CN107048472A

CN107048472A - 多孔陶瓷固定化果胶酶及其在烟草薄片加工过程中的应用

Info

Publication number: CN107048472A
Application number: CN201710384300.8A
Authority: CN
Inventors: 郝辉; 马宇平; 许春平; 陈芝飞; 邱建华; 刘绍锋; 张俊岭; 李怀奇; 蔡莉莉; 董艳娟; 王充; 冉盼盼
Original assignee: China Tobacco Henan Industrial Co Ltd; Zhengzhou University of Light Industry
Current assignee: China Tobacco Henan Industrial Co Ltd; Zhengzhou University of Light Industry
Priority date: 2017-05-26
Filing date: 2017-05-26
Publication date: 2017-08-18

Abstract

本发明属于烟草制备技术领域，具体涉及一种多孔陶瓷固定化果胶酶及其在烟草薄片加工过程中的应用。本申请通过将特定菌株发酵获得粗酶液，然后将果胶酶固定在多孔陶瓷上，直接用于烟草薄片三级萃取液处理以降低其果胶酶含量，从而改善烟草品质。实验证明，本申请中固定化果胶酶用于烟草薄片加工过程中后，最高可将烟草薄片中果胶含量由2.00%降低到1.53%，降解率达到23.50%。将处理后烟草薄片用于卷烟后，感官抽吸评价表明，添加有酶解后烟草薄片的卷烟样品相较于未处理的样品，卷烟香气更加细腻，烟气透发性更好，刺激性减轻，口感发涩程度减小，杂气减少，劲头足，且燃烧性更好，能够改善烟草的吸食品质。

Description

多孔陶瓷固定化果胶酶及其在烟草薄片加工过程中的应用

技术领域

本发明属于烟草制备技术领域，具体涉及一种多孔陶瓷固定化果胶酶及其在烟草薄片加工过程中的应用。

背景技术

造纸法烟草薄片（Paper-Process Reconstituted Tobacco）是一种烟草资源再生利用的产品。它是利用一些烟草废弃料、边角料，如烟梗、烟叶碎片、烟末等为原料，经过浸提、浓缩、分离、打浆、磨浆、抄造、烘干、加香工艺过程，制成烟叶薄片，用作卷烟填充物。造纸法烟草薄片，不仅在改善烟叶产品结构强度、燃烧性能及降低卷烟的烟气烟碱和焦油量等方面具有优势，同时还能降低烟叶单耗，节约生产成本，可以说是烟草工业近年最重要的成果之一。而近年来，生物技术与造纸法烟草薄片技术在生产中的结合应用，不仅发挥了造纸法烟草薄片的工艺优势，而且利用生物技术有选择地改变烟草化学成分，明显改善了烟草薄片的品质。

研究表明，烟草原料中的纤维素、木质素、果胶和蛋白质在高温下均会产生芳烃类化合物。其中果胶是一种胶体性物质，沉积在初生细胞壁和胞间层，并与纤维素、半纤维素、木质素以及一些蛋白质相互交联。果胶在热解过程中主要生成甲醇等有害物质。果胶的去除不仅能够减少这类物质的生成，而且还能够改变烟草细胞结构，让细胞变的更松散透气，有利于提高烟草燃烧能力，减少热解的发生。

现有技术中，针对烟草薄片中果胶类物质的降解主要是采用传统的果胶酶进行的。但是由于烟草薄片中果胶结构的复杂性和多样性，而现有技术中的果胶酶普遍存在对于烟草薄片中果胶降解针对性不强、降解不够充分、降解过程难以控制的缺陷，因而急需探讨新的果胶酶及其在烟草薄片加工中的应用。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用特定菌株发酵制备的果胶酶，通过将该果胶酶固定化在多孔陶瓷上，对烟草薄片加工过程中的三级萃取液具有较好针对性，可实现针对性降解，从而改善烟草品质。

本发明的技术方案具体如下所述。

一种多孔陶瓷固定化果胶酶，以多孔陶瓷为载体固定化果胶酶，通过如下生产步骤制备获得：

（1）菌种活化，从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中28~32℃活化培养2~3d左右；

所述发酵菌株具体为中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)保藏的保藏号为CICC41151的塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)；该菌株为可公开获得菌株；

所述活化培养基为查氏琼脂培养基；从保藏培养基挑取菌株后接种活化培养基时具体可采用划线法接种；

（2）制备种子液，将步骤（1）中活化后的菌种接种到种子培养基中，24~28℃、120~180rmin摇床培养36~48h左右（优选，26℃、160 r/min培养48h），制备种子液；

所述种子培养基配方为：果胶3g/L，蛋白胨10g/L，NaNO₃ 3.0g，MgSO₄•7H₂O 0.5g，KCl0.5g，FeSO₄•4H₂O 0.01g，K₂HPO₄ 1.0g，pH=6.0～6.5；具体装液量可设计为：100/ 250mL锥形瓶。

（3）发酵培养，将步骤（2）中所制备的种子液接种到发酵培养基中，24~28℃、120~180rmin摇床培养4~14h以进一步发酵培养（优选，26℃、160 r/min摇床培养12h左右）；

将种子液接种发酵培养基时，接种量具体可按4%体积分数比例进行接种；

所述发酵培养基配方为：果胶50 g/L、蛋白胨2.0g/L，pH=6.2左右；

（4）制备粗酶液，将步骤（3）中发酵液经抽滤滤去菌体，再经超滤浓缩即可获得粗酶液，测定酶活后即可作为果胶酶进行固定；

（5）果胶酶的固定化，将步骤（4）中的果胶酶，以直径0.4cm、平均孔径650～750nm的多孔陶瓷为载体，将果胶酶固定化3~5h（优选固定化4h）后，以质量浓度1.2~1.6%的戊二醛交联1~3h（优选以质量浓度1.3%的戊二醛交联2h）。

所述多孔陶瓷固定化果胶酶在烟草薄片加工过程中的应用，用于烟草薄片原料的烟梗和烟末进行逆流萃取加工过程中的三级萃取液，按多孔陶瓷固定化果胶酶：三级萃取液体积=1g：1~50mL的比例，将多孔陶瓷固定化果胶酶与三级萃取液混合均匀后，40~50℃、酶解2~6h。

较优处理条件为，按多孔陶瓷固定化果胶酶：三级萃取液体积=1g：40mL的比例，将多孔陶瓷固定化果胶酶与三级萃取液混合均匀后，45℃、酶解3h。

一种利用所述多孔陶瓷固定化果胶酶的针对烟草薄片中果胶的加工方法，具体包括如下步骤：

（1）制备多孔陶瓷固定化果胶酶，按照上述步骤（1）至步骤（5）方法制备多孔陶瓷固定化果胶酶备用；

（2）按照现有烟草薄片加工工艺，在烟草薄片原料的烟梗和烟末进行逆流萃取加工过程中的三级萃取液中，加入步骤（1）中所制备多孔陶瓷固定化果胶酶，按多孔陶瓷固定化果胶酶：三级萃取液体积=1g：1~50mL的比例，将多孔陶瓷固定化果胶酶与三级萃取液混合均匀后，40~50℃、酶解2~6h。

本发明的总体技术路线是：将特定菌株首先发酵，筛选优化最佳发酵条件，获得最高果胶酶酶活的粗酶液，然后将果胶酶固定在多孔陶瓷上，直接用于烟草薄片三级萃取液处理以降低其果胶酶含量，通过优化处理工艺，获得最佳降解效果，从而改善烟草品质。

初步试验表明，可将烟草薄片三级萃取液中果胶含量由2.00%降低到1.53%，降解率达到23.50%。将处理后烟草薄片用于卷烟后，进一步的感官抽吸评价表明，添加有酶解后烟草薄片的卷烟样品相较于未处理的样品，卷烟香气更加细腻，烟气透发性更好，刺激性减轻，口感发涩程度减小，杂气减少，劲头足，且燃烧性更好，从而较好的改善了烟草的吸食品质。

总体而言，本申请与现有烟草薄片加工工艺结合较为紧密，所制备多孔陶瓷固定化果胶酶酶活较高，便于应用，能够较好降解烟草薄片原料中果胶成分，改善烟草质量效果较为明显，具有一定地推广应用价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中果胶含量测定、果胶降解率的计算方法简要介绍如下。

酶活测定方法

本发明中酶活测定参照Miller(1959)方法，具体为：

A．取0.4mL l%果胶溶液于试管中，加入1.0mL pH=5的0.04mol/L Na₂HPO₄-0.02mol/L柠檬酸缓冲液，45℃水浴平衡5min；

B．加入0.1mL适当稀释的酶液，45℃反应30min（空白对照组以煮沸失活的酶液代替）；

C．加入3.0mLDNS溶液终止反应，沸水浴5min；

D．冷却，定容至15mL，于分光光度计540 nm 波长下测吸光度，得到反应体系中半乳糖醛酸的量；

酶活力单位：1mL酶液或1g酶在45℃、pH5.0的条件下，每min分解底物产生lμg半乳糖醛酸的酶量定义为1单位聚半乳糖醛酸酶(PG)酶活，以U/mL表示；

酶活力计算公式：U= (C_实验-C_对照)*N*1000*(V_总/V_酶)/t；

其中，N—酶液稀释倍数，V_总—反应总体积，V_酶—酶液体积，t—反应时间（min）；

DNS法标准曲线的绘制：配置1mg/mL的半乳糖醛酸标准溶液。取1 mg /mL 半乳糖醛酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于试管中，补水至1 mL，加DNS 试剂3 mL，混合后于沸水中煮7 min，冷却后定容至15mL，于分光光度计540 nm 波长下测吸光度；以吸光度为纵坐标，半乳糖醛酸量为横坐标，绘制标准曲线。

果胶含量测定

下述实施例中对于烟草薄片加工过程中的三级萃取液的果胶含量采用咔唑比色法测定，具体测定步骤如下：

1、样品预处理，取待测样品，量取10mL，样品于250mL锥形瓶中，加入150mL加热至沸腾的0.05mol/L 的HCl 溶液，装上冷凝器，于90℃水浴中加热回流1h，冷却后把滤液移入250mL容量瓶中，加入2mol/L的NaOH中和至pH=4，摇匀，收集滤液即得总果胶提取液，备用；

2、以半乳糖醛酸为标准品，咔唑比色法测定果胶含量，取步骤A中所得总果胶提取液1mL于含有6mL浓硫酸的试管中，摇匀；

85℃水浴加热15min；冷却，加入0.15%咔唑无水乙醇溶液0.3mL，摇匀，暗置30min；530nm下测吸光度；

3、根据咔唑比色法标准曲线和公式，求得待测液果胶含量；

所述公式为：果胶（%）= C×V×K×100/(W×10⁶) ；

其中，C：对照标准曲线求得的果胶提取稀释液的果胶含量（μg/mL)，V：果胶提取液原液体积（mL），K：果胶提取液稀释倍数，W：样品质量（g），10⁶：质量单位换算系数；

所述咔唑比色法标准曲线的绘制方法为：

首先准确称取0.1000g半乳糖醛酸标准品于烧杯中，用少量蒸馏水溶解后转移至100mL容量瓶中，用pH为3的盐酸定容；

然后分别取0、1、2、3、4、5、6、7mL于8个100容量瓶中，用pH为3的HCl定容，得到浓度为0、10、20、30、40、50、60、70μg/mL的标准溶液；

最后以上述方法测定，然后绘制咔唑比色法的标准曲线。

果胶降解率计算

下述实施例中果胶降解率按以下公式计算：

Ei=[（C0－Ci）/C0]×100%；

其中，Ei：果胶的降解率，C0：空白对照样中果胶水解生成的半乳糖醛酸的量；Ci：酶处理的三级萃取液中果胶水解生成的半乳糖醛酸的量；空白对照样和酶处理的三级萃取液中果胶含量测定均按上述咔唑比色法进行测定。

实施例1

本实施例所提供的多孔陶瓷固定化果胶酶，通过如下生产步骤制备获得。

（1）菌种活化，从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中30℃活化培养2d左右；

所述发酵菌株具体为来源中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)保藏的保藏号为41151的塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)；本实施例中所用菌株从保藏单位购买获得；

所述活化培养基为查氏琼脂培培养基；从保藏培养基挑取菌株后接种活化培养基时具体采用划线法接种。

（2）制备种子液，将步骤（1）中活化后的菌种接种到种子培养基中，26℃、160 r/min摇床培养48h，制备种子液；

所述种子培养基配方为：果胶3g/L，蛋白胨10g/L，NaNO₃ 3.0g，MgSO₄•7H₂O 0.5g，KCl0.5g，FeSO₄•4H₂O 0.01g，K₂HPO₄ 1.0g，pH=6.0～6.5；具体装液量为：100/ 250mL锥形瓶。

从活化培养基中挑取菌株时，具体按如下方法进行：

用打孔器在活化培养基平板上靠近菌株生长边缘的位置取两块0.5cm²的、长满新生菌丝的接种块，再接种于种子培养基中；

还需解释的是，在摇床发酵培养结束后后，可加入灭菌的磁珠和适量的玻璃珠，使用磁力搅拌器搅拌2h左右，以使将培养物打碎，便于作为种子液接种用于进一步发酵培养扩增使用。

（3）发酵培养，将步骤（2）中所制备的种子液接种到发酵培养基中，26℃、160 r/min摇床培养12h以进一步发酵培养；

将种子液接种发酵培养基时，接种量具体按4%体积分数比例进行接种；

所述发酵培养基配方为：果胶50 g/L、蛋白胨2.0g/L，pH=6.2。

（4）制备粗酶液，将步骤（3）中发酵液经抽滤滤去菌体，再经超滤浓缩即可获得粗酶液，测定后其酶活为2654.32U/mL，然后即可作为果胶酶进行固定；

（5）果胶酶的固定化，将步骤（4）中的果胶酶，以直径为0.4cm，平均孔径为650～750nm的多孔陶瓷为载体，将果胶酶固定化4h后，以浓度为1.3%的戊二醛交联2h。测定表明，固定化后的多孔陶瓷固定化果胶酶的酶活为639.65U/g。

实施例2

将实施例1所制备多孔陶瓷固定化果胶酶用于降解烟草薄片原料中果胶，所述烟草薄片原料为许昌薄片厂提供的按现有工艺制备的以烟梗和烟末为原料进行逆流萃取加工过程中的三级萃取液，具体使用方法为：

将实施例1中所制备多孔陶瓷固定化果胶酶（酶活为639.65U/g，理论而言，实施例1中所制备任意酶活的多孔陶瓷固定化果胶酶均可用于降解果胶，现在仅以实施例1所制备的酶活为639.65U/g的多孔陶瓷固定化果胶酶为例进行实验），按多孔陶瓷固定化果胶酶：三级萃取液体积=1g：1~50mL的比例，将多孔陶瓷固定化果胶酶与三级萃取液混合均匀后，40~50℃、酶解2~6h。

酶解结束后，取10mL的酶解液，测定处理后样品中的果胶含量。

同样操作条件下，以空白的未固定果胶酶的多孔陶瓷作为对照组，最终计算果胶降解率。

对上述工艺参数优化后，按多孔陶瓷固定化果胶酶：三级萃取液体积=1g：40mL的比例，45℃条件下，酶解6h后果胶降解效果最好，在此条件下三级萃取液中果胶降解率为23.50%。

为进一步检测酶解处理后烟草薄片对于烟草吸食效果的改进程度，以上述酶解处理条件处理后三级萃取液为烟草薄片生产原料，制成烟草薄片，发明人对其进行了实际卷烟抽吸实验，相关实验过程简要介绍如下。

将最佳酶解条件处理后烟草薄片在80℃条件下进行适当烘干（至湿度65%）后，切丝，然后置于恒温恒湿箱内平衡（相对湿度(60 ±5)% ，温度 (22 ±2) ℃）48 h；

按烟丝重量15%（即称取0.12 g样品）与平衡后85%的贵州毕节B2F烟丝，均匀混合后按现有技术制备抽吸用卷烟，此即为试验组卷烟。

相同条件及相同方法下采用未处理的三级萃取液为原料所制备的烟草薄片，制烟并标记为空白组。

将各组卷烟样品（每支烟只总重0.80±0.01 g）在温度(22±2)℃、相对湿度(60±5)%的恒温恒湿箱中平衡24 h后，依据国家现行成品烟评析标准GB5606.4-2005对卷烟进行质量评吸鉴定和评价。

具体评价结果如下表所示：

。

从上述评价结果可以看出，酶解处理后的烟草薄片添加与卷烟后，可使卷烟的香气更加细腻，烟气透发性更好，同时能够增加甜润感且减轻刺激性，口感发涩程度减小，余味纯净舒适，劲头足，且燃烧性更好，卷烟的吸食品质得到了较好改善。

Claims

1.一种多孔陶瓷固定化果胶酶，在其特征在于，通过如下步骤制备获得：

（1）菌种活化，从保藏培养基上挑取发酵菌株，接种到活化培养基中活化培养2~3d；

所述发酵菌株具体为中国工业微生物菌种保藏中心保藏的保藏号为CICC 41151的塔宾曲霉；

（2）制备种子液，将步骤（1）中活化后的菌种接种到种子培养基中，24~28℃、120~180rmin摇床培养36~48h，制备种子液；

（3）发酵培养，将步骤（2）中所制备的种子液接种到发酵培养基中，24~28℃、120~180rmin摇床培养4~14h进一步发酵培养，获得发酵液；

所述发酵培养基配方为：果胶50 g/L、蛋白胨2.0g/L，pH=6.2；

（4）制备粗酶液，将步骤（3）中发酵液经抽滤滤去菌体，再经超滤浓缩即可获得粗酶液；

（5）果胶酶的固定化，将步骤（4）中的粗酶液，以多孔陶瓷为载体进行果胶酶固化，再进行戊二醛交联化，以固定果胶酶。

2.如权利要求1所述多孔陶瓷固定化果胶酶，其特征在于，步骤（2）中，所述种子培养基配方为：果胶3g/L，蛋白胨10g/L，NaNO₃ 3.0g，MgSO₄•7H₂O 0.5g，KCl 0.5g，FeSO₄•4H₂O0.01g，K₂HPO₄ 1.0g。

3.如权利要求1所述多孔陶瓷固定化果胶酶，其特征在于，步骤（5）中，所述多孔陶瓷规格为：直径0.4cm、平均孔径650～750nm；戊二醛交联时，以质量浓度1.2~1.6%的戊二醛交联1~3h。

4.权利要求1~6任一项所述多孔陶瓷固定化果胶酶在烟草薄片加工过程中的应用，其特征在于，用于烟草薄片加工时，作用于烟草薄片原料的三级萃取液。

5.如权利要求4所述多孔陶瓷固定化果胶酶在烟草薄片加工过程中的应用，其特征在于，应用时，按多孔陶瓷固定化果胶酶：三级萃取液=1g：1~50mL的比例，将多孔陶瓷固定化果胶酶与三级萃取液混合均匀后，40~50℃、酶解2~6h。

6.如权利要求5所述多孔陶瓷固定化果胶酶在烟草薄片加工过程中的应用，其特征在于，应用时，按多孔陶瓷固定化果胶酶：三级萃取液体积=1g：40mL的比例，将多孔陶瓷固定化果胶酶与三级萃取液混合均匀后，45℃、酶解3h。

7.一种利用权利要求1所述多孔陶瓷固定化果胶酶的针对烟草薄片中果胶的加工方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

（1）制备多孔陶瓷固定化果胶酶；

（2）在烟草薄片原料进行逆流萃取加工过程中的三级萃取液中，加入步骤（1）中所制备多孔陶瓷固定化果胶酶，按多孔陶瓷固定化果胶酶：三级萃取液体积=1g：1~50mL的比例，将多孔陶瓷固定化果胶酶与三级萃取液混合均匀后，40~50℃、酶解2~6h。