CN1968961A - 制备肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备式(1)的N6－(氨基亚氨基甲基)－N2－(3－巯基－1－氧代丙基－L－赖氨酰甘氨酰基－L－α－天冬氨酰基－L－色氨酰基－L－脯氨酰基－L－半胱酰胺，环状(1→6)－二硫化物的改进方法，该方法包括在固相树脂上用合适的保护基组装氨基酸残基和硫代烷基羧酸，从树脂中解离如此获得的肽并同时除去除硫羟基部分的Acm保护基以外的侧链保护基，以获得式(3)的肽酰胺，将式(3)的肽酰胺中的赖氨酸残基通过鸟苷酸化转化成高精氨酸残基，以获得式(4)的肽酰胺，制备式(5)的银肽，接着同时脱保护和氧化所述银肽，以获得包含式(1)的化合物的粗肽酰胺，并最后进行色谱纯化。所述方法简单、容易、环境友好且成本有效。

Description

制备肽的方法
技术领域
本发明涉及使用固相Fmoc-化学，制备式(1)的N6-(氨基亚氨基甲基)-N2-(3-巯基-1-氧代丙基-L-赖氨酰甘氨酰基-L-α-天冬氨酰基-L-色氨酰基-L-脯氨酰基-L-半胱酰胺，环状(1→6)-二硫化物的改进方法。
背景技术
美国专利No.5318899描述了式(1)的N6-(氨基亚氨基甲基)-N2-(3-巯基-1-氧代丙基-L-赖氨酰甘氨酰基-L-α-天冬氨酰基-L-色氨酰基-L-脯氨酰基-L-半胱酰胺，环状(1→6)-二硫化物作为用于治疗和预防与血小板有关的局部缺血疾病的治疗剂。它结合到人类血小板的血小板受体糖蛋白(GP)上并抑制血小板聚集。血小板聚集由在血小板膜表面上的GP配合物介导。它以非活性形式存在于未受到刺激的血小板表面上。当血小板通过粘合和生理***激活时，GP也被激活，以便它变为血纤蛋白原、vonWillebrand因子(vWF)和纤连蛋白的受体。然而，它是血纤蛋白原和/或vWF的结合物，认为这种结合物是造成血小板聚集和体内血栓形成的主要原因。这教导特异地抑制血纤蛋白原或vWF结合到GP上的物质，抑制血小板聚集且可成为在体内抑制血栓形成的候选物(Eric J.Topol，Tatiana V.Byzova，Edward F.Plowand The Lancet；Vol 353；1999年1月16日；第227-231页)。该文章描述了具有血小板聚集抑制活性的化合物，但没有教导合成该分子的方法。
血小板糖蛋白IIb/IIIa的拮抗物在经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention)(PCI)过程中在降低导致心肌损坏的血栓复杂程度方面具有得到证明的作用。
式(1)的化合物是二硫化物成环的环状七肽，其含有六个氨基酸和一个巯基丙酰(脱氨半胱氨酰)残基。在半胱酰胺和巯基丙酰基部分之间形成二硫化物桥。已知它通过溶液相肽合成生产并通过制备反相液相色谱纯化并冻干(www.fda.gov/cder/foi/label/1998/20718lbl.pdf)。
关于肽的合成方法，两种主要的合成技术主导目前的实践。这些是在溶液中合成(均相)和在固相上合成(非均相)。但与固相路线相比溶液相路线更麻烦，因为在每一次偶联之后必需分离已形成的肽，而在固相合成中，通过简单的过滤洗涤掉过量的试剂和副产物。在两者中，通过逐步添加氨基酸部分到形成的肽链上，从而制备所需的肽化合物。
美国专利5958732和5318899要求保护关于重组技术来合成肽，例如式(1)的N6-(氨基亚氨基甲基)-N2-(3-巯基-1-氧代丙基-L-赖氨酰甘氨酰基-L-α-天冬氨酰基-L-色氨酰基-L-脯氨酰基-L-半胱酰胺，环状(1→6)-二硫化物。将通过这一重组方法获得的肽通过溶液相合成来改性，以将赖氨酸残基转化成高精氨酸残基。这些专利文献还要求保护使用Boc化学的固相合成，且这些专利的主题从根本上不同于本发明。
与Boc化学相比，基于Fmoc化学的合成利用温和的工序，且由于Fmoc基团的碱不稳定性，因此使用酸活泼侧链保护基，从而提供垂直(orthogonal)保护。使用保护基的原理是断开保护基的化学键的能量低于任何其它基团。
专利US5686566、US5686567、US5686569、US5686570和US5756451涉及式(1)化合物的盐或其它形式的不同的PAI，但没有教导使用Fmoc固相合成制备它的方法。
同样，专利US5759999、US5786333、US5770564、US5807825、US5807828、US5843897、US5968902和US5935926描述了治疗与血小板有关的疾病的方法以及使用boc化学制备式(1)的肽酰胺的方法。
专利US5344783和US5851839涉及选择并鉴定血小板聚集抑制剂(PAI)的方法并公开了制备式(1)的肽酰胺的boc化学。
美国专利5780595要求保护对PAI特异的抗体，且还公开了制备式(1)的肽酰胺的boc化学。
合成各种其它肽的Fmoc路线是现有技术中公知的，且可获得数篇文献用于其制备。然而，开发经济、包括最少步骤且还生态友好的制备式(1)的化合物的方法存在明确的需要。
如前所述，基于Fmoc化学的合成利用温和的工序，且由于Fmoc基团的碱活泼性，因此使用酸活泼侧链保护基，从而提供垂直保护。在Fmoc化学中所使用的保护基基于叔丁基部分：对于Ser、Thr来说，为叔丁基醚，对于Asp、Glu来说为叔丁基酯，和对于Lys、His来说为Boc。Trt和acm基已用于保护Cys。Arg和Har中的胍基受到Mtr、Pmc或Pbf保护。大多数Fmoc-氨基酸衍生物可以商购。然而，在制备某些氨基酸类似物，例如含有高精氨酸的肽以及基于二硫化物键的环状肽化合物领域中存在问题，因为在纯化最终产物之前要求分离操作，这会增加成本且可影响最终产物的纯度和产率。Fmoc-高精氨酸残基若商购以用于链的组装，则变的昂贵。可选地，在肽的组装中，通过在α-NH2处鸟苷酸化(guanylation)赖氨酸残基形成Har单元，这已证明获得了后叶加压素类似物用于评价其生物活性(Lindeberg et al，Int.J.Peptide Protein Res.10，1977，240-244)。
WO03/093302公开了使用Fmoc-α-氮保护的Cα-碳酰胺(carboxamide)半胱氨酸合成式(1)的肽。它描述了将沉淀形式的第一氨基酸，半胱氨酸通过其硫羟基侧链连接到固体载体4-甲氧基三苯甲基聚苯乙烯树脂上，接着除去α-氮保护基并在所述氮上组装肽。然而，该方法使用固体载体-4-甲氧基三苯甲基聚苯乙烯树脂，它不是常见的商业实施方案，且Fmoc-α-氮保护的Cα-碳酰胺半胱氨酸也不是可商购的。这使得该方法具有增加数量的步骤且相对于本发明的方法来说还昂贵。解离条件利用乙二硫醇，它使得该方法高度有毒和非环境友好，从而要求使用昂贵的涤气器。提及在链的组装中使用Fmoc-高精氨酸残基，若它可商购的话，则也使得该方法非常昂贵。总之，在这一文献中要求保护的方法不同于在本发明中要求保护的方法。另外，WO03/093302的方法与一些局限有关，在本发明的方法步骤中，通过提供合适的改性，从而克服了所述局限。
因此，与WO03/093302-A2专利公开中所述的方法相比，本发明的方法是改进和有效的方法，正如以下所提及的。
1.不包括生产-SH肽，该肽对空气氧化敏感，从而导致形成杂质，所述杂质将阻碍最终产物的纯化和产率。
2.精确选择氨基酸的保护基，形成肽链。
3.使用合适的活化试剂，活化氨基酸中的羧基官能，防止氨基酸的外消旋化。
4.在不分离-SH肽下由银-肽盐中间体获得式(1)的在肽酰胺中的二硫化物环的有效方法。
合成了相当数量的已知的，天然存在的小和中等尺寸的环状肽以及拥有所需的药学性能的一些它们的合成衍生物和类似物。然而，因为它们的合成和纯化复杂，较宽的医疗应用常常受到阻碍。因此，以简单、较少的步骤和以较低的成本制备这些化合物的改进方法是所需的且是工业和人类的需要。
肽的纯度和产率是任何合成路线的重要方面。用药理学的活性化合物在最终产物中的相对含量表示的产率应当尽可能高。通过药理学的活性杂质的存在程度来表示纯度，所述杂质尽管仅仅以痕量存在，但当用作治疗剂时，可干扰或甚至使肽的有益作用无效。在药理学的这两个方面必需考虑。通常，在较大的肽分子情况下，纯化变得愈加困难。在均(溶液)相合成(它是目前工业生产较大量肽所选的方法)，在分离的步骤之间要求的反复纯化提供较纯的产品，但产率较低。因此，需要在合成的最后阶段改进产率和纯化技术。本发明是工业上可行的固相合成方法，且是得到具有提高的产率的高纯产品的新方法。
现有技术描述了使用HOBt和DIC活化氨基酸，这会导致形成OBt酯。然而，使用这一工序的主要缺点是制备OBt酯本身花费约20分钟，且反应还必需在0℃下进行。在SPPS内逐步引入Nα保护的氨基酸通常包括引入的氨基酸的就地羧基活化或者使用预成形的活化氨基酸衍生物。近年来，基于铝和磷鎓的衍生物(HBTU、TBTU、Py Boc和HATU)成为就地羧基活化的优选工具。已显示它们在偶联效率和抑制对映异构化二者方面给出优异的结果。(Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis by Chan W.C.andWhite P.D.，Oxford University Press，2000，第41-74页)。使用HBTU提供高的产率和高的纯度。它在活化步骤中节约时间且不要求冷却。对于Mpr(Acm)-OH来说，也不要求双偶联。
大多数Fmoc-氨基酸衍生物是可商购的。然而，在制备某些氨基酸类似物，例如含有高精氨酸的肽以及基于二硫化物键的环状肽化合物领域中存在问题，因为在纯化最终产物之前要求分离操作，这将增加成本且可影响最终产物的纯度和产率。Fmoc-高精氨酸残基若商购用于在肽链的组装中使用的话，则非常昂贵。或者，可使用赖氨酸，接着在α-NH2处鸟苷酸化赖氨酸残基，从而进行肽的组装(Lindeberg et al，Int.J.Peptide Protein Res.10，1977，240-244)。
通常作为最后的合成步骤进行氧化环化受护的或者未保护的硫氢基并形成二硫化物结构，原因是二硫化物键的显著热和化学活泼性。在少数情况下，它也可在从固体载体中解离肽分子之前进行。在CRC Handbook of Neurohypophyseal HormoneAnalogs，Vol.1，Part1；Jost，K.，et al.Eds.，CRC Press，BocaRaton，Fla.1987，p.31中进一步解释了在，例如，甲醇或乙酸中含有游离和/或某些类型的被保护的硫氢基和碘的开链肽的氧化。然而，碘作为环化剂不是没有缺点。例如，存在于肽基质内的色氨酸部分具有碘化的危险，使在起始材料的完全转化和最小化副反应之间的平衡变为精密的平衡，这反过来会影响产物纯度。Tam(Tam J.P.et al.，1990，J.Am.Chem.Soc.，Vol.113，p.6657)证明，与其它方法，例如空气氧化相比，在各种缓冲体系中使用20-50％的DMSO溶液大大地促进二硫化物键的形成。还发现DMSO大大地降低，和在一些情况下，完全抑制使用其它氧化工序发生的肽的聚集和沉淀。因此，与其它已知的方法相比，通过DMSO氧化的二硫化物环肽的产率和纯度高得多。在本发明中，通过不选择用于氧化环化的碘路线，正好解决了这一方面。此外，在本发明中，使肽酰胺的银盐代替含硫羟基的肽酰胺进行氧化，而没有分离SH-肽并消除在氧化反应过程中形成的副产物。因此，脱保护接着氧化在本发明中采用的鸟苷酸化肽酰胺的工序步骤得到含提高纯度和产率的式(1)化合物的粗肽酰胺。最后纯化粗肽导致最终纯肽的提高的产率。
在已知的合成路线中另一复杂的因素是在所需的环状二硫化物和在反应最后还原(reducing)过量碘所使用的无机硫化合物，例如连二硫酸钠或硫代硫酸钠之间相互作用的可能性。这种还原的含硫化合物可与二硫化物键相互作用，所述二硫化物键对亲核进攻一般来说敏感。由于本发明的方法避免使用碘，因此所得产品具有高的纯度和检测不到相关杂质。
以几个容易和简单的步骤实现该方法。使用固相合成使得该方法更加简单，和使用Fmoc-化学省去使用苛刻的化学品，例如HF，从而不影响产品稳定性。该方法省去纯化中间体，从而增加产率和降低成本。通过不必须使用硫醇用涤气器，在步骤(b)和(e)中替代硫醇作为清除剂使得该方法更加环境友好和经济。
方法的选择常常决定治疗学上肽的稳定性。长期以来要求获得克服与现有技术方法有关局限性的式(1)的肽。因此，含有色氨酸、二硫化物环、ε-NH2侧链等的肽合成的工业方法要求合适地选择保护基和反应条件以构建肽链。通过申请人开发在本申请中此处完整地描述的方法，现已成功地实现了这一目的。
说明书中所使用的术语一览表
AA         氨基酸
Acm        乙酰氨基甲基
ACT        活化剂
ADP        腺苷二磷酸
AgOTf      三氟甲烷磺酸银
Arg        精氨酸
Asp        天冬氨酸
Boc/boc    叔丁氧羰基
Cys        半胱氨酸
DCM        二氯甲烷
DEP        脱保护剂
DMF        二甲基甲酰胺
DMSO       二甲亚砜
DTT        二硫苏糖醇
EDT        乙二硫醇
Fmoc       9-芴基甲氧羰基
Glu        谷氨酸
Gly        甘氨酸
HBTU       2-(1H-苯并***-1-基)-1，1，3，3-
           四甲基脲(uronium)六氟磷酸盐
HF        氟化氢
HIC        疏水作用色谱法
His        组氨酸
IEC        离子交换色谱法
LC-MS      液相色谱-质谱
Lys        赖氨酸
Mpr        巯基丙酸
Mtr        4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基
NMM        N-甲基吗啉
Obut       O-叔丁基
Pbf        2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-
           磺酰基
Pmc        2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-
           磺酰基
PPP        贫血小板血浆
Pro        脯氨酸
PRP        富血小板血浆
RP-HPLC    反相高效液相色谱
RV         反应容器
Ser        丝氨酸
SOLV       溶剂
SP         合成肽
TEA    三乙胺
TFA    三氟乙酸
Thr    苏氨酸
TIS    三异丙基硅烷
Trp    色氨酸
Trt    三苯甲基
发明内容
发明目的
本发明的主要目的是提供获得式(1)的N6-(氨基亚氨基甲基)-N2-(3-巯基-1-氧代丙基-L-赖氨酰甘氨酰基-L-α-天冬氨酰基-L-色氨酰基-L-脯氨酰基-L-半胱酰胺，环状(1→6)-二硫化物的改进方法。
本发明的另一目的是公开用于获得高产率和高纯度的式(1)的肽酰胺的方法。
本发明又一目的是公开通过使用Fmoc化学固相合成式(1)的肽酰胺的方法。
本发明的再一目的是公开生产式(1)的肽的方法，其与溶液相合成相比具有较少数量的步骤。
本发明的又一目的是设计生产式(1)的肽酰胺的方法，其没有与式(1)的化合物的现有技术固相合成有关的局限性。
本发明再一目的是提供用于制备具有提高的纯度的含有二硫化物部分的小和中等尺寸的肽的方法。
本发明的又一目的是选择合适的保护基和试剂，在方法步骤中使形成的伴随杂质最小化，因而提高产率和降低成本。
发明概述
本发明涉及用于制备式(1)的N6-(氨基亚氨基甲基)-N2-(3-巯基-1-氧代丙基-L-赖氨酰甘氨酰基-L-α-天冬氨酰基-L-色氨酰基-L-脯氨酰基-L-半胱酰胺，环状(1→6)-二硫化物的改进的方法，它包括在固相树脂上组装氨基酸残基和具有合适的保护基的硫代烷基羧酸，从树脂上解离如此获得的肽，同时除去除了硫羟基部分的Acm保护基以外的侧链保护基，以获得式(3)的肽酰胺，将具有被保护的硫羟基基团的式(3)的肽酰胺的赖氨酸残基通过鸟苷酸化转化成高精氨酸残基，接着同时脱保护，获得式(5)的银肽，并氧化银肽，以获得式(1)的粗肽酰胺，并最后进行色谱纯化。所述方法简单、容易、环境友好且成本有效。
附图说明
图1：来自树脂的HBTU-粗肽的分析RP-HPLC洗脱分布图(柱子：PEP300；C-18；5μ；150×3mm；流速：0.5ml/min；注射体积：20μl；溶剂体系：A：0.1％TFA，B：100％乙腈)。
图2：来自树脂的DIC-粗肽的分析RP-HPLC洗脱分布图(柱子：PEP300；C-18；5μ；150×3mm；流速：0.5ml/min；注射体积：20μl；溶剂体系：A：0.1％TFA，B：100％乙腈)。
图3：粗的鸟苷酸化肽的分析RP-HPLC洗脱分布图(柱子：PEP300；C-18；5μ；150×3mm；流速：0.5ml/min；注射体积：20μl；溶剂体系：A：0.1％TFA，B：100％乙腈)。
图4：SH肽的分析RP-HPLC洗脱分布图(柱子：PEP300；C-18；5μ；150×3mm；流速：0.5ml/min；注射体积：20μl；溶剂体系：A：0.1％TFA，B：100％乙腈)。峰A-粗SH肽。
图5：粗环状肽的分析RP-HPLC洗脱分布图(柱子：PEP300；C-18；5μ；150×3mm；流速：0.5ml/min；注射体积：20μl；溶剂体系：A：0.1％TFA，B：100％乙腈)。峰A-粗环状肽。
图6：粗环状肽的制备RP-HPLC纯化洗脱分布图(柱子：Phenomenex Luna；C-18(2)；10μ；250×50mm；流速：50ml/min；溶剂体系：A：0.1％TFA，B：100％甲醇)。
图7：纯化的环状肽的分析RP-HPLC洗脱分布图(柱子：PEP300；C-18；5μ；150×3mm；流速：0.5ml/min；溶剂体系：A：0.1％TFA，B：100％乙腈)。峰A-纯化的肽。
图8：纯肽的MS分析，显示质量(mass)为832和杂质为903。
表1：通过式(1)的合成肽抑制ADP诱导的聚集。
具体实施方式
根据本发明，提供在固相上制备式(1)的肽N6-(氨基亚氨基甲基)-N2-(3-巯基-1-氧代丙基-L-赖氨酰甘氨酰基-L-α-天冬氨酰基-L-色氨酰基-L-脯氨酰基-L-半胱酰胺，环状(1→6)-二硫化物的方法，所述方法包含下述步骤：
Figure A20048004310900171
                     式(1)
a)通过偶联，借助肽键彼此直接相连，在固体载体树脂上以所要求的顺序组装包含六个氨基酸和一个硫代烷基羧酸的肽链，获得式(2)的肽；
(Acm)Mpr-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂
                     式(2)
b)在每次偶联之后用乙酸酐使步骤(a)的游离氨基封端；
c)从固体载体树脂上解离并脱保护除了在步骤(b)的肽中的acm基团以外的所有基团，以获得式(3)的肽酰胺；
(Acm)Mpr-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-CONH2
                     式(3)；
d)在有机溶剂中，在ε-赖氨酸-NH2处鸟苷酸化步骤(c)的肽，接着用另一溶剂沉淀，以获得式(4)的肽酰胺；
(Acm)Mpr-Homoarg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-CONH2
                     式(4)
e)在合适的溶剂中，用重金属盐处理步骤(d)式(4)的肽酰胺，接着使用有机溶剂沉淀，以获得式(5)的重金属-肽盐；
                     式(5)
f)用合适的亲核试剂处理步骤(e)的重金属-肽盐，以获得式(1)的粗肽酰胺；和
g)通过色谱技术纯化步骤(f)的粗肽酰胺。
本发明的一个实施方案涉及使化合物的氨基和羧基当量反应，以形成所述肽键。
本发明的另一实施方案提供通过连接体键合到固相树脂上的被保护的第一氨基酸的C端，以获得固相键合的氨基酸。
本发明的又一实施方案使用具有任何酰胺树脂，优选Rink酰胺树脂，的固体载体。
本发明的再一实施方案使用第一被保护的氨基酸作为硫羟基保护的Fmoc半胱氨酸。
本发明的又一实施方案使用HBTU作为偶联剂。
本发明的再一实施方案提供用连接体解离树脂，导致释放组装的肽酰胺。
本发明的再一实施方案提供通过连接每一端基官能度而获得的式(1)的肽酰胺化合物，所述端基官能度是氨基或羧酸基或其衍生物。
本发明的再一实施方案使用选自由Cys、Pro、Trp、Asp、Lys、Gly、Arg、Har、Leu、Glu组成的组中的氨基酸。
本发明的一个实施方案使用硫代烷基羧酸2-硫代丙酸。
本发明的另一实施方案提供以Fmoc或Boc方式使用用于氨基酸的氨基官能的保护基。
本发明的又一实施方案提供以未保护的或者被保护O-tBu酯的方式使用羧基官能。
本发明的再一实施方案用于使用硫羟基官能的保护基作为Acm基。
本发明的再一实施方案提供以确定的比例使用试剂：TFA、TIS、EDT、DCM、苯酚和水，优选TFA(85-98％)∶TIS(0-5％)∶H2O(0-5％)∶EDT(0-5％)∶苯酚(0-5％)，更优选TFA(94.5-95.5％)∶TIS(0-2.5％)∶H2O(0-3％)∶EDT(0-2.5％)，从固体载体树脂上解离该肽。
本发明的另一实施方案使用选自由DMF、乙醇和甲醇组成的组中的用于鸟苷酸化的有机溶剂。
本发明的又一实施方案优选通过使用溶剂DMF进行肽的鸟苷酸化。
本发明的再一实施方案使用选自由丙酮、乙腈、甲醇、醚、戊烷、己烷及其混合物组成的组中的溶剂，进行式(4)的肽酰胺的沉淀。
本发明的再一实施方案优选使用乙腈进行沉淀。
本发明的另一实施方案可通过RP-HPLC实现式(4)的肽的纯化。
本发明的又一实施方案，所得式(1)的肽酰胺具有大于99％的纯度。
本发明的再一实施方案，使用Fmoc化学，通过固相合成进行式(1)的肽的制备。
本发明进一步的实施方案使用选自三氟甲烷磺酸铊、乙酸汞或三氟甲烷磺酸银中的重金属盐，优选三氟甲烷磺酸银除去acm。
本发明的另一实施方案，优选在TFA中，用三氟甲烷磺酸银处理式(4)的肽，获得重金属肽盐。
本发明的再一实施方案，优选使用醚溶剂和更优选二异丙基醚，进行式(5)的重金属-肽盐的沉淀。
本发明的再一实施方案，可用HCl和DMSO处理重金属-肽盐，以同时除去重金属并氧化所得肽，以得到式(1)的粗肽酰胺。
本发明的再一实施方案，可通过RP-HPLC纯化式(1)的粗肽酰胺。
本发明的另一实施方案，优选通过RP-HPLC，使用C-4、C-8或C-18二氧化硅或聚合物反相柱，使用甲醇和/或乙腈，与含水TFA(0-0.5％)结合作为流动相，进行式(1)的粗肽酰胺的纯化。
本发明的再一实施方案使用甲醇(AR等级)纯化粗肽，使得该方法便宜。
本发明的再一实施方案提供制备以下给出的式(2)中间体肽的方法：
(Acm)Mpr-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂
                     式(2)
本发明的又一实施方案提供制备以下给出的酰胺式(3)的中间体肽的方法：
(Acm)Mpr-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-CONH2
                     式(3)
本发明的又一实施方案提供制备以下给出的式(4)的肽酰胺的方法：
(Acm)Mpr-Homoarg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-CONH2
                     式(4)
本发明的再一实施方案提供制备以下给出的式(5)的中间体肽酰胺银盐的方法：
Figure A20048004310900211
                     式(5)
下述实施例是本发明的说明且不解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例(1)化学合成直链肽
(Acm)Mpr-Lys(Boc)-Gly-Asp(OBut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树
                      脂
                     式(2)
通用程序：
按照下述方式进行肽链的组装。将树脂转移至肽合成仪[CS936，CS BIO，Calif.Peptide Synthesizer]的RV，并在肽合成仪上，使用1.5-4.0倍摩尔过量的氨基酸衍生物，在树脂上组装直链肽。通过在树脂上使Fmoc-基脱保护，将第一氨基酸Fmoc-Cys(C)偶联到树脂上，接着在NMM存在下，通过HBTU活化Fmoc-Cys(C)。为了偶联下一个氨基酸，脯氨酸，使第一氨基酸，即Fmoc-Cys(C)的α-氮脱保护，接着在NMM存在下，通过HBTU活化Fmoc-Pro。用所有氨基酸重复这一方法，直到将全部直链肽链组装在固体载体上。在端处组装Mpr。每一次偶联在45-90分钟的时间范围内进行。偶联步骤之后紧跟着用乙酸酐封端30-60分钟。在完成偶联之后，用有机溶剂洗涤树脂，所述有机溶剂可选自DMF、N-甲基吡咯烷酮或DCM，优选DMF，其次DCM，然后真空干燥。获得式(2)的直链肽。
通过固相肽合成技术，在rink酰胺树脂上，使用Fmoc化学，以肽酰胺形式合成该肽。
  仪器   CS936、CS BIO，Calif.肽合成仪
  树脂   Rink酰胺树脂(0.65mm/g)
  活化剂   HBTU/0.4M NMM
  溶剂   二甲基甲酰胺
  脱保护   20％哌啶
将树脂(15.38g-rink酰胺，10mmol)转移到CS 936的RV，并在DMF中溶胀。
(i)合成Fmoc Cys(Acm)-树脂，通过偶联Fmoc-Cys(Acm)/HBTU至树脂。用DMF洗涤预溶胀的树脂(10mmol)2次，接着通过用20％哌啶处理2次，除去Fmoc。用DMF洗涤树脂6次。将Fmoc Cys(Acm)(20mmol)和HBTU(与氨基酸等摩尔)溶解在0.4M NMM中，并加入到树脂中。在优化的搅拌下进行偶联60分钟。再次用DMF洗涤树脂三次。在偶联之后，通过乙酸酐(2.5M)封端游离氨基45分钟，接着用DMF洗涤3次。这一HBTU方法是其中酯没有分离的一步方法。
合成循环如下程序化：
步骤    试剂    时间    重复    活动
1       SOLV    10分钟  X3      洗涤树脂
2       DEP     5分钟   X2      N末端脱保护
3       SOLV    30秒    X6      洗涤树脂
4       ACT     30秒    X1      溶解Fmoc-Cys(Acm)/HBTU
5       AA      45分钟  X1      Fmoc-Cys(Acm)偶联
6       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
(ii)合成Fmoc-Pro-Cys(Acm)-树脂，通过将Fmoc-Pro/HBTU偶联至Fmoc-Cys(Acm)-树脂。与步骤1一样进行反应。合成循环如下程序化：
步骤    试剂    时间    重复    活动
1       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
2       DEP     5分钟   X2      N末端脱保护
3       SOLV    30秒    X6      洗涤树脂
4       ACT     30秒    X1      溶解Fmoc-Pro/HBTU
5       AA      45分钟  X1      偶联Fmoc-Pro
6       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
(iii)合成Fmoc-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂，通过偶联Fmoc-Trp/HBTU至Fmoc-Pro-Cys(Acm)-树脂。与步骤1一样进行反应。合成循环如下程序化：
步骤    试剂    时间    重复    活动
1       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
2       DEP     5分钟   X2      N末端脱保护
3       SOLV    30秒    X6      洗涤树脂
4       ACT     30秒    X1      溶解Fmoc-Trp/HBTU
5       AA      45分钟  X1      偶联Fmoc-Trp
6       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
(iv)合成Fmoc-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂，通过偶联Fmoc-Asp(Obut)/HBTU至Fmoc-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂。与步骤1一样进行反应。合成循环如下程序化：
步骤    试剂    时间    重复    活动
1       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
2       DEP     5分钟   X2      N末端脱保护
3       SOLV    30秒    X6      洗涤树脂
4       ACT     30秒    X1      溶解Fmoc-Asp(Obut)/HBTU
5       AA      45分钟  X1      偶联Fmoc-Asp(Obut)
6       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
(v)合成Fmoc-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂，通过偶联Fmoc-Gly/HBTU至Fmoc-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂。与步骤1一样进行反应。合成循环如下程序化：
步骤    试剂    时间    重复    活动
1       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
2       DEP     5分钟   X2      N末端脱保护
3       SOLV    30秒    X6      洗涤树脂
4       ACT     30秒    X1      溶解Fmoc-Gly/HBTU
5       AA      45分钟  X1      偶联Fmoc-Gly
6       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
(vi)合成Fmoc-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂，通过偶联Fmoc-Lys(Boc)/HBTU至Fmoc-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂。与步骤1一样进行反应。合成循环如下程序化：
步骤    试剂    时间    重复    活动
1       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
2       DEP     5分钟   X2      N末端脱保护
3       SOLV    30秒    X6      洗涤树脂
4       ACT     30秒    X1    溶解Fmoc-Lys(Boc)/HBTU
5       AA      45分钟  X1    偶联Fmoc-Lys(Boc)
6       SOLV    30秒    X3    洗涤树脂
(vii)合成Mpr(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂，通过偶联Mpr(Acm)/HBTU至Fmoc-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂。与步骤1一样进行反应。合成循环如下程序化：
步骤    试剂    时间    重复    活动
1       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
2       DEP     5分钟   X2      N末端脱保护
3       SOLV    30秒    X6      洗涤树脂
4       ACT     30秒    X1      溶解Mpr(Acm)/HBTU
5       AA      45分钟  X1      偶联Mpr(Acm)
6       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
实施例(2)化学合成直链肽
(Acm)Mpr-Lys(Boc)-Gly-Asp(OBut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂
                       式(2)
通用程序：
按照下述方式进行肽链的组装。将树脂转移至肽合成仪[PS3，Protein Technologies，Peptide Synthesizer]的RV，并在肽合成仪上，使用1.5-4.0倍摩尔过量的氨基酸衍生物，在树脂上组装直链肽。通过在树脂上使Fmoc-基脱保护，将第一氨基酸Fmoc-Cys(C)偶联到树脂上，接着活化Fmoc-Cys(C)。将Fmoc-Cys(C)(1.3mmol)和HOBt(2.6mmol)溶解在DMF(5.0ml)中，并在冰浴中冷却到低于10℃。将DIC(1.74mmol)以单一的等分部分加入到反应混合物中。然后在引入至反应容器内的潮湿(damp)树脂之前，搅拌该混合物6分钟。该偶联反应发生60分钟。
为了偶联下一个氨基酸，脯氨酸，使第一氨基酸，即Fmoc-Cys(C)的α-氮脱保护。随后在如上所述的冷却条件下，通过DIC/HOBt活化Fmoc-Pro，然后将这一混合物转移到反应容器中。用所有氨基酸重复这一方法，直到将全部直链肽链组装在固体载体上。在端处组装Mpr。每一次偶联在45-90分钟的时间范围内进行。重复Mpr的偶联。偶联步骤之后紧跟着用乙酸酐封端30-60分钟。在完成偶联之后，用有机溶剂洗涤树脂，所述有机溶剂可选自DMF、N-甲基吡咯烷酮或DCM，优选DMF，其次DCM，然后真空干燥。获得式(2)的直链肽。
通过固相肽合成技术，在rink酰胺树脂上，使用Fmoc化学，以肽酰胺形式合成该肽。
  仪器   PS3，蛋白质技术，肽合成仪
  树脂   Rink酰胺树脂(0.65mm/g)
  活化剂   DIC/HOBT
  溶剂   二甲基甲酰胺
  脱保护   20％哌啶
将树脂(1g-rink酰胺，0.65mmol)转移至PS3的RV，并在DMF内溶胀。
合成Fmoc Cys(Acm)-树脂，通过偶联已活化的Fmoc-Cys(Acm)到树脂上。用DMF洗涤预溶胀的树脂(0.65mmol)2次，接着通过用20％哌啶处理2次，除去Fmoc。用DMF洗涤树脂6次。将Fmoc Cys(Acm)(1.3mmol)和HOBt(2.6mmol)溶解在DMF(5.0ml)中，并在冰浴内冷却到低于10℃。将DIC(1.74mmol)作为单一等分部分(single aliquot)加入到反应混合物中。然后在引入至潮湿树脂之前，搅拌该混合物6分钟。在优化的搅拌下进行偶联60分钟。再次用DMF洗涤树脂三次。在偶联之后，通过乙酸酐(2.5M)封端游离氨基45分钟，接着用DMF洗涤3次。这一DIC/HOBt方法是手工且多步的方法。
合成循环如下程序化：
步骤    试剂    时间    重复    活动
1       SOLV    10分钟  X3      洗涤树脂
2       DEP     5分钟   X2      N末端脱保护
3       SOLV    30秒    X6      洗涤树脂
4       手工添加已活化的Fmoc氨基酸
5       AA      45分钟  X1      Fmoc-Cys(Acm)偶联
6       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
(ii)合成Fmoc-Pro-Cys(Acm)-树脂，通过偶联已活化的Fmoc-Pro至Fmoc-Cys(Acm)-树脂。与步骤1一样进行反应。合成循环如下程序化：
步骤    试剂    时间    重复    活动
1       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
2       DEP     5分钟   X2      N末端脱保护
3       SOLV    30秒    X6      洗涤树脂
4       手工添加已活化的Fmoc氨基酸
5       AA      45分钟  X1      偶联Fmoc-Pro
6       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
(iii)合成Fmoc-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂，通过偶联已活化的Fmoc-Trp至Fmoc-Pro-Cys(Acm)-树脂。与步骤1一样进行反应。合成循环如下程序化：
步骤    试剂    时间    重复    活动
1       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
2       DEP     5分钟   X2      N末端脱保护
3       SOLV    30秒    X6      洗涤树脂
4       手工添加已活化的Fmoc氨基酸
5       AA      45分钟  X1      偶联Fmoc-Trp
6       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
(iv)合成Fmoc-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂，通过偶联Fmoc-Asp至Fmoc-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂。与步骤1一样进行反应。合成循环如下程序化：
步骤    试剂    时间    重复    活动
1       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
2       DEP     5分钟   X2      N末端脱保护
3       SOLV    30秒    X6      洗涤树脂
4       手工添加已活化的Fmoc氨基酸
5       AA      45分钟  X1      偶联Fmoc-Asp(Obut)
6       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
(v)合成Fmoc-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂，通过偶联Fmoc-Gly至Fmoc-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂。与步骤1一样进行反应。合成循环如下程序化：
步骤    试剂    时间    重复    活动
1       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
2       DEP     5分钟   X2      N末端脱保护
3       SOLV    30秒    X6      洗涤树脂
4       手工添加已活化的Fmoc氨基酸
5       AA      45分钟  X1      偶联Fmoc-Gly
6       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
(vi)合成Fmoc-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂，通过偶联Fmoc-Lys(Boc)至Fmoc-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂。与步骤1一样进行反应。合成循环如下程序化：
步骤    试剂    时间    重复    活动
1       SOLV    30秒    X3    洗涤树脂
2       DEP     5分钟   X2    N末端脱保护
3       SOLV    30秒    X6    洗涤树脂
4       手工添加已活化的Fmoc氨基酸
5       AA      45分钟  X1    偶联Fmoc-Lys(Boc)
6       SOLV    30秒    X3    洗涤树脂
(vii)合成Mpr(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂，通过偶联Mpr(Acm)至Fmoc-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂。与步骤1一样进行反应。合成循环如下程序化：
步骤    试剂    时间    重复    活动
1       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
2       DEP     5分钟   X2      N末端脱保护
3       SOLV    30秒    X6      洗涤树脂
4       手工添加已活化的Fmoc氨基酸
5       AA      45分钟  X1      偶联Mpr(Acm)
6       SOLV    30秒    X3      洗涤树脂
在合成中，偶联Mpr(Acm)必需进行2次，以完成偶联反应。
实施例(3)从树脂中解离肽以产生肽酰胺(Acm)Mpr-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-CONH2(式(3))
在室温下，在CS936中，用500ml由TFA(95％)∶TIS(2.5％)∶H2O(2.5％)∶EDT(0％)∶苯酚(0％)组成的解离鸡尾酒(cocktail)处理组装的肽树脂(来自实施例1或2)2小时。通过RV过滤反应混合物，并在旋转蒸发装置(Rotavap)上蒸发TFA。在20℃下，通过添加300ml冷的二异丙基醚，在恒定的搅拌下进行肽的沉淀。在-20℃下，使在溶剂中的粗肽沉淀静置10小时。通过经Whatman纸no.5过滤，分离肽，接着用冷的溶剂洗涤(100ml×3)，以除去在解离鸡尾酒中所使用的清除剂。在P2O5上真空干燥粗肽沉淀，并通过RP-HPLC表征(图1和2)。
实施例1            实施例2
产率：58.73        产率：48.73
肽的纯度％：90％   肽的纯度％：79.68％
实施例(4)鸟苷酸化粗肽以产生(Acm)Mpr-Homoarg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-CONH2(式(4))
将肽(1g，1.157mmol)溶解在15ml DMF内，用TEA调节pH到9.0。添加在DMF(15ml)中的试剂3，5-二甲基吡唑-1-甲脒(carboxamidine)硝酸盐(931.5mg)到该肽中。在多次添加1倍过量的试剂3，5-二甲基吡唑-1-甲脒硝酸盐情况下，在30℃下搅拌反应混合物4天。
通过添加280ml乙腈(用TEA调节pH到8.0)，从反应混合物中沉淀肽。在-20℃下进一步保持混合10小时。经Whatman no.5滤纸过滤，并用乙腈(pH8.0)洗涤3次，接着用普通(plain)乙腈洗涤，以中和pH。在高真空下干燥沉淀过夜。产率：85％。通过RP-HPLC表征肽(图2)。
实施例(5)使鸟苷酸化肽脱ACM，接着氧化以产生
Figure A20048004310900301
                    式(1)
将TFA(134.9ml)和茴香醚(2.7ml)混合，在冰中冷却，添加至658mg来自实施例3的预冷却的肽中，并用氮气饱和。接着添加AgOTf(3.47g)，并在冰浴中搅拌2小时。在高真空下除去TFA，并通过添加二异丙醚(～400ml)沉淀肽的银盐。经G-4烧结漏斗过滤反应混合物，并将沉淀(银-肽)再悬浮在二异丙醚(60ml×3)中，如上所述洗涤，并在真空下经P2O5干燥。
通过在冰冷条件下，在15.6ml 50％DMSO/IM HCl内溶解10mg银-肽盐，进行银肽的氧化。在25℃下搅拌反应混合物3小时。经G-4烧结漏斗或Hyflo床过滤沉淀，除去氯化银。为氧化的完成检测滤液(图4)。一旦反应完成，获得式(1)的粗肽。纯度百分数：85％。
实施例(6)纯化S-S-肽
将式(1)的粗二硫化物环肽装载在制备型C-18柱子(50×250mm，100埃)上。通过使用含水TFA(0.1％)和甲醇，以梯度程序纯化肽(图5)。紧跟着使用以上所述的溶剂体系，在由控制器、2台LC8A泵、UV-Vis检测器组成的Shimadzu制备型HPLC体系上进行等度操作(isocratic run)。通过分析型RP-HPLC，分析式(1)的纯化的肽酰胺(图6)。通过质谱分光光度计测定质量(图7)。
实施例(7)：纯化S-S-肽
以与实施例5相同的方式进行纯化，除了使用乙腈而不是甲醇，以获得式(1)的肽酰胺之外。
实施例(8)：使用乙酸汞(II)，使鸟苷酸化肽脱ACM
与实施例(4)一样，除了通过用乙酸汞(II)处理，从鸟苷酸化肽中除去半胱氨酸中的Acm基团保护之外。
将肽(13.4mg，通过Lowry方法评估，Cys-Acm中的肽)溶解在400μl乙酸(10％)中。将10倍过量的乙酸汞(II)(82.96mg)加入其中，将反应物涡旋，并在室温下保持5小时。添加100倍过量的β-巯基乙醇(181.37μl)，将溶液涡旋，并使之在室温下静置过夜。将反应混合物离心4分钟，并收集上清液。通过离心，用400μl×3的10％乙酸提取沉淀。汇集滤液，通过RP-HPLC测定的纯度百分数为55％(图3)。
实施例(9)：使用碘使鸟苷酸化肽脱ACM
与实施例(4)一样，除了通过用碘处理，从鸟苷酸化肽中除去半胱氨酸中的Acm基团保护之外。
将肽(9.18mg，通过Lowry方法评估，Cys-Acm中的肽)溶解在17.8ml乙酸(80％)中，并用氮气吹扫15分钟。在1小时内，将1mM碘溶液(在80％乙酸中，～4ml)加入到肽溶液中，直到存在持久稳定的黄色。再搅拌混合物30分钟，接着用1N Na2S2O3中和，直到黄色消失，并冻干。通过Ellamn Test进行‘SH’的评估，其为负则表示没有实现ACM的除去。
实施例(10)：纯化脱ACM的肽
通过RP-HPLC，使用hyperprep(250×10mm，12μ，C-18柱)，使经乙酸汞(II)处理和经I2处理的肽样品脱盐。
实施例(11)：血小板聚集抑制分析以检测式(1)生物活性
使用4×Laser Aggregometer(EMA)，使用血小板聚集抑制分析，检测式(1)的肽的生物活性。抽取来自已同意的人类捐赠者的新鲜静脉血，并收集在柠檬酸盐缓冲液内。通过离心分离富血小板血浆(PRP)和贫血小板血浆。调节PRP内的血小板数为2-3×108个血小板/ml。在用PPP调节基线聚集之后，用10-20mMADP处理PRP，并检测总的聚集百分数。然后随参考标准和式(1)的合成肽的浓度变化，首先培育PRP。然后添加ADP，以检测聚集抑制。数次检测式1的合成肽的生物活性的再现性，并与参考标准物比较。表1代表许多实验(来自12个实验)之一。与商业参考标准相比，合成肽(SP)的IC50剂量小于140nM。在大多数样品中观察到采用SP存在大于50％ADP诱导的血小板聚集的抑制，且结果与商业参考标准相当。
表1：通过式(1)的合成肽(SP)抑制ADP诱导的聚集
  供体No.  通过ADP聚集的百分数   浓度(nM)   通过下述的抑制率％
  式1的SP   参考标准物
  1.  89.4％   70   ND   ND
  140   44.6   31.20
  280   61.40   52.50
  2.  92.13   70   46.66   30.31
  140   51.16   45.18
  280   67.74   60.92
  3.  54.14   70   57.42   27.41
  140   60.28   49.20
  280   ND   ND
  4.  68.11   70   ND   ND
  140   20.52   23.06
  280   42.73   40.53
  5.  66.50   70   52.63   45.68
  140   87.21   57.44
  280   ND   ND
  6.  66.17   70   ND   ND
  140   82.92   70.56
  280   ND   ND

Claims (30)

1.一种用于在固相上制备式(1)的肽N6-(氨基亚氨基甲基)-N2-(3-巯基-1-氧代丙基-L-赖氨酰甘氨酰基-L-α-天冬氨酰基-L-色氨酰基-L-脯氨酰基-L-半胱酰胺，环状(1→6)-二硫化物的方法，
                    式(1)
所述方法包含：
a.通过偶联，借助肽键彼此直接相连，在固体载体树脂上以所要求的顺序组装包含六个氨基酸和一个巯基烷基硫代烷基羧酸的肽链，以获得如以下给出的式(2)的肽键合的树脂；
(Acm)Mpr-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂
                       式(2)
b.在每次偶联之后用乙酸酐使游离氨基封端；
c.从树脂上解离并脱保护步骤(a)的肽的除acm基团以外的所有基团，以获得如以下给出的式(3)的肽酰胺：
(AAcm)Mpr-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(BAcm)-CONH2
                   式(3)
d.在有机溶剂中在ε-赖氨酸-NH2处鸟苷酸化肽，接着用另一溶剂沉淀，通过用另一溶剂沉淀，以获得如以下给出的式(4)的肽：
(AAcm)CysMpr-Homoarg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(BAcm)-CONH2
                      式(4)
e.在合适的溶剂中用重金属盐处理式(4)的肽，接着使用有机溶剂沉淀重金属-肽盐，以获得式(5)的重金属-肽盐；
                   式(5)
f.用硫醇处理步骤(e)的重金属-肽盐，接着脱盐和氧化，以获得式(1)的肽；和
g.通过RPHPLC单独或与HIC和IEC色谱技术结合，纯化步骤(f)或(g)的粗肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中化合物的氨基和羧基当量的反应形成所述肽键。
3.根据权利要求1所述的方法，其中被保护的第一氨基酸的C端通过连接体键合到固相上，以获得固相键合的氨基酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所使用的固体载体是任何酰胺树脂，优选Rink酰胺树脂。
5.根据权利要求1所述的方法，其中第一被保护的氨基酸是硫羟基保护的Fmoc半胱氨酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在用连接体解离树脂中导致释放已组装的肽酰胺。
7.根据权利要求1所述的方法，其中肽酰胺化合物是通过肽键连接到每一端基官能度上的化合物，且其中每一端基官能度是氨基或羧酸基或其衍生物。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所使用的氨基酸选自由Cys、Pro、Trp、Asp、Lys、Gly、Arg、Har、Leu和Glu组成的组中。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所使用的巯基烷基硫代烷基羧酸是2-巯基丙酸硫代丙酸。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，氨基酸的-NH2官能团的保护基是Fmoc或Boc。
11.根据权利要求1所述的方法，其中-COOH官能团的保护基是未保护的或者被保护的O-tBu酯或者游离的。
12.根据权利要求1所述的方法，其中SH-官能的保护基是Acm基。
13.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中，以确定的比例使用试剂：TFA、TIS、EDT、DCM、苯酚和水，优选TFA(85-98％)∶TIS(0-5％)∶H2O(0-5％)∶EDT(0-5％)∶苯酚(0-5％)，更优选TFA(94.5-95.5％)∶TIS(0-2.5％)∶H2O(0-3％)∶EDT(0-2.5％)，从固体载体树脂上解离该肽。
14.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(d)中，用于鸟苷酸化的有机溶剂选自由DMF、乙醇和甲醇组成的组中。
15.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(d)中，通过实施使用选自由丙酮、乙腈、甲醇、醚、戊烷、己烷及其混合物组成的组中的溶剂，进行式(4)的肽的沉淀。
16.根据权利要求15所述的方法，其中优选实施使用乙腈进行沉淀。
17.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(g)中，所得式(1)的肽的纯度大于99％。
18.根据权利要求1所述的方法，其中使用Fmoc化学，进行通过固相合成制备式(1)的肽。
19.根据权利要求1所述的方法，其中氨基酸的组装得到式2的肽键合的树脂：
(Acm)Mpr-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-树脂
                       式(2)。
20.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(d)中，优选通过使用在DMF中的溶剂，进行实施式3的肽的鸟苷酸化。
21.根据权利要求1所述的方法，其中通过RP-HPLC，可进行式(4)的肽的纯化。
22.根据权利要求1所述的方法，其中用于处理式(4)的肽的重金属盐是在TFA中的三氟甲烷磺酸银。
23.根据权利要求1所述的方法，其中优选使用醚溶剂，和更优选二异丙醚，进行式(5)的重金属-肽盐的沉淀
                   式(5)。
24.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(f)中，可用HCl和DMSO处理重金属-肽盐，以同时除去重金属并氧化所得肽，得到式(1)的粗肽酰胺。
25.根据权利要求1所述的方法，其中可通过RP-HPLC纯化式(1)的粗肽酰胺。
26.根据权利要求1所述的方法，其中优选通过RP-HPLC，使用C-4、C-8或C-18二氧化硅或聚合物反相柱，使用甲醇和/或乙腈单独或与含水TFA(0-0.5％)结合作为流动相，进行式(1)的粗肽酰胺的纯化。
27.式(2)的中间体肽：
(Acm)Mpr-Lys(Boc)-Gly-Asp(Obut)-Trp-Pro-Cys(“Acm)-树脂
                       式(2)。
28.式(3)的中间体肽：
(Acm)Mpr-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-CONH2
                    式(3)。
29.式(4)的中间体肽：
(Acm)Mpr-Homoarg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-CONH2
                      式(4)。
30.式(5)的中间体肽盐：
                    式(5)。
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