CN1954826A - 银杏叶提取物在降低胆固醇方面的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及银杏叶提取物(GBE，Ginkgo bilobaExtract)在发挥预防和治疗作用过程中所引起的肝脏中胆汁合成关键酶基因的表达变化。更具体地，本发明涉及GBE对体内与胆固醇代谢相关的关键酶基因——胆固醇7α－羟化酶基因(Cyp7a1)、羟－3－甲基戊二酸甲酰辅酶基因(Hmgcr)、过氧化物酶体增生物活化受体基因(Ppar)和视黄醇类受体基因(Rxr)的调节。

Description

银杏叶提取物在降低胆固醇方面的用途
技术领域
本发明涉及银杏叶提取物(也称为“银杏叶组合物”)在制备降胆固醇药物中的用途。更具体地，本发明涉及银杏叶提取物(GBE，Ginkgo biloba Extract)引起的肝脏中胆汁合成关键酶基因的表达变化，本发明的GBE对体内与胆固醇代谢相关的关键酶基因——胆固醇7α-羟化酶基因(Cyp7a1)、羟-3-甲基戊二酸甲酰辅酶基因(Hmgcr)、过氧化物酶体增生物活化受体基因(Ppar)和视黄醇类受体基因(Rxr)有下调或上调作用。
背景技术
银杏(Ginkgo biloba L.)，系银杏科银杏种植物。其叶片为常用中药材，具有敛肺气、平喘咳、止带浊功能，可用于肺虚哮喘、冠心病、心绞痛等疾病。研究表明，银杏叶的主要活性成分为黄酮类和内酯类化合物。目前，已可通过一定的提取手段制得活性成分含量较高的银杏叶提取物，如德国专利DE-B 1767098、DE-B 2117 429、美国专利5,399,348以及中国专利CN 1145230等所描述的方法。
银杏叶提取物——GBE，是目前世界畅销的食用增补剂和药品之一。60年代中期，德国科学家已发现GBE对心脑血管疾病和外周循环障碍疾病有较好的防治作用。根据多年来国内外对GBE的研究结果，对GBE已认可的作用可概括如下：(1)舒张血管，增加血供；(2)降低血黏度，改善血液流变学；(3)抗PAF作用，抑制血小板凝集和血栓形成；(4)改善线粒体功能，增强神经细胞能量供应；(5)抑制氧自由基，减轻缺血再灌注损伤；(6)调节神经递质及其受体作用，保护神经细胞；(7)抗神经免疫炎症反应及抗水肿和神经髓鞘保护作用等。目前，关于GBE对糖代谢的文献报道较多，但其研究多停留在机体和细胞学水平，未能从分子水平揭示GBE作用后靶细胞或靶细胞基因表达水平的变化规律及其可能影响的代谢途径。
另外，虽然认为银杏叶提取物可能对脂类代谢(如甘油三酯)有一定影响，但是在本发明之前尚未报道过GBE降低胆固醇的明确作用和机理。
胆固醇被公认为心血管疾病的主要元凶之一，血总胆固醇升高为冠心病的独立危险因素，且与冠状动脉病变程度呈正相关。为了有效地预防和治疗与高胆固醇有关的疾病，本领域迫切需要开发具有明确的降低胆固醇作用原因且能有效降低胆固醇水平的组合物，尤其是源自天然物质的组合物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种源自天然物质的、具有明确调节胆固醇代谢相关基因表达并可有效降低胆固醇水平的组合物。
本发明的目的还在于提供了一种可以用来作为调节胆固醇水平的药物作用靶点的组合，这些药物作用靶点可以用于药物筛选的标志物。
在本发明的第一方面，提供了一种银杏叶酮酯类提取物在制备降胆固醇组合物中的用途。
在另一优选例中，所述的银杏叶酮酯类提取物中含有5-50％的银杏叶黄酮类物质、1-10％银杏叶内酯类物质。
在另一优选例中，所述的银杏叶酮酯类提取物具有以下指纹图谱的特征峰：黄酮醇苷、芦丁、莽草酸、犬鸟氨酸、儿茶素类、黄烷类化合物。
在另一优选例中，所述的提取物为GBE50、GBE78、或其组合。
在另一优选例中，所述的组合物的剂型是片剂、胶囊、液体胶囊、颗粒剂、滴丸、口服液、粉针剂、冻干粉、注射液。
在另一优选例中，所述的组合物含有选自他汀类药物或抑制素类药物的物质。
在另一优选例中，所述的他汀类药物或抑制素类药物分别选自：阿托伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀和利匹妥。
在另一优选例中，所述的组合物还用于(a)降低胆固醇7α-羟化酶基因(Cyp7a1)的表达；(b)降低羟-3-甲基戊二酸甲酰辅酶基因(Hmgcr)的表达；(c)促进过氧化物酶体增生物活化受体基因(Ppar)的表达；或(d)促进视黄醇类受体基因(Rxr)的表达。
在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物或保健品组合物。
在本发明的第二方面，提供了一种银杏叶酮酯类提取物的用途，它被用于制备：
(a)降低胆固醇7α-羟化酶基因(Cyp7a1)的表达的组合物；
(b)降低羟-3-甲基戊二酸甲酰辅酶基因(Hmgcr)表达的组合物；
(c)促进过氧化物酶体增生物活化受体基因(Ppar)的表达组合物；
(d)促进视黄醇类受体基因(Rxr)表达的组合物；或
(e)调节上述四种基因共同或任意组合的表达的组合物。
在本发明的第三方面，提供了一组在基因水平和蛋白水平发生改变的基因表达变化的用途，用作胆固醇水平调节的指示指标，所述的基因表达选自下组：
(a)胆固醇7α-羟化酶基因(Cyp7a1)的表达的变化；
(b)羟-3-甲基戊二酸甲酰辅酶基因(Hmgcr)表达的变化；
(c)视黄醇类受体基因(Rxr)表达的变化；
(d)过氧化物酶体增生物活化受体(PPAR)的变化；
或(e)上述基因变化的组合。
在另一优选例中，所述基因表达变化选自下组：
(a)胆固醇7α-羟化酶基因(Cyp7a1)的表达的下降；
(b)羟-3-甲基戊二酸甲酰辅酶基因(Hmgcr)表达的下降；
(c)视黄醇类受体基因(Rxr)表达的上升；
(d)过氧化物酶体增生物活化受体(PPAR)的上升。
本发明的实验表明，这些基因的表达水平的变化及其组合，可以影响体内的胆固醇的水平。
在另一优选例中，这些基因的表达水平变化及其组合，作为提示服用或使用药物、制剂、化学试剂、保健品后的对胆固醇水平调节的指示指标。
具体实施方式
本发明人经过研究发现，银杏叶酮酯类提取物具有明显的降胆固醇作用，并且通过基因芯片的检测，银杏叶提取物对肝脏中胆汁合成关键酶基因的表达有影响。具体地，银杏叶酮酯类提取物对体内与胆固醇代谢相关的关键酶基因——胆固醇7α-羟化酶基因(Cyp7a1)、羟-3-甲基戊二酸甲酰辅酶基因(Hmgcr)的表达有抑制作用，并对过氧化物酶体增生物活化受体基因(Ppar)、视黄醇类受体基因(Rxr)的表达有促进作用。因此，银杏叶酮酯类提取物特别适合开发成降胆固醇的药物和保健品。在此基础上完成了本发明。
活性成分
在本发明中，活性成分指银杏叶酮酯类提取物或银杏叶组合物。
如本文所用，术语“银杏叶酮酯类提取物”、“银杏叶组合物”、“银杏叶提取物”、“银杏叶黄酮类提取物”可互换使用，均指提取自银杏叶，且黄酮类物质含量大于20wt％(较佳地大于30wt％，更佳地大于50wt％，且至多80wt％以下)的提取物。在本发明中，银杏叶酮酯类提取物除了含有黄酮类物质之外，还可有内酯类物质。通常，在银杏叶酮酯类提取物中，内酯类物质的含量为4-10wt％。
此外，所述的银杏叶酮酯类提取物中，银杏酸的含量宜低于20ppm，较佳地低于10ppm，更佳地低于5ppm。
一类优选的银杏叶酮酯类提取物是中国专利ZL99803683.8所述的银杏叶组合物。
一种特别优选的银杏叶酮酯类提取物包括黄酮类化合物约44％-78％、银杏内酯2.5％-10％(包括银杏内酯A、B、C和J或其混合物)、白果内酯2.5％-10％和银杏酸0.1-5ppm的银杏叶酮酯类提取物。
较佳地，所述的黄酮类化合物包含黄酮醇、黄烷醇和黄酮苷，更佳地，所述黄酮苷含量为20-75％。
一种特别优选的银杏叶酮酯类提取物包括黄酮类化合物约44％-78％(其中包含黄酮醇、黄烷醇和黄酮苷)、银杏内酯2.5％-10％(包括银杏内酯A、B、C和J或其混合物)、白果内酯2.5％-10％和银杏酸0.1-5ppm的银杏叶酮酯类提取物。
一种更特别优选的银杏叶酮酯类提取物包括黄酮类化合物约44％-78％(其中黄酮苷含量为20-75％)、银杏内酯2.5％-10％(包括银杏内酯A、B、C和J或其混合物)、白果内酯2.5％-10％和银杏酸0.1-5ppm的银杏叶酮酯类提取物。
更佳地，优选的银杏叶组合物的指纹图谱具有约17个特征峰，这些特征峰包括但不限于，黄酮醇苷、芦丁、莽草酸、花青素类、儿茶素类、黄烷类化合物等的特征峰。
银杏叶酮酯类提取物的制备方法是本领域中已知的，例如德国专利DE-B1767 098、DE-B 2117 429、美国专利5,399,348以及中国专利CN1145230等所描述的方法。
组合物和施用方法
本发明还提供了含有银杏叶酮酯类提取物的组合物。
在本发明中，可用常规方法将银杏叶酮酯类提取物与(药学上)可接受的载体、赋形剂或稀释剂相混合，形成本发明的药物组合物或保健品组合物。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。
本发明药物组合物或保健品组合物，可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其他合适的形状。本发明的核酸活性成分的含量通常为组合物重量的1-99％，较佳地为2-95％，更佳地为5-90％，最佳地10-80％。
本发明药物组合物或保健品组合物，可以为单剂或多剂形式。按施用剂量计，通常含有1-1000mg/剂，较佳地约2-500mg/剂，更佳地5-100mg/剂。
本发明的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、肌注、皮下注射等。优选口服给药。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明药物的施用量，按活性物质计算，通常为每天约0.01-500mg/kg体重，较佳地约0.1-50mg/kg体重。此外，本发明的降胆固醇制剂还可与其他治疗剂一起使用，如他汀类药物(阿托伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀和氟伐他汀)，抑制素类药物(利匹妥)，以及它们的混合物。
本发明的主要优点在于：
(a)提供一种源自天然物质的、可有效降低胆固醇水平的组合物，且明确GBE通过调节与胆固醇代谢相关的四个基因的表达而降低胆固醇，明确GBE用于降低胆固醇的有效性和配伍原则。
(b)胆固醇7α-羟化酶基因(Cyp7a1)、羟-3-甲基戊二酸甲酰辅酶基因(Hmgcr)的表达有抑制作用，并对氧化物酶体增生物活化受体基因(Ppar)、视黄醇类受体基因(Rxr)的表达的变化，单独或组合方式，可以用来提示体内胆固醇水平的代谢水平，这些基因的表达变化水平，可以用来但不限于进行相关药物功效的鉴定与筛选，食品添加剂保健功能的检测。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
通用方法和材料
1)动物模型的建立
(1)动物来源
Wistar大鼠，雌雄兼半，3周龄，清洁级，购自中科院上海生命科学院实验动物中心。
(2)饲料配方
基础饲料为购自中科院上海生命科学院实验动物中心的实验大鼠颗粒饲料，高脂饲料和高脂饲料+GBE50的饲料由中科院上海生命科学院实验动物中心饲料加工厂负责加工。
表1  各组饲料组成和比例
  饲料种类                           配比
  基础饲料高脂饲料高脂饲料+GBE50   蛋白质22.08％，脂肪5.3％，纤维素4.24％，灰份5.98％，钙1.21％，磷0.75％.，水8.8％基础饲料84.5％，胆酸钠0.5％，蛋黄粉10％，猪油5％高脂饲料99.95％，GBE 0.05％
(3)动物分组和处理.
大鼠稳定饲养观察一周后按下表进行分组实验，大鼠饲养温度保持在(22±2)℃，湿度保持在60％～80％，自由取食进水。自然光照及约12h的明暗周期。
表2  动物分组和处理
  #   分组   动物   处理方法
  IIIIIIIVV   正常对照组高脂模型组高脂+维生素D组高脂+GBE50组高脂+维生素D+GBE50组   ♀♂各10只♀♂各10只♀♂各10只♀♂各10只♀♂各10只   大鼠喂饲基础饲料17周大鼠喂饲高脂饲料17周大鼠喂饲高脂饲料13周后一次性大剂量腹腔注射维生素D60万单位大鼠喂饲高脂饲料17周大鼠喂饲高脂饲料13周后一次性大剂量腹腔注射维生素D600万单位，同时开始每天灌胃给预药物(100mg kg-1d-1)连续给药4周
(4)给药实验
预防给药实验：大鼠用高脂饲料和GBE均匀混合加工的饲料喂养30周，同时有正常饲料组、高脂饲料组和正常饲料加GBE组作为对照，观察GBE作为预防口服给药的疗效。
治疗给药实验：大鼠在高脂饲料喂饲26周后，一次性大剂量腹腔注射维生素D60万单位，诱导大鼠出现动脉粥样硬化病灶(见温进坤等，中国老年学杂志，2001年，21期，50-52页；Julia B.，J.等，Atherosclerosis，1996年，第122期，141-152页)同时开始为期四周的灌胃给药，剂量为50mgkg-1d-1，同时有正常饲料、高脂饲料加维生素D不给药组作为对照，观察GBE的治疗效果。
(5)病理学检测和分析
常规HE染色表明在高脂饲料组、高脂饲料+维生素D组均出现脂肪肝病灶，说明高脂饲料、高脂饲料加上一次性大剂量注射维生素D均能诱导大鼠出现脂肪肝病灶；施加维生素D组出现心冠状血管壁增生、胸主动脉血管壁增厚和钙盐沉积以及颈总动脉管腔变窄，说明维生素D能进一步使大鼠的胸主动脉血管、颈总动脉和心脏等器官出现病灶，经病理学诊断为动脉粥样硬化中期。
实施例1 GBE50的制备
GBE50购自上海杏灵科技药业股份有限公司(批号20030608)，其制备方法参照中国专利ZL99803683.8进行，符合国家药品监督管理局《国家药品标准WS3-227(Z-028)-2002(Z)》。
经测定，GBE50成分组成和比例如下：
银杏黄酮醇甙≥24％，银杏总黄酮≥44％，银杏总内酯≥6％，明确有效成份达50％，银杏酸≤5PPM。
实施例2 GBE50作用对血液中胆固醇含量的影响
按上海捷门生物技术合作公司产品提供的胆固醇测定试剂盒说明书进行测定。
表3  不同处理组大鼠血液中胆固醇含量的统计分析结果
  组别   测定指标：血中胆固醇含量(mol/L)
  正常对照组高脂饲料组高脂饲料+GBE50组高脂饲料+VD组高脂饲料+VD+GBE50组   1.64±0.062.13±0.02*1.86±0.112.52±0.13*1.92±0.03
*P＜0.01
大鼠血液中胆固醇含量测定数据经统计分析得到的结果表明喂饲高脂饲料组大鼠和喂饲高脂饲料加维生素D组大鼠的血液中胆固醇水平均显著高于正常对照组和用药组。高脂饲料加GBE50组大鼠和高脂饲料加维生素D加GBE50组大鼠与各自用药前组大鼠的血液中胆固醇水平相比较均显著下降(P＜0.01)，说明GBE50能降低高血脂大鼠血液中胆固醇含量。
另外，用GBE78也观察到类似地降低高血脂大鼠血液中胆固醇含量的作用。
实施例3 芯片检测法检测GBE对模型大鼠肝脏基因表达谱的影响
芯片检测
1)RNA质量
(1)琼脂糖胶电泳结果图像中28S和18S的亮度比例为2∶1。可以初步判定总RNA质量较好。
(2)经过Agilent 2100分析仪分析各实验组大鼠肝脏总RNA的质量，其28S与18S两个峰的面积之均比大于或等于2，RNA质量符合进一步实验的要求。
2)cDNA探针制备和纯化
按照上海生物芯片公司提供的SBC Rat cDNA V1.3芯片检测所附带的实验步骤进行操作。
3)芯片杂交
(1)芯片检测方案
选取雄性大鼠各组肝脏RNA按表4实验方案进行芯片检测。
(2)用SBC Rat cDNA V1.3芯片进行检测，按芯片生产商所附实验操作步骤进行杂交和扫描分析。
表4  芯片检测实验方案
  编号 实验目的 RNA来源 Cy3 Cy5   芯片数量
  1 个体差异基因筛选 I♂正常对照组大鼠肝脏I♂-LMIX正常对照组大鼠肝脏的等量混合   I♂-1L   I♂-LMIX   3
  I♂-21L   I♂-LMIX   3
  I♂-31L   I♂-LMIX   3
  I♂-4L   I♂-LMIX   3
  I♂-5L   I♂-LMIX   3
2 高脂饲料处理大鼠对肝脏基因表达谱的影响 II♂高脂饲料组大鼠肝脏I♂-LMIX正常对照组大鼠肝脏的等量混合   II♂-1L   I♂-LMIX   3
  II♂-2L   I♂-LMIX   3
  II♂-3L   I♂-LMIX   3
  II♂-4L   I♂-LMIX   3
  II♂-5L   I♂-LMIX   3
  3 高脂饲料+VD处理大鼠对肝脏基因表达谱的影响 III♂高脂饲料+VD组大鼠肝脏I♂-LMIX正常对照组大鼠肝脏的等量混合   III♂-1L   I♂-LMIX   3
  III♂-2L   I♂-LMIX   3
  III♂-3L   I♂-LMIX   3
  III♂-4L   I♂-LMIX   3
  III♂-5L   I♂-LMIX   3
  4 高脂饲料+GBE50处理大鼠对肝脏基因表达谱的影响 VI♂高脂饲料+GBE50组大鼠肝脏I♂-LMIX正常对照组大鼠肝脏的等量混合   VI♂-1L   I♂-LMIX   3
  VI♂-2L   I♂-LMIX   3
  VI♂-3L   I♂-LMIX   3
  VI♂-4L   I♂-LMIX   3
  VI♂-5L   I♂-LMIX   3
  5 高脂饲料+VD+GBE50处理大鼠对肝脏基因表达谱的影响 V♂：高脂饲料+VD+GBE50组大鼠肝脏I♂-LMIX：正常对照组大鼠肝脏的等量混合   V♂-1L   I♂-LMIX   3
  V♂-2L   I♂-LMIX   3
  V♂-3L   I♂-LMIX   3
  V♂-4L   I♂-LMIX   3
  V♂-5L   I♂-LMIX   3
数据分析
Agilent扫描仪扫描芯片。所得到的图像为两种荧光的复合图，经TiffSplit软件分割成单色荧光图像。将图像导入图像分析软件Imagene 5.0，经过自动和人工定位与排列，确定杂交点的范围，过滤背景噪音，提取得到基因表达的荧光信号强度值，最后以列表形式输出，从而完成将扫描得到的图像定量转化为数值。输出的数据导入分析软件Genespring，用LOWESS方法标准化，计算得到ratio值(两种荧光cy3与cy5的比值)。SAM(SignificanceAnalysis of Microarrays)软件对各组微矩阵数据组进行分析。通过对个体差异组芯片数据的分析，剔除在不同正常大鼠肝脏中RNA表达量发生上下调变化的基因(ratio值＜0.5，ratio值＞2)，即个体差异基因，再对其他基因进行差异表达筛选和聚类分析，发现肝脏中胆汁酸生物合成的关键酶基因Cyp7a1在用GBE50处理组的ratio值分别为0.254和0.345，即GBE50下调该基因表达水平，而在高脂饲料组和高脂饲料+VD组都未发生表达水平变化(如表5所示)。
表5  不同处理大鼠组肝脏中Cyp7a1经芯片得到的ratio值
  基因名称   基因登记号 功能注释   个体差异组   高脂饲料组   高脂饲料+VD组   高脂饲料+GBE50组  高脂饲料+VD+GBE50组
Cyp7a1   NM_012942   胆汁酸生物合成的限速酶 1.283 0.916 1.300 0.254 0.345
实施例4 荧光定量PCR验证GBE对模型大鼠肝脏基因表达谱的影响
对与胆固醇合成、代谢和转运相关的基因在不同处理组中的mRNA水平进行定量PCR验证，用大鼠的三磷酸甘油醛脱氢酶基因(Gapd)做对照，不同处理组与正常组进行比较，验证基因信息(见表6)和不同处理组与正常组比值结果(见表7)如下：
表6  定量PCR验证基因信息表
  基因名称   基因登记号   上游引物序列(5’-3’)   下游引物序列(5’-3’)
  Gapd   NM_017008   1294TCCTGCACCACCAACTGCTTAG   1395AGTGGCAGTGATGGCATGGACT
  Cyp7a1   NM_012942   1015GCTCTGGAGGGAGTGCCAT   1115GGATGCACTGGAAAGCCTCA
  Hmgcr   NM_013134   2422ACATCAGCTGTACCATGCCG   2524GCCCCTTGAACACCTAGCATC
  Ldlr   NM_175762   2145AAACTGGTGTGAGGCAACGG   2248GGCAAGCGCAGGTGAACTT
  Lcat   NM_017024   1202TCCGCATGAATGGGACAGAT   1303TAGGAGTGCCATGCGGGTAG
  Nr1h2   NM_031626   1117GCATCCACCATCGAGATCATG   1250ATGAACTCCACCTGCAAGCCT
  Nr1h3   NM_031627   1133TGCAGGACCAGCTCCAAGTAG   1233TGGGAACATCAGTCGGTCGT
  Nr1h4   NM_021745   1133CAGTCGAGGCCATGTTCCTT   1234AGATGCCGCTCTTTCGAATTC
  Ppara   NM_013196   879CACAATGCAATCCGTTTTGG   988TTGAGGTCTGCAGTTTCCGA
  Ppard   NM_013141   1190CCCATGAGTTCTTGCGCAGTA   1323CAGAATGATGGCGGCAATG
  Pparg   NM_013124   538CGAAGAACCATCCGATTGAAG   680CCAAACCTGATGGCATTGTGA
  Rxra   NM_012805   1103GCTGCTGATTGCCTCCTTCT   1203CAGCACTGTGAGCGCTGTTC
  Rxrb   NM_206849   913AATGAGCTCCTCATTGCGTCC   1018CTGCAGAATGGGCTGAGTTTC
  Rxrg   NM_031765   1416AAGGTTTATGCCACCCTCGAG   1525TTCAATCCAATGGAGCGCA
  Acat1   NM_017075   607ACACCGCGAAGAAGCTGAGTA   723TGGGCGTAATCTCATTTGCA
  Acat2   NM_009338   913AATGAGCTCCTCATTGCGTCC   639TGGCCAGCTTTCTGAGCAT
  Acatn   NM_022252   1416AAGGTTTATGCCACCCTCGAG   940TAACGATTCCCCTGGGTTGAG
表7  荧光定量PCR验证结果
  基因名称  基因登记号 基因产物 高脂饲料组   高脂饲料+GBE50组   高脂饲料+VD组   高脂饲料+VD+GBE50组
Cyp7a1 NM_012942   生物合成胆汁酸的限速酶 1.371±0.033 0.323±0.001** 0.815±0.255 0.314±0.021**
Hmgcr NM_013134   生物合成胆固醇的限速酶 0.518±0.114 0.321±0.054** 1.031±0.461 0.269±0.051**
  Ldlr  NM_175762   低密度酯蛋白受体   1.116±0.111   0.892±0.220   1.761±0.072   0.473±0.055*
Lcat NM_017024   卵磷脂-胆固醇酰基转移酶 1.508±0.201 0.871±0.051 1.025±0.024 1.277±0.178
  Nr1h2  NM_031626   β型肝脏X受体   2.255±0.529   1.545±0.060   1.961±0.028   2.073±0.405
  Nr1h3  NM_031627   α型肝脏X受体   1.106±0.118   0.983±0.171   1.711±0.208   0.660±0.008
  Nr1h4  NM_021745   法呢醇X受体   1.201±0.003   1.365±0.264   1.615±0.005   0.912±0.134
Ppara NM_013196   超氧化物酶体增生因子激活的受体α 1.124±0.006 0.940±0.045 1.925±0.062 1.116±0.134
Ppard NM_013141   超氧化物酶体增生因子激活的受体β 2.330±0.127   5.492±0.226*** 5.481±0.280   9.918±0.236***
Pparg NM_013124   超氧化物酶体增生因子激活的受体γ 1.651±0.111 1.600±0.083 1.709±0.188 1.221±0.131
  Rxra  NM_012805   视黄醇类受体α   2.054±0.085*   1.425±0.036   2.858±0.296*   1.850±0.097
Rxrb NM_206849 视黄醇类受体β 7.188±.053 2.457±.121** 8.946±0.095   13.61±0.511***
  Rxrg  NM_031765   视黄醇类受体γ   1.588±0.201   1.173±0.040   1.067±0.381   0.801±0.069
Acat1 NM_017075   乙酰辅酶A-胆固醇酰基转移酶1 1.642±0.112 1.596±0.153 1.472±0.112 1.540±0.150
Acat2 NM_009338   乙酰辅酶A-胆固醇酰基转移酶2 0.892±0.095 1.037±0.196 1.026±0.050 0.951±0.057
Acatn NM_022252   乙酰辅酶A-胆固醇酰基转移体 1.655±0.140 1.020±0.022 1.616±0.332 1.428±0.188
*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.001
表6中用定量PCR方法对一系列基因在各处理组大鼠肝脏中mRNA水平验证统计结果分析表明：
(1)高脂饲料+GBE50组和高脂饲料+VD+GBE50组与正常组相比较Cyp7a1，Hmgcr基因的表达量都显著降低(P＜0.01)，而高脂饲料组和高脂饲料+VD组与正常对照组相比较Cyp7a1，Hmgcr基因的表达量无显著差异；
(2)四种不同处理组与正常组相比较，视黄醇类受体(RXR)α、β和γ三种亚型中RXR-β亚型Rxrb基因的表达量都显著增加，在高脂饲料+VD+GBE50组显著高于高脂饲料+VD组，而在高脂饲料组则显著低于高脂饲料+GBE50组，因为RXR受体的转录同时受外来的和体内代谢的刺激物的调节，如9-顺式视黄酸和药物(见R.Fraydoon等Current Opinion in Structure Bio1ogy，2001年，第11期，33-38页)。
(3)肝脏X受体(LXR)α型和β型基因Nr1h2和Nr1h3在各组都有表达且均无显著差异；法呢醇X受体(FXR)基因Nr1h4在各组都有表达且均无显著差异；
(4)低密度脂蛋白受体基因Ldlr在高脂饲料+VD+GBE50组相对表达量显著低于高脂饲料+VD组；
(5)卵磷脂-胆固醇酰基转移酶基因Lcat、乙酰辅酶A-胆固醇酰基转移酶基因Acat1、Acat2和Acatn在各组均无显著差异，说明GBE50不影响这些基因的转录水平。
(6)过氧化物酶体增生物活化受体基因(Ppar)中的Ppard基因表达量在高脂饲料+GBE50组和高脂饲料+VD+GBE50组中均可见极显著的提高。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种银杏叶提取物在制备降胆固醇组合物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的银杏叶提取物中含有5-50％的银杏叶黄酮类物质、1-10％银杏叶内酯类物质。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的银杏叶提取物具有以下指纹图谱的特征峰：黄酮醇苷、芦丁、莽草酸、花青素类、儿茶素类、黄烷类化合物。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的提取物为银杏酮酯、银杏叶标准提取物、或其组合。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物的剂型是片剂、胶囊、液体胶囊、颗粒剂、滴丸、口服液、粉针剂、冻干粉、注射液。
在另一优选例中，所述的组合物含有选自他汀类药物或抑制素类药物的物质。
在另一优选例中，所述的他汀类药物或抑制素类药物分别选自：阿托伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀和利匹妥。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于(a)降低胆固醇7α-羟化酶基因(Cyp7a1)的表达；(b)降低羟-3-甲基戊二酸甲酰辅酶基因(Hmgcr)的表达；(c)促进过氧化物酶体增生物活化受体基因(Ppar)的表达；或(d)促进视黄醇类受体基因(Rxr)的表达。
在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物或保健品组合物。
7.一种银杏叶提取物的用途，其特征在于，它被用于制备：(a)降低胆固醇7α-羟化酶基因(Cyp7a1)的表达的组合物；(b)降低羟-3-甲基戊二酸甲酰辅酶基因(Hmgcr)表达的组合物；(c)促进过氧化物酶体增生物活化受体基因(Ppar)的表达组合物；(d)促进视黄醇类受体基因(Rxr)表达的组合物；或(e)调节上述四种基因共同或任意组合的表达的组合物。
8.一组在基因水平和蛋白水平发生改变的基因表达变化的用途，其特征在于，用作胆固醇水平调节的指示指标，所述的基因表达选自下组：
(a)胆固醇7α-羟化酶基因(Cyp7a1)的表达的变化；
(b)羟-3-甲基戊二酸甲酰辅酶基因(Hmgcr)表达的变化；
(c)视黄醇类受体基因(Rxr)表达的变化；
(d)过氧化物酶体增生物活化受体(PPAR)的变化；
或(e)上述基因变化的组合。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述基因表达变化选自下组：
(a)胆固醇7α-羟化酶基因(Cyp7a1)的表达的下降；
(b)羟-3-甲基戊二酸甲酰辅酶基因(Hmgcr)表达的下降；
(c)视黄醇类受体基因(Rxr)表达的上升；
(d)过氧化物酶体增生物活化受体(PPAR)的上升；
这些基因的表达水平的变化及其组合，可以影响体内的胆固醇的水平。
10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，这些基因的表达水平变化及其组合，作为提示服用或使用药物、制剂、化学试剂、保健品后的对胆固醇水平调节的指示指标。
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