CN1962851A - 一种新的发酵生产乳酸的培养基配方 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于培养乳酸菌的培养基，所述的培养基中含有适量的维生素化合物硫胺素、核黄素、烟酸、盐酸吡哆醛和生物素。本发明还公开所述培养基的用途以及采用所述培养基生产乳酸的方法。本发明的培养基与优化以前的培养基相比，残糖降低，乳酸产量显著大幅提高，而且生产成本大幅降低。

Description

一种新的发酵生产乳酸的培养基配方

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种乳酸菌培养基以及采用所述乳酸菌培养基的乳酸生产方法。

背景技术

乳酸是一种重要的工业有机酸，有着极其广泛的应用，可广泛用于食品、制药、制革、纺织、环保和农业中。其产品主要表现形式为酸味剂、调味剂、防腐剂、鞣制剂、植物生长调节剂、生物可降解材料和手性药物等。由于乳酸用途广泛且有不断扩大之势，乳酸衍生物开发力度逐年加大，因此世界乳酸需求量增加很快。

不同菌种有不同的乳酸发酵机理，可分成同型发酵和异型发酵两类，国内外基本上都是以同型发酵生产乳酸为主。与异型发酵相比，同型发酵生产L-乳酸具有许多特点：1)细菌发酵的理论转化率高；2)细菌发酵属于厌氧或微好氧发酵，不需大量通风，节能；3)细菌发酵副产物较少，利于下游分离等。但是，细菌同型发酵的营养要求较高，尽管通常在培养基中含有的酵母膏含有微量的必需氨基酸和生长因子，然而其中的生长因子成份及含量皆不确定，无法全面满足乳酸发酵所需。

现有技术中，原始的培养基配方为蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，K₂HPO₄ 2g/L，柠檬酸二胺2g/L，乙酸钠4g/L，葡萄糖40g/L，MgSO₄·7H₂O0.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.2g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.03g/L，吐温-801 mL/L，调pH6.0，该配方的副产物较多，乳酸的产量和产率相对较低，其主要原因是由于生长因子不足而影响菌体的生长和产酸。

因此，本领域急需对乳酸菌的培养基成份进行优化，从而促进乳酸菌菌体的生长，提高乳酸产量，降低成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适合于培养乳酸菌，可显著提高乳酸发酵水平的培养基。

在本发明的第一方面，提供一种用于培养乳酸菌的培养基，所述的培养基中含有碳源、氮源、磷源、无机盐、乙酸钠，并且，所述的培养基中还含有硫胺素、核黄素、烟酸、盐酸吡哆醛和生物素。

在本发明的另一优选例中，所述的培养基中含有：

硫胺素：    0.01～0.1mg/L；

核黄素：    0.005～0.05mg/L；

烟酸：      0.5～10mg/L；

盐酸吡哆醛：0.02～2mg/L；

生物素：    0.02～0.5mg/L。

更优选的，所述的培养基中含有：

硫胺素：    0.02-0.08mg/L；

核黄素：    0.006-0.04mg/L；

烟酸：      1-8mg/L；

盐酸吡哆醛：0.05-0.5mg/L；和

生物素：    0.03-0.2mg/L。

进一步优选的，所述的培养基中含有：

硫胺素：    0.03-0.06mg/L，例如为0.053mg/L；

核黄素：    0.01-0.03mg/L，例如为0.01mg/L；

烟酸：      3-5mg/L，例如为4mg/L；

盐酸吡哆醛：0.1-0.3mg/L，例如为0.2mg/L；

生物素：    0.05-0.15mg/L，例如为0.075mg/L。

在本发明的另一优选例中，所述的培养基含有：

碳源：    10-500g/L；

氮源：    0.1-100g/L；

磷源：    0.1-10g/L；

无机盐：  0.0001-2g/L；和

乙酸钠：  0.5-20g/L；

更优选的，所述的培养基含有：

碳源：    20-300g/L；

氮源：    2-40g/L；

磷源：    1-3g/L；

无机盐：  0.005-1g/L；和

乙酸钠：  1-10g/L。

进一步优选的，所述的培养基含有：

碳源：    40-200g/L；

氮源：    5-30g/L；

磷源：    1.5-2.5g/L；

无机盐：  0.01-0.5g/L；和

乙酸钠：  2-6g/L。

在本发明的另一优选例中，所述的碳源选自：葡萄糖或果糖；或

所述的氮源选自：蛋白胨、酵母膏、或牛肉膏；或

所述的磷源选自：K₂HPO₄；或

所述的无机盐选自以下一种或多种：二价镁、二价铁、二价锰或一价钠的无机盐。

更优选的，所述的无机盐选自以下一种或多种：MgSO₄·7H₂O、MnSO₄·H₂O、硫酸亚铁、氯化钠。

在本发明的另一优选例中，所述的碳源为：葡萄糖；或

所述的氮源为：蛋白胨、酵母膏和牛肉膏；或

所述的无机盐为：MgSO₄·7H₂O、MnSO₄·H₂O、硫酸亚铁、和氯化钠。

在本发明的另一优选例中，所述的培养基中还含有：

柠檬酸二铵：  0.1-10g/L；

吐温-80：    0.01-10ml/L。

更优选的，含有：

柠檬酸二铵： 0.5-5g/L；

吐温-80：    0.2-3ml/L。

进一步优选的，含有：

柠檬酸二铵： 1-3g/L；

吐温-80：    0.5-2ml/L。

在本发明的另一优选例中，所述的培养基中含有：

硫胺素：     0.01～0.1mg/L；

核黄素：     0.005～0.05mg/L；

烟酸：       0.5～10mg/L；

盐酸吡哆醛： 0.02～2mg/L；

生物素：     0.02～0.5mg/L；

蛋白胨：     1～50g/L；

牛肉膏：     1～50g/L；

酵母膏：     0.5～50g/L；

K₂HPO₄：     0.1-10g/L；

柠檬酸二胺： 0.1-10g/L；

乙酸钠：     0.5～20g/L；

葡萄糖：     10～500g/L；

MgSO₄·7H₂O：0.005～2g/L；

MnSO₄·H₂O： 0.005～2g/L；

硫酸亚铁：   0.0001～1g/L；

氯化钠：     0.0005～1g/L；和

吐温-80：    0.01-10ml/L；

用NaOH调节pH为5.0～7.0，余量为水。

更优选的，所述的培养基中含有：

硫胺素：    0.02-0.08mg/L；

核黄素：    0.006-0.04mg/L；

烟酸：      1-8mg/L；

盐酸吡哆醛：0.05-0.5mg/L；

生物素：    0.03-0.2mg/L；

蛋白胨：    3-30g/L；

牛肉膏：    3-30g/L；

酵母膏：    3-30g/L；

K₂HPO₄：    1-3g/L；

柠檬酸二胺：0.5-5g/L；

乙酸钠：    1-10g/L；

葡萄糖：       20-300g/L；

MgSO₄·7H₂O：  0.01-1g/L；

MnSO₄·H₂O：   0.01-1g/L；

硫酸亚铁：     0.002-0.2g/L；

氯化钠：       0.001-0.5g/L；和

吐温-80：      0.2-3ml/L。

进一步优选的，所述的培养基中含有：

硫胺素：      0.03-0.06mg/L；

核黄素：      0.01-0.03mg/L；

烟酸：        3-5mg/L；

盐酸吡哆醛：  0.1-0.3mg/L；

生物素：      0.05-0.15mg/L；

蛋白胨：      5-20g/L；

牛肉膏：      5-20g/L；

酵母膏：      6-15g/L；

K₂HPO₄：      1.5-2.5g/L；

柠檬酸二胺：  1-3g/L；

乙酸钠：      2-6g/L；

葡萄糖：      40-200g/L；

MgSO₄·7H₂O： 0.1-0.5g/L；

MnSO₄·H₂O：  0.1-0.5g/L；

硫酸亚铁：    0.005-0.015g/L；

氯化钠：      0.01-0.1g/L；和

吐温-80：     0.5-2ml/L。

在本发明的另一优选例中，所述的培养基的pH值为4.5-7.5。

在本发明的另一优选例中，调节所述的培养基的pH值为5.5-6.5。最优选的，所述的培养基的pH值为6.0。

在本发明的另一优选例中，在发酵过程中用NaOH、NH₃或CaCO₃调节所述的培养基的pH值。

在本发明的另一优选例中，在配制时，可在所述的培养基中加入促凝固的成份，从而将所述培养基制备成固体形式的培养基。更优选的，所述的促凝固的成份为琼脂。

在本发明的另一优选例中，所述的乳酸菌包括(但不限于)：乳酸乳杆菌(L.Lactis)、或干酪乳杆菌(L.casei)。例如，所述的干酪乳杆菌可以是拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。

在本发明的第二方面，提供所述的培养基的用途，用于乳酸的生产。

在本发明的第三方面，提供一种利用所述的培养基生产乳酸的方法，所述的方法包括：

(1)在适合乳酸菌生长的条件下，在权利要求1所述的培养基中培养乳酸菌，获得乳酸菌培养物；和

(2)从乳酸菌培养物中分离获得乳酸。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

具体实施方式

本发明人经过长期而广泛的研究，发现在乳酸发酵过程中，培养基成份是影响乳酸发酵水平的关键因素，而在常规的乳酸培养基中加入适量的维生素，可大大提高(提高25％以上；更优选地，提高40％以上)乳酸的产量。基于此完成了本发明。

本发明人通过以下方法对培养基进行优化：

以硫胺素、生物素、核黄素、烟酸、盐酸吡哆醛、维生素C等因子作为候选对象，首先采用2_IV ^5-2部分因子析因设计进行筛选，筛选出影响发酵水平的五种有影响的维生素：硫胺素、生物素、核黄素、烟酸、盐酸吡哆醛，其中以硫胺素和生物素的影响最为明显。

其次，在从大量影响因子中筛选出重要的因子后，根据实验数据拟合出一次多项式，并利用最速上升实验确定最大响应区域，优化硫胺素、核黄素、烟酸、盐酸吡哆醛和生物素的最适添加浓度。

结果发现，硫胺素、生物素等能够明显促进乳酸菌生物合成乳酸。并且还发现，硫胺素、核黄素、烟酸、盐酸吡哆醛和生物素以适当比例的组合对于促进乳酸菌生物合成乳酸是最有效的。这5种维生素能够均衡地维持乳酸菌菌体的生长，以及产酸。根据前述的优化结果，并且经过本发明人反复多次的配比试验，证实了所述5种维生素较佳配比如下：

硫胺素：    0.01～0.1mg/L；

核黄素：    0.005～0.05mg/L；

烟酸：      0.5～10mg/L；

盐酸吡哆醛：0.02～2mg/L；

生物素：    0.02～0.5mg/L。

更优选的，所述5种维生素的较佳配比如下：

硫胺素：    0.02～0.08mg/L；

核黄素：    0.006～0.04mg/L；

烟酸：      1～8mg/L；

盐酸吡哆醛：0.05～0.5mg/L；

生物素：    0.03～0.2mg/L。

最优选的，所述5种维生素的较佳配比如下：

硫胺素：    0.053mg/L；

核黄素：    0.01mg/L；

烟酸：      4mg/L；

盐酸吡哆醛：0.2mg/L；

生物素：    0.075mg/L。

本发明的培养基中除了含有上述维生素化合物以外，还含有碳源、氮源和无机盐等常规的成份。碳源是指能提供微生物营养所需碳元素的营养源。氮源是指能提供微生物营养所需氮元素的营养源。无机盐是行使构成菌体成分、酶活性基组成或维持酶活性、调节渗透压、pH等的成份。至于这些常规的成份，可以采用常规的乳酸菌培养基中相应成份及用量。这些成份可用本领域技术人员熟知的其它成份替代，且本领域的技术人员不难确定其含量。

经本发明人优化后的培养基配方，它含有足够的营养成份，既能满足摇瓶实验的需要，又能成功地将摇瓶发酵结果放大到发酵罐，而且发酵结束时残糖降低、副产物减少，利于下游的分离纯化工作。在本发明的一个实施例中，所述培养基与优化以前的培养基相比，乳酸的产量达169.1g/L，乳酸产量提高了42.47％，且生产成本大幅降低。

作为本发明的一种优选实施方式，所述的培养基的组分和含量为：

硫胺素0.005-0.1mg/L、核黄素0.005-0.2mg/L、烟酸0.1-20mg/L、盐酸吡哆醛0.01-4.0mg/L、生物素0.001-1.0mg/L，蛋白胨1-50g/L，牛肉膏1-50g/L，酵母膏0.5-50g/L，K₂HPO₄ 0.2-20g/L，柠檬酸二胺0.2-20g/L，乙酸钠0.2-20g/L，葡萄糖10-500g/L，MgSO₄·7H₂O 0.005-2g/L，MnSO₄·H₂O0.005-2g/L，硫酸亚铁0.0001-1g/L，氯化钠0.0005-1g/L，吐温-800.005-10mL；用NaOH调节pH为5.0-7.0。

本发明的培养基适合于任何本领域用于发酵生产乳酸的乳酸菌，包括但不限于：乳酸乳杆菌(L.Lactis)和干酪乳杆菌(L.casei)；例如，所述培养基可用于培养：拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，可利用拟干酪乳杆菌(L.casei)生物合成乳酸。

本发明的培养基适于不同规模的乳酸菌培养或发酵，包括(但不限于)用于进行：种子培养、发酵生产乳酸的摇瓶培养；或大规模发酵生产乳酸。

本发明还提供了制备所述培养基的方法，包括如下步骤：(a)将所述的有机氮源、K₂HPO₄、柠檬酸二胺、乙酸钠、无机盐、吐温-80按照比例在水中混合；(b)将碳源按照比例溶解在水中；(c)将维生素族化合物按照比例溶解在水中；(d)将步骤(a)、(b)、(c)的成份按照比例混合，获得所述的培养基。采用所述的方法，将氮源、碳源和维生素B族化合物分别配制(采用不同的灭菌方式，或在不同的温度下灭菌)，再进行混合，这样可以最大程度降低高温灭菌对葡萄糖的营养成分和维生素有效成分的损害。

作为本发明的一种实施方式，所述方法包括：1)将蛋白胨，牛肉膏，酵母膏，K₂HPO₄，柠檬酸二胺，乙酸钠，MgSO₄·7H₂O，MnSO₄·H₂O，硫酸亚铁，氯化钠，吐温-80按照比例在水中溶解；用NaOH溶液调pH6.0，121℃灭菌20min；2)将葡萄糖加水溶解，115℃灭菌20min；3)将硫胺素、核黄素、烟酸、盐酸吡哆醛、生物素分别加水溶解，用无菌过滤膜过滤除菌；4)将步骤1)、2)和3)的成分按照比例混合，获得所需的培养基。

本发明的主要优点在于：

本发明人首次发现在常规的乳酸培养基中加入适量的维生素化合物，可大大提高乳酸的产量。加入适量维生素化合物后的培养基与优化以前的培养基相比，糖利用率和乳酸产率都达到提高，同时生产成本大幅降低。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1培养基的配方

所述的培养基的几种配方见表1：

表1

	培养基1	培养基2	培养基3	培养基4	培养基5
						葡萄糖g/L)	200	200	160	40	350
蛋白胨(g/L)	10	10	10	8	30
						牛肉膏(g/L)	10	10	10	8	20
酵母膏(g/L)	5	5	5	6	15
						K2HPO4(g/L)	2	2	1.5	1	2
柠檬酸二胺(g/L)	2	2	2.5	1	3.5
						乙酸钠(g/L)	4	4	4	1.5	6.5
MgSO4·7H2O(g/L)	0.2	0.2	0.2	0.1	0.5
						MnSO4·H2O(g/L)	0.2	0.2	0.15	0.1	0.5

硫酸亚铁(g/L)	0.01	0.01	0.01	0.006	0.2
						氯化钠(g/L)	0.03	0.03	0.025	0.03	0.2
吐温-80(ml/L)	1	1	1.25	0.5	3
						硫胺素(mg/L)	0.053	0	0.045	0.02	0.05
核黄素(mg/L)	0.01	0	0.015	0.015	0.025
						烟酸(mg/L)	4	0	3.5	2	6
盐酸吡哆醛(mg/L)	0.2	0	0.25	0.11	0.6
						尘物素(mg/L)	0.075	0	0.09	0.035	0.12
pH值	6.0±0.3	6.0±0.3	6.0±0.3	6.0±0.3	6.0±0.3

实施例2采用培养基1生产乳酸

一.培养基1的配制

1)按蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，K₂HPO₄ 2g/L，柠檬酸二胺2g/L，乙酸钠4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，MnSO₄·H₂O 0.2g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.03g/L，吐温-80 1mL/L的比例称取以上培养基组分加适量蒸馏水溶解；用4mol/L的NaOH溶液调pH6.0，121℃灭菌20min。

2)按培养基中葡萄糖终浓度为200g/L，按比例配制一定浓度的母液，115℃灭菌20min。

3)按培养基中组合维生素的终浓度为：硫胺素0.053mg/L、核黄素0.01mg/L、烟酸4.0mg/L、盐酸吡哆醛0.2mg/L、生物素0.075mg/L，配制一定浓度的母液，用无菌过滤膜过滤除菌。

4)将步骤1)、2)和3)的成分按照比例混合，用于发酵。

二.发酵

使用上述配制的培养基1，发酵培养乳酸菌拟干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)(购于ATCC)发酵生产乳酸。

培养基成分如上，用4mol/L的NaOH将溶液pH值调到6.0。

培养方法：接种时间为12h，接种量15％，130rpm、37℃用pH检测与补料控制摇床培养，发酵开始时以6mol/L氨水自动调节pH值为6.0，分批发酵时间为48h。

然后，发酵结束时检测乳酸的发酵水平，结果测得乳酸含量为169.1g/L，比在相同条件下不添加维生素族的化合物(见实施例3)的乳酸发酵水平提高了约42.5％。

并且，添加硫胺素、核黄素、烟酸、盐酸吡哆醛和生物素后单位质量乳酸的原材料成本为0.0203rmb/g乳酸，而对照的成本为0.0288rmb/g乳酸，相比成本降低了29.51％。

实施例3采用培养基2生产乳酸

使用不加硫胺素、核黄素、烟酸、盐酸吡哆醛和生物素的培养基，培养拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)发酵生产乳酸。

除了在培养基中不加入维生素族的化合物，其它各种成分以及配比同上述的培养基1，则得到培养基2，配制方法同实施例2。

培养方法：接种时间为12h，接种量15％，130rpm、37℃用pH检测与补料控制摇床培养，发酵开始时以6mol/L氨水自动调节pH值为6.0，分批发酵时间为48h。

然后，发酵结束时检测乳酸的发酵水平，结果测得乳酸含量为118.7g/L，可见乳酸产量明显低于添加硫胺素、核黄素、烟酸、盐酸吡哆醛和生物素后的乳酸产量。

实施例4采用培养基3生产乳酸

采用培养基3的配方配制培养基，培养乳酸菌Lactobacillus lactisBME5-18M(购于ATCC)，用于发酵生产乳酸。

培养方法：接种时间为12h，接种量15％，130rpm、37℃用pH检测与补料控制摇床培养，发酵开始时以6mol/L氨水自动调节pH值为6.0，分批发酵时间为48h。

然后，发酵结束时检测乳酸的发酵水平，结果测得乳酸含量接近于实施例2(采用培养基1进行发酵)，与培养基2相比乳酸产量提高了近40％；另一方面，乳酸发酵生产的成本降低了近29％。

实施例5采用培养基4生产乳酸

采用培养基4的配方配制培养基，培养乳酸菌Lactobacillus casei ssp.casei(DSM 20244)，用于发酵生产乳酸。

培养方法：接种时间为12h，接种量15％，130rpm、37℃用pH检测与补料控制摇床培养，发酵开始时以6mol/L氨水自动调节pH值为6.0，分批发酵时间为48h。

然后，发酵结束时检测乳酸的发酵水平，结果测得乳酸含量较高，与培养基2相比乳酸产量提高了28％；另一方面，乳酸发酵生产的成本降低了约20％。

实施例6采用培养基5生产乳酸

采用培养基5的配方配制培养基，培养拟干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)，用于发酵生产乳酸。

培养方法：接种时间为12h，接种量15％，130rpm、37℃用pH检测与补料控制摇床培养，发酵开始时以6mol/L氨水自动调节pH值为6.0，分批发酵时间为48h。

然后，发酵结束时检测乳酸的发酵水平，结果测得乳酸含量较高，与培养基2相比乳酸产量提高了36％；另一方面，乳酸发酵生产的成本降低了约25％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于培养乳酸菌的培养基，所述的培养基中含有碳源、氮源、磷源、无机盐、乙酸钠，其特征在于，所述的培养基中还含有硫胺素、核黄素、烟酸、盐酸吡哆醛和生物素。

2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的培养基中含有：

硫胺素：           0.01～0.1mg/L；

核黄素：           0.005～0.05mg/L；

烟酸：             0.5～10mg/L；

盐酸吡哆醛：       0.02～2mg/L；和

生物素：           0.02～0.5mg/L。

3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的培养基含有：

碳源：      10-500g/L；

氮源：      0.1-100g/L；

磷源：      0.1-10g/L；

无机盐：    0.0001-2g/L；和

乙酸钠：    0.5-20g/L。

4.如权利要求3所述培养基，其特征在于，

所述的碳源选自：葡萄糖或果糖；或

所述的氮源选自：蛋白胨、酵母膏、或牛肉膏；或

所述的磷源选自：K₂HPO₄；或

所述的无机盐选自以下一种或多种：二价镁、二价铁、二价锰、或一价钠的无机盐。

5.如权利要求4所述的培养基，其特征在于，

所述的碳源为：葡萄糖；或

所述的氮源为：蛋白胨、酵母膏和牛肉膏；或

所述的无机盐为：MgSO₄·7H₂O、MnSO₄·H₂O、硫酸亚铁和氯化钠。

6.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的培养基还含有：

柠檬酸二铵：  0.1-10g/L；和

吐温-80：    0.01-10ml/L。

7.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的培养基的pH值为4.5-7.5。

8.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述的乳酸菌选自：乳酸乳杆菌、或干酪乳杆菌。

9.权利要求1所述的培养基的用途，其特征在于，用于乳酸的生产。

10.一种利用权利要求1所述的培养基生产乳酸的方法，其特征在于，所述的方法包括：

(1)在适合乳酸菌生长的条件下，在权利要求1所述的培养基中培养乳酸菌，获得乳酸菌培养物；和

(2)从乳酸菌培养物中分离获得乳酸。