CN1985851A - 含有蟾酥提取物的脂质微球注射液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含蟾酥脂溶物的脂质微球注射液和水包油乳剂的组合物，和其制备方法。它包括蟾酥脂溶物、脂溶性介质、水、表面活性剂和等渗调节剂，其组成的质量百分比为：脂溶性介质1％至30％，蟾酥脂溶物0.0001％至5％，表面活性剂0.5％至10％，等渗调节剂0.5％至10％，余量为水。本制剂具有抗癌镇痛的作用，将降低蟾酥的血管刺激性，避免有效成分被心脏摄取引起的心脏毒性，提高药物瘤体内浓度。

Description

含有蟾酥提取物的脂质微球注射液及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，确切地说它是一种含有蟾酥脂溶物的脂质微球注射液(水包油乳剂)及制备方法。

背景技术

多年来，人们虽然进行了诸多努力并取得较大的进展，但迄今为止肿瘤的危害仍未能被有效遏制。有数据表明，2002年国内因恶性肿瘤及癌症致死的人数占当年死亡人口总数的25.37％，肿瘤已成为危害人类健康的第一杀手。近两年来，肿瘤的发病呈上升趋势，发病年龄也从平均的55岁明显下移。可以预言，在今后的二、三十年内，癌症的发病率及死亡率将呈继续上升的趋势。

癌性疼痛是癌症患者最常见且最难控制的症状，也是影响患者生活质量的重要因素。我国现有癌症病人200万，每年新发病人160万，癌痛发生率为51.5％。世界卫生组织(WHO)于1982年成立了世界卫生组织癌痛治疗委员会，并提出到2000年达到全世界范围内“使癌症病人不痛”的目标。然而令人遗憾的是目前大约30％～50％的癌痛患者仍然没有获得满意的缓解。目前，癌痛作为影响抗癌计划有效进行、影响生存质量的重要因素已受到广泛重视，癌性疼痛的相关研究已成为全球性的重要研究课题。应用WHO大力推广的“三阶梯药物止痛法”控制癌痛的方案，疗效虽然比较确切，但长期使用镇痛剂毒副作用大，成瘾性、依赖性强，并受患者耐受性的限制，致使部分病人止痛效果欠佳。

由于多数抗肿瘤药物不良反应严重，在治疗过程中对患者的身心造成很大伤害，因此如何在提高药物疗效的同时，减轻患者痛苦，降低药物的刺激性及毒性，从而提高患者生存质量，尽可能延长患者的生命逐渐成为目前抗肿瘤药物研究新的方向与重点。中医药在肿瘤治疗领域中有其独特的功效，无论在抑制或杀伤肿瘤细胞方面，还是术后调理，减轻放、化疗不良反应，改善症状和体征，提高生存质量等方面，均发挥了重要的作用。

蟾酥又名蟾蜍眉脂(《药性论》)，蟾蜍眉酥(《日华子本草》)，癞蛤蟆浆(《新疆药材》)，蛤蟆酥(《山东中药》)，蛤蟆浆(《中药材手册》)，为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo Bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictusSchneide等的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液，经加工干燥而成。性甘辛，温(也有医书提出蟾酥味为辛凉的观点)，有毒。能解毒，消肿，强心，止痛。治疗疮，痈疽，发背等症。蟾蜍及相关制剂***，在我国具有非常悠久的历史。我国第一部本草专著《神农本草经》中就记载着：“虾蟆味辛寒，主那气，破疙坚血，痈肿，阴疮，服之不患热病”。

现代研究表明蟾蜍体内包含多种化学成分，按溶解性质的不同可分为两大类，脂溶性部分约占20％，具有甾体结构，统称为蟾蜍甾类(Bufosterol)。水溶性部分为一定量的吲哚类生物碱，以及部分多糖类、有机酸和氨基酸等。

研究证实蟾酥抗癌有效成分多为脂溶性化合物，其中脂蟾毒配基、蟾毒灵、华蟾素毒基含量较多、活性较强。蟾酥脂溶性成分的抗癌、缓解癌痛的药理作用及其分子药理学机制的研究已成为近年来国内外研究的热点和焦点。

蟾毒灵                                R

                          华蟾毒精    OCOCH₃

                          脂蟾毒配基  H

药理学研究表明，蟾酥抗癌、缓解癌痛的主要作用机制为：(1)抑制癌细胞DNA和RNA的生物合成。(2)破坏瘤细胞的线粒体及粗面型内质网。(3)诱导癌细胞分化、凋亡。(4)提高cAMP及cAMP/cGMP之值。(5)提高小鼠血清IgG和白细胞总数。(6)增强巨噬细胞吞噬作用、刺激机体释放抗肿瘤细胞因子。更新研究显示蟾毒灵能够抑制肿瘤血管内皮和血管增生，与传统的肿瘤治疗相比，抑制肿瘤组织血管生成药物主要针对已经启动的新生血管，故具有特异性。同时它还能提高机体免疫力，减轻化疗的毒副反应，降低癌痛发生率，增强机体对放疗、化疗的耐受性，在适宜剂量内，毒性极小。但是蟾酥脂溶性提取物在生物体内分布广泛，静脉注射后容易引起过敏反应，对于血管具有刺激性，同时会引起室性早搏等心脏不良反应。

华蟾素注射液、蟾酥注射液研制上市较早，以当时的新药审批标准，只要求其提供稳定的可重复的成份做为质控标准，所以是以5-羟色胺计吲哚类生物碱含量不少于0.50％(mg/ml)为质控标准。但是迄今未见到蟾蜍中吲哚类生物碱类成份被证实有抗肿瘤作用研究的报导，相反，肿瘤患者体内生过多的5-羟色胺会导致类癌综合征的发生，临床表现为头面部阵发性充血潮红，心动过速和血压升高，也可引起呼吸困难、哮喘，有的病人可致顽固性腹泻。蟾毒色胺是5-羟色胺的衍生物，药理作用与致幻剂麦角酰二乙胺相似。人体内有较低含量分布，但在尿中含量检测呈阴性，而孤独症或强迫症患者的尿中***量明显升高。因此用5-羟色胺来做药物的质控成份不但是不合适，而且还会给蟾酥临床安全使用带来潜在隐患。

脂肪乳剂的特殊的理化特性和低毒性决定了其可以作为脂溶性药物，特别是抗癌药物、***物及抗炎药物的良好载体。常采用的方法是将药物包裹于脂肪乳剂的脂质核心部分，由于该结构亦类似于微球，因此脂质微球(LipidMicrosphere，LM)的名称也应运而生。一般认为脂质微球是通过将药物溶于脂肪油中，并经磷脂乳化分散于水相后制成，是一种以脂肪油为软基质而被磷脂膜包封的微粒分散体系，平均粒径在200nm左右。

LM具有许多物理化学及生物学上的优点：(1)是脂溶性药物的良好载体，避免了有机溶剂的使用。(2)相当一部分药物分布在油相或油水界面膜中，对于易水解或对pH变化敏感的药物，这种“隔离”能保护药物免遭破坏，同时避免了与体液的直接接触，降低了药物自身可能产生的局部及血管刺激性。(3)微粒载体能将所载药物集中运送到特定部位释放而发挥疗效。粒径在200nm左右的小微粒能被机体的网状组织***的吞噬细胞所吞噬而滞留在网状组织***(如肝脏、肺等)，对癌症的治疗具有重要意义。

本研究将开发出具有药物炸弹靶向治疗作用的蟾酥新剂型--蟾酥脂质微球注射液，降低药物对于血管刺激性，避免有效成分被心脏摄取，提高药物瘤体内浓度。这无疑将对充分发挥其抗肿瘤活性，降低癌痛发生率，进一步促进和推广蟾酥在临床的应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种含有蟾酥脂溶物的脂质微球注射液(水包油乳剂)及制备方法。

该注射液包含蟾酥脂溶物，脂溶性介质，水和表面活性剂。其中蟾酥脂溶物为具有甾体结构的蟾蜍甾类(Bufosterol)，该类物质来源于蟾酥药材，或者经由蟾蜍直接提取转化，或者由人工合成配制。

脂溶性介质指示一大类生理可接受性物质，不管是矿物油，植物油，动物油，精油或合成油，或其混合物。因此，脂溶性介质用以指一个宽范围的具有十分不同化学性质的物质。在以类型或功能分类油时，如矿物油源自石油并包含脂肪或蜡基烃，芳香烃或混合的脂肪与芳香基烃。在矿物油类别中也包含石油衍生的油如精制石蜡油等。在植物油类别中，油主要来源于种子或坚果，并包含干性油如亚麻子和桐油；半干性油如红花油和大豆油；不干性油如蓖麻油、棉籽油和椰子油和可用作的皂料如棕榈油和椰子油。在动物油类别中，油通常来自作为牛羊脂，猪油和硬脂酸的脂肪。液状动物油包含鱼油，油酸，鲸蜡油等。它们通常含大量脂肪酸。包含一些植物油，如橄榄油，棉籽油，谷物油和花生油，也包含一些特殊的鱼油，它们由于富含维生素而被广泛的用作药物，如鳕鱼肝，鲨鱼肝油等。液状脂肪油如单、双、三甘油酯，或其混合物为优选的油。根据本发明，中等链长的三甘油酯也为有用的油。优选为长链脂肪酸甘油酯、中链脂肪酸甘油酯，及其混合物。

所用表面活性剂可为任何表面活性剂，通常为磷脂，聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(吐温，Tween)，聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物类(普朗尼克，Poloxamer，Pluronic)，油酸钠，油酸，胆酸，胆酸钠，去氧胆酸，去氧胆酸钠及其混合物。所述磷脂选自卵磷脂，豆磷脂，及其混合物。所述吐温选自吐温20，吐温40，吐温60，吐温80，吐温85，及其混合物。优选为卵磷脂，豆磷脂，油酸钠，油酸，吐温80，普朗尼克F68，及其混合物。

典型地，以制剂组成质量百分比计本发明的配方组成为：

脂溶性介质1％～30％

蟾酥脂溶物0.0001％～5％

表面活性剂0.5％～10％

等渗调节剂0.5％～10％

其余为注射用水

如果需要，组合物中也可以添加多种添加剂。如可能含有金属螯合剂。一般金属螯合剂为乙二胺四乙酸二钠，乙二胺四乙酸二钠钙，乙二胺四乙酸二钠镁及其混合物。金属螯合剂以制剂计用量为约0％至约1％。

本发明也涉及含有蟾酥脂溶物的脂质微球注射液和水包油乳剂的制备方法。包含以下步骤中的一种或几种：

1.将蟾酥脂溶物超微颗粒混悬液或者是超微的粉末加入至不含蟾酥脂溶物的空白乳剂或者是含有部分蟾酥脂溶物的乳剂中经高压均质过程混合制得蟾酥脂溶物脂质微球注射液。

2.将蟾酥脂溶物与脂溶性介质加热混和，待有效成分溶解于脂溶性介质后，通过过滤或离心除去杂质，再分散在水相中，经过高速搅拌制备初乳。

3.将蟾酥脂溶物与表面活性剂溶解在有机溶剂中，然后除去有机溶剂，将剩余物质与脂溶性介质加热混合，再分散在水相中，经过高速搅拌制备初乳。

4.该制剂的制备方法主要包括高速搅拌过程及高压均质过程。

5.制剂的灭菌采用高压旋转灭菌法。

本研究将制备出具有药物炸弹靶向治疗作用的蟾酥新剂型--蟾酥脂质微球注射液，临床用于抗癌镇痛，该注射液将降低蟾酥的血管刺激性，避免有效成分被心脏摄取，提高药物瘤体内浓度。

附图说明：

图1为脂质微球结构示意图。

图2为不同浓度乙醇对提取结果的影响。

(其中，

表示提取干燥物中指标成分含量和，

表示指标成分转移率)

图3为不同粒度粉末对提取结果的影响。

(其中， 表示提取干燥物中指标成分含量和， 表示指标成分转移率)

图4为提取回流时间对提取结果的影响。

(其中，表示指标成分转移率，

表示提取干燥物中指标成分含量和)

图5为蟾酥提取物表观油水分配系数(Log P)的测定。

(其中，

表示蟾毒灵， 表示华蟾毒配基，

表示脂蟾毒配基)

图6为蟾酥脂质微球注射液作用HGC细胞24h对成活率的影响

(其中， 表示空白乳剂组，表示 表示阴性对照组， 表示蟾酥脂质微球组)

图7为蟾酥脂质微球注射液作用A549细胞24h对成活率的影响

(其中， 表示空白乳剂组，表示 表示阴性对照组， 表示蟾酥脂质微球组)

图8为蟾酥脂质微球注射液作用U87细胞24h对成活率的影响

(其中， 表示空白乳剂组，■表示蟾酥脂质微球组)

图9为蟾酥脂质微球注射液作用U251细胞24h对成活率的影响

(其中， 表示空白乳剂组，■表示蟾酥脂质微球组)

具体实施方式

实施例1

蟾酥脂质微球注射液的处方制备工艺

处方1：

薏苡仁油1-30g

蟾酥脂溶物0.0001g-5g

卵磷脂0.5-10g

甘油0.5-10g

注射用水加至100ml

制备方法1：

(1)将处方量的卵磷脂、甘油加入适量注射用水中在40-100℃进行混合得水相；(2)将蟾酥脂溶物加入薏苡仁油中，在40-100℃加热至有效成分完全溶解后经过0.45μm得澄清油相；(3)将水相和油相混合后转入组织捣碎机内，搅拌数分钟，1-5次，制备得初乳；(4)取上述初乳加入注射用水至全量，调节pH5-8，转移至高压均质机内，匀化1-10次，取样镜检，至油滴在0.5μm以下；(5)取均质后乳剂灌封于输液瓶中，充氮，置于高压旋转灭菌器中灭菌。

处方2：

大豆油1-30g

蟾酥脂溶物0.0001g-5g

豆磷脂0.5-10g

甘油0.5-10g

油酸0.5-10g

注射用水加至100ml

制备方法2：

(1)将处方量甘油加入适量注射用水中在40-100℃进行混合得水相；(2)将蟾酥脂溶物，豆磷脂，油酸加入大豆油中，在40-100℃加热至有效成分完全溶解后经过0.45μm得澄清油相；(3)将水相和油相混合后转入组织捣碎机内，搅拌数分钟，1-5次，制备得初乳；(4)取上述初乳加入注射用水至全量，调节pH5-8，转移至高压均质机内，匀化1-10次，取样镜检，至油滴在0.5μm以下；(5)取均质后乳剂灌封于输液瓶中，充氮，置于高压旋转灭菌器中灭菌。

处方3：

中链脂肪酸甘油酯1-30g

蟾酥脂溶物0.0001g-5g

豆磷脂0.5-10g

甘油0.5-10g

油酸钠0.5-10g

注射用水加至100ml

制备方法3：

(1)将处方量甘油，油酸钠加入适量注射用水中在40-100℃进行混合得水相，调节水相pH为4-7；(2)将蟾酥脂溶物，豆磷脂加入中链脂肪酸甘油酯中，在40-100℃加热至有效成分完全溶解后经过离心得澄清油相；(3)将水相和油相混合后转入组织捣碎机内，搅拌数分钟，1-5次，制备得初乳；(4)取上述初乳加入注射用水至全量，调节pH5-8，转移至高压均质机内，匀化1-10次，取样镜检，至油滴在0.5μm以下；(5)取均质后乳剂灌封于输液瓶中，充氮，置于高压旋转灭菌器中灭菌。

处方4：

鸦胆子油1-30g

蟾酥脂溶物0.0001g-5g

豆磷脂0.5-10g

甘油0.5-10g

油酸0.5-10g

注射用水加至100ml

制备方法4：

(1)将处方量甘油加入适量注射用水中在40-100℃进行混合得水相；(2)将蟾酥脂溶物，豆磷脂，油酸加入鸦胆子油中，在40-100℃加热至有效成分完全溶解后经过0.45μm得澄清油相；(3)将水相和油相混合后转入组织捣碎机内，搅拌数分钟，1-5次，制备得初乳；(4)取上述初乳加入注射用水至全量，调节pH5-8，转移至高压均质机内，匀化1-10次，取样镜检，至油滴在0.5μm以下；(5)取均质后乳剂灌封于输液瓶中，充氮，置于高压旋转灭菌器中灭菌。

处方5：

大豆油1-30g

蟾酥脂溶物0.0001g-5g

豆磷脂0.5-10g

甘油0.5-10g

油酸0.5-10g

吐温800.5-10g

EDTA-2Na 0-1g

注射用水加至100ml

制备方法5：

(1)将处方量甘油，吐温80，EDTA-2Na加入适量注射用水中在40-100℃进行混合得水相；(2)将蟾酥脂溶物，豆磷脂，油酸加入大豆油中，在40-100℃加热至有效成分完全溶解后经过0.45μm得澄清油相；(3)将水相和油相混合后转入组织捣碎机内，搅拌数分钟，1-5次，制备得初乳；(4)取上述初乳加入注射用水至全量，调节pH5-8，转移至高压均质机内，匀化1-10次，取样镜检，至油滴在0.5μm以下；(5)取均质后乳剂灌封于输液瓶中，充氮，置于高压旋转灭菌器中灭菌。

处方6：

大豆油/中链脂肪酸甘油酯1-30g

蟾酥脂溶物0.0001g-5g

卵磷脂0.5-10g

甘油0.5-10g

吐温-800.5-10g

F68 0.5-10g

EDTA-2Na 0-1g

注射用水加至100ml

制备方法6：

(1)将处方量蟾酥脂溶物分散于Tween-80溶液中，高速搅拌器搅拌数分钟，1-5次，然后用高压乳匀机匀化1-10次(50-100MP，20-100℃)得药物分散溶液(2)将处方量的卵磷脂、甘油与预热至40-100℃的药物分散溶液进行混合，转入组织捣碎机内，搅拌数分钟，1-5次，直至各成份均匀分散；(3)于上述分散液中加入处方量的预热至40-100℃的大豆油，转入组织捣碎机内，搅拌数分钟，1-5次，直至油相均匀分散，加入20-100℃的注射用水至全量；(4)取上述初乳加入注射用水至全量，调节pH5-8，转移至高压均质机内，匀化1-10次，取样镜检，至油滴在0.5μm以下；(5)取均质后乳剂灌封于输液瓶中，充氮，置于高压旋转灭菌器中灭菌。

处方7：

红花油1-30g

蟾酥脂溶物0.0001g-5g

卵磷脂0.5-5g

甘油0-5g

Tween-80 0-1g

注射用水加至100ml

制备方法7：

(1)将处方量蟾酥脂溶物分散于Tween-80溶液中，高速搅拌器搅拌数分钟，1-5次，然后用高压乳匀机匀化1-10次(50-100MP，20-100℃)得药物分散溶液(2)将处方量的卵磷脂、甘油与预热至40-100℃的注射用水进行混合，转入组织捣碎机内，搅拌数分钟，1-5次，直至各成份均匀分散得水相；(3)将水相加入处方量的预热至40-100℃的大豆油，转入组织捣碎机内，搅拌数分钟，1-5次，直至油相均匀分散，加入20-100℃的注射用水至全量；(4)将蟾酥脂溶物超微颗粒混悬液加入空白乳剂中高速搅拌；(5)取上述初乳加入注射用水至全量，调节pH5-8，转移至高压均质机内，匀化1-10次，取样镜检，至油滴在0.5μm以下；(6)取蟾酥脂溶物亚微乳剂灌封于输液瓶中，充氮，置于高压旋转灭菌器中，灭菌。

处方8：

油相(大豆油/MCT)5-30g

蟾酥脂溶物0.0001g-5g

卵磷脂0.5-5g

甘油0-5g

油酸钠0-1g

EDTA 0-1g

注射用水加至100mL

制备方法8：

(1)将注射用甘油、油酸钠、EDTA、F68分散于适量注射用水中，至磁力搅拌器中加热至40-100℃搅拌至全部溶解；(2)注射用卵磷脂、Tween-80、加入至由注射用MCT、注射用大豆油组成的混合油相中，加热至40-100℃下搅拌至卵磷脂完全溶解，加入蟾酥脂溶物，进行高压均质。(3)将油相加入至水相中，置于高速组织捣碎机搅拌数分钟，1-5次。(4)调节pH值至4-9，注射用水稀释定容至处方量，转移至高压均质机均质3-10次。(5)装瓶，封罐氮气，置于高压旋转灭菌器中，灭菌。

除以上所列处方中组合物外，按以上方法另外制备5个制剂，它们的质量组成百分比如下(其余为水)：

蟾酥脂溶物

0.0001-5％

大豆油、红花油、薏苡仁油、鸦胆子油、中链脂肪酸甘油酯	1％-30％
		卵磷脂、豆磷脂	0.5％-10％
油酸、油酸钠	0.5％-10％
		胆酸、去氧胆酸钠	0.5％-10％
甘油，山梨醇，甘露醇，葡萄糖	0.5％-10％
		EDTA	0-1％
Poloxamer F68	0.5％-10％
		吐温80	0.5％-10％

实施例2

蟾酥提取工艺的研究

1不同浓度乙醇对提取结果的影响

选取蟾酥药材细粉，采用10倍量(1g∶10mL)不同比例乙醇加热回流1小时，放至室温，抽滤，滤液蒸干，滤液干燥物及残渣各真空干燥一天。分别测定干燥物中指标性成份含量。结果见图2。

随着乙醇浓度的增大，指标成分在干燥提取物中的含量增加，在外观上可以看出90％乙醇提取液色泽接近无色，而70％乙醇提取液则呈黄色。同时也由于90％乙醇除杂能力强，干燥提取物质量明显低于较低浓度乙醇提取干燥物，所以提取物收率最低，计算出的药物转移率最低。另外有文献报道，通过细胞活力检测各种不同的蟾蛛毒素提取物及层析纯化物对HL60细胞增殖抑制强度不同，其抑制作用最强的为80％乙醇回流产物。综合考虑，本试验初步选择80％乙醇作为提取溶剂进行其他指标的考察。

2不同粒度粉末对提取结果的影响

取不同粒度蟾酥药材粉末三份，采用10倍量(1g∶10mL)80％乙醇加热回流1小时，放至室温，抽滤，滤液蒸干，滤液干燥物及残渣各真空干燥一天，分别测定干燥物中指标性成份含量。结果见图3。

在本试验操作中所采用的粉碎机在短时间内即可将药材粉碎在60目以下，其中多数分布在80-100目。因此我们只对60-80目，80-100目及小于100目的粉末进行了提取考察。结果显示三种范围粉末在80％乙醇回流提取1小时后的提取结果没有明显差异。

3提取回流时间对提取结果的影响

选取蟾酥药材细粉，采用10倍量(1g∶10mL)80％乙醇加热回流0.5、1、2小时，放至室温，抽滤，滤液蒸干，滤液干燥物及残渣各真空干燥一天，分别测定干燥物中指标性成份含量。结果见图4。由图看出，提取时间超过1小时后，无论是提取物中指标性成份含量或是其转移率均未有明显变化。因此初步确定在其他提取条件不变前提下，乙醇回流时间为1小时。

4单因素考察后提取工艺验证试验

依单因素考察提取工艺试验结果，初步确定蟾酥脂溶物提取工艺为：选取蟾酥药材细粉，采用10倍量(1g∶10mL)80％乙醇加热回流1小时，放至室温，抽滤，滤液蒸干，所得干燥物真空干燥一天。取蟾酥药材三份，依上述提取工艺进行验证试验，测定干燥物中指标性成份含量及转移率。结果表明提取工艺重现性良好，提取物收率指标性成份百分含量的平均值为27.5 4％，转移率平均值为84.63％。

表1单因素考察后提取工艺验证试验

编号123meanRSD(％)	提取物收率	提取物指标成份百分含量和(％)				转移率
							(％)36.736.336.236.40.7	B7.057.067.137.080.6	C9.159.289.129.180.9	R11.5211.3811.4211.440.6	Σ27.7227.2227.6727.541.0	(％)85.084.684.384.630.4

实施例3

蟾酥脂质微球注射液粒径及ζ-电位的测定

粒径和粒度分布是脂质微球最重要的特性之一，对静脉注射用脂质微球的粒度要求目前尚无统一规定，已报道的产品一般粒径均匀，平均小于1μm，无聚集合并现象，在1滴乳剂液中(0.05mL)，10-15μm的乳滴不多于2颗，无大于15μm的乳滴。目前关于脂质微球的乳滴粒度测定常采用的方法有显微镜法、动态光散射法、激光散射法、Coulter计数法等。本试验中LM的粒度测定方法是采用光学显微镜及光子相关光谱法(Photon-Correlation Spectroscopy，PCS)，也称动态光散射原理(Dynamic light scatter，DLS，NicompTM PSS 380)。

使用NicompTM PSS 380进行粒度测定的操作方法为：将样品用过0.22μm微孔滤膜的注射用水稀释约5000倍，立即放入样品池内，将光强度(Intensity)调节至300左右，光源为HeNe激光(λ₀＝633nm)，将操作参数中温度设为测定时室温，开始测定，保持测定至Time history曲线趋于直线时停止测定，保存数据。实验结果见图5。

实施例4

蟾酥脂质微球注射液半数致死量的测定

实验材料

1实验动物：昆明种小白鼠，体重(20±2)g，雌雄各半。

2实验药品和试剂

蟾酥脂质微球注射液(生药含量：40mg/50ml)；空白乳剂。

3实验方法

蟾酥脂质微球注射液原液，按1∶0.7比例稀释，配成4个浓度的溶液。取禁食24小时的小鼠50只，每10只一组，1-4组按以上不同稀释度的溶液尾静脉注射，第5组为空白对照组，注射容量均为0.24ml/10g体重。给药后立即观察，随后每4h观察1次，24h后每天观察1次，直至14d结束。观察各种毒性反应、中枢神经***症状和其它异常表现；记录死亡动物的死亡时间和只数。并及时解剖死亡动物，取出心脏、肺，实验结束时解剖全部动物，取出心脏、肺，生理盐水冲洗后置于10％甲醛溶液中固定，做病理学检查。

4实验结果

蟾酥脂质微球注射液高剂量组的中枢神经***的急性毒性表现为实验动物全身抽搐、部分实验动物出现强直、角弓反张致死；呼吸***的表现为呼吸加快；心血管***的表现为心动过速；此外还可见上眼睑下垂、眼球突出以及失禁等症状；中、低剂量组中枢神经***的表现不明显，多数动物处于静卧状态，上眼睑下垂、呼吸急促，心动过速。死亡动物进行大体解剖，肉眼可见肺部淤血。其近似LD₅₀见表2。

表2：蟾酥脂质微球注射液LD₅₀测定结果

剂量(mg/kg)(d)	剂量对数值(x)	死亡率(p)	机率单位(y)	权重(w)
					9.4113.4419.20	0.9741.1281.283	2/10(20％)5/10(50％)9/10(90％)	4.165.06.28	4.906.393.43

Σ15.44   Σ14.72

采用简化机率法计算蟾酥脂质微球注射液的半数致死量。

${\mathrm{IgLD}}_{50}-\frac{2i(y_x-\stackrel{-}{y})}{y_3-Y_1}+X_2$

＝2×0.1549(5-5.147)/(6.28-4.16)+1.128

＝1.107

LD₅₀＝10^-11.107＝12.794mg/kg

$S_{x50}\frac{2i}{{(y_3-y_1)}^2}\sqrt{\frac{6{(y_k-\stackrel{-}{y})}^2+{(y_3-y_1)}^2}{\mathrm{\ΣW}}}$

＝0.0689×0.56

＝0.0216

LD₅₀的95％平均可信限＝LD₅₀±4.5×Sx₅₀×LD₅₀

＝12.794±1.244mg/kg

实施例5

蟾酥脂质微球注射液对肿瘤细胞成活率的影响

药品：蟾酥脂质微球注射液(以原药材计0.8mg/ml，沈阳药科大学药剂教研室提供)

试剂：1640、DMEM、FBS、CS、MTT

细胞系：HGC stomach carcinoma(human)，A549 lung carcinoma(human)，U87 astrocytoma(human)，U251 astrocytoma(human)

方法(MTT比色法)：

取对数生长期的细胞以10×10⁴/ml的密度加在96孔培养板中，37℃、5％CO₂条件下培养24h，换无血清培养液后，将蟾酥脂质微球注射液用无血清培养液稀释成不同浓度分别加入实验孔中，另设不加药阴性对照和各相应浓度空白乳剂对照，每个浓度设5个复孔，继续培养24h，培养结束后加MTT(终浓度0.25％)继续孵育3h，孵育结束后换DMSO100μl/孔，作用10min，在酶标仪492nm处测吸光度A值。抑制率＝(1-加药组吸光度值/空白组吸光度值)×100％。

统计方法：采用one-way ANOVA结合dunnett test比较各浓度空白乳剂与培养液对照组之间的差异(*P＜0.05)；采用Independent sample t-test比较给药组与相应浓度空白乳剂对照组(#P＜0.05)。

结果：

1、蟾酥脂质微球注射液作用HGC细胞24h对成活率的影响

由图6可见，各浓度空白乳剂对细胞成活率有一些影响，但是没有显著性差异，可能是由于标准差较大造成的。与其乳剂对照组相比，8和80μg/ml组可显著性降低HGC的成活率。

2、蟾酥脂质微球注射液作用A549细胞24h对成活率的影响

由图7可见，各浓度空白乳剂对细胞成活率有一些影响，空白乳剂稀释10倍组可显著抑制细胞成活率。与其乳剂对照组相比，8和80μg/ml组可显著性降低A549的成活率。

3、蟾酥脂质微球注射液作用U87细胞24h对成活率的影响

由图8可见，各浓度的空白乳剂对照组均不影响U87的成活率，0.08、0.8、8、80μg/ml可显著性降低细胞成活率，最大可抑制50％左右。

4、蟾酥脂质微球注射液作用U251细胞24h对成活率的影响

由图9可见，稀释空白乳剂10³、10⁴倍能显著影响U251的成活率，0.08、0.8、8、80μg/ml可显著性降低细胞成活率，最大可抑制40％左右。

实施例6

蟾酥脂质微球注射液小鼠醋酸扭体试验报告

器材：1ml注射器、天平、秒表。

药品：0.7％醋酸溶液；蟾酥脂质微球注射液(以原药材计0.8mg/ml，沈阳药科大学药剂教研室提供)

动物：昆明种小白鼠(18～22g)。

方法：(1)蟾酥脂质微球注射液量效关系的考察：将小白鼠随机分为8组，每组12只，腹腔给予不同浓度的蟾酥脂质微球注射液，给药体积为0.2ml/10g。给药后1h各鼠腹腔注射0.7％醋酸溶液0.2ml。观察并记录15min内出现扭体反应的次数，计算扭体抑制率，进行组间差异性比较。(2)蟾酥脂质微球注射液时效关系的考察：将小白鼠随机分为5组，每组6只，腹腔给予蟾酥脂质微球注射液，剂量为量效结果中与溶剂对照组有显著性差异的最低剂量，给药体积为0.2ml/10g。各组动物分别在给药0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h后腹腔注射0.7％醋酸溶液0.2ml，观察并记录15min内出现扭体反应的次数，计算扭体抑制率。

结果：

(1)小鼠醋酸扭体法考察蟾酥脂质微球注射液量效关系，如下表。

组别	剂量(按生约量计，mg/ml)	例数(只)	15min内扭体次数(X±SD)	抑制率(％)
					12	0.40.16	1212	6.33±4.479**6.50±3.754**	69.0068.17

345678

0.080.040.020.010.008溶剂对照组

121212121212

7.17±4.549**7.92±4.441**9.25±5.446*11.67±5.01515.08±4.71920.42±7.489

64.8961.2154.7042.8526.850.00

注：与溶剂对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

(2)小鼠醋酸扭体法考察蟾酥脂质微球注射液时效关系，如下表。

组别	剂量(按生药计)mg/ml	例数(只)	时间(h)	15min内扭体次数(X±SE)	抑制率(％)
						12345	0.02溶剂对照组0.02溶剂对照组0.02溶剂对照组0.02溶剂对照组0.02溶剂对照组	6666666666	0.50.51.01.01.51.52.02.02.52.5	11.50±3.65820.50±2.9303.83±1.68221.07±3.4393.83±1.35221.67±3.0841.33±0.49419.00±2.7935.33±1.40619.83±2.496	43.9081.9182.3393.0073.12

【结论】量效关系的试验结果表明，药物浓度为0.4mg/ml、0.16mg/ml、0.08mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml时均能够显著抑制醋酸引起的小鼠扭体反应。经计算，蟾酥脂质微球注射液对小鼠醋酸扭体反应的半数有效量ED₅₀＝0.0253mg/ml。时效关系的试验结果表明，给药2h后，对醋酸引起的扭体反应抑制最为显著。

Claims (9)

1、一种含有蟾酥脂溶物的脂质微球注射液，其特征在于：它包括蟾酥脂溶物、脂溶性介质、水、表面活性剂和等渗调节剂，其组成的质量百分比为：

脂溶性介质1％至30％，

蟾酥脂溶物0.0001％至5％，

表面活性剂0.5％至10％，

等渗调节剂0.5％至10％，

余量为水。

2、根据权利要求1所述的一种含有蟾酥脂溶物的脂质微球注射液，其特征在于：所述注射液包括供静脉输液用的含蟾酥脂溶物的水包油乳剂，构成此类水包油乳剂的组合物与构成脂质微球注射液的组合物相同。

3、根据权利要求1或2所述的一种含有蟾酥脂溶物的脂质微球注射液，其特征在于：所述蟾酥脂溶物为具有甾体结构的蟾蜍甾类(Bufosterol)，该类物质来源于蟾酥药材，或者经由蟾蜍直接提取转化，或者由人工合成配制。

4、根据权利要求1或2所述的一种含有蟾酥脂溶物的脂质微球注射液，其特征在于：制剂中还含有金属螯合剂，其组成质量百分比为0％至1％，所述金属螯合剂(EDTA)为乙二胺四乙酸二钠，乙二胺四乙酸二钠钙，乙二胺四乙酸二钠镁或其混合物；所述等渗调节剂为甘油、山梨醇、甘露醇、葡萄糖，及其混合物；此外制剂中还含有氢氧化钠，盐酸，及其混合物。

5、根据权利要求1或2所述的一种含有蟾酥脂溶物的脂质微球注射液，其特征在于：所述的脂溶性介质选自矿物油，植物油，动物油，精油和合成油，或其混合物；所述表面活性剂选自磷脂，聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(吐温，Tween)，聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物类(普朗尼克，Poloxamer，Pluronic)，油酸钠，油酸，胆酸，胆酸钠，去氧胆酸，去氧胆酸钠及其混合物。

6、根据权利要求1或2所述的一种含有蟾酥脂溶物的脂质微球注射液，其特征在于：所述油选自红花油，藏红花油，大豆油，玉米油，蓖麻油，棉籽油，椰子油，棕榈油，中链脂肪酸甘油三酯(MCT)，薏苡仁油，鸦胆子油，及其混合物；其中所述磷脂选自卵磷脂，豆磷脂，人工合成磷脂，或者是以上不同规格的任意比例混合物；所述吐温选自吐温20，吐温40，吐温60，吐温80，吐温85，或者是以上不同规格的任意比例混合物。

7、根据权利要求1或2所述的一种含有蟾酥脂溶物的脂质微球注射液，其特征在于：包含以下工艺步骤：将蟾酥脂溶物超微颗粒混悬液或者是超微粉末加入至不含蟾酥脂溶物的空白乳剂或者是含有部分蟾酥脂溶物的乳剂中经高压均质过程混合制得蟾酥脂溶物脂质微球注射液。

8、根据权利要求1或2所述的一种含有蟾酥脂溶物的脂质微球注射液，其特征在于：包含以下工艺步骤：将蟾酥脂溶物与表面活性剂溶解在有机溶剂中，然后除去有机溶剂，将剩余物质与脂溶性介质加热混合，再分散在水相中，经过高速搅拌制备初乳后，进行高压均质过程，制剂的灭菌采用高压旋转灭菌法。

9、根据权利要求1或2所述的一种含有蟾酥脂溶物的脂质微球注射液，其特征在于包含以下工艺步骤：将蟾酥脂溶物与脂溶性介质加热混和，待有效成分溶解于脂溶性介质后，通过过滤或离心除去杂质，再分散在水相中，经过高速搅拌制备初乳后，进行高压均质过程，制剂的灭菌采用高压旋转灭菌法。

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