v poloze 26 B-řetězce spolu s jedním nebo s několika faramaceuticky vhodnými ex-cipienty nebo nosiči. Farmaceutické prostředky mohou být typicky formulovány tak, že obsahují 100 jednotek na ml nebo podobné koncentrace účinného množství analogu (nebo analogů) inzulínu. Tyto prostředky jsou zpravidla, ne však nutně, parenterální povahy a mohou se připravovat jakýmkoli způsobem za použití excipientů nebo nosičů pro parenterální výrobky, jež jsou v oboru dobře známé (například Remingsto's Pharmaceuti ca 1 Sciences, 17. vydání, Mack rubí ishing Conpany. Ξ č s t o n, ? A . USA, 1 S 8 5 ) . Dávky pro parenterál-n í podání mohca být například připraveny suspendováním nebo rozpuštěním požadovaného množství alespoň jednoho analogu inzulínu obsahujícího slaninový zbytek, v poloze 25 3-řetězce v netolickém tekutém nosiči vhodném k i njektováπí, jako je vodné medium a sterilizací «usper.se nebo roztoku, p r úvodní a m p u 1 e nebo nosič mohou sloužit ke smísení před použitím. Farmaceutické prostředky, u -pravené k parenterá1 ní mu podávání, používají ředidel, excipientů a nosičů, jako vody, s vodou smísitelných organických rozpouštědel, jako je například glycerin, sezamový olej, podzemnicový o-lej, vodný propylenglykol a N,N'-di methylformamid. Jakožto příklady farmaceutických přípravků se uvádějí sterilní, isotonické, vodné roztoky solanky a analcgu inzulínu obsahujícího a 1 ani nový zbytek v poloze 25 3-řetězce, které mohou být pufrovény farmaceuticky přijatelným pufrem a jež jsou prosté pyrogenu. Přídavně mohou parenterá1 ní farmaceutické prostředky obsahovat ochranné prostředky, jako fenol nebo meta-krezol. Lze také použít činidel upravujících hodnotu pH konečného výrobku, jako jsou hydroxid sodný nebo kyselina chlorovodíková.

Analogy inzulínu pcdle vynálezu mohou být také zpracovávány na farmaceutické prostředky k intra nasé1nímu podávání. Takové prostředky jsou podrobně popsány v evropské zveřejněné přihlášce vynálezu číslo 0200383 A3. Takové farmaceutické prostředky se připravují s jedním nebo s několika vhodnými ředidly, s farmaceuticky vhodným množstvím soli alkalického kovu, soli amoniové nebo volné kyseliny inzulínu v podstatě prostého zinku a s případně absurci usnadňujícím mne žs t ví m alespoň jednoho činidla usnadň u j í -čího edsorpci, voleného ze souboru zahrnujícího (i) kyselinu olejovou nebo její sůl, (2) tekutou formu sorbitanového esteru mastné kyseliny, (3) tekutou formu derivátu po 1yoxyethy1enu nebo sor-bitanového esteru mastné kyseliny a (4) tekutou formu kopolymeru hvdroxypo1yo xye t hy1e n-po 1yo xypr o py1e n-po1yo xye t hy 1 enu. -17-

Seznam sekvencí (1) Obecné informace i) Přihlašovatel: Chance a kol. ii) Název vynálezu: Analog inzulínu, způsob jeho přípravy a maceutický prostředek, který ho obsahuje i i i ) Počet sekvencí: 2 iv) Adresy pro korespondenci

A. Adresát: E1 1 i Lilly and Company, Patent Divisicn/DKN B. Ulice: Lilly Corporate Center C. Město: Indianopolis

D. Stát: IN E. Země: Spojené státy americké F. ZIP: 46285 v) Forma pro počítač A. Typ média: Disketa 3,50 ", 1,0 Mb B. Počítač: Macintosh C. Operační systém: Macintosh D. Software: microsoft Word v i) Platné přihlašovací údaje A. Číslo přihlášky: B. Datum podání C. Klasifikace vii) Předchozí přihlašovací údaje A. Číslo přihlášky B. Datum podání 1 ; Informace o zás tupci/zmocněnci A. Jméno:: D o u c1 a s K Norman 3. Registrační čí slo: 33267 C . Referenční/ští tkové číslo: x8667 Telekomunikační informace A. Telefon: (317) 276-2953 B. Telefax: (317) 276-1294 C . Telex: -18- 2. Informace pro SEQ ID. C.l" i) Charakteristiky sekvence A. Délka: 21 aminokyselin 3. Typ: aminokyselina C. Strandednesss: C. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: polypeptid ix) Význak: A. Jméno/klíč: variabilní místo 3. Umístění: 21 C. Identifikační metoda: D. Další informace: "Tato aminokyselina je buď

Asn, Asp, Glu, Gin, Ala, Gly nebo Ser." 1 xi ) Popi s sekvence: SEQ ID č.:1: Gly I 1 e Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser I 1 e Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 1 0 1 0 1 5 G 1 u As n Tyr Cys Xsa 20 1

Informace pro S Ξ O ID č. :2 i) Charakteristiky sekvence A. Délka: 30 aminokyselin B. Typ: aminokyselina D. Topologie: lineární ii) Typ molekuly: polypeptid i x) Význak: A . J mé n o / k i í č : v a r i a D i 1 n í m í s t o 3. Umístění: 1 C. Identifikační metoda: D. Další informace: "Tato aminokyselina je buď Phe nebo Asp". i x) Význak: A. Jméno/klíč: variabilní místo B. Umístění: 3 C. Identifikační metoda: D. Další informace: "Tato aminokyse1 i na je buď Asn nebo Asp". - 1 9 : >: ; Význak: A. Jréno/k i í č : v a r i s b- i lni m í stc 3 . U m i s t ě n i : 25 C . I c e n t i f i ka č n í metoda: D . D a i š í i n formace: "Tato a m i n e k y s e lina i e DUO Aid G 1 ’T Leu, I i e nebo Pro. " X 1 Popis s & k V 9 nce: S E 0 ID č. :2 X c <3 Vel X6 6 Gin His Leu Cys G1y S 6 r H i 5 Leu v a 1 Glu Ala Leu 1 2 1 0 1 5 'Τ' , . i y r Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Xa a Thr Pro Lys Thr 20 25 30 ? r j m y s 1 o v a v v u ž i t e 1 n o s t An aiocy molekul y lidského i n zu 1 i r. u stá 1 e j š i a s větší r y c h P Ů sobe ní, než jakou má normální 1 i d s k ý i n z u 1 i n, vhodné pro v farmaceutického orostředku. i *

Claims (3)

1. * R O K Y

   i Ί\

   log inzulínu p c\ je Asn. nároku 1, přičemž Xaa v polo: 2 1 SE Q c inu podle n O č e V -/» c e o 2 je Pne. o o 1 o z e podle nároku 3 mel r

   c e i /> d 1 e ! o, 7 , V po
2. 5 . Farmaceutický prostředek v y z π a č u j : c í s e i t i m, že obsahuje f sramceut icky vhodné ředidlo a an.al ogu inzulínu vzorce S Ξ Q ID č. : 1 správně zesítlnéhc na SEQ ID č. :2 nebo jeho f a r rr.a c e ut i c k y vhodnou s ů i podle nároku 1 až 5, přičemž Xaa v po- c sout 0 r u z a h r n u ;i \ c í Z 0 fU g = P h e ; X a 5 v ;o!cze 3 SE 0 I 3 č : 2 je z: - léna Z 5 s c uberu z c h r n u j 1 c í ho As p c AS n č Λ č a V n cloze SEC ID Γ * ^ j e v 0 1 6 Π c Z Θ S C U u 0 r u zahrnu i i c í h o Ala, G i y, Val , Le u , 1 i e a ť o t 1 i c k ý prostředek podle n á r oku 6, v y znač t í m , že Xaa v polož e 2 1 SEO ID č. . : 1 i e A ~ 1 v po loze 1 SE Q ID ě . : : 2 ; e ? h e. X a a v poloze ID č . : 2 ;e v clena ze λ a a v po: leze _ Z Z 1 V AI c . G1 y, Va 1 . Le u , I1e nebo Pro.

   8 . r č r ίτία e e U t i c k v pros t Γ 9 G e k z c c í e ná roku 7, 'v7 y z n c Č c: se p ^ m , že Á č č v z 0 i o:e 2 6 z 0 1 'J č . .:2 ; e A 9 . Z puso b p ř í p r s vy a n c i o g u i n z u linu ρ o c1 s r.áro ku v y z n a č u JI c í e e t i m Ž G se zesiluj e S i 0 u cen IN č: 1 se s1 o učen i nou SE 0 ID č . : 2 .
3. 3 , SE O 1 O An a 1 o q n z u i i n u i pravíte lny způsobem podle nároku 9. t i