CN1993052B - 植物病害防除剂和防除方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有对植物病害具有防除能力的乳酸菌的植物病害防除剂、和用相同的乳酸菌处理植物和/或土壤的植物病害防除方法，通过使用对人健康有益的乳酸菌可以进行安全稳定的农作物生产。作为上述乳酸菌，优选是属于戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)等片球属的微生物、属于植物乳芽孢杆菌(Lactobacillus plantarum)等芽孢杆菌属的微生物。

Description

植物病害防除剂和防除方法
技术领域
本发明涉及植物病害防除剂和防除方法，更详细地说，涉及使用对人的健康有用的乳酸菌能够抑制农作物的病害的植物病害防除剂和防除方法。本发明还涉及使用特定的乳酸菌的植物和/或土壤的处理方法。
背景技术
近年来，对以化学合成农药难以防除的植物病害进行了使用有用微生物防除的生物防除的应用研究。此外，对考虑了对环境的负担的农业方法，即，推进环保型农业的需求增强，以抑制使用化学合成农药的为目的，积极地研究了通过有用微生物进行的生物防除。
例如：下列专利文献1～3中，提出了使用属于假单胞属(Pseudomonas)的微生物的植物病害的防除技术。此外，在下述专利文献4中，并用针对土壤病害的原因的微生物具有拮抗性的放线菌和产生粘性物质的微生物以防除植物病害的技术。此外，在下述专利文献5中，提出了并用属于枝孢属(Cladsporium)的微生物和属于芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物以防除植物病害的技术。
专利文献1：日本专利第3431926号公报(特开平5-916号公报)
专利文献2：日本专利第2533828号公报(特开平6-9325号公报)
专利文献3：日本专利第3135708号公报(特开平6-107511号公报)
专利文献4：日本特开2003-277212号公报
专利文献5：日本特开2003-300803号公报
专利文献6：日本特开平10-164987号公报
发明内容
发明要解决的课题
对以植物病害防除为目的而使用的微生物，表明其防除效果而销售时，需要根据农药取缔法进行农药注册。在农药注册时，除了对植物病害的防除效果以外，还必需进行针对人或者动植物、自然环境的影响评价等的安全性审查，只有审查合格的微生物才能作为农药注册、销售。
此外，消费者对“食品”的安全性的关心正在升高，不仅关心食品中的微生物，而且对利用有用微生物进行了病害防除的农作物也把考虑到这一点作为重要的课题。
一方面，因为消费者的“健康”意识增高，所以对身体有效的功能性成分或者含有该成分的食品等的欢迎度在集中。其中，对具有整肠作用或者抑癌作用等效果的乳酸菌的关心也正在增高。
因此，使用对人的健康有用的乳酸菌，只要能防除农作物病害，就不会产生在农药注册上的安全性检查方面的问题，消除了消费者对安全性存在的怀疑，因为能进一步提高农作物的功能性和商品性，所以可以理想地防除病害。
本发明鉴于以上观点，以通过使用对人的健康有益的乳酸菌，提供能够安全、放心地进行农作物生产的植物病害防除剂和防除方法做为目的。
并且，在上述专利文献6中，提出了下述的植物栽培技术：能够在从种子阶段到可以出苗阶段的栽培过程中人为控制栽培环境的植物的栽培方法(例如：水田栽培)中，在洗涤植物后，向植物表面固定对人体无害的微生物乳酸菌，通过乳酸菌覆盖植物表面，抑制杂菌或者病原菌的入侵以及繁殖。不过，该技术涉及被称为生物保存(Biopreservation)的食品保存技术，所使用的乳酸菌使发芽的萝卜等植物不被由对人有害的菌(大肠杆菌等)所污染。所以，是与以在存在无数微生物的环境下的苗圃的栽培为主的、用于防除植物自身病害的植物病害而使用乳酸菌的本发明明显不同的技术。
此外，上述专利文献4中，公开了使用属于乳芽孢杆菌属(Lactbacillus)的微生物，不过记载的该微生物自身并不是具有对植物病害防除能力的菌，只不过是与拮抗菌的放线菌同时并用产生粘性物质的微生物而已。所以，同一文献并未暗示乳酸菌具有对土壤病害等的植物病害的防除效果。
解决课题的方法
本发明人为了解决上述课题努力研究，结果发现使用对人健康有用的乳酸菌能够防除农作物的植物病害，至此完成了本发明。
即，本发明涉及以含有对植物病害具有防除能力的乳酸菌为特征的植物病害防除剂。本发明还涉及以用对植物病害具有防除能力的乳酸菌处理植物和/或土壤为特征的植物病害防除方法。
本发明还涉及以从戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)FERMBP-10365菌株、以及植物乳芽孢杆菌(Lactobacillus plantarum)NITEBP-108菌株中选出的至少一种乳酸菌处理植物和/或土壤的方法。
发明效果
根据本发明，因为使用乳酸菌防除农作物的植物病害，所以能够确保高的安全性的同时可以进行稳定的农作物生产。此外，通过用乳酸菌进行处理，在其与农作物高密度共生时，也可以赋予农作物整肠作用或者抑癌作用等功能，可以提高农作物的商品性。
此外，上述的FERM BP-10365菌株和NITE BP-108菌株，具有对植物病害的防除效果的同时，还具有在环境压力条件下提高种子的发芽率的效果。所以，使用这些微生物的上述处理方法不仅可以作为植物病害防除方法，而且可以作为发芽改善方法而加以利用。
具体实施方式
下面对本发明进行详细的说明。
在本发明用于防除植物病害的乳酸菌只要具有防御病原微生物感染植物的能力，即，对植物病害具有防除能力，没有特别的限制。作为相应的病害防除能力，可以是通过抗生作用、竞争作用以及抵抗性诱导作用中的任何一种作用，也可以是通过这些中的任何2项以上的作用的组合。此处，抗生作用指的是乳酸菌产生抗生素，据此抑制病原微生物的作用，也称为拮抗性。此外，竞争作用指的是乳酸菌与病原微生物之间的空间或者营养成分的争夺，乳酸菌因为生长繁殖旺盛先占领空间或者先获取营养，以此抑制病原微生物的作用。此外，抵抗性诱导作用指的是乳酸菌作用于植物，通过所产生的物质抑制病原微生物的感染或者增殖的作用。
在本发明中，乳酸菌指的是满足下列条件的菌：(1)革兰氏阳性；(2)细胞的形态是杆菌或者球菌；(3)过氧化氢酶阴性；(4)相对消耗的葡萄糖产生50％以上的乳酸；(5)不形成内生孢子和(6)无运动性或者显著较少的运动性。
具体而言，可列举属于下列属的微生物：戊糖片球菌属(Pediococcus pentosaeus)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilatici)、小片球菌(Pediococcus pavulus)、有害片球菌(Pediococcus damnosus)、四联球菌属(Pediococcus halophilus)等属于片球菌属(Pediococcus)；苹果乳芽孢杆菌(Lactobacillusmali)、猪双臼乳芽孢杆菌(Lactobacillus suebicus)、植物乳芽孢杆菌(Lactobacillus plantarum)、消化乳芽孢杆菌(Lactobacillusalimentarius)、清酒乳芽孢杆菌(Lactobacillus sakei)、戊糖乳芽孢杆菌(Lactobacillus pentosus)、短乳芽孢杆菌(Lactobacillus brevis)、坏发酵乳芽孢杆菌(Lactobacillusmalefermentans)、乳酸乳芽孢杆菌(Lactobacillus lactis)、加氏乳芽孢杆菌(Lactobacillus gasseri)、嗜酸乳芽孢杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚德氏乳芽孢杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳芽孢杆菌(Lactobacilluscasei)等属于乳芽孢杆菌属(Lactobacillus)；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、棉子糖乳球菌(Lactococcusraffinolactis)、植物乳球菌(Lactococcus plantarum)等乳球菌属(Lactococcus)；广布肉杆菌(Carnobacterium divergens)等的肉杆菌(Carnobacterium)属；稍小魏斯氏菌(Weissellaminor)等的魏斯氏菌(Weissella)属；极小阿托波氏菌(Atopobium parvulus)等的阿托波氏菌(Atopobium)属；牛链球菌(Streptococcus bovis)等的链球菌属(Streptococcus)；蜂房肠杆菌(Enterococcus avium)等肠杆菌(Enterococcus)属；河流漫游球菌(Vagococcus fluvialis)等漫游球菌(Vagococcus)属、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)等明串珠菌(Leuconostoc)属、酒酒球菌(Oenococcus oeni)等酒球菌(Oenococcus)属、嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)等四联球菌(Tetragenococcus)等属的微生物。这些可以分别单独使用也可以将多个属于相同属或者不同属的微生物组合使用。
优选属于片球属(Pediococcus)或者乳芽孢杆菌(Lactobacillus)属的微生物，更优选选自戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、植物乳芽孢杆菌(Lactobacillus plantarum)、消化乳芽孢杆菌(Lactobacillusalimentarius)和清酒乳芽孢杆菌(Lactobacillus sakei)中的至少一种微生物。特别是属于戊糖片球菌的KMC05株(FERM BP-10365菌株)以及属于植物乳芽孢杆菌的DHH15株(NITE BP-108菌株)，因为如后述的实施例所示的那样在植物病害的防除效果上特别优良，所以特别优选使用这些。
此外，这些KMC05株、SHH15株，如后述实施例所述的在环境压力下种子的发芽率得到提高，所以与植物病害的防除效果相加，能够赋予种子健康且稳定地发芽和增殖。所以，该微生物不仅能用于植物病害的防除方法，而且也能够用于发芽改善方法。作为发芽改善方法而被应用的时候，该微生物对种子进行处理或者在播种前或者播种后对土壤进行处理。
在本发明中对作为防除对象的植物病害没有特别的限定。可以适用于包括土壤病害的各种植物病害的防除。例如：菠菜等苋科作物，水稻、玉米等稻科作物，芋、水芋、Potos等芋科作物；葱、洋葱、郁金香、百合等百合科作物；卷心菜、白菜、萝卜、土豆、花白菜等油菜科作物，草莓、梅、桃、苹果等蔷薇科作物，黄豆、红小豆等豆科作物，胡萝卜、荷兰芹等芹科作物，辣椒、茄子、番茄、马铃薯、矮牵牛等茄科作物，黄瓜、西瓜、南瓜等瓜科作物，牛蒡、莴苣、菊花、大波斯菊、向日葵等菊科作物，剑兰等马莲科作物，勿忘我等乌芙蓉科作物，非洲堇等苦苣苔科作物，金鱼草、夏堇等红花玉芙蓉科作物，康乃馨、满天星等瞿麦科作物，牵牛花等旋花科作物，水仙等石蒜科作物，卡多利亚、兰草等兰科作物，柿等柿树科作物，无花果等桑科作物，葡萄等葡萄科作物，栗子等山毛榉科作物，温州蜜桔、柠檬等桔科作物，猕猴桃等木天蓼科作物等发生的萎凋病、立枯病、株腐病、半身萎凋病、黑斑病、根瘤病、疫病、白化病、霜霉病、生锈病、紫文羽病、白绢病、白粉病、炭疽病、灰锈病、稻瘟病、软腐病、青枯病、黑腐病、坏腐病、斑点细菌病、根头癌病、霜害病等。
此外，作为病原微生物，可列举：镰孢属(Fusarium)、Phytium属、丝核菌属(Rhizoctonia)、轮枝孢属(Verticillium)、链格孢属(Alternaria)、根肿菌属(plasmodiophora)、Rhytophthora属、Albugo属、Peronospora属、Puccinia属、Hericobasidium属、Sclerotium属、单丝壳菌属(Sphaerotheca)、毛盘孢属(Colletotrichum)、葡萄孢属(Botrytis)、Pyricularia属等丝状菌；欧文氏菌属(Erwinia)、Ralstonia属、黄单胞菌属(Xanthomonas)、棍状杆菌属(Clavibacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)等细菌；链霉菌属(Streptomyce )等放线菌。
本发明的植物病害防除剂，含有上述乳酸菌，其形态通常为农药可使用的形态，例如：粒剂、粉剂、水和剂、乳剂等，没有特别的限制。作为例子，可以提供将上述乳酸菌与制剂学上许可的载体吸附的粉剂或者粒剂，这种情况下，作为载体，可以使用硅藻土、粘土、滑石、沸石、稻壳、骨粉等。
本发明的植物病害防除方法是用上述乳酸菌处理植物或者土壤的方法，该处理方法没有特别的限定。例如可以列举下述方法：
(1)用上述乳酸菌的培养液等分散了乳酸菌的液体处理植物的方法。其中包括用所说的乳酸菌的分散液向种子喷雾，或在该分散液中浸渍种子等对种子进行处理。此外，包括向该分散液中浸渍固定栽培前的苗的根部，将该分散液穿刺接种到叶或茎等中。
(2)用上述乳酸分散液处理土壤的方法。其中包括向播种培养用土或者育苗用土、苗圃等进行该分散液的喷雾、或灌注；这种情况下，也可以处理植物固定栽培前或者种子播种前的土壤，也可以处理固定栽培后或者播种后的土壤。
(3)将上述乳酸菌自身粉末化，或者使之附着到载体上而制备的粉末或者粒状的防除剂处理植物的方法。其中包括使所述的粉末或者粒状防除剂附着到种子的表面，或者与种子混合进行播种等，对种子进行处理。
(4)用上述粉末状或者粒状的防除剂处理土壤的方法。其中包括将该粉末或者粒状的防除剂与上述各种培养用土或者苗圃用土混合，或者撒在苗圃土上。
实施例
下面，列举实施例对本发明进行更具体的说明，不过本发明的范围并不局限于此。
(实施例1：菠菜萎凋病的防除效果)
以建立使用乳酸菌防除菠菜的植物病害的技术为目的，按照以下的方式选择抑制菠菜的土壤病害之一的萎凋病发病的乳酸菌。
首先，将从发酵乳或者发酵食品等中分离的推断为主要是乳酸菌的149个菌株供给细菌实验，进行第一次选择。在第一次选择中，将各细菌在8ml MRS液体培养基中于37℃、静置培养3天后，在5000rpm下离心分离5分钟，回收菌体。将回收的菌体用灭菌水洗涤3次后，在用灭菌水制备的109cfu/ml的悬浊液中于23℃下浸渍处理与该悬浊液等量的菠菜种子(品种：おかぁ)24小时。接着在装有市售的培养土的直径为10.5cm的乙烯罐中按照10粒/罐播种6罐浸渍处理了的种子，在维持在20℃的温室内培养。在接种10天后，使萎凋病菌密度为每1克土壤5×103cfu(克隆形成单位)对各个罐子进行萎凋病菌尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)Ho4株的灌注接种，在30℃的温室中培养30天后，调查发病株数。并且，在对照区内代替细菌的悬浊液，使用在灭菌蒸馏水中浸渍处理过的种子。对于各细菌，根据下述公式计算防除价，防除价达到40以上的有15株菌株，选择出具有植物病害防除能力的乳酸菌。防除价和菌株数的关系如下述的表1所示。
防除价＝(1-各处理区的发病株率/对照区的发病株率)×100
表1
防除价 9以下 10～19     20～29     30～39    40～49     50～59     60以上
菌株数 89 23     12     10     6     6     3
对第一次选择中选择的15个菌株实施第二次选择。在第二次选择中，用和第一次选择相同的方法，将在细菌悬浊液中浸渍处理过的菠菜种子接种到装有萎凋病菌密度调整为每克土壤1×104cfu的土壤的直径15.0cm的乙烯罐子中，15粒/罐，共接种4罐，在接种后10天内于保持在20℃的温室内生长，在之后的30天里在30℃的温室中栽培，调查接种40天后的发病株数。其结果，选出对菠菜萎凋病有效的乳酸菌8株，其中，选出对萎凋病的发病抑制效果特别优良的细菌KMC05株。KMC05株的发病株数和防除价如下表2所示。
表2
处理区 发病株率(％) 防除价
KMC05区     11.9**     84
对照区     73.9     -
**：相对对照区域进行t-检验
具有1％的显著差异。
KMC05株的分类学性状如下述表3所示：
  培养温度 30℃ 生化试验     产生3-羟基丁酮马尿酸钠水解Esculin水解吡咯烷酮芳基酰胺酶α-半乳糖苷酶β-葡萄糖醛酸酶β-半乳糖苷酶碱性磷酸酶亮氨酸芳基酰胺酶精氨酸双脱氢酶   +++---++++
  细胞形态 球菌(Φ1.0μm)
  革兰氏染色 +
  孢子 -
  运动性 -
  克隆形态 培养基：MRS琼脂糖培养时间：48小时圆形边缘光滑低凸状有光泽乳白色
发酵性试验 D-核糖L-***糖D-甘露醇D-山梨醇乳糖D-海藻糖菊芋糖D-棉子糖淀粉糖原 ----------
  培养温度(℃) 37     +
45     -
  过氧化氢酶 -
  氧化酶 -
  产酸/产气(葡萄糖) +/-
  O/F检验(葡萄糖) +/+
根据表3可以推定KMC05株是属于片球菌属或者属于芽孢杆菌属的菌株，此外，16SrDNA碱基序列分析的结果表明是归属于戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)的菌株。
KMC05株以京都府的一个机构-京都府农业资源研究中心(所长：并木隆和，地址：邮编619-0244日本国京都府相乐郡精华町大字北稻八间小字大路74番地)的名义，如下保藏。
保藏机构的名称：独立行政法人产业技术综合研究所，专利生物保藏中心；
保藏机构的地址：邮编305-8566日本茨城县筑波市东1丁目1番地中央第6
保藏日：2004年6月18日(国内保藏日)
保藏号：FERM-BP-10365(2004年6月18日，由国内保藏的FERMP-20091在2005年7月1日进行国际保藏)。
并且，在上述第二次选择时与KMC05株一起选择的另外的有前景的乳酸菌如下表4所示，分别同时表示了防除价与分离源。
表4
    种属 株名 防除价     分离源
    Lactobacillus plantarum  MOE07株     41 新生婴儿粪便
    Lactobacillus plantarum  MDK13株     44 新生婴儿粪便
    Lactobacillus plantarum  WKB19株     42 新生婴儿粪便
    Lactobacillus alimentarius  SHH25株     67 新生婴儿粪便
    Lactobacillus sakei  KMC11株     41 泡菜
    Pediococcus pentosaceus  FM54株     42 发酵乳
    Pediococcus acidilactici  SHH16株     44 新生婴儿粪便
(实施例2：菠菜枯萎病的防除效果)
确认作为抑制菠菜萎凋病的发病的细菌而选择的乳酸菌KMC05株对菠菜的其他的土壤病害-立枯病是否有防除效果。
使用枯萎病菌终极腐霉(Pythium ultimum)OPU407株(从大阪府立大学获得)，将其与1g菠菜种子在5ml蒸馏水中制成2根培养土，在22℃培养两周。将该菌体用少量的灭菌土壤磨碎后，以100g灭菌土壤制备污染源。将得到的污染源用灭菌土壤稀释200倍和300倍，装到直径为10.5cm的乙烯罐子中作为污染土。
对于KMC05株，在8ml的MRS液体培养基中于37℃培养3天后，离心分离回收菌体。用灭菌水洗涤3次回收的菌体后，在用灭菌水制备的109cfu/ml的悬浊液中，在23℃下浸渍处理与该悬浊液等量的菠菜种子(品种：おかぁ)24小时。然后将浸渍处理的种子对上述的200倍稀释和300倍稀释的各污染土分别按照10粒/罐播种12罐，在最低温度保持在20℃的温室内生长。在播种6天后进行发芽调查，在播种20天后，进行枯萎调查，求出表示相对发芽株的枯萎株的比例的枯萎株率。并且，在对照区，用代替KMC05株的悬浊液在灭菌蒸馏水中浸渍处理的种子。
表5
污染源的稀释倍率 发芽株数(株/罐)   枯萎株率(％)
    对照区     KMC05区     对照区     KMC05区
    200     4.7     9.2**     62.7     31.8**
    300     8.8     9.2     32.8     16.3*
*：通过t-检验相对对照区具有5％的显著差异。
**：通过t-检验相对对照区具有1％的显著差异。
结果如表5所示，通过用KMC05株进行处理，发芽前的土壤中的种子腐败减少，以健康状态发芽的株增加。此外，发芽的株中引起枯萎的株的比例减少。
(实施例3：土壤水分过剩条件下的菠菜种子的发芽率提高)
为了确认上述乳酸菌KMC05株在环境压力下是否具有促进农作物种子发芽的效果，将KMC05株在8ml的MRS液体培养基中于37℃培养3天后，离心分离回收菌体。用灭菌水洗涤3次回收的菌体后，在用灭菌水制备的109cfu/ml的悬浊液中，在23℃下浸渍处理与该悬浊液等量的菠菜种子(品种：おかぁ)24小时。然后将浸渍处理的种子按照10粒/罐在600ml容量的塑料杯子中播种，保持在23℃的恒温器内生长。在生长时，按照土壤水分最大容水量110％、120％、130％的量灌水，使之为水分剩余的状态。在播种7天后进行发芽调查。并且，在对照区，用代替KMC05株的悬浊液在灭菌蒸馏水中浸渍处理的种子。
表6
  土壤水分条件(MWHC的％)     发芽株数(株/罐)
    对照区     KMC05区
    110     5.7     7.8*
    120     5.4     8.3*
    130     2.3     4.7*
*：通过t-检验相对对照区具有5％的显著差异。
MWHC的％：相对最大容水量的土壤水分的比例
结果如表6所示，通过用KMC05株进行处理，能够提高在环境压力下的菠菜种子的发芽率。据此可知使用KMC05株进行处理时，不仅对植物病害具有防除效果，而且能够提高在环境压力条件下的种子的发芽率、赋予发芽稳定的效果。
(实施例4：针对辣椒疫病的防除效果)
将上述KMC05株在8ml的MRS液体培养基中在于30℃静置培养3天后，以5000rpm离心分离5分钟，回收菌体。用灭菌水洗涤3次回收的菌体后，在用灭菌水制备的109cfu/ml的悬浊液中，在23℃下浸渍处理与该悬浊液等量的菠菜种子(品种：伏见辣椒)24小时。然后将浸渍处理的种子播种到装有市售培养用土的孔盘(cell tray)中，在30℃下生长40天。
用200ml的V8液体培养基在23℃下培养10天疫病菌辣椒疫霉(Phytophthora capsici)pph株，之后，将液体培养基匀浆，用灭菌水将其10倍稀释。
将在孔盘中长成的苗移植到装有市售培养用土的的直径为10.5cm的乙烯罐中。对植株源灌注上述匀浆得到的疫病菌磨碎液20ml。并且，在对照区，使用以同样的条件在灭菌水中浸渍处理了的种子。此外，分别提供24罐进行实验。
自从移植、灌注疫菌菌起1个月后调查发病。发病调查将健康定为0、将下面位置的叶子萎缩定为1，将中间位置叶子萎缩定为2，将上面位置的叶子萎缩定为3，将枯死定为4，进行评价，根据下面的式子计算发病度和防除价。
发病度＝(0×A+1×B+2×C+3×D+4×E)/(4×(A+B+C+D+E))×100
式中A、B、C、D、E分别是健康株、下面位置叶子枯萎株、中间位置叶子枯萎株、上面位置叶子枯萎株、枯死株的株数。
防除价＝(1-各处理区的发病度/对照区的发病度)×100
表7
处理区 发病度 防除价
KMC05区 8.3     78
对照区 37.5     -
结果如表7所示，通过用KMC05株进行处理，可以确认明显的辣椒疫病的发病抑制效果。
(实施例5：蔬菜类软腐病的防除效果)
将从发酵乳或者发酵食品等中分离的推断为主要是乳酸菌的410株菌株供给给细菌实验，进行第一次选择。在第一次选择中，将各细菌在8ml的MRS液体培养基中于30℃、静置培养2天后，在5000rpm离心分离5分钟，回收菌体。将回收的菌体用灭菌水洗涤3次后，再用灭菌水悬浮成109cfu/ml，向其中添加并调整软腐病菌胡萝卜欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)MAFF302818株至107cfu/ml。将8片直径1cm的卷心菜叶的圆片在上述悬浊液中于24℃下浸渍处理1小时后，去除圆片表面的水分，排列在9cm的灭菌的瓶中，在28℃下静置24小时。并且，在对照区内使用添加灭菌蒸馏水调整到107cfu/ml的软腐病菌的液体浸渍处理圆片。
将各圆片的病症面积为0％、1～49％、50～99％、100％分别评价为发病指数0、1、2、3。按照下述公式计算防除价，将防除价达到40以上的27株作为具有植物病害防除能力的乳酸菌选出。
发病度＝(0×A+1×B+2×C+3×D)/(4×(A+B+C+D))×100
式中A、B、C、D分别是病斑面积为0％、1～49％、50～99％、100％的卷心菜叶的圆片数。
防除价＝(1-各处理区的发病度/对照区的发病度)×100
对上述的第一次选择中选择出的2 7株菌株实施第二次选择。在第二次选择中用和第一次选择相同的方法进行培养，向调整为108cfu/ml的乳酸菌悬浊液中加入软腐病菌，调整到107cfu/ml，使用该溶液，用和第一次选择相同的方法，选择出防除价显示为40以上的9个菌株。
然后，对该9个菌株实施第三次选择。在第三次选择中，用和第一次选择相同的方法进行培养，向用灭菌水调整为109cfu/ml的乳酸菌悬浊液中加入软腐病菌，调整到107cfu/ml。在得到的悬浊液中将10根缝纫针扎成的束的前端浸入，在播种25天后的白菜叶(品种：无双)的中后部穿刺接种。接种每株3个位置，各个区域接种5株。并且，在对照区，使用以灭菌水调整到相同浓度的液体。
在播种10天后调查发病。发病调查将在每个接种部位，健康或者仅褐变的评价为0、病征不足1cm的评价为1、病症1cm以上的评价为2，根据下述公式计算发病度和防除价。
发病度＝(0×A+1×B+2×C)/(2×(A+B+C))×100
式中A、B、C分别是健全或者仅褐变的、病征不足1cm的、病症1cm以上的接种部位数。
防除价＝(1-各处理区的发病度/对照区的发病度)×100
其结果，选出对白菜软腐病有效的乳酸菌3株，其中选择出了防除效果特别优良的细菌SHH15株。SHH15株的发病率和防除价如下述表8所示。
表8：
  处理区   发病度   防除价
  SHH15区 3.3     95
  对照区 66.7     -
根据16SrDNA碱基序列分析的结果，SHH15株被确定为归属于植物乳芽孢杆菌(Lactobacillus plantarum)的菌株。SHH15株以京都府的一个机构-京都府农业资源研究中心(所长：并木隆和，地址：邮编619-0244日本国京都府相乐郡精华町大字北稻八间小字大路74番地)的名义，如下保藏。
保藏机构的名称：独立行政法人产品评价技术基地机构专利微生物保藏中心；
保藏机构的地址：邮编292-0818日本千叶县木更津市かずさ鎌足25-8
保藏日：2005年6月30日
保藏号：NITE BP-108。
如表8所示，SHH15株对白菜软腐病具有优良的防除效果，通过这些处理，明显能够抑制白菜软腐病的发病。
并且，在上述第三次选择时与SHH15株一起选择的另外的有前景的乳酸菌如下表9所示，分别同时表示了防除价与分离源。
表9
    种属 株名 防除价   分离源
Lactobacillus plantarum  RK01株     70 辣根
Lactobacillus plantarum  SHH28株     95 新生婴儿粪便
(实施例6：土壤水分过剩条件下的菠菜种子的发芽率的提高)
为了确认上述乳酸菌SHH15株在环境压力条件下是否具有促进农作物的种子发芽的效果，将SHH15株在8ml的MRS培养基中于30℃培养3天后，离心分离回收菌体。用灭菌水洗涤3次回收的菌体后，在用灭菌水制备的109cfu/ml的悬浊液中，在23℃下浸渍处理与该悬浊液等量的菠菜种子(品种：おかぁ)24小时。然后将浸渍处理的种子按照10粒/罐在600ml容量的塑料杯子中播种10罐，保持在25℃的恒温器内生长。在生长时，按照土壤水分最大容水量120％的量灌水，使之为水分剩余的状态。在播种7天后进行发芽调查。并且，在对照区，用代替SHH15株的悬浊液而在灭菌蒸馏水中浸渍处理的种子。
表10
    处理区     发芽株数(株/罐)
    SHH15区     6.2**
    对照区     3.4
**：通过t-检验相对对照区具有1％的显著差异。
结果如表10所示，通过用SHH15株进行处理，能够提高在环境压力下的菠菜种子的发芽率。据此可知使用SHH15株进行处理时，不仅对植物病害具有防除效果，而且能够提高在环境压力条件下的种子的发芽率、赋予发芽稳定的效果。
产业上的实用性
本发明的植物病害防除剂和防除方法，因为能够使用对人健康有益的乳酸菌防除植物病害，所以能够用于安全而且稳定的农作物生产。

Claims (7)

1.植物病害防除剂，其特征在于，含有对植物病害具有防除能力的乳酸菌，其中，所述乳酸菌是选自属于片球菌属的微生物和属于乳芽孢杆菌属的微生物中的至少一种微生物。
2.权利要求1所述的植物病害防除剂，其中，所述乳酸菌选自戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)和植物乳芽孢杆菌(Lactobacillus plantarum)中的至少一种微生物。
3.权利要求1所述的植物病害防除剂，其中，所述乳酸菌选自戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)FERM BP-10365菌株和植物乳芽孢杆菌(Lactobacillus plantarum)NITE BP-108菌株中的至少一种微生物。
4.植物病害防除方法，其特征在于，用具有对植物病害具有防除能力的乳酸菌处理植物和/或土壤，其中，所述乳酸菌是选自属于片球菌属的微生物和属于乳芽孢杆菌属的微生物中的至少一种微生物。
5.权利要求4所述的植物病害防除方法，其中，所述乳酸菌选自戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)以及植物乳芽孢杆菌(Lactobacillus plantarum)中选出的至少一种微生物。
6.权利要求4所述的植物病害防除方法，其中，所述乳酸菌选自戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)FERM BP-10365菌株和植物乳芽孢杆菌(Lactobacillus plantarum)NITE BP-108菌株中的至少一种微生物。
7.植物和/或者土壤的处理方法，包括用选自戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)FERM BP-10365菌株和植物乳芽孢杆菌(Lactobacillus plantarum)NITE BP-108菌株中的至少一种乳酸菌处理植物和/或者土壤。
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