CN109112163B - 一株戊糖乳杆菌发酵液及其抑制辣椒疫霉菌的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属生物防治土传病原菌技术领域，提供一株戊糖乳杆菌发酵液及其抑制辣椒疫霉菌的应用。戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus）已于2007年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1919。避免了作物、蔬菜使用化学农药导致的化学农药残留，保证了作物、蔬菜的食用安全性。减轻了化学农药在土壤中的蓄积量，防止化学农药对土壤的污染。在土壤中不会产生污染。使地球上的人类及生物能够正常生长与世代繁衍。抑制率能够达到87%，戊糖乳杆菌发酵上清液对辣椒疫霉菌具有明显的抑制作用，能够用于制备防治辣椒疫霉菌的生物制剂。

Description

一株戊糖乳杆菌发酵液及其抑制辣椒疫霉菌的应用
技术领域
本发明属于生物防治土传病原菌技术领域，具体涉及一株戊糖乳杆菌发酵液及其抑制辣椒疫霉菌的应用。
背景技术
土传性病害是病虫害在土壤中繁殖、生存或越冬，以土壤为传播媒介侵害地上的植物，其危害范围广，传播速度快，隐蔽性强，因此损失巨大，且难治理。由于土传病虫害的危害而造成的农作物产量损失通常会达到20%～40%，严重地块可能高达60%，或者甚至绝收。土传性病害已严重制约了保护地的发展。
随着农业结构的调整，全国各地蔬菜种植面积逐年扩大，蔬菜各种土传病害的发生变得日益严重。辣椒疫霉菌是危害广泛的一种土传病原菌，目前在世界各大洲均已发现，并且寄主范围不断扩大，目前可危害18科的78种植物，威胁了各种植物的大量生产。辣椒疫霉菌能够产生卵孢子,由于卵孢子具有抗逆性、能够忍耐极端的环境条件，辣椒疫霉菌成为最难防治的病害之一。对辣椒疫霉菌的防治的研究有重要的现实意义。
土壤消毒剂的应用对土传病原菌—辣椒疫霉菌有良好的效果。尤其是高强度化学药剂土壤消毒技术的应用，大幅度减少了辣椒疫霉菌的危害而造成的农作物产量损失。但是大量使用化学农药造成作物可食用部分农药过量残留，并且易引起土壤板结，地力下降和环境污染等问题。目前使用化学杀菌剂防治时由于其药效持续时间短，因而农民使用药剂的次数和剂量逐步增加，其有害成份在作物、蔬菜、土壤中的蓄积量也逐渐增加。这种情况在温室大棚蔬菜栽培中尤为突出，对人体健康和生态环境构成极大危害。因此，研制药效持久，且对人体和生态环境无害的生物菌剂替代化学农药成为我国乃至世界范围内的发展方向。当前，大量的具有生防潜力的微生物被研究报道。通过筛选拮抗微生物，可以从根本上抑制辣椒疫霉菌的生长繁殖，从而遏制辣椒疫病。更重要的是，许多生物防治菌不仅对病原菌表现出拮抗性，而且可以在植物根际形成一种有益的特有的微生态环境［涂璇等，西北农林科技大学，2004, 35（3）：236-245］，促进植物对外界营养物质的吸收与利用，甚至产生有可能促进植物的生长繁殖的代谢物，这不仅是一种安全高效的防治方法，而且也是绿色农业生态可持续发展所需要的。
发明内容
本发明的目的是提供一株戊糖乳杆菌发酵液及其抑制辣椒疫霉菌的应用。
本发明所述的戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus）已于2007年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），保藏号为CGMCC No.1919。
本发明所述的戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus）是从四川泡菜老汤(取自于中国农业大学东校区东门的某川菜酒家，其中NaCl浓度为4.75%，pH是4.19）中分离得到，代号为sp，具体的分离方法为：采用稀释108涂布平板方法，（采用MRS液体培养基进行分离，于37℃培养箱中培养，培养基MRS具体配方如下所示）通过连续画线平板法纯化，应用API50CH试剂条和API50CHL培养基（Bio-Merieux，50410）按照厂商的指示说明对分离的菌株进行糖发酵反应，试验结果由APILABPLUS(Version3.3.3，Bio-Merieux，France)程序和标准鉴定。
所述戊糖乳杆菌的发酵方法为：将戊糖乳杆菌按与培养基的体积比为1:6的接种比例接种在MRS液体培养基中，37℃培养箱中培养18～36h，取发酵液5ml接种入45ml的MRS液体培养基中，同样培养条件下扩大培养18～36h，取发酵后的50ml发酵液接种入450ml的MRS液体培养基中，继续同样培养条件下扩大培养18～36h，然后将培养液在4000g离心5～8min，取200ml上清液浓缩7倍至粘稠膏状，得到本发明所使用的活性发酵液。
所述MRS液体培养基的组成：阮蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g，聚山梨醇酯80 1.0g，拧檬酸二钠 2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.05g，磷酸二氢钾2.0g，蒸馏水1L，pH为6.5±0.2，121℃灭菌20min。
辣椒疫霉菌的培养方法：将活化过的辣椒疫霉菌试管斜面，用生理盐水清洗两次，最后将菌液稀释至2×108个／mL左右，或用分光光度计测定，650nm下的透光率为20%。保存备用。
采用牛津杯法对辣椒疫霉菌进行抑制试验：（1）制备下层培养基：30g黑麦加蒸馏水250ml，然后加热煮20-30min，然后再加入蔗糖10g，琼脂粉7.5g，待其完全溶解后加水至500ml，121℃灭菌15min，无菌条件下在已灭菌的培养皿中分装下层培养基；（2）制备上层培养基：取50℃的下层黑麦培养基200ml，加入辣椒疫霉菌悬液10ml，混合均匀备用。50℃的培养基可通过将高温灭菌的培养基稍微冷却后放在50℃的恒温水浴锅中保温30min来制备。（3）培养：在凝固后的下层培养皿加入5ml混合有辣椒疫霉菌的上层培养基，将培养皿来回倾侧，使含菌的上层均匀分布，上层培养基凝固后在每个培养皿内间隔放置4只牛津杯，然后用无菌滴管或移液抢将制备的戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus）测试品溶液加到牛津杯内，液面与杯面齐平。然后小心将培养皿移至37℃恒温箱中培养5--7天。观察记录培养皿中抑菌圈直径，每个测试样品设3个重复，并以未接菌株的MRS液体培养基为对照，得到测试样品对辣椒疫霉菌的抑制率，以抑菌圈大小评定样品对辣椒疫霉菌的抑制作用。
本发明所述的戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus）发酵液在制备抑制辣椒疫霉菌生物制剂中的应用。
本发明的有益效果是：由于使用的是生物发酵液，避免了作物、蔬菜使用化学农药导致的化学农药残留，保证了作物、蔬菜的食用安全性。也减轻了化学农药在土壤中的蓄积量，防止了化学农药对土壤的污染。微生物性材料在土壤中不会产生污染。使地球上的人类及生物能够正常生长与世代繁衍。抑制率[未发病的植株×（1-发病率%）÷调查植株×发病率%×100％]能够达到87%，戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus）发酵上清液对辣椒疫霉菌具有明显的抑制作用，能够用于制备防治辣椒疫霉菌的生物制剂。
附图说明
图1为戊糖乳杆菌的形态结构图，图中A为戊糖乳杆菌在MRS培养基上培养5-7d的菌落图，B为×40倍显微图，C为×100倍显微图；图2为戊糖乳杆菌对辣椒疫霉菌抑菌实验的结果图，图中：A为浓缩7倍后的上清液，B为未浓缩的上清液，C为未接菌株的MRS液体培养基对照；图3为辣椒苗发病情况，图中a为辣椒苗发病茎，b为辣椒苗发病叶。
具体实施方式
实施例1：戊糖乳杆菌的分离纯化及鉴定
从四川泡菜老汤(取自于中国农业大学东校区东门的川菜酒家；NaCl浓度为4.75%，pH是4.19）中分离得到，代号为sp，具体的分离方法为采用具体的分离方法为采用稀释108涂布平板方法（采用MRS液体培养基进行分离，于37℃培养箱中培养，培养基具体配方如下所示）,通过连续画线平板法纯化，应用API50CH试剂条和API50CHL培养基（Bio-Merieux，50410）按照厂商的指示说明对分离的菌株进行糖发酵反应，试验结果由APILABPLUS(Version3.3.3，Bio-Merieux，France)程序和标准鉴定(API50CH鉴定结果如表一所示）。
分离纯化的菌落较小，为乳白色，边缘圆整，呈球状，且结合由APILABPLUS程序和标准鉴定的API50CH试剂分析结果可知，分离纯化的菌种为戊糖乳杆菌。
表1 API50CH试剂分析结果
Table 1 Reagent from AP150CH reagents
Figure 233959DEST_PATH_IMAGE002
+: Positive reaction; -: Negative reaction.
实施例2：戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus）对辣椒疫霉菌的抑制实验
1.戊糖乳杆菌Lactobacillus Pentosus发酵上清液的制备
将保藏的戊糖乳杆菌（CGMCC No.1919）接种在MRS液体培养基中（两者的体积比例1:6），于37℃培养箱中培养18～36时，取发酵液5毫升接入45毫升MRS液体培养基中，在同样培养条件下扩大培养，将发酵后的50毫升发酵液接入450毫升MRS液体培养基中，再在同样培养条件下扩大培养。将培养液在离心力为4000g离心5～8分钟，将上清液收集浓缩7倍至粘稠膏状。
所述MRS液体培养基的组成：阮蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g，聚山梨醇酯80 1.0g，拧檬酸二钠 2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.05g，磷酸二氢钾2.0g，蒸馏水1L，pH为6.5±0.2，121℃灭菌20min。
2.辣椒疫霉菌悬液的制备
将活化过的辣椒疫霉菌试管斜面，用生理盐水洗下，离心沉淀，菌体再用生理盐水洗一次，最后将菌液稀释至2×108个／毫升左右，或用分光光度计测定，650nm下的透光率为20%。保存备用。
3.戊糖乳杆菌微生物材料对辣椒疫霉菌抑菌实验
采用牛津杯法对辣椒疫霉菌进行抑制试验：（1）制备下层培养基：称取黑麦30g加蒸馏水250mL，然后加热搅拌煮20-30min使其溶解，再加入蔗糖10g，琼脂粉7.5g，待其完全溶解后加水至500mL，121℃灭菌15min，无菌条件下在已灭菌的培养皿中分装下层培养基；（2）制备上层培养基：取50℃的下层黑麦培养基200ml，加入辣椒疫霉菌悬液10ml，混合均匀备用。50℃的培养基可通过将高温灭菌的培养基稍微冷却后放在50℃的恒温水浴锅中保温30min来制备。（3）培养：在凝固后的下层培养皿加入5ml混合有辣椒疫霉菌的上层培养基，将培养皿来回倾侧，使含菌的上层均匀分布，上层培养基凝固后在每个培养皿内间隔放置4只牛津杯，然后用无菌滴管或移液抢将制备的戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus）测试样品溶液加到牛津杯内，液面与杯面齐平。然后小心将培养皿移至37℃恒温箱中培养5--7天。观察记录培养皿中抑菌圈直径，每个测试样品设3个重复，并以未接菌株的MRS液体培养基为对照，得到测试样品对辣椒疫霉菌的抑制率，以抑菌圈大小评定样品对辣椒疫霉菌的抑制作用。
微生物材料戊糖乳杆菌对辣椒疫霉菌抑菌实验的结果见图2，抑菌圈直径见表2，统计分析表1中所得数据可以得出戊糖乳杆菌Lactobacillus Pentosus发酵上清液对辣椒疫霉菌的抑制效果显著高于对照实验，且浓缩7倍戊糖乳杆菌Lactobacillus Pentosus发酵上清液显著高于未浓缩发酵上清液，说明戊糖乳杆菌Lactobacillus Pentosus发酵上清液对辣椒疫霉菌有抑制作用，可作为防治辣椒疫霉菌的材料。
表2 扩散法检测Lactobacillus Pentosus发酵上清液抑菌圈直径
Figure 151100DEST_PATH_IMAGE004
实施例3：戊糖乳杆菌对辣椒疫霉菌的防治效果
采用大田试验检测戊糖乳杆菌对辣椒疫霉病的防治效果。移栽4叶期健壮辣椒苗3 棵。设置为：①对照1：土壤不接种任何微生物；②对照2：土壤接种辣椒疫霉菌；③处理实验：土壤同时加入戊糖乳杆菌发酵上清液(原液，未浓缩，也未稀释)和辣椒疫霉菌。辣椒疫霉菌接种量为 1g 风干土500 ～ 800 个孢子囊； 戊糖乳杆菌发酵上清液在辣椒栽好时,从根部均匀浇入10ml。每个处理6株,试验重复三次。所有对照及处理在移栽后7、14d调查、统计发病情况，计算发病率，计算公式为：发病率=发病株树/调查总株数×100％。结果见表3，辣椒苗发病情况见图3。
辣椒苗移栽后 7d, 未做任何处理对照1的辣椒苗无一株发病； 接种病原菌孢子囊对照 2 的发病率达 92 %； 处理的发病率为 14 %。移栽后 12d , 所有处理植株发病率开始增加, 但处理实验发病率增加最少, 为 15 % , 与其他处理差异达显著水平。可能此时处理中培养滤液中的拮抗物质已经被植株或土壤中的微生物代谢利用或者失活。戊糖乳杆菌发酵上清液在移栽后的 5 ～ 7d 内可以抑制病菌的侵入, 由此可见, 戊糖乳杆菌代谢产生的拮抗物质在病害的防治初期起重要作用。
表 3 不同处理对辣椒疫病的控制作用 (%)
Figure DEST_PATH_IMAGE006
注：表中数据为两次试验发病率的平均值；同一行不同小写字母表示差异达 0.05显著水平。

Claims (2)

1.一株戊糖乳杆菌发酵液在制备抑制辣椒疫霉菌生物制剂中的应用，其特征在于：所述戊糖乳杆菌发酵液由如下方法制备而成：
（1）戊糖乳杆菌（Lactobacillus Pentosus）已于2007年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏号为CGMCC No.1919；
（2）将戊糖乳杆菌按与培养基的体积比为1:6的接种比例接种在MRS液体培养基中，37℃培养箱中培养18～36h，取发酵液5ml接种入45ml的MRS液体培养基中，同样培养条件下扩大培养18～36h，取发酵后的50ml发酵液接种入450ml的MRS液体培养基中，继续同样培养条件下扩大培养18～36h，然后将培养液在4000g离心5～8min分离菌液和菌体，取上清液浓缩7倍至粘稠膏状，得到所使用的活性发酵液。
2.根据权利要求1所述的一株戊糖乳杆菌发酵液在制备抑制辣椒疫霉菌生物制剂中的应用，其特征在于：所述MRS液体培养基的组成为：阮蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g，聚山梨醇酯80 1.0g，柠檬酸二钠2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.05g，磷酸二氢钾2.0g，蒸馏水1L，pH为 6.5±0.2，121℃灭菌20min。
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