CS252472B2 - Method of b-carboxypeptidase's enzyme insulation - Google Patents

Method of b-carboxypeptidase's enzyme insulation Download PDF

Info

Publication number
CS252472B2
CS252472B2 CS842361A CS236184A CS252472B2 CS 252472 B2 CS252472 B2 CS 252472B2 CS 842361 A CS842361 A CS 842361A CS 236184 A CS236184 A CS 236184A CS 252472 B2 CS252472 B2 CS 252472B2
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
enzyme
centrifuged
suspension
carboxypeptidase
allowed
Prior art date
Application number
CS842361A
Other languages
English (en)
Other versions
CS236184A2 (en
Inventor
Laszlo Boross
Erzsebet Dala
Aranka Kiss
Bela Szajani
Arpad Tetzli
Original Assignee
Reanal Finomvegyszergyar
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Reanal Finomvegyszergyar filed Critical Reanal Finomvegyszergyar
Priority to CS853128A priority Critical patent/CS252482B2/cs
Publication of CS236184A2 publication Critical patent/CS236184A2/cs
Publication of CS252472B2 publication Critical patent/CS252472B2/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y10S435/816—Enzyme separation or purification by solubility

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Vynález se týká nového způsobu izolace enzymu karboxypeptidáza B z pankreatu savců, zvláště z pankreatu vepřů a způsobu imobilizace takto izolovaného enzymu.
Jakožto obchodní produkt dostupný enzym karboxypeptidáza B se izoluje ze slinivky břišní vepře. Podle odborné lie^i^čit^ury se však může tento enzym izolovat také z pankreatu jňných savců, například z pankreatu hovězího dobytka nebo koz.
Podle článku zveřejněného v časopise J. B^<^1. Chem. 235, str. 2 272 (1960) se vepřový pankreas vyřízne a autolyzuje se při teplotě místno^i. Obsažený tuk se z orgánu odstraní extrakcí acetonem, směsí acetonu a etheru a nakonec etherem, tuku zbavený orgán se pak usuší a převede se na prášek. Acetonický prášek se extrahuje vodou a extrakt se frakcionuje síranem amonným. Produkt se postupně podrobí odsolení, iontové výměně (sloupcovou chromatografií na DEAE-ceeulóze) a vysrážení síranem amonným. Sraženina se zbaví soU dialyzou nebo gelovou fi.lta^cí. Enzym se skladuje ve zmrazeném stavu, jelkkcž lylfilifaee snižuje akkivitu o 25 až 45 %.
SpeHicU aktivita ^oduktu je 184,2 jednbtek/mg (při te^otě 25 °C m^iřeno za ^ontí Hiřpuuyl-Iι-arginnbovéhb subbstátu), což odpovídá 16 až 17 násobnému čištění ve srovnání s extraktem získaným z autolyžované tkáně.
Tento způsob je v pra^i obecně rozšířen.
Podle publikace v časopise Bibchemistry _1, str. 1 069 (1962) se enzym karboxy^^í^j^tti^d^áza může připravovat v krysta^cké formě aktivací čišěéného zimogenu, to znamená enzymu řtokarioxypeptidáza B. Při tomto způsobu se jakožto výchozí látky používá rovněž vodného extraktu acetonic^ho prášku pankreasu. Vodný extrakt obsahuje enzym řrokaribxyřeptidáza B, který se podrobuje chrbmmaografecéému čištění nejdříve na OFEE-cclulóze a pak na DEAE-Sephadexu. Prokarboxypeptidáza B se převádí tupsiieem na aktivní ktribxyřeptidázu B, která se pak podrobuje kryssafizffc.
Podle článku uveřejněného v časopise Brodiem. 163, str. 253 (1977) se popisuje způsob izolace enzymu karibxypeptidáza B z lidského pankreatu. Výroba acetonického prášku, vysrážení síranem amonným a chrbmattbrrfil na DEEE-ccIuIózi jsou v podstatě stejné, jako je popsáno v článku v časopise J. Biol. Chem. 235, str. 2 272 (1960). Způsob, popsaný pro zpracování lidského pankreatu, se liší od shora popsaných způsobů jedině koncentrací použitého pufru a gradienty duentá pH chr^m^^aafi na DEEE-ccIuIózi. Takto získaný enzym, karioxyřeptidáza B, se rozděluje na dvě frakce, a to В 3 a B2 chromatografií pooádděnou na ltnbomětiči Whatmanova karboxyímUthycceulóza. Sp^č^cká tkkivitt frakcí В. a В. je 1 192 jednotek/mg popřípadě 862 jednotek/mg (při te^otó 37 °C měřeno na subst^tu Hiřpuuyl-L-trrintnovém) , což odp<^^ídá ve srovnání s vodným extraktem 10δnásbbtémb popřípadě 78násobnémb vyčištění. Enzym karboxypeptidáza B se může izolovat také . z ^nkreatu kbzy, ^Indián J. BiDclnm. Biophys. 12 str. 24 (1975) ^příp^ě .13, stt. 106 (1976)].
Jakožto podstatné ehatntktetstiky tohoto způsobu se uvádí:
Pankreas kozy se zmrazí na -20 % ve zmrazeném stavu se rozžne a při t^lo^ + 4 °C se shromážduje vytéka^cí buněčná ktpatita. Shromážděná kapalina se podrobuje an^lyze. Hodnota pH roztoku se upraví na 4,6, roztok se zředí vodou destilovanbu na desetinásobný objem a oz^tιkl·t sus^nze se tleháot sUt při ^epl^b^d +4 °C po do^ dvou až Ш hodin. Přloáiná část aktivního ktrbbxyplptidázového enzymu se vysráží. Sraženina se extrahuje hydroxidem barnatým při hodnotě pH 10,0 až 10,4. Z extraktu se enzym nechá vykastrovat při hodnotě pH 6,5 a čtyřikrát se překrystruje. Drší čištění takto získaného produktu je popsáno ve článku v časopise Indián J. Bioehem. Bibphys. .13, str. 106 (1976). Podle tohoto způsobu se př hodnotě pH 6,5 vysrtilný produkt rozpustí v 0,2 molárním roztoku hydroxidu b^natého, hodnota pH se upraví kyselinou octovou na 7,0 a látka se dále čistí frtkeilntcí prováděnou síranem amonným a opakovanou iontovou výměnou na DEEE-celulóze. Roztok enzymu, zbavený sol-í, se skladuje při te^otó -2° °C.
Specifická aktivita produktu je 102,66 'jednotok/mg (umřeno na Hi.ppuryl-L-argininovcm substrátu), ccž odpovídá 44násobnému vyčistění.
Podle článku uveřejněného o časopise J. MC. Ccaa!. 10, str. 253 (1981 ) se ocdný extrak t acetonického prášku z panRrreatu kozy frakcionuje amonným a frakce získaná při 0,3 až
0,7 násobném sycení se podrobuje iřrcmottcrrtfi na karboxymeehYl-Sephadexu C-50 a na OEAE-celulóze. Sρecifická aktivita takto získaného produktu je 82,9 jednotek/mg (mmřeno na Hippury1-L-arginňoovém substrátu), což odpovídá 18,2násobnému vyčištění.
•Společný nedootatek shora uvedených způsobů je založen na tom, že se používá jakožto výchozí Látky buněčné kapaliny pankreasu nebo acetoniikéřc prášku orgánu'. Shromažďování buněčné kapaliny je obtížné a v případe pankreatu vepře je prakticky neprovvditelné pro vysoký obsah tuku a slizu v orgánu. Výroba acetcnickéhc prášku vyžaduje po^uřtí nákladných, z hlediska požární bezpečnootí a z hlediska výbuchů nebezpečných rozpouštědel (aceton, ether), lokální zahřátí může škodit enzymu, výtěžxy a specifická aktivita klesaáí. Dalším nedostatkem je, že produkt uspokojivé čistoty je vyrobitelný jen za pomoci kcmpeikcoaoéřo pracovního postupu sestávajícího z mnoha operací.
Cílem vynálezu je proto odstranit shora uvedené nedostatky známých způsobů a vyvinout způsob, podle kterého by se mohl připravovat enzym karboxypepeidáza B se vhodnou specifickou aktivitou jednoduše za odstranění nutnooti shromažďovat kapalinu z orgánu a připravovat acet:.coický prášek.
Zjistilo se, že v případě, kdy se Ucoocenieovaoý pankreas vepře podrobuje autolyze a následnému tepennému zpracování, pak se odstředí nebo filtruje, supernatant se dvoustupňové sytí solí připravenou z lcdnomocoéřc kat^ntu a z anorganické kyseliny, pak se ze suspenze z druhého stupně sycení oddělí sraženina a roztok sraženiny se proti vodě, získá se roztok enzymy který při tepote 25 °C měřeno na Hippuryl-L-arginnnovém substrátu má specifickou aktivitu alespoň 70 jednotek/mg a je ptouuitelný bez dalšího čištění pro výrobu imobílizovaného enzymu karboxypeptidáza 8.
Předmětem vynálezu je tedy nový způsob pro přípravu enzymu karboxypeptidáza B z pankreatu savců, při kterém se slinivka břišní o sobě známým způsobem homoogeniuue·, hcmocgcnzát se auto^zRe při 37 °C po d^u lcdné hodiny nebo při tepote 25 °C po dobu 16 hodin, pak se zředí pufrem o hodnotě pH 5,0 až 8,5 v poměru 1:1 a po dobu 5 až 30 minut se podrobuje tejnému z^acov^í při tepote 50 až 75 °C, takto ztek^ směs se odstředili nebo filtruje, do supernatantu se přidá 200 až 320 g/1 síranu amonného, získaná suspenze se odstředí, sraženina se vyhodí, do supernatantu se přidá 10 až 50 g/1 síranu amonného, vysrážená aktivní frakce, obsahující enzym karioxypeptidáza B, se oddali odstředěním, tento enzym se rozpus^tí ve vodě nebo v roztoku pufru, dialyzuje se proti vodě nebo proti roztoku pufru a skladuje se ve zmrazeném stavu.
Při způsobu podle vynálezu se Ucoocenieooaoý a autdyzovaný pankreas ředí pufrem, jehož hodnota pH je 5,0 až 8,5, s výhodou 6,0, v poměru 1:1 a pak se tepelně zpracovává při te^otě 50 až 75 °C po dobu 5 až 30 minu^ účelně při t^lo^ 60 °C po dobu 20 minut. Při tomto tepelném zpracování se převážná část izolovaný enzym provázejících proteinů'denaturuje. Denilturcoaný protein vypadne z vodného roztoku ve formě sraženiny s velkým povrchem a pro své čeřicí působení strhne velkou část zbylých nečistot v roztoku. Tím se odstraní obtížná a nákladná příprava acetcnickéUo prášku pankreatu.
Značná část proteinových se vysráží po oddělení denaturovaných proteinů z roztoku obsahnuícího pufr přidáním 200 až 320 g/1, s výhodou 310 až 320 g/1 síranu amonného. Sraženina, která obsahuje bílkovinové nečistoty, se odstraní a za supernatentu se vysráží enzym obsahnuící produkt přidáním 10 až 80 g/1, s výhodou 30 g/1 síranu amonného. Sraženina se rceeuj>tí ve vodě nebo v roztoku pufru a roztok se o sobě zmámým způsobem dalyzuje vodou.
д
Při teplotě. 25 °C měřená specifická aktivita takto získaného, enzym obsahujícího, produktu je alespoň 70 jcdnotek/mg, což odpovídá desetinásobnému přečištění. Takto získaný produkt se může bez dalšího čištění bezprostředné použít pro výrobu imobilizovaného enzymového přípravku.
Imobilizovaného enzymu karboxypeptidázy В se může používat pro stanovení koncových karboxylových skupin -COOII aminokyselin proteinů a peptidů nebo к dělení DL-argininu nebo DL-lysinu v provozním měřítku. Použití imobilizovaných přípravků enzymu karboxypeptidázy В pro dělení DL-argininu a DL-lysinu naráží na komplikovaný způsob přípravy enzymu a na vysoké náklady takové přípravy. Způsob izolace enzymu karboxypeptidázy В podle vynálezu odstraňuje tyto nedostatky a umožňuje provozní používání enzymu karboxypeptidázy В. К tomu je zapotřebí imobilizovat enzym v aktivní formě.
Způsob imobilizace enzymu karboxypeptidázy В se může provádět různými způsoby. Jako zvláště výhodný se ukazuje způsob imobilizace, který jsme popsali v našem československém patentu č. 252 482 podaná v souvislosti s vyřízením výměru ze dne 24. ledna 1985.
Způsob podle vynálezu blíže objasňují následující příklady praktického provedení, které však vynález nijak neomezují.
Příklad 1
Na strojku pro maso se umele 0,25 kg vepřového pankreat, pak se přidá 250 ml 0,05 molárního Tris-HCl-pufru (hodnota pH 7,0) a směs se nechá stát přes noc při teplotě +4 °C. Příští den se suspenze zahřeje na teplotu 37 °C a nechá se stát po dobu jedné hodiny při této teplotě. Suspenze vepřového pankreatu se pak odstředí suprenatant se zahřeje na teplotu 50 °C a při této teplotě se inkubuje po dobu 30 minut. Po přidání 2 objemových dílů ledově chladného pufru se směs odstředí. Do supernatantu se přidá 42,2 g síranu amonného. Směs se nechá stát přes noc, suspenze se odstředí, sraženina se vyhodí. Hodnota pH supernatantu se upraví na 7,0 až 7,2. Po přidání 36,1 g síranu amonného se suspenze nechá stát přes noc a pak se odstředí. Sraženina se rozpustí v Tris-HCl-pufru (o hodnotě pH 7,0) a o teplotě 1-4 °C a destilovanou vodou se dialyzuje к odstranění soli. Po dialyze se roztok zfiltruje a zmrazí. Výtěžkem je 343 mg enzymu karboxypeptidáza B. Specifická aktivita získaného enzymu je 17,5/umolu hydrolyzovaného Hippuryl-L-argininu/min/mg proteinu.
Příklad 2
Na strojku na maso se umele 0,25 kg vepřového pankreatu, pak se přidá 250 ml 0,05 molárního Tris-HCl-pufru (hodnota pH 7,0) a směs se nechá stát přes noc při teplotě 4-4 °C. Příští ráno se suspenze zahřeje na teplotu 37 °C a při této teplotě se nechá stát po dobu jedné hodiny. Suspenze vepřového pankreatu se pak odstředí, suprenatant se zahřeje na teplotu 60 °C a při této teplotě se inkubuje po dobu dalších 10 minut. Po přidání dvou objemových dílů ledově chladného pufru se směs odstředí. Do supernatantu se přidá 92 g síranu amonného. Jelikož se po stání přes noc nevyloučí žádná sraženina, přidá se do roztoku po nastavení hodnoty pH na 7,0 až 7,2 dalších 78,7 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát přes noc a odstředí se. Sraženina se rozpustí ve studeném (teplota +4 °C) Tris-HCl-pufru (o hodnotě pH 7,0) a dialyzuje se proti destilované vodě do dokonalého odstranění solí. Po dialyze se roztok filtruje a zmrazí se. Výtěžek je 295 mg enzymu karboxypeptidáza B. Specifická aktivita enzymu je 53,1 jumolu hydrolyzovaného Hippuryl-L-argininu/min/mg proteinu.
P ř í к 1 a d 3
Na strojku na maso se mele 0,25 kg vepřového pankreatu, načež se přidá 250 ml 0,05 molárního Tris-HCl-pufru (o hodnotě pH 7,0) a směs se nechá stát přes noc při teplotě 4-4 °C. Příští ráno se suspenze ohřeje na teplotu 37 °C a nechá se stát po dobu jedné hodiny při této teplotě. Suspenze vepřového pankreatu se odstředí, supernatant se ohřeje na teplotu °C a při této teplotě se inkubuje po dobu dalších 20 minut. Po přidání dvou objemových dílů ledově chladného pufru se směs odstředí. Do supernatantu se přidá 98,2 g síranu amonného. Jelikož se po stání přes noc nevyloučí žádná sraženina, upraví se hodnota pH roztoku na 7,0 až 7,2 a přidá se dalších 86,9 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát přes noc a odstředí se. Sraženina se rozpustí ve chladném (o teplotě +4 °C) Tris-HCl-pufru (o hodnotě pH 7,0), a dialyzuje se proti destilované vodě do dokonalého odstranění solí. Po dialyze se roztok filtruje a zmrazí se. Tak se získá 266 mg enzymu karboxypeptidáza B. Specifická aktivita je 63,2/umolu hydrolyzovaného Hippuryl-L-argininu/min/mg proteinu.
Příklad 4
Na strojku na maso se umele 0,25 kg vepřového pankreatu a pak se přidá 250 ml 0,05 molárního Tris-HCl-pufru (o hodnotě pH 7,0; směs se nechá stát přes noc při teplotě +4 °C. Příští ráno se suspenze zahřeje na teplotu +37 °C a nechá se stát při této teplotě po dobu jedné hodiny, suspenze vepřového pankreatu se odstředí, supernatant se zahřeje na teplotu 75 °C a při této době se inkubuje po dobu dalších 5 minut. Po přidání dvou objemových dílů ledově chladného pufru se směs odstředí. Do supernatantu se přidá 66,9 g síranu amonného. Jelikož se po stání přes noc nevyloučí žádná sraženina, přidá se do roztoku po nastavení hodnoty pH na 7,0 až 7,2 dalších 55,8 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát přes noc a odstředí se. Sraženina se rozpustí ve studeném (teplota +4 °C) Tris-HCl-pufru (hodnota pH 7,0) a dialyzuje se proti destilované vodě až do dokonalého odstranění solí. Po dialyze se roztok zfiltruje a zmrazí se. Výtěžek je 34 mg enzymu karboxypeptidáza. Specifická aktivita enzymu je 21,6/imolu hydrolyzovaného Hippuryl-L-argininu/min/mg proteinu.
V následující tabulce se uvádí vliv teploty a doby tepelného zpracování homogenizátu vepřového pankreatu na aktivitu enzymu karboxypeptidáza B, přičemž 1 jednotka odpovídá enzymu, který katalýzuje hydrolyzu 1,0 /imolu Hippuryl-L-argininu za minutu (měřeno při teplotě 25 °C a při hodnotě pH 7,65).
Tabulka 1
Vliv teploty a doby trvání tepelného zpracování homogenizátu vepřového pankreatu na aktivitu enzymu karboxypeptidáza В
Teplota °C Doba min Celková aktivita Celkový protein Specifická aktivita jednotka/kg pankreatu mg/kg pankreatu jednotka/mg
50 30 23 968 1 372 17,5
60 10 6 2 660 1 180 53,1
20 67 260 1 064 63,2
75 5 2 932 136 21,6
Příklad 5
Na strojku pro maso se umele 0,25 kg vepřového pankreatu a nechá se stát přes noc při teplotě místnosti. Příští ráno se přidá 250 ml 0,05 molárního acetátového pufru (hodnota pH 5,0). Suspenze se zahřeje na teplotu 60 °C a nechá se stát při této teplotě po dobu 20 minut. Po přidání dvou objemových dílů ledově chladné vody se směs odstředí. Do supernatantu se přidá 274,8 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát přes noc, odstředí se a sraženina se vyhodí. Do supernatantu se po nastavení hodnoty pH na 7,0 až 7,2 přidá 232,9 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát přes noc a odstředí se. Zbytek se rozpustí ve studeném (teplota +4 °C) Tris-HCl-pufru (o hodnotě pH 7,0) a dialyzuje se proti destilované vodě k dokonalému odstranění solí. Po dialyze se roztok zfiltruje a zmrazí se. Výtěžek je
360 mg enzymu karboxypeptidáza B. Sppeifická aktivita je 14,8 yummOu hydrolyzovaného Hippuury-L-arginnuu/mňn/mg proteinu.
Příklad 6
Na masovém strojku se umele 0,25 kg vepřového pankreatu a nechá se stát přes noc při teplotě místno^i. Příští ráno se přidá 250 ml 0,05 mo^Tního roztoku acetátového pufru (o hodnotě pH 5,5). Suspenze se zahřeje na tep]ot.u 60 °C a nechá se stát při této tepiotě po dobu 20 Po přidání 2 objemových dílů ledově chladné vody se směs odstředí. Do supernatantu se přidá 261,2 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát přes noc, odstředí se po nastavení hodnoty pH na 7,0 až 7,2 přidá 228 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát př-es noc a ods^edí se. Zbytek se roz^usí ve studenéím (teplota +4 °C) Tris-HCl-^fru (o hodnotě pH 7,0) a dialyzuje se proti destUované vodě tak dlouho, až jsou soU dokonale odstraněny. Po dialyze se roztok zfiltruje a zmrazí se. Tak se získá 317 mg enzymu karboxypeptidáza B. Speecfická akkivita je 20,3/imolu hydrolyzovaného Hippuuyl-L-argnnňuu/rnnn/mg proteinu. __
Příklad 7
Na strojku pro maso se ummle 0,3 kg vepřového pankreatu a nechá se stát při teplotě místno^i přes noc. Příští ráno se přidá 300 ml 0,05 imOárnÍho fosfátového pufru (hodnota pH 60) . Suspenze se zahřeje na tepotu 60 °C a nechá se stát při této te^ottě po dobu 20 mm^ut. Po přidání dvou objemových dílů ledově chladné vody se směs odstředí. Do supernatantu se přidá 301 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát přes noc, odstředí se a sraženina se zahodí. Do supernatantu se po nastavení hodnoty pH na 7,0 až 7,2 se přidá 2 52,6 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát přes noc a odstředí se. Zbytek se rozpussí ve st^udeném (+4 °C) Tri.s-HCl-pufru (o hodnotě pH ^0) a dialyzuje se proti destilované vodě až do dokonalého odstranění s^O^lí. Po dialyze se roztok zfiltruje a zmrazí se. Výtěžek je 517 mg enzymu karboxypeiotidáza B. S^peífi^^^á a^k^ivit^a je 57 yumolu hydrolyzovaného -L-arginňnu/mňn/mg proteinu.
Příklad 8
Na strojku pro maso se umele 0,3 kg vepřového pankreatu a nechá se stát při teplotě mí^t^м^Si přes noc. Příští ráno se přidá 300 ml 0,05 motárního ftráátovéht pufru (hodnota pH 6/5) . Suspenze se zahřeje na tepotu 60 °C a nectá se stát po dobu 20 minut při této teplotě. Po přidání dvou objemových dílů ledově chladné vody se směs odstředí. Do supernatantu se přidá 326 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát přes noc, odstředí se a sraženina se zahodí. Do snpernatantn se po nastavení hodnoty pH na 7,0 až 7,2 přidá 275 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát přes noc a odstředí se. Zbytek se rozpučí ve studeném (te^ota +4 °C) Tris-HCl-pufru (o hodnotě pH 7,0) a dialyzuje se ^ot^i ^st^ovarré vodě až do dokonalého odstranění Po dialyze se roztok zfiltruje a zmrazí se. Výtěžek je
361 mg enzymu karboxy^ptidáza B. Speeifiiká aktivita je ^^/jmolu hydrolyzovaného Hippuuyl-L-arginnuu/mňn/mg proteinu.
Příklad 9
Na strojku pro maso se umele 0,3 kg vepřového pankreatu a nechá se stát při teplotě místnosti přes noc. Přřští ráno se přidá 300 ml 0,05 motárníht ftsfátovéht pufru (o hodnotě pH 7,0). ^^spenze se zahřeje na tepotu 60 °C a nechá se stát po dobu 20 minut při t^o tep^ě. Po přidání dvou objemových dílů ledově chladné vody se směs odstředí. Do supernatantu se přidá 326 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát přes noc, odstředí se a sraženina se vyhodí. Do supernatantu se po nastavení hodnoty pH na 7,0 až 7,2 přidá 272 g síranu amonného.
Suspenze se nechá stát přes noc a odstředí se. Zbytek se rozpustí ve studeném (teplota + 4 °C) Tris-HC 1-psfrs Wnota pH 7,0) a dialyzuje se proti destilované vodě až do dokonalého odstranění soU. Po dialyze se roztok zfiltruje a zmrazí se. Výtěžek je 488 mg enzymu karboxypeptidáza B. Sppeifická aktivita je 39,9umolu hydrolyzovaného Hippuuyl-L-arginiuu/min/mg proteinu.
Příklad 10
Na strojku pro maso se rozemele 0,25 kg vepřového pankreatu a nechá se stát přes noc při teplotě místno^i. Příští ráno se přidá 250 ml 0,05 mcOárního Tris-HCl-pufru (o hodnotě pH 7,5). Suspenze se zahřeje na teplots 60 °C a nechá se stět při této teplotě po dobu 2 0 Po přidání dvou objemových dílů ledově studené vody se směs odstředí. Do supernatantu se přidá 247 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát přes noc, odstředí se a sraženina se zahodí. Do supernatantu se po nastavení hodnoty pH na 7,0 až 7,2 se přidá 202 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát přes noc a odstředí se. Zbytek se rozpásl ve studeném (o teplotě +4 °C) Tris-^HC1-puífru (o hodnotě pH 7,0) a dialyzuje se proti desti^vané vodě až do dokonalého odstranění sooi. Po dialyze se roztok zfiltruje a zmrazí se. Výtěžek je 695 mg enzymu karboxypeptidáza B. Spceífická akkivita je 17,4umolu hydrolyzovaného Hippuuyl-L-arginiuu/min//g proteinu.
Příklad 11
Na strojku pro maso se rozemele 0,25 kg vepřového pankreatu a nechá se stát přes noc při teplotě mí^tl^otti.. Ppíští ráno se přidá 250 ml 0,05 motárníht Tris-HCl-pufru (hodnota pH 8,0). Suspenze se zahřeje na teplotu 60 °C a nechá se stát při táto teploté po dobu 20 minut. Po přidání dvou objemových dílů ledově chladné vody se směs odstředí. Do supernztantu se přidá 255 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát přes noc, odstředí se a sraženina se zahodí. Do supernatantu se po nastavení hodnoty pH na 7,0 až 7,2 přidá 198 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát přes noc a odstředí se. Zbytek se rozpuutí ve studeném (tepLot^a +4 °C) Tri.s-^l^uítu (o hodnotě pH 7,0) a dialyzuje se prooi destioované vodě až do dokonalého odstranění scoí. Dialyzovaný roztok se zfiltruje a zmrazí. Výtěžek je 552 mg enzymu tzrbtxypeptidázz B. Specifická zkkivitz je 14,3Umolu hydrolyzovaného Hippuuyl-L-arginisu/min/mg proteinu.
PPíklad 12
Na stroj ku na maso se rozemele vepřový pankreas v m^nosst^Jí 0,25 kg a nechá se stát přes noc při teplotě místno^i. Příští ráno se přidá 250 ml 0,05 motárníht Tris-HCl-pufru (o hodnotě pH 8 5. Suspenze se zahřeje na tepotu 60 °C a nechá se stit při táto tie^otá po dobu 20 minut. Po přidání dvou objemových dílů ledově chladné vody se směs odstředí. Do supernatantu se pří^d^á 247 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát přes noc, odstředí se a sraženina se vyhodí. Do supernatantu se po nastavení hodnoty pH 7,0 až 7,2 přidá 197 g síranu amonného. Suspenze se nechá stát přes noc a odstředí se. Zbytek se rozpustí ve studeném ( + 4 °C) 'Tris-^l^ulíru (o hodnotě pH 7,0) a dizlyzuje se psotii testibvváné vodě až do dokonalého odstranění soU. Dialyzovzný roztok se zfiltruje a zmrazí se. Výtěžek je 1 209 mg enzymu tzrbtxypeptidázz B. Ssucifiitá zkkivitz je 6,4dimolu hydrolyzovaného Hiupusyl-L-arginisu/min/mg proteinu.
V tabulce 2 se uvádí vliv hodnoty pH pufru ^užitého při tepdném zpracování (60 °C po dobu 20 minut) homooeeizovaného vepřového pankreatu na zktivits enzymu kzrboxypeptidázz B.
Tabulka 2
Vliv Hodnoty pH pufru použitého při tepelném zpracování (60 °C po dobu 20 minut) homogenihovaného vepřového pankreatu na aktivitu enzymu karboxypeptidáza B
Hodnota pH
Celková aktivita Celkový protein jednotka/kg pankreatu mg/kg pankreatu
SppeCfická akkivita jednotka/mg
5,0 21 348 1 440 14,8
5,5 25 808 1 268 20,3
6,0 98 333 1 724 57,0
6,5 52 767 1 204 43,8
7,0 64 882 1 625 39,9
7,5 48 400 2 780 17,4
8,0 31 632 2 210 14,3
8,5 30 753 4 836 6,4
Příklad 13
Na strojku pro maso se rozem^l.e 0,25 kg vepřového pankreatu a nechá se stát přes noc při teplotě míssnoosi. Příští ráno se přidá 250 ml 0,05 mooárního fosfátového pufru (o hodnotě pH 6,0). Suspenze se zahřeje na tej^oU 60 °C a nectá se stát po dobu 20 minut při toto teplotě. Po přidání dvou objemových dílů ledově chladné vody se suspenze odstředí. Suppenatant se upraví přidáním síranu amonného až do koncentrace 340 g/1 (480 g). Suspenze se nechá stát přes noc, odstředí se, sraženina se vyhodí a do supernatantu se přidá síran amonný až do koncentrace 370 g/1 (41,1 g) . Suspenze se nechá stát přes noc a odstředí se. Sraženina se rozpuutí ve studeném ( + 4 °C) TTs-HCl^i^ru (o hodnotě pH 7,0) a dialyzuje se proti destioované vodě až do odstranění veškerých soU. Po dialyze se roztok zfiltruje a zmrazí se. Výtěžek je 95 mg enzymu karboxypeptidáza B. S^peiifi^c^ká akkivita je 56,2 umolu hydrolyzovaného Hippuryl-L-rrginiuu/min/mg proteinu.
Příklad 14
Na strojku pro maso se rozemele 0,2 kg vepřového pankreatu a nechá se stát přes noc při teplotě místnoosi. Příští ráno se přidá 200 ml 0,05 mooárního fosfátového pufru (o hodnotě pH 6,0). Suspenze se ·..ohřeje na teplotu 60 °C a inchá se po dobu 20 minut při této tohoto. Po přidání dvou objemových díl^ů ledově chladné vody se suspenze ocdstřecdií. Do supernatantu se přidá síran amonný až do koncentrace 330 g/1 (33 g). Suspenze se nechá stát přes noc, odstředí se a sraženina se zahodí. Suppenatant se nasstí síranem amonným až do koncentrace 370 g/1 (44,8 g) . Suspenze se nechá stát přes noc a odstředí se. Sraženina se rozpuutí ve studeném (te^ota +4 °C) Tri-s-HCl^uíiru (o hodnotě pH 7,0) a ^a^zuje se prooi deetilovaně vodě až do dokonalého odstranění solí. Výtěžek .. je 62 mg enzymu karboxypeρtidázr B. Sppeifická atomta je 89,0 Ammlu hydrolyzovaného Hippuuyl-L-rrginiuu/min/mg proteinu.
Příklad 15
Na strojku pro maso se rozemele 0,25 kg vepřového pa^J^ireatu a nechá se stát přes noc při teplotě místnossi. Příští ráno se přidá 250 ml 0,05 molárního fosfátového pufru (o hodnotě pH 6,0); suspenze se zahřeje na tepotu 60 °C a nectá 20 minut. Po přidání dvou objemových dílů ledově chladné tant se nasytí síranem amonným až do koncentrace 320 g/1 přes noc, odstředí se, sraženina se zahodí a supernatant koncentrace 370 g/1 (65 g). Suspenze se nechá stát přes noc a odstředí se. rozpuutí ve studeném ( + 4 °C) Tds-HCl-^udu (o hodnotě pH 7,0) a dialyzuje vané vodě až do odstranění solí. Po dialyze se roztok zfiltruje a zmrazí se. Výtěžek je 106,5 mg karboxypeptidázy B. Sppeífická aktivita je 9 5,5uimolu hydrolyzovaného Hippuuyl-ί^ςίηήηυ/πιίη.^ς proteinu.
se stát při této tepdoté po dobu vody se suspenze odstředí.
(386 g). Suspenze se nasytí síranem
Supernase nechá stát amonným až do Sraženina se se ргоЪ:1 destHoPříklad 16
Na strojku pro maso se rozemele O.? kg vepřového nankreatu a nechá se stát přes noc při teplotě míítnoosi. PPÍští ráno se přidá 200 ml 0,05 mo^Tního fosfátového pu^ru (o hodnotě pH 6,0). Suspenze se zahřeje na tepotu 60 °C a necb! se 20 minut. Po přidání dvou objemových dílů ledově studené tant se nasytí síranem amonným až do koncentrace 310 g/1 přes noc, odstředí se, sraženina se zahodí a supernatant koncentrace se rozpuutí SestiSovaaé se. Výtěžek zovaného Hipauryl-L-arginánu/min/mg proteinu.
stát pš1 teto tepote po dobu vody se suspenze odstředí. Superna(310 g). Suspenze se nechá stát se nasytí síranem amonném až do
370 g/1 (67,2 g) . Suspenze se nechá stát přes noc a o^tředí se. Sraženina ve studném ( + 4 °C) T^s-HCl-fufru (o hodnotě pH 7,0) a dialyzuje se proti vodě až do dokonalého odstranění solí'. Po dialyze se roztok je 135 mg enzymu karblxypeptrsáza B. nirp.-ifl.ek.á aktivita je zfiltruje a zmrazí
4,3uimolu hydrolyP říkl a d 17 se stát přes noc se stát při této teplotě po dobu vody se suspenze odstředí. Superna(386,4 g). Suspenze se nechá stát se nasytí síranem amonným do koncenNa strojku na maso se rozemele 0,25 kg vepřového pankreatu a nechá při teplotě ms^t^]^a^sS:L. Příští ráno se přidá 250 ml 0,06 moláraSho fosfátového pufru (o hodnotě pH 6,0). Suspenze se zahřeje na teplotu 60 °C a nechá 20 minut. Po přidání dvou objemových dílů ledově chladné tant se nasytí síranem amonným až do koncentrace 320 g/1 přes noc, odstředí se, sraženina se zahodí a supernatant trace 360 g/1 (52 g) . Suspenze se nechá stát přes noc ?. odstředí se. Sraženina se rozpuutí ve studeném ( + 4 °C) 'T^s-^l-pufru (o hodnotě pH 7,°) a ďLal^yzuje se proti testHované vodě až do dokonalého odstranění solí. Po dialyze se roztok zfiltruje a zmrazí se. výtěžek je 76 mg enzymu karboxypeptidáza B. Specifická aktivita je 123,9 Ar^mo_u hydrolyzovaného Hippuuyl-L-arginnnu/min/mg proteinu.
P říkl a d 18
Na strojku pro m^so se rozemele 0,25 kg vepřového pankreatu a nechá se etál pres noc při teplotě míítnoosi. PPíští ráno se přidá 250 ml 0,05 mo^Eního fosfátového pufru (o hodnotě pH 6,0). Suspenze se zahřeje na teplot^u 60 °C a nechá 20 minut. Po přidání dvou objemových dílů ledově chladné tant se nasytí síranem amonným až do koncentrace 320 g/1 přes noc, odstředí se, sraženina se zahodí a supernatant se stát při této teplotě po dobu vody se suspenze odstředí. S^i^c^ema(386,4 g). Suspenze se nechá stát se nasytí símnem koncentrace 350 g/1 (39 g). Suspenze se nechá stát přes noc a odstředí se. rozpusití ve studeném ( + 4 °C) '^^'-HCl-pufru vané vodě až do dokonalého odstranění solí. Výtěžek je 45 mg enzymu karboxyppptidáza B. ho Hippuuyl-L-arginanu/min/mg proteinu.
(o hodnotě Po dialyze Sppeifická amonným až do Sraženina se se prot:i destiloa zmrazí se.
pH 7,0) a dalyzuje se roztok zfiltruje aktivita je 286,7 ximolu hydrolyzovanéI
47 2
Příklad
Na strojku pro maso se rozem^^le 0,25 kg vepřového pankreatu a nechá se stát přes noc při teplotě místnossi. Příští ráno se přidá ml '3,05 molárního fosfátvvěho pufru (o hodnotě pH 6,0). Suspenze se zahřeje im - - .- i. ... i0 - . o.·.' . '; .. o? .—,άι no dobu 20 minut při této teplotě. Po přidaní dvou objemových ie.L Ί ? -o, . ; j _ -'.spmzc odstředí. Supernatant se. nasytí síranem amonným do koncentrace 3 2.' ti g/1 (38c, 4 g) . Suspenze se nechá stát přes noc, odstředí se, sraženina se vyhodí a supernatant se nasytí síranem amonným až do koncentrace 340 g/1 (26 g). Suspenze se nechá stát přes noc a odstředí se. Sraženina se rozmístí' ve studeném (+4 °C) Tris-HCl-pufru (o hodnotě pH 7^) a dialyzuje se ^oti destno-vané vodě až do dokonalého odstranění solí. Po dialyze se roztok zfiltruje a zmrazí se. Výtěžek je 25,5 mg enzymu karboxypeppidáza B. Speeifická aktivita je 195,8 Amolu hydrolyzovuného Hippuuyl-L-arginiuu/min/ing proteinu.
V následující tabulce se uvádí \ iu.· frakcJ^s^nace síranem amonným na aktivitu enzymu karboxypeppidáza B.
Tabulka 3
Působení frakci^onace síranem amonným na aktivitu enzymu karboxypeptidáza B
Konneenracel· síranu Celková, aktiviaa Cekoový protein Specifická aktiviamonného (g/1) jeňookyy mg - psoSeiu и .'.р.’к - panke-.uuu ta jednokka/mg
1. sycení 2.. .sycení ________________ . _ _____________________________________________
34 0 2 1 5 71 3 8 0 56,2
330 370 2-' 67 0 310 89,0
320 370 40 697 426 95,5
310 370 29 914 675 44,3
320 360 37 629 304 123,8
320 350 51 610 180 286,7
320 340 19 977 102 195,8
Příklad 20
Na strojku pro maso se rozemele 1 kg hovězího pankreatu a nechá se stát přes ш’ při teplotě místnosti. PPíští ráno se přidá jeden litr 0,05 moSárnsho fosfátového pufru (hodnota pH 6^) a sus^nze se zahřeje na tepotu 60 °C a nechá se stlt při této tepote po dobu 20 minut. Po přidání dvou objemových dílů (3,8 litrů) ledově chladné vody se suspenze odstředí. Suppenntant se nasytí síranem amonným až do koncentrace 320 g/1 (1,6 kg). Suspenze se nechá stát přes noc, odstředí se a sraženina se zahodí. Suppenatant se nasytí síranem amonným až do koncentrace 350 g/1 (165 g). Suspenze se nechá stát přes noc a odstředí se. Sraženina se rozpuu^ ve studeném ( + 4 °C) Tris-HCl-pufru (o ^dnotě pH 7,0) a dialyzuje se proti destiSovklV vodě až do dokonalého odstranění solí. Po dialyze se roztok z filtruje a zmrazí se. Výtěžek je 2318,7 mg enzymu karboxypeptidáza B. Sppeífická aktivita je 15,4 /umolu hydrnlyzovkného Hippuuyl-L-arginluu/min/mg proteinu.
Příklad 21
Suspenduje se 1 g Akriíexu C-100 Xerogelu /obsah karboxyskupin: 6,2 + 0,3 m-ekv (g) v 50 ml 0,1 molárního roztoku kaliumfosfátového pufru (pH 7,0), načež se do suspenze na Pelově chlaclné lázni za s-tě^ho micMní přidá rozt:^ 2 g N-cyyrlleeχy·lN'-[22(4-molfolin)ethyl] j_im^(^r^mtthyi-)-t^<^.luen!^i^/1 fonátu ve 20 my c^ačín^o ( + 4 °C) roztok pufru. Po lOminutovém míchání se do roztoku přidá vodný roztok enzymu karboxypeptidáza B (koncentrace 16,45 mg/my, specifická aktivita enzymu: 17 /umoiu hydrolyzovaného Hippuryl-L-argininu/min/mg proteinu). Reakční doba je 48 hodin, přičemž se směs dvakrát míchá vždy po dobu 6 hodin. Gey se odíraní, promyje se třikrát vždy 100 ml 0,1 m^H^^rního roztoku kaliumfosfátového pufru (o hodnotě pH 7,0), třikrát vždy 100 ml 0,1 i^dárního, 1 mol chloridu sodného obsahujícího roztoku kaliumfosfátového pufru (o hodnotě pH 7,0) a třikrát vždy 100 ml 0,1 moHrního roztoku kalimfosfátového pufru (o hodnotě pH 7,0). Gel se nakonec promyje pětkrát vždy 200 ml destilovaié vody a lyofilizuje se. Výtěžek je 1,6 g. Akktvita je 630 /umoiu hydrolyzovaného HippuuyУ-L-argiiiiu/mii/g suché látky.
Příklad 22
Suspenduje se 1 g Xxrogelu Akkilex C-100 /obsah rayboxyskupin je 6,2 + 0,3 m-ekv (g) ve 50 ml 0,1 mooárního roztoku kaliumfosfátového ' pufru (o hodnotě pH 7,0). Do suspenze se pak na ledově chladné lázni přidá za stálého míchání roztok 1 g N-cykkoheexyl-N'- 2-(4-modinyUethy rarbodčimicdn/thyy----oluensulfoiátu ve 20 ml stučleného ( + 4 °C) roztoto pufru. Po lOminutovém míchání se do roztoku přidá 31 ml vodného roztoku enzymu karboxypeptidáza B (koncentrace: 16,45 mg/ml a specifická aktivita enzymu: 17 ximolu hydrolyzovaného Hipppuyl-L-arginínu/min/mg proteinu). Reakční doba je 48 hodin, přičemž se v průběhu této doby dvakrát míchá vždy po dobu 6 hodin. Gel se odddlí, třikrát se promyje vždy 100 ml 0,1 mostního roztoku kaliumfosfátového p^fru (o hodnotě pH 7,0), třikrát vždy 100 ml 0,1 mo^riního, 1 ' mol chloridu sodného obsahu jícího roztoku kaliumfosfátového pufru (o hodnotě pH 7,0) a třikrát vždy 100 ml 0,1 mooárního roztoku kaliumfosfátového pufru (o hodnotě pH 7,0). Gel se nakonec promyje pětkrát vždy 200 mi destilovaié vody a lyofilizuje se. Výtěžek je 1,43 g. Akkivita je 690 /umoiu hydrolyzovaného Hippuury^^^i^nu/g suché látky.
Příklad 23
Suspenduje se 1 g Xxrogelu Akkilex C-100 /obsah karboxylových skupin 6,2 + 0,3 m-ekv (g) v 50 ml· 0,1 mo^Tního roztoku kaliumfosfátového pufru (o hodnotě pH 7,0), načež se do suspenze na ledově cdaclné lázni, za stálého míchání přidá roztok 2 g N-cydoheey^-N^-^2t(4^t^ooyol1.ii^])ethy1] karbodiimidmeeheУ1-utolueisulfoiátu ve 20 ml stu^en^o ( + 4 °C) roztob pufru. Po lOminutovém míchání se do roztoku přidá 15,5 ml vodného roztoku enzymu karboxypeptidáza B (konienirace: 16,45 mggml, specifická aktivita enzymu: 17 /um)lu hydrolyzovaného H(^]uιlUJ^].-L·tayg(^ni^um^(^nmg proteinu) . Reakční doba je 48 hodin, přičemž se v průběhu této doby směs dvakrát míchá vždy po dobu 6 hodin. Gel se odddlí a promyje se třikrát vždy 100 ml 0,1 radimího roztoku kaliumfosfátového pufru (o hodnotě pH 7,0), třikrát vždy 100 ml 0,1 mo^riního, 1 mol chloridu sodného obsahuuícího roztoku kaliumfosfátového pufru (o hodnotě pH 7,0) a třikrát vždy 100 ml 0,1 mooárního roztoku kaliumfosfátového pufru (o hodnotě pH 7,0). Nakonec se gel promyje pětkrát vždy 200 ml des^^vané vody a lyofilizuje se. Výtěžek je 1,6 g. Ak^ita je 880 /umoiu hydrolyzovaného Hippiiury-L-argininu/min/g suché látky.
PPíklad 24
Suspenduje se 1 g Xxrogelu Akkilex C-100 /obsah karboxylových skupin 6,2 + 0,3 m-ekv (g) v 50 ml 0,1 mo^Tního roztoku kaliumfosfátového pufru (o hodnotě pH 7,0), načež_ se do suspenze na ledově chladné vo^ní lázni za stálého míchání přidá 2 g N^t^^^J^lohex^^lt^N'-_2 Н-шо^оЫпу1) ethyl] rarbodiimidmethey“-utoluensulfliátu ve 20 ml s^tenéto ( + 4 °C) roztoku
2 pufru. Po 1 Onu и и t ov<'in mi uhání se přidá roztok 62 ml vodného roztoku enzymu karboxypeptidáza В (končen l rac< ·: 16,4 5 mg Z ml, specifická aktivita enzymu: 17 /umolu hydrolyzovaného HippLiryl-h-a rq i ni 11 o / mi n / ing proteinu). Reakční doba je 48 hodin, přičemž se v průběhu této doby směs dvakrát míchá vždy po dobu 6 hodin. Gel se oddělí a promyje se třikrát vždy
100 ml 0,1 molárního roztoku kaliumfosfátového pufru (o hodnotě pH 7,0), třikrát vždy
100 ml 0,1 molárního, 1 mol chloridu sodného obsahujícího roztoku kaliumfosfátového pufru (o hodnotě pH 7,0) a třikrát vždy 100 ml 0,1 molárního roztoku kaliumfosfátového pufru (o hodnotě pil 7,0). Gel se nakonec pětkrát promyje vždy 200 ml destilované vody a lyofilizuje se. Výtěžek je 1,55 g. Aktivita je 740 Zimolu hydrolyzovaného Hippuryl-L-argininu/min/g suché látky.
Tabulka 4
Imobilizace enzymu karboxypeptidáza В
Složení reakční Aktivi- Imobilizo- Imobilizova- V rozpuštěné Ztrátě Specifická
směsi ta pro- váná ný protein formě regene- aktivity aktivita
lx 2x 3x duktu/ akti- jednot- rovaná akti- jednotka % jednotka %
АС-100 СМС СРВ jednotka vita ka % vita jednot-
g g g g Xero- jednot- ka %
qelu ka
1 2 510 630 1 008 11,6 313,7 61,5 207,0 2,4 7 444,1 86,0 3,21 19,51
1 1 510 690 987 11,4 328,0 64,3 285,0 3,3 7 387,8 85,3 3,0 18,23
1 2 255 880 1 408 32,5 102,0 40,0 73,3 1,7 2 848,3 65,8 13,80 83,89
1 2 1 020 740 1 147 6,6 655,6 64,3 371,9 2,1 15 799,1 91,3 1,75 10,63
lx = AC-100, Akrilex 100
2x - CMC, N-cyklohexy1-N~-[2(4-morfolinyl)ethyl] karbodiimidmethyl-p-toluensulfonát
Зх = СРВ, karboxypeptidáza В
4x = specifická aktivita rozpuštěného enzymu se považuje za 100 %

Claims (1)

  1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU
    Způsob izolace enzymu karboxypeptidázy В ze slinivky břišní savců, vyznačující se tím, že se připraví homogenizát pankreatu a ten se autolýzuje, autolyzát se zředí pufrem o hodnotě pH 5,0 až 8,5 s výhodou 6,0 až 7,0 v poměru 1:1 a podrobuje se při teplotě 50 až 75 °C, s výhodou při teplotě 50 až 65 °C po dobu 5 až 30 minut, s výhodou po dobu 15 až 25 minut tepelnému zpracování, potom se takto získaná směs odstředí a filtruje, do supernatantu se přidá 200 až 320 g/1, s výhodou 300 až 320 g/1 síranu amonného, získaná suspenze se popřípadě odstředí, frakce, která obsahuje aktivní enzym karboxypeptidázy B, se vysráží ze získané kapaliny přidáním 10 až 80 g/1, s výhodou 25 až 35 g/1 síranu amonného, sraženina se oddělí odstředěním a takto získaný enzym se rozpustí ve vodě nebo nebo v roztoku pufru a dialýzuje se vodou nebo roztokem pufru.
CS842361A 1983-07-11 1984-03-29 Method of b-carboxypeptidase's enzyme insulation CS252472B2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS853128A CS252482B2 (cs) 1983-07-11 1984-03-29 Způsob imobilizace enzymu karboxypeptidázy

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU832469A HU190129B (en) 1983-07-11 1983-07-11 Process for the isolation of carboxypeptidase b enzyme from mammal pancreas

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS236184A2 CS236184A2 (en) 1987-01-15
CS252472B2 true CS252472B2 (en) 1987-09-17

Family

ID=10959530

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS842361A CS252472B2 (en) 1983-07-11 1984-03-29 Method of b-carboxypeptidase's enzyme insulation

Country Status (9)

Country Link
US (1) US4650762A (cs)
CS (1) CS252472B2 (cs)
CU (1) CU21674A3 (cs)
DD (2) DD220334A5 (cs)
DE (1) DE3412669A1 (cs)
HU (1) HU190129B (cs)
RO (1) RO88619A (cs)
RU (1) RU1769763C (cs)
SU (1) SU1487817A3 (cs)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5278284A (en) * 1992-05-14 1994-01-11 Miller Brewing Company Protein purification method
IL116696A (en) * 1995-01-25 1999-08-17 Bio Technology General Corp Production of enzymatically active recombinant carboxypeptidase b
PL325017A1 (en) * 1995-08-16 1998-07-06 Zeneca Ltd Chemical compounds

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3260654A (en) * 1963-03-22 1966-07-12 Ormonoterapia Richter Spa Method for the preparation of a pancreas extract having a high proteolytic activity
FR3071M (fr) * 1963-10-18 1965-01-18 Centre Nat Rech Scient Nouvelles protéases pancréatiques, utilisables notamment en gastro-entérologie.
DK124483B (da) * 1967-12-04 1972-10-23 Bayer Ag Fremgangsmåde til rensning af carboxypeptidase B.
JPS57150384A (en) * 1981-03-12 1982-09-17 Eisai Co Ltd Carboxypeptidase ar and its preparation
US4532214A (en) * 1982-06-03 1985-07-30 Reanal Finomvegyszergyar Method for isolation of aminoacylase

Also Published As

Publication number Publication date
HU190129B (en) 1986-08-28
US4650762A (en) 1987-03-17
DD222632A5 (de) 1985-05-22
RO88619A (ro) 1986-02-28
DD220334A5 (de) 1985-03-27
CS236184A2 (en) 1987-01-15
CU21674A3 (en) 1987-10-12
DE3412669A1 (de) 1985-01-24
SU1487817A3 (ru) 1989-06-15
RU1769763C (ru) 1992-10-15
HUT34234A (en) 1985-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US3945889A (en) Preparation of human placental hyaluronidase
EP1036166B1 (en) Procedure for extraction and use of hatching fluid from atlantic salmon
CS252472B2 (en) Method of b-carboxypeptidase&#39;s enzyme insulation
US2808362A (en) Preparation of hyaluronidase
RU2208637C1 (ru) Способ получения генно-инженерного инсулина человека
JP2021177752A (ja) 低温酸性プロテアーゼＰｓＡＰＡ並びにその調製方法及び応用
DE2509482C2 (de) Verfahren zur Herstellung des Kallikrein-Trypsin-Inhibitors aus Rinderlunge
EP0092829A2 (en) Process for semi-synthesis of human insulin and alkaline protease for use therein
Pardoe The inducible neuraminidase (N-acyl-neuraminyl hydrolase EC 3.2. 1.18) of Klebsiella aerogenes NCIB 9479
JPH0244510B2 (cs)
KR20010109348A (ko) 췌장의 프로카복시-펩티다제 ｂ, 이의 동질 효소 및뮤테인의 제조 방법, 및 이들의 용도
Chongcharoen et al. Characterization of trypsin-modified bovine lens acylpeptide hydrolase
CS252482B2 (cs) Způsob imobilizace enzymu karboxypeptidázy
EP0059182B1 (en) A process for isolating aminoacylase enzyme from a mammal kidney extract
EP0028942B1 (en) Process for the production of an immobilized enzyme system and the purification of glucose isomerase
US4374197A (en) Process for thymosin α1
US20220204922A1 (en) Purified fish proteases with high specific activities and its process of production
JP3547021B2 (ja) 新規アスパルチック・プロティナーゼ
CA2125158C (en) Proteolytic mixture containing escharase and method of isolating same
RU2236460C1 (ru) Способ получения препарата коллагеназы
Jaken et al. Purification and comparison of several catalytic parameters of the γ-glutamyltranspeptidase of rat mammary adenocarcinoma (13762) and of normal rat mammary gland
NO168218B (no) Elektrisk hengeisolator
RU1807080C (ru) Способ выделени амилазы из препарата амилоризин
SU582745A3 (ru) Способ получени туберкулина
JP3866357B2 (ja) 熱安定性耐溶媒性エステル分解酵素