CN1972960A - 埃替非巴肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明特别提供了制备埃替非巴肽的会聚方法，该方法包括使2－6埃替非巴肽片段与活性半胱氨酸酰胺残基结合形成2－7埃替非巴肽片段，通过二硫键的形成将巯基丙酸残基附着到该2－7埃替非巴肽片段上，分子内结合所述的肽，并除去保护基团以形成埃替非巴肽。本发明进一步提供了通过所述的方法制备的产物，可用作埃替非巴肽制备的合成中间体的新的化合物，和与埃替非巴肽结构类似的新化合物。

Description

埃替非巴肽的制备方法
相关申请对照参考
本申请要求于2004年4月8日提交的美国临时申请No.60/560,453的优先权，其在此处全部引入作为参考。
发明领域
在某些具体实施方式中，本发明涉及制备埃替非巴肽(eptifibatide)的新方法，埃替非巴肽是用于治疗心血管疾病的药物。本发明还涉及可用作埃替非巴肽合成中间体的化合物，和与埃替非巴肽结构类似的化合物，和纯化埃替非巴肽的方法。
发明背景
埃替非巴肽是高效的血小板糖蛋白IIb/IIIa环状七肽拮抗剂。它是短效肠外抗血栓剂，用于在经皮冠状动脉介入治疗中治疗不稳定心绞痛并辅助血栓溶解剂用于治疗急性心肌梗塞。参见例如，Phillips等人，Journal of Biological Chemistry(1993)，268(2)，1066-73；和Scarborough，American Heart Journal(1999)，138(6，Pt.1)，1093-1104。埃替非巴肽也对进行球囊血管成形术的患者给药，球囊血管成形术在美国是每年有超过一百万人等待接受治疗的方法。
认为埃替非巴肽是通过抑制血小板聚集，具体地是通过阻断血小板受体GP IIb-IIIa而起作用的。血小板的聚集可阻碍血液向心脏的供应，引起不稳定心绞痛，并且，可能引起心肌梗塞(心脏病发作)。埃替非巴肽对血小板有特效，避免了其它常用心血管方法的干扰，且停用埃替非巴肽后可消除其作用效果。
埃替非巴肽在美国以商标INTEGRILIN销售，并用于治疗急性冠状动脉综合症(不稳定心绞痛和非Q波心肌梗死)患者，包括接受医疗护理和那些接受经皮冠状动脉介入治疗(“PCI”)的患者。同样表明，埃替非巴肽可在包括涉及冠状动脉支架置入方法的经皮冠状动脉介入治疗时使用。
报导的许多埃替非巴肽的合成方法使用了已知的固相肽合成技术，如在美国专利5,318,899；5,686,570和5,747,447中所述。在1999 IBCConference on Peptide Technologies，“Peptisyntha′s Method ofProducing GMP Peptides on an Industrial Scale”中，也报导了工业规模的液相方法。该工业方法是包括各自制备两个片段：Mpa-Har-Gly和Asp-Trp-Pro的会聚(convergent)合成。这两个片段的结合提供了埃替非巴肽所需七个残基中的六个。最后附上的残基是S-三苯甲基保护的半胱氨酰胺(S-trityl-protected cysteinamide)，如在美国专利5,506,362中所述。在除去S-三苯甲基保护基团(在半胱氨酰胺和巯基丙酰基残基上)后，则通过二硫键的形成获得环的闭合。据报道，通过工业方法得到的粗制埃替非巴肽的纯度为约80％。两柱色谱步骤将纯度提升到大于99％。
通常认为对于大规模的埃替非巴肽生产，液相合成比固相合成更加可行。然而，对于大规模的液相工艺，存在溶解性问题和产生复杂的反应混合物的难题。例如，复杂的反应混合物使得产物的纯化更加困难。存在克服这些问题的方法，如使用全硅烷化氨基酸(persilylatedamino acids)和相转移剂，如美国专利4,954,616中所述，和广泛的色谱法纯化，但是这些方法增加了整个工艺的成本。
从而存在对埃替非巴肽生产的选择性方法的需求。
发明概述
本发明特别提供了制备埃替非巴肽的方法。本发明的特定方法包括提供了式II的化合物：
其中Har是高精氨酰基；Gly是甘氨酰基；Trp是色氨酰基；Pro是脯氨酰基；CyS-NH2是半胱氨酰胺；Mpa是巯基丙酸；和P2是羧基保护基团；使Har和Mpa残基结合形成式III的化合物：
Figure A20058001075200122
(III)；并且
从式III化合物的Asp残基上除去P2，以形成埃替非巴肽。
本发明还提供了这样的方法，在该方法中氨基末端保护的高精氨酸残基与甘氨酸残基结合，从而形成下式的2-3埃替非巴肽片段：
P1-Har-Gly-OH.
还提供了这样的方法，在该方法中通过二肽的色氨酰基残基，将具有保护的羟基侧链的天冬氨酸残基与色氨酰基-脯氨酰基二肽结合，从而形成下式保护的4-6埃替非巴肽片段：
P3-Asp(O-P2)-Trp-Pro-OH.
脱保护后，所述的2-3埃替非巴肽片段和4-6埃替非巴肽片段，依次可以通过2-3埃替非巴肽片段的Gly残基的附着，结合到该4-6埃替非巴肽片段的Asp残基上，从而形成下式的2-6埃替非巴肽片段：
P1-Har-Gly-Asp(O-P2)-Trp-Pro-OH
其中，Har是高精氨酰基；Gly是甘氨酰基；Asp是天冬氨酰基；Trp是色氨酰基；Pro是脯氨酰基；P1是氨基保护基团；和P2是羧基保护基团。在优选的具体实施方式中，所述的2-6埃替非巴肽片段通过该2-6埃替非巴肽片段的Pro残基结合到活性半胱氨酰胺残基上，从而形成下式的2-7埃替非巴肽片段：
P1-Har-Gly-Asp(O-P2)-Trp-Pro-ACys-NH2
其中，ACys-NH2是活性半胱氨酰胺残基。通过巯基丙酸残基和所述的2-7埃替非巴肽片段的ACys-NH2残基之间的二硫键，巯基丙酸残基可被附着于该2-7埃替非巴肽片段上，从而形成式1的化合物：
Figure A20058001075200131
其中，Mpa是巯基丙酸；Cys-NH2是半胱氨酰胺。从式1化合物的Har残基上除去P1得到式II的化合物：
Figure A20058001075200132
使这一化合物的N-末端Har和C-末端Mpa相结合得到式III的化合物：
Figure A20058001075200133
随后，从Asp残基上除去P2得到埃替非巴肽。
本发明还提供了通过所述方法制得的产物，如式IV的化合物：
Figure A20058001075200141
其中，R1是氢或P1；P1是氨基保护基团；P2是羧基保护基团。本发明其它代表性的化合物包括Fmoc-Har-Gly-OH，Fmoc-Har-GIy-O-P4，和Fmoc-Har-Gly-Asp(O-P5)-Trp-Pro-OH，其中P4和P5是羧基保护基团。在某些具体实施方式中，本发明提供了包括埃替非巴肽和小于1％的特定工艺杂质的组合物。本发明还提供了纯化埃替非巴肽的方法。
具体实施方式详述
在一个方面，本发明提供了制备埃替非巴肽的会聚方法，所述方法包括：制备2-3埃替非巴肽片段，制备4-6埃替非巴肽片段，和将2-3和4-6埃替非巴肽片段结合形成2-6埃替非巴肽片段。这些方法中的某些包括将所述的2-6埃替非巴肽片段与活化的半胱氨酰胺残基结合，形成2-7埃替非巴肽片段，在巯基丙酸和2-7埃替非巴肽片段之间形成二硫键以形成前体A，进行前体A的分子内肽结合，并从结合产物除去保护基团以形成埃替非巴肽。
在另外的具体实施方式中，本发明涉及通过所述制备埃替非巴肽的方法制得的产物。在另一个具体实施方式中，本发明涉及可用作埃替非巴肽制备中间体的新化合物。仍在另外的具体实施方式中，本发明涉及与埃替非巴肽结构类似的化合物。在另外的具体实施方式中，本发明还提供了纯化埃替非巴肽的方法。
如本文所用，术语“羧基保护基团”是指这样的部分，所述的部分能选择性地附着于羧基基团和从该羧基基团上除去，以防止其参与不希望的化学反应，且对所希望的反应无不可接受的不利影响。羧基保护基团的例子包括：酯，例如甲基，乙基，叔丁基，(未)取代的苯甲基，和甲硅烷基酯等。其它的羧基保护基团是本领域公知的，并在Protecting Groups in Organic Synthesis中有详细描述，Theodora W.Greene and Peter G.M.Wuts，第3版，1999，John Wiley and Sons，Inc出版。
如本文所用，术语“氨基保护基团”是指这样的部分，所述的部分能够选择性地附着于氮原子和从该氮原子上除去，以防止其参与不希望的化学反应，且对所希望的反应无不可接受的不利影响。氨基保护基团的例子包括氨基甲酸酯，如Boc，Cbz，Fmoc，alloc，氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯等；环酰亚胺衍生物，如邻苯二甲酰亚胺；酰胺，例如甲酰，(未)取代的乙酰，和苯甲酰；和三烷基甲硅烷基基团，如叔丁基二甲基甲硅烷基和三异丙基甲硅烷基。其它的氨基保护基团是本领域公知的，并在Protecting Groups in Organic Synthesis中有详细描述，Theodora W.Greene和Peter G.M.Wuts，第3版，1999，John Wileyand Sons，Inc出版。
如本文所用，术语“结合”和其所有变换是指通过任何方法在被连接的部分间形成酰胺键。
如本文所用，术语“附着”和其所有变换是指，通过任何可用于形成酰胺或二硫键的方法，在被连接的部分间形成酰胺或二硫键。
如本文所用，术语“活化的半胱氨酰胺残基”是指能够与巯基丙酸形成二硫键的半胱氨酰胺残基。
如本文所用，术语“Gly-埃替非巴肽”是指与埃替非巴肽结构相关，但含有两个紧邻的甘氨酸残基而非一个甘氨酸残基的化合物。
本文中所有的氨基酸残基是指具有L构型的天然氨基酸。
埃替非巴肽具有以下的化学结构：
埃替非巴肽也可以用氨基酸名称表示如下：
Figure A20058001075200162
其中氨基酸名称对应于下面所示的化学图：
为说明方便起见，所述残基也可从(1)到(7)编号。残基(1)是巯基丙酸；(2)是高精氨酰基(Har)；(3)是甘氨酰基(Gly)；(4)是天冬氨酰基(Asp)；(5)是色氨酰基(Trp)；(6)是脯氨酰基(Pro)；(7)是半胱氨酰胺(CyS-NH2)。
在某些具体实施方式中，本发明涉及制备埃替非巴肽的会聚方法。在第一序列的步骤中，制备含有氨基酸(2)和(3)的2-3埃替非巴肽片段。在第二序列中，制备含有氨基酸(4)、(5)和(6)的4-6埃替非巴肽片段。然后将所述的两个片段结合得到单一的2-6片段，该2-6片段为五肽。埃替非巴肽的2-6片段在Har残基的氨基末端和天冬氨酰基的侧链羧基被保护。流程图1简要说明了所述2-6埃替非巴肽片段制备的示例性方法：
流程图1.埃替非巴肽的2-6片段的制备
流程图1的序列A表示2-3埃替非巴肽片段的制备，序列B表示4-6埃替非巴肽片段的制备。两个序列的会聚得到埃替非巴肽的2-6片段。尽管流程图1给出了示例性的氨基酸保护基团，肽合成领域的技术人员应理解也可以使用其它已知的氨基酸保护基团。例如，代替Fmoc(9-芴甲氧羰基)基团，可使用其它的氨基甲酸酯保护基团如，Cbz(苯甲氧羰基)，RCbz(芳环上取代的苯甲氧羰基)，9(2-硫代)芴甲基氨基甲酸酯，9(2，7-二溴)芴甲基氨基甲酸酯，2-氯-3-茚甲基氨基甲酸酯，苯[f]茚-3-基甲基氨基甲酸酯，或Alloc(烯丙氧羰基)基团。
天冬氨酰基残基上的叔丁基酯可被任何其它能够被酸处理解离的保护基团取代，例如，ODpm(二苯甲酯)或能够被氢解解离的保护性基团，例如，OBzl(苯甲酯)。
在流程图1的序列A中描述的埃替非巴肽片段的Fmoc-Har部分可以被RNP1-Har取代，其中RNP1是氨基保护基团，例如，Cbz(苯甲氧羰基)基团，RCbz(芳环上取代的苯甲氧羰基)，或Alloc(烯丙氧羰基)基团。类似地，在序列B中描述的埃替非巴肽片段的Z-Asp(或Cbz-Asp)部分可以被RNP2-Asp取代，其中RNP2是在碱性条件下能够被解离的氨基保护基团，例如，Fmoc(芴甲氧羰基)，或其中RNP2是能够被氢解解离的氨基保护基团，例如，RCbz(具有取代芳环的苄氧羰基保护基团)基团。另外，在流程图1中描述的-OtBu基团可以被RCP取代，其中RCP是能够被酸处理解离的羧基保护基团，例如，ODpm(二苯甲酯)基团。Pfp(五氟苯基)可被RL1取代，其中RL1是羧基活化基团；Su(琥珀酰亚胺)可被RL2取代，其中，RL2是羧基活化基团。
与片段的性质无关，Pfp和Su均可被其它稳定的活性酯例如，单和二硝基苯酯，三-和五苯酯代替。本领域技术人员应理解，特定保护基团的选择依赖于在相同化合物上存在的其它保护基团的特性。在本发明的某些具体实施方式中，这样选择特定的保护基团，使其在不影响其它保护基团的条件下能够被选择性地除去。
在本发明的某些具体实施方式中，接下来将保护的2-6埃替非巴肽片段与“活化的”半胱氨酰胺(7)结合，例如，3-硝基-2吡啶亚磺酰基半胱氨酰胺(H-Cys(Npys)-NH2)；Nps(2-硝基-苯基-亚磺酰基)；S-苯基硫代半胱氨酰胺，其中苯环是取代的；S-烷基硫代半胱氨酰胺；或半胱氨酰胺的S-磺酸酯和S-亚磺酰基硫代碳酸酯，以形成埃替非巴肽的2-7六肽片段。剩余的埃替非巴肽残基为巯基丙酸或Mpa-OH(1)。在1和该2-7片段之间形成二硫键的条件下，Mpa-OH附着于所述的2-7六肽片段上。所得的二硫化物，在本文称为前体A，是制备埃替非巴肽的关键的并且是新的前体。前体A的结构如下：
其中，P1是氨基保护基团，P2是羧基保护基团。优选在适于除去P1基团的条件下，P2是稳定的。选择允许只选择性地除去P1和P2之一的、兼容的P1和P2基团是本领域公知的。一对兼容的保护基团对的例子为：P1＝Fmoc，其可以在碱性条件下被除去，P2＝叔丁基，其在相同条件下是稳定的。
流程图2概括了前体A制备的示例性方法：
流程图2.由2-6制备前体A
Figure A20058001075200202
如流程图1，流程图2中的Fmoc和叔丁基基团可以被其它已知的，通常认为对于肽合成有用的保护基团取代。
在本发明的某些具体实施方式中，从前体A除去P1保护基团得到另一种前体，前体B，它是埃替非巴肽的2-7-1部分。
前体B可以通过分子内肽结合转化成前体C：
Figure A20058001075200212
所述的分子内肽结合可以例如，在有机溶剂中，在适当的结合剂存在下实现，所述的结合剂例如，脲型(uronium-type)结合剂，例如但不限于，O-[氰基(乙氧羰基)亚甲基氨基]-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐(TOTU)，HBTU，或TBTU(分别是2-(1H-苯并***-1基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐和四氟硼酸盐)；碳二酰亚胺型试剂，例如但不限于，DCC(二环己基碳二酰亚胺)，DIC(二异丙基碳二酰亚胺)，或EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二酰亚胺)；活化酯；或膦型结合剂，例如，Bop(苯并***-1-基氧-三(二甲基氨基)-膦六氟磷酸盐)或PyBOP(苯并***-1-基氧-三(吡咯烷并)-膦六氟磷酸盐)。肽的结合在例如，Humphrey和Chamberlin，Chem.Rev.1997，97，2243-2266中描述，其在此处全部引入作为参考。
从前体C除去P2保护基团得到埃替非巴肽。P2的除去可以例如，在有机溶剂中，在酸，碱，或任何其它所述的保护基团在其中不稳定的试剂或试剂体系存在下实现。流程图3概括了由前体A制备埃替非巴肽的示例性方法：
流程图3，由前体A制备埃替非巴肽
在除去Fmoc保护基团后，所述的2-7-1片段进行分子内肽结合得到埃替非巴肽的叔丁基酯。从天冬氨酰基残基除去叔丁基基团得到埃替非巴肽。
在某些具体实施方式中，本发明还涉及与埃替非巴肽结构类似，并根据类似于上述制备埃替非巴肽的方法的方法制备的化合物。这样的化合物包括，例如，-Gly-埃替非巴肽，其包含两个紧邻的甘氨酸残基，而不是象埃替非巴肽中那样只有一个甘氨酸残基：
Figure A20058001075200231
Gly-埃替非巴肽可以，例如，根据上述制备埃替非巴肽的步骤而制备，除了将Gly-Gly二肽结合到高精氨酸以形成该2-3埃替非巴肽片段的对应物，而非将甘氨酸结合到高精氨酸以形成该片段。例如，根据这一改变的步骤，流程图1中所示的H-Gly-OtBu(3)基团被H-Gly-Gly-OtBu基团替代。
在本发明的某些具体实施方式中，也可以根据上述制备埃替非巴肽的方法，在埃替非巴肽的制备过程中制得Gly-埃替非巴肽。本发明的某些具体实施方式涉及包括埃替非巴肽和Gly-埃替非巴肽的组合物，包括：包括至少99％的埃替非巴肽和在约0.01％到约1％范围内的GIy-埃替非巴肽的组合物，和包括至少99％埃替非巴肽和在约0.01％到约0.1％范围内的GIy-埃替非巴肽的组合物。
本发明还提供纯化埃替非巴肽的方法包括：例如，使埃替非巴肽溶液与固定相接触，所述的固定相包括例如，附着于二氧化硅上的十八烷基碳链，用三氟乙酸/乙腈溶液洗涤与埃替非巴肽溶液接触的固定相，选择性地用乙酸/乙腈溶液洗涤与埃替非巴肽溶液接触的固定相，并用铵酸(ammonium acid)/乙腈溶液洗涤与埃替非巴肽溶液接触的固定相。反相固定相是本领域技术人员公知的，并且可以由其它这样的相代替十八碳基二氧化硅。
在本发明的特定具体实施方式中，由起始浓度为95％的0.1％三氟乙酸水溶液和5％的乙腈溶液，和最终浓度为50％的0.1％三氟乙酸水溶液和50％的乙腈溶液梯度洗脱与埃替非巴肽溶液接触的固定相。
本发明进一步提供了具体实施方式，其中由起始浓度为95％的0.5％乙酸水溶液和5％的乙腈溶液，和最终浓度为50％的0.5％乙酸水溶液和50％的乙腈溶液梯度洗脱与埃替非巴肽溶液接触的固定相。在某些具体实施方式中，所述的固定相由乙酸/乙腈梯度洗脱之后，进行一次或多次的三氟乙酸/乙腈梯度洗脱。
本发明还提供了具体实施方式，其中，铵酸/乙腈溶液是包括95％的100mM铵酸水溶液和5％的乙腈溶液的溶液。在本发明的某些方面，由铵酸/乙腈溶液洗涤之后，用三氟乙酸/乙腈和/或乙酸/乙腈进行梯度洗脱。
上述方法中发生的氨基酸残基的结合可以通过已知的本领域技术人员熟悉的肽合成方法完成。可以使用形成肽的任何适当的结合步骤。
下面的实施例用于说明本发明的某些具体实施方式，并不应视为对本发明范围的限制。
实施例1：Z-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH的制备
可以通过已知的方法，例如在此处全部引入作为参考的Bodanszky，M.(1979)，Active esters in peptide synthesis，The peptides，Vol.1(ed.E.Gross and J.Meienhofer)，Chapter 3.Academic Press，London中描述的方法，由市售可得的Z-Asp(OtBu)-OSu和H-Trp-Pro-OH为原料获得Z-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH。
实施例2：H-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-OH的制备
约20℃下，在装有二甲基乙酰胺(DMAC，1.2L)的2升的反应器中加入0.300kg的原料Z-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH，保持温度在约20℃。使Z-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH溶解后，然后将反应混合物用氮气吹扫并保护(blanketed)。向反应混合物中加入钯/碳(5重量％)(0.015kg)之后在2bar压力下氢化同时保持反应混合物在约20℃。
两小时后，和之后的每一小时，通过HPLC分析反应样品。用含有0.1％三氟乙酸(TFA)的水/乙腈溶剂混合物，以98∶2水/乙腈到2∶98水/乙腈10分钟的梯度，在Purospher Star Cl8 55*4mm柱上进行HPLC分析。在215nm进行HPLC检测，流速为2.0mL/min，温度为40℃。
当HPLC分析显示原料相对于产物面积百分比小于或等于0.2％时，认为反应完成。当HPL显示反应完成时，将对甲苯磺酸的水溶液(0.094kg p-TsOH溶于0.150L水)加入到反应混合物中。然后将反应混合物通过用DMAC预洗涤过的Celite过滤(Celite用0.6L洗涤三次)。在反应混合物过滤后，将滤饼用新的DMAC(0.3L)洗涤三次。最后一次洗涤后进行HPLC分析，确定没有产物留在滤饼上。
在约20℃将合并滤液转移到新的容器中，在该温度下加入N-乙基吗啉(0.066L)。添加中保持温度低于约22℃。然后将混合物冷却到约8-12℃，并缓慢加入水(3L)以保持温度低于约15℃。然后在约8-12℃搅拌该混合物约30分钟，并保持在该温度8小时。在这段时间内产物从溶液中结晶析出。可通过HPLC分析上层清液，以确定仍在溶液中的产物量和是否需要进一步冷却。过滤得到的浆，并将收集的固体用2∶1的水∶DMAC(各自为0.9L)溶液洗涤两次。然后用乙腈(各自为0.9L)洗涤该固体两次，并在低于约25℃的温度下真空干燥至恒重。干燥后的水含量为3.5％(Karl-Fisher法分析)。
利用三氟乙酸/乙腈水梯度溶液，通过反相HPLC分析产物。
LC/MS分析确定，H-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-OH的[M+H]质量为473.0。
回收率为93.2％(0.218kg)；净回收率为93.1％(基于氮含量：95.4％)
实施例3：Fmoc-Har-GIy-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-OH的制备
向Fmoc-Har-Gly-OH(0.163kg净重；基于肽含量：90.5％)在THF：DMAC(分别是0.717L和0.179L)中的浆中，加入甲基磺酸(0.027L)和五氟苯酚(0.083kg)。在约20℃搅拌该混合物至固体溶解。滴加加入N-乙基吗啉(NEM)(0.030L)，之后加入溶于THF(0.179L)中的二环己基碳二亚胺(DCC)(0.072kg)，并在约20℃搅拌该混合物。形成Fmoc-Har-Gly-OPfp后，进行HPLC分析。在约17小时后，Fmoc-Har-Gly-OH/Fmoc-Har-Gly-Opfp的比为1.5/98.5。
向反应混合物中加入H-Asρ(O-tBu)-Trp-Pro-OH(0.146kg，约3.5w/w％H2O)和NEM(0.049L)。在约20℃搅拌该混合物3小时。这时，HPLC分析显示该混合物含有约87％的产物，＜2％的Fmoc-Har-Gly-OPfp，6％的Fmoc-Har-Gly-OH，约0.5％的H-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-OH，和约5.5％的确定为Fmoc-Har-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-OH(″d.a.杂质″)的杂质。在Purospher Star C18 55*4mm柱上进行HPLC分析，使用含有0.1％三氟乙酸(TFA)的水/乙腈溶剂混合物，梯度为98∶2水/乙腈到2∶98水/乙腈10分钟。在215nm进行HPLC检测，流速为2.0mL/min，且温度为40℃。
过滤该反应混合物，并用5/1的THF/DMAC(2×0.489L)混合物洗涤该固体两次。在不高于35℃下，减压(约20mBar)将滤液浓缩至约0.815L。在1小时内将浓缩后的混合物缓慢加入到含有碳酸氢钠的(0.059kg)的乙腈/水1/4混合物(4.1L)中。小心控制添加速度以避免形成胶状沉淀。在约15分钟内加入约3.5％的所述溶液，然后中止添加，在约20℃下搅拌该浆1小时。该糊状沉淀变成白色浆。在15到30分钟内加入另外7.5％的该溶液，并再次中止添加，在约20℃下搅拌该浆2小时。在约2小时内加入剩余89％的溶液。在约20℃搅拌该混合物12小时，然后过滤。用乙腈/H2O的1/4混合物(3×0.7L)，乙腈/二异丙醚(DlPE)的2/3混合物(3×0.7L)和DIPE(2×0.7L)洗涤该固体。在T≤30℃下干燥该固体产物至获得恒重。干燥后的水含量为3.3％(Karl-Fisher法分析)。
利用三氟乙酸/乙腈水梯度溶液通过反相HPLC分析产物。
LC/MS分析确定，Fmoc-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH的[M+H]质量为922.5。
回收率为81.8％(0.234kg)；净回收率为82.3％(基于氮含量：96.0％)
实施例4；Fmoc-Har-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NPys)-NH2的制备
在约20℃下，在装有肽合成级DMF(0.675L)的反应器中，加入Fmoc-Har-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-OH(0.225kg)。将混合物冷却至约0℃，并加入H-Cys(NPys)-NH2作为固体盐酸盐(0.080kg)。将O-苯并***-1-基-N，N，N，’N’-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)(0.082kg)加入反应混合物中。通过分部分地添加二异丙基乙基胺(DIPEA)(0.112L)调整反应混合物的pH值为6.5到7.0，同时保持温度约为0℃。在该温度下搅拌所述的混合物，在此期间约每45分钟，通过HPLC样品分析产物形成。该反应混合物的pH值保持在添加DIPEA所需的6.5到7.0的pH值。在PlatinumEPS 100-5 C18 5μ250*4.6mm柱上进行HPLC分析；溶剂A；0.1％TFA的水；溶剂B：0.1％TFA的乙腈；梯度：12到98％B15分钟。在215nm进行HPLC检测，流速2.0mL/min且温度为40℃。当五肽和Cys(NPys)-NH2原料通过HPLC各自显示为小于1％时，认为反应完成。否则，在混合物中加入显示不足的另外的TBTU，DPEA和原料。
在约5℃的温度下，将反应混合物加入另一个含有水(4.5L)容器中。在添加中搅拌保持该温度。在约5℃下搅拌10分钟后，过滤该混合物并用水洗涤固体五次(各0.9L)。然后用甲苯洗涤该固体三次(各0.675L)。可用二异丙基醚洗涤代替甲苯洗涤。在35℃或之下真空干燥所述固体直至获得恒重。干燥后的水含量为1.2％(Karl-Fisher法分析)。
利用三氟乙酸/乙腈水梯度溶液通过反相HPLC分析产物。
LC/MS分析确定，Fmoc-Har-Gly-Asρ(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NPys)NH2的[M+H]质量为1178.4。
回收率为102.4％(0.295kg)；净回收率为87.7％(基于肽含量：82.0％)
实施例5：Fmoc-Har-GIy-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NH2)-Mpa(Fmoc[2-7-1])的制备
在约20℃，在氮气氛下，向装有HPLC级乙腈(0.570L)和肽合成级DMF(0.285L)的反应器中缓慢搅拌加入0.285kg的Fmoc-Har-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NPys)NH2(Fmoc[2-7])。在Fmoc[2-7]溶解后，将该混合物冷却到约-3℃。以可保持反应温度在约-3℃的速度，将在约20℃制备的巯基丙酸(Mpa，0.023kg)在乙腈(0.057L)中的溶液加入到反应混合物中。通过HPLC分析监控所述的反应，并当分析显示与Fmoc[2-7-1]相比，Fmoc[2-7]小于1％时认为反应完成。在Purospher Star Cl 8 55*4mm柱上，用含有0.1％三氟乙酸(TFA)的水/乙腈溶剂混合物，梯度为98∶2水/乙腈到2∶98水∶乙腈10分钟，进行HPLC分析。在215nm进行HPLC测定，流速为2.0mL/min，温度为40℃。
在约20℃，将反应混合物加入到第二个装有HPLC级乙腈(5.7L)和N-乙基吗啉(NEM，0.033L)的容器中。在添加完成后，在该温度搅拌反应约30分钟。将该浆缓慢冷却到约0℃，并在此温度下继续搅拌约45分钟。然后进行以下步骤三次：(a)停止搅拌允许沉淀和上层清液分离；(b)将上层清液抽出容器(c)在约0℃，将新的HPLC级乙腈(1.425L)加入到反应器中并重新开始搅拌；和(d)在约0℃搅拌该浆约5分钟。过滤剩下的浆，并用HPLC级乙腈(各1.140L)洗涤固体两次和用甲苯(1.425L)洗涤一次。用甲苯的洗涤可以由用二异丙基醚的洗涤替代。在不高于20℃，在高真空下干燥所述的固体。
利用三氟乙酸/乙腈水梯度溶液通过反相HPLC分析产物。
LC/MS分析确定，
Fmoc-Har-GIy-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NH2)-Mpa的[M+H]质量为1128.4。
回收率为93.8％(0.256kg)；净回收率定量(基于肽含量：87.4％)
实施例6：H-Har-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NH2)-Mpa([2-7-1])的制备
在约20℃，在装有肽合成级DMF(0.750L)的反应器中缓慢搅拌加入0.250kg的Fmoc-Har-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NH2)-Mpa(Fmoc[2-7-1])。将该混合物冷却到约10℃，在该温度下加入二乙胺(0.034L)。加入二乙胺后，使得混合物的温度升至约20℃。通过每小时取样进行HPLC分析，监测反应进程。在Platinum EPS 100-5 C18 5μ250*4.6mm柱上进行HPLC分析；溶剂A：0.1％的TFA水溶液；溶剂B：0.1％TFA的乙腈溶液；梯度：22 to 98％B15分钟。在215nm进行HPLC检测，流速为2.0mL/min，温度为40℃。当Fmoc[2-7-1]的百分比相对于[2-7-1]小于约0.5％时，认为反应完成。通常反应在3小时内完成。
将反应混合物加入到第二个装有乙酸乙酯(5.0L)的容器中，并冷却到约10℃。在约10℃搅拌所得到的悬浮液10分钟。进行以下步骤两次：(a)停止搅拌，并允许沉淀从上层清液中分离约15分钟；(b)将上层清液抽出该容器；(c)在约10℃，加入新的乙酸乙酯(0.750L)；(c)在约10℃搅拌该悬浮液约5分钟。过滤浆，并用乙酸乙酯(每次为0.750L)洗涤固体6次。可以用二异丙基醚进行另外的洗涤以除去残余的乙酸乙酯。在不高于25℃下，在高真空下干燥该固体最长18小时。
利用三氟乙酸/乙腈水梯度溶液通过反相HPLC分析产物。
LC/MS分析确定，H-Har-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NH2)-Mpa的[M+H]质量为906.3。
GC分析显示为3.4％的残余二乙胺。
回收率为106.1％(0.213kg)；净回收率为99.2％(基于肽含量：81.9％)。
实施例7：[MPA-Har-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys](NH2)(cyclo-[1-7](OtBu)-NH2)的制备
向反应器中装入肽合成级的DMF(0.768L)，并将该溶液冷却到约10℃。加入O-[氰基(乙氧羰基)亚甲基氨基]-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐(TOTU)(0.070kg)，之后由肽合成级二氯甲烷(1.536L)稀释，同时保持温度低于15℃。将所得到的溶液冷却到约-6℃，并分成小部分地加入NEM(0.024L)，保持温度在约-6℃。在加入NEM之前和之后测量pH值。取样进行HPLC分析。
在Phenomenex Luna Cl8(2)柱，5um，150*4.6mm上进行HPLC分析，梯度为12到98％B15分钟。溶剂A：0.1％的TFA水溶液，溶剂B：0.1％的TFA乙腈溶液。在215nm检测，流速为2mL/min，温度为40℃。
在约20℃，向分离反应器中装入肽合成级的DMF(0.768L)，之后装入0.192kg的H-Har-Gly-Asp(O-tBu)-Trp-Pro-Cys(NH2)-Mpa([2-7-I])。当所述固体溶解后，将所得到的溶液冷却到约0℃。小部分地加入HOBt(0.026kg)(以纯度校正HOBt的重量)。得到的溶液用肽合成级的二氯甲烷(0.384L)稀释。取样进行HPLC分析。
在最小3小时内用另外的泵，将[2-7-1]溶液极缓慢地加入到TOTU溶液中，同时保持温度为约-6℃。在加入50％的[2-7-1]溶液后，取样进行HPLC分析。同时在该点测量pH值。当[2-7-1]添加完成后，也进行HPLC和pH值取样。如果需要的话，通过加入NEM将pH值调整到7-7.5，同时保持温度在约-6℃。
每15分钟检查pH值，需要的话用NEM调整到7-7.5，同时保持温度在约-6℃。每45分钟，取样进行HPLC分析直至环化完成。当[2-7-1]的面积百分比相对于环化产物＜0.5％时，认为反应完成。
若反应停止，加入每残余量[2-7-1]1.1当量的TOTU，并根据需要将pH值调整到7-7.5，同时保持温度在-6℃。
当反应完成时，在＜40℃下真空浓缩该混合物至最终体积为约0.8L。将得到的粘性溶液冷却到约5℃，并缓慢地加入快速搅拌的约0℃的乙酸乙酯(7.0L)。得到的浆在约0℃下搅拌20分钟。然后进行以下步骤三次：(a)停止搅拌，允许沉淀和上层清液分离；(b)将上层清液抽出该容器；(c)在约0℃下，将新的乙酸乙酯(1.15L)加入反应器，并重新开始搅拌；(d)在约0℃，搅拌该浆约20分钟。在上述步骤完成时，将较小体积的乙酸乙酯(0.768L)加入到反应中，并在0℃重新开始搅拌10分钟。得到的浆过滤，并用乙酸乙酯(0.576L)洗涤该固体一次，用二异丙基醚(0.576L)洗涤三次。在约25℃高真空下干燥该固体。
利用三氟乙酸/乙腈水梯度溶液通过反相HPLC分析产物。
LC/MS分析确定，(环-[1-7](OtBu)-NH2)的[M+H]质量为888.2。
回收率为103.7％(0.194kg)；净回收率定量为(基于肽含量：79.7％)
实施例8：[MPA-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys](NH2)(环-[1-7]-NH2)的制备
在约20℃，制备二氯甲烷(0.573L)，茴香醚(0.086L)和TFA(0.122L)的混合物。将所得到的溶液冷却到15℃，并缓慢加入固体[1-7](OtBu)-NH2(0.191kg)。在[1-7](OtBu)-NH2的添加中，保持温度低于20℃。将反应混合物进一步冷却到10℃，并在约10分钟内加入另外部分的TFA(0.365L)。在添加过程中保持温度低于20℃。在加入全部的TFA后，允许反应在20℃搅拌，之后进行HPLC分析。
在Platinum EPS 100-5 C18柱，250*4.6mm上进行HPLC分析。梯度为22到98％B15分钟，其中溶剂A是0.1％TFA水溶液，溶剂B是0.1％TFA的乙腈溶液。在215nm检测，流速为1.5mL/min，温度为40℃。当相对于产物剩余＜3.0面积％的[1-7](OtBu)-NH2时，反应完成。
当反应完成时，将该混合物冷却到10℃，并在10℃加入到2/1二异丙基醚(DIPE)/乙腈(3.78L)溶液中。将得到的浆在10℃搅拌10分钟，然后真空过滤。将该固体用DIPE和乙腈的7/3混合物(0.573L)洗涤三次，用DIPE(0.573L)洗涤三次。产物在不高于25℃下干燥。
利用三氟乙酸/乙腈水梯度溶液通过反相HPLC分析该产物。
LC/MS分析确定，(环-[1-7]-NH2)的[M+H]质量为832.3。
回收率为0.157kg(87.9％)，且净回收率为87.2％(基于肽含量：79.1％)
纯API的含量为45.8％。这个数值是通过以下的HPLC方法获得的：Synergi Max-RP 4μm 80 250*4.6mm；溶剂A：52mMH3PO4/CH3CN/100mM H7SA(86/14/0.80)；溶剂B：52mM H3PO4/CH3CN/100mM H7SA(50/50/0.80)；220mm；1.3ml/min；50℃；梯度：0％B45分钟，然后45％B13分钟，然后100％B1分钟。
实施例9：埃替非巴肽的纯化
初次纯化：
初次纯化为基于三氟乙酸/乙腈的纯化。对单个的主要组分(fraction)应用标准为≥92.0％。固定相为Kromasil C18，10μm，100A柱，直径5cm。柱压50巴，流速50ml/min，测定波长215nm。流动相如下：
溶剂A：0.1％TFA溶于工艺水(processed water)/CH3CN(95/5)；和
溶剂B：0.1％TFA溶于工艺水/CH3CN(50/50)。
通过100％的溶剂A洗脱15分钟平衡该柱。纯化梯度如下：100％的溶剂A洗脱10分钟；梯度：15％B到45％的B60分钟；和100％的溶剂B洗脱15分钟。
利用MAD-009-SF323TG1方法监测纯化，目标接受标准如下：
主组分(Fl)：≥92％；和
副组分(Fp)：≥60％且≤92％。
收集组分在2℃到8℃贮存。
二次纯化：
二次纯化是基于乙酸/乙腈的纯化。对单个主要组分的应用标准为≥99.0％，单个杂质为＜0.3/0.5％。固定相为Kromasil Cl8，10μm，100A柱，直径5cm。柱压40±5巴，流速50ml/min，检测波长215nm。流动相如下：
溶剂A：0.5％AcOH溶于工艺水/CH3CN(95/5)；和
溶剂B：0.5％AcOH溶于工艺水/CH3CN(50/50)。
通过100％的溶剂A洗脱15分钟平衡该柱。纯化梯度如下：100％的溶剂A洗脱10分钟；梯度：0％B到15％B5分钟；和15-35％B60分钟；和100％溶剂B洗脱15分钟。
利用MAD-009-SF323TG1方法监测纯化，目标接受标准如下：
主组分(Fl)：≥99.％，杂质＜0.3/0.5％；和
副组分(Fp)：≥80.0％且≤99.0％。
收集组分在2℃到8℃贮存。
脱盐/浓缩：
在浓缩步骤前，在乙酸铵溶液中进行两次脱盐步骤，以除去残留的三氟乙酸反离子并获得肽的乙酸形式。浓缩步骤减少了处理溶液的体积。
NH4OAc脱盐/AcOH浓缩的固定相是Kromasil C18，10μm，100A柱，直径5cm。柱压40±5巴，流速50ml/min，测定波长215nm。流动相如下：
溶剂A：0.5％AcOH溶于工艺水/CH3CN(95/5)；和
溶剂B：0.5％AcOH溶于工艺水/CH3CN(50/50)；和
溶剂C：NH4OAc 100mM pH：6.5溶于工艺水/CH3CN(95/5)。
通过100％的溶剂A洗脱15分钟平衡该柱。对于柱负荷，用2体积的工艺水稀释AcOH纯化的主要组分。
如下进行脱盐：溶剂A10分钟；溶剂C10分钟；溶剂A10分钟；和溶剂C10分钟。
如下进行浓缩：溶剂A10分钟和50％B15分钟。
利用MAD-009-SF323TG1方法监测脱盐和浓缩，且目标接受标准如下：
主组分(Fl)：≥99.0％，杂质＜0.3/0.5％；和
副组分(Fp)：＞80.0％且＜99.0％。
收集组分在2℃到8℃贮存。
本文中引用或描述的任何专利、专利申请和出版物的全部公开内容在此处引入作为参考。

Claims (46)

1.一种方法，包括：
·提供式II的化合物：
其中，
Har是高精氨酰基；
Gly是甘氨酰基；
Asp是天冬酰基；
Trp是色氨酰基；
Pro是脯氨酰基；
Cys-NH2是半胱氨酰胺；和
Mpa是巯基丙酸；和
P2是羧基保护基团；和
·将Har和Mpa残基结合以形成式III的化合物：
2.权利要求1的方法，其中P2是叔丁基。
3.权利要求1的方法，进一步包括将P2从式III化合物的Asp残基上除去，以形成埃替非巴肽。
4.权利要求1的方法，进一步包括将P1从式I化合物的Har残基上除去：
其中P1是氨基保护基团，从而形成式II的化合物。
5.权利要求4的方法，其中在适于除去P1的条件下P2是稳定的。
6.权利要求4的方法，其中P2是叔丁基。
7.权利要求4的方法，其中P1是9-芴甲氧羰基或苯甲氧羰基。
8.权利要求4的方法，进一步包括将Mpa残基附着到下式的2-7埃替非巴肽片段上：
P1-Har-Gly-Asp(O-P2)-Trp-Pro-ACys-NH2
其中ACys-NH2是活化的半胱氨酰胺残基，通过2-7埃替非巴肽片段的Acys-NH2残基和Mpa残基之间的二硫键，从而形成式I的化合物。
9.权利要求8的方法，进一步包括将下式的2-6埃替非巴肽片段
P1-Har-Gly-Asp(O-P2)-Trp-Pro-OH
与活化的半胱氨酰胺残基通过所述2-6埃替非巴肽片段的Pro残基结合，从而形成所述的2-7埃替非巴肽片段。
10.权利要求9的方法，其中所述的活化的半胱氨酰胺残基是H-Cys(Npys)-NH2。
11.权利要求9的方法，进一步包括将下式的2-3埃替非巴肽片段P1-Har-Gly-OH
与下式的4-6埃替非巴肽片段
H-Asp(O-P2)-Trp-Pro-OH
通过将该2-3埃替非巴肽片段的Gly残基附着到该4-6埃替非巴肽片段的Asp残基上，从而形成所述的2-6埃替非巴肽片段。
12.权利要求11的方法，进一步包括将具有保护羧基侧链的氨基末端保护Asp残基与Trp-Pro二肽结合，所述结合通过该二肽的Trp残基并从Asp残基上除去氨基末端保护基团，以形成所述的4-6埃替非巴肽片段。
13.权利要求12的方法，进一步包括将氨基末端保护的Har残基和保护或未保护的Gly残基结合，以形成所述的2-3埃替非巴肽片段。
14.一种方法，包括：
将氨基末端保护的高精氨酸残基与保护或未保护的甘氨酸残基结合，从而形成下式的2-3埃替非巴肽片段：
P1-Har-Gly-OH；
通过二肽的色氨酸残基，将具有保护羧基侧链的氨基末端保护的天冬氨酸残基与色氨酸-脯氨酸二肽结合，并从天冬氨酸残基上除去氨基末端保护基团，从而形成下式的保护的4-6埃替非巴肽片段：
P3-Asp(O-P2)-Trp-Pro-OH
通过将该2-3埃替非巴肽片段的Gly残基附着到该4-6埃替非巴肽片段的Asp残基上，将该2-3埃替非巴肽片段和该4-6埃替非巴肽片段结合，从而形成下式的2-6埃替非巴肽片段：
P1-Har-Gly-Asp(O-P2)-Trp-Pro-OH
其中，
Har是高精氨酰基；
Gly是甘氨酰基；
Asp是天冬酰基；
Trp是色氨酰基；
Pro是脯氨酰基；
P1和P3是氨基保护基团；和
P2是羧基保护基团；
通过所述2-6埃替非巴肽片段的Pro残基，将该2-6埃替非巴肽片段结合到活化的半胱氨酰胺残基上，从而形成下式的2-7埃替非巴肽片段：
P1-Har-Gly-Asp(O-P2)-Trp-Pro-ACys-NH2
其中ACys-NH2是活化的半胱氨酰胺；
通过在巯基丙酸残基和所述2-7埃替非巴肽片段的ACys-NH2残基之间的二硫键，将巯基丙酸残基附着到该2-7埃替非巴肽片段上，从而形成式I的化合物：
Figure A2005800107520005C1
其中
Mpa是巯基丙酸；
Cys-NH2是半胱氨酰胺；
将P1从式I化合物的Har残基上除去，从而形成式II化合物：
Figure A2005800107520005C2
将式II化合物的Har和Mpa残基结合，从而形成式III的化合物：
从式III化合物的Asp残基上除去P2，以形成埃替非巴肽。
15.权利要求14的方法，其中在适于除去P1的条件下，P2是稳定的。
16.权利要求14的方法，其中P2是叔丁基。
17.权利要求14的方法，其中P1是9-芴甲氧羰基或苯甲氧羰基。
18.权利要求14的方法，其中ACys-NH2是H-Cys(Npys)-NH2。
19.式IV的化合物：
其中，R1是氢或P1；
P1是氨基保护基团；和
P2是羧基保护基团。
20.权利要求19的化合物，其中P2是叔丁基。
21.权利要求19的化合物，其中R1是氢。
22.权利要求21的化合物，其中P2是叔丁基。
23.权利要求19的化合物，其中R1是P1。
24.权利要求23的化合物，其中P1是9-芴甲氧羰基或苯甲氧羰基。
25.权利要求24的化合物，其中P2是叔丁基。
26.选自下组的化合物：
Fmoc-Har-Gly-OH；
Fmoc-Har-Gly-O-P4；和
Fmoc-Har-Gly-Asp(O-P5)-Trp-Pro-OH
其中
Fmoc是9-芴甲氧羰基；
Har是高精氨酸；
Gly是甘氨酸；
Asp是天冬氨酸；
Trp是色氨酸；
Pro是脯氨酸；
P4和P5是羧基保护基团。
27.权利要求26的化合物，其中P4是五氟苯酚。
28.权利要求26的化合物，其中P5是叔丁基。
29.3-硝基-2吡啶亚磺酰基-半胱氨酰胺(H-Cys(Npys)-NH2)。
30.下式的化合物：
31.包括埃替非巴肽和Gly-埃替非巴肽的组合物。
32.权利要求31的组合物，包括至少99％的埃替非巴肽和在约0.01％到约1％范围内的Gly-埃替非巴肽。
33.权利要求32的组合物，包括至少99％的埃替非巴肽和在约0.01％到约0.1％范围内的Gly-埃替非巴肽。
34.根据权利要求1的方法制备的产物。
35.根据权利要求4的方法制备的产物。
36.根据权利要求8的方法制备的产物。
37.根据权利要求9的方法制备的产物。
38.根据权利要求11的方法制备的产物。
39.根据权利要求12的方法制备的产物。
40.根据权利要求13的方法制备的产物。
41.纯化埃替非巴肽的方法，包括：
将埃替非巴肽溶液与包括附着于二氧化硅的十八碳链的固定相接触；
用三氟乙酸/乙腈溶液洗涤所述与埃替非巴肽溶液接触的固定相；
任选地用乙酸/乙腈溶液洗涤所述与埃替非巴肽溶液接触的固定相，和
用铵酸/乙腈溶液洗涤所述与埃替非巴肽溶液接触的固定相。
42.权利要求41的方法，其中三氟乙酸/乙腈溶液是包括95％的0.1％三氟乙酸水溶液和5％的乙腈溶液的溶液。
43.权利要求42的方法，进一步包括用三氟乙酸/乙腈溶液洗涤所述与埃替非巴肽溶液接触的固定相，所述的三氟乙酸/乙腈溶液包括50％的0.1三氟乙酸水溶液和50％的乙腈溶液。
44.权利要求41的方法，其中乙酸/乙腈溶液是包括95％的0.5％乙酸水溶液和5％的乙腈溶液的溶液。
45.权利要求44的方法，进一步包括用包括50％的0.5％乙酸水溶液和50％的乙腈溶液的乙酸/乙腈溶液，洗涤所述与埃替非巴肽溶液接触的固定相。
46.权利要求41的方法，其中铵酸/乙腈溶液是包括95％的100mM铵酸水溶液和5％的乙腈溶液的溶液。
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