CN1974593B - 一种基因组特异性扩增引物及其标记小麦α-醇溶蛋白的方法 - Google Patents

一种基因组特异性扩增引物及其标记小麦α-醇溶蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种依据α-醇溶蛋白DNA序列中的SNP位点设计，在引物3’端的4个碱基中引入一个错配位点，并且各引物组合都仅能扩出鉴别片段。通过检测这些标记，可以预测小麦的α-醇溶蛋白基因家族构成，加快品质育种的进度；可以评价和利用种质资源。同时本发明使用方便，效果快捷明显，有良好的应用前景。

Description

一种基因组特异性扩增引物及其标记小麦α-醇溶蛋白的方法 
技术领域
本发明提供了分析α-醇溶蛋白基因的分子标记方法，属于分子遗传育种领域，专用于小麦优质品种的选育和种质资源的评价利用。 
背景技术
小麦储藏蛋白量大而且具有重要的经济价值。醇溶蛋白是其主要成分之一，大约占储藏蛋白的40-50％。根据在A-PAGE(酸性聚丙烯酰氨凝胶电泳)中迁移率的差异，醇溶蛋白可被分成α(最快)、β、γ和ω(最慢)4个区域，分子水平的研究显示只存在α(α和β区)、γ和ω三种类型，其中α-醇溶蛋白含量最高。目前的研究已发现二倍体、四倍体和六倍体小麦及近缘的山羊草物种中均有这种蛋白。 
小麦α-醇溶蛋白的编码基因位于第6同源群染色体的短臂上(Gli-A2、Gli-B2和Gli-D2)，已有研究表明六倍体普通小麦中α-醇溶蛋白基因拷贝数大于100，其中大约50％是假基因，仅有一些能被转录、翻译，因此认识和利用这类重要基因有相当的难度。α-醇溶蛋白与面粉品质的关系目前争议很大，不同学者通过品质测验分别得出负相关、正相关甚至没有关系的结论。之所以有如此0同的结论，很大程度上可能是因为它组成的复杂性和品质测验时制备方法本身的局限。由于α-醇溶蛋白在种子储藏蛋白中含量较高，所以在人类摄入的总蛋白中比例很高。但是它的特定肽段对一些人有毒性，表现为乳糜泻。目前用来鉴定小麦α-醇溶蛋白的方法是种子储藏蛋白的A-PAGE法和基因克隆，前种方法的缺点一是不够精确，二是要等到种子收获后才能进行检测和筛选，效率不高；后一种方法工作量大，而且不能真实反映表达情况。 
由于普通小麦有A、B和D三个部分同源的基因组，而且各个基因组控制的α-醇溶蛋白的表达时期、表达量、毒性肽段的分布及对品质的影响等特征均不相同。同时基因组内各种类型基因的上述特征也有所区别，因此在小麦品质育种中开发针对α-醇溶蛋白，而且简单有效的分子标记有非常重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以鉴定普通小麦B和D基因组α-醇溶蛋白基因的特异性标记。通过检测这些标记，可以预测小麦的α-醇溶蛋白基因家族构成，加快品质育种的进度；可以评价和利用种质资源。 
为了达到本发明的目的，本发明采用的技术方案如下： 
单核苷酸多态性位点(SNP)是基因组DNA中频率很高一种遗传变异类型，它是指基因组内DNA中某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、***、缺失等变化。本发明的特异性扩增引物正是依据α-醇溶蛋白DNA序列中的SNP位点设计，最后在引物3’端的4个碱基中再引入一个错配位点，目的是使引物更具有特异性。 
本发明使用常规PCR体系。使用的引物有2类，其中一类是特异性扩增引物。 
表1特异性扩增引物说明 
(“/”表示简并) 
另外一类是通用引物，分别记为F1(ATGAAGACCTTTCTCATCCTTG)，F2(GG/CTCAATACAAATCCAC/TCATG)，R1(TCAGTT A/G GTACC G/AAAGATGCC)和R2(TTCTCTTCTCAGTTA/GGTACCA/G)。特异性扩增引物与合适 的通用引物组合即可实现特异性扩增。 
在以中国春缺体-四体材料DNA为模板的扩增条件下，各引物组合都仅能扩出鉴别片段。 
PCR反应组成：DNA                100-150ng 
             dNTPs              100μM 
             引物P1             4pmol 
             引物P2             4pmol 
             Taq plus聚合酶     0.75U 
             10×PCR缓冲液      2.5μL 
             Mg2+               1.5mM 
             ddH2O              加至终体积25μL 
PCR反应程序：(1)94℃     4分钟 
             (2)94℃     45秒 
             (3)58～60℃ 1分钟 
             (4)72℃     40秒 
             重复(2)→(4)40次 
             (5)72℃     10分钟 
PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳45分钟。 
由于编码α-醇溶蛋白的基因位于小麦第6同源群短臂上，所以本发明使用中国春第6同源群的4份缺体-四体材料，分别是N6AT6B，N6AT6D，N6BT6D和N6DT6B。N6AT6B表示A染色体组的一对第6号染色体被B染色体组的第6号染色体取代，因此对于一对6A染色体而言是缺体，而对于一对6B染色体而言是四体，其余类推。这样如果一对特异性扩增引物在以N6DT6B总DNA为模板的反应体系中无预期扩增产物，在以N6AT6B，N6AT6D和N6BT6D总DNA为模板的反应体系中有目的片段，我们就认为它位于D基因组特有的α-醇溶蛋白基因。 
通过本发明所述的方法检测育种材料时可使用第6同源群缺体-四体材料作为对照，这样可防止由于试剂和仪器原因引起的假阳性现象。由于不同α-醇溶蛋 白基因的重复区和两个多聚酰氨区长度差异大，为减少长度差异带来的不利影响，我们将通用引物设计在基因编码区两端的保守区。 
本发明的积极性效果如下： 
六倍体普通小麦中有超过α-醇溶蛋白100拷贝，大约50％是假基因，仅有一些能被转录、翻译，因此认识和利用这类重要基因有相当的难度。而这些基因编码的蛋白又与品质有关，甚至与人的疾病有关。解决这些问题最简单有效的办法是培育合适的品种，但目前在育种工作中并没有快速高效的检测方法。本发明使用方便，效果快捷明显，有良好的应用前景。 
附图说明
图1：N6DT6B缺失类型，引物对P45R+F2的电泳检测结果； 
图2：N6DT6B缺失类型，引物对P58R+F2的电泳检测结果； 
图3：N6BT6D缺失类型，引物对P62R+F2的电泳检测结果； 
图4：N6BT6D缺失类型，引物对P68R+F1的电泳检测结果； 
M＝marker，1＝N6AT6B，2＝N6AT6D，3＝N6BT6D，4＝N6DT6B； 
1000bp，750bp，500bp和250bp分别表示marker片段的大小。 
具体实施方式
实施例1： 
利用特异性扩增引物对P1F+R2鉴定中国春第6同源群缺体-四体材料。 
反应体系如下：DNA               100-150ng 
              dNTPs             100μM 
(2)94℃    45秒 
              引物P1            4pmol 
              引物P2            4pmol 
              Taq plus聚合酶    0.75U 
              10×PCR缓冲液     2.5μL 
              Mg2+              1.5mM 
              ddH2O             加至终体积25μL 
PCR反应程序：(1)94℃  4分钟 
(2)94℃    45秒 
(3)55℃    1分钟 
(4)72℃    40秒 
重复(2)→(4)40次 
(5)72℃    10分钟 
PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳45分钟。结果如下： 
材料 N6AT6B  N6AT6D  N6BT6D  N6DT6B
目的片段(约880bp) 有  有  有  无
因此可以推断P1F+R2扩增的基因位于D基因组，该引物依据的SNP位点为D基因组特有。 
实施例2： 
利用引物对P4F+R2鉴定中国春第6同源群缺体-四体材料。 
反应体系组成和PCR反应程序同实施例1。 
PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳45分钟。结果如下： 
材料 N6AT6B  N6AT6D  N6BT6D  N6DT6B
目的片段(约865bp) 有  有  有  无
因此可以推断P4F+R2扩增的基因位于D基因组，该引物依据的SNP位点为D基因组特有。 
实施例3： 
利用特异性扩增引物对P18F+R1鉴定中国春第6同源群缺体-四体材料。 
反应体系组成和PCR反应程序同实施例1。 
PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳45分钟。结果如下： 
材料 N6AT6B  N6AT6D  N6BT6D  N6DT6B
目的片段(约730bp) 有  有  无  有
因此可以推断P18F+R1扩增的基因位于B基因组，该引物依据的SNP位点为B基因组特有。 
因此可以推断P18F+R1扩增的基因位于B基因组，该引物依据的SNP位点为B基因组特有。 
实施例4： 
利用特异性扩增引物对P23F+R2鉴定中国春第6同源群缺体-四体材料。 
反应体系组成和PCR反应程序同实施例1。 
PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳45分钟。结果如下： 
材料 N6AT6B  N6AT6D  N6BT6D  N6DT6B
目的片段(约645bp) 有  有  有  无
因此可以推断P23F+R2扩增的基因位于D基因组，该引物依据的SNP位点为D基因组特有。 
实施例5： 
利用特异性扩增引物对Pgli-1+F1鉴定中国春第6同源群缺体-四体材料。 
反应体系组成同实施例1。 
PCR反应程序：(1)94℃    4分钟 
             (2)94℃    45秒 
             (3)58℃    1分钟 
             (4)72℃    40秒 
             重复(2)→(4)40次 
             (5)72℃    10分钟 
PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳45分钟。结果如下： 
材料 N6AT6B N6AT6D N6BT6D N6DT6B
目的片段(约880bp) 有 有 有 无
因此可以推断Pgli-1+F1扩增的基因位于D基因组，该引物依据的SNP位点为D基因组特有。 
实施例6： 
利用特异性扩增引物对P45R+F2鉴定中国春第6同源群缺体-四体材料。 
反应体系组成同实施例1。 
PCR反应程序：(1)94℃    4分钟 
             (2)94℃    45秒 
             (3)60℃    1分钟 
             (4)72℃    40秒 
             重复(2)→(4)40次 
             (5)72℃    10分钟 
PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳45分钟。结果如下： 
材料 N6AT6B N6AT6D N6BT6D N6DT6B
目的片段(约710bp) 有 有 有 无
因此可以推断P45R+F2扩增的基因位于D基因组，该引物依据的SNP位点为D基因组特有。 
实施例7： 
利用特异性扩增引物对P50F+R2鉴定中国春第6同源群缺体-四体材料。 
反应体系组成和PCR反应程序同实施例1。 
PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳45分钟。结果如下： 
材料 N6AT6B N6AT6D N6BT6D N6DT6B
目的片段(约200bp) 有 有 有 无
因此可以推断P50F+R2扩增的基因位于D基因组，该引物依据的SNP位点为D基因组特有。 
实施例8： 
利用特异性扩增引物对P58R+F2鉴定中国春第6同源群缺体-四体材料。 
反应体系组成和PCR反应程序同实施例1。 
PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳45分钟。结果如下： 
材料 N6AT6B N6AT6D N6BT6D N6DT6B
目的片段(约860bp) 有 有 有 无
因此可以推断P58R+F2扩增的基因位于D基因组，该引物依据的SNP位点为D基因组特有。 
实施例9： 
利用特异性扩增引物对P62R+F2鉴定中国春第6同源群缺体-四体材料。 
反应体系组成和PCR反应程序同实施例1。 
PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳45分钟。结果如下： 
材料 N6AT6B N6AT6D N6BT6D N6DT6B
目的片段(约870bp) 有 有 无 有
因此可以推断P62R+F2扩增的基因位于B基因组，该引物依据的SNP位点为B基因组特有。 
实施例10： 
利用特异性扩增引物对P68R+F1鉴定中国春第6同源群缺体-四体材料。 
反应体系组成和PCR反应程序同实施例1。 
PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行。扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上分离，100V恒定电压电泳45分钟。结果如下： 
材料 N6AT6B N6AT6D N6BT6D N6DT6B
目的片段(约710bp) 有 有 无 有
因此可以推断P68R+F1扩增的基因位于B基因组，该引物依据的SNP位点为B基因组特有。 

Claims (2)

1.一种特异性扩增引物，其特征在于，依据α-醇溶蛋白DNA序列中的SNP位点设计，在该引物3’端的4个碱基中再引入一个错配位点，所述特异性扩增引物是具有下列碱基组成的特定序列的寡聚体：
(1)正向：5′TTGCCCTCCTTGCTATTGGA 3′，
反向：5′TTCTCTTCTCAGTTA/GGTACCA/G 3′；
或(2)正向：5′TAGCAACCACCG/ACCACATT 3′，
反向：5′TTCTCTTCTCAGTTA/GGTACCA/G 3′；
或(3)正向：5′CAACAACCATATCCACAGCGA 3′，
反向：5′TCAGTT A/G GTACC G/AAAGATGCC 3′；
或(4)正向：5′CGCAACTACCATATCCGAAGA 3′，
反向：5′TTCTCTTCTCAGTTA/GGTACCA/G 3′；
或(5)正向：5′ATGAAGACCTTTCTCATCCTTG 3′，
反向：5′TGGAGGGATGTAGACATTGAAGG 3′；
或(6)正向：5′GG/CTCAATACAAATCCAC/TCATG 3′，
反向：5′GTTGGAAGGAGACCTGGCTAA 3′；
或(7)正向：5′TCCTACCAGCAGCCTAAGG 3′，
反向：5′TTCTCTTCTCAGTTA/GGTACCA/G 3′；
或(8)正向：5′GG/CTCAATACAAATCCAC/TCATG 3′，
反向：5′CACATTGCAGGTAGCGTCAC 3′；
或(9)正向：5′GG/CTCAATACAAATCCAC/TCATG 3，
反向：5′ATGTAGACATTGCACA/GTTGGT 3′；
或(10)正向：5′ATGAAGACCTTTCTCATCCTTG 3′，
反向：5′TAGGAGACCTGGCTCGTCA 3′。
2.一种基因组特异性扩增引物标记小麦α-醇溶蛋白的方法，包括基因组DNA提取、引物设计、基因扩增、特异片段的验证，其特征在于，以权利要求1所述的核苷酸分子为特异性扩增引物，开发特异分子标记。
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曾燕如等.一种新的分子标记－－单核苷酸多肽（SNP）.南京林业大学学报（自然科学版）27 3.2003,27(3),84-88.
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朱秀志等.SNPs分析技术及其在小麦遗传育种中的应用.天津农业科学11 1.2005,11(1),12-15.
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