CN101955996A - 一种单碱基Indel突变的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单碱基Indel突变的检测方法，根据基因中已知存在的Indel位点设计引物对Pw和Pm，然后PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测判型；提取待测样本的全基因组，并以全基因组为模板，以Pw、Pm为引物分别进行PCR扩增；将PCR扩增获得的产物等体积混合进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳相应条带有无来判定待测样本的目的基因Indel变异发生与否。本方法能够方便、准确的对待测样本目的基因的Indel突变做出检测，有非常大的应用价值。而Indel突变在重要的复杂疾病、分子育种和遗传多样性评价等方面的研究有着重大的理论价值。

Description

一种单碱基Indel突变的检测方法

技术领域

本发明生物技术领域，涉及遗传分子标记的筛查和检测，特别涉及一种单碱基Indel(单个核苷酸***/缺失)突变的检测方法。

背景技术

生命的遗传信息存贮于DNA序列之中，高等生物每一个细胞的全部DNA构成了该生物的基因组。基因组DNA序列的变异是物种遗传多样性的基础，是生物多样性的最初变异来源。单核苷酸的变异(SNP)是DNA序列的最常见最基本的变异，成为第三代分子标记。在人类多基因遗传疾病的研究时，SNP分析具有巨大的应用潜力。如：利用SNP标记已发现与人类一些重要疾病(糖尿病、精神***症、癌症、镰状细胞贫血和血友病等)相连锁的标记座基因；在农作物育种时，重要农艺性状基因紧密连锁SNP标记的获得提高了育种的选择性与预见性。如：利用SNP标记寻找与抗旱性、抗病性等重要农艺性状相连锁的基因；在家畜育种时，利用分子标记辅助选择。如：根据SNP对应激综合症基因，肥胖基因诊断和检测，矮小基因、绵羊多胎基因和双肌基因的SNP应用等加快了家畜育种进展。

然而SNP的数量由Indel的密度决定，Indel本身也是一种核苷酸***/缺失突变，且Indel能够引起附近碱基发生热点突变。自然选择在很大程度上是通过对Indel的选择而实现的，尤其对单碱基Indel的选择。所以作为多数自发突变的发生根源的Indel，在解开肿瘤发生机制、作物和家畜遗传育种等方面具有重大潜在应用价值，新近备受关注。

但是目前可以检测单个核苷酸Indel的方法存在一定的局限性。如：DNA序列测定法是其中最为准确的检测Indel的方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器和非常熟练的技术人员，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想Indel检测方法；PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阴性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段。限制性酶切片段长度多态性(RFLP)一种简单的Indel检测方法，但应用非常局限，不是通用的方法；SNP基因芯片、微球阵列技术、质谱仪和TaqMan荧光探针等检测技术平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种检测单碱基Indel突变位点的方法，针对核苷酸缺失或***等位基因位点特异性设计引物，产生碱基连续错配而阻止特异性引物与未对应的基因模板链结合，是一种简便、准确性高的检测方法。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种检测单碱基Indel突变位点的方法，包括以下步骤：

1)根据基因中已知存在的Indel位点设计引物对Pw和Pm；

以野生型链为模板设计Pw引物对，正向引物Pw-F的3′端起始位碱基与对应于Indel位点下游第3或4位的碱基相同，Pw-F的其余序列与3′端起始位碱基上游15～25bp的序列相同；反向引物Pw-R与Indel位点的下游100～1000bp范围内的15～25bp的序列互补；

以突变型链为模板设计Pm引物对，反向引物Pm-R的3′端起始位碱基与Indel位点上游第3或4位的碱基互补，Pm-R的其余序列与3′端起始位碱基下游的15～25bp的序列互补；正向引物Pm-F与Indel位点的上游100～1000bp范围内的15～25bp的序列相同；

或者，以野生型链为模板设计Pw引物对，反向引物Pw-R的3′端起始位碱基与对应于Indel位点上游第3或4位的碱基互补，Pw-R的其余序列与3′端起始位碱基下游15～25bp的序列互补；正向引物Pw-F与对应于Indel位点的上游100～1000bp范围内的15～25bp序列相同；

以突变型链为模板设计Pm引物对，正向引物Pm-F的3′端起始位碱基与Indel等位基因位点下游第3或4位的碱基相同，Pm-F的其余序列与3′端起始位的碱基上游的15～25bp的序列相同；反向引物与Indel位点的下游100～1000bp范围内的15～25bp序列互补；

引物对Pw和Pm所能够扩增的基因片段长度相差100bp以上；

2)提取待测样本的基因组DNA，并以全基因组DNA为模板，以人工合成的引物对Pw、Pm为引物，分别进行PCR扩增；

3)将分别PCR扩增获得的产物等体积混合，然后对混合物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判定待测样本的目的基因是否发生了Indel变异：

当电泳结果显示为只有Pw扩增的一个条带时，表明待测样本的目的基因型为没有发生Indel变异的野生纯合子；

当电泳结果显示为只有Pm扩增的一个条带时，表明待测样本的目的基因型为发生Indel变异的野生纯合子；

当电泳结果显示为一个Pw扩增的条带和一个Pm扩增的条带时，表明待测样本的目的基因型的为杂合子。

所述的检测单碱基Indel突变位点的方法，对山羊weaver基因5′UTR发生的如SEQ ID No.1所示的第118位的单碱基“A”的***/缺失(Indel)多态性的检测，所述的Pw引物对为：

正向引物Pw-F：ctacgttatc tccgggcaaa gcc 23；

反向引物Pw-R：tgggcacgaa tgcaaatac      19；

所述的Pm引物对为：

正向引物Pm-F：aaagcaactc gggtcaagg      19；

反向引物Pm-R：catccgtctc gtggcttgc      19；

Pw引物对扩增的基因片段长度为367bp，Pm引物对扩增的基因片段长度为132bp。

根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊的weaver基因5′UTR的Indel多态性为：

当电泳结果显示为只有367bp条带时，表明待测山羊的weaver基因5′UTR为野生纯合；

当电泳结果显示为只有132bp条带时，表明待测山羊的weaver基因5′UTR为突变纯合；

当电泳结果显示为367bp和132bp条带时，表明待测山羊的weaver基因5′UTR为杂合。

与现有技术相比，本分明具有以下有益的技术效果：

针对已知的核苷酸缺失或***等位基因位点设计特异性引物，本发明通过把Indel突变位点设计到特异性引物3′端的第3或4位，这样会因产生碱基的连续错配而有效地阻止特异性引物与非对应的基因模板链结合，从而提高了引物的特异性，防止的假阳性的出现。

当利用Pm引物对特异扩增样本中Indel突变等位基因时，引物对Pm对于Indel野生等位基因的扩增就会因碱基连续错配而使延伸有效受阻。同样当利用Pw引物对扩增样本中Indel野生等位基因时，引物对Pw对于Indel突变等位基因的扩增也会因碱基连续错配而使延伸有效受阻。即引物对Pm只特异扩增Indel突变等位基因，而引物对Pw引物对只特异扩增Indel野生等位基因，而连续错配保证了实验的特异性，提高了实验的准确度和科学性。

此外，本发明Pw和Pm两对引物分管扩增防止了它们与模板存在复杂的竞争使得假阳性或假阴性的概率增加。而且两对引物扩增的片段大小相差在100bp取以上，这样可以易于区分电泳之后的条带大小。

这种方法可以准确、快速地检测出样本中的Indel变异，而Indel能够引起附近碱基发生热点突变，SNP的数量由Indel的密度决定。研究表明DNA序列中的Indel突变往往会引起较大的遗传效应，会造成表型性状大的改变。所以本发明在重要的复杂疾病、分子育种和遗传多样性评价等方面的研究有着重大的应用价值。

附图说明

图1为本发明检测单碱基Indel突变位点的方法流程示意图；

图2为本发明针对单碱基Indel突变位点设计引物而形成的碱基连续错配示意图；

图3为本发明利用本发明来检测山羊weaver基因5′UTR发生Indel变异的电泳结果图；

图4位山羊weaver基因5′UTR发生Indel位点的野生型和突变型的基因序列测序图。

具体实施方式

本发明建立一种基于增强AS-PCR的检测Indel突变位点的方法，根据Indel位点不同的等位基因设计特异性引物，分别扩增不同的等位基因片段。这种方法能够简便、准确的检测到待测样本目的基因的Indel突变发生情况。下面结合附图和对山羊weaver基因5′UTR发生的Indel具体检测方法来对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。

参见图1，Indel突变位点的检测方法，包括以下步骤：

1)根据基因中已知存在的Indel位点设计引物对Pw和Pm；

以野生型链为模板设计Pw引物对，正向引物Pw-F的3′端起始位碱基与对应于Indel位点下游第3或4位的碱基相同，Pw-F的其余序列与3′端起始位碱基上游15～25bp的序列相同；反向引物Pw-R与Indel位点的下游100～1000bp范围内的15～25bp的序列互补；

以突变型链为模板设计Pm引物对，反向引物Pm-R的3′端起始位碱基与Indel位点上游第3或4位的碱基互补，Pm-R的其余序列与3′端起始位碱基下游的15～25bp的序列互补；正向引物Pm-F与Indel位点的上游100～1000bp范围内的15～25bp的序列相同；

还可以按照以下方法，根据Indel位点的设计Pw和Pm特异性引物并能达到相同的效果：以野生型链为模板设计Pw引物对，反向引物Pw-R的3′端起始位碱基与对应于Indel位点上游第3或4位的碱基互补，Pw-R的其余序列与3′端起始位碱基下游15～25bp的序列互补；正向引物Pw-F与对应于Indel位点的上游100～1000bp范围内的15～25bp序列相同；

以突变型链为模板设计Pm引物对，正向引物Pm-F的3′端起始位碱基与Indel等位基因位点下游第3或4位的碱基相同，Pm-F的其余序列与3′端起始位的碱基上游的15～25bp的序列相同；反向引物与Indel位点的下游100～1000bp范围内的15～25bp序列互补；

引物对Pw和Pm所能够扩增的基因片段长度相差100bp以上；

参见图2，具体以引物Pm-F与Indel位点为N的***为例来说明连续错配的形成：

Pm-F的设计为Indel突变位点在正向引物Pm-F的3′端的第4位上，以此引物扩增含突变型等位基因片段，电泳时有相应条带。对于引物与野生型链(没有N的***)则形成4个连续错配，延伸受阻。电泳时无相应条带。

2)提取待测样本的基因组DNA，并以全基因组DNA为模板，以人工合成的引物对Pw、Pm为引物，分别进行PCR扩增；

3)将分别PCR扩增获得的产物等体积混合，然后对混合物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带的有无来判定待测样本的目的基因Indel变异与否：

当电泳结果显示为只有Pw扩增的一个条带时，表明待测样本的目的基因型为没有发生Indel变异的野生纯合子；

当电泳结果显示为只有Pm扩增的一个条带时，表明待测样本的目的基因型为发生Indel变异的野生纯合子；

当电泳结果显示为一个Pw扩增的条带和一个Pm扩增的条带时，表明待测样本的目的基因型的为杂合子。

实施例1山羊weaver基因5′UTR的Indel多态性的检测

1)山羊weaver基因5′UTR存在如SEQ ID No.1所示的第118位发生一个碱基“A”Indel多态性；

设计引物对Pw为：

以野生型链为模板设计正向引物3′端第1位碱基与对应于Indel等位基因位点下游第3位碱基相同，即：序列表SEQ ID No.1第121位的“C”碱基，然后以此位碱基上游的一段相同DNA序列为正向引物，引物的长短取决于引物的退火温度和GC含量，以间隔348bp长度设计反向引物，引物对Pw具体为：

正向引物Pw-F：ctacgttatc tccgggcaaa gcc 23；

反向引物Pw-R：tgggcacgaa tgcaaatac      19；

该引物对扩增片段长度为367bp。

设计引物对和Pm为：

以突变型链为模板设计反向引物3′端第1位碱基与Indel等位基因位点上游第4位碱基互补，即与序列表SEQ ID No.1第114位的“G”碱基互补。引物的长短取决于引的退火温度和GC含量，然后以间隔118bp长度设计反向引物，引物对Pw具体为：

正向引物Pm-F：aaagcaactc gggtcaagg     19；

反向引物Pm-R：catccgtctc gtggcttgc     19；

该引物对扩增片段长度为132bp。

2)人工合成的引物对Pw、Pm，提取待测样本的全基因组，以引物对Pw、Pm为引物同一待测DNA样本为模板分别进行PCR扩增，PCR反应体系为12.5μL，具体见表1。

PCR反应程序，具体见表2。

表1PCR反应体系

体系成分	体积(μL)
		10×PCR缓冲液(MBI)	1.250
MgCl2(25mmol/L)	0.750
		dNTPs(2.5mmol/L)	1.250
上游引物(10pmol/L)	0.125
		下游引物(10pmol/L)	0.125
Taq DNA聚合酶(0.5U/μL)	1.000
		DNA模板(50ng/μL)	0.500
灭菌超纯水(H2O)	7.500
		总体积	12.500

注：Taq DNA聚合酶是普通的不具有3’外切活性。

表2PCR反应程序

3)各取5μL上述PCR扩增产物混合后进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶质量浓度为1.5％、电压120V、电泳0.5h，EB染色检测判断结果，用Gel Doc XR+凝胶成像分析***照相分析，并判型、记录其基因型；

当发生Indel突变时，可形成不同的基因型，分别为WW、WM和MM(AA、A0和00，0表示无“A”***突变，A表示***突变)，可以分别通过电泳图谱来进行判别。如图3所示的电泳检测结果，其中各个泳道从左到右依次为DNAMaker(其条带分布由上到下依次为600、500、400、300、200和100bp)、WW、WM、WW、MM、WM、WW、MM和WM；

其中，对于野生纯合子WW进行PCR扩增时Pw-F与Pw-R引物对是有效的能正常进行PCR扩增，而Pm-F与Pm-R引物对是因Pm-R引物3’端的连续错配而使PCR延伸受阻，所以琼脂糖凝胶电泳时只表现367bp条带；相反发生突变后的纯合子MM，进行AS-PCR时Pm-F与Pm-R引物对是有效的能正常进行PCR扩增，而Pw-F与Pw-R引物对是因Pw-F引物3’端的连续错配而使PCR延伸受阻，所以琼脂糖凝胶电泳时只表现132bp条带；杂合子WM的两条链分别为野生型链和突变型链，所以Pw-F与Pw-R引物对和Pm-F与Pm-R引物对均有效并能正常进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳时表现为367bp和132bp两条带。根据图3中条带的数目、大小能够判定是否发生了Indel，将3种基因型区分开，从而检测其Indel多态性。

测序验证：随机挑选3种基因型各10个不同个体以引物对P为引物对进行PCR扩增，然后对比测序结果和电泳判断结果；所述的引物对P为：

测序正向引物P-F：aaagcaactc gggtcaagg  19；

测序反向引物P-R：tgggcacgaa tgcaaatac  19；

该引物对的扩增体系及反应程序(见表1，2)扩增片段长度为：MM基因型个体465bp，WW基因型个体464bp，Indel突变位点的检测结果分别如图4a、图4b所示，结果表明与电泳判断结果一致。

实施例2不同山羊群体多态性检测中的Indel诊断应用

1、群体多态性中的Indel诊断

利用实施例1所述的方法检测了3个山羊品种，其中西农萨能奶山羊(268份DNA样品)和关中奶山羊(440份DNA样品)属于乳用型；新疆绒山羊为绒用型(119份DNA样品)。

2、Indel位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。PAA＝NAA/N，其中PAA代表某一位点的AA基因型频率；NAA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：PA＝(2NAA+NAa1+NAa2+……+NAan)/2N。式中，PA表示等位基因A频率，NAA表示群体中具有AA基因型的个体数量，NAai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因。统计结果见表3。

表3三个山羊品种中weaver基因5′UTR的Indel位点的基因型和等位基因频率

从表3可以看出：在萨能奶山羊、关中奶山羊和新疆绒山羊3个山羊品种中W等位基因占优势，为主导等位基因。MM基因型的个体非常少。

序列表

 

<110>西北农林科技大学

<120>一种单碱基Indel突变的检测方法

<160>1

<210>1

<211>465

<212>DNA

<213>奶山羊(Capra hircus)

<220>

<221>***/缺失

<222>(118)

<400>1

aaagcaactc gggtcaagga aaccatcaag atcccgggcc ccgctcgggt catccttttg     60

catgctgtac agcacttcac agtttgcaga gaggtgcact acgttatctc cgggcaaagc    120

cacgagccgg atgcggaagg accgggaaag tggttctgac tggcagtctg aagcgcatga    180

gcttgactgg ggcccagagc aagtgccggc agggcggtgg ccgggctgag aggttggtgg    240

gaggtccttt gcgtcccagg ctatgcagga acaggaagga tggtctgttc taccagccgc    300

agctgcagct atccccgctg agcagctcaa atgctcttgt cagagcaatt cacatcaccc    360

cctcaaattc acacctggga ttccaagaaa gaaagaaatg ttaagtgatc attaacatcc    420

tttctgtatc ccccccaccc ccgtgcgtat ttgcattcgt gccca                    465

Claims (3)

1.一种检测单碱基Indel突变位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)根据基因中已知存在的Indel位点设计引物对Pw和Pm：

以野生型链为模板设计Pw引物对，正向引物Pw-F的3′端起始位碱基与对应于Indel位点下游第3或4位的碱基相同，Pw-F的其余序列与3′端起始位碱基上游15～25bp的序列相同；反向引物Pw-R与对应于Indel位点的下游100～1000bp范围内的15～25bp的序列互补；

以突变型链为模板设计Pm引物对，反向引物Pm-R的3′端起始位碱基与Indel位点上游第3或4位的碱基互补，Pm-R的其余序列与3′端起始位碱基下游的15～25bp的序列互补；正向引物Pm-F与Indel位点的上游100～1000bp范围内的15～25bp的序列相同；

或者，以野生型链为模板设计Pw引物对，反向引物Pw-R的3′端起始位碱基与对应于Indel位点上游第3或4位的碱基互补，Pw-R的其余序列与3′端起始位碱基下游15～25bp的序列互补；正向引物Pw-F与对应于Indel位点的上游100～1000bp范围内的15～25bp序列相同；

以突变型链为模板设计Pm引物对，正向引物Pm-F的3′端起始位碱基与Indel等位基因位点下游第3或4位的碱基相同，Pm-F的其余序列与3′端起始位的碱基上游的15～25bp的序列相同；反向引物与Indel位点的下游100～1000bp范围内的15～25bp序列互补；

引物对Pw和Pm所能够扩增的基因片段长度相差100bp以上；

2)提取待测样本的基因组DNA，并以全基因组DNA为模板，以人工合成的引物对Pw、Pm为引物，分别进行PCR扩增；

3)将分别PCR扩增获得的产物等体积混合，然后对混合物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果判定待测样本的目的基因是否发生了Indel变异：

当电泳结果显示为只有Pw扩增的一个条带时，表明待测样本的目的基因型为没有发生Indel变异的野生纯合子；

当电泳结果显示为只有Pm扩增的一个条带时，表明待测样本的目的基因型为发生Indel变异的野生纯合子；

当电泳结果显示为一个Pw扩增的条带和一个Pm扩增的条带时，表明待测样本的目的基因型的为杂合子。

2.如权利要求1所述的检测单碱基Indel突变位点的方法，其特征在于，对山羊weaver基因5′UTR发生的如SEQ ID No.1所示的第118位的Indel多态性的检测，所述的Pw引物对为：

正向引物Pw-F：ctacgttatc tccgggcaaa gcc 23；

反向引物Pw-R：tgggcacgaa tgcaaatac      19；

所述的Pm引物对为：

正向引物Pm-F：aaagcaactc gggtcaagg      19；

反向引物Pm-R：catccgtctc gtggcttgc      19；

Pw引物对扩增的基因片段长度为367bp，Pm引物对扩增的基因片段长度为132bp。

3.如权利要求2所述的检测单碱基Indel突变位点的方法，其特征在于，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊的weaver基因5′UTR的Indel多态性为：

当电泳结果显示为只有367bp条带时，表明待测山羊的weaver基因5′UTR为野生纯合；

当电泳结果显示为只有132bp条带时，表明待测山羊的weaver基因5′UTR为突变纯合；

当电泳结果显示为367bp和132bp条带时，表明待测山羊的weaver基因5′UTR为杂合。

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