CN1988919A - 包含脂质体的射线照相造影剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包含脂质体的射线照相造影剂，其包含了在脂膜内部和外部的水相中都含有的水溶性碘化合物。脂质体是通过将构成脂膜的脂膜组分与超临界或亚临界二氧化碳在至少一种含有羟基或聚氧化亚烷基的化合物的存在下相混合而制备得到的。得到的射线照相造影剂不含任何毒性溶剂如含氯溶剂，因而能够保证具有很高的安全性。

Description

包含脂质体的射线照相造影剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及包含脂质体的射线照相造影剂及其制备方法，具体涉及包含脂质体囊泡的射线照相造影剂，钙造影剂是通过将脂膜组分与超临界或亚临界二氧化碳在至少一种含有羟基或聚氧化亚烷基的化合物的存在下混合形成的，并且非离子型碘化合物被高效且稳定地包封在脂质体内。

发明背景

利用X射线检查和诊断是当今医学影像诊断的核心。所谓的硬组织如骨骼和牙齿能够有效地吸收X射线，因此可以得到高对比度的X射线影像。反之，不同的软组织之间吸收X射线的差别相对小，难于获得高对比度的影像。在这种情况下，通常使用造影剂来获得高对比度的影像。

当前实际应用的X射线造影剂几乎全部都是含有三碘苯基基团的水溶性化合物的造影剂材料。将造影剂送入内腔区域中，例如血管、输尿管或者输卵管，用来检查内腔的形状或狭窄。然而，上述化合物迅速从内腔区域流出，没有与组织或疾病区域相互作用，这不利于对组织或疾病区域具体例如癌组织的详细检查。所以，期望有一种X射线造影剂能够选择性积聚在目标组织或疾病区域之内/或之上，由此获得和周围或其他区域具有清晰对比区别的影像。

转运作为细小微粒且能增长血液中对靶组织的半衰期的造影剂的技术能够有效克服上述问题。有方法研究了将造影剂化合物包封在脂质体内，该脂质体由与生物膜类似的类脂构成，并且显示出低抗原性。例如，国际公开WO88/09165、WO89/00988、WO90/07491、JP-ANO.07-316079和2003-5596(在下文中，术语JP-A指日本专利申请公开)提出了一种包含非离子型造影剂的脂质体。此外，在上面的方法中，尽管脂质体作为原料在体内显示出高度安全性和最佳降解性，然而在制备过程中使用了有机溶剂，特别是含氯溶剂如氯仿和二氯甲烷，作为磷脂形成脂质体膜的溶剂(专利文件1)。因此，由于残留溶剂的毒性，上述方法均不能进行实际应用(专利文件2)。

从另一方面来说，尽管脂溶性的化学物质易于被包封在脂质体内，但是由于其它因素包封量不一定很大。尽管通过化学物质的电荷与带电类脂电荷的相互作用，水溶性电解质也能被包封在脂质体内，但是对于水溶性的非电解质，上述方法是行不通的。通常期望将基本上表现出低毒性的非离子型碘化合物而不是离子型造影剂化合物包封在脂质体内，从上述的原因来看，这并非易事。此外，成型的脂质体容易形成多层膜，并且碘化合物的包封率低。将水溶性的非电解质有效的包封在脂质体内的方法包括，例如，反相蒸发法和***注射法。然而，在这些方法中使用了有机溶剂，会产生安全性问题。

JP-A NO.2003-119120(专利文件3)公开了一种通过使用超临界二氧化碳制备含有脂质体的化妆品或者皮肤外用药品的方法，该方法具体实施在制备皮肤外用药品中，使亲水性和疏水性的药用成分密闭在脂质体内。然而，尽管其中公开了水溶性电解质作为药用成分的例子，但是水溶性非电解质通过这种方法是否能有效地包封在脂质体内是不清楚的。此外，这种方法需要利用辅助溶剂如乙醇来提高包封率，导致不使用有机溶剂就很难制备具有相对高包封率的脂质体。即使造影剂材料能够很好的包封在脂质体内，一些问题例如随着时间推移造影剂的泄漏或者由于脂质体自身环境而变得不稳定都是必须要考虑的。进一步指出因为脂质体导入生物体后几乎总是陷进网状内皮组织***中，例如肝或脾，因而并没有达到预想的效果(Cancer Res.，43，5328(1983))。与包含自由形式的碘化合物的常规射线照相造影剂不同的是，当碘化合物包封在脂质体内，存在于脂质体内部和外部的造影剂材料的形式、包封率等等会影响造影剂的性能。因此，仍然期望一种制备脂质体的方法，其能够有效地包封和稳定地保留非离子型碘化合物，并且不会产生安全性问题。

正如上文中所讨论的，已经开展了广泛的研究来解决这些问题。本发明已经形成一个结论，即利用脂质体对造影剂材料的保留可以通过脂质体结构(其通常由脂质双分子层组成)、其稳定性和碘化合物的稳定包封而进行改进。

因此，本发明的目的在于提供一种射线照相造影剂，其通过将造影剂材料包封在脂质体囊泡内而显示出增强了的转运效率和选择性。

具体地，本发明的目的在于提供一种包含脂质体的射线照相造影剂及其制备方法，其中碘化合物被有效且稳定地包封了并且没有使用毒性有机溶剂及其制备方法。

专利文件1：日本专利NO.2619037

专利文件2：JP-A NO.7-316079

专利文件3：JP-A NO.2003-119120

发明内容

上述目的是通过以下方案实现的。

本发明直接涉及制备含有脂质体的射线照相造影剂的方法，该方法包括将磷脂和甾醇溶解在超临界或亚临界二氧化碳中，在含有羟基或聚氧化亚烷基的化合物的存在下，向其中加入含有碘化合物的水溶液形成胶束，排出二氧化碳形成包封了碘化合物的脂质体囊泡。

在上述制备射线照相造影剂的方法中，含有羟基或聚氧化亚烷基的化合物优选含有聚氧化亚烷基的化合物。

含有聚氧化亚烷基的化合物优选含有聚氧化亚烷基的类脂，更优选含有聚氧化乙烯基的类脂。

上述含有羟基或聚氧化亚烷基的化合物优选包含的量为超临界或亚临界二氧化碳重量的0.01到1％。

包含的碘化合物优选碘原子的量每ml造影剂为100到350mg的I。

碘化合物优选非离子型碘化合物。具体地，碘化合物优选至少选自下面组中的一种：碘美普尔(iomeprol)、碘帕醇(iopamidol)、碘海醇(iohexol)、碘喷托(iopentol)、碘普胺(iopromide)、碘昔兰(ioxilane)、碘西胺(iosimide)、iobenzol、碘曲仑(iotrolan)、碘克沙醇(iodixanol)、碘西醇(iodecimol)、碘酞硫(iotasl)、甲泛葡胺和1，3-双[N-3，5-二-(2，3-二羟丙基氨基羰基)-2，4，6-三碘苯基]-N-羟基乙酰基-氨基]-丙烷，更优选至少选自下面组中的一种：碘美普尔、碘帕醇、碘海醇、碘普胺、碘昔兰、碘酞硫、碘曲仑和碘克沙醇。

脂质体囊泡分散在水介质中，优选重量为70％到90％的碘化合物没有包封在脂质体囊泡内，而是存在于水介质中。

造影剂中含有的全部类脂优选每ml造影剂为20到100mg。

包封在脂质体囊泡内的碘化合物与全部类脂的重量比优选为3到8(g/g)。

脂质体优选基本上由单层或数层囊泡构成。

包含的碘化合物优选按照碘原子量计为每ml造影剂200到300mg的I(优选240到300mg I每ml造影剂)，与造影剂中包含的全部类脂一起为20到80mg/ml。

磷脂(不包括PEG-磷脂)与甾醇的摩尔比优选从100/60到100/90。

磷脂(不包括PEG-磷脂)与含有聚氧化亚烷基的类脂的摩尔比优选从100/5到100/10。

上述脂质体囊泡优选平均尺寸为0.05到0.8μm。

含有碘化合物的水溶液优选包含选自水溶性胺缓冲液、乙二胺四乙酸钙二钠(或EDTA Na₂-Ca)、无机盐、渗透压调节剂和防腐剂中的至少一种。

存在于脂质体囊泡内部和外部的水相均优选包含作为盐酸盐、磷酸盐或碳酸氢盐的阳离子，且需满足以下要求：

[Na⁺]+126.[Ca²⁺]+50.[K⁺]≤130其中[Na⁺]是指含量为20到70mM的钠离子，[Ca²⁺]是指含量为0.1到0.6mM的钙离子和[K⁺]是指含量为0.4到0.8mM的钾离子，以及镁离子的含量为0.5到0.8mM。

下面对本发明进行详细描述。

本发明涉及制备包含了脂膜内部水相中含有碘化合物的脂质体囊泡的射线照相造影剂，脂质体的制备是在含有羟基或聚氧化亚烷基的化合物的存在下，通过将形成脂膜的脂膜组分与超临或亚临界二氧化碳混合，并且脂质体基本不含任何含氯试剂或其他有机溶剂。

射线照相造影剂

脂质体通常是形成了脂膜结构，即脂质双分子层。本发明的射线照相造影剂包含了基本不合含氯溶剂的脂质体，其中作为造影剂材料的碘化合物被包封在脂膜内部的水相中。在一个优选的实施方案中，造影剂包含了在脂质体膜内部的水相中和分散脂质体囊泡的水介质中的碘化合物和至少一种辅助性添加剂(药用辅助制剂)，其中各自的浓度优选在膜内和膜外基本相同。术语“基本相同”是指彼此的浓度几乎一样。在说明书中，把脂质体膜也称作脂膜。

辅助性添加剂是指与造影剂材料一起加入的化合物，根据制备造影剂的技术可以使用多种物质。其中具体的例子包括生理可接受的缓冲剂、螯合剂如EDTA Na₂-Ca(或为乙二胺四乙酸二钠钙盐)或EDTA Na₂(或为乙二胺四乙酸二钠盐)以及任选的渗透压调节剂、稳定剂、抗氧化剂如α-维生素E和粘度调节剂。优选的包括水溶性胺类缓冲剂和螯合剂。作为pH缓冲剂，优选胺类缓冲剂和碳酸盐缓冲剂，其中更优选胺类缓冲剂并且特别理想的是氨丁三醇(又被称为氨基三丁醇或2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇)。螯合剂优选EDTA Na₂-Ca(乙二胺四乙酸二钠钙盐)。

水介质是指主要由可溶解碘化合物或辅助性添加剂的水组成的溶剂。这里是指不含放热材料的可使用的灭菌水。除了脂质体膜内部的水相之外(或叫做包封水溶液)，还有一种水溶液，即其中分散了脂质体囊泡的水介质，也包含碘化合物和辅助性添加剂，如水溶性的胺类缓冲剂或螯合剂。因此，膜内外的渗透压没有差别，由此可保持脂质体的结构稳定。

造影剂化合物

可用于造影剂材料的碘化合物优选水溶性碘化合物。任何可用作造影剂的离子或非离子型的水溶性碘化合物均可应用于本发明中。非离子的碘化合物，由于通常比离子型碘化合物显示出较低的渗透压而优选。特别地，本发明优选含有至少一个碘代苯基基团如2，4，6-三碘苯基基团(例如，非离子型三碘苯甲酸类)的水溶性非离子型碘化合物。这种碘化合物优选按照碘原子的量为100到350mg I/ml造影剂被包含。

优选的非离子型碘化合物的例子包括碘美普尔、碘帕醇、碘海醇、碘喷托、碘普胺、碘昔兰、碘西胺、iobenzol、碘曲仑、碘克沙醇、碘西醇、碘酞硫、甲泛葡胺和1，3-双[N-3，5-二-(2，3-二羟丙基氨基羰基)-2，4，6-三碘苯基]-N-羟基乙酰基-氨基]-丙烷。

其中，更优选碘美普尔、碘帕醇、碘海醇、碘普胺、碘昔兰、碘酞硫、碘曲仑和碘克沙醇。

此外，非离子型碘化合物的例子包括泛影酸、泛影酸钠、泛影葡甲胺、醋碘苯酸及其可溶性盐、尿影酸、碘达酸、胆影酸钠、胆影葡甲胺、碘马尿酸及其可溶性盐、碘代甲胺酸(iodomethamic acid)、碘吡拉啥、碘-2-吡啶酮-N-乙酸、3，5-二碘-4-吡啶酮-N-乙酸(碘吡拉啥)、上述酸类的二乙基铵盐、碘拉酸、甲泛影酸及其盐、碘番酸、碘醋胺酸、碘芬酸及其可溶性盐、sodium thyropanoate、碘泊酸钠和其它类似的碘化合物。

优选造影剂中包含的全部碘化合物重量的70％到95％不是包封在脂质体囊泡内部，而是存在于分散囊泡的水介质中。

全部类脂含量优选为20到100mg每ml造影剂。

包封在脂质体囊泡内的碘化合物与上述全部类脂重量比优选为3到8(g/g)。

脂质体囊泡均优选为单层囊泡或数层囊泡，数层囊泡是指一个囊泡由几层脂膜组成。

本发明的造影剂中的全部类脂含量优选为20到100mg/ml，更优选为20到80mg/ml，更优选为40到90mg/ml，最优选为50到80mg/ml。在这里，全部类脂是指形成脂质体的所有类脂，包括磷脂、甾醇和乙二醇。全部类脂可以基本上认为是造影剂中包含的脂质体的量。然而，脂质体存在多种形式，因此全部类脂的量不能简单的相当于脂质体的量。作为本发明的射线照相造影剂的一个目的，为了获得输送的效率，脂质体优选尽可能多的包封碘化合物，但是过高浓度的溶液会带来比如脂质体囊泡的凝结或者造影剂粘度的增加等麻烦。

这些碘化合物可以单独使用也可联合使用。应用于本发明中的碘化合物并不限于上述所列举的化合物，并且不仅包括游离形式还包括其盐和水合物形式。

在本发明中适合作为射线照相造影剂的碘化合物优选碘美普尔、碘帕醇、碘曲仑和碘克沙醇，它们即使在相对高的浓度中也显示出高亲水性和低渗透压。特别是二聚的非离子型碘化合物如碘曲仑和碘克沙醇更具优势，因为当在相同的碘浓度中制备时，它们制备得到的造影剂有更低的总分子量，会使渗透压降低。

根据本发明的造影剂中含有的水溶性碘化合物的浓度可根据以下因素任意设定：例如造影剂化合物的性质、作为药物的预期剂量和临床指南。脂质体内包封的水溶性碘化合物的量一般占造影剂包含的全部碘化合物重量的5％到95％，优选5％到90％且更优选5％到70％。特别地，本发明中为了防止脂质体内包封的碘化合物不稳定，脂质体内包封的水溶性碘化合物通常占全部碘化合物重量的5％到35％，优选5％到30％，更优选5％到25％。如果被包封在脂质体囊泡内的水溶性碘化合物的比例占到造影剂中包含的全部碘化合物重量的5％到30％(优选重量的5％到25％)，被包封的碘化合物流出到囊泡外的水分散体中，其中残留物占重量的70％到95％(或者重量的75％到95％)，基本上可以被忽略。相应地，由于脂质体渗透压的影响，碘化合物的包封能够防止不稳定性，从而增强造影剂材料的稳定性。

根据前述，造影剂脂膜内部的水相中包封的碘原子的重量为10到200mg/ml，优选20到180mg/ml，更优选70到110mg/ml。这也是由前面的包封率和全部碘含量定义的参数。

脂质体

在本发明的射线照相造影剂中，上述造影剂化合物以脂质体内包封物的形式被使用，脂质体作为一种微型载体能够有效且有选择地将造影剂化合物转运到目标区域例如靶器官或组织。应用脂质体的造影剂能增加在血液中的保留时间，促进血液的稳定性，由此获得有效的药物转运和靶向作用。需要通过与保留效果密切相关的改进如稳定的脂质体结构和包封材料的保留稳定性以及一些特性如血液稳定性和血液保留性从而产生EPR(增强的渗透性和保留时间)效果，其对获得极佳的肿瘤影像很有效。

在本发明的射线照相造影剂中，适当设计囊泡尺寸和包封造影剂化合物的脂质体双分子膜能够获得靶向作用，其中主动靶向作用和被动靶向作用都已考虑到了。前者通过调整囊泡尺寸、类脂成分或者脂质体的电荷能够控制生物学行为。通过随后描述的方法可以很容易地将脂质体的尺寸调整到狭窄的范围。脂质体膜表面的设计可以通过改变磷脂的种类和组分及包封材料来完成以提供想要得到的特性。

还应考察主动靶向的引入，它能够提高造影剂的完整性和选择性。例如，引入能够控制向靶向区域的指引过程的聚氧化亚烷基或者聚乙二醇(PEG)的聚合物链，是非常有好处的。适合本发明造影剂的脂质体是表面经聚氧化亚烷基或者PEG修饰的能够延长在血液中的保留时间的脂质体和不容易被网状内皮组织细胞如肝脏吞噬(binged)的脂质体。没有到达癌组织或者发病区域的造影剂，并没有积聚在正常区域，而是在由脂质体降解引起副作用之前就被排出体外。这可以通过在脂质体设计中优化控制脂质体的稳定性与向外排出的时间关系而实现。碘化合物作为造影剂材料能够迅速经肾排入尿中，因此能够阻止由体内无效保留引起的不利影响和延迟副作用的发生。

通常优选磷脂和/或糖脂作为脂质体脂膜(或脂双层)的组分。在本发明中，射线照相造影剂中包含的脂质体，如下所述地，是在至少一种含有羟基或聚氧化亚烷基的化合物的存在下，通过将形成脂膜的组分与超临界或亚临界二氧化碳混合而制备的。

脂质体中优选的中性磷脂的例子包括从大豆或蛋黄中得到的卵磷脂和溶血卵磷脂，以及它们的氢化产物或氢氧化衍生物。此外，磷脂的例子还包括：磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和神经鞘磷脂，它们都来源于蛋黄、大豆或其它动植物，或者通过半合成的方法获得；或通过合成的方法得到磷脂酸、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸(DSPS)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二棕榈酰磷脂酰肌醇(DPPI)、二硬脂酰磷脂酰肌醇(DSPI)、二棕榈酰磷脂酸(DPPA)和二硬脂酰磷脂酸(DSPA)。

用于本发明的阳离子类脂的例子包括1，2-二油酰氧-3-(三甲铵)丙烷(DOTAP)、N，N-双十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)、二甲基十八烷基溴化铵(DDAB)、N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、2，3-二油酰氧-N-[2(精胺-碳氧酰氨)乙基]-N，N-二甲基-1-丙烷三氟乙酸铵盐(DOSPA)和N-[1-(2，3-二肉豆蔻氧)丙基]-N，N-二甲基-N-(2-羟乙基)溴化铵(DMRIE)。

阳离子磷脂的例子包括磷脂酸和氨基醇的酯，例如，二棕榈酰磷脂酸(DPPA)或二硬脂酰磷脂酸(DSPA)和羟基乙二胺的酯。包含的这些阳离子的重量是全部类脂重量的0.1％到5％，优选重量的0.3到3％，更优选重量的0.5％到2％。

这些磷脂可以单独使用也可以两种或两种以上联合使用。优选所用的两种或两种以上带电磷脂带同种电荷，即全带负电或全带正电，这样可以防止脂质体的凝集。中性磷脂和带电磷脂联合使用优选重量比为200∶1到3∶1，更优选100∶1到4∶1，且更优选40∶1到5∶1。

甘油糖脂的例子包括甘油类脂，例如双半乳糖甘油二酯和双半乳糖甘油二酯硫酸酯；鞘氨醇糖脂如半乳糖甘油酯、半乳糖甘油酯硫酸酯、乳糖甘油酯、神经节苷脂G7、神经节苷脂G6和神经节苷脂G4。

除了上述的类脂外，也可以选择性的含有其它物质作为脂膜的组分。例如，用作脂层稳定剂的有胆固醇、二氢胆固醇、胆固醇酯、植物甾醇、谷甾醇、豆甾醇、油菜甾醇、胆甾烷醇、羊毛甾醇和2，4-二羟基羊毛甾醇。此外，甾醇的衍生物例如1-O-甾醇半乳糖甙、1-O-甾醇麦芽糖甙和1-O-甾醇半乳糖甙显示对稳定脂质体有效(参见JP-A No.5-245357)，并且前面所述的甾醇，特别优选胆固醇。

甾醇的用量通常为磷脂重量的0.05到1.5倍，优选重量的0.2到1倍，更优选重量的0.3到0.8倍，。小于重量的0.05倍不能通过增强混合类脂的分散性而起到稳定作用，大于重量的2倍会抑制脂质体的形成或得到不稳定的形式。

被包封在脂膜内的胆固醇能够起到像锚(anchor)一样的作用用来将聚氧化亚烷基引入。具体地，胆固醇作为脂膜组分包含在脂质体中，可以选择性地经锚与聚氧化亚烷基基团连接。短链的烯基或氧化烯基可被用作锚。JP-ANo.9-3093公开了新的胆固醇衍生物，其中多种活性物质能够有效的固定在聚氧化烯烃链的上部，用作脂质体的组分。

所用的甾醇优选磷脂(不包括PEG-磷脂)/甾醇的摩尔比为100/60到100/90，更优选100/70到100/85。摩尔比是基于不包括PEG-磷脂的磷脂的量。摩尔比小于100/60不能通过类脂混合物的分散作用达到稳定作用。

除了上述的甾醇之外，也可以加入二醇作为脂质体囊泡膜的组分。在制备脂质体时，磷脂与二醇一起加入能增强包封在脂质体囊泡内的水溶性碘化合物的持有率。二醇的例子包括乙二醇、二甘醇、三甘醇、丙二醇、一缩二丙二醇、1，3-丙二醇、1，4-丁二醇、1，5-戊二醇、新戊二醇、1，6-己二醇、1，7-庚二醇、1，8-辛二醇、1，9-壬二醇、1，10-癸二醇和频哪醇。二醇的用量优选为全部类脂重量的0.01％到20％，更优选重量的0.5％到10％。

其它的添加剂化合物包括，例如，提供负电荷的物质、磷脂酸烷基酯如二乙酰磷酸酯和提供正电荷的物质，脂肪胺如硬脂酰胺。

制备脂质体时，利用含有羟基或聚氧化亚烷基(PAO)基团的化合物(优选含有聚氧化亚烷基或类似基团的磷脂或胆固醇)和超临界或亚临界状态下的二氧化碳会产生显示出相对高包封率的脂质体，且没有使用有机溶剂。为了克服一些问题如被网状内皮组织细胞俘获和脂质体本身的不稳定性如破坏或凝集，试图引入聚合物链如聚乙二醇(PEG)链(又称为聚氧化乙烯基基团，(CH₂CH₂O)_n-H)到脂质体表面，参见JP-A NO.1-249717中的和FEBS letters268，235(1990)中的描述。

将聚氧化亚烷基链(又称为聚氧化烯基链)或PEG链连接到脂质体囊泡的表面上能够给脂质体带来新的作用。例如，这种PEG修饰的脂质体预计对于免疫***具有更低的可识别性(所谓的隐身状态)。已经证明脂质体具有亲水倾向会促进血液稳定性，从而在很长一段时间可稳定地保持血液浓度，参见Biochim.Biophys.Acta.，1066，29-36(1991)。JP-ANO.2002-37833中公开了一种技术，其中经聚氧化亚烷基修饰的磷脂混入脂质体膜中，来增加脂质体在血液中的保留时间。这种脂质体还显示出改善的老化稳定性。

上述性质能够使本发明的射线照相造影剂具有器官-特异性。例如，因为类脂成分容易积聚在肝脏，使用未含有或含有微量PEG的脂质体预计有所选择性的与肝脏对照。增加囊泡的尺寸到200nm或更大导致肝脏枯否氏细胞(Kupffer cells)吞噬作用迅速合并的可能性增加，引起在所述肝脏位点中的积聚。在给肝癌成像时，由于癌组织的枯否氏细胞比正常细胞少，造影剂脂质体合并的量较少，能形成清晰的对照。

在其它器官的成像情况中，通过引入PEG，脂质体成了隐身状态，在肝脏中的聚集变的困难，所以，推荐使用PEG修饰的脂质体。PEG的引入形成了水合球体，从而稳定脂质体和增强血液保留。通过改变PEG中氧化乙烯单元的长度和引入比例，可以调整其功能。作为PEG优选具有10到3500(优选100到2000)个氧化乙烯单元的聚乙二醇。按照构成脂质体的类脂量，优选含有PEG为重量的1％到40％，更优选重量的5％到25％。

脂质体中的PEG进行修饰可以通过公知技术来完成。例如，连接在一种锚式化合物(如胆固醇)上的聚乙二醇(PEG)基团与作为膜组分的磷脂相混合形成脂质体，该锚式化合物可与活化的PEG基团相连接。由于引入脂质体表面的PEG基团与将在下面陈述的功能性材料(“functional material”)不发生反应，很难将功能性材料固定在脂质体表面上。与其相反，顶端经化学修饰的PEG与磷脂结合，而作为制备脂质体的组分。

可引入公知的聚氧化亚烷基基团代替聚乙二醇，聚氧化亚烷基基团用通式-(AO)_n-Y表示，其中AO为具有2至4个碳原子的氧化烯基基团；n表示平均加成摩尔数，为1至2000的整数(优选10到500，更优选20到200)；Y为氢原子、烷基基团或者官能团。

具有2至4个碳原子的氧化烯基基团的例子包括氧化乙烯基基团、氧化丙烯基基团、氧化三亚甲基基团、氧化四亚甲基基团、氧-1-乙基乙烯基基团和氧-1，2-二甲基乙烯基基团。

当n≥2时，两个以上的氧化烯基可相同或不同。对于后者，氧化亚烷基可以以随机的形式或者嵌段共聚的形式而不同。为了使氧化烯基具有亲水性，优选只用氧化乙烯进行加成聚合反应，其中n优选≥10。在不同的氧化烯基之间发生加成聚合反应的情况中，预计至少20mol％(优选至少50mol％)的氧化烯基进行了加成聚合。为了使氧化烯基具有亲油性，优选增加除氧化乙烯之外的烯化氧的摩尔浓度。例如，包含聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物(或称聚氧乙烯嵌段共聚聚氧丙烯)的脂质体是本发明优选的一种实施例。

上述的Y的官能团是将功能性物质如糖、糖蛋白、抗体、凝集素和细胞粘合因子连接到聚氧化亚烷基上的基团，其中具体实例包括氨基、氧化羰基咪唑基团和N-羟基琥珀酰亚胺。

锚向聚氧化亚烷基链且上部结合了前述的功能性物质的脂质体，不仅显示出由于引入聚氧化亚烷基基团的效果，还能给出功能性物质全面的作用，例如，识别部件的功能，如对具体器官的方向性和对癌组织的方向性。为了具有对癌组织的方向性，将相对应于只存在在瘤细胞中的特定肿瘤抗原的抗肿瘤的单克隆抗体结合到脂质体膜上，从而为脂质体带来高的目标选择性(参见，例如，JP-A No.11-28087)。

含有聚氧化亚烷基的磷脂或胆固醇可单独使用或者联合使用。基于脂质体膜形成组分的总量计算，其含量优选为0.001到50mol％，更优选0.01到25mol％，且更优选0.1到10mol％。含量小于0.001mol％会导致降低预期效果。

关于磷脂聚氧化亚烷基衍生物为提出的经修饰的磷脂，由以下分子式表示(参见JP-A NO.7-165770)：

分子式

其中R₁和R₂分别为具有2至29个碳原子的烷基基团；M为氢原子或碱金属原子如钠或钾；AO、n和Y分别同上述定义。

其中具体实例包括磷脂酰胺的聚氧乙烯(PEO)衍生物等，如二硬脂酰磷脂酰二乙醇胺聚氧乙烯(DSPE-PEO)。此外，JP-ANO.2002-37883公开了用于制备水溶性的多聚体修饰的脂质体的、纯度极高的聚氧化亚烷基修饰的磷脂，显示出增强的血液保留性。还公开了在制备脂质体时使用具有相对低单酰基含量的聚氧化亚烷基修饰的磷脂会给脂质体分散体带来非常出色的老化稳定性。

脂质体的制备

根据本发明的射线照相造影剂的制备方法，其特征在于，在含有羟基或聚氧化亚烷基的化合物的存在下，将作为脂膜组分的磷脂和至少一种阳离子类脂和甾醇与超临界或亚临界二氧化碳混合，然后将碘化合物的水溶液导入其中形成胶束(双分子层胶束)，其后，排出二氧化碳形成包封了包含碘化合物的水性中心的脂质体囊泡。碘化合物的水溶液进一步优选含有辅助性添加剂。

这里还提出了多种制备脂质体的方法。不同的方法经常最终产生形状和性质差别很大的脂质体，参见JP-A NO.6-80560。所以，应根据所需脂质体的结构或特征选择最适合的制备方法。通常，通过将类脂组分如磷脂、甾醇和凝集素几乎没有例外地溶解于有机溶剂如氯仿、二氯甲烷、***、四氯化碳、乙酸乙酯、二噁烷或四氢呋喃(THF)中制备脂质体。特别地，经常使用含氯溶剂。这样制备的脂质体必然含有有机溶剂。因此，需要长时间多步骤的处理来去除残留的有机溶剂。很难将残留的有机溶剂特别是含氯溶剂完全去除，而这由于会对生物体产生副作用而引起关注。

制备本发明的脂质体，使用了利用超临界或亚临界二氧化碳的方法来避免上述问题。选择二氧化碳是因为它具有31.1℃的临界温度和75.3kg/cm²的临界压力且相对易于操作，为惰性气体且即使残留也对人体无毒，其高纯度液体价廉且容易获得。通过这种方法制备的脂质体包封碘化合物作为射线照相造影剂具有优势和优点，这将在下文中描述。

利用超临界或亚临界二氧化碳进行脂质体的制备，需要将脂膜组分溶解或分散在超临界状态(包括亚临界状态)下的二氧化碳中。溶解、分散或混合优选在作为助溶剂(或称为辅助性溶剂)的含有羟基或聚氧化亚烷基的化合物的存在下进行。

上述的含有羟基的化合物(或称为包含羟基的化合物)包括含有羟基、多元醇基团、聚亚烷基二醇醚基团、或者乙二醇/聚乙二醇醚基团的组合作为亲水性基团的化合物。优选使用含有羟基的化合物作为助溶剂，其显示出对脂膜组分如磷脂或胆固醇的亲合力且易于与其混合。显示出最佳的亲水性和亲油性的两亲型化合物适于将脂膜组分分散在极性二氧化碳流体(或液体)中。

糖类也被用作含有羟基的化合物。具体地，单糖包括，例如，己糖如脱氢抗坏血酸、季戊四醇、山梨醇、葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺和N-乙酰葡糖胺，以及戊糖如木糖、核糖和***糖。寡糖包括，例如，二糖如麦芽糖、乳糖、海藻糖和异麦芽糖、麦芽三糖、异麦芽三糖、甘露三糖、甘露三糖、麦芽四糖和麦芽五糖。此外多糖包括，例如，纤维素和直链淀粉(或为淀粉)，但并不限于这些。

由于担心残余助溶剂的毒性，根据安全性不使用低级醇作为含有羟基的化合物是可取的。考虑到有效性和安全性，助溶剂优选含有聚乙二醇基团的化合物，更优选含有聚乙二醇基团的类脂，其中优选具有10到3500个(优选100到2000个)氧化乙烯单元的聚乙二醇。

一种或多种含有羟基的化合物的使用能增加包封率。含有羟基的化合物被用作助溶剂，其优选用量为超临界或亚临界二氧化碳重量的0.01％到1％，且更优选重量的0.1％到0.8％。

本发明中所用的超临界或亚临界二氧化碳的温度通常是从25℃到200℃，优选从31℃到100℃，且更优选从35℃到80℃。其中压力通常是从50到500kg/cm²，优选从100到400kg/cm²，且特别优选90到150kg/cm²。

以下面的方式制备本发明中用作射线照相造影剂的脂质体。将液态二氧化碳加入到压力容器中且置于在上述适宜的压力和温度下的超临界状态或亚临界状态中。将作为脂质体脂膜组分的磷脂和稳定脂膜的材料在上述含有羟基的化合物的存在下溶解或分散在超临界(或亚临界)二氧化碳内。其中可加入阳离子的磷脂或含有聚氧化亚烷基的化合物(例如，聚氧化亚烷基修饰的磷脂)作为膜类脂。可选择地，将液态二氧化碳加入到预先加入上述化合物的压力容器内，且通过调整温度和压力置于超临界状态中。然后，将含有碘化合物的水溶液和任选的上述辅助性溶剂导入到已形成的含有磷脂和稳定脂膜材料的超临界二氧化碳中来形成胶束。加入部分和被加入部分是可以互换的。混合完成后，容器内部抽真空排出二氧化碳以形成脂质体内部包封了碘化合物的水分散体。在这种情况下，碘化合物还可被包含在除脂质体囊泡内部的水相之外的囊泡外面的水相中(外部水相)。既然上述的水溶液被包封在脂质体囊泡内部，则现在碘化合物不仅存在于外部水相中还主要存在于脂质体囊泡内部的水相中，处于所谓的内囊状态。此外，脂质体还要通过孔径为0.1到1.0μm(优选0.1到0.5μm)的多孔过滤器。然后，经药剂制备加工过程，如消毒处理和包装，本发明的射线照相造影剂就制备完成了。

已经证实通过超临界或亚临界二氧化碳制备脂质体具有脂质体高形成率、包封材料高包封百分率和脂质体内的被包封材料的高保持率，参见JP-ANO.2003-1191120。此外，本发明中的上述方法，甚至能达到工业化应用程度，能使非离子型水溶性物质在脂质体中得到有效包封，基本上不需任何有机溶剂，适用于制备本发明的射线照相造影剂。上述表述“基本上不需任何有机溶剂”是指残留的有机溶剂的含量不超过10μg/l。

射线照相造影剂的制备

用于本发明的射线照相造影剂的脂质体选自那些基本上由单层膜或数层膜组成的脂质体。单层膜的脂质体是指由单层的囊泡组成的脂质体，也就是说，由单一的磷脂双分子层形成的单层囊泡。基本上由单层膜组成的脂质体是指由磷脂双分子层构成，利用冷冻断裂复制技术经透射式电子显微观察其复制品，几乎均被识别为单层的。因此，当观察保留在碳膜上的微粒印记时，那种没有差别的可判断为单层囊泡，那种具有两种或两种以上差别的是多层囊泡。上述术语“基本上”的含义是指，以总脂质体的量也就是射线照相造影剂中含有的总囊泡量计，这种单层囊泡的量优选含有至少80％，更优选90％。

单膜脂质体或由数层膜组成的脂质体，即单层囊泡能够利用上述超临界二氧化碳作为类脂溶剂并经水相分离方法得到有效地制备。反之，在传统的脂质体制备方法中，脂质体由多层囊泡(MLV)构成，即通常多层囊泡占相当大的比例。因此，需要一些如超声处理或者经特定大小的孔过滤操作以增加单层脂质体的比例。单层囊泡具有使得加入的脂质体量或特定的类脂量通常少于多层囊泡的优点。

单层囊泡，特别是大单层囊泡(LUV)其优势是比多层囊泡具有更大的包封能力。应用在射线照相造影剂中的脂质体介于尺寸为0.2至1μm的LUV和小于0.05μm的小单层囊泡(SUV)之间。因此，保留体积超过了SUV且水溶性碘化合物的俘获率即包封率变得更好，这将在后面描述。此外，与MLV或LUV所不同的是，这种囊状脂质体由于结合在网状内皮组织细胞内而不会从血流中迅速消失。

然而，即使单层囊泡表现出较好的碘化合物包封率，当包封的碘化合物重量相对过多时会降低其稳定性。特别地，据观察由于离子强度的迅速改变而具有变弱倾向。将用于本发明造影剂的脂质体调整为相对小的囊泡尺寸并且结合选自含有聚氧化亚烷基的化合物(例如，磷脂)、甾醇和乙二醇中的至少一种化合物而形成囊泡膜能增强脂膜的稳定性。结果证明这种脂质体能够抵抗盐的冲击。

作为微粒的脂质体的囊状微粒尺寸(或称为脂质体囊泡尺寸，下文也简称为囊泡尺寸)及其分布与增强血液保留性质、靶向能力和转运效率这些与本发明目有关的方面密切相关。囊泡尺寸可以通过以下方法测定，将含有包封了碘化合物的脂质体囊泡的分散体冷冻并断裂后，使碳蒸发沉积(vapor-deposited)在断裂界面上，再通过电子显微镜观察沉积的碳(冷冻断裂TEM法)。囊泡尺寸可以通过设定或控制工艺条件来调整。例如，增加前述的超临界压力会导致脂质体囊泡尺寸的减小。利用聚碳酸酯膜过滤以使囊泡尺寸分布在更窄范围内。因此，使脂质体通过安装了0.1到0.5μm孔径过滤器的挤压机可有效获得具有不到0.4μm的平均囊泡尺寸的单层囊泡脂质体。本发明中，平均囊泡尺寸是指特定数目的被观察的造影剂的囊状微粒的简单(或算术)平均值，例如，20个囊泡。该值通常与中心囊泡尺寸相同或接近，中心囊泡尺寸是指在囊泡尺寸分布中具有最高频率的囊泡尺寸。除了前述的调整尺寸的操作，又加入了该挤压操作，其具有的优点如调整存在于脂质体囊泡外部的碘化合物浓度、改变脂质体分散溶液和除去杂质。

脂质体微粒的尺寸对增强脂质体的主动靶向能力是重要的。例如，日本专利NO.2619037公开了将3μm或更大的脂质体排除就可避免在肺毛细管中的不利保留。然而，0.5到3μm的脂质体不一定表现出肿瘤的指向性。

用于本发明的造影剂的脂质体的平均囊泡尺寸优选0.05到0.5μm，更优选0.05到0.2μm，而且更优选0.05到0.13μm。囊泡尺寸可以根据X射线成像的目标进行调整。例如，目的是给肿瘤区域有选择的成像时，优选0.11到0.13μm。调整脂质体囊泡尺寸为0.1到0.2μm的范围内(优选0.11到0.13μm)可使造影剂选择性的集中在癌组织。这被认为是EPR效应。实体癌组织血管化壁上的孔异常地大于孔径为30到80nm的正常组织毛细管壁微孔，因此即使是约0.1到约0.2μm的大分子也通过血管壁泄漏。因此，EPR效应是由于癌组织血管壁的渗透性比正常组织的微血管壁的渗透性高。

由于***在癌组织周围没有充分生长，通过血管壁泄漏的造影剂不能回到血管中并在那里保留相对长的时间。EPR效应是利用血流的被动转运，因此需要增加的血液保留时间以有效的发展这种效应。因此，造影剂微粒(或者包封碘化合物的脂质体囊状微粒)需要保留在血液中，并且很多次经过靠近癌细胞的血管。本发明的射线照相造影剂，其没有包含任何特别大的粒子，不易变成被网状内皮组织细胞俘获的目标。脂质体囊泡，其形状与红细胞相似并且行为也与红细胞相似，在血液中长时间保留且不会迅速经肾排出，被覆盖时不会被网状内皮组织细胞吞噬。EPR效应必然会加强造影剂化合物向靶器官或组织的转移，并且有选择地集中并积聚在癌组织中。瘤细胞/正常细胞累积比率的升高可以增强造影剂的对照效果。改进的肿瘤造影术使发现微小的转移瘤成为可能，其到目前为止还是难于被检测。

当碘化合物被包封在作为微型载体的脂质体中时，除了造影剂材料的运载率和保留稳定性外，还必须考虑脂膜的量。增加类脂的量会增高造影剂的粘度。包封在脂质体囊泡内的碘化合物的量，其包含在包封于脂质体囊泡内的水溶液中，按照包封在囊泡内的碘化合物与形成囊状膜的类脂的重量比，优选从1到10，更优选从3到8，且更优选从5到8。

包封在脂质体内的碘化合物的重量比小于1时需要注入相对大量的类脂，导致降低了的造影剂材料的转运率。根据日本专利NO.2619037中的描述，根据当时的技术水平即使重量比为1也是相对高的值。因为射线照相造影剂的粘度取决于脂质体中类脂的含量，表现出增强了保留体积和包封率的单膜形成的脂质体(单层囊泡)或数层膜形成的脂质体具有明显地优势。相反，当包封的碘化合物与脂质体膜的类脂的重量比超过10时，脂质体的结构会变得不稳定，并且不可避免地在储藏期间或者甚至在注射入生物体内后碘化合物从脂膜中扩散或泄漏。此外，专利申请号为NO.9-505821的PCT国际申请的日本公开文本中描述到，即使在制备和分离脂质体分散体系之后立即达到100％的包封，包封的组分也会在短时间内减少由于渗透压造成的不稳定影像。

本发明的射线照相造影剂不是经口服而是经血管优选经静脉内如注射或滴注给予人类，然后在X射线下进行成像。在CT检查中，特别是为了血管损害或肿瘤损害成像时，大多数情况下，经常在短时间内给予大量相对高浓度的造影剂。为了能够如此大剂量的注射，用于成像的造影剂的必要条件是组分的流动性和低粘滞性。为了降低注射阻力以减少受试者的痛苦并且也为了避免血细胞渗出的危险，本发明组分的溶液的粘度优选在37℃下不超过20mPa·s(用Ostwald法测量)，更优选不超过18mPa·s，且更优选不超过15mPa·s。有时候需要其具有一定程度的粘性可以经肿瘤稀释来减慢进程，这取决于身体被成像的位置。

相对高渗摩浓度会给心脏和循环***带来负担。与血液是等渗的溶液或悬浮液是通过将造影剂材料以形成等渗溶液的浓度溶解或悬浮在介质中而制备得到的。例如，当等渗溶液不能仅用造影剂化合物制备时，由于其低溶解性，可加入非离子型水溶性物质，像盐类如氯化钠，或糖类如甘露糖醇、葡萄糖、蔗糖和山梨糖醇来形成等渗溶液或悬浮液。

碘化合物的最佳浓度通常根据不同症状和不同X-射线成像检查而设计。曾经有人批露了在射线照相术中转运到靶器官的碘化合物的量能达到指定的造影效果，例如，参见日本专利NO.2619037中的描述。这个量基本上相当于传统的X-射线造影检查中使用的碘类造影剂。脂质体内部的碘的总量或者脂质体内部和外部的碘的总量与常规剂量相同。实质性器官的造影效果主要由每身体重量单位所给药的碘量来控制，即(造影剂的浓度)×(造影剂的剂量)，并且经常与给药的碘量成比例的增加。例如，为了获得肝脏实质性器官足够的造影效果，使用量为600mg I每kg(身体重量单位)。然而，在过高溶液浓度下，不利的情况如脂质体囊泡的聚合或增加的粘度必须要考虑到。

根据本发明的方法制备的造影剂的碘含量，在通常假定的溶液剂量为10到300ml时，通常为30到500mg I/ml，优选为150到500mg I/ml，且更优选为250到400mg I/ml。

优选地，本发明的射线照相造影剂包含包封在脂质体膜内部水相中和膜外部水相中的碘化合物(即脂质体囊泡分散的水介质中)，且更优选，碘化合物的浓度在脂质体膜内和膜外基本相同。同一碘化合物同时存在于脂质体膜内和膜外意味着在碘化合物在同一造影剂中以不同形式存在。存在于分散脂质体的水介质中的碘化合物与以自由形式存在的传统的碘化合物以相似的行为在身体内活动。从另一方面说，包封在脂质体内的碘化合物在体内是随着脂质体的活动而转运。这种造影剂材料的状态在诊断检查中表现出以下优点。根据本发明的射线照相造影剂的应用，未被包封的造影剂材料和被包封在脂质体内的造影剂材料在体内的扩散时间不同，使所呈现的影像随着时间的流逝在分布行为上发生变化，这会提供有价值的诊断信息。正常的细胞与癌细胞在血管***、静脉性能和***的发展程度方面不同，其经造影剂材料通过血液动力学和灌注状态下的行为反映出来。即使仅仅是一次给药，本发明的造影剂组分能够收集大量的临床数据。

实施例

本发明将根据具体实施例作进一步的说明，实施例中应用的装置、其中的材料及其参数值如浓度、数量、处理时间、处理温度等等和处理方法仅仅是落在本发明的范围内的优选实施例。

实施例1

碘化合物中碘的测定

样品(脂质体分散体)用等渗盐溶液进行透析，透析结束后，向其中加入乙醇破坏脂质体，再用吸光测定法测定包封在脂质体内的碘化合物的量。上述碘化合物的量与样品中碘化合物的总量的比率用来表示包封率(wt％)。

造影剂的制备

将86mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、38.4mg胆固醇和19.2mg PEG-磷脂的混合物(SUNBRIGHT DSPE-020CN，经聚乙二醇修饰的类脂，由NIPPON OIL & FATS CO.，LTD.生产)加入到不锈钢高压反应釜中，加热保持釜的温度在60℃，然后，向其中加入13g液态二氧化碳。搅拌的同时，通过减小高压釜内部的容积使釜内的压力由50kg/cm²升高到120kg/cm²使二氧化碳处于超临界状态以使类脂分散和溶解在超临界二氧化碳中。进一步地，用计量泵在50分钟的时间内持续向其中加入5ml含有306.2mg/ml碘帕醇溶液(碘含量为150mg/ml)、1mg/ml氨丁三醇和0.1mg/ml乙二胺四乙酸钙二钠(EDTANa₂-Ca)的造影剂溶液，并且用盐酸或氢氧化钠调节pH大约为7。加入完成后，高压釜内部抽真空排出二氧化碳，得到包封了造影剂溶液的脂质体分散体。所得的分散体加热到60℃并经由Advantech Co.生产的1.0μm和0.45μm的纤维素类过滤器进行压力过滤。如此得到的含有脂质体的造影剂命名为样品1-1。

样品1-2到1-5的制备同上述样品1-1，只是与DPPC和胆固醇一起加入的乙醇或PEG-磷脂的量如表1中所示。

测量了样品1-1到1-5的包封率(即包封在脂质体内部的碘帕醇与碘化合物总量的比率，其均由转换为碘原子的当量表示)。

表1

样品序号	PEG-磷脂(mg)	乙醇(mg)	包封率(wt％)	与CO2的比率(wt％)*
					1-1	19.2	0	19	0.15
1-2	9.6	0	10	0.08
					1-3	0	0	4	0
1-4	0	2000	7	0
					1-5	0	8000	9	0

^*PEG-磷脂与CO₂的比率(wt％)

实施例2

造影剂

样品2-1到2-8的制备同实施例1中样品1-1，只是造影剂溶液的数量或种类有所不同。

测量了如此制备的样品的碘含量，用分光光度计测定了包封率(即即包封在脂质体内部的碘帕醇与碘化合物总量的比率)，如表2中所示。

表2

样品序号	造影剂溶液	碘含量(mg/ml)	包封率(wt％)
				2-1	碘帕醇溶液	150	19
2-2	碘帕醇溶液	250	18
				2-3	碘帕醇溶液	300	15
2-4	碘帕醇溶液	240	16
				2-5	碘海醇溶液	180	18
2-6	碘海醇溶液	300	14
				2-7	碘美普尔溶液	300	13
2-8	碘昔兰溶液	300	14

实施例3

脂质体囊泡尺寸

脂质体囊泡尺寸是通过以下方法测定的。将含有包封了碘化合物的脂质体囊泡的分散体冷冻并断裂后，使碳蒸发沉积在断裂界面上，再通过电子显微镜观察沉积的碳(冷冻断裂TEM法)。

微粒尺寸定义为被观察的20个脂质体微粒的尺寸的算术平均值。

造影剂的制备

将192mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、76.8mg胆固醇和38.4mg PEG-磷脂的混合物(SUNBRIGHT DSPE-020CN，经聚乙二醇修饰的磷脂，由NIPPON OIL & FATS CO.，LTD.生产)加入到不锈钢高压反应釜中，加热保持釜的温度在60℃，然后，向其中加入13g液态二氧化碳。搅拌的同时，通过减小高压釜内部的容积使釜内的压力由50kg/cm²升高到120kg/cm²使二氧化碳处于超临界状态，以使类脂分散和溶解在超临界二氧化碳中。进一步地，用计量泵在50分钟的时间内持续向其中加入10ml含有306.2mg/ml碘帕醇溶液(碘含量为200mg/ml)、1mg/ml氨丁三醇和0.1mg/ml乙二胺四乙酸钙二钠(EDTANa₂-Ca)的造影剂溶液，并且用盐酸或氢氧化钠调节pH大约为7。加入完成后，高压釜内部抽真空排出二氧化碳，得到包封了造影剂溶液的脂质体分散体。所得的分散体加热到60℃并经由Advantech Co.生产的1.0μm的纤维素类过滤器进行压力过滤。如此得到的含有脂质体的造影剂命名为样品3-1。

根据前述的方法测定了包封在脂质体内部的碘的量(也简称为被包封碘的量)和包封率。按照上面的方法测定了脂质体囊泡的尺寸。其结果如表3所示。

样品3-2到3-4的制备同样品3-1，只是造影剂浓度(碘含量)有所不同，如表3所示。

表3

样品序号	造影剂浓度(mg/ml)	全部脂类的量(mg/ml)	脂质体微粒尺寸(μm)	包封率(％)	被包封碘的量(mg/ml)	压力过滤速率(g/min)	分散体老化稳定性
									1个月	3个月
							3-1	200			30.7	0.4	15	30	1.0	4	3
3-2	240	30.7	0.4	15	36	1.0			5	5
							3-3	250			30.7	0.4	15	37.5	1.0	5	5
3-4	300	30.7	0.42	12	36	0.5			4	4

评价

压力过滤速率的测定

用在上述造影剂的制备中所用到的1.0μm纤维素过滤器(直径为2cm)进行压力过滤时间的测定，其被通过液体的量所除而测定出压力过滤速率。根据工业生产效率不超过0.2ml/min的速率是不能被接受的。

分散体的老化稳定性

将制得的脂质体造影剂分别置于一个20ml的小瓶内并盖上盖子，盖子的***用密封带封好。将这些样品放在23℃和55％RH的环境下的黑暗的地方放置1个月和3个月。

这些老化的样品按照以下的标准用视力进行评价。

5：没有观察到沉积物，制备以来也没有发生变化；

4：观察到轻微的混浊，但是没有分离也没有发现沉积；

3：观察到程度较高的混浊，但是没有分离也没有发现沉积；

2：产生了沉积物；

1：透明的液体和白色的沉积物完全分离了。

从表中明显可以看出，本发明的造影剂显示出增加的被包封的碘的量和出色的1μm过滤器的压力滤过率。进一步证明当造影剂浓度为240到300mg/ml时被包封的碘的含量更多，相对于其他浓度来说，这给造影剂带来了优势。令人惊奇的是，造影剂浓度从240到300mg/ml时能增强分散体的稳定性，因此即使三个月之后出色的分散体依然能保持住。

实施例4

造影剂的制备

将368.4mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、147.4mg胆固醇和111.5mgPEG-磷脂的混合物(SUNBRIGHT DSPE-020CN，经聚乙二醇修饰的磷脂，由NIPPON OIL & FATS CO.，LTD.生产)加入到不锈钢高压反应釜中，加热保持釜的温度在60℃，然后，向其中加入13g液态二氧化碳。搅拌的同时，通过减小高压釜内部的容积使釜内的压力由50kg/cm²升高到120kg/cm²使二氧化碳处于超临界状态以使类脂分散和溶解在超临界二氧化碳中。进一步地，用计量泵在50分钟的时间内持续向其中加入13ml含有306.2mg/ml碘帕醇溶液(碘含量为150mg/ml)、1mg/ml氨丁三醇和0.1mg/ml乙二胺四乙酸钙二钠(EDTANa₂-Ca)的造影剂溶液，并且用盐酸或氢氧化钠调节pH大约为7。加入完成后，高压釜内部抽真空排出二氧化碳，得到包封了造影剂溶液的脂质体分散体。所得的分散体加热到60℃并经由Advantech Co.生产的0.45μm的纤维素类过滤器进行压力过滤。如此得到的含有脂质体的造影剂命名为样品4-1。

样品4-2到4-8

样品4-2到4-8的制备同样品4-1，只是类脂组分、造影剂浓度或全部类脂的量有所不同，如表4所示。

样品4-9是通过以下方法制备的。将368.4mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、147.4mg胆固醇和111.5mg PEG-磷脂的混合物(SUNBRIGHTDSPE-020CN，经聚乙二醇修饰的磷脂，由NIPPON OIL & FATS CO.，LTD.生产)与10ml氯仿、乙醇和水的混合物(重量比为100∶20∶0.1)在烧瓶(messflask)中混合。将制得的混合物在水浴上(65℃)加热并且用旋转蒸发器蒸发将溶剂蒸馏掉。残余物在真空中干燥2小时以形成脂膜。进一步地，加入13ml上述造影剂溶液，且在65℃加热期间用搅拌器搅拌所得的混合物大约10分钟。进一步搅拌得到了含有造影剂溶液的脂质体分散体。将所得的分散体加热到60℃并经由Advantech Co.生产的1.0μm和0.45μm的纤维素类过滤器进行压力过滤得到包含脂质体的造影剂。

表4

样品序号	DPPC	胆固醇(摩尔比*)	DSPE-020CN(摩尔比*)	造影剂浓度(mg/ml)	全部脂类的量(mg/ml)	微粒尺寸(μm)	包封率(％)	过滤速率**(g/min)
									4-1	100	76	6	150	23.6	0.40	17	2.0
4-2	100	76	9	250	48.2	0.40	18	1.2
									4-3	100	76	6	150	18.0	0.40	13	2.1
4-4	100	76	6	150	90.0	0.42	14	0.8
									4-5	100	80	15	250	48.2	0.38	13	1.0
4-6	100	65	15	250	48.2	0.39	14	1.2
									4-7	100	100	9	250	48.2	0.40	14	0.5
4-8	100	50	6	150	23.6	0.39	13	1.5
									4-9	100	76	6	150	23.6	0.40	5	0.3

^*摩尔比，基于DPPC

^**用0.45μm过滤器进行的压力过滤

评价

脂质体囊泡尺寸

各个造影剂样品的平均囊泡尺寸是根据前述的方法进行测定的。

包封率评价

将得到的脂质体造影剂样品分别置于一个20ml的小瓶内并盖上盖子，盖子的***用密封带封好。将这些样品放在23℃和55％RH的环境下的黑暗的地方放置2个月。然后，将这些样品分别用等渗盐溶液进行透析，透析完成后，向其中加入乙醇破坏脂质体，经吸光测定法测定包封在脂质体内的碘化合物的量。包封的碘化合物的量与碘化合物的总量的比率用来表示包封率(％)。老化2个月后，不完整的或不稳定的脂质体微粒因为破裂、凝结或泄漏释放出内含物，导致包封率降低。

压力过滤速率的测定

利用在上述造影剂的制备中所用到的0.45μm纤维素过滤器(直径为2cm)，按照实施例3进行压力过滤速率的测定。

从表4中可以看出，根据本发明制备的造影剂显示出增高的包封率和出色的压力滤过率。

工业实用性

根据本发明的内容，提供了一种通过将造影剂材料包封在脂质体囊泡内而表现出转运效率和选择性增强的射线照相造影剂。

这里还提供了一种包含脂质体的射线照相造影剂及其制备方法，其有效且稳定地包封了碘化合物而没有使用毒性有机溶剂及其制备方法。

Claims (20)

1.一种制备包含脂质体的射线照相造影剂的方法，其特征在于该方法包括：

在含有羟基或聚氧化亚烷基的化合物的存在下，将作为脂膜组分的磷脂和甾醇溶解在超临界或亚临界二氧化碳中，

向其中加入含有碘化合物的水溶液以形成胶束，以及

排出二氧化碳以形成包封了碘化合物的脂质体囊泡。

2.根据权利要求1的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于含有羟基或聚氧化亚烷基的化合物为含有聚氧化亚烷基的化合物。

3.根据权利要求2的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于含有聚氧化亚烷基的化合物为含有聚氧化亚烷基的类脂。

4.根据权利要求3的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于含有聚氧化亚烷基的类脂为含有聚氧化乙烯基的类脂。

5.根据权利要求1的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于包含的含有羟基或聚氧化亚烷基的化合物的量为二氧化碳重量的0.01％到1％。

6.根据权利要求1的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于脂质体囊泡为单层或数层囊泡。

7.根据权利要求1的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于包含的碘化合物的量以碘原子的量计为每ml造影剂100到350mg的I。

8.根据权利要求1的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于碘化合物为非离子型碘化合物。

9.根据权利要求8的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于碘化合物为选自碘美普尔、碘帕醇、碘海醇、碘喷托、碘普胺、碘昔兰、碘西胺、iobenzol、碘曲仑、碘克沙醇、碘西醇、碘酞硫、甲泛葡胺和1，3-双-[N-3，5-二-(2，3-二羟丙基氨基羰基)-2，4，6-三碘苯基]-N-羟基乙酰基-氨基]-丙烷中的至少一种。

10.根据权利要求9的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于碘化合物为选自碘美普尔、碘帕醇、碘海醇、碘普胺、碘昔兰、碘酞硫、碘曲仑和碘克沙醇中的至少一种。

11.根据权利要求1的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于脂质体囊泡分散在水介质中，并且70％到95％重量的碘化合物没有包封在脂质体囊泡内而是存在于水介质中。

12.根据权利要求1的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于造影剂中含有的全部类脂为20到100mg/ml。

13.根据权利要求12的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于包封在脂质体囊泡内的碘化合物与全部类脂的重量比为3到8。

14.根据权利要求7的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于包含的碘化合物的量以碘原子的量计为每ml造影剂200到300mg的I，以及造影剂中含有的全部类脂为20到80mg/ml。

15.根据权利要求14的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于包含的碘化合物的量以碘原子的量计为每ml造影剂240到300mg的I。

16.根据权利要求1的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于磷脂与甾醇的摩尔比为100/60到100/90。

17.根据权利要求3的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于磷脂与含有聚氧化亚烷基的类脂的摩尔比为100/5到100/10。

18.根据权利要求1的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于脂质体囊泡的平均尺寸为0.05到0.8μm。

19.根据权利要求1的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于含有碘化合物的水溶液还包含选自水溶性胺缓冲液、乙二胺四乙酸钙二钠、无机盐、渗透压调节剂和防腐剂中的至少一种。

20.根据权利要求1的制备射线照相造影剂的方法，其特征在于脂质体囊泡内部和外部的水相中含有作为盐酸盐、磷酸盐或碳酸氢盐的阳离子，且需满足以下要求：

[Na⁺]+126·[Ca²⁺]+50·[K⁺]≤130

其中[Na⁺]是指含量为20到70mM的钠离子，[Ca²⁺]是指含量为0.1到0.6mM的钙离子，[K⁺]是指含量为0.4到0.8mM的钾离子，以及镁离子的含量为0.5到0.8mM。