CN103619325A - 用于生产脂质体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过使用脂质粉末的水溶液的高剪切混合形成脂质体的方法；脂质粉末可以通过任意已知的技术来生产。脂质体的组分包括但不限于阳离子脂质、免疫刺激剂/免疫增强剂和作为用于形成脂质体的组分的大分子。所公开的方法描述了一种通过高剪切混合配制单独的稳定脂质体或复合了具有高浓度的带与脂质体相反的电荷的大分子比如蛋白质、DNA和RNA的稳定脂质体的方法，其中归因于配制方法，避免了聚集。

Description

用于生产脂质体的方法
发明领域
本发明涉及脂质体生产及制剂。尤其，本发明涉及阳离子脂质体的生产和配制，这是通过可由不含有机溶剂的方法（超临界流体技术（fx criticalfluid technologies））得到的脂质粉末和高剪切混合的独特组合，藉此在过程期间没有使用有机溶剂下，将脂质体组分混合且配制成稳定的脂质体。在治疗和预防医学中，脂质体可以用作抗原组分的佐剂或用作药物递送***。尤其，本发明涉及用于免疫的在水介质中的疫苗的佐剂。
发明背景
术语脂质体是用于由封闭含水区室（aqueous compartment）的脂质双层组成的囊泡的广泛定义。膜形成脂质是两亲的且因此包含极性和非极性区域。极性区域通常由磷酸酯基团、酸性基团和/或叔胺或季铵盐组成，且在生理pH下可以具有净的负表面电荷（阴离子）、中性表面电荷或正表面电荷（阳离子），这取决于脂质头基（head group）的组成。非极性区域通常由具有≥8个碳的一个或多个脂肪酸链和/或胆固醇（cholesterol）组成。构成囊泡双层膜的脂质被排布（organized），使得非极性的烃“尾部”指向双层的中心，而极性的“头部”分别朝向水相内部和水相外部。
获得均匀的脂质体的一种方法涉及使磷脂溶解在有机溶剂中，其然后被蒸发至干燥，在试管内部留下薄的脂质膜（Bangham等，1965）。干的脂质膜然后在适量的水相中水化，且混合物被加热至高于脂质/脂质混合物的相转变温度Tm且脂质膜被允许“膨胀”。通过振动试管来分散得到的通常由多层囊泡（Multilamellar Vesicles）（MLV）组成的脂质体。这种制备为通过例如超声处理（Papahadjopoulos等，1967）或如Cullis等在美国专利第5,008,050号中描述的挤出的方法生产单层囊泡（UV）提供了基础。
用于制备小囊泡的其它技术为由Szoka和Papahadjopoulos介绍的反相蒸发法（Szoka和Papahadjopoulos，1978；美国专利第4,235,871号）。这种技术包括在有机溶剂和待包封的（encapsulated）物质的缓冲水溶液中形成脂质的油包水乳液。在减压下除去有机溶剂产生粘性凝胶。当这种凝胶崩解（collapse）时，形成脂质囊泡的水悬浮液。
通过用于包封不具有对脂质体的强的亲和力的水溶性化合物例如蛋白质的复乳法（double emulsion method）来制备磷脂的脂质体被Schneider描述在US4,008,801和US4,224,179中。具有包含化合物的脂质体的乳液是通过复乳法制备的：使小体积的具有水溶性的化合物比如蛋白质抗原和/或免疫刺激剂（immunostimulator）的水溶液与较大体积的具有溶解的磷脂的有机溶剂混合。所形成的乳液与较大体积的水溶液混合且用气流除去有机溶剂。
Carmona-Ribeiro和Chaimovich（Ribeiro和Chaimovich，1983）所描述的方法涉及向缓冲水溶液注入期望脂质的例如氯仿、甲醇、乙醇的有机溶液，其中当溶剂蒸发时脂质自发地形成脂质体。在近些年中已经评估了用于脂质体的大规模生产的乙醇注射方法（Wagner2006，Justo2010），且这种制造方法被判断为对于大规模生产比例如磷脂膜方法更可行。
已知几种从有机溶剂溶液获得均匀的脂质粉末的方法，比如冷冻干燥、喷雾干燥、溶剂蒸发（Mehnert和
Figure BDA0000445909040000021
2001）。在这些方法中，其中溶解了脂质的有机溶剂是通过所描述的技术来除去的。由于许多方法在药物产品中留下了残余的溶剂，因此有机溶剂的使用具有若干缺点。而且，在大规模生产上（on upscaling），对于人员和环境问题，需要非常注意。同时，已经考察了用于制造脂质粉末的热或冷均化方法（Mehnert和
Figure BDA0000445909040000022
2001）。
在近些年中，可选择地，已经通过超临界流体方法来生产脂质粉末，方法被开发用于生产不溶于水的药物的稳定悬浮液（Badens等，2001，Cape等，2008）。超临界流体方法利用处于其超临界状态的压缩气体例如CO2作为一些方法中的溶剂或作为其它方法中的反溶剂（anti-solvent）（Pasquali等，2008）。这可以有助于通过经由从其中化合物被液化或溶解/部分溶解的超临界溶液中快速膨胀使不溶于水的化合物沉淀，或通过应用经由将化合物的溶液喷到压缩气体、液体或超临界流体中的反溶剂方法，来制备亚微颗粒。对于生产磷脂囊泡，该方法是公知的（WO9714407、US5,554,382、WO2010004287）。最经常地，应用有机溶剂或添加的共溶剂。
已经考察了直接从超临界CO2溶液中制造的用于包封（encapsulation）的脂质体，其应用乙醇作为由磷脂和胆固醇组成的脂质体的共溶剂（Frederiksen等人,1997）。
已经考察了制造脂质体包载/包封的物质比如大分子、DNA/RNA、酶、蛋白质、肽和激素的技术。脂质体包载技术的一个实例是脱水-再水化程序（Gregoriadis1987、1993、1999，Kirby等，1984，Zadi，2000）。在这个方法中，脂质体是通过例如上文所述的脂质膜水化方法来进行的，其中在脱水-再水化方法之前除去所应用的有机溶剂。脂质膜通过使用水/缓冲液来形成“空的”脂质体，或可选择地通过使用含有待包封的物质的水溶液来水化。水化程序可以通过已知的技术来完成，比如通过加热水溶液直至高于脂质组分的相转变温度Tm且以一定间隔旋转混合。随后，冷冻干燥脂质体制剂，且然后在高于脂质的凝胶-液晶转变温度的控制条件下，首先用少量的水或含有物质的溶液再次水化，之后稀释至最终体积。产生的脱水-再水化囊泡（DRV）可以通过微流化至合适的尺寸来处理，且通过色谱、离心步骤等除去剩下的未包载的物质。然而，包载后的尺寸减少趋向于导致较低的包载载量（entrapment load）和效率。
然而，所有这些方法都包括了有机溶剂/共溶剂的使用。由于已知很多有机溶剂是致癌的和/或对中枢神经***具有损伤效应，因此重要的是，减少在人用的药物产品中的残余的有机溶剂的含量，且证明（document）留在药物产品中的痕量没有超过可容忍的药典水平。而且，有机溶剂在生产中的使用导致了大量的这些化合物被丢弃。因此，存在着在使用有机溶剂时应遵守的许多规章和条例，这使得生产过程较为复杂化。使用现今所用的防护配件和设备，最小化人员的暴露且维持高标准的工作环境是可能的。因此，现今当局更为关注的是对于外部环境的暴露。当挥发性的组分比如有机溶剂通过抽吸从工作环境移除到外部环境时，那些这些溶剂可以引起空气中的光化学污染物比如臭氧或烟雾的形成。因此，新的政府举措包括限制来自工业的空气污染物的指南。这个指南包括保持挥发性有机组分的非常精确的平衡，因此必须登记进入和出去的每一种物品。这使得在现代工业中采用有机溶剂的工作是非常耗时且昂贵的。在本发明中，不含有机溶剂的生产方法的使用因此是高度有利的。
在最近几十年中，已经广泛研究了脂质体作为疫苗递送***和佐剂的应用。阳离子脂质体是用于疫苗抗原的最有效的脂质体递送***且是比其它脂质体***更有效力的免疫增强剂的脂质体递送***。然而，尽管一些证据表明阳离子脂质体本身可以改进针对共同施用的疫苗抗原的免疫应答，但是它们的主要功能是保护抗原不在体内清除且将抗原递送至专门的抗原呈递细胞（Christensen等，2007）。最近的研究表明，对于疫苗在注射部位处的保留，阳离子电荷是重要的因素，使得天然免疫细胞的延长的抗原呈递和天然免疫细胞的延长的免疫刺激成为可能（Henriksen-Lacey等，2010）。此外，阳离子脂质体可以用于引入免疫刺激剂，以以所需方向增强且调节的免疫应答，且因此在设计用于特定疾病靶标的特制（tailor-made）的佐剂时，提供了有效的工具（Christensen等，2007）。构成脂质体的阳离子活性剂组分可以包括表面活性剂如二甲基双十八烷基铵（DDA）、3-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、1,2-酰基-3-三甲基铵-丙烷(DxTAP)、N-[1-(2,3-酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲铵(DxTMA)、酰氧基(乙基-2-酰基-3-羟乙基)咪唑啉鎓(DxTIM)、1,2-酰基-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DxEPC)、3-十四烷基氨基-叔丁基-N-十四烷基丙脒（3-tetradecylamino-tert-butyl-N-tetradecylpropion-amidine）(二C14-脒)、N-棕榈酰基-D-鞘氨氧基（erythrospingosyl）-1-O-氨基甲酰基精胺(CCS)和二甲基二酰基铵(DDxA)，其中x代表具有不同的链长度的酰基链比如：月桂酰(C12)、肉豆蔻酰(C14)、棕榈酰基(C16)、硬脂酰基(C18)、二十烷酰基(C20)和山嵛酰基(C22)。
这些脂质体的免疫原性（immunogenicity）可以通过包含所谓的模式识别受体（PRR）的免疫刺激配体（又称免疫增强剂）来增强，所谓的模式识别受体（PRR）识别已知为病原体相关分子模式（PAMP）的保守分子结构。PAMP调节先天免疫应答且因此调节随后的适应性应答的能力可以被有利地开发，用于疫苗。PRR包括C型凝集素受体、核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）蛋白质和常生Toll样受体（ever-growing toll-like receptor）（TLR）家族。PAMP在病原体之间变化且包括分子比如索状因子（TDM）、鞭毛蛋白、脂多糖（LPS）、肽聚糖及几种核酸变体，比如胞嘧啶：磷酸酯：鸟嘌呤（CpG）寡聚脱氧核苷酸和双链核糖核酸（dsRNA）。多年来，已经开发了受PAMPS启发的许多免疫刺激剂。这些包括海藻糖二山嵛酸酯（trehalose dibehenate）（TDB）、合成的单分枝酰基甘油（monomycolylglycerol）（MMG）、单磷酰脂质A（MPL）、聚肌苷酸：聚胞苷酸（聚(I:C)）。对于开发疫苗佐剂，脂质体和这些PAMP/免疫刺激剂的组合是一种有吸引力的方法，因为脂质体不仅递送疫苗抗原，而且递送PAMP/免疫刺激剂至抗原提呈细胞，从而增强免疫应答。
已经提出了诱导细胞介导的免疫应答的多种佐剂，但是总体上没有任何佐剂对所有的方面都是理想的。
一种对促进细胞介导的免疫应答特别有效的佐剂类型是季铵化合物类，例如二甲基双十八烷基铵(DDA)。DDA是合成的两亲物，其包括亲水的带正电的二甲基铵头基和两个长的疏水烷基链。在水环境中，DDA分子自组装以形成类似于由天然磷脂形成的脂质体的泡状双层。从文献中已知DDA与其它免疫增强剂的组合。
不幸地，两亲的季铵化合物例如单独的DDA的悬浮液是物理学不稳定的，并且在4℃下的延长的储存而没有聚集和沉淀的发生是不可能的。由于沉淀将会妨碍制剂的临床使用，因此DDA制剂稳定性的缺乏目前已经是在人中进行任何应用的主要障碍。
已经设想了用来稳定两亲的季铵化合物的悬浮液的若干方式。这些方式包括使用例如聚乙二醇（PEG）、糖脂（比如TDB）和聚合物来稳定双层。WO2006002642公开了物理学稳定的脂质体制剂。该文件涉及通过将糖脂结合到脂质双层中来立体稳定阳离子脂质体以及脂质膜的增加的水化。稳定的脂质体可以用作抗原组分的佐剂或用作药物递送***。尤其，该文件涉及用于免疫的在水相中具有佐剂的疫苗，其中最终产品是稳定的且不含有机溶剂。
此外，WO2006002642公开了糖脂之外的其它免疫增强剂例如聚(I:C)和CpG向囊泡制剂的添加，然而未提出如何将这些进一步的组合制成稳定的制剂，因为这些免疫增强剂的结合使得制剂不稳定。然而，免疫增强剂和/或抗原向稳定制剂的进一步添加可造成不稳定。尤其，因为高度带电的聚合电解质与带相反电荷的脂质体的结合促进了脂质双层膜的自身不稳定性的事实，聚阴离子如（聚(I:C)）难以配制到阳离子脂质体和脂质体佐剂。电荷的中和与外部表面积的伴随的减少在双层正常方向中产生侧向压力的梯度。这产生弯矩（bending moment），其反过来导致脂质体不稳定，引起较大聚集物随时间过去而形成、宽的尺寸分布及结构不均匀性，导致脂质体的沉淀。
存在用于使寡核苷酸、肽或蛋白质结合/复合脂质体中或与脂质体结合/复合的在文献中描述的几种方法，其中在用有机溶剂结合/复合之前已经制备了脂质体。在一种方法中，存在于水相中的寡核苷酸、肽或蛋白质通过冷冻干燥被部分地包载，之后重新水化冻干的脂质体（Kirby和Gregoriadis，1984）。
可选择地，肽或蛋白质通过使用由Pick(Pick，1981)和由Bally等在美国专利第4,975,282号中描述的冷冻和融解技术来结合。在这种技术中，通过上述方法生产的预先形成的囊泡与肽或蛋白质混合，并且在液氮中反复地迅速冷冻和加热到相关脂质的相转变温度Tm以上的温度。由于这种方式应用了预先形成的脂质体，用于生产此类脂质体的上述方法也应用到这里，例如有机溶剂的使用和在规模化方法时的困难，比如快速冷冻较大的批料。
对于使用有机溶剂和复乳法使高浓度的亲水阴离子化合物例如聚阴离子如聚(I:C)吸附到季铵化合物的阳离子脂质的脂质体的最近的实例被描述在（Nordly等，2011）中。
本发明公开了一种通过不含有机溶剂的方法从脂质粉末，优选地从不含有机溶剂的方法中得到的脂质粉末中制造和配制阳离子脂质体的方法。本发明还公开了用来配制具有添加的聚阴离子免疫增强剂的稳定的阳离子脂质体的方法。
发明概述
本发明公开了一种通过使用高剪切混合，通过脂质粉末的再水化而没有使用有机溶剂来形成脂质体的新方法，所述脂质粉末可优选地在没有有机溶剂或共溶剂的使用下获得。本发明使用超临界流体技术，以产生均匀的脂质粉末，但脂质粉末可通过其它已知的技术来生产。脂质体的组分包括但不限于阳离子脂质、免疫刺激剂/免疫增强剂和作为用于形成脂质体的组分的大分子。
本发明公开了一种用于通过高剪切混合，配制单独的稳定脂质体或复合了高浓度的带与脂质体相反电荷的大分子比如蛋白质、DNA和RNA的稳定脂质体的方法，其中由于所公开的配制方法，聚集被避免了。
本发明还公开了这些复合有聚阴离子免疫刺激剂的稳定脂质体作为疫苗佐剂的用途。
发明详述
本发明公开了一种用脂质粉末在水溶液中的高剪切混合来生产脂质体的方法。
水溶液可以是纯水或包含缓冲液、盐、糖、大分子、酸、碱、氨基酸、肽、蛋白质等的水溶液。溶液的pH可以在pH1-14，优选地pH5-9，且最优选地pH6-8之间。
在本发明的优选实施方式中，脂质粉末是通过超临界流体方法来生产的。
优选的脂质粉末是均匀的混合物，其中一种脂质组分是季铵化合物，例如其中季铵化合物为二甲基双十八烷基铵（DDA）、或二甲基双十八烯基铵（DODA）、或1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷和二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA)、十八烯酰氧基(乙基-2-十七烯基-3-羟基乙基)咪唑啉鎓(DOTIM)、1,2-二油烯基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)和3-十四烷基氨基-叔丁基-N-十四烷基丙脒(二C14-脒)。
本发明的脂质体还可以包括中性脂质比如磷脂；稳定化糖脂，比如α,α′-海藻糖6,6′-二山萮酸酯（TDB）或单分枝酰基甘油（MMG）或其合成类似物；免疫增强剂，比如C型凝集素受体、核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）蛋白质及toll样受体（TLR）家族，比如索状因子（TDM）或合成类似物TDB，鞭毛蛋白，脂多糖，肽聚糖或核酸变体，比如胞嘧啶:磷酸酯:鸟嘌呤（CpG）寡聚脱氧核苷酸和双链核糖核酸（dsRNA）如聚肌苷酸:聚胞苷酸（聚(I:C)）。
在另外的实施方式中，应用高剪切混合程序和控制的添加包含待与脂质体复合的物质的溶液，所生产的脂质体与大分子比如寡核苷酸、肽、蛋白质、碳水化合物和/或脂质复合。高剪切混合可以基于其中转子的旋转速度为至少3.400rpm的转子-定子原理。其它高剪切混合技术包括但不限于均化和挤出。
通过所述方法生产的脂质体可以用于佐剂、递送***、药物或药妆品的制造。
在应用氧化敏感的组分如磷脂、不饱和脂肪酸或在应用对氧化、脱氨基等敏感的活性药物成分的情况下，在本发明中的所有步骤易于在惰性气氛下处理。
本发明还公开了被稳定以用作疫苗佐剂的脂质体产品，其中疫苗可以针对任意的疾病比如流感、链球菌、结核病、糖尿病、癌症、疟疾、衣原体等。
通过本发明的方法制造或稳定的脂质粉末或脂质体可以在药学上用于注射，用于递送***、局部应用、皮肤内应用、鼻内应用、肺应用或应用在其它制剂中，比如但不限于化妆品。
定义
“脂质粉末”被定义成组成脂质粉末制剂的脂质混合物的干燥的微粒材料。对于脂质粉末进一步用于脂质体制造，脂质粉末为制剂的脂质的均匀混合物是期望的。
“脂质体”被定义成由一个或多个脂质双层围绕着水性核心（aqueouscore）构成的封闭的囊泡结构。每个脂质双层由两个脂质单层体组成，每个单层体具有一个疏水的“尾部”区域和一个亲水的极性“头部”区域。在脂质双层中，脂质单层体的疏水“尾部”朝向双层内部，而亲水“头部”朝向双层外部。脂质体可具有多种物理化学性质，例如尺寸、脂质组成、表面电荷、流动性及双层膜的数量。根据脂质双层的数量，脂质体可归类为包括单个脂质双层的单层囊泡(UV)或小的单层囊泡（SUV），或包括每一个通过水层与另一个分开的两个或更多个同心的双层的多层囊泡(MLV)。水溶性化合物被包载入脂质体的水相/核，相反地，亲脂性化合物被包载入脂质双层膜的核/中心。
术语“阳离子脂质”意图包括具有疏水且极性的头基部分，在生理可接受的pH下具有净正电荷，并且可以在水中形成双层囊泡或者胶束（micelle）的任意的两亲脂质，包括天然的及合成的脂质和脂质类似物。
用于本发明的阳离子脂质一种特别优选的类型是具有通式NR1R2R3R4-X的季铵化合物，其中R1和R2各自独立地是包含从1至3个碳原子的短链烷基，R3独立地是氢或者甲基或者包含从12至20个碳原子，优选从14至18个碳原子的烷基，且R4独立地是包含从12至20个碳原子，优选从14至18个碳原子的烃基。X是药物上可接受的阴离子，其本身无毒性。这样阴离子的实例为卤素阴离子，例如氯离子、溴离子和碘离子。还可使用无机阴离子例如硫酸根和磷酸根，或者由简单的有机酸如乙酸衍生的有机阴离子。R1和R2基团可以是甲基、乙基、丙基和异丙基，而R3可以是氢、甲基或者十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基(eicocyl)，R4可以是十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基和二十烷基。然而其它C12-C20烃基也是可能的，因为尽管R3和R4基团优选是饱和的，且无分支侧链，但是它们在较少程度上可以带有支链，例如甲基和乙基侧链。R3和R4还可以具有较少的不饱和度，例如每一个包含1至3个双键，但是优选地，它们是饱和的烷基。
阳离子脂质最优选二甲基双十八烷基溴化铵或氯化铵(DDA-B或DDA-C)，或者其硫酸盐、磷酸盐或者乙酸盐(DDA-X)；或者二甲基双十八烯基溴化铵或氯化铵(DODA-B或DODA-C)，或者其硫酸盐、磷酸盐或者乙酸盐化合物(DODA-X)。
其它优选的阳离子脂质为1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷和二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵(DOTMA)、十八烯酰氧基(乙基-2-十七烯基-3-羟基乙基)咪唑啉鎓(DOTIM)、1,2-二油烯基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)和3-十四烷基氨基-叔丁基-N-十四烷基丙脒(二C14-脒)。
烷基链是指可以是直链的或支链的脂肪族烃链。链可以是饱和的，或其可以包含一个或多个双键，例如为不饱和的。
酰基链称为烷基-OC(O)基团，其中烷基如之前所描述的。
脂肪酸链是指支链的或无支链的、饱和的或不饱和的烷基或酰基的烃链。
术语药学上可接受的是指不会干扰有效成分的效力或者生物活性且对主体或患者没有毒性的物质。
用于本发明的相转变温度或Tm是一种温度，在此温度下脂质体双层从较低温度的凝胶相物理地变成高温流体相，较低温度的凝胶相以有序的脂肪酸链(有序的固体相)为特征，在高温流体相中脂肪酸链具有高度的构象无序（液体无序相），如通过差示扫描量热法（DSC）测量的。
通过将糖脂结合到脂质体膜中来稳定阳离子脂质体。结合是指将分子的疏水区域和亲水区域包埋在膜、胶束、脂质体或双层的相应的疏水和亲水的区域或部分中的程序。将糖脂结合到脂质体中的程序可以是“薄膜方法”、“反相蒸发方法”和“有机溶液注射方法”，以及将来的目前未知的具有将糖脂结合到脂质体膜中的相同效果的方法。所有目前已知的方法在发明章节的背景中提及。
糖脂被定义成包含通过糖苷键与疏水部分例如长链脂肪酸、酰基甘油、鞘氨醇（sphingoid）、神经酰胺或异戊二烯磷酸酯结合的一个或多个单糖或甘油残基的任何化合物。本发明的糖脂可以是合成来源的、植物来源的或微生物来源的，例如来自分枝杆菌。
用于本发明的一类糖脂是酰化(或烷基化)的糖苷，其包括与一个、两个或甚至三个脂肪酸酯化的一个或两个糖残基。脂肪酸可以是直链的，包括饱和脂肪酸例如肉豆蔻酸C14:0、十五烷酸C:15、棕榈酸C16:0、十七烷酸C17:0、硬脂酸(steric acid)C18:0、十九烷酸C:19、二十烷酸C:20、二十一烷酸C21:0、二十二烷酸C:22，以及不饱和脂肪酸例如油酸C18:1n-9、亚油酸18:2n-6；或复杂的支链脂肪酸例如霉菌酸、甲氧基霉菌酸、酮基霉菌酸、环氧霉菌酸和棒状杆菌分支菌酸（corynomycolic acids）。糖残基可以是简单的单糖例如葡萄糖和果糖，或含有两个共价键接的单糖的二糖，例如由葡萄糖和果糖组成的蔗糖和其中两个葡萄糖单元通过糖苷键连接的海藻糖。用于本发明的一类糖脂是从分枝杆菌分离的细胞壁糖脂，其包括与一个、两个或三个正十六烷酸C16:0、油酸C18:1n-9、亚油酸18:2n-6，或复杂的羟基支链脂肪酸即在60至90个碳原子的长度范围内的霉菌酸残基酯化的二糖。用于本发明的其它细菌糖脂具有较短的脂肪酸链，例如从棒状杆菌、诺卡氏菌中分离的棒状杆菌分支菌酸（22-36个碳)或者诺卡氏分枝霉菌酸（nocardomycolic acid）（44-60个碳）。优选的分枝杆菌糖脂是常称作索状因子的α,α′-海藻糖6,6′-二霉菌酸酯（TDM），它是分枝杆菌细胞壁的最重要的免疫调节组分之一。在特别优选的实施方案中，糖脂包括与两个二十二烷脂肪酸(山萮酸)酯化的二糖α,α′-海藻糖，例如为TDM的纯合成类似物的α,α′-海藻糖6,6′-二山萮酸酯（TDB）。另外优选的分支杆菌糖脂是单分枝酰基甘油，或优选地合成类似物3-羟基-2-十四烷基-十八烷酸2,3-二羟基丙酯或具有较短或较长的酰基骨架的密切相关的化合物。
用于本发明的其它类型的糖脂包括但不限于：基于甘油的糖脂：这些脂质包括与甘油的羟基糖苷键连接（linked glycosidically）的单糖或寡糖部分，所述甘油可用一个或两个脂肪酸酰化(或者烷基化)。而且，这些糖脂可以是不带电荷的且因此通常被称为中性甘油糖脂，或者可以包含硫酸根或磷酸根。这种类型的优选糖脂为单分枝酰基甘油（MMG）（Andersen等2009a，Andersen等2009b）或其合成类似物，比如3-羟基-2-十四烷基-十八烷酸-2,3-二羟基丙酯或具有较短或较长的酰基骨架的密切相关的化合物（Andersen等2009b，Nordly等2011）。
基于神经酰胺的糖脂：根据碳水化物部分的结构，鞘糖脂（glycosphingolipid）被分为含有未取代的糖基的中性鞘糖脂和含有带有酸性的羧基、硫酸根或磷酸根的糖基的酸性鞘糖脂。
脂多糖(LPS)：这些复杂的化合物是在革兰氏阴性细菌的细胞壁中发现的内毒素的抗原（S-脂多糖）。脂质部分(脂质A)通过糖苷键与多糖形成复合物。脂质A包括在氨基葡萄糖I的1位和氨基葡萄糖II的4位具有2个磷酸酯基团的b-1,6-氨基葡萄糖-氨基葡萄糖（b-1,6-glucosaminyl-glucosamine）主链。氨基葡萄糖II的3位与长链多糖形成酸不稳定的（acid-labile）糖苷键。用羟基化的脂肪酸如羟基肉豆蔻酸酯（键合两个酯且键合两个酰胺）和常规的脂肪酸（月桂酸酯）来取代其它基团（在埃希氏菌中）。本发明特别优选的脂多糖是脂质A的单磷酰基衍生物(MPL)，其是无毒的且具有优良的佐剂性能。
甾醇类的糖苷：此家族包括与一甾醇分子的羟基键合的一碳水合物单元。确定甾醇部分包括多种甾醇：胆固醇、菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇、菜子甾醇和二氢谷甾醇。糖部分包括葡萄糖、木糖和甚至***糖。
脂肪酸或脂肪醇的糖苷：许多简单的糖脂发现于细菌、酵母和低等有机体(海绵)中。这些化合物包括与脂肪醇或羟基脂肪酸的一个羟基键合或者与脂肪酸的一个羧基键合(酯键)的糖基部分(一个或几个单元)。这些化合物通常具有令人感兴趣的物理或生物学性质。它们中的一些由于它们的洗涤剂性能（detergent properties），被工业化生产（烷基糖苷）。
而且，糖脂例如TDB和MMG本身具有免疫刺激特性且可以以协同的方式与季铵化合物起作用，以增强免疫应答。而且，大分子例如寡核苷酸、肽或蛋白质抗原可以被包载在单层和多层脂质体的水相内。
免疫增强剂是指增强疫苗递送***和抗原的效果或与疫苗递送***和抗原协同地起作用以获得免疫应答的任意组分。这种增强作用可以通过模式识别受体非特异性地或特异性地完成，模式识别受体包括但不限于c型凝集素受体、核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）蛋白质和toll样受体（TLR）。
物质的复合包括但不限于非共价结合，例如大分子与相同或相反带电的脂质体的静电相互作用、疏水引力。
大分子：大分子被定义成由连接到一起的许多较小的结构单元组成的非常大的分子，比如蛋白质；同时，复杂的和非常大的分子比如DNA和RNA被定义成大分子。术语被用于四种常规的生物聚合物（核酸、蛋白质、碳水化合物及脂质），以及具有大的分子量的非聚合分子。本发明的大分子的使用中包括但不限于寡核苷酸、肽、蛋白质、碳水化合物及脂质。
本发明公开了在水化之前和在可能用于与其它大分子的随后复合的水化后，脂质体的脂质组分比如阳离子型表面活性剂如DDA和糖脂如TDB的均匀混合。脂质组分与其它大分子（例如，寡核苷酸）的混合也可以在水化前完成，且在进行复合时具有高剪切混合。阳离子脂质和尤其是带负电荷的大分子（例如，寡核苷酸）之间的复合物通常是热力学不稳定的，导致较大的聚集物随着的时间的过去而形成、宽的尺寸分布及结构不均匀。高度带电的聚合电解质与带相反电荷的脂质体的结合增强了膜本身的不稳定性。电荷的中和外部表面积的伴随的减少产生在双层正常方向中的侧向压力的梯度。这产生弯矩，其反过来引起脂质体的不稳定性。
生产脂质粉末
为干燥的微粒材料的脂质粉末必须是制剂的脂质的均匀混合物。较不均匀的脂质粉末将导致较不稳定的且较不均匀的脂质体制剂。存在获得均匀粉末的几种已知的方式，比如冷冻干燥、喷雾干燥、溶剂蒸发，所有均为其中从脂质在有机溶剂中的溶液中除去有机溶剂的方法。由于许多方法在药物产品中留下残余溶剂，因此有机溶剂的使用具有若干缺点。而且关于扩大规模时，重点在于人员及环境问题。
本发明公开了一种方法，其在从脂质原料到配制的阳离子脂质体或具有添加的聚阴离子免疫增强剂的配制的阳离子脂质体的整个脂质体制造过程期间避免了有机溶剂的使用。重点在于应用可以在没有使用有机溶剂的情况下获得的均匀的脂质粉末。均匀的粉末可以通过将进入的初始材料溶解、液化或熔化成均匀的共混物来获得，其在从超临界流体或从得到的熔化物的冷却中固化时，得到可以被研磨至粉末的脂质粉末或固体脂质粉末。一种这样的方法超临界流体，例如超临界CO2。脂质在超临界CO2中被液化/分散/溶解，这可保证脂质的均匀混合。产生的干燥脂质粉末可通过包含脂质混合物的超临界CO2的快速膨胀来获得。以这种方式，获得细微粒脂质粉末。
在本发明中实现均匀粉末的其它类型包括但不限于化合物的简单熔化。在熔化过程例如搅拌或粒化期间或之后，这可使用或不使用压力，使用或不使用有效的冷却且使用或不使用机械搅拌来进行。
优选地，脂质粉末是通过使用超临界流体技术来生产的，以产生均匀的脂质粉末，但任意的脂质粉末可以被用作脂质体生产的基础材料。
生产脂质体
根据本发明，在脂质粉末水化步骤期间使用高剪切混合（图1），以简单的方式从脂质粉来配制脂质体，而没有使用有机溶剂。这种高剪切混合方法可以用于复合与脂质体和带相反电荷的大分子比如寡核苷酸、肽或蛋白质，得到稳定的脂质体-大分子复合物。
高剪切混合的结果是至少以下两种物质的混合：不溶解在彼此中，难于溶解在彼此中，或彼此间没有化学反应。两个不互溶的物质的一个此类实例是将脂质水化到缓冲水溶液以形成脂质体。在高剪切混合期间，一种物质被分布遍及另一种物质。
高剪切混合的优选方法是基于转子-定子（rotor-stator）原理。在此，以高的圆周速度转动转子。旋转产生抽吸，这拉动介质至转子中且然后在来自定子的齿的帮助下将其推动至外部。这确保了脂质体制剂和任意添加的免疫增强剂或其它物质的完全混合。稳定的脂质体和脂质体-大分子复合物是用从3400至40000rpm的旋转速度来形成的；现今，旋转速度被限制到约40000rpm，但是对于制备稳定的脂质体溶液，似乎没有上限。在制造过程中，将温度保持为低于沸点且高于5℃。
所用的其它类型的高剪切混合包括但不限于：均化，超声及挤出。均化是通过脂质体或脂质体-大分子复合物的强烈共混来进行的。超声被用于混合多层（微米级）囊泡且缩减（downsize）多层（微米级）囊泡的尺寸，所述多层囊泡是通过加热且搅拌成小的（纳米级）单层囊泡中来制造的。挤出被用于混合如上所制造的多层囊泡且缩减如上所制造的多层囊泡的尺寸，其中限定尺寸且均匀的脂质体是通过穿过聚碳酸酯膜的连续挤出来制备的。
在本发明呈现的方法被用于制造脂质体制剂和包括结合或封装大分子和免疫调节剂的脂质体-单分子复合物。
使用本发明，可以形成稳定的脂质体制剂且尤其是脂质体-大分子复合物的稳定制剂。在本方法中，可以使具有对脂质体膜的化合物的静电亲和力的所有物质实际上结合。静电亲和力是在多种带相反电荷的原子形成离子键时产生的在两种或更多种化合物之间的亲和力。制造的脂质体是具有高度正的]-电势的阳离子。这导致物质的高的吸附程度，所述物质包括但不限于例如在生理pH下具有低于7.4的pI的大分子，因为它们带负电荷且具有对带正电荷的脂质体的静电亲和力。
通过本发明所呈现的方法形成的脂质体和脂质体-大分子复合物随着时间的过去是非常稳定的。药物制剂的稳定性是指在产品的贮存期限过程中制剂维持在限定的范围内的能力。脂质体分散体展示化学及物理的稳定特征。
化学稳定性涉及化学降解，而物理稳定性涉及***的胶体稳定性。
脂质体分散体的物理稳定性是通过囊泡间的相互作用来确定，其依赖吸引力和排斥力之间的平衡。胶体***是通过排斥力即静电排斥和立体排斥来稳定，这是由于在主体（bulk）中和在相互作用区域中的水之间的化学电势的差。
本发明还呈现这些脂质体作为佐剂例如用于疫苗组合物中的应用。尤其，本发明涉及用于免疫的具有在水介质中的佐剂的疫苗，其中最终产品是稳定的。
佐剂是可增强其它化合物的效力或效价，但本身具有很少的药理作用或不具有药理作用的剂。佐剂还可以作为稳定剂或递送***起作用。佐剂是广泛用于人的治疗（human therapies）中，比如广谱的疫苗、联合治疗（其中使用多种药物）、癌症治疗例如化学治疗、激素治疗、放射治疗、免疫治疗和靶向治疗，主要为小分子和大克隆抗体。在化妆品工业中，佐剂主要用于皮肤癌、光老化及在伤口愈合的区域内的药妆品，但也可以用于其它应用中。佐剂还被用于农业中，例如用于动物保健和农业喷雾剂两者中，以增强杀虫剂、杀菌剂、除草剂、取食刺激剂等的性能。
附图说明
图1通过高剪切混合制造的CAF01脂质体的Cryo-TEM图。制剂包含小的单层囊泡，如SUV或如多囊泡UV's。
图2超临界流体方法之前DDA和TDB作为单一组分原料的DSC分析。使用来自TA instruments的微量热计来测量。
图3超临界流体方法（RESS）生产的DDA/TDB脂质粉末（DDA:TDB比例为5:1w/w）的DSC分析。使用来自TA instruments的微量热计来测量。对于没有使用有机溶剂的方法，比较了超临界流体方法期间的搅拌和没有搅拌的影响。
图4在标准的高压釜中通过超临界CO2方法制造的DDA/TDB脂质粉末（DDA:TDB比例为5:1w/w）的DSC分析。脂质粉末的峰明显地区别于图2所示的DDA和TDB原料的那些峰。使用来自TA instruments的微量热计来测量。
图5用高剪切混合再水化的DDA脂质体和CAF01(DDA/TDB)脂质体的DSC温度过程线（thermograph）。从30-55℃，以30℃/小时扫描，操作压力为35psi。VP-DSC微热量计（Microcal，Northhampton，MA）。
图6用高剪切混合再水化的CAF01(DDA/TDB)脂质体的尺寸分布。尺寸分布是用来自Malvern Instruments Ltd.，英国的Malvern Zetasizer-Nano来测量的。
图7A）通过以16000rpm(-●-)、12000rpm(-■-)和24000rpm(-▲-)的高剪切混合制备的CAF01(DDA/TDB)脂质体的平均粒径的时间进展（Time development）。脂质体被分散在调节至pH7.4的10mM Tris缓冲液中。在6000rpm下制备的CAF01脂质体聚集到一定的程度，使得在71天后通过PCS进行进一步测量是不可能的。B）来自血液淋巴细胞的IFN-γ的释放，所述血液淋巴细胞从用通过超声或高剪切方法制备的CAF01(DDA/TDB)中的2μg的Ag85B-ESAT-6/DDA/TDB免疫的C57BI/6j小鼠中分离。血液淋巴细胞是在第三次免疫的1周后分离的且用0.05、0.5和5μg/ml的Ag85B-ESAT-6体外再刺激。
图8A）来自血液淋巴细胞的IFN-γ的释放，血液淋巴细胞从用通过在6000、12000和24000rpm下的高剪切方法制备的CAF05(DDA/TDB/聚(I:C))中的5μg的卵白蛋白来免疫的C57Bl/6j小鼠中分离。在第三次免疫后3周分离脾细胞（spleenocyte），且用5μg/ml的卵白蛋白体外再刺激。B）用通过在6000、12000和24000rpm下的高剪切方法制备的CAF05（DDA/TDB/聚(I:C)）中的卵白蛋白三次免疫后的%SIINFEKL-阳性CD8+T细胞（%SIINFEKL-positive CD8+T-cell）。在第三次免疫后3周分离脾细胞，且用5μg/ml的SIINFEKL体外再刺激。
图9A）来自血液淋巴细胞的IFN-γ的释放，所述血液淋巴细胞从用通过高剪切混合、DRV、冻融、复乳和超声方法制备的CAF05（DDA/TDB/聚(I:C)）中的5μg卵白蛋白来免疫的C57Bl/6j小鼠中分离。在第三次免疫后3周分离脾细胞，且用5μg/ml的卵白蛋白体外再刺激。B）用通过高剪切混合、DRV、冻融、复乳和超声方法制备的CAF05（DDA/TDB/聚(I:C)）中的5μg卵白蛋白免疫三次后的%SIINFEKL-阳性CD8+T细胞。
图10用高剪切混合制造的H56-CAF01疫苗的尺寸分布。粒径分布为148.7±0.6d.nm，用来自Malvern Instruments Ltd.，英国的MalvernZetasizer-Nano测量。
图11CAF05（DDA/TDB/聚(I:C)）的DLS稳定性。通过动态光散射来测量随着时间的变化的平均粒径（n=3）。在2-8℃下储藏时，CAF05制剂在160天内是稳定的，并且在规定（specification）内。
图12CAF05（DDA/TDB/聚(I:C)）的HPLC稳定性。
随着时间的过去，测量CAF05中的DDA和TDB含量。CAF05佐剂样品的两种极性脂质DDA和TDB的含量是用反相HPLC和通过蒸发光散射检测（ELSD）的检测来量化的。CAF05佐剂中的DDA和TDB的含量在360天内没有改变，是稳定的，并且在规定（specification）内，表明当根据所公开的发明来制造时，CAF05是稳定的。
图13增加聚IC含量的稳定CAF05制剂的粒径。
在时间0下，具有从5/1:0.1至5/1:1的不同DDA/TDB：聚(I:C)比率的CAF05（DDA/TDB/聚(I:C)）的制剂的直径都在157-220nm内。观察到，对于含有较高的聚(I.C)的制剂，粒径随着时间的增加较为显著，尽管所有的制剂都是稳定的。
图14粒径对浓度。
在时间0下，对于所有浓缩的整体产品，CAF05（DDA/TDB/聚(I:C)）和CAF09（DDA/MMG/聚(I:C)）的制剂的直径都在165-225nm内。
图15CAF04（DDA/MMG）的DLS稳定性。在此，MMG是类似物3-羟基-2-十四烷基-十八烷酸-2,3-二羟基丙酯。通过动态光散射来测量随着时间变化的平均粒径（n=3）。在2-8℃下储藏时，CAF04制剂在240天内是稳定的并且在规定内。
图16CAF04(DDA/MMG)的HPLC稳定性
测量随着时间变化的CAF04中的DDA含量。●DDA/MMG类似物10.000/4.000；■DDA/MMG类似物10.000/2.000。CAF04佐剂样品的极性脂质DDA的含量是用反相HPLC和通过蒸发光散射检测（ELSD）的检测来量化的。CAF04佐剂中的DDA的含量在60天内没有改变，是稳定的，并且在规定内，表明当根据所公开的发明来制造时，CAF04是稳定的。
实施例
实施例1：用差示扫描仪（differential scanning calometry）（DSC）来检测DDA、TDB和脂质粉末混合物的熔化温度。
起始材料和在超临界CO2流体方法后产生的粉末的DSC温度过程线呈现在图2和图3中。温度过程线是用来自TA instruments的微量热计获得的。用TA instruments的通用软件版本3.9A（universal software v.3.9A）来进行数据采集和分析。
在图2中，DDA的相转变显示出具有89℃的顶点的窄峰。TDB的相转变显示出分别具有在77℃和93℃处的顶点的两个峰。
图3中所示的温度过程线表明，在超临界方法（RESS）期间搅拌没有影响。用超临界流体方法制备的粉末显示出与通过其中使用有机溶剂/共溶剂的脂质膜方法制备的粉末的本质相似性（intrinsic similarity）。
用于获得图3中的图形的超临界流体方法的条件为75℃和140巴。
实施例2：使用超临界二氧化碳方法，没有使用乙醇来制备DDA/TDB脂质粉末。
DDA/TDB脂质粉末（DDA:TDB比率为5:1w/w）的DSC温度过程线显示在图4中。脂质组分被装载到标准的高压釜中，密封且加热至操作条件，对于超临界流体方法，用于获得图4中的图形的操作条件为75℃和140巴。没有添加共溶剂。搅拌液化的悬浮液，之后，在通风之前，使样品冷却至室温。可获得的脂质粉末块可以容易地研磨成细粉末。
实施例3：通过高剪切混合生产稳定的CAF01（DDA/TDB）脂质体
根据所需的最终脂质含量，称取脂质体粉末。根据所称取的脂质含量和所需的最终含量，添加期望的缓冲液，例如10mM Tris pH7.4。在与应用低速下的高剪切混合的同时，将缓冲液和脂质粉末加热至高于相转变温度Tm的温度。可以应用较高的速度水平，然而，不期望的发泡风险随速度的增加而增加。当达到温度Tm时，开始在高旋转速度下的高剪切混合。在高旋转速度下搅拌混合物，直到达到所需的尺寸分布。使脂质体混合物冷却至室温，然后冷冻。
实施例4：通过高剪切混合生产稳定的CAF05（DDA/TDB/聚(I:C)）脂质体
CAF05由三种组分DDA、TDB和聚(I:C)组成。首先，将用高剪切混合水化的DDA/TDB（CAF01）冷却至60℃。在60℃下，将聚(I:C)溶液滴加到液面下，至脂质体溶液中，同时保持高剪切混合。当添加完成时，继续高剪切混合，持续大约5分钟。使CAF05溶液冷却至室温，然后冷冻。稳定性数据显示在图11（粒径分布）和图12（DDA和TDB的HPLC）中。通过应用本发明所公开的制造方法，制造高的脂质和聚(I:C)含量的CAF05制剂是可能的。对于分别高至8000ug/mL、1600ug/mL和1600ug/mL的DDA/TDB/聚(I:C)含量的CAF05制剂，实例显示在图14中。
实施例5：用高剪切混合生产的DDA和CAF01（DDA/TDB）脂质体的熔化温度的测定。
脂质体的DSC温度过程线显示在图5中。DDA的相转变显示出具有46.7℃的顶点的窄峰。DDA/TDB的相转变为分别具有在41.6℃和46.1℃处的两个顶点的从39至47.5℃的宽峰。
用VP_DSC微量热计(Microcal,Northhampton,MA)来进行量热实验。使用从30至55℃的30℃/小时的扫描速率。操作压力为35psi。总的脂质浓度为2750μg/mL。用Microcal’s Origin7软件来进行数据采集和分析。相转变温度被定义成在峰最大值处的温度。
实施例6：脂质体的尺寸分布
在来自英国的Malvern Instruments Ltd的Malvern Zetasizer-Nano系列上的动态光扫描来测量脂质体的平均尺寸。数据是在25℃下获得的且收集测量值三次。使用Malvern Zetasizer PCS版本6.20软件来收集并计算数据。用高剪切混合再水化的CAF01（DDA/TDB）脂质体的尺寸分布显示在图6中。显示在图6中的CAF01脂质体的平均流体动力直径（hydrodynamicdiameter）为163.2±0.493nm。测量值的多分散指数为0.258±0.008。
实施例7：CAF01（DDA/TDB）脂质体的稳定性
通过在6000、12000和24000rpm下的高剪切混合方法制备的CAF01（DDA/TDB）的颗粒的稳定性是通过经由使用Malvern ZetaSizer nanoZS（Malvern Instruments Ltd.，英国）的动态光散射测量来测量随时间变化的粒径来确定的。在第0天，CAF01（DDA/TDB）的制剂被分散在具有pH7.4的10mM Tris缓冲液中。沉淀后，在第1天、第6天、第15天、第21天、第29天、第71天、第92天和第132天进行测量（图7A）。随时间变化的粒径稳定性的比较表明稳定的脂质体是通过在12000rpm和24000rpm下的高剪切混合来获得的。相反，在6000rpm下导致粒径增加，且在4℃下储藏71天后观察到可见的聚集物，且在92天后由于聚集，使进一步的粒径测量是不可能的。
实施例8：H56-CAF01TB疫苗
疫苗候选物H56-CAF01包含与H56重组亚单元蛋白质（ESAT6-Ag85B-Rv2660）复合的CAF01（DDA/TDB）脂质体。将用高剪切混合水化的DDA/TDB冷却至室温，同时维持高剪切混合。缓慢添加H56蛋白质抗原的水溶液，同时维持高剪切混合，持续大约5分钟。在图10中显示的是，应用这种程序，可获得疫苗，而没有可检测的观察到的聚集物。呈现在图10中的CAF01（DDA/TDB）脂质体的平均流体动力直径为148.7±0.600nm。测量值的多分散指数为0.251±0.007。
实施例9：CAF05（DDA/TDB/聚(I:C)）的稳定性
具有不同的聚(I:C)含量的通过高剪切混合方法制备的CAF05（DDA/TDB/聚(I:C)）脂质体的颗粒的稳定性是通过经由使用MalvernZetasizer nano（Malvern Instruments Ltd.，英国)的动态光散射测量来测量随时间变化的粒径来确定的。在第0天，对于在pH7.4的Tris缓冲液中的不同比率的DDA/TDB:聚(I:C)，如实施例4中所述地制备CAF05（DDA/TDB/聚(I:C)）的制剂。在制备后的第0天、第7天和第14天进行粒径分布的测量（图13）。随时间变化的粒径稳定性的比较表明是通过根据所公开的发明的高剪切混合获得了稳定的CAF05脂质体。
实施例10：通过高剪切混合和用旋转混合水化脂质制备的脂质体的免疫原性的比较。
在尾部的基部（the base of the tail），皮下地（s.c.）免疫小鼠，同时每一次免疫之间间隔2周。疫苗（0.2ml/小鼠）包含在300μg CAF01（DDA/TDB）中乳化的2μg的熔合蛋白Ag85B-ESAT-6。在末次免疫后三周，纯化血液淋巴细胞且在用0.05、0.5和5μg的Ag85B-ESAT-6体外再刺激后测量IFN-γ释放水平。与用旋转混合方法产生的免疫应答相比，在12000rpm下的高剪切混合得到较高的（尽管不是显著较高的）IFN-γ应答（图7B）。而且，如在用低的抗原浓度再刺激后用未改变的回忆应答（recall response）所观察到的，维持抗原亲合力（antigen avidity）（图7B）。
实施例11：通过在6000、12000和24000rpm下高剪切混合制备的CAF01脂质体的免疫原性的比较。
在尾部的基部，皮下地（s.c.）免疫小鼠，同时每一次免疫之间间隔2周。疫苗（0.2ml/小鼠）包含在通过在6000、12000和24000rpm下高剪切混合制备的300μg CAF01中乳化的5μg的卵白蛋白。末次免疫后三周，从单个小鼠中纯化脾细胞，且在用5μg的卵白蛋白体外再刺激后测量IFN-γ释放水平（图8A）。在不同的制剂之间未观察到显著的变化，尽管24000rpm的方法得到稍微较低的应答。
此外，通过FACS考察CD8+细胞的量：在1μg/ml抗-CD28和抗-CD49d的存在下，用5μg/ml OVA或5μg/ml的OVA的CD8肽抗原表位来刺激分离的脾细胞，持续1小时。在添加10μg/ml布雷菲德菌素A和0.7μl/ml莫能菌素/Golgi-stop后，细胞随后在37℃下孵育5-6小时。在4℃下储存过夜后，在FACS缓冲液中洗涤细胞，且随后使用在FACS缓冲液中的抗-CD8-PerCP-Cy5.5的1:200稀释液，在4℃下用mAb来进行表面标志物（surface marker）染色，持续30分钟。
立即通过流式细胞术，使用FACScan流式细胞仪（BD）来检验染色的细胞。在三种制剂之间，没有获得以%计的CD+细胞的显著差异（图8B）。
实施例12：通过高剪切混合、DRV、冻融、复乳和超声方法制备的CAF01脂质体的免疫原性的比较。
在尾部的基部，皮下地（s.c.）免疫小鼠，同时每一次免疫之间间隔2周。疫苗（0.2ml/小鼠）包含在通过高剪切混合、DRV、冻融、复乳和超声方法制备的300μg CAF01（DDA/TDB）佐剂中乳化的5μg的卵白蛋白。末次免疫后三周，从单个小鼠中纯化脾细胞，且在用5μg的卵白蛋白体外再刺激后测量IFN-γ释放水平（图9A）。在不同的制剂之间未观察到显著的变化，尽管高剪切混合和冻融方法得到比其它方法高的应答。
此外，通过FACS考察CD8+细胞的量：在1μg/ml抗-CD28和抗-CD49d的存在下，用5μg/ml OVA或5μg/ml的OVA的CD8肽抗原表位来刺激分离的脾细胞，持续1小时。在添加10μg/ml布雷菲德菌素A和0.7μl/ml莫能菌素/Golgi-stop后，细胞随后在37℃下孵育5-6小时。在4℃下储存过夜后，在FACS缓冲液中洗涤细胞，且随后使用在FACS缓冲液中的抗-CD8-PerCP-Cy5.5的1:200稀释液，在4℃下用mAb来进行表面标志物染色，持续30分钟。立即通过流式细胞术，使用FACScan流式细胞仪（BD）来检验染色的细胞。与上述结果一致，与通过DRV方法但不是复乳和超声方法获得的那些应答相比，基于高剪切混合和冻融的制剂诱导显著较高的CD8应答（图9B）。
实施例13：通过高剪切混合生产稳定的CAF09（DDA/MMG/聚(I:C)）脂质体
CAF09由三种组分DDA、合成的MMG类似物（3-羟基-2-十四烷基-十八烷酸-2,3-二羟基丙酯）和聚(I:C)组成。首先，将用高剪切混合水化的DDA/MMG（CAF04）冷却至60℃。在60℃下，将聚(I:C)溶液滴加到液面下，至脂质体溶液中，同时保持高剪切混合。当完成添加时，继续高剪切混合，持续大约5分钟。使CAF09溶液冷却至室温，然后冷冻。用于根据所公开的发明制造的CAF09（165-225nm）的粒径分布的数据显示在图14中。
实施例14：通过高剪切混合生产的具有不同脂质体佐剂的各种疫苗制剂
已经制备了具有来自多种疾病靶标如结核病、HIV、A型流感和衣原体的抗原的用高剪切混合生产的CAF01、CAF04、CAF05和CAF09脂质体的稳定制剂（表1）。
佐剂 抗原 疾病靶标
CAF01 H1 结核病
H56 结核病
TB10.3蛋白质 结核病
TB10.3-P1 结核病
Gag p24 HIV
rMOMP 衣原体
CtH1 衣原体
流感裂解（Influenza split） 流感
CAF05 TB10.3蛋白质 结核病
H56 结核病
Gag p24 HIV
H1 结核病
H4 结核病
TB10.4 结核病
流感裂解 流感
CtH1 衣原体
CAF04 H56 结核病
rMOMP 衣原体
CAF09 H56 结核病
TB10.3 结核病
OVA 模型抗原
流感裂解 流感
表1：疫苗制剂。
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Claims (20)

1.一种使用脂质粉末的高剪切混合来生产脂质体的方法，其中一种脂质组分是具有通式NR1R2R3R4-X的季铵化合物，其中R1和R2各自独立地为含有从1至3个碳原子的短链烷基，R3独立地为氢或甲基或含有从12至20个碳原子，优选地14至18个碳原子的烷基，且R4独立地为含有从12至20个碳原子，优选地从14至18个碳原子的烃基，且X为本身无毒的、药学上可接受的阴离子，所述脂质组分在水溶液中水化。
2.根据权利要求1所述的生产脂质体的方法，还包括中性脂质、糖脂和/或免疫增强剂。
3.根据权利要求1-2所述的生产脂质体的方法，其中所述高剪切混合基于转子-定子原理、均化、超声或挤出。
4.根据权利要求3所述的生产脂质体的方法，其中所述转子的旋转速度为至少3.400rpm。
5.根据权利要求1-4所述的生产脂质体的方法，其中所述脂质粉末是通过超临界流体方法生产的。
6.根据权利要求1-5所述的生产脂质体的方法，其中所述季铵化合物为二甲基双十八烷基铵（DDA）、或二甲基双十八烯基铵（DODA）、或1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二棕榈酰基-3-三甲基铵丙烷、1,2-二硬脂酰基-3-三甲基铵丙烷和二油酰基-3-二甲基铵丙烷（DODAP）、N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵（DOTMA）、十八烯酰氧基(乙基-2-十七烯基-3-羟基乙基)咪唑啉鎓（DOTIM）、1,2-二油烯基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱（DOEPC）和3-十四烷基氨基-叔丁基-N-十四烷基丙脒（二C14-脒）。
7.根据权利要求6所述的生产脂质体的方法，其中所述脂质体额外地包含中性脂质，比如磷脂。
8.根据权利要求6-7所述的生产脂质体的方法，其中通过结合糖脂来稳定所述脂质体。
9.根据权利要求8所述的生产脂质体的方法，其中所述糖脂为α,α′-海藻糖6,6′-二山萮酸酯（TDB），或单分枝酰基甘油（MMG）或其合成类似物。
10.根据权利要求9所述的生产脂质体的方法，其中合成的MMG类似物为3-羟基-2-十四烷基-十八烷酸-2,3-二羟基丙酯。
11.根据权利要求1-10所述的生产脂质体的方法，其中所述脂质体额外地包含免疫增强剂。
12.根据权利要求11所述的生产脂质体的方法，其中所述免疫增强剂选自C型凝集素受体，核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）蛋白质及toll样受体（TLR）家族，比如索状因子（TDM）或合成类似物TDB，单分枝酰基甘油（MMG）或其合成类似物，鞭毛蛋白，脂多糖，肽聚糖或核酸变体，比如胞嘧啶:磷酸酯:鸟嘌呤（CpG）寡聚脱氧核苷酸和双链核糖核酸（dsRNA）如聚肌苷酸:聚胞苷酸（聚(I:C)）。
13.根据权利要求1-12所述的生产脂质体的方法，其中所述脂质体与大分子比如寡核苷酸、肽、蛋白质、碳水化合物和/或脂质复合。
14.一种根据任一前述权利要求生产的脂质体产品。
15.根据权利要求14所述的脂质体产品，其中所述脂质体包含DDA和TDB。
16.根据权利要求14所述的脂质体产品，其中所述脂质体包含DDA和合成的MMG类似物。
17.根据权利要求14-16所述的脂质体产品，其中所述脂质体还包含聚(I:C)。
18.根据权利要求14-17所述的脂质体产品，其包含抗原。
19.根据权利要求18所述的脂质体产品，其中所述抗原为ESAT6-Ag85B或ESAT6-Ag85B-Rv2660。
20.根据权利要求14-19的脂质体产品用于制造佐剂、疫苗、递送***、药物或药妆品的用途。
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