CN88101864A - 低毒性药物类脂制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明对与有毒的疏水性药物如多烯抗菌素两性霉素B结合的非脂质体的类脂化合物的方法和组合物作了介绍。类脂组份最好是磷脂——二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)和二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPC)(约7∶3摩尔比)的混合物。该类脂配合物含有一种生物活性剂，并且可用许多方法制备。与药物的游离形式相比，具有基本相等或较大效力以及降低的药物毒性。还公开了新的脂质体装填方法。

Description

本申请是1987年7月6日提出的美国申请069908的部分后续，又是1987年3月5日提出的美国申请022157号的部分后续。
本发明是针对制备具有高的药品：类脂比（高的药品：类脂配合物，或称HDLCS）的结合药物的类脂配合物的制剂及方法。一般耒说这样一些制剂的效力基本等于或大于游离形式的同一药品，且毒性较低。此外，还公开了配制这种HDLCS的方法。更具体地，本发明是针对这些具有毒性的抗真菌多烯类抗菌素，特别是两性霉毒B和制霉菌素的高的药品;类脂比配合物的使用。
本发明的高药品：类脂比配合物（HDLCS）可采用与制备脂质体基本相同的技术耒制备。本发明包括使用与生物活性剂如药品，尤其是多烯抗菌素如两性霉素B和制霉素结合的这些HDLC结构。
本发明另一方面是公开了在不用有机溶剂的情况下制备脂质体（或HDLCS）的新方法。经过乙醇或含水中介体将药品包裹或结合到脂质体中。
脂质体是完全封闭的类脂双层膜，包含了一个被包裹的水性空间。脂质体可以是单层囊（具有单一膜双层）或多层囊（以多元双层膜为特点的洋葱状结构，通过含水层而彼此分开）。这种双层是由包括一个疏水“尾”区和一个亲水“头”区的二个类脂单层组成的。膜双层的结构使类脂单层疏水（非极性）尾指向双层的中心，而亲水“头”指向水相。
Bangham等人（J.Mol.Biol.，1965，13∶238-252）最初的脂质体制剂是把磷脂悬浮在一种有机溶剂中，然后蒸发，使反应器上留下磷脂膜，然后加入适量的水相，使该混合物“膨胀”，得到的由多层囊（MLVS）组成的脂质体用机械方法分散。这种技术成为Papahadjopoulos等人介绍的小声波处理的单层囊和大单层囊（Biochem.Biophys.Acta.，1967，135∶624-638）发展形成的基础。
用于制备大单层囊（LUVS）的技术，例如逆相蒸发，浸渍法和净化稀释均能用于生产脂质体。这些和另外一些生产脂质体的方法的回顾在教科书Liposomes中可以找到（Marc Ostro，ed.，Marel Dekker，Inc.，New York，1983，Chapter1）其中的相关部分通过引用被结合到本申请中。也可参阅Szoka，Jr，等人（1980，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，9∶467）的文章。其有关部分通过引用被结合到本申请中。特别推荐的形成LUV的方法已被Cullis等人（PCT Publication No.87/00238，January16，1986，题为“Extrusion Technique for Producing Unilamellar Vesicles”）作了介绍，通过引用被结合在此申请中。用这种称为LUVETS的技术制成的囊被加压挤过一个膜过滤器，囊也可用挤压技术通过一个200nm的过滤器耒制备。这些囊被称为VET200。在挤压前，这些囊至少可经受一次冷冻-解冻循环。该法已为Mayer等人，1985年在Biochem.et.Biophys。Acta，817∶193-196题为“Solute Distributions and Trapping Efficiencies Observed in Freeze-Thawed Multilamellar Vesicles”的文章中作了介绍，其有关部分参考结合在本申请中。
在本发明的实施中，推荐一类以具有基本相等的片层溶质分布为特征的脂质体和它们的制备方法。这类被推荐的脂质体如Lenk等人在美国专利4，522，803中所规定的那样被称作稳定的多层囊（SPLV），它包含了单相囊（Fountain等人在美国专利4，588，578中作了描述）和上述经过冷冻-解冻处理的多层囊（FATMLV）。
许多固醇和其水溶性衍生物已被用耒形成脂质体，具体可参阅Janoff等人，1988年1月26日批准的题为“Steroidal    Liposomes”的美国专利4，721，612。Mayhew等人在1985年3月14日出版的PCT公开WO85/00968上介绍了一种通过将其包裹在由α-维生素E及其某些衍生物的脂质体中降低药品毒性的方法。而且，各种维生素E及其水溶性衍生物已被用耒制备脂质体，参阅Janoff等人的“α-维生素E为基础的囊”（1987年4月23日出版的PCT公开No87/02219）并参考结合到本申请中。
在脂质体药物传递***中，生物活性剂例如药物被包裹在脂质体中，然后给待治疗的病人施用。例如参阅Rahman等人的美国专利3，993，754;Sears的美国专利4，145，410;Papahadjopoulos等人的美国专利4，235，871;Schneider的美国专利4，224，179;Lenk等人的美国专利4，522，803以及Fountain等人的美国专利4，588，578此外，如果药物是亲脂的，它可以与类脂质的双层结合。在本发明中，术语“包裹”或“包裹”既包括在脂质体水性空间中的药物，也包括与类脂双层结合的药物。
许多治疗疾病有用的药物对病人有毒性，这些毒性可能是心脏毒性的，如抗肿瘤药品阿霉素;或者是肾毒性的，例如氨基苷或象两性霉素B这样的多烯抗菌素。两性霉素B是一种极毒的抗真菌多烯抗菌素，对治疗有生命危险的真菌感染具有独特的最大可靠性（Taylor等人，Am.Rev.Respir.Dis;1982，125∶610-611）。因为两性霉素B是一种疏水性药物，它不溶于水溶液，商业上得到的是它在脱氧胆酸酯中的胶体分散液，用一种本身有毒性的洗涤剂使它悬浮。两性霉素B甲酯和两性霉素B还被证明是有抗HTLV-Ⅱ/LAV病毒，一种类脂包裹住的还原病毒的活性，这种病毒在病原学上表现为获得性免疫缺陷综合症（AIDS）（Schaffner等人;Biochem，Pharmacol，1986，35∶4110-4113）。在本研究中，把两性霉素B甲酯抗坏血酸盐（水溶性）和两性霉素B分别加入HTLVⅢ/LAV感染细胞的培养物中并检验细胞的病毒复制。结果表明，两性霉素B甲酯和两性霉素B类似于在疱疹病毒下证明的那样能保护靶细胞抗该病毒的细胞致病作用（Stevens等人，Arch.Virol.，1975，48∶391）。
采用脂质体包囊的两性霉素B的报导已在文献中出现。Juliano等人（Annals N.Y.Acad.Sci;1985，446∶390-402讨论了用脂质体两性霉素B治疗全身真菌感染。这些脂质体包括磷脂，例如以7∶3摩尔比例的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）和二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）和胆甾醇。比较游离的和脂质体包裹的两性霉素B的急性毒性研究（LD50）和体外试验表明，来用脂质体的制剂具有基本不变的抗真菌效果，而且毒性降低。Lopez-Berestein等人（J.Infect.Dis.，1986，151∶704-710）把脂质体包囊的两性霉素B施用于全身真菌感染的病人，该脂质体含有7∶3摩尔比的DMPC∶DMPG，该药物以大于90%的效率被包囊。5摩尔%两性霉素B的脂质体药物的治疗效果为：被治疗的病人66%反应良好，真菌感染部分或全部缓解。Lopez-Berestein等人（J.Infect.Dis.，1983，147∶939-945），Ahrens等人（S.Jour.Med.Vet.Mycol，1984，22∶161-166），Panosian等人（Antimicrob.Agents    Chemo.，1984，25∶655-656）以及Tremblay等人（Antimicrob.Agents    Chemo.，1984，26∶170-173）也试验了在治疗和预防老鼠全身念珠菌病和利什曼原虫病（Panosian等人，Supra）时游离的与脂质体的两性霉素B的对比效果。他们发现，用脂质体包囊的两性霉素B对治疗念珠菌病有增大的治疗指数。在所有的情况下，均发现当药物被包囊在脂质体中时，可以耐受大得多的两性霉素B的剂量。两性霉素B脂质体制剂对治疗利什曼原虫病没有或没有多少作用。
已经制成含有DMPC∶DMPG，麦角甾醇和两性霉素B的前脂质体（类脂和药物涂布到一种可溶性载体上形成一种颗粒物）（Payne等人，J.Pharm.Sci.，1986，75∶330-333）。
在其他的研究中，用脂质体两性霉素B与用两性霉素B脱氧胆酸酯进行类似的静脉注射治疗老鼠的隐性微球进行比较（Graybill等人，J.Infect.Dis，1982，145∶748-752）。用脂质体两性霉素B治疗的老鼠显示出更长的存活期，更低的隐性微球菌组织数，更低的急性毒性。本研究所用的多层囊脂质体含有麦角甾醇。Taylor等人（Am.Rev.Resp.Dis.，1982，125∶610-611）用含有麦角甾醇和磷脂的脂质体两性霉素B治疗老鼠组织胞浆菌病。在治疗组织胞浆菌病中脂质体制剂与游离的两性霉菌B制剂相比毒性小，效果较好，并且改变了血清和组织的分布其有较低的血清浓度和较高的肝脾浓度。
在上述研究中，含类脂的脂质体以增加制剂中类脂的含量耒缓和药物毒性的趋势从而改善被包裹药物的毒性。申请人意外地发现，一个低的类脂成分也能非常有效地降低毒性。本发明用MLV法形成HDLCS时。能得到HDLCS与MLVS的混合体;这些制剂所用的药品两性霉素B的含量从约5-约25%摩尔，HDLCS的比例随着药物的摩尔百分数增加而增大。使用25-约50%摩尔药品的制剂基本上是HDLCS而无脂质体。另外，含5%摩尔或更低量的疏水药品的制剂实质上是有一些HDLCS的脂质体。如果需要的话，从不同一的混合体中分离HDLCS可以采用该技术领域中已知的任何一种分离技术，例如密度梯度离心分离法耒完成。
形成HDLCS所用的方法大体上与形成脂质体所用的方法相同，但本发明采用高的药品：类脂比，形成较脂质体更多的HDLCS，与脂质体制剂相比，毒性竟意想不到的大大下降。
本发明公开了HDLC（药品：类脂高比例的配合物）制剂，该制剂含有类脂和包括药物在内的生物活性剂。这类HDLCS可以含有磷脂，如DMPC和DMPG，最好是7∶3摩尔比，或饱和磷脂，或脂肪酸磷脂。
生物活性剂最好是一种药物，例如抗真菌剂如制霉菌素或两性霉素B。所用药物的摩尔百分数最好是约6-约50%摩尔，最好是30-50%摩尔。这种HDLCS的药物组合物最好含一种药物如两性霉素B，并使它含有药用的载体或稀释剂，并且，这些组合物可以经非肠道给药。通过把它们施用于象人类这样的哺乳动物耒治疗如真菌感染的传染病。本发明含HDLC的组合物包括那些基本上无脂质体的组合物以及基本上无包裹药物的脂质体的组合物。总的耒说，类脂重量一般不大于约10%，最好不大于约5%尤其是不大于3%。
公开了用于制备本发明HDLCS的各种方法：例如首先在一种溶剂，例如DMSO或甲醇中将药品，如两性霉素B溶液化的技术。将类脂（DMPC∶DMPG最好以7∶3摩尔比）溶解于一种溶剂，如二氯甲烷，并将类脂溶液与药物溶液混合，减压蒸发溶剂，生成薄的类脂药物膜。该膜在一种水溶液，如盐水、PBS或甘氨酸缓冲液中可以水合形成HDLCS。另外，该水溶液在溶剂蒸发前，可被加入到含药物和类脂相的溶剂中。另一方面，得到的干燥类脂药物膜可再悬浮在一种溶剂，例如二氯甲烷中，并在该膜水合以前，再次减压蒸发。还可利用一种脱水的方法，在此方法中，使一种干燥的类脂药品膜脱水形成一种与水溶液水合的片状物。
在另一形成本发明HDLCS的方法中，通过MLV法制备含有生物活性剂（药物，例如多烯类抗真菌剂如两性霉素B）的类脂颗粒（或脂质体）。其中两性霉素B约含6-50%摩尔，然后将此颗粒（或脂质体）在约25℃-约60℃最好是约60℃下进行一次热循环处理。此循环在成一种具有较高的有序的和低毒的两性霉素B/类脂配合物。
在本发明的另一方面，用吸收光谱技术测定药物（例如多烯抗真菌剂，如两性霉素B）类脂配合物。一种药物的吸收光谱对该药物耒说是固有的;在紫外或可见光区，药物的特征是一个峰或一系列峰。两性霉素的标记峰（如图12所示，溶于脱氧胆酸酯）处于300-500nm之间，并有一些特征峰。这些峰中最有代表性的是那些在413nm处出现的峰。因此药物与类脂的配合物所引起的这些峰的囊减能定量地用作为HDLC毒性的定量，换句话说，其毒性程度可通过吸收峰高度的大小耒确定。
还公开了一种脂质体装填工艺，其中药品尤其是多烯抗菌素两性霉素B在声波作用下被分散到一种溶剂中，例如已加入盐酸这样一种酸的乙醇中。一种类脂膜，尤其是含有约7∶3摩尔比的DMPC∶DMPG，用一种水溶液，尤其是用含水缓冲液如PBS使其水合。把含药物的经过酸化的乙醇溶液等分试样加入脂质体制剂中，装填该脂质体。把得到的悬浮体中的乙醇除掉，用含水溶液再使其悬浮，取决于与类脂共混合的药物的摩尔比，本方法有利于HOLCS的形成，而不是脂质体;例如药物的摩尔百分数在16%左右和以上，形成的HDLCS多于脂质体。另外，药物在0-15%摩尔时，本方法有利于脂质体的形成。用这种酸性乙醇装填方法制备的脂质体或HDLCS通过添加药用载体或稀释剂后可以作为药物组合物通过施药于哺乳动物如人类用于治疗真菌感染。
图1是用LD50量度的急性毒性与该制剂中两性霉素B摩尔百分比的关系曲线。
图2是含5%摩尔两性霉素B的脂质体（MLV）制剂的差示扫描量热法光谱。
图3是含25%摩尔两性霉素B的HDLC制剂（MLV法）的差示扫描量热法光谱。
图4是含5%摩尔两性霉素B的多层脂质体的等密度梯度图。类脂（实线）;两性霉素B（虚线）。
图5是用50%摩尔两性霉素B制备的HDlCS（MLV法）的等密度梯度图。类脂（实线），两性霉素B（虚线）。
图6示出含5%摩尔和50%摩尔（分别）的两性霉素B的脂质体和HDLC制剂（MLV法）的X射线衍射数据。
图7示出含25和50%摩尔两性霉素B的HDLC制剂（MLV工艺）的31P-核磁共振谱。
图8示出含0和5%摩尔两性霉素B的脂质体（MLV）制剂的31P-核磁共振谱。
图9是含脂质体的两性霉素B等密度梯度图，该脂质体是采用含5%摩尔两性霉素B的酸性乙醇工艺制备的。类脂（实线）;两性霉素B（虚线）。
图10是溶于脱氧胆酸酯中的游离两性霉素B的吸收光谱。
图11是在7∶3的DMPC/DMPG中的5%摩尔两性霉素B（a）;25%摩尔两性霉素B（b）;25%摩尔两性霉素B加热后的（c）;以及50%摩尔两性霉素B（d）的吸收光谱。
图12是在7∶3DMPC/DMPG中的25%摩尔两性霉素B（a）于60℃加热前;（b）于60℃加热10分钟后的吸收光谱。
图13是含25%摩尔两性霉素B的7∶3DMPC/DMPG在（a）热循环前，（b）热循环后与纯的DMPC/DMPG光谱（c）相比较的DSC谱。
图14是含25%摩尔的两性霉素B的7∶3摩尔比的DMPC/DMPG配合物在（a）60℃热循环前，（b）60℃热循环后的31P-核磁共振谱。
图15说明离子强度对两性霉素B摄入DMPC∶DMPG脂质体中的影响。
图16表示保温温度对两性霉素B摄入DMPC∶DMPG脂质体中的速率影响。
图17表示脂质体结构对两性霉素B摄入DMPC∶DMPG MLVS中或LUVS中的影响。
以下对具有独特性质的非脂质体的高药品：类脂比配合物（HDLCS）及其制备方法作说明。这些HDLCS含有一种生物活性剂，例如疏水性药品，当把HDLC施用于一个有机体时，与施用游离形式或脂质体形式的药品相比，有基本相等的或更大的效力和较低的毒性。这样一些HDLCS具有高的药物：类脂摩尔比（大于约5%摩尔的药品）。本发明意外地证实，类脂含量少的配合物，例如速溶的HDLC制剂与脂质体制剂相比，毒性降低。本发明涉及用作为与药物，例如抗真菌多烯抗菌素两性霉素B和制霉菌素结合的药品载体体系的HDLC制剂。这种制剂不同于目前市场上能得到的制剂。它在水溶液，例如盐水中是稳定的。
此外，描述了一种新的脂质体装填法，它通过一种溶剂中介体包裹药物耒装填脂质体。该溶剂的特征是它溶解该生物活性剂，例如两性霉素B，它不破坏该脂质体膜结构，并且它与水溶液如水混溶。这样的一种溶剂是乙醇，进行这种方法无需使用有机溶剂。根据制剂中所用药品的摩尔百分数，将形成HDLCS而不是脂质体。在有利于HDLCS形成的情况下，本方法用药品装填HDLCS。
HDLCS是指以粒子形式存在的与药品结合的类脂，这些粒子就性质上说是非脂质体的。当用MLV方法形成时，这些HDLCS可用下列方法表征，例如：（1）冷冻断面电子显微图（Deamer等人Biochim.Biophys.Acta，1970，219∶47-60）证明是非脂质体配合物;（2）包裹体积测量法（Deamer等人，Chem.Phys.Lipids，1986，40∶167-188）证明包裹体积基本上是零，因此，是非脂质体的;（3）差示扫描量热法（DSC）（Chapman.D.，in∶Liposome Technology，Gregoriadis.G.，ed.，1984，CRC Press，Boca Raton），表明没有类脂双层前转变相或主转变（main transition）;（4）31P-NMR核磁共振谱（Cullis等人，1982 in Membrane Fluidity in Biology，Academic Press，Inc.，London & N.Y.）表明它具有高度固定化类脂的特性（广泛的各向同性）;和（5）X射线衍射数据（Shipley等人，in∶Biomembranes，1973，Chapman，D.and Wallach，O.，eds.，Vol 2∶1，Academic Press Inc.，London & N.y.）表明是胶相类脂。如同由密度梯度离心法证实的那样，这些体系还有的特点是药物与类脂完全的结合。在该技术中，梯度在一个很大的力（约230，000×g）的作用下离心约24小时，以保证梯度内所有组分达到它们平衡的密度位置。这些体系的提洗曲线显出重叠的药物与类脂峰，表明所有药物与类脂已结合。
本发明的一个方面是形成HDLCS时的药品：类脂比例，它导致基本相同或更大的药品效力。并且普遍地降低急性毒性（由老鼠的LD50耒量度）（图1）。申请人已发现，在约6-50%摩尔的疏水药品之间满足此要求，而好的比例是约15-50%，更好是25-50%，最好是25-35%摩尔疏水药物。当药物浓度超过约6%摩尔和达到25%摩尔时，生成脂质体和HDLCS的混合群体。在此范围内，当药物百分数趋于25%时，在结构中占更大百分比的是HDLC，而不是脂质体。药物浓度约为5%摩尔和更低，直到该技术领域人员称之为“临界胶束浓度”的一个更低的极限时，存在的是混合的HDLC/脂质体群体，但基本上是脂质体结构。用本发明新型的乙醇中介体工艺可以形成这样的脂质体。
上述HDLCS的特点是，采用密度离心法观察到的各种药物类脂分散体。用等密度蔗糖密度柱分离该药物类脂配合物（DMPC∶DMPG为7∶3摩尔比）显示的谱带依赖于药品∶类脂比例和制备方法。在用MLV方法得到的含有5%摩尔药品体系内观察到物质的二个主谱带，一个是脂质体的，而另一个是与类脂（HDLCS）结合的药物的。含25-50%摩尔药品的制剂呈现单一谱带，表示大多数药物已与类脂结合。使人惊奇的是，这些类脂量低/药品摩尔百分比高的体系是低毒的。图1表示老鼠LD50（mg/kg）与制剂中药物，两性霉素B摩尔百分数的关系。药物在5-50%摩尔之间LD50增大，而在60%摩尔时下降。用商业上能得到的这种药品形式，Fungizone，其LD50约在3.5mg/kg，试管内的血液细胞溶胞作用（溶血作用）证明了同样的毒性现象。
用各种摩尔百分比的药物，对药物一类脂结合的MLV制剂进行俘获体积的研究（包裹的溶质（μl）/μmol类脂）证明含有25摩尔%和更高的（HDLC）制剂具有的独特性质;这类制剂不包裹任何溶质，因此，它不是脂质体。这些同样制剂的冷冻-断面电子显微图证明脂质体是在0-5%摩尔药物下形成，而非脂质体的HDLCS是在25-50摩尔%药物下形成。
对具有各种摩尔百分比药物的MLV制剂所进行的差示扫描量热法示踪结果证明了同样的现象;也就是说，在5%摩尔药物下，其光谱显示出无扰动双层态类脂的跃迁峰的特征（图2），但在25摩尔%药物下没有跃迁峰（图3）。在25摩尔%药品的情况下，所有类脂与药物完全结合，即类脂的酰基链不是游离的，而发生集体跃迁。这些数据进一步证实了密度离心作用显示的药物浓度在5摩尔%时类脂结合的药物和游离类脂的双峰（图6），而在25～50摩尔%药物浓度时出现所有类脂与药物结合而引起的一个单峰（图5）。
5摩尔%（MLV工艺）的X-射线数据显示出低温时的凝胶相的类脂，在特征温度23℃下，转变至液晶相。然而，50摩尔%药物在所有温度下，类脂均处于凝胶相;因为所有类脂都与药物紧密地结合，所以没有这种相变（图6）。用31P-核磁共振谱研究的类似数据表明，这些较高（25和50）摩尔百分比的药物制剂（HDLCS）没有游离类脂的信号;不存在这种类脂的具有低场肩/高场峰的特性，而在0和5摩尔%药物的样品中是可以见得到的（图8）。
虽然具有高药物-类脂比的类脂配合物制剂是本发明的一个方面，然而，制备脂质体的方法可以用于制备这些类脂配合物。具体地说，这些方法包括称为多层囊（MLV）的脂质体形成程序。可以采用的其它工艺是：形成稳定的多层囊的程序（SPLV）、挤压工艺（LUVETS）耒形成大的单层囊的工艺，或其它该技术领域中已知的脂质体形成工艺。Lenk等人在美国专利4，522，803（1985年6月11日公布）中公开了形成SPLVS的工艺，Cullis等人在PCT申请WO86/00238（1986年1月16日出版）中公开了LUVET工艺;各自的有关部分通过引用被结合到本申请中。在本发明新的脂质体形成方面，脂质体是在加入要包裹的在酸性乙醇中的药品的水溶液中形成的。在本发明的另一个形成脂质体的具体实例中，两性霉素B通过一个含水介质而结合到脂质体中。在此技术中，两性霉素B在声波作用下悬浮在一个水溶液中、例如蒸馏水中。然后被悬浮药品与在含水溶液、如蒸馏水或氯化钠溶液中悬浮的类脂混合。在等于或高于所用类脂的相变温度下保温此混合物。
（1）用于制备类脂配合物的和（2）用于本发明脂质体新的形成技术中的类脂是磷脂、例如磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE），磷脂酰丝氨酸（PS），磷脂酰甘油（PG），磷脂酸（PA），磷脂酰肌醇（PI），神经鞘磷脂（SPM）等，单独或联合使用。饱和磷脂，例如氢化酱油PC也可使用。磷脂能合成或从天然源、如鸡蛋或酱油得到。另一种类脂组合物是饱和的脂肪酸，如肉豆蔻酸。在推荐的实施例中，磷脂可以采用以任意摩尔比混合的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）和二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）DMPC∶DMPG以约99∶1至约1∶99，最好是约7∶3摩尔比。DMPC和二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸（DMPS）也可结合使用。然而，DMPS可以单独使用。类脂配合物和脂质体也可含有类固醇，它作为类脂相的一部分，这种类固醇可以是胆固醇、胆固醇的聚乙二醇衍生物（PEG-胆固醇）、粪甾醇、胆甾烷醇、胆甾烷、甾醇如胆固醇、半琥珀酸胆固醇（CHS）的有机物衍生物等。生育酚的有机酸衍生物也可以用作配合物或形成脂质体的成分，例如半琥珀酸α-生育酚酯（THS）。同时含CHS和THS的配合物及其三种盐形式，通常可用该技术中已知的任何一种制备甾醇的脂质体方法加以制备。详细的可分别参阅Janoff等人题目为“Steroidal    Liposomes”的美国专利4，721，614（1988年1月26日公布）和Janoff等人题目为“Alpha    Tocopherol    Based    Vesicles”的PCT公开No.87/02219（1987年4月23日出版，申请日是1986年9月24日），其有关部分通过引用被结合到本申请中。
生物活性剂，如药物可用于本发明。在HDLCS的情况下，所用的生物活性剂是疏水的;在脂质体情况下，生物活性剂由于脂质体可以包裹二种类型的介质，所以既可以是疏水的也可以是亲水的。这样一些生物活性剂包括，但不限于多烯抗菌素，例如抗真菌剂匹马菌素，杀假丝菌素，菲律宾菌素，最好是制霉菌素和两性霉素B。可用的其它生物活性剂包括，但不限于抗菌化合物，如氨基苷类，例如庆大霉素，抗病毒化合物如利福平，杀寄生虫化合物如锑衍生物，抗肿瘤化合物如长春花碱、长春新碱、丝裂霉素C、阿霉素、红比霉素、氨甲蝶呤和二氨二氯络铂（顺氯氨铂），其它生物活性剂中，蛋白质如白朊，毒素如diptheria毒素，酶如过氧化氢酶，激素如***，神经递质如乙酰胆碱，胆蛋白如α-胆蛋白，糖蛋白如透明质酸，免疫球蛋白如IgG，免疫用调节剂如干扰素或白细胞介素，染料如偶氮胂Ⅲ，放射性标记物如14C，不透放射性的物质如99Te，萤光化合物如羧基萤光黄，多糖类如糖原，细胞受体结合分子如***受体蛋白，非甾族抗炎物如消炎痛，乙酸水杨酸酯、异丁苯丙酸、苏灵米、吡氧噻嗪和甲氧萘丙酸;消炎物如***，抗青光眼剂如噻吗心安或毛果云香碱，麻醉剂如地布卡因，核酸如胸腺啶啶，核苷酸如RNA聚合物，心血管剂如α-阻断剂，β-阻断剂、钙通道阻断剂、ACE抑制剂等，CNS剂和***剂。
在制备HDLCS时，如同一般制备脂质体一样可以用有机溶剂。合适的有机溶剂是具有中等极性和介电性（具有相反电荷中间极性的溶剂）的那些溶剂，它能溶剂类脂，包括但不限于氯仿、甲醇、二甲基亚砜（DMSO）、二氯甲烷和混合溶剂如氯仿∶甲醇（70∶30）和苯∶甲醇（70∶30）。结果是，形成可称为混合物的、其中组分到处均匀分布的溶液。溶剂最好根据它们的生化相容性、低毒性和易燃性加以选择。当溶解药品、尤其是两性霉素B时，最好用DMSO，因它最容易在DMSO中溶解。甲醇可以代替DMSO，但溶剂体积随之加大。为了溶解类脂，最好用二氯甲烷，这是由于它对人的低毒性。在本发明的新的形成脂质体工艺中，最好选择乙醇或水溶液作溶剂。
在形成HDLC的水合物阶段，可以用水溶液如蒸馏水（例如USP注射用水）、盐水或含水缓冲液。可以使用的含水缓冲液包括、但不限于缓冲盐水如磷酸盐缓冲盐水（PBS），三-（羟基甲基）-氨基甲烷氯化氢（Tris）缓冲液，或甘氨酸缓冲溶，PH约为7.0-7.5，最好是7.2。
在HDLCS或这种新的脂质体形成阶段，可以进行声波处理。在槽式声波处理器内，用约50-60HZ，于25℃处理约15-30分钟。
生成的HDLCS或脂质体，可按照Cullis等人（PCT公开No.88/00238，1986年1月16日出版）的步骤使其挤压通过过滤器而成为一定的大小。该形成一定大小的步骤允许形成颗粒大小均匀的群体。例如，过滤HDLCS可通过一个弯曲路径的或直通的膜式过滤器、如聚碳酸酯过滤器耒完成。
用本发明的新步骤形成的HDLCS或脂质体可在形成的各种阶段上进行冷冻干燥或脱水处理。例如，类脂膜可以在脱溶剂后和加药物前冷冻干燥。或者，类脂-药物膜可以在HDLC或脂质体水合前冷冻干燥。这种脱水作用可通过将类脂、HDLC或脂质体处在减压下由此脱除全部溶剂耒进行。作为另一个选择或附加地，最终水合的HDLC或脂质体制剂也可在该脱水步骤之前通过置于液氮介质环境中脱水并使它冷冻。冷冻前的脱水可按照Bally等人的技术（PCT公开NO.86/01103，1986年2、27日出版）在制剂中加一种或多种保护糖的情况下进行，其有关部分通过引用被结合到本申请中，也参见Schneider等人1980年10月21日公开的美国专利4，229，360。这样一些技术增强了制剂的长期保存及稳定性。其它运行的方法，现在已知的或以后发现的，都可用于上述公开的类脂配合物制剂的脱水中。
形成本发明HDLCS的一种方法是MLV法，其中生物活性剂（例如药品）被溶于烧瓶内的甲醇中，然后往里加类脂、如DMPC和DMPG（DMPC∶PMPG摩尔比为7∶3）的氯仿溶液。减压旋转蒸发溶液后，将干膜再悬浮在PBS中，用槽式声波处理器处理（约50-60赫兹，约25℃下约30分钟）至透明。在药品：类脂的摩尔比为约6和6以上（直至约60摩尔%）时，制剂是非脂质体的HDLC结构，基本上无脂质体。HDLC制剂的毒性取决于药物∶类脂比，较高的药物∶类脂比制剂（约16-50摩尔%药物）比较低的药物∶类脂比制剂显示出更低的急性毒性。如上所述，含有高至约5%摩尔药物的制剂实际上是脂质体。
另一方法是一种改良的MLV法，差别在于上述制备的药物一类脂膜是在钟罩内减压干燥，生成一种药物一类脂薄片。将此薄片粉碎至粉末，当加水溶液时，此粉末均匀地水合。该法包含有在有机溶剂如DMSO或甲醇中的药品溶液接着与二氯甲烷中的类脂（最好是7∶3摩尔比的DMPC∶DMPG）混合。这种混合物然后于减压下干燥成膜，再例如于钟罩内减压干燥。所得到的干燥粉末用食盐水溶液水合并加热至生成药品一类脂悬浮液。如上所述，形成HDLCS、脂质体及它们的混合物，以及伴生的毒性程度是取决于药品∶类脂比
其它方法可用于HDLCS的形成中。一种这样的方法是SPLV，其中药物溶于一种溶剂如DMSO。在溶剂（例如氯仿或二氯甲烷）中的类脂（如摩尔比为7∶3的DMPC∶DMPG）减压干燥成薄膜，并把一种有机溶剂、如二氯甲烷加入该类脂。把药物溶液（例如两性霉性B）的一份等分试样加入该类脂悬浮液中，将得到的混合物用声波处理至透明。加入缓冲水溶液（例如缓冲盐水），混合物再置于减压下去除二氯甲烷。生成的糊再用PBS水合并用声波处理至透明。如同采用上面的方法那样，生成的制剂，将取决于所用的药物∶类脂摩尔比是HDLC或脂质体。用这种制剂的老鼠LD50，在较高的药品∶类脂比下显示出较低的毒性。
还有另一种方法是改良的SPLV法，其中有机溶剂（例如DMSO）中的药物与类脂（例如DMPC∶DMPG）溶液混合，并加入缓冲水溶液（例如PBS），接着在氮气下用声波处理的同时蒸发溶剂。再添加另一份PBS，过滤所得到的溶液，最好用5微米过滤器，然后于约10，000xg下离心约10分钟，去除并弃去上清液，将片状沉淀再次悬浮在含水溶剂中。接着，离心进行第二次“洗涤”，得到的片状沉淀再悬浮在PBS中。如同上面公开的制剂一样，该制剂的急性毒性直接与药物∶类脂比有关，即该比值越高（至约60摩尔%药物），制剂的毒性越小。
还有另一个SPLV方法是把药物溶剂与类脂溶液如前所述混合，但加入注射用水，（USP），而不是加入盐水并将悬浮液升温至37℃的方法。在声波处理下、在氮气氛中再次蒸发溶剂，加入更多量的注射水并将悬浮液在37℃下保持约10分钟。把该制剂用LUVET方法通过一个0.1或0.15微米的过滤器进行灭菌过滤。这种方法是通过在约700磅/吋2压力下过滤形成脂质体的挤压法，它是Cullis等人在1986年1月16日公开的PCT公开86/99238中的主题，其有关部分通过引用被结合到本申请中。这种制剂也可以如上文所述那样，按照Bally等人的方法进行脱水，急性毒性试验再次表明高的药物/类脂比对药物毒性有改进作用。
另一个方法包括通过声波处理将药物溶解于酸化的无水乙醇中。溶解在溶剂（例如，苯∶甲醇）中的类脂（例如，7∶3摩尔比的DMPC∶DMPG）被冷冻干燥，然后与含水溶溶（例如，PBS）涡旋方式混合，在室温下加入酸化的乙醇-药物溶液，并搅拌。然后该制剂被冷冻干燥并用含水缓冲液再水合。作为另一种选择，溶剂可以被蒸发，留下可以用水溶液水合的类脂药物薄膜，较低的急性毒性再次与较高的药物/类脂比相联系。与主要生成HDLCS所使用的6摩尔%和更高的浓度相比较，当使用的药物浓度为约5摩尔%和低于这一浓度时，该方法主要产生脂质体。制剂的密度梯度离心证明了所有的类脂是与药物相结合的。然后，该制剂可以被冷冻干燥，除去乙醇，并用水溶液例如蒸馏水重新水合。
在本发明另一个脂质体实施方案中，两性霉素B经过一种含水中介结合到脂质体中。在该技术中，通过声波处理将两性霉素B悬浮在水溶液、如蒸馏水中。然后将悬浮的药物与水溶液、如蒸馏水或氯化钠溶液中的类脂悬浮液相混合。该混合物在等于或高于所用类脂的相变温度上进行保温，结果生成MLVS。
上述讨论的高摩尔比的两性霉素B-类脂制剂之所以显示出低的毒性是由于加强了两性霉素B-两性霉素B在类脂基质中的相互作用。这可由吸收谱耒证明。例如，在413毫米处由脱氧胆酸盐中的游离两性霉素B产生的吸收率大于在类脂中未被加热的5摩尔%两性霉素B的吸收率。而且，在类脂中25摩尔%的两性霉素B的吸收率大于50摩尔%两性霉素B所显示的吸收率（见图10）。
利用吸收谱技术耒测定药物（例如，两性霉素B）一类脂配合物的毒性。一种药物的吸收谱对该药物耒说是特定的;两性霉素B的特征（图12显示的，溶解在脱氧胆酸盐中）是在300和500毫微米之间，并具有一些特征峰，这些峰中最有代表性的是在413毫微米显现的峰。由于药物与类脂的结合引起这个峰的衰减可以定量地作为HDLC毒性的一个量度。上述的任何一种类脂，当以这种方式配合时，均可预料导致这里所讨论的具有这种特征的、然而是衰减了的吸收率，这是因为谱对该药物是特定的。
如果将显示出低于最大毒性缓冲作用的两性霉素一类脂制剂（例如，25摩尔%的样品）加热至25～60℃，得到的制剂的毒性被衰减（见图11）。当两性霉素B与50摩尔%类脂配合时观察到的毒性衰减至最大（见图11）。发生这种衰减一种可能的解释是因为类脂被相分离，于是在加热过程中类脂从两性霉素B中被排斥出耒，使两性霉素B与它自己更紧密的结合，于是得到了较低毒性的制剂。被排出的类脂可以通过在差示扫描量热谱（见图12）中观察到吸热的再现（在加热之后）得到证明，这与基本上没有两性霉素B的类脂相一致。而且，被排出的类脂可以通过由加热过的制剂产生的31P-NMR信号变窄得到证明。此外，这种变窄是与类脂在两性霉素B浓度中实际上的减少一致的。
最后，加热过的制剂的冷冻断面电子显微镜检验揭示出在加热后有类脂（和脂质体）存在，而这在加热之前未被看到。未加热过的样品显示了没有游离类脂的配合物，制剂的特征显示出类脂和两性霉素B之间的分子内部的相互作用。
当对含有50摩尔%两性霉素B的样品进行上述研究时，观察到被研究样品在加热前后的差别很小。据推测，在50摩尔%含量时，药物与类脂的相互作用是如此之大，以致没有另外可用于从结构中被排出去的类脂。这些样品表明当用DSC和NMR进行研究时，无论在加热前还是在加热后显示出基本上没有变化的信号。
相分离的类脂使两性霉素B处于有助于两性霉素B-两性霉素B相互作用（由此得到较小的毒性）的环境的理论可以得到吸收谱的支持。与没有受热的***相比较，由加热过的制剂产生的谱，其强度小得多（意味着降低了毒性）。在一个例子中，与LD50为15毫克/公斤的没有加热过的制剂相比，经过这样的加热将导致LD50大于30毫克/公斤。在这一例子中，注意到加热后在413毫微米处有吸收率的衰减。
上述这种加热工艺可以用前面列举过的任何一种脂质体或类脂形成的工艺耒演示，但是在这一例子中，使用了MLV工艺。同样地，可以利用前面指出的任何一种类脂或磷脂，也可使用前文中指出的任何一种溶剂或含水缓冲剂。例如，悬浮在有机溶剂、如三氯甲烷中的类脂（按已知形成脂质体的任何量，如DMPC∶DMPG为7∶3摩尔比）被干燥成在园底烧瓶壁上的薄膜。两性霉素B（或任何其它前述的药物）被溶解于任何一种适宜的有机溶剂中（一个适宜的溶剂是溶解药物、例如具体是两性霉素B的溶剂）。本发明中可以使用生成脂质体或类脂微粒的任何摩尔百分比的药物（两性霉素B）。具体地说，本发明使用了约从5至约50摩尔%的两性霉素B。要形成脂质体时，采用5%摩尔或更低药物的药物/类脂摩尔比。为了生成HDLCS，可以使用约6至约50摩尔%的药物。在药物为25摩尔%和更高时，就性质耒说，其群体基本上是HDLC。
在本发明的加热实例中，按照每100ml甲醇10mg两性霉素B，即0.1mg/ml的两性霉素B，把两性霉素B溶解在甲醇中。将含有溶解了两性霉素B的甲醇（100.0ml）加入到类脂薄膜上，该薄膜重新被悬浮。得到的悬浮液在减压下进行旋转蒸发以形成薄膜。然后将该类脂-两性霉素B薄膜在一份水溶液中重新悬浮，该水溶液的体积要能够足以形成脂质体或类脂微粒，如约4.0ml。然后，悬浮液可被搅拌和声波处理约几分钟至约1小时，并在水浴中从约25℃至约60℃加热10至约400分钟。
形成本发明HDLCS的另一种方法，包括使用均匀化步骤而不用声波处理。例如，HDLCS可以按SPLV工艺制造，其中药物（例如，两性霉素B）可以加入到一个适宜的溶剂（如DMSO）中并用机械搅拌器混合致使全部药物溶解。如果需要时，可以将溶液过滤，除去任何不溶的药物颗粒。然后可以把摩尔比为7∶3的DMPC∶DMPG溶解在一种适宜的溶剂（如二氯甲烷）中，再将该类脂与药物-DMSO溶液混合。然后将一种水溶液、如盐水加到该混合物中，在约35～45℃下通过旋转蒸发除去有机溶剂。除去溶剂后，得到的药物-类脂混合物用水溶液、如盐水稀释，并用均化器把HDLCS的悬浮液磨细。任何均化装置或可磨细颗粒的胶体磨都适用于这一步骤，但最好使用Gifford Wood胶体磨。将颗粒磨细到一个可以允许的颗粒大小、例如其中90%的颗粒直径小于10微米，优选的颗粒范围是约4至约10微米或约15～30minutes。按照要求的大小和均匀度，颗粒可以一次或多次通过这种磨机。HDLC颗粒可以用Malvern粒子分选机分析其颗粒大小的分布。如果需要时，可以用现有技术中已知的分离颗粒的任何一种方法，例如过滤把更大或更小的颗粒除去。这样一种方法最好得到粒子直径的范围在约0.2微米至10.0微米之间。
该技术领域中技术人员知道的用于形成脂质体的其它方法也可以用于实施本发明;本发明的HDLCS不只局限于上述形成它的那些工艺。
由本发明新方法制备的HDLC制剂和脂质体可用于动物（包括人）的治疗上，用以处理多种的感染，或要求以下的条件中：（1）重复给药;（2）以保持生物活性的形式投送药物;或（3）减少毒性同时具有等于或大于有关药物在游离状态下的效力。这些条件包括但不限于局部的和全身的真菌感染，例如用抗真菌剂、如制霉素和两性霉素B处理的那些感染以及病毒疾病、获得性免疫缺陷综合症（AIDS）和疱疹。另外，本发明的制剂在水溶液中是稳定的。
制剂的投药方式可以取决于生物体中化合物要被送达的部位和细胞。本发明的HDLCS和脂质体可以单独施用，但通常与按予定的施药路线和标准药物实践所选择的药物载体相混合的形式施用的。例如，局部应用可以很容易送达到特定的部位（如果是外部感染，如眼、皮肤、耳、创伤或烧伤）。这种局部施用可以是膏剂、软膏、凝胶、乳剂或糊剂，直接贴敷到感染区。另一方面，制剂可以进行非肠胃道的注射，例如静脉内、肌肉或皮下注射。对于非肠胃道的施药可以以含有其它溶质、如含有足够盐或葡萄糖的灭菌水溶液的形式使用，以使溶液成为等渗的。另外的用途，可以由该领域的技术人员根据该制剂的具体特性耒予见。
利用本发明的组合物，可以通过把脂质体或HDLCS雾化的水悬浮液注入肺中耒治疗气喘病。例如，脂质体或HDLCS可以被悬浮在一种适宜的溶剂中，所说适宜溶剂是指这种溶剂通过气动或超声喷雾器或者更方便地通过一个自备的由碳氟化合物小块产生的气压驱动的喷雾器可被雾化。另外的吸入制剂，例如把脂质体或HDLCS以颗粒形式送达的***，不论是在适宜载体中的干粉剂或悬浮物的形式都是可以接受的。在雾化之后，在呼吸道中，大部分有推动作用的溶剂通过急骤蒸发而损失了并被水分所代替，导致这些颗粒的沉淀。
在医治或予防性治疗真菌或病毒疾病给病人投药时，对某一特定的患者，处方医方将最终确定适宜的剂量，而且这种剂量根据年令、体重、个人的反应以及病人症状的性质和严重程度是可能变化的，以HDLC或脂质体形式的药物的剂量通常约为游离药物使用的量。但是，在某些情况下，需要施用超出这些限制的剂量。
下述给出的实例只是为了具体说明本发明而不是限制本发明的范围。
实例1
在500ml的园底烧瓶中将两性霉素B（10mg;总药物5摩尔%）加到100ml的甲醇中，并用声液处理该混合物直至透明。这种声波处理步骤是在一个槽式声波处理器中进行的，在约50-60赫兹、25℃下处理约15分钟。加入二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）（100mg在1.0ml三氟甲烷中）以及42mg二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG）（在0.42ml三氟甲烷中），得到的分散体在60℃、减压下旋转蒸发进行干燥，在烧瓶中产生一层薄膜。将薄膜重新悬浮在4.0ml的PBS中，将溶液转移到玻璃管中并用声波处理至透明。
用16.7、20、25、33、50和60摩尔%的两性霉素B重复上述实例。对测定导致老鼠死亡率为50%时所用药物的剂量的急性毒性进行研究（LD50），结果表明LD50随着药物的摩尔%的增加而增大，直至50摩尔%的两性霉素B。
实例2
将两性霉素B（140mg;总药物5摩尔%）加入到1.5ml二甲基亚砜（DMSO）中。把DMPC（1400mg）和600mgDMPG溶解于50ml二氯甲烷中，并将这二种溶液转移到一个烧瓶中，该溶液被搅拌直至透明，然后在减压下通过旋转蒸发进行干燥，在烧瓶中产生一层薄膜，然后在钟罩中干燥1～4天。经过这样干燥之后，形成薄片状的薄膜被磨碎成粉末并与注射用的100ml或50ml0.9%的盐水，或50mlUSP水混合。得到的悬浮液在37℃加热1小时。
用甲醇代替DMSO作为两性霉素B的悬浮溶剂，并用10、16.7和33摩尔%的两性霉素重复上述实例。使用1mg和2mg的卵磷脂酰胆碱耒代替7∶3摩尔比的DMPC∶DMPG。
实例3
把两性霉素（100mg;总药物5摩尔%）溶解在2.0ml的DMSO中。将DMPC（100mg在1.0ml中）和DMPG（42mg在0.42ml中）在烧瓶中共同溶解于三氯甲烷中，在减压下通过旋转蒸发除去三氯甲烷。二氯甲烷（20ml）被加入该烧瓶中，接着加入0.2ml的两性霉素B的贮备液。在实例1所述的条件下对这种悬浮液用声波处理至透明（约1分钟）。加入PBS（0.3ml），PH7.2，然后在氮气流下、在声波处理的同时去除二氯甲烷。得到的糊状物重新悬浮在10.0mlPBS中，并在10，000xg下离心10分钟，接着通过浴槽声处理约20分钟。
用16.7、20、25、33、50和60摩尔%的两性霉素B重复上述实例。
实例4
将两性霉素（140mg，总药物5摩尔%）溶解在1.5ml二氯甲烷中。二种溶液被混合直到透明，转移至烧瓶中，并与8.0ml的PBS混合。在氮气流中、在槽式声波处理器中将二氯甲烷蒸发。象实例1中那样进行声波处理。加入PBS（32ml）并用具有5微米细孔的聚四氟乙烯（PTFE）Teflon过滤器将溶液过滤，通过二次离心进行洗涤，最后悬浮在100mlPBS中。
用4.0和12.0mlPBS耒水合类脂重复上述实例。
实例5
将两性霉素B（140mg;总药物5摩尔%）溶于1.5mlDMSO中。DMPC（1400mg）和600mgDMPG溶解于50ml二氯甲烷中。将二种溶液混合直至透明，转移到烧瓶中，并通过减压下旋转蒸发，干燥成薄膜。薄膜被重新悬浮在50ml二氯甲烷中，将8.0mlPBS加入该溶液中。通过在氮气氛下、同时按照实例1的程序进行声波处理蒸发除去二氯甲烷。得到的糊状物用32mlPBS进行水合，通过二次离心对悬浮物进行洗涤，最后重新悬浮在100mlPBS中，并通过5微米细孔的聚四氟乙烯（PTFE）过滤器。
用PH3、6和9的甘氨酸缓冲液代替PBS重复上述实例。
还用5.0、10.0、15.0、20、0ml的PBS作为水合缓冲液的体积重复上述实例。
实例6
将两性霉素B（140mg;总药物5摩尔%）溶解在1.5mlDMSO中。卵磷脂酰胆碱（EPC）（2.0gm）溶解于50gm二氯甲烷中，二种溶液在烧瓶中进行混合。加入PBS（8.0ml）并在氮气流下、按实例1的程序进行声波处理的同时除去溶剂。加入PBS（200ml）。
用10和20摩尔%的两性霉素B重复上实例。
实例7
将两性霉素B（140mg;总药物5摩尔%）溶解于1.5mlDMSO中。用50gm二氯甲烷将DMPC（140mg）和600mg    DMPG溶解在500ml的园底烧瓶中。二种溶液在烧瓶中混合，并在37℃加入10ml注射水（USP）。用氮气流在按照实例1中的程序进行声波处理的同时使溶剂蒸发，然后加入50ml注射水，（USP）并将溶液升温至37℃，维持30分钟。
用10和16.7摩尔%的两性霉素重复上实例，接着使溶液通过一个可由Nucleopore公司得到的3微米直通路径的聚碳酸酯过滤器。
实例8
将两性霉素B（140mg;总药物16.7摩尔%）与50ml甲醇混合并将该混合物进行15分钟声波处理以形成溶液，然后通过一个可从Millex公司得到的0.22微米弯曲路径的过滤器（混合纤维素和醋酸硝酸酯）。DMPC（350mg）和150mgDMPG共同溶解在50gm二氯甲烷中，并与该滤出溶液混合。在氮气流下、按照实例1中的程度进行声波处理的同时使溶剂蒸发。加入PBS（50ml）。将一半制剂（25ml）按标准冷冻干燥程序进行冷冻干燥。
实例9
将10μl1N盐酸加入到2ml无水乙醇中。将两性霉素B（20mg;总药物5摩尔%）加入到该酸化了的乙醇中，混合物在实例1一样的条件下进行声波处理至透明，所不同的是声波处理的时间是30～60秒。DMPC（200mg）和DMPG（42mg）被放入一加入苯∶甲醇（70∶30）溶液的试管中，该溶液按实例8所述进行冷冻干燥。干燥过的类脂与2.0mlPBS混合并通过涡旋方式混合，使混合物分散。两性霉素B溶液（0.2ml）加入到该类脂中，混合物被搅拌过夜。将得到的DMPC∶DMPG MLVS（200μl）在蔗糖密度梯度上形成层，并在22℃，230，000xg下离心24小时。结果在图11中给出;全部的两性霉素B是与类脂结合的，有一个宽广的分布，梯度的顶部含有大部分类脂而两性霉素B的主峰在该梯度的底部。作为另一个选择，得到的DMPC∶DMPG MLVS被冷冻干燥并用蒸馏水（2.0ml）重新水合。
用7、9、16.7、17、20、25、33、50和60摩尔%的两性霉素B重复上实例。药物的摩尔百分比在16.7以及16.7以上时主要生成HDLCS。这种高药物：类脂比的制剂的密度离心梯度与图5中所示的相类似，其中所有的药物和类脂共以单独一个峰的形式共同结合。
实例10
为了进行X-射线衍射、DSC、冷冻断面电子显微镜检验和31P-NMR研究，如下制备25摩尔%两性霉素B-DMPC∶DMPG的样品：7∶3摩尔比的DMPC∶DMPG（44mg总类脂）和20mg两性霉素B（25摩尔%两性霉素B）被悬浮在三氯甲烷∶甲醇（70∶30V/V）中，并在减压下于55℃蒸发至在烧瓶壁上产生薄膜。用8.0ml20mMHepes，250mMNacl，PH7.2，在22℃下通过用玻璃球涡旋地搅拌，使薄膜被水合。制剂在10，000xg下离心10分钟，倾倒去上层清液并将片状沉淀物重新悬浮在1.0ml的Hepes/Nacl缓冲液中。然后制剂在槽式声波处理器中在25℃，50～60赫兹下进行声波处理20分钟。
用0.5和50摩尔%的两性霉素B重复上述程序。
实例11
为了测定含有两性霉素B的脂质体和HDLCS的俘获体积，进行如下程序：
把DMPC（100mg）和42mgDMPG的三氯甲烷溶液在烧瓶中与10mg两性霉素B（25摩尔%）的甲醇溶液（0.1mg/ml两性霉素B）相结合，溶剂在减压下、于37℃被除去，在搅拌下将加入0.3ml稀的3H-菊淀粉蒸馏水溶液的PBS（3.7ml）加入到该干类脂薄膜中。把一份（10.2ml）这种溶液放入闪烁合剂中并在β闪烁计数器上进行放射性计数。第二份（溶液）按照Bartlett的方法（J.Biol Chem，1959，234∶466-468）测定磷酸盐。该类脂-药物悬浮液在10，000xg下被离心10分钟，弃去上层清液，并将片状沉淀重新悬浮在PBS中。再进行两次离心和片状沉淀的重新悬浮步骤;对最后的重新悬浮液取样（100μl）并在β闪烁计数器上计数。最后的片状沉淀物的重新悬浮液中的第二份试样用于按上述方法测定其磷酸盐。菊淀粉的包裹率是通过用起始计数除最后的放射性计数再乘100而计算出耒的。俘获体积（μl被俘获的菊淀粉/μmol类脂）也被计算出耒。
用0.5和50摩尔%的两性霉素B重复上述程序。
实例12
制备两性霉素B颗粒是通过从约10ml的三氟甲烷中将15.5mgDMPC和6.5mgDMPG（摩尔比为7∶3）干燥到100ml园底烧瓶壁上完成的。两性霉素B（10mg）被悬浮在100ml甲醇中，将100.0ml的甲醇溶液加入到烧瓶中并使类脂薄膜被悬浮，给出25摩尔%的两性霉素B。然后该混合物于37℃在旋转蒸发下被干燥成瓶壁上的薄膜。薄膜用4.0ml，10mMHepes，150mM    Nacl（PH7.2）通过玻璃球搅拌使之水合，并用声波处理30分钟，生成最后的悬浮液。这种悬浮液的一个样品浸没在水浴中，在60℃下加热10分钟。得到的悬浮液通过DSC、NMR和冷冻断面电子显微镜检验耒描述其特征。
在不加热样品情况下重复上述程序，这些样品被保持在22℃，也通过上述各项技术耒描述其特性。
实例13
用50摩尔%和5摩尔%的两性霉素B对实例12中的原料和程度进行重复。用DSC、ESR和冷冻断面电子显微镜检验耒说明这些制剂的特征。
实例14
DSC测定法是在耒自马萨诸塞州Amherst的Micro    Cal公司的Micro    Cal    MC-1装置上进行的。含有5～9mg悬浮液的0.7ml的试样体积被注入到样品池中，在参考池中用相同体积的缓冲液。样品按约26℃/小时或约37℃/小时被加热。在同样的经历下，同一样品的两次一样的操作给出能再现到0.2℃的起始和结束温度。通常，含有两性霉素B的样品被加热到60℃（不再高了），并且然后至少用2小时冷却到7-4℃以保证样品有始终如一的经历。
实例15
NMR谱是在145.7MHZ下在Bruker    AM360大口径的NMR谱仪上利用获得的8K数据点，50，000赫兹的扫描宽度和相应于45°脉冲的20微秒的脉冲宽度获得的。谱是由一直到10，000个瞬变状态累积而成的。
实例16
把1份0.1～0.3μl的样品***一对Balzers（Nashua NH）铜支撑板之间并快速从23℃沉入液态丙烷中，在Balzers冷冻一断裂仪的双重复制装置上，在真空度为2×10-6mbar或更高和-115℃的条件下，样品被断裂并复制。这些复制品被浮起在3N的HNO3中，接着在一系列阶梯变化的次氯酸钠溶液中清洗。最后将其在蒸馏水中洗净并在300Hex筛孔的铜网（Polyscionces PA）上采集。这些复制品在Philips 300电子显微镜上以3，000至22，000的放大倍数进行检验。
实例17
吸收谱（如图12和13）是通过用Hepes/Nacl缓冲液将两性霉素B稀释到25μM/升的两性霉素B进行的。样品被放入Beckman分光光度计的样品杯中并在300至500nm处读数。样品杯相对于缓冲液空白读数。
实例18
用于ESR的样品是用一系列doxyl空间排列酸的位置异构物标记的，此处的doxyl信息基团是存在于沿着脂肪酸链的不同位置上。借助于涡旋和声波处理。要被干燥成试管壁上薄膜的乙醇溶液，通过引入探针而实现标记的。所有的样品被标记成1摩尔%。
ESR谱是在带有氮气流温度调节的IBM测试仪ER100DESR谱议上被记录下耒的。外部已校准的热敏电阻探头（Omega    Engineering，Inc，Stamford，CA）用于监测样品的温度。记录ESR谱是在微波功率为10mw和微波频率为9.11GHZ，用100G的场扫描和0.32G的100KHZ条件下进行的。有序参数是从最大超精密***（Amax）计算出耒的。
实例19
两性霉素B（337.5g）被加到3375ml的DMSO中并用机械搅拌器进行搅拌至两性霉素B（100mg/ml）被溶解（约3小时）。将混合物转移到不锈钢压力容器中（容积5升）并通过0.22μm的Sartofluor过滤器和聚丙烯深度过滤器（Pall    Profile，Pall，Inc.，Glen.Cove，N.Y.）。
在40升的压力容器中，50.8kg二氯甲烷与225.0gm的DMPC和99.0gm的DMPG相混合，经3.5小时至完全溶解。通过0.2M2的Sartofluor 0.22微米的聚四氟乙烯过滤器，把得到的类脂溶液转移到不锈钢操作罐中。用另外的55.2Kg二氯甲烷清洗该40升的压力容器，同样地过滤到操作罐中。操作罐以195转/分的转速旋转混合该类脂溶液，然后把两性霉素B的DMSO溶液转移到操作罐中。再将氯化钠溶液（16.2升，0.9%USP）通过0.22μm的Millipak 100聚碳酸酯过滤器加入到操作罐中。
用一个与操作罐串联的设定在35℃的热交换器，被加热的液氮流横穿过操作罐并在12小时期间将溶剂除去。得到的类脂-药物配合物用氯化钠0.9%USP（7，000ml）稀释，通过Millipak    100    0.22微米过滤器转移到操作罐中。
得到的HDLCS通过使用Gifford Wood胶体磨和旋转叶型泵使之均匀化。HDLCS通过用10磅/吋2反压调节的0.5密耳间隙的胶体磨头部，经过3小时，得到小于20微米的颗粒。用Malvern粒度测量器分析HDLCS的颗粒大小。
实例20
溶解在三氯甲烷中的类脂（总计102.6μmol，70∶30摩尔比的DMPC∶DMPG）被吸取到500ml的园底烧瓶中。通过用Branson槽式声波处理器进行声波处理将制霉菌素（500mg）溶解在1.0升甲醇中（0.5mg/ml）。溶解了的制霉菌素（5.0ml）加入到含有类脂的园底烧瓶中，并进行混合，然后通过在45℃旋转蒸发15分钟除去溶剂，得到的制剂用盐水（5.0ml）通过用玻璃球涡旋混合重新水合。当用光显微镜检验时，可看到脂质体。
用25，50，75和100摩尔%的制霉菌素并重复上述程序。根据冷冻断面电子显微镜检验，含25摩尔%制霉菌素的制剂是非脂质体的HDLCS。
实例21
类脂（14.8μmol/ml，DMPC∶DMPG为7∶3摩尔比）被蒸馏水水合并在4℃下保温。得到的MLVS用LUVET程序被挤压通过二个叠层的聚碳酸酯过滤器。
用槽式声波处理器按10.8μmol/ml的浓度将两性霉素B分散在蒸馏水中。这种两性霉素B分散体被加到类脂悬浮液中，使类脂和两性霉素B的最终浓度分别相应为13.5μmol/ml和0.98μmol/ml。为了除去未结合的两性霉素B，于22℃下在Beckman    L8-60超速离心机的Ti60或SW27回转器（Beckman）上把20ml样品在15，000Xg下离心30分钟。在不扰动脂质体片状沉淀物的情况下除去上清液游离的两性霉素B。通过准弹性光散射耒测量得到的脂质体，结果为直径大于1.0μm。
使用23℃的保温条件重复上述程序，用150mM Nacl，10mM Na2PO4，PH7.4对类脂进行水合。通过准弹性光散射耒测定得到的脂质体，结果是直径大于1.0μm。当介质的离子强度低时（蒸馏水对照150mM Nacl），两性霉素B被脂质体的摄入率最高（图17）。
图16表明在不同的保温条件下，两性霉素B被DMPC∶DMPG脂质体摄取的情况。在23℃和45℃的摄取率是相似的。当类脂是处在凝胶相时，也就是在15℃时，药物还累积了。
实例22
利用实例20的原料和程序，但是其中在蒸馏水中悬浮的类脂与两性霉素B一起在22℃下保温。得到的脂质体是单层的。通过准弹性光散射测得其平均直径为约0.1～0.2μm。图19表明两性霉素B的摄取速度在开始的两个小时中LUVS比MLVS更快。

Claims (15)

1、一种形成含有药物和类脂的HDLC或脂质体的方法，包括以下步骤：
a.形成至少含有一种类脂的脂质体；
b.将药物悬浮在酸化的乙醇中；以及
c.混合步骤b的药物悬浮液和步骤a的脂质体。
2、按权利要求1所述的方法，其中药物含量约5摩尔%
3、按权利要求2所述的方法生成的脂质体。
4、按权利要求2所述的方法，其中药物含量约25摩尔%
5、一种制备含有HDLC的组合物的方法，包括以下步骤：
a.在中等极性的有机溶剂中溶解至少一种类脂;
b.将药物溶解在一种生物相容的有机溶剂中;以及
c.把a步骤的溶液与b步骤的溶液混合
6、按权利要求5所述的方法，其中药物含量的范围约为25～50摩尔%之间。
7、一种制备含有HDLC的组合物的方法，包括以下步骤：
a.在一个中等极性的有机溶剂中溶解至少一种类脂;
b.将药物溶解在一种有机溶剂中;
c.混合步骤a的溶液与步骤b的溶液;以及
d.将上述步骤c得到的混合物进行脱水。
8、一种制备HDLC的方法，包括以下步骤：
a.在一种中等极性的有机溶剂中溶解至少一种类脂;
b.将药物溶解在一种生物相溶的有机溶剂中;
c.将a步骤的产物与b步骤的产物混合;
d.将减压下从上述c步骤的混合物中蒸发溶剂至产生干燥的类脂薄膜;以及
e.将一种含水溶液加入到步骤d的薄膜中。
9、一种制备HDLC的方法，包括以下步骤：
a.将药物溶解在一种生物相容的有机溶剂中;
b.在一种中等极性的有机溶剂中溶解至少一种类脂，并将其与步骤a的溶液相混合;
c.在上述a和b的混合溶液中加入一种水溶液并在减压下蒸发溶剂主形成糊状;以及
d.将水溶液加上上述步骤c的糊状物中。
10、一种形成HDLC的方法，包括用MLV工艺形成一种含有两性霉素B和7∶3摩尔比的DMPC∶DMPG制剂的步骤，并加热该制剂。
11、按权利要求10所述的方法，其中两性霉素B的含量为约25～约50摩尔%。
12、按权利要求11所述的方法，其中制剂在约60℃被加热约10分钟。
13、通过解读HDLC制剂的吸收谱和测量其峰的强度耒确定HDLC毒性的方法。
14、一种制备包括HDLC脂质体的组合物的方法，该方法包括以下步骤：
a.将药物悬浮于一种水溶液中;
b.将类脂悬浮于一种水溶液中;
c.将步骤a和b的产物混合;以及
d.在该类脂的相变温度或高于该相变温度下，对步骤c的产物进行保温。
15、按权利要求14所述的方法，其中将药物通过声波处理悬浮于水溶液中。
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