CN1047078A

CN1047078A - 用作兴奋性基酸神经递质拮抗物和/或钙通道阻滞剂的聚胺和多肽

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Publication number: CN1047078A
Application number: CN90103929A
Authority: CN
Inventors: 尼古拉斯·阿历克斯·萨科曼诺; 罗伯特·艾尔弗雷德·沃尔克曼
Original assignee: Natural Products Science Ltd; Pfizer Inc
Current assignee: Natural Products Science Ltd; Pfizer Inc
Priority date: 1989-04-28
Filing date: 1990-04-27
Publication date: 1990-11-21
Anticipated expiration: 2005-04-27
Also published as: JP2691141B2; JP2746360B2; CS215790A3; JP2746359B2; ZA903229B; JP2744904B2; PT93876B; DD293959A5; EP0395357B1; IL94147A0; DK0395357T3; HU223593B1; KR930000163B1; DE69024253T2; JPH09118694A; KR920007554B1; YU84590A; ES2081929T3; CA2015505C; FI902139A0

Abstract

本发明涉及某种被发现存在于Agelenopsis aperta蜘蛛毒液中的聚胺和多肽。本发明的聚胺及其盐类对影响多种生物体细胞的兴奋性氨基酸神经递质有拮抗作用，并且除用于拮抗所述神经递质本身外，还用于治疗兴奋性氨基酸神经递质介导病和病理状态以及防治无脊椎动物病害。本发明的多肽和一种所述聚胺及其盐类对多种生物体细胞中钙通道有阻滞作用，并且除用于阻滞所述细胞钙通道本身外，还用于治疗钙通道介导病和病理状态以及防治无脊椎动物病害。本发明还涉及含有所述聚胺、多肽及其盐类的组合物。

Description

本发明涉及某种被发现存在于Agelenopsis aperta蜘蛛毒液中的聚胺和多肽。聚胺及其可药用的盐类拮抗影响包括无脊椎动物和脊椎动物在内的多种生物体的神经细胞的兴奋性氨基酸神经递质。多肽和一种所述聚胺及其可药用盐类阻滞包括无脊椎动物和脊椎动物在内的多种生物体的神经细胞和肌肉细胞中的钙通道。本发明也涉及这些聚胺及其盐类的用途，即除用于拮抗影响例如生物体神经***细胞的兴奋性氨基酸神经递质本身外，还用于治疗哺乳动物中兴奋性氨基酸神经递质的介导病及病理状态以及防治无脊椎动物病害，还涉及含有所述聚胺及其盐类的组合物。另外，本发明涉及所述多肽和一种所述聚胺及其盐类的用途，即除用于阻滞例如生物体的神经和肌肉***细胞中钙通道本身外，还用于治疗哺乳动物中钙通道介导病和病理状态，以及防治无脊椎动物病害，还涉及含有所述多肽、聚胺及其盐类的组合物。

据报道，Agelenopsis aperta蜘蛛毒液中含有至少影响钙流的两种毒素，Jackson，H.，et al.，Soc.Neu.Sci.Abstr.12∶1078（1987）。其作者公开了一种在其中称为AG2的毒素，该毒素分子量低于1000道尔顿，并对大范围细胞组织中的钙流呈现出抑制作用。另外，Jackson，H.，et al.，Soc.Neu.Sci.Abstr.12∶730（1986）中报道了另一种取自Aglenopsis aperta的毒素，它含有一种分子量约为6000的组分。据报道该毒素引起传递过程的突触前阻滞，文章提出该毒素对钙通道的阻滞与神经递质的释放有关。

属兴奋性氨基酸神经递质拮抗物的化合物有多种用途。其中已发现兴奋性氨基酸神经递质拮抗物可临床应用于治疗如癫癎发作、中风、脑局部缺血及神经退化病如阿尔茨海默氏病和癫癎的病理状态以及作为一种精神治疗剂，见《在健康和疾病中的兴奋性氨基酸》（Excitatory Amino Acids in Health and Disease，D.Lodge，Ed.，John Wiley and Sons Ltd.，New York，NY 1988），其中的知识在此结合作为参考。此外，这类化合物也用于研究细胞生理学（如神经细胞）以及防治无脊椎动物病害。

钙拮抗物类化合物具有多种用途。其中已发现钙拮抗物用于临床治疗如心绞痛、高血压、心肌病、室上心律不齐、驼背aesophogeal失驰缓性、早产及雷诺病的病理状态。见《钙拮抗物》（W.G.Nayler，Calcium Antagonists，Academic Press，Harcourt Brace Javanovich Publishers，NewYork，NY 1988），其中的知识在此结合作为参考。此外，这类化合物也用于细胞生理学如神经细胞研究以及防治无脊椎动物病害。

本发明涉及的聚胺及多肽被发现存在于Agelenopsis aperta蜘蛛毒液中。本发明的聚胺以及按照本发明含有该聚胺的馏分如下：

馏分A′（AGEL 452）：

馏分A₁（AGEL 468）：

馏分A₂（AGEL 448）：

馏分B₁（AGEL 505）：

馏分B₂（AGGL 504）：

高分辨FAB质谱法（FAB MS：）测得C₂₇H₄₈N₆O₃分子量计算值为505.3861。

馏分E（AGEL 489）：

本发明的多肽以及按照本发明含有该多肽的馏分如下：

馏分G：

一种氨基末端氨基酸序列含有：

H₂N-谷-赖-甘-亮-脯-谷-甘-丙-谷-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-丝-天冬-半胱-赖-半胱-丙-甘-谷氨酰胺-色-异亮-赖-半胱-精-半胱-脯-色-赖-色-组-异亮-苏-甘-谷-甘-脯-半胱-苏-半胱-谷-精-甘-亮-赖-赖-苏-半胱-异亮-丝-赖-亮-丝-天冬-脯-天冬酰胺-精-天冬酰胺-谷-色-亮-丝-;按照FAB质谱法（FAB MS：）确定的整个多肽分子量为：7267。

馏分H₂：

一种氨基末端氨基酸序列含有：

H₂N-丙-赖-丙-亮-脯-脯-甘-丝-缬-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-丝-天冬-半胱-赖-半胱-酪-甘-赖-色-组-赖-半胱-精-半胱-脯-色-赖-色-组-苯丙-苏-甘-谷-甘-脯-半胱-苏-半胱-谷-赖-甘-甲硫-甘-组-苏-半胱-异亮-苏-赖-亮-组-半胱-脯-天冬酰胺-赖-丙-谷-色-甘-亮-天冬-色-：按照离子雾化质谱法（Ion-Spray MS：）确定的整个多肽分子量为：7793。

馏分I：

H₂N-天冬-半胱-缬-甘-谷-丝-谷氨酰胺-谷氨酰胺-半胱-丙-天冬-色-丙-甘-脯-组-半胱-半胱-天冬-甘-酪-酪-半胱-苏-半胱-精-酪-苯丙-脯-赖-半胱-异亮-半胱-缬-天冬酰胺-天冬酰胺-天冬酰胺-CONH₂;FAB MS：4158。

馏分J：

H₂N-天冬-谷-脯-半胱-异亮-脯-亮-甘-赖-丝-半胱-丝-色-赖-异亮-甘-苏-脯-酪-半胱-半胱-脯-组-脯-天冬-天冬-丙-甘-精-精-苏-色-半胱-异亮-缬-天冬-酪-丝-精-苯丙-缬-苏-异亮-半胱-丝-甘-精-赖-酪-CONH₂;依照FAB MS：确定的整个多肽的分子量为：5506。

馏分L₁：

一种氨基末端氨基酸序列含有：

H₂N-异亮-缬-甘-甘-赖-苏-丙-赖-苯丙-甘-天冬-酪-脯-色-甲硫-缬-丝-异亮-谷氨酰胺-谷氨酰胺-赖-天冬酰胺-赖-赖-甘-甘-苯丙-天冬-;整个多肽的分子量近似值约为20，000。

馏分L₂：

一种按实施例9所述而获得的多肽。

馏分M：

一种氨基末端氨基酸序列含有：

H₂N-谷-丙-苏-谷-丙-丙-赖-缬-亮-丝-天冬酰胺-亮-天冬-谷-苏-缬-天冬-脯-;整个多肽分子量近似值约为80，000。

本发明的聚胺及其可药用盐类拮抗影响细胞的兴奋性氨基酸神经递质。因此，所述聚胺自身用于拮抗所述神经递质。本发明的聚胺也可用于防治由兴奋性氨基酸神经递质介导的无脊椎动物病害及治疗哺乳动物中由兴奋性氨基酸神经递质介导的疾病和病理状态。所述聚胺也可用作哺乳动物的精神治疗剂。

上述聚胺B₁与本发明的多肽阻滞细胞中钙通道。因此，所述聚胺B₁和多肽自身用于阻滞细胞中钙通道。所述聚胺B₁和多肽也用于防治无脊椎动物的细胞中钙通道功能介导病害及治疗哺乳动物的细胞中钙通道功能介导疾病及病理状态。

具有与上述多肽基本相同的氨基酸序列和基本相同的钙通道阻滞效能的多肽也在本发明范围之内。

本发明还涉及含有所述聚胺和多肽的医药组合物以及所述聚胺和多肽的使用方法。

按照本技术领域普通技术人员所熟知的标准方法通过电刺激的挤榨工序从Agelenopsis aperta蜘蛛中获取毒液。优选使用的方法是其能防止由腹回流或血淋巴造成完整毒液的污染，这种方法对本领域普通技术人员是熟知的。如此获得的完整毒物在用于如下所述的纯化之前，在约-78℃下以冻结态储存。

完整毒液组分的纯化是采用反相高效液相色谱法（HPLC）在各种制备和半制备柱上完成的，如C-4和C-18 Vydac （Rainin Instrument Co.Inc.，Mack Road，Woburn Massachusetts 01801）。用单色波在220-230nm范围内进行峰值检测。馏分的进一步分析例如可用沃特斯（Waters）990二极管阵列检测器（Miuipore Corporation，Waters Chromatography Division，34Maple Street，Milford，Massachusetts 01757）采集的多色UV数据来完成。柱上的馏分用已知方法收集，例如通过用ISCO/“FOXY”馏分收集器和ISCO 2159峰测仪（ISCO，4700Superior，Lincoln.，Nebraska 68504）。将馏分收集在适当尺寸的容器中，例如消毒的聚乙烯实验室器皿。然后该馏分冷冻干燥以去除洗脱液及随后冷冻干燥去除水完成其浓缩。然后，所得组分馏分的纯化物可通过使用具有梯度体系的分析柱的色谱分析来确定，这种梯度体系较用于馏分最终纯化的体系更为isocratic。

各种馏分所具有的结构依照已知的分析法确定，如质谱测定法和核磁共振法。本发明的多肽是依照已知方法定序的。例如：所研究的多肽中胱氨酸残基的S-吡啶基乙基化作用可在溶液中进行，随后进行多肽的氨基酸定序。这-S-吡啶基乙基化作用步骤如下。将约1-10微克的多肽溶解或稀释到多达50微升的缓冲剂中，该缓冲剂是由一份PH值为8.5含有4mM乙二胺四乙酸（EDTA）的1M的盐酸三羟甲基氨基甲烷（TrisHCl）和三份8M的盐酸胍混合配制而成。然后，加入2.5微升10%的2-巯基乙醇水溶液，将该混合物于室温在氩气氛下于暗处培养2小时。培养之后，加入2微升4-乙烯基吡啶（储存于-20℃氩气氛下的新鲜试剂），将混合物于室温在氩气氛下于暗处再培养2小时。然后将混合物脱盐，优选采用在一短的反相柱上进行色谱分离。然后按照已知的方法对回收的烷基化多肽定序。

在实施本发明及采用如上概述的基本步骤时发现，用于毒液原始分离的合适的分离柱为22毫米×250毫米的C-18Vydac

柱，其孔隙尺寸为300

，颗粒尺寸为10μ，洗离该柱体所用流速为15毫升/分，采用线性梯度程序为：95%→80%A，5%→20%B〔0→30分钟〕，然后80%→30%A，20%→70%B〔30→55分钟〕，其中A为0.1%的三氟乙酸（TFA）水溶液，B为乙腈。馏分是按照上面描述的方法收集的。如此获得的、标以A、B、E、G、H、I、J、K、L和M的馏分被选择用于进一步的分析和/或纯化。另外发现，完整毒液分离时产生一种特别是在此标以A′的馏分，分离时用C-18Vydac

柱（22毫米×250毫米，孔隙尺寸为300

，颗粒尺寸为10μ），所用流速为15毫升/分，采用线性梯度程序为：5%→10%B，95%→90%A〔0→30分钟〕，其中A和B如上所述。不同馏分的洗脱时间将在以下的实施例1和实施例2中给出。

对馏分A、B、G、H、I/J和L还将用不同的分离柱和梯度程序做进一步的纯化。每一特定的细分级及其结果将在以下的实施例3、4、6、7、8和10中给出。

如以下实施例所示，馏分A′、A₁、A₂、B₁、B₂和E含有聚胺化合物。这些化合物以及含有这些化合物的馏分如下所示。

馏分A′（AGEL 452）：

馏分A₁（AGEL 468）：

馏分A₂（AGEL 448）：

馏分B₁（AGEL 505）：

馏分B₂（AGEL 504）：

高分辨FAB MS：测得C₂₇H₄₈N₆O₃分子量计算值为505.3861。

馏分E（AGEL 489）：

如以下实施例所示，馏分G、H₂、I、J、L₁、L₂和M含有多肽。这些多肽及含有该多肽的馏分如下：

馏分G：

一种氨基末端氨基酸序列含有：

H₂N-谷-赖-甘-亮-脯-谷-甘-丙-谷-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-丝-天冬-半胱-赖-半胱-丙-甘-谷氨酰胺-色-异亮-赖-半胱-精-半胱-脯-色-赖-色-组-异亮-苏-甘-谷-甘-脯-半胱-苏-半胱-谷-精-甘-亮-赖-赖-苏-半胱-异亮-丝-赖-异亮-丝-天冬-脯-天冬酰胺-精-天冬酰胺-谷-色-亮-丝-;按照FAB质谱法所得整个多肽分子量为：7267。

馏分H₂：

一种氨基末端氨基酸序列含有：

H₂N-丙-赖-丙-亮-脯-脯-甘-丝-缬-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-丝-天冬-半胱-赖-半胱-酪-甘-赖-色-组-赖-半胱-精-半胱-脯-色-赖-色-组-苯丙-苏-甘-谷-甘-脯-半胱-苏-半胱-谷-赖-甘-甲硫-赖-组-苏-半胱-异亮-苏-赖-亮-组-半胱-脯-天冬酰胺-赖-丙-谷-色-甘-亮-天冬-色-;按照离子雾化质谱法测得整个多肽分子量为：7793。

馏分I：

H₂N-天冬-半胱-缬-甘-谷-丝-谷氨酰胺-谷氨酰胺-半胱-丙-天冬-色-丙-甘-脯-组-半胱-半胱-天冬-甘-酪-酪-半胱-苏-半胱-精-酪-苯丙-脯-赖-半胱-异亮-半胱-缬-天冬酰胺-天冬酰胺-天冬酰胺-CONH₂;FAB MS：4159。

馏分J：

H₂N-天冬-谷-脯-半胱-异亮-脯-亮-甘-赖-丝-半胱-丝-色-赖-异亮-甘-苏-脯-色-半胱-半胱-脯-组-脯-天冬-天冬-丙-甘-精-精-苏-色-半胱-异亮-缬-天冬-酪-丝-精-苯丙-缬-苏-异亮-半胱-丝-甘-精-赖-酪-CONH₂;FAB MS：5506。

馏分L₁：

一种氨基末端氨基酸序列含有：

H₂N-异亮-缬-甘-甘-赖-苏-丙-赖-苯丙-甘-天冬-酪-脯-色-甲硫-缬-丝-异亮-谷氨酰胺-谷氨酰胺-赖-天冬酰胺-赖-赖-甘-甘-苯丙-天冬-;整个多肽的分子量近似值为：20，000。

馏分L₂：

一种如按实施例9所述获得的多肽。

馏分M：

一种氨基末端氨基酸序列含有：

H₂N-谷-丙-苏-谷-丙-丙-赖-缬-亮-丝-天冬酰胺-亮-天冬-谷-苏-缬-天冬-脯-;整个多肽的分子量近似值为：80，000。

在此将有关取自Agelenopsis aperta毒液的馏分中的化合物的作用予以公开，该化合物目前也可通过除分离/纯化外其他的方法由完整毒液中获取。所有这些方法都在本发明范围之内。例如，馏分A′、A₁、A₂、B₁、B₂和E中含有的聚胺可直接用合成制得。馏分G、H₂、I、J、L₁、L₂和M中含有多肽及其所述的整个氨基酸序列可按照熟知的方法通过体外蛋白质合成法来合成制得。例如，这类多肽可用一种ABI 430A固相肽合成器（Applied Biosystems，Inc.，850Lincoln Center Drive Foster City，California 94404）采用本领域普通技术人员所熟知的标准Merrifield化学或其他固相化学加以合成。该多肽也可通过该多肽或其部分的编码序列的无性繁殖的DNA重组体技术制得。对于哪些仅知其部分氨基酸序列的多肽也可进行无性繁殖，例如，使用能利用已知的氨基酸序列信息的混和探测器的方法。DNA重组体技术与体外蛋白质合成法的结合也可用来制造本发明的多肽。

本技术领域普通技术人员已熟知，某些氨基酸取代物可用多肽制造而不影响或基本不影响所述多肽的功能。这种确定的取代物在一种多肽到另一种多肽中是可以变化的。对可容许的取代物的确定可依照本领域普通技术人员熟知的方法进行。因此，具有基本相同的氨基酸序列和具有基本相同的钙通道阻滞效能的所有多肽均在本发明的范围之内。

制造本发明中其通式为

（其中R为H或OH）的某些聚胺的合成流程如以下反应流程A到D所示。

反应流程B

反应流程C

反应流程D

反应流程E

反应流程G

反应流程G（续）

反应流程H

按照反应流程A，式X的聚胺中间化合物是通过由二氨基丁烷起始的一系列反应步骤制备而成。制备按照反应流程A式X的中间化合物适宜的反应条件在实施例11的A到Ⅰ部分中给出。反应流程B说明了一种制备式ⅩⅢ的中间化合物的方法。制备按照反应流程B的中间化合物适宜的反应条件在实施例11的J到L部分中给出。式ⅩⅪ的中间化合物的制备方法示于反应流程C。制备按照反应流程C式ⅩⅪ的化合物适宜的反应条件在实施例12的A到F部分中给出。制备本发明的式ⅩⅥ和ⅩⅩⅤ的聚胺化合物的方法示于反应流程D。偶合式Ⅹ和ⅩⅢ或Ⅹ和ⅩⅪ的两个中间化合物以及随后制备式ⅩⅥ和ⅩⅩⅤ化合物适宜的反应条件在实施例11的M到O部分以及实施例12的G到I部分中给出。

反应流程E和F分别表明了中间化合物ⅩⅩⅧ和ⅩⅩⅪ的制备方法。制备按照反应流程E的中间化合物适宜的反应条件在实施例13的A到C部分中给出。制备按照反应流程F的中间化合物适宜的反应条件在实施例14的A到C部分中给出。制备本发明的式ⅩⅩⅩⅥ和ⅩⅩⅩⅦ聚胺化合物的方法示于反应流程G。偶合式Ⅹ和ⅩⅩⅧ或Ⅹ和ⅩⅩⅪ两种中间化合物以及随后制备式ⅩⅩⅩⅥ和ⅩⅩⅩⅦ化合物适宜的反应条件分别在实施例13的D到F部分以及实施例14的D到F部分中给出。

反应流程H表明了本发明的式ⅩLⅠ聚胺化合物的制备方法。制备式ⅩⅩⅩⅧ中间化合物、将其偶合到式ⅩⅩⅡ中间化合物以及随后制备本发明的式ⅩLⅠ的聚胺化合物适宜的反应条件示于例15中。

本发明的聚胺对影响细胞的兴奋性氨基酸神经递质有可逆的拮抗作用。所述细胞诸如包括无脊椎动物和脊椎动物的多种生物体的神经***细胞。用于全文的脊椎动物概念包括哺乳动物。用于全文的无脊椎动物概念含意包括如：昆虫、外寄生物和内寄生物等。如上所述，馏分B₁的聚胺也对存在于多种细胞中的钙通道有可逆的阻滞作用。所述细胞诸如无脊椎动物和脊椎动物***中包括心血管在内的神经和肌肉***中的细胞。

本发明的聚胺拮抗兴奋性氨基酸神经递质的能力是依照以下步骤通过其阻滞幼鼠小脑中N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）诱导的环鸟苷酸（cGMP）值升高的能力表现出来的。将十只8-14天的Wistar鼠的小脑快速切下并于4℃下放置在PH值为7.4的克雷伯氏/碳酸氢盐缓冲剂中，然后用McⅡwain组织切碎机（The Nickle Laboratory Engineering Co.，Gomshall，Surrey，England）将其切成0.5毫米×0.5毫米的切片。将所得的小脑切片转放于37℃的100毫升的与95∶5的O₂/CO₂相持续平衡的克雷伯氏/碳酸氢盐缓冲剂中。小脑切片以90分钟、三次更换缓冲剂的方式培养。然后去除缓冲剂。将该组织离心分离（1分钟，3200r.p.m）并将其再悬浮于20毫升克雷伯氏/碳酸氢盐缓冲剂中。而后，取出250微升等分试样（约2毫克）并放入1.5毫升的微驱逐管（microfuge）中。向这些试管中加入10微升待研究的化合物配制液，接着再加入10微升的2.5mM的NMDA溶液使反应开始。最终的NMDA浓度为100μM。控制不使NMDA增加。这些试管在37℃的摇动水浴中培养1分钟，然后加入750微升的50mM氯化三羟甲基氨基甲烷（Tris-Cl），5mM EDTA溶液以终止反应。将试管立即置于沸腾水浴中五分钟。然后，将每一试管中的组分用置于第三能级的探测声波***声波定位15秒钟。取出10微升该组分，用Lowry，Anal.Biochem.100∶201-220（1979）中报道的方法确定蛋白质。随后将这些试管做离心分离（5分钟，10，000xg），去除100微升的上层清液，然后采用New England Nuclear（Boston，Massachusetts）按照厂商提供的环鸟苷酸放射免疫分析法（cGMP RIA assay）测定环鸟苷酸值。数据以每毫克蛋白质产生微微摩尔的环鸟苷酸表示。

本发明的多肽不可逆地阻滞存在于多种细胞中的钙通道。所述细胞诸如无脊椎动物和脊椎动物的神经和肌肉***中的细胞。

馏分B₁的聚胺以及馏分G、H₁、H₂、I、J、K、L₁、L₂和M中的多肽对钙通道的阻滞能力可通过以下步骤显示出来。将解离的幼鼠新皮层神经元悬浮于PH值为7.4含有2mM CaCl₂和1%牛血清白蛋白（BSA）的克雷伯氏碳酸氢盐缓冲剂中。将神经元离心分离沉淀并再悬浮于附加含有1μM fura2/AM（Sigma Chem.Co.，P.O.BOX 14508，St.Louis，Missouri 63178）的与前相同的缓冲剂中。将这些细胞于37℃培养15分钟，洗涤，而后在不含fura2/AM的相同缓冲剂中再培养15分钟。再将这些细胞于含有1.5mM CaCl₂的上述缓冲剂中洗涤并作为浓缩细胞悬浮液在室温下平衡5-10分钟。向一小石英杯中加入1.2毫升预热的（37℃），含有1.5mM CaCl₂和10mM葡萄糖而不含BSA的缓冲剂，然后加入0.3毫升上述制备的浓缩细胞悬浮液。小杯放置在一具有磁搅拌器的热态夹持器内（37℃），并用一荧光分光光度计（如Perkin Elmer 650-40型，Perkin Elmer，Wilton，Connecticut 06897）测量其荧光。荧光信号允许稳定约1分钟。然后将1-4微升以适当浓度存在于克雷伯氏碳酸氢盐缓冲剂中的待研究的化合物的储液加到小杯中。荧光信号的校准和fura-2漏失量的校正用确定的Nemeth，et al.，J.Biol.Chem.262∶5188（1987）中报道的方法进行。在每个试验完成时，通过加入依诺霉素（ionomycin）确定最大荧光值（Fmax），并且通过接着向螯合钙中添加5毫摩尔乙二醇双乙胺醚-N，N′-四乙酸（EGTA）以确定最小荧光值（Fmin）。使用上述步骤，由加入标题化合物时荧光值的减小，显示出使用标题化合物所发生的钙通道阻滞。

具有与馏分G、H₁、I、J、L₁、L₂和M基本相同的氨基酸序列的多肽也在本发明的范围之中，它们具有和上述多肽基本相同的钙通道阻滞作用。

本发明的聚胺对拮抗兴奋性氨基酸神经递质本身是有效的。因此，该聚胺也用于控制无脊椎动物病害，以及用于治疗哺乳动物中以兴奋性氨基酸神经递质介导的疾病和病理状态。例如癫癎发作，中风，大脑局部缺血，神经退化性紊乱如阿尔茨海默氏病和癫癎。上述聚胺也用作哺乳动物的精神治疗剂。此外，该聚胺在研究包括但不限于神经***细胞的细胞生理学中是有用的。

本发明馏分B₁的聚胺和多肽本身在细胞中有效的作为钙通道阻滞剂。因此，这些化合物也用于控制无脊椎动物病害，以及治疗由哺乳动物细胞中钙通道功能所介导的疾病和病理状态，例如心绞痛、高血压病、心肌病、上心室上，律不齐、驼背失驰缓病（aesophogealachalasia）、早产和雷诺病。此外，这些化合物在研究包括但不限于神经和肌肉***细胞的细胞生理学中是有用的。

本发明的聚胺和多肽的可药用盐类也在本发明的范围之中。这些盐采用该专业普通技术人员所熟知的方法制成。例如，聚胺的酸式添加盐和多肽的碱式盐可按照一般的方法制备。

在将本发明的聚胺或多肽施用于哺乳动物时，它可以单独使用，或与可药用载体或稀释剂结合，以按照标准药品惯例的药品组合物形式使用。该聚胺和多肽可以口服或不经肠道施用，对于多肽优选非经肠道的用药方法。非经肠道的用药包括静脉、肌肉内、腹膜内、皮下和局部用药。

对于本发明聚胺或多肽的口服用药，化合物可以如片剂或胶囊形式服用，或作为水溶液或悬浮液服用。在口服片剂的情况下，通常添加载体，一般使用的载体包括乳糖和粮食淀粉，并添加润滑剂如硬酯酸镁。对于口服胶囊形式，有效的稀释物是乳糖和干燥的粮食淀粉。当需要以含水悬浮液用于口服时，将有效成分与乳化剂和悬浮剂相结合。如果需要，可以加入某些甜化剂和/或加味剂。

对于肌肉内、腹膜内、皮下和静脉用药，通常制备有效成分的无菌溶液，并且溶液的PH值应适于调整和缓冲。对于静脉用药，应控制溶剂的总浓度以提供配制品的等渗性。

当本发明的聚胺或多肽或它们的盐用于人体治疗时，日剂量一般由开药方的医生确定。此外，剂量按照各个病人的年令、体重和反应，以及病人症状的严重性和所施用的具体化合物的效力而不同。

当本发明的聚胺或多肽或它们的盐用于控制无脊椎动物病害时，上述化合物被直接施用于所述的无脊椎动物或提供到所述无脊椎动物的环境中。例如，本发明的一种化合物可作为溶液喷洒到上述无脊椎动物身上，为控制上述无脊椎动物病害所需化合物的量根据该无脊椎动物及环境条件而变化，并且由施用该化合物的人确定。

当本发明的聚胺或多肽或它们的盐被用于细胞生理学研究时，上述化合物按照该专业普通技术人员所公知的方法供入细胞。例如，上述化合物可以以适当的生理缓冲溶液的形式供入这些细胞，用于此项研究的本发明化合物的适当浓度为100μM。然而在这项研究中所述化合物的浓度可以大于或远小于100μM。所供入的该化合物的量按照公知的方法由该专业普通技术人员确定。

实施例1

Agelenopsis aperta完整毒液的初步分离

将由Natural Product Sciences Inc.，Salt LakeCity，Utah 84108获得的，并以冷冻状态于大约-78℃贮存的Agelenopsis aperta完整毒液融解，并将10-60微升的该毒液稀释到200微升，再置于C-18多孔层实心球（22毫米×250毫米，300埃孔径大小，10微米颗粒尺寸）柱上，并使用15毫升/分的流速和用下列线性梯度程序的溶剂体系洗脱：5%→20%B，95%→80%A〔0→30分钟〕然后20%→70%B，80%→30%A〔30→55分钟〕，此处A是0.1%的含水三氟乙酸（TFA），B是乙腈。于220-230毫微米单色波进行峰值检测，并用ISCO/“FOXY”馏分收集器和ISCO 2159峰值检测器收集各馏分。馏分收集20分钟至60分钟，在峰值检测的基础上，收集到以下馏分：

馏分洗脱时间

A 约21分钟

B 约22.75分钟

E 约27.5分钟

G 约38分钟

H 约39分钟

I 约40分钟

J 约40分钟

L 约43分钟

M 约48.3分钟

实施例2

分离Agelenopsis aperta的完整毒液以获得馏分A′

按照实施例1所述获得Agelenopsis aperta的完整毒液并将其置于C-18多孔层实心球柱上。使用15毫升/分的流速和用下列线性梯度程序的溶剂体系洗脱该柱：5%→10%B，95%→90%A〔0→30分钟〕，此处A是0.1%的含水三氟乙酸（TFA），B是乙腈。按实施例1所述进行峰值检测和馏分收集。以大约12.5分钟洗脱获得馏分A′，然后为进行光谱分析，按照标准方法通过冷冻干燥去洗脱液和随后的冷冻干燥去水制备馏分A′。

由馏分A′包括的化合物结构随后通过使用FAB MS确定。如此获得的数据和由此推断的结构结下：

A′：FAB MS：M/Z 453（M+1）

结构：苯甲酰胺，N-（20-氨基-4-羟基-4，8，12，17-四氮杂二十烷（tetraazeicos）-1-基）-4-羟基

实施例3

馏分A的细分离和其中结构的确定

将按照如实施例1描述所获得的馏分A置于C-4多孔层实心球（10毫米×250毫米，300埃孔径大小，5微米颗粒尺寸）柱上，并使用4.0毫升/分的流速以及采用下列线性梯度程序的溶剂体系洗脱：0%→10%B，100%→90%A〔0→30分钟〕，此处A是0.1%含水三氟乙酸（TFA），B是乙腈。使用Waters 990二极管系检测器完成峰值检测，并如同实施例1所述完成馏分收集，获得如下两种馏分：

馏分洗脱时间

A₁约7分钟

A₂约9分钟

为光谱分析，按标准方法通过冷冻干燥去洗脱液和随后的冷冻干燥去水制备馏分A₁和A₂。

由馏分A₁和A₂所包括的化合物结构即而通过使用FAB MS确定。如此获得的数据和由此推断的结构如下：

A₁：

FAB MS：M/Z 469（M+1），高分辩率：对于C₂₃H₄₅N₆O计算为469.3863，误差2.0mmμ，

结构：苯甲酰胺，N-（20-氨基-4-羟基-4，8，12，17-四氮杂二十烷-1-基）-2，5-二羟基

A₂：

FAB MS：M/Z 449（M+1），433，376，260，203。

结构：1H-吲哚-3-乙酰胺，N-（16-氨基-4-羟基-4，8，13-三氮杂十六烷-1-基）-4-羟基

实施例4

馏分B的细分离和其中结构的确定

将按照实施例1描述所获得的馏分B置于C-4多孔层实心球（22毫米×250毫米，300埃孔径大小，10微米颗粒尺寸）柱上，并使用15毫升/分流速和采用下列非线性梯度程序的溶剂体系洗脱：0%→0%B，100%→100%A〔0→5分钟〕，然后0%→10%B，100%→90%A〔5→20分钟〕（Waters曲线1），然后10%→20%B，90%→80%A〔20→30分钟〕（Waters曲线6），然后，20%→50%B，80%→50%A〔30→40分钟〕（Waters曲线11），此处A是0.1%含水三氟乙酸（TFA），B是乙腈。使用Waters 990二极管系检测器完成峰值检测，并如同实施例1所述完成馏分收集。获得两种馏分如下：

馏分洗脱时间

B₁约18.5分钟

B₂约21.5分钟

为进行光谱分析，再按照标准方法通过冷冻干燥去除洗脱液和随后的冷冻干燥去除水制备该馏分。

由馏分B₁所包括的化合物结构通过使用FAB MS确定，其结结果如下：

FAB MS：M/Z 506（M+1），489，461，433，378，333，260，231，215，203，155，119。

高分辨率：对C₂₆H₄₈N₇O₃计算为506.3810

结构：1H-吲哚-3-乙酰胺，N-（20-氨基-4-羟基-4，8，12，17-四氮杂二十烷-1-基）-4-羟基

由馏分B₂所包括的化合物分子量通过使用FAB MS确定，其结果如下：

FAB MS：

高分辨率：对于C₂₇H₄₈N₆O₃计算为505.3861

实施例5

由馏分E包括的化合物结构

如实施例1描述所得的馏分E，为进行光谱分析，按标准方法通过冷冻干燥去洗脱液和随后的冷冻干燥去水而制备，由馏分E所包括的化合物结构使用FAB MS，¹H-NMR和¹³C-NMR确定。如此获得的数据和由此推断的结构如下：

FAB MS：M/Z490（M+1），472，433，362，333，260，215，203，177，155，119

高分辨率：对于C₂₆H₄₈N₇O₂计算为490.3860，误差0.6mmμ

¹H-NMR（500MHz，d6-DMSO）：10.89（s，1H），8.90-7.85（m，6H），7.55（d，J＝8.0Hz，1H），7.34（d，J＝8.0Hz，1H），7.19（s，1H），7.08（dd，J＝8.0Hz，J＝8.0Hz，1H），6.98（dd，J＝8.0Hz，J＝8.0Hz，1H），3.50（s，2H），3.13（m，2H），3.03-2.82（m，18H），1.88（m，6H），1.78（m，2H），1.62（m，4H）

¹³C-NMR（125.76MHz，d6-DMSO）：170.94，136.10，127.17，123.75，120.92，118.67，118.26，111.33，108.97，57.39，57.07，46.12，46.12，44.06，43.89，43.89，36.52，36.22，32.78，26.71，23.79，23.06，22.65，22.65，22.45

结构：1H-吲哚-3-乙酰胺，N-（20-氨基-4-羟基-4，8，12，17-四氮杂二十烷-1-基）

可供选择并且较佳的是，采用如实施例1所述的方法分离完整毒液，只是所用的溶剂体系和线性梯度程序为：0%→20%B，100%→80%A〔0→30分钟〕，并于220毫微米波段进行峰值检测。经约26.0分钟洗脱的馏分被置于Dynamax Phenyl柱上（4.6毫米×250毫米，60埃孔径尺寸，8微米颗粒尺寸），并使用1毫升/分钟流速和10%B，90%A的isocratic条件洗脱，此处的A和B如同实施如1所述。使用Waters 990二极管系检测器（λ＝220毫微米）完成峰值检测，如同实施例1所述收集各馏分。经大约55.27分钟洗脱的馏分按照标准方法经冷冻干燥去洗脱液和随后的冷冻干燥去水，结果产出本例的化合物。

实施例6

馏分G的细分离

将按照实施例1描述所获的馏分G置于C-18多孔层实心球（22毫米×250毫米，300埃孔径大小，10微米颗粒尺寸），柱上，并使用10毫升/分流速和采用下列非线性梯度程序的溶剂体系洗脱：20%→30%B，80%→70%A〔0→40分钟〕（Waters曲线6），并使用Waters 990二极管系检测器如同实施例1所述收集各馏分。馏分G经如上所述进行细分离后，以约22分钟由柱上洗脱，再将包括多肽的那种馏分按照公知的方法通过冷冻干燥去洗脱液和随后的冷冻干燥去水制备用来定序。

该馏分的烷基化多肽的氨基酸分析按照制造者的说明书使用Waters Pico-Tag法获得，序列数据由一台Applied Biosystems470A型蛋白质/肽定序器（Applied Biosystems，Inc.，850Lincoln Center Drive Foster City，California 94404）收集，伴随有含水TFA转化。所得的苯基海硫因氨基酸的分析用Applied Biosystems 120A型PTH分析仪在线完成，或用Dupont Zorbax PTH柱（Biomedical Product Department，Chromatography Products，E.I.dupont de Nemours and Co.，Inc.，1007Market Street，Wilmington，Delaware 19898）离线完成。

作为完整多肽的氨基酸分析和FAB MS的一个确定的结果，由馏分G包括的多肽部分的氨基-末端氨基酸序列被确定为：

H₂N-谷-赖-甘-亮-脯-谷-甘-丙-谷-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-丝-天冬-半胱-赖-半胱-丙-甘-谷氨酰胺-色-异亮-赖-半胱-精-半胱-脯-色-赖-色-组-异亮-苏-甘-谷-甘-脯-半胱-苏-半胱-谷-精-甘-亮-赖-赖-苏-半胱-异亮-丝-赖-亮-丝-天冬-脯-天冬酰胺-精-天冬酰胺-谷-色-亮-丝-;FAB MS：7267

实施例7

馏分H的细分离和其中结构的确定

将如实施例1描述所得的馏分H置于C-18多孔层实心球（22毫米×250毫米，300埃孔径大小，10微米颗粒尺寸）柱上，并使用10毫升/分的流速和采用下列非线性梯度程序的溶剂体系洗脱：20%→25%B，80%→75%A〔0→30分钟〕（Waters曲线6），然后25%→50%B，75%→50%A〔30→45分钟〕（Waters曲线11），此处A是0.1%TFA，B是乙腈，并使用Waters990二极管系检测器，同时如实施例1所述收集各馏分。收集的各馏分中所关心的馏分是：

馏分洗脱时间

H₂大约36分钟

H₃大约41分钟

然后，按照实施例6所述的步骤制备用于定序的包括多肽的馏分H₂和H₃，并做定序。

馏分H₂包括的多肽部分的氨基末端氨基酸序列被确定为：

H₂N-丙-赖-丙-亮-脯-脯-甘-丝-缬-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-丝-天冬-半胱-赖-半胱-酪-甘-赖-色-组-赖-半胱-精-半胱-脯-色-赖-色-组-苯丙-苏-甘-谷-甘-脯-半胱-苏-半胱-谷-赖-甘-甲硫-赖-组-苏-半胱-异亮-苏-赖-亮-组-半胱-脯-天冬酰胺-赖-丙-谷-色-甘-亮-天冬-色-;该完整多肽的分子量由Ion Spray MS确定为7793。

实施例8

馏分I和J的细分离及其中结构的确定

如实施例1中所述获得的馏分I和J由于具有实施例1中所示的相同的洗脱时间而不能充分分离，故将其一起置于C-4多孔层实心球（22毫米×250毫米，300埃孔径大小，10微米颗粒尺寸）柱上，并使用10毫升/分的流速和采用下列非线性梯度程序的溶剂体系洗脱：20%→30%B，80%→70%A〔0→30分钟〕（Waters曲线6），然后30%→50%B，70%→50%A〔30→45分钟〕（Waters曲线11），此处A是0.1%含水TFA，B是乙腈。按照实施例6所述步骤完成峰值检测和馏分收集。收集的各馏分中所关心的馏分是：

馏分洗脱时间

I 约22分钟

J 约27.5分钟

按照实施例6所述步骤制备用于定序的包括多肽的馏分I和J并做定序。

馏分I包括的多肽的氨基酸序列和FAB MS被确定如下：

H₂N-天冬-半胱-缬-甘-谷-丝-谷氨酰胺-谷氨酰胺-半胱-丙-天冬-色-丙-甘-脯-组-半胱-半胱-天冬-甘-酪-酪-半胱-苏-半胱-精-酪-苯丙-脯-赖-半胱-异亮-半胱-缬-天冬酰胺-天冬酰胺-天冬酰胺-CONH₂，FAB MS：4158。

馏分J包括的多肽部分的氨基-末端氨基酸序列和完整多肽的FAB MS确定如下：

H₂N-天冬-谷-脯-半胱-异亮-脯-亮-甘-赖-丝-半胱-丝-色-赖-异亮-甘-苏-脯-酪-半胱-半胱-脯-组-脯-天冬-天冬-丙-甘-精-精-苏-色-半胱-亮-缬-天冬-酪-丝-精-苯丙-缬-苏-异亮-半胱-丝-甘-精-赖-酪-CONH₂;FAB MS：5506。

实施例9

馏分L的细分离和其中结构的确定

将按照实施例1所述获得的馏分L置于C-18多孔层实心球（10毫米×250毫米，300埃孔径大小，5微米颗粒尺寸）柱上，并使用3.5毫升/分的流速和采用下列线性梯度程序的溶剂体系洗脱：25%→40%B，75%→60%A〔0→30分钟〕，此处A是0.1%含水TFA，B是乙腈。按照实施例6所述的步骤完成峰值检测和馏分收集。在收集的馏分中所关心的馏分是：

馏分洗脱时间

L₁约20.25分钟

L₂约22.5分钟

按照实施例6所述的步骤制备用于定序的包括多肽的馏分L₁和L₂并做定序。

馏分L₁包括的多肽部分的氨基-末端氨基酸序列被确定如下：

H₂N-异亮-缬-甘-甘-赖-苏-丙-赖-苯丙-甘-天冬-酪-脯-色-甲硫-缬-丝-异亮-谷氨酰胺-谷氨酰胺-赖-天冬酰胺-赖-赖-甘-甘-苯丙-天冬-

完整多肽的分子量按照已知方法通过凝胶电泳确定，约为20000。

实施例10

包括馏分M的化合物结构的确定

如实施例1所述获得的并包括多肽的馏分M按照实施例6所述步骤做用于定序的制备，并做定序。

馏分M所包括的多肽部分的氨基-末端氨基酸序列确定如下：

H₂N-谷-丙-苏-谷-丙-丙-赖-缬-亮-丝-天冬酰胺-亮-天冬-谷-苏-缬-天冬-脯-

完整多肽的分子量按照已知方法通过凝胶电泳确定，约为80000。

实施例11

1H-吲哚-3-乙酰胺，N-（20-氨基-4-羟基-4，8，12，17-四氮杂二十烷-1-基）

确认由实施例4所述的馏分E所包括的标题化合物的合成如下面所述完成。

在氮气氛下，搅拌13.22克（0.15摩尔）二氨基丁烷和3.5毫升甲醇并通过注射泵加入9.94毫升（0.15摩尔）丙烯腈，时间超过两小时，同时冷却到0-5℃，在大约18小时之后，使用如下溶剂体系将该混合物在600克硅胶上进行色谱分离：3∶1CH₂Cl/MeOH（2升）继而含5%体积异丙基胺的3∶1CH₂Cl₂/MeOH（2升），将含偶合产物的各馏分在真空中蒸发浓缩并产出一种黄色的粘性油，核磁共振（NMR）分析检证出该产物是上面结构式（Ⅰ）的偶合产物。

在氮气氛下，将5.78克（0.041摩尔）上述A部分中制备的结构式Ⅰ的化合物加入75毫升CH₃CN和11.48克KF硅藻土（Celite）中并搅拌。向搅拌的混合物中加入9.75克（0.041摩尔）按照制备A时所述步骤制备的结构式为Ⅱ的化合物于25毫升CH₃CN中的溶液。该反应被回流加热并用薄层色谱法（TLC）（3∶1 CH₂Cl₂/MeOH）监测。三小时之后，使该反应冷却并置于室温下。然后将硅藻土过滤掉并用二氯甲烷充分洗涤滤饼。将滤液在真空中浓缩。包含在浓缩滤液中的粗产物在硅胶上色谱分离。使用2升3∶1 CH₂Cl₂/MeOH，然后2升3∶1 CH₂Cl₂/MeOH和10毫升异丙基胺，再用2升3∶1 CH₂Cl₂/MeOH和30毫升异丙基胺。在该柱被异丙基胺饱和之后由柱上洗脱该产物，但该产物还是不纯的。将所有产物馏分合并并浓缩。用500克在CH₂Cl₂中的硅胶和125毫升异丙基胺调浆制成硅胶，然后以标准方法用其填充一个柱，使用二氯甲烷将上述粗产物置于柱上，接着以500毫升二氯甲烷和随后的1升3∶1CH₂Cl₂/MeOH流过该柱。将产物馏分合并并在真空中浓缩。结果产出1.5克上面结构式Ⅲ的产物。另有2克结构式Ⅲ的产物使用1升3∶1CH₂Cl₂/MeOH和30毫升异丙基苯胺由柱上洗脱。

在氮气氛下，将3.5克（11.8毫摩尔）的如以上B部分所述而制备的结构式Ⅲ的化合物，以及150毫升二氯甲烷一起搅拌，并加入5.2克（23.6毫摩尔）的二-t-丁基碳酸氢酯。在室温下搅拌该混合物约68小时。再将该混合物在真空中浓缩，并使用400克硅胶和60∶40己烷/乙酸乙酯溶剂进行色谱分离，结果产出5.62克结构式为Ⅳ的油状化合物。

D.

在氮气氛下，如上述C部分所述制备的结构式为Ⅳ的化合物3.0克在250毫升帕尔瓶中溶于30毫升乙酸。向该溶液中加入3.0克Pd（OH）₂/碳，并于50磅/吋²H₂压力下将该混合物氢化两小时。经过滤去除催化剂并将滤饼用乙酸良好洗涤。将滤液浓缩，再置于75毫升二氯甲烷中、用75毫升1N NaOH洗涤两次并以K₂CO₃干燥。将该溶液在真空中浓缩，结果产生2.86克上面结构式为Ⅴ的产物。

E.

在氮气氛下，将如上面D部分所述制备的结构式为Ⅴ的化合物2.86克（5.7毫摩尔）溶于75毫升甲醇中。伴随搅拌将0.41毫升（6.3毫摩尔）丙烯腈加入该混合物中，再搅拌该反该物一夜。然后将该反应混合物浓缩，再浓缩三次去除30毫升二氯甲烷并在真空中去掉溶剂，结果产出3.18克结构式为Ⅵ的油状化合物。

在氮气氛下，如上面E部分所述制备的结构式为Ⅵ的化合物3.18克（5.7毫摩尔）与100毫升二氯甲烷合并并搅拌成溶液，向该溶液中加入1.37克（6.3毫摩尔）二-t-丁基碳酸氢酯，并在室温下搅拌该反应90分钟，再将该反应混合物浓缩并在300克硅胶上使用60∶40己烷/乙酸乙酯作为洗脱液进行色谱分离。将这些产物馏分合并、浓缩，用3×20毫升二氯甲烷萃取并在真空中除去溶剂，得到3.12克上述式Ⅶ的产物。

在上述D部分的步骤之后，将上述F部分所得到的3.12克（4.76毫摩尔）式Ⅶ化合物溶于30毫升乙酸中，并在55磅/吋²下有3.0克Pb（OH）₂/C存在时氢化2小时，得到3.02克油状的上所式Ⅷ产物。

在氮氛下将1.0克（1.5毫摩尔）G部分所述制得的式Ⅷ化合物溶于10毫升甲醇中。向该溶液加入0.1毫升（1.67毫摩尔）丙烯腈并将该反应搅拌过夜。然后将该反应混合物由20毫升二氯甲烷中浓缩，再浓缩三次并在真空中除去溶剂，得到1.0克上述式Ⅸ化合物

在上述D部分的步骤之后，将1.0克（1.4毫摩尔）上述H部分制得的式Ⅸ化合物溶于30毫升乙酸中，并在50磅/吋²下氢化2.5小时，得到0.85克上述式Ⅹ产物。

J.

通过搅拌制得含有6.78克（20毫摩尔）硫酸四丁氢铵和75毫升水的溶液，并当容许起泡时加入3.36克（40毫摩尔）NaHCO₃。然后加入3.5克（20毫摩尔）吲哚乙酸，将混合物搅拌5分钟并添加75毫升CHCl₃。将混合物再搅拌5分钟并使底部两层分离。用Na₂SO₄盐处理含水层并用CHCl₃萃取，合并全部CHCl₃萃取液并用Na₂SO₄干燥，将生成的纯净琥珀色溶液浓缩，用3×75毫升丙酮检查并最后溶于75毫升丙酮中。然后添加1.9毫升（22毫摩尔）烯丙基溴并使该混合物保持30分钟。然后将混合物浓缩并使用3∶1己烷/乙酸乙酯在硅胶上色谱分离，得到3.57克轻黄油状的上式Ⅺ产物。

K.

在Angew.Chem.Int.Ed.Engl.23∶298（1984）步骤之后，将2.15克（10毫摩尔）上述J部分制得的式Ⅺ化合物与20毫升乙腈合并，并向该混合物中添加2.61克（12毫摩尔）二-t-丁基碳酸氢酯。然后加0.122克（1毫摩尔）4-（N，N-二甲基-氨基）吡啶并使反应进行15分钟。然后用乙酸乙酯将混合物稀释至125毫升，用稀HCl洗涤二次，25毫升水洗涤三次，盐水洗涤一次，干燥并浓缩。使用14.5∶1己烷/乙酸乙酯作洗脱剂通过在硅胶上色谱分离将产物提纯。得到2.87克无色油状的上式Ⅻ化合物。

L.

向3.27克（10.4毫摩尔）在20毫升二氯甲烷中的按上述K部分制得的式Ⅻ化合物添加7.4毫升2-乙基己酸钠的乙酸乙酯溶液（0.231克/毫升）。然后加0.5克φ₃P和0.5克（φ₃P）₄Pd并将混合物搅拌60分钟。然后将该混合物浓缩，溶于150毫升乙酸乙酯中并以5×25毫升H₂O洗涤。将含水萃取液合并并用1×25毫升乙酸乙酯和1×25毫升二***反萃。向含水层添加75毫升新鲜乙酸乙酯，然后酸化至PH3。分离乙酸乙酯层并用1×50毫升新鲜乙酸乙酯萃取含水层。将两次乙酸乙酯萃取液合并并用2×20毫升水，然后1×20毫升盐水洗涤，再干燥、浓缩，用3×30毫升己烷检查，在第二次检查中生成结晶。用己烷将混合物稀释至75毫升。将固体过滤，用己烷充分洗涤并在空气中干燥，得到1.37克白色固体。核磁共振（NMR）证实了式ⅩⅢ标明的结构。

在氮气氛下，将200毫克（0.73毫摩尔）式ⅩⅢ化合物与25毫升二氯甲烷、84毫克（0.73毫摩尔）N-羟基琥珀酰二胺和150毫克（0.73毫摩尔）二环己基碳化二亚胺混合，随后几乎立刻生成沉淀。将该混合物搅拌3小时。然后，将二环己基脲过滤出来，并向滤液中逐滴添加40毫升实施例11 A-I部分所述制得的式Ⅹ化合物的二氯甲烷溶液。将混合物搅拌12小时，然后用0.1NaOH洗涤并用K₂CO₃干燥、浓缩并使用150克硅胶色谱分离，用9∶1二氯甲烷/甲烷（0.5升）淋洗以分离杂质，而后用9∶1∶0.1二氯甲烷/甲醇/异丙胺洗脱。再将该产物浓缩，用二氯甲烷检查并再次浓缩，得到400毫克由300兆赫核磁共振证实的式ⅩⅣ化合物。

在氮气氛下，将0.34克（0.35毫摩尔）上述制得的式ⅩⅣ化合物与30毫升丙酮混合，搅拌成溶液并在冰/丙酮浴中冷却至约0℃。然后在8-10分钟内逐滴加入0.212克（1.05毫摩尔）85%3-氯过苯甲酸在20毫升丙酮中的溶液。使反应搅拌30分钟，然后用二***稀释至150毫升，并用2×25毫升10%K₂CO₃、2×25毫升H₂O、2×25毫升10%K₂CO₃、2×25毫升水洗涤，用K₂CO₃干燥。将该混合物浓缩，用2×30毫升二氯甲烷检查并在真空中浓缩至恒定重量0.33克。核磁共振分析表明，该产物是所需的式ⅩⅤ产物、原料和副产品的混合物。将该产品混合物加入3毫升在其中加有20毫克NaCNBH₃的乙酸中。将该混合物搅拌过液，在真空中除去乙酸，溶于50毫升二氯甲烷中并用PH7的含水缓冲剂1×75毫升洗涤。如果需要，用1N NaOH将PH调至7，分离二氯甲烷层并使用PH7的含水缓冲剂1×50毫升，以及1×25毫升盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，在真空中浓缩至恒定重量0.31克。将生成的产物在100克硅胶上色谱分离，用95∶5乙酸乙酯/甲醇洗脱并收集25毫升馏分。提纯的式ⅩⅤ产物洗下在馏分18-25中。将这些馏分合并、浓缩，用2×5毫升二氯甲烷检查并在真空中浓缩成68毫克白色泡沫，将该泡沫在-80℃下贮存。也含有所需产物的馏分26-40还含有某些杂质。将馏分26-40合并、浓缩、用二氯甲烷检查并在真空中浓缩至恒定重量66毫克。将后面的产物与6毫克已用作核磁共振研究的前面的产物和按上述步骤制得的混合物合并。将生成的混合物在75克硅胶上色谱分离，用9∶5乙酸乙酯/甲醇洗脱并收集25毫升馏分。提纯的式ⅩⅤ产物存在于馏分16-21中。将这些馏分合并、浓缩，用2×5毫升二氯甲烷检查并在真空中浓缩至恒定重量46毫克，在-80℃下贮存。

在氮气氛下，将108毫克（0.109毫摩尔）如上述制得的ⅩⅤ化合物溶于1.5毫升二氯甲烷中。然后，添加2毫升三氟乙酸并将混合物在室温下搅拌1小时。然后将反应混合物浓缩成薄膜并加15毫升二***。该薄膜转变成固体并在搅拌30分钟以后得到白色粉末。将粉末过滤，用二***充分洗涤，在氮中干燥，然后抽干至恒定重量为109克的本实施例的标题化合物。

实施例12

1H-吲哚-3-乙酰胺，N-（20-氨基-4-羟基-4，8，12，17-四氮杂二十烷（tetraazeicos）-1-基）-4-羟基

如下所述完成由实施例3所述馏分B₁所包括的确定的标题化合物的合成。

在氩气氛下使用火焰干燥的玻璃器皿，将4.0克（30毫摩尔）4-羟基吲哚与25毫升Aldrich干燥的二甲基甲酰胺（DMF）混合并搅拌成溶液。然后添加1.44克（30毫摩尔）以50%油分散体形式的NaH。在起泡减退后，添加2.5毫升氯甲基甲基醚（Aldrich）并将生成的暗绿色溶液搅拌过夜。然后用乙酸乙酯将该溶液稀释至125毫升，用5×25毫升H₂O和1×25毫升盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥并使用4∶1己烷/乙酸乙酯色谱分离。将含有该产物的馏分合并并浓缩，得到2.70克油状ⅩⅦ化合物。

B.

在50毫升配有机械搅拌器和氮气氛的三颈圆底烧瓶中冷却1.3克含水甲醛（37%）和2.28克乙酸。然后添加3.23毫升冷却的二甲基胺（25%水溶液）。使用约1.5-2.0毫升四氢呋喃作为转移溶剂向该生成的冷却溶液添加2.7克（15.2毫摩尔）式ⅩⅦ化合物。将反应加温至室温并搅拌过夜。然后添加40毫升10%NaOH，随后生成沉淀。在搅拌后，将沉淀过滤，用水洗涤、空气干燥，得到3.26克式ⅩⅧ化合物。

在氮气氛下，将4.62克KCN和10毫升H₂O混合并搅拌成溶液。然后添加30毫升乙醇和3.26克（14毫摩尔）式ⅩⅧ化合物，将该混合物搅拌并回流加热约65小时。使反应冷却并浓缩。将生成的含式ⅩⅩ化合物的沉淀过滤，用水洗涤、空气干燥。用4×15毫升二氯甲烷萃取含水层，保留有机萃取液。然后用50毫升乙酸乙酯复盖含水层并酸化至PH2。将乙酸乙酯层分离，鼓氮气泡通过乙酸乙酯层脱气，干燥并浓缩成固体，用二异丙醚研制该固体得到1.03克灰白色固体形式的式ⅩⅨ化合物。然后将所有来自碱性含水层中的萃取液合并、干燥、与来自上述的滤液混合并浓缩，得到0.4克固体形式的ⅩⅩ化合物。

D.

ⅩⅩ→ⅩⅨ

在氮气氛下，将1.6克式ⅩⅩ化合物与7.5毫升乙醇、30毫升H₂O和1.3克KOH混合。将该混合物回流加热并搅拌过夜。然后将该反应冷却，用2×15毫升乙酸乙酯萃取，用新鲜乙酸乙酯复盖并酸化至PH2。将合并的乙酸乙酯层干燥并浓缩。用异丙醚研制所得到的固体，得到1.1克式ⅩⅨ化合物。

E.

将1.44克（4.25毫摩尔）TBAHSO₄溶于10毫升水中。然后添加714毫克（8.5毫摩尔）NaHCO₃。在起泡消除后，添加1.0克（4.25毫摩尔）式ⅩⅨ化合物并将混合物搅拌1分钟，然后添加40毫升氯仿。反应被搅拌5分钟，分离氯仿层，然后用1×15毫升氯仿萃取含水混合物。将混合的氯仿萃取液干燥、浓缩并用2×30毫升丙酮检查。然后将产物在氮气氛下再溶于30毫升丙酮中，添加0.37毫升（4.25毫摩尔）烯丙基溴并搅拌该反应2小时。将混合物浓缩并使用乙酸乙酯作洗脱剂色谱分离。将产物浓缩，得到1.1克油。将所有产物与25毫升二氯甲烷混合并添加0.98克（4.5毫摩尔）二-t-丁基碳酸氢酯及51毫克（0.425毫摩尔）4-（N，N-二甲氨基）吡啶。将反应搅拌过夜。然后将该反应混合物浓缩并用9∶1己烷/乙酸乙酯色谱分离，浓缩后得到1.33克粘油状的式ⅩⅪ化合物。

F.

将64毫克（0.17毫摩尔）式ⅩⅪ化合物溶于2毫升甲醇中。向该溶液添加1.7毫升0.1N NaOH，将得到的反应混合物搅拌过夜。然后使反应酸化，干燥，用乙酸乙酯萃取并浓缩。核磁共振分析表明，全部式ⅩⅪ化合物的烯丙酯已被分离，但是发生某些基酯转移并存在一些甲酯。为此将产物与剩余量的式ⅩⅪ化合物（约1.26克）混合，溶于5毫升四氢呋喃中并冷却至0℃。然后添加3.8毫升1N NaOH，在0℃下搅拌该反应5分钟。再加温至室温。反应导至两相，需要添加5毫升甲醇以消除该两相。将该反应搅拌过夜。然后除去四氢呋喃和甲醇。并用50毫升乙酸乙酯复盖剩余的含水溶液并酸化至PH2。分离乙酸乙酯层，用1×20毫升H₂O洗涤，再用盐水洗涤一次，用Na₂SO₄干燥、过滤并浓缩成胶，该胶在用己烷研制时结晶，得到1.08克白色固体。用70∶30乙酸乙酯/己烷色谱分离该固体并将纯净的产物馏分合并、浓缩并由乙酸乙酯/己烷中结晶出，得到0.884克式ⅩⅫ化合物。

G.

在氮气氛中，将271毫克（0.81毫摩尔）式ⅩⅫ化合物在搅拌下溶于4毫升无水四氢呋喃中。然后，添加93毫克（0.81毫摩尔）N-羟基琥珀酰亚胺和167毫克（0.81毫摩尔）二环己基碳化二亚胺并将混合物搅拌。1小时50分钟后，加入0.58克（0.8毫摩尔）按照实施例11步骤制得的溶于30毫升二氯甲烷中的式Ⅹ化合物，并将该混合物搅拌一周（Over the weekend）。然后将二环己脲过滤出，用2×3毫升1N NaOH萃取该混合物，用K₂CO₃干燥并浓缩。然后将产物在100克硅胶上色谱分离，用9∶1二氯甲烷/甲醇洗脱所需产物外的一切化合物，然后用9∶10∶1二氯甲烷/甲醇/异丙胺洗脱该产物。将含有该产物的馏分浓缩，用二氯甲烷检查若干次并除去溶剂，得到349毫克白色泡沫状的式ⅩⅩⅢ化合物。

可选择地和较好的是，用0.165克（1.43毫摩尔）N-羟基琥珀酰亚胺，随后0.294克（1.43毫摩尔）二环己基碳化二亚胺处理50毫升含有0.480克（1.43毫摩尔）式ⅩⅫ化合物的二氯甲烷溶液并使之搅拌5小时。将反应混合物过滤，在20分钟内逐滴将含有粗羟基琥珀酰亚胺的滤液加入100毫升按实施例11所述步骤制得的1.03克（1.43毫摩尔）式Ⅹ化合物的二氯甲烷溶液中。该反应被搅拌72小时。然后用20毫升1N NaOH将粗反应混合物洗涤两次，用K₂CO₃干燥，过滤并浓缩。然后在硅胶上用4∶1二氯甲烷/甲醇，随后用9∶1∶1二氯甲烷/甲醇/二异丙胺色谱分离该产物，得到912毫克式ⅩⅩⅢ化合物。

H.

在氮气氛下，将吲哚基乙酰胺ⅩⅩⅢ（900毫克，0.87毫摩尔）溶于40毫升二氯甲烷中。向该溶液添加2-（苯磺酰）-3-苯基氧化氮丙啶（Phenyloxaziridine）（500毫克，1.92毫摩尔）。通过薄层气相色谱控制反应的进程。1小时后，将反应混合物在真空中浓缩，得到主要是粗氮羰基，将其溶于35毫升乙酸中，添加大过量氰氢硼化钠（1.00克，15.9毫摩尔）并使反应搅拌约2小时。将反应在真空中浓缩，溶于二氯甲烷中（50毫升），用PH7的缓冲液（1×50毫升）洗涤，用1N NaOH调节PH至7。再次用PH7的缓冲液（1×50毫升）洗涤有机层，用碳酸钾干燥，在真空中浓缩，以产生粗产物，将该产物在硅胶上用95∶5乙酸乙酯/甲醇色谱分离，产出612毫克（67%）白色泡沫状式ⅩⅩⅣ的化合物。

通过交替抽真空和排吸氩三次，使3毫升三氟乙酸脱气。然后将平底烧瓶包封在铝箔中，并用约2.5毫升二氯甲烷作为转移剂添加98毫克式ⅩⅩⅣ化合物。45分钟后，将混合物浓缩，得到一种油，该油在用二***研制时，得到88毫克白色固体形式的式ⅩⅩⅤ化合物，在-80℃下贮存。

可选择地以及较好的是，在1.5分钟内向用氩清洗过的100毫升饱和二恶烷-HCl溶液中加入0.520克（0.495毫摩尔）按上述H部分步骤制得的式ⅩⅩⅣ化合物的10毫升二恶烷溶液。立即生成沉淀并使反应搅拌1小时。然后加二***，5分钟后，将溶液过滤。用二***洗涤所产生的固体，在氮气氛下，然后在减压下干燥，产生345毫克式ⅩⅩⅣ′的酸，可在-78℃下贮存。然后，向氩清洗过的含水溶液加入150毫克（0.205毫摩尔）式ⅩⅩⅣ′的酸。通过高效液体色谱控制该反应。在约7小时后该反应结束时，将反应混合物冷冻干燥，产出103毫克盐酸盐形式的ⅩⅩⅤ化合物。

实施例13

苯甲酰胺，N-（20-氨基-4-羟基-4，8，12，17-四氮杂二十烷-1-基）-4-羟基

如下所述完成由实施例2所述馏分A′所包括的确定的标题化合物的合成。

A.

在400毫升烧杯中，将6.78克（20毫摩尔）硫酸四丁氢铵与60毫升水混合并搅拌成溶液。然后，当容许起泡时，添加3.36克（40毫摩尔）NaHCO₃，随后加40毫升含2.76克（20毫摩尔）对羟基苯甲酸、0.8克NaOH和40毫升H₂O的溶液。将反应混合物搅拌5分钟，然后添加200毫升二氯甲烷。将混合物再搅拌5分钟并使各层分离。用50毫升二氯甲烷萃取含水层二次。将合并的二氯甲烷萃取液用Na₂SO₄干燥、浓缩，用75毫升丙酮检查二次并再溶于50毫升丙酮中。然后添加1.9毫升（22毫摩尔）烯丙基溴并搅拌该混合物。然后将反应混合物浓缩，溶于100毫升乙酸乙酯中，用30毫升H₂O洗涤2次，用50毫升饱和碳酸氢盐洗涤一次，用30毫升水洗涤一次，用盐水洗涤一次，用水洗涤一次再用盐水洗涤一次。将得到的产物干燥并浓缩，得到一种油。用50毫升石油醚将该油研制1小时。然后将该混合物过滤，用石油醚充分洗涤并空气干燥，得到1.7克上述式ⅩⅩⅥ化合物。

B.

在氮气氛下，将1.7克（9.55毫摩尔）如以上A部分所述制得的式ⅩⅩⅥ化合物与50毫升Aldrich干燥二甲基甲酰胺混合并搅拌成溶液。然后添加0.38克（9.55毫摩尔）60%油分散体形式的NaH并使该反应搅拌过夜。然后添加0.76毫升氯甲基·甲醚（Aldrich），随后立即生成沉淀。将该反应混合物搅拌18小时。使反应在200毫升乙酸乙酯/100毫升水中骤冷。分离乙酸乙酯层，用50毫升H₂O洗涤三次，用50毫升1N NaOH洗涤1次，用50毫升水洗涤一次和用盐水洗涤一次。将所得溶液干燥、浓缩并在硅胶上用4∶1己烷/乙酸乙酯色谱分离，得到1.63克上述式ⅩⅩⅦ化合物。

C.

将1.62克（7.3毫摩尔）如上B部分所述制得的式ⅩⅩⅦ化合物溶于75毫升四氢呋喃中。然后添加含有0.4克（10毫摩尔）NaOH的15毫升水溶液，结果形成两层。添加甲醇直至得到均匀混合物。然后将反应搅拌过夜。在真空中除去四氢呋喃和甲醇并用15毫升乙酸乙酯萃取剩余的含水溶液二次。然后用50毫升新鲜乙酸乙酯复盖该含水层并用6N HCl酸化至PH2.5。而后分离乙酸乙酯层，用10毫升H₂O洗涤一次和用25毫升盐水洗涤一次。将形成的溶液浓缩得到固体，该固体用己烷研制，过滤并真空干燥，得到1.2克上述式ⅩⅩⅧ化合物。

D.

用0.081克（0.7毫摩尔）N-羟基琥珀酰亚胺，随之用0.144克（0.7毫摩尔）二环己基碳化二亚胺处理20毫升含有0.127克（0.7毫摩尔）以上C部分所述制得的式ⅩⅩⅧ化合物的二氯甲烷溶液，并将其搅拌4小时。然后将反应混合物过滤，并将含有粗羟基琥珀酰亚胺的滤液在20分钟内逐滴加入80毫升含有0.50克（0.7毫摩尔）实施例11A-I部分所述步骤制得的式Ⅹ化合物的二氯甲烷溶液中。然后搅拌该反应数小时。再用1N NaOH（2×20毫升）洗涤该反应混合物，用碳酸钾干燥，过滤并浓缩。在硅胶上用9∶1二氯甲烷/甲醇，随后用9∶1∶0.25二氯甲烷/甲醇/二异丙胺色谱分离该浓缩物，得到370毫克上述式ⅩⅩⅫ化合物。

在氮气氛下，将0.335克（0.38毫摩尔）按以上D部分所述步骤制得的式ⅩⅩⅫ化合物溶于30毫升二氯甲烷中。将0.230克（0.88毫摩尔）2-（磺酰苯基）-3-苯基-氧化氮丙啶（oxaziridine）加入该溶液中。0.5小时后，使反应在真空中浓缩并将该浓缩物溶于15毫升乙酸中。添加大过量氢氰硼化物（0.100克，1.6毫摩尔），并搅拌该反应2小时。然后将反应在真空中浓缩，再溶于50毫升二氯甲烷中，用50毫升PH7的缓冲液洗涤一次，用1N NaOH调节至PH7。再用50毫升PH7的缓冲液洗涤有机层一次，用碳酸钠干燥并在真空中浓缩。在硅胶上用50∶50丙酮/己烷色谱分离该浓缩物，得到253毫克上述式ⅩⅩⅩⅣ化合物。

在室温氩气氛下，将上面E部分所述制备的式ⅩⅩⅩⅣ化合物和5毫升三氟乙酸混合。将该反应搅拌1.5小时。补充加入2毫升三氟乙酸洗涤烧瓶壁。使该反应另外再进行1.5小时。然后，该反应在真空中浓缩，用***研制，在氮气氛下过滤并干燥以产出218毫克式ⅩⅩⅩⅥ化合物，即本实施例标题化合物。

实施例14

苯甲酰胺，N-（20-氨基-4，8，12，17-四氮杂二十烷-1-基）-2，5-二羟基

如下所述进行如实施例3所述馏分A₁所包括的确定的标题化合物的合成。

A.

采用实施例12A部分所述的步骤，不同的是初始用3.08克（20毫摩尔）2，5-二羟基苯甲酸，产生3.0克上式ⅩⅪⅩ化合物。

B.

在氮气氛下，将3.0克（15.5毫摩尔）的式ⅩⅩⅨ化合物与50毫升Aldrich干燥DMF混合并搅拌成溶液。然后，加入1.24克（31毫摩尔）60%油分散剂形式的NaH并搅拌混合物。3小时后，加入2.5毫升（33毫摩尔）氯甲基甲醚并将该反应搅拌18小时。然后将该反应混合物加入到300毫升乙酸乙酯和100毫升水中。而后分离乙酸乙酯层并用75毫升水洗涤三次，用75毫升1N NaOH洗涤二次，用50毫升H₂O洗涤二次和用盐水洗涤一次。干燥并浓缩得到的溶液，产出2.9克油，该油用4∶1己烷/乙酸乙酯在硅胶上进行色谱分离，得到两种馏分，其第二种馏分含有1.16克上式ⅩⅩⅩ化合物。

C.

将1.16克（4.1毫摩尔）上式ⅩⅩⅩ化合物加入10毫升四氢呋喃中。然后，加入0.24克（6毫摩尔）NaOH的10毫升水溶液中，结果形成两相。将甲醇加入该混合物中直至获得单一相，然后搅拌该混合物18小时。然后将溶剂分离，剩余的水溶液用15毫升乙酸乙酯萃取二次。然后该水相层用35毫升新鲜乙酸乙酯覆盖，并用6N HCl调节PH至2.5。随后分离该乙酸乙酯层，用10毫升水洗涤一次，用盐水洗涤一次，干燥并浓缩，产出1.0克油状的上式ⅩⅩⅪ化合物。

D.

采用实施例13D部分所述的步骤，使用0.17克（0.7毫摩尔）如上面C部分所述制备的式ⅩⅩⅪ化合物，0.081克（0.7毫摩尔）N-羟基琥珀酰亚胺，0.144克（0.7毫摩尔）二环己基碳化二亚胺和0.5克（0.7毫摩尔）按实施例11中A-I部分所述步骤制备的式Ⅹ化合物，经色谱分离后，产出370毫克的上式ⅩⅩⅩⅢ化合物。

采用实施例13E部分所述的步骤，用0.308克（0.33毫摩尔）按以上D部分所述步骤制备的式ⅩⅩⅩⅢ化合物和0.250克（0.96毫摩尔）2-（磺酰苯基）-3-苯基-氧化氮丙啶，用乙酸乙酯随后用50∶50丙酮/己烷硅胶色谱分离后，产出210毫克上式ⅩⅩⅩⅤ化合物。

F.

采用实施例13F部分所述的步骤，用0.100克（0.104毫摩尔）按上述E部分所述步骤制备的式ⅩⅩⅩⅤ化合物，产出108毫克式ⅩⅩⅩⅦ化合物，即本实施例的标题化合物。

实施例15

1H-吲哚-3-乙酰胺，N-（16-氨基-4-羟基-4，8，13-三氮杂十六烷-1-基）-4-羟基

如下所述进行实施例3所述的馏分A₂所包括的确定的标题化合物的合成。

A.

采用实施例11D部分所述的步骤，用1.15克（2.07毫摩尔）如实施例11中A-E部分所述制备的式Ⅵ化合物，产出1.10克上式ⅩⅩⅩⅧ化合物。

B.

采用实施例12中G部分所述的可选择的步骤，用含有0.228克（6.8毫摩尔）按上述实施例12的A-F部分所述制备的式ⅩⅩⅡ化合物的二氯甲烷溶液（15毫升），0.380克（6.8毫摩尔）按上述A部分所述制备的式ⅩⅩⅩⅧ化合物，0.078克（6.8毫摩尔）N-羟基琥珀酰亚胺和0.140克（6.8毫摩尔）二环己基碳化二亚胺，用9∶1二氯甲烷/甲醇随后用9∶1∶0.5二氯甲烷/甲醇/二异丙胺硅胶色谱分离后，产出0.407克式ⅩⅩⅩⅨ化合物。

C.

采用实施例12H部分所述的步骤，用0.350克（0.4毫摩尔）式ⅩⅩⅩⅨ化合物和0.230克（0.88毫摩尔）2-（磺酰苯基）-3-苯基-氧化氮丙啶，用50∶50丙酮/己烷硅胶色谱分离后，产出0.274克上述式XL化合物。该产物含有少量苯氨磺酰，因而用乙酸乙酯随后用50∶50丙酮/己烷在硅胶上进一步提纯。

D.

采用实施例12Ⅰ部分的可选择步骤，用0.166克（0.186毫摩尔）按上述C部分所述步骤制备的式XL化合物，经二恶烷/HCl处理后得到粗酸。将该式XL′酸溶于水中8小时，随后通过冰冻干燥，产出88毫克式XLI化合物。

制剂A

在氮气氛下，搅拌600毫升N，N-二甲基甲酰胺中的34.5克（157.6毫摩尔）3-溴丙胺氢溴酸盐。向该溶液加入34.4克（157.6毫摩尔）二-t-碳酸氢丁酯并随后加入32.3毫升（236毫摩尔）三乙胺。立即产生沉殿，反应搅拌过夜然后将反应混合物用乙酸乙酯稀释至1.5升，用500毫升1N HCl洗涤一次，用500毫升水洗涤三次，用盐水洗涤一次并用Na₂SO₄干燥。浓缩后，产物用4∶1己烷/乙酸乙酯在800克硅胶上色谱分离，用薄层色谱法（KMnO₄/I₂）检测馏分。将含有产物的馏分合并，在真空下浓缩，用50毫升二氯甲烷检查二次并用高真空提纯，产出25.8克本制剂产物。

Claims

1、一种选自由如下化合物组成的组的基本上纯的化合物：

一种具有以下确定特征的化合物：

(a)存在于来自 Agelenopsis aperta蜘蛛的粗毒液馏分中，该馏分洗离C-18 Vydac 22毫米×250毫米的柱体，该柱体的孔隙尺寸为300

，颗粒尺寸为10μ，洗脱所用流速为15毫升/分，并用线性梯度程序为：5%→20%B，95%→80%A[0→30分钟]然后20%→70%B，80%→30%A[30→55分钟]的溶剂体系，其中A是0.1%TFA水溶液，B是乙腈，洗脱时间约为22.75分钟；

(b)存在于上述(a)所述馏分的馏分中，该馏分洗离C-18 Vydac

22毫米×250毫米，孔隙尺寸为300 ，颗粒尺寸为10μ的柱体，洗脱所用流速为15毫升/分钟，并用非线性梯度程序为：0%→0%B，100%→100%A[0→5分钟]，然后0%→10%B，100%→90%A[5→20分钟](Wates曲线1)，然后10%→20%B，90→80%A[20→30分钟](Wates曲线6)，然后20%→50%B，80%→50%A[30→40分钟](Waters曲线11)的溶剂体系，其中A为0.1%的TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为21.5分钟；以及

(c)FAB MS：高分辨率：505.3861，及其可药用的盐类。

2、一种基本上纯的多肽，该多肽选自下列化合物组成的组：一种具有如下确定特征的多肽：

（a）存在于来自Agelenopsis aperta蜘蛛粗毒液馏分中，该馏分洗离C-18Vydac

22毫米×250毫米的柱体，该柱体的孔隙尺寸为300

，颗粒尺寸为10μ，洗脱所用流速为15毫升/分钟，并用线性梯度程序为：5%→20%B，95%→80%A〔0→30分钟〕然后20%→70%B，80%→30%A〔30→55分钟〕的溶剂体系，其中A是0.1%TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为38分钟;

（b）存在于上述（a）所述馏分的馏分中，该馏分洗离C-18Vydac

22毫米×250毫米的柱体，该柱体孔隙尺寸为300 ，颗粒尺寸为10μ，洗脱所用流速为10毫升/分钟，并用非线性梯度程序为：20%→30%B，80%→70%A〔0→40分钟〕（Waters 曲线6）的溶剂体系，其中A为0.1%TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为22分钟;

（c）一种氨基末端氨基酸序列包括：

H₂N-谷-赖-甘-亮-脯-谷-甘-丙-谷-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-丝-天冬-半胱-赖-半胱-丙-甘-谷氨酰胺-色-异亮-赖-半胱-精-半胱-脯-色-赖-色-组-异亮-苏-甘-谷-甘-脯-半胱-苏-半胱-谷-精-甘-亮-赖-赖-苏-半胱-异亮-丝-赖-亮-丝-天冬-脯-天冬酰胺-精-天冬酰胺-谷-色-亮-丝-;以及

（d）FAB MS：7267;和一种与所说的多肽具有基本相同的氨基酸序列和基本相同的钙通道阻滞活性的多肽，

一种具有下式的多肽：

天冬-半胱-缬-甘-谷-丝-谷氨酰胺-谷氨酰胺-半胱-丙-天冬-色-丙-甘-脯-组-半胱-半胱-天冬-甘-酪-酪-半胱-苏-半胱-精-酪-苯丙-脯-赖-半胱-异亮-半胱-缬-天冬酰胺胺-天冬酰胺-天冬酰胺-CONH₂

和一种与所说的多肽具有基本相同的氨基酸序列和基本相同的钙通道阻滞活性的多肽，

一种具有如下确定特征的多肽：

（a）存在于Agelenopsis aperta蜘蛛粗毒液的馏分中，该馏分洗离C-18Vydac

22毫米×250毫米的柱体，该柱体孔隙尺寸为300

，颗粒尺寸为10μ，洗脱所用流速为15毫升/分钟，用线性梯度程序为：5%→20%B，95%→80%A〔0→30分钟〕然后20%→70%B，80%→30%A〔30→55分钟〕的溶剂体系，其中A为0.1%TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为39分钟;

22毫米×250毫米的柱体，该柱体孔隙尺寸为300 ，颗粒尺寸为10μ，洗脱所用流速为10毫升/分钟，用非线性梯度程序为：20%→25%B，80%→75%A〔0→30分钟〕（Waters曲线6）然后25%→50%B，75%→50%A30→45分钟〕（Waters曲线11）的溶剂体系，其中A为0.1%TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为36分钟;和

（c）一种氨基末端氨基酸序列包括：

H₂N-丙-赖-丙-亮-脯-脯-甘-丝-缬-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-丝-天冬-半胱-赖-半胱-酪-甘-赖-色-组-赖-半胱-精-半胱-脯-色-赖-色-组-苯丙-苏-甘-谷-甘-脯-半胱-苏-半胱-谷-赖-甘-甲硫-甘-组-苏-半胱-异亮-苏-赖-亮-组-半胱-脯-天冬酰胺-赖-丙-谷-色-甘-亮-天冬-色-;和

（d）Ion-Spray MS：7793;

以及一种与所说多肽具有基本相同氨基酸序列和基本相同的钙通道阻滞活性的多肽，

一种如下式的多肽：

H₂N-天冬-谷-脯-半胱-异亮-脯-亮-甘-赖-丝-半胱-丝-色-赖-异亮-甘-苏-脯-酪-半胱-半胱-脯-组-脯-天冬-天冬-丙-甘-精-精-苏-色-半胱-亮-缬-天冬-酪-丝-精-苯丙-缬-苏-异亮-半胱-丝-甘-精-赖-酪-CONH₂和一种与所说的多肽具有基本相同的氨基酸序列和基本相同的钙通道阻滞活性的多肽，

一种具有如下确定特征的多肽：

（a）存在于来自Agelenopsis aperta蜘蛛粗毒液的馏分中，该馏分洗离C-18Vydac

22毫米×250毫米的柱体，该柱体孔隙尺寸为300 ，颗粒尺寸为10μ，洗脱所用流速为15毫升/分钟，用线性梯度程序为：5%→20%B，95%→80%A〔0→30分钟〕然后20%→70%B，80%→30%A〔30→55分钟〕的溶剂体系，其中A为0.1%TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为43分钟;

22毫米×250毫米的柱体，该柱体孔隙尺寸为300 ，颗粒尺寸为5μ，洗脱所用流速为3.5毫升/分钟，用线性梯度程序为：25%→40%B，75%→60%A〔0→30分钟〕的溶剂体系，其中A为0.1%TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为20.25分钟。

（c）一种氨基末端氨基酸序列包括：

H₂N-异亮-缬-甘-甘-赖-苏-丙-赖-苯丙-甘-天冬-酪-脯-色-甲硫-缬-丝-异亮-谷氨酰胺-谷氨酰胺-赖-天冬酰胺-赖-赖-甘-甘-苯丙-天冬-;和

（d）分子量约为20000;

以及一种与所说的多肽具有基本相同氨基酸序列和基本相同的钙通道阻滞活性的多肽

一种具有如下确定特征的多肽：

（a）存在于来自Agelenopsis aperta蜘蛛粗毒液的馏分中，该馏分洗离C-18Vydac 22毫米×250毫米的柱体，该柱体孔隙尺寸为300

，颗粒尺寸为10μ，洗脱所用流速为15毫升/分钟，使用线性梯度程序为：5%→20%B，95%→80%A〔0→30分钟〕然后20%→70%B，80%→30%A〔30→55分钟〕的溶剂体系，其中A为0.1%TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为43分钟;

（b）存在于上述（a）所述馏分的馏分中，该馏分洗离C-18Vydac 10毫米×250毫米的柱体，该柱体孔隙尺寸为300

，颗粒尺寸为5μ，洗脱所用流速为3.5毫升/分钟并使用线性梯度程序为：25%→40%B，75%→60%A〔0→30分钟〕的溶剂体系，其中A为0.1%TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为22.5分钟;

以及一种与所说多肽具有基本相同的氨基酸序列和基本相同的钙通道阻滞活性的多肽，

一种具有如下确定特征的多肽：

22毫米×250毫米的柱体，该柱体孔隙尺寸为300

，颗粒尺寸为10μ，洗脱所用流速为15毫升/分钟，使用线性梯度程序为：5%→20%B，95%→80%A〔0→30分钟〕然后20%→70%B，80→30%A〔30→55分钟〕的溶剂体系，其中A为0.1%TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为48.3分钟;

（b）一种氨基末端氨基酸序列包括：

H₂N-谷-丙-苏-谷-丙-丙-赖-缬-亮-丝-天冬酰胺-亮-天冬-谷-苏-缬-天冬-脯-;和

（c）分子量约为80000

以及一种与所说的多肽具有基本相同的氨基酸序列和基本相同的钙通道阻滞活性的多肽，及其可药用的盐类。

3、按照权利要求2的基本上纯的多肽，该多肽选自由如下多肽组成的组：

一种具有如下确定特征的多肽：

（a）存在于来自Agelenopsis aperta蜘蛛粗毒液的馏分中，该馏分洗离C-18Vydac 22毫米×250毫米的柱体，该柱体的孔隙尺寸为300

，颗粒尺寸为10μ，洗脱所用流速为15毫升/分钟，用线性梯度程序为：5%→20%B，95%→80%A〔0→30分钟〕然后20%→70%B，80%→30%A〔30→55分钟〕的溶剂体系，其中A为0.1%TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为38分钟;

22毫米×250毫米柱体，该柱体孔隙尺寸为300

，颗粒尺寸为10μ，洗脱所用流速为10毫升/分钟，用非线性梯度程序为：20%→30%B，80%→70%A〔0→40分钟〕（Waters曲线6）的溶剂体系，其中A为0.1%TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为22分钟;

（c）一种氨基末端氨基酸序列包括：

H₂N-谷-赖-甘-亮-脯-谷-甘-丙-谷-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-丝-天冬-半胱-赖-半胱-丙-甘-谷氨酰胺-色-异亮-赖-半胱-精-半胱-脯-色-赖-色-组-异亮-苏-甘-谷-甘-脯-半胱-苏-半胱-谷-精-甘-亮-赖-赖-苏-半胱-异亮-丝-赖-亮-丝-天冬-脯-天冬酰胺-精-天冬酰胺-谷-色-亮-丝-;和

（d）FAB MS：7267;

一种具有如下通式的多肽：

天冬-半胱-缬-甘-谷-丝-谷氨酰胺-谷氨酰胺-半胱-丙-天冬-色-丙-甘-脯-组-半胱-天冬-甘-酪-酪-半胱-苏-半胱-精-酪-苯丙-脯-赖-半胱-异亮-半胱-缬-天冬酰胺-天冬酰胺-天冬酰胺-CONH₂，

一种具有如下确定特征的多肽：

22毫米×250毫米的柱体，该柱体孔隙尺寸为300 ，颗粒尺寸为10μ，洗脱所用流速为15毫升/分钟，用线性梯度程序为：5%→20%B，95%→80%A〔0→30分钟〕然后20%→70%B，80%→30%A〔30→55分钟〕的溶剂体系，其中A为0.1%TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为39分钟;

（b）存在于上述（a）所述馏分的馏分中，该馏分洗离C-18Vydac 22毫米×250毫米的柱体，该柱体孔隙尺寸为300 ，颗粒尺寸为10μ，洗脱所用流速为10毫升/分钟，用非线性梯度程序为：20%→25%B，80%→75%A〔0→30分钟〕（Waters 曲线6）然后25%→50%B，75%→50%A〔30→45分钟〕（Waters曲线11）的溶剂体系，其中A为0.1%TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为36分钟;和

（c）一种氨基末端氨基酸序列包括：

H₂N-丙-赖-丙-亮-脯-脯-甘-丝-缬-半胱-天冬-甘-天冬酰胺-谷-丝-天冬-半胱-赖-半胱-酪-甘-赖-色-组-赖-半胱-精-半胱-脯-色-赖-色-组-苯丙-苏-甘-谷-甘-脯-半胱-苏-半胱-谷-赖-甘-甲硫-甘-组-苏-半胱-异亮-苏-赖-亮-组-半胱-脯-天冬-赖-丙-谷-色-甘-亮-天冬-色-;和

（d）Ion-Spray MS：7793，

一种如下式的多肽：

H₂N-天冬-谷-脯-半胱-异亮-脯-亮-甘-赖-丝-半胱-丝-色-赖-异亮-甘-苏-脯-酪-半胱-半胱-脯-组-脯-天冬-天冬-丙-甘-精-精-苏-色-半胱-亮-缬-天冬-酪-丝-精-苯丙-缬-苏-异亮-半胱-丝-甘-精-赖-酪-CONH₂，一种具有如下确定特征的多肽：

22毫米×250毫米的柱体，该柱体孔隙尺寸为30

，颗粒尺寸为10μ，洗脱所用流速为15毫升/分钟，用线性梯度程序为：5%→20%B，95%→80%A〔0→30分钟〕然后20%→70%B，80%→30%A〔30→55分钟〕的溶剂体系，其中A为0.1%TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为43分钟;

（b）存在于上述（a）所述的馏分的馏分中，该馏分洗离C-18Vydac

22毫米×250毫米的柱体该柱体孔隙尺寸为300

，颗粒尺寸为5μ，洗脱所用流速为3.5毫升/分钟，用线性梯度程序为：25%→40%B，75%→60%A〔0→30分钟〕的溶剂体系，其中A为0.1%TFA水溶液，B为乙脯，洗脱时间约为20.25分钟;

（c）一种氨基末端氨基酸序列包括：

（d）分子量约为20000，

一种具有如下确定特征的多肽：

，颗粒尺寸为10μ，洗脱所用流速为15毫升/分钟，用线性梯度程序为：5%→20%B，95%→80%A〔0→30分钟〕然后20%→70%B，80%→30%A〔30→55分钟〕的溶剂体系，其中A为0.1%TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为43分钟;和

，颗粒尺寸为5μ，所用洗脱流速为3.5毫升/分钟，用线性梯度程序为：25%→40%B，70%→60%A〔0→30分钟〕的溶剂体系，其中A为0.1%TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为22.5分钟，

一种具有如下确定特征的多肽：

，颗粒尺寸为10μ，洗脱用流速为15毫升/分钟，用线性梯度程序为：5%→20%B，95%→80%A〔0→30分钟〕然后20%→70%B，80%→30%A〔30→55分钟〕的溶剂体系，其中A为0.1%TFA水溶液，B为乙腈，洗脱时间约为48.3分钟;

（b）一种氨基末端氨基酸序列包括：

（c）分子量约为80000，

及其可药用的盐类。

4、一种拮抗兴奋性氨基酸神经递质的医药组合物，该神经递质影响哺乳动物的神经***细胞，所述的组合物含有一种兴奋性氨基酸神经递质拮抗量的按照权利要求1的化合物或一种其可药用的盐和一种可药用的稀释剂或载体。

5、一种阻滞哺乳动物神经***细胞中钙通道的医药组合物，该组合物含有一种钙通道阻滞量的按照权利要求1的式为：

的化合物或一种其可药用的盐和一种可药用的稀释剂或载体。

6、一种拮抗影响哺乳动物神经***细胞的兴奋性氨基酸神经递质和阻滞哺乳动物神经***细胞钙通道的医药组合物，所述的组合物含有一种兴奋性氨基酸神经递质拮抗量和一种钙通道阻滞量的按照权利要求1的式为：

的化合物或其一种可药用的盐和一种可药用的稀释剂或载体。

7、一种阻滞哺乳动物神经***细胞钙通道的医药组合物，该组合物含有一种钙通道阻滞量的按照权利要求2的多肽或其一种可药用的盐和一种可药用的稀释剂或载体。

8、一种阻滞哺乳动物神经***细胞钙通道的医药组合物，该组合物含有一种钙通道阻滞量的按照权利要求3的多肽或其一种可药用的盐和一种可药用的稀释剂或载体。