CN1953987B - 在乳酸克鲁维酵母中构建和应用基本上缺少大肠杆菌转录能力的乳酸克鲁维酵母启动子变体的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了涉及在酵母中产生重组蛋白的方法和组合物。描述了修饰的PLAC4，其中一个或多个突变可以被引入启动子的Pribnow盒样序列中。当在载体中置于目标基因的上游时，修饰的启动子导致目标基因在转化的细菌中的表达显著减少，但是在酵母中产生目标基因的有效表达。

Description

在乳酸克鲁维酵母中构建和应用基本上缺少大肠杆菌转录能力的乳酸克鲁维酵母启动子变体的方法
发明背景
 数十年来，在食品和乳制品工业中，芽殖酵母乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)(K.lactis)已经广泛用于在工业规模水平生产重组蛋白，其理由包含下述因素：(i)乳酸克鲁维酵母的许多菌株在培养物中生长迅速，并生长至极高的细胞密度；(ii)乳酸克鲁维酵母有效地引导蛋白分泌到培养基中；和(iii)乳酸克鲁维酵母具有GRAS(普遍认为安全(GenerallyRegarded AsSafe))FDA资格，这允许其被用于食品、农业和健康相关的应用中。
 典型的乳酸克鲁维酵母异源蛋白生产策略涉及将想要的蛋白从细胞分泌到生长培养基中。该方法相比细胞内表达方法具有许多优点：(i)产生的蛋白相当纯，这是因为乳酸克鲁维酵母分泌相对极少量的内源蛋白；(ii)仅对分泌的真核蛋白进行翻译后蛋白修饰是可行的；和(iii)可以设计从持续生长的细胞的培养基收获蛋白的策略。
 适合在乳酸克鲁维酵母中指导高水平的转录的强酵母启动子是乳酸克鲁维酵母LAC4启动子(PLAC4)(Dickson，et al.Cell 15∶123-130(1978)；Dickson，R.C.，和M.I.Riley，Biotechnology 13∶19-40(1989)；Dickson，et al.Mol.Cel.Biol.]∶1048-1056(1981))。该启动子天然地引发编码高水平表达的乳糖酶(β-半乳糖苷酶)的LAC4基因的表达。作为对生长培养基中存在的乳糖或半乳糖的响应，LAC4的转录水平被提高，其中乳糖酶使得细胞能将乳糖转化为可发酵的糖。利用PLAC4表达异源蛋白可以在酵母发酵中获得100mg L-1以上的分泌的重组蛋白这样的水平。
 不幸地是，它除了能在乳酸克鲁维酵母中充当强启动子的作用外，PLAC4在大肠杆菌(E.coli)细胞中作为组成型启动子促进基因表达。当在导入到酵母细胞之前试图装配含有编码对大肠杆菌有毒性的蛋白的基因的DNA构建物时，这尤其可能成为问题。Gibbs等(FEMSYeastResearch 4：573-577(2004))已经报道过解决该问题的一个方法，他们在穿梭载体中利用酵母内含子。不幸的是，这种修饰破坏了一些但不是所有的潜在毒性重组蛋白的功能性表达。
发明概述
 在本发明的一个实施方案中，提供了在酵母细胞中产生重组蛋白的方法，包括下述步骤：获得载体，在所述载体中已经***有编码目标蛋白的基因以及修饰的PLAC4，其中，所述修饰导致在细菌中的基因表达的显著降低，所述细菌的例子为大肠杆菌；用所述载体转化酵母细胞，所述酵母细胞的例子为乳酸克鲁维酵母；和在所述酵母细胞中产生有效数量的重组蛋白。在某些实施方案中，至少50％、更特别地至少70％、更特别地至少90％的转化的酵母细胞表达重组蛋白。在本发明的一个实施方案中，在酵母中产生的有效数量的重组蛋白基本上类似于在未修饰的PLAC4启动子的控制下由重组基因表达的蛋白的量。
 在该方法中的修饰的PLAC4可以任选地在一个或多个Pribnow盒-样序列(Pribnow box-like sequences)中包含有突变，例如在PBI、PBII和PBIII中，更特别地在对应于核苷酸-198至-212的启动子第一区域，或在对应于核苷酸-133至-146的启动子第二区域中包含有突变。在某些实施方案中，修饰的PLAC4含有在启动子第一区域的一个或多个突变，也含有在启动子第二区域的一个或多个突变。在本发明进一步的实施方案中，在修饰的PLAC4中的核苷酸-1至-283被来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的磷酸甘油酸激酶启动子(PGK1)的核苷酸-1至-283替换。
 载体在转化的酵母细胞中可以是附加体型质粒或整合型质粒。载体含有修饰的PLAC4启动子和任选地含有PLAC4终止子。此外，载体可以包括编码至少一种酵母分泌信号肽诸如乳酸克鲁维酵母α-交配因子(K1α-MF)分泌信号肽的DNA序列，还可以包括选择性标记诸如构巢曲霉乙酰胺酶(amdS)选择性标记基因，或用于***编码重组蛋白的基因的多克隆位点。
 用上述载体转化的细胞可以包括宿主酵母细胞和/或宿主细菌细胞。
 在本发明的一个实施方案中，提供了包括上述载体和任选地包括感受态酵母细胞以及使用说明书的试剂盒。
 本发明的一个实施方案提供了修饰的PLAC4Pribnow盒，其中TTATCATTGT(SEQ ID NO：22)被修饰成AGAACAGAGA(SEQ ID NO：23)，和/或TATTATTCT被修饰成GAGAGCTCT。
附图说明
 图1显示了大肠杆菌/乳酸克鲁维酵母整合型表达载体pGBN1。
 基因被克隆入多克隆位点(MCS)，与酿酒酵母α-交配因子分泌前导序列(Sc α-MF)处于相同的翻译阅读框中。转录分别由PLAC4和LAC4转录终止子序列(TTLAC4)起始和终止。酿酒酵母ADH1启动子(PADH1)驱动在酵母中赋予对G418的抗性的细菌基因的表达。大肠杆菌载体序列已被***PLAC4中独特的SacII位点，使得能在大肠杆菌中增殖。通过用SacII或BstXI消化使载体线性化，以便整合入乳酸克鲁维酵母染色体的LAC4启动子基因座。
 图2显示了PLAC4中的Pribnow盒样序列，和PLAC4变体表达载体的构建。
 图2A显示了Pribnow盒样序列PBI和PBII和PBIII(SEQ IDNOS：1和2)，其位置相对于与PLAC4相关的主要和次要大肠杆菌转录起始位点，并与Pribnow盒共有序列TATAAT形成比对。与该共有序列相对应的核苷酸用框框起来。
 图2B显示了含有PLAC4变体的表达载体。大肠杆菌主要和次要转录起始位点的大约位置显示在pGBN1的示意图上。对于每种构建物，都显示了半乳糖应答元件，上游激动子序列(UAS)UASI和II的大约位置。已被PGK1启动子的片段替代的PLAC4DNA区域用黑色显示。在质粒pGBN1PBI和pGBNIpBII-PBIII的PLAC4DNA的Pribnow盒样序列中的突变碱基用在每一碱基上面的黑点示出(SEQ ID NOS：3和4)。所有编号的位置都是相对于Scα-MF分泌前导序列的ATG起始密码子的腺嘌呤而言，该腺嘌呤被指定为位置+1。
 图3显示了绿色荧光蛋白(GFP)在大肠杆菌中和人血清白蛋白(HSA)在乳酸克鲁维酵母中的PLAC4变体表达。
 图3A显示了克隆在各种PLAC4变体中的每一种变体的下游的GFP。用SDS-PAGE分离来自携带各种表达构建物的大肠杆菌的裂解物的蛋白，并通过Western分析检测GFP。
 泳道1：pGBN1，用作阴性对照。裂解物来自含有空的pGBN1质粒的细菌。
 泳道2：pGBN1/PLAc4，用作第二对照，含有未修饰的PLAC4；
 泳道3-6：来自用pGBN1转化的大肠杆菌的裂解物，其中PLAC4已经用PPGK 1、P杂合、PLAC4-PBI和PLAC4-PBII-PBIII替代。
 图3B显示了克隆在各种PLAC4下游的HSA，用于在乳酸克鲁维酵母细胞中表达。用SDS-PAGE(4-20％丙烯酰胺)和考马斯染色，分析在含有各种整合的HSA表达载体的乳酸克鲁维酵母细胞株的消耗培养基(spent culture medium)中的分泌蛋白。HSA在胶上跑出单条带，表观质量为66kDa。
 泳道1：来自含有整合入染色体的空pGBN1的酵母菌株的消耗培养基，作为阴性对照；
 泳道2-6：来自乳酸克鲁维酵母的消耗培养基，该乳酸克鲁维酵母用pGBNILAc4-HSA/PLAc4、pGBNIPGKI-HSA/PPGK1、pGBNI杂合-HSA/P杂合、pGBNILAC4-PBI-HSA/PLAc4-PBI和pGBNILAC4-PBII-PBIII-HSA/PLAc4-PBII-PBIII转化。
 图4显示了pKLAC1，大肠杆菌/乳酸克鲁维酵母整合型表达载体。pKLAC1载体(GenBank登记号AY968582)的构建类似于pGBN1，具有下述变化：(i)基因被克隆入多克隆位点中，与天然K1α-MF前导序列处于相同的翻译阅读框中；和(ii)由PLAC4-PBI变体启动在乳酸克鲁维酵母中的表达。PADH1引发乙酰胺酶选择性标记(amdS)基因的表达，以便通过在乙酰胺培养基上的生长来选择转化子。
 图5显示了乳酸克鲁维酵母细胞的消耗培养基中分泌的肠激酶的活性，该乳酸克鲁维酵母细胞含有整合的pKLAC1-EKL(编码肠激酶催化亚基的基因)。将七个含有pKLAC1-EKL的乳酸克鲁维酵母细胞株和野生型GG799细胞在YPGa1培养基中培养48小时。通过测量荧光肽随时间而变化的切割情况，分析澄清的消耗培养基的肠激酶活性。KLEK-S1和KLEK-S4是两个含有多拷贝的整合pKLAC1-EKL的细胞株，这是由Southern分析测定的。所有其他细胞株含有单个拷贝的整合pKLAC1-EKL。
发明详述
 功能性穿梭载体允许被克隆的基因在被导入酵母细胞进行表达之前在细菌中增殖。然而，在细菌宿主细胞诸如大肠杆菌中由在PLAC4控制之下的基因偶然表达的蛋白，可能不利地影响利用强PLAC4的酵母表达***。该启动子活性可能干扰基因的克隆效率，所述基因的翻译产物对细菌有潜在害处。
 在PLAC4中的两核苷酸序列与细菌Pribnow盒转录元件共有序列TATAAT非常相似。这些序列位于转录起始位置上游大约10个核苷酸的地方，并与大肠杆菌中的主要转录起始位置和次要转录起始位置相临，且在它们上游(Dickson et al.Biotechnology 13∶19-40(1989))。特别地，这些序列位于主要转录体的-204至-209处，次要转录体的-144至-136处(参见图2A框中的序列)。
 与大肠杆菌表达乳酸克鲁维酵母PLAC4相关的两种RNA转录体的起始位点已经进行了作图，它们相对于天然LAC4基因的ATG起始密码子中的腺嘌呤核苷酸而言，位于-196bp(主要大肠杆菌转录体的起始)和-127bp(次要大肠杆菌转录体的起始)(Dickson et al.1989)。
 携带有突变的Pribnow盒样序列的PLAC4变体可以通过定点诱变产生，其基本上保留它们在乳酸克鲁维酵母中充当强启动子的能力，保留的程度类似于未突变的Pribnow盒样序列的能力。携带有突变的Pribnow盒样序列的PLAC4变体可以在克鲁维酵母属各种的其他酵母菌株中，以及酵母属(Saccharomyces)各种、毕赤酵母属(Pichia)各种、汉逊酵母属(Hansenula)各种、Yarrowia各种、脉孢菌属(Neurospora)各种、曲霉属(Aspergillus)各种、青霉属(Penicillium)各种、假丝酵母属(Candida)各种、裂殖酵母菌属(Schizosaccharomyces)各种、隐球酵母属(Cryptococcus)各种、鬼伞属(Coprinus)各种、黑粉菌属(Ustilago)各种、Magnaporth各种和木霉菌属(trichoderma)各种中保留强启动子活性。基于本领域的知识，即DNA序列对于启动子强度具有决定性意义，可以期望一些突变体将比使用野生型PLAC4的类似条件产生更多数量的蛋白。在这里，突变是指下述任何突变：在DNA序列中置换、删除或添加一个或多个核苷酸。
 在本发明的一个实施方案中，真菌表达宿主是酵母乳酸克鲁维酵母，细菌宿主是大肠杆菌，一系列的PLAC4变体已经通过三个DNA序列(PBI、PBII和PBIII)的靶向诱变而产生，这三个DNA序列类似于细菌启动子大肠杆菌Pribnow盒元件，并且紧接着位于与PLAC4相关的两大肠杆菌转录起始位置的上游。在这些例子中，PLAC4中的突变位于下述区域：(a)在启动子的-198至-212区域(图2B)，例如在位置-201、-203、-204、-207、-209和-210。这些突变基本上不干扰启动子在乳酸克鲁维酵母中充当强启动子的能力；(b)启动子的-133至-146区域，例如在位置-139、-140、-141、-142和-144，其基本上不干扰强启动子活性；或(c)-198至-212和-133至-146区域。在进一步的实施方案中，产生杂合启动子，该启动子由替换乳酸克鲁维酵母PLAC4的-1至-283区域的酿酒酵母(Sc)PGKI启动子的283bp(-1至-283)组成(图2B)。
 在乳酸克鲁维酵母中，更一般地在酵母中，过量表达蛋白，涉及构建含有DNA片段的穿梭载体，该DNA片段带有适于在感兴趣的基因被导入酵母宿主之后指导该感兴趣的基因高水平转录的序列。该载体应该含有下述中的至少一个或多个：(i)强酵母启动子；(ii)编码分泌前导序列的DNA(如果需要将蛋白分泌到培养基中)；(iii)编码待表达的蛋白的基因；(iv)转录终止序列；和(v)酵母-选择性标记基因。这些序列成分通常在大肠杆菌中以质粒载体形式被装配，然后转移到酵母细胞中，以产生蛋白。
 当存在于整合型质粒或附加体型质粒诸如基于pKD1的载体、含2micron的载体和着丝粒载体上时，PLAC4能够充当强启动子用于在酵母中的蛋白质表达。分泌型前导序列(如果需要将蛋白分泌入培养基)可以包括Sc α-MF前-原分泌前导肽(pre-pro secretion leaderpeptide)，其已克隆为HindIII/XhoI片段。也可以使用其他的原核或真核分泌信号肽(例如乳酸克鲁维酵母α-交配因子前-原分泌信号肽，乳酸克鲁维酵母杀伤毒素信号肽)或合成的分泌信号肽。可选择地，可以完全从载体中省去分泌前导序列，以获得期望的蛋白的细胞内表达。
 转录终止子序列的例子是TTLAc4。
 酵母-选择性标记基因例如可以是G418或amdS基因。在转化的酵母细胞中乙酰胺酶的表达使得它们能够生长在缺少简单氮源但是含有乙酰胺的培养基中。乙酰胺酶降解乙酰胺为氨，氨可以被细胞作为氮源利用。该选择方法的益处是它富集细胞转化子群体，这些细胞已经包含有多个串联整合的基于pKLAC1的表达载体，并产生比单个整合更多的重组蛋白(图5)。
 上述PLAC4突变体已经被整合入大肠杆菌/乳酸克鲁维酵母整合型穿梭载体，例如pGBN1和pKLAC1，分别如图1和4所述，其在转化感受态宿主细胞后整合入乳酸克鲁维酵母基因组，并且随后指导蛋白表达。
 在本发明的实施方案中，在用基于pKLAC1的构建物转化乳酸克鲁维酵母之后，在乙酰胺板上形成的至少50％，更特别地至少70％，优选地至少90％的转化子，表达外来蛋白，例如HSA或大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)、毒性蛋白酶肠激酶、鼠运甲状腺素蛋白、来自海洋生物的毒性胶蛋白和细菌纤维素酶。这些例子不是限制性的。该***对于置于突变的PLAC4下游的任何蛋白编码基因都有用处。
 针对若干不同的蛋白，测定了在PLAC4和其突变体下的蛋白表达水平。例如，PBI的突变使报告蛋白(GFP)的细菌表达降低-87％，而PBII和PBIII的突变对GFP在细菌宿主细胞中的表达影响很小。剔除所有三种序列完全消除了GFP在细菌宿主细胞中表达。对于HSA，实施例和图3b显示，当由野生型或者突变型PLAC4表达时，大约50mg L-1的HSA被乳酸克鲁维酵母分泌。
 上面和下面引用的文献和2004年4月8日提交的美国临时申请序列号60/560，418并入本文，作为参考。
实施例
酵母菌株、转化和培养条件
 原养型乳酸克鲁维酵母菌株GG799(MAT α[pGK11+])在30℃，以常规的方式生长并维持在YPD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)中。在转化GG799细胞之前，通过SacII消化，将1μg含有感兴趣的基因的基于pGBN1或pKLAC1的表达载体线性化。根据供应商的指导，将线性化的表达载体用于以整合的方式转化商业上获得的感受态乳酸克鲁维酵母GG799细胞(New England Biolabs，Beverly，MA)。通过在30℃，在含有200μg G418ml-1(Sigma，St.Louis，MO)的YPD琼脂板上培养2-3天，选择用pGBN1、pGBN1PGK1、pGBN1杂合、pGBN1PBI或pGBN1PBII-PBIII载体转化的细胞集落。通过在30℃，在含有1.17％酵母碳基(New England Biolabs，Beverly，MA)、5mM乙酰胺(New England Biolabs，Beverly，MA)和30mM磷酸钠缓冲液pH 7的琼脂板上培养4-5天，选择用基于pKLAC1的载体转化的细胞集落。在30℃，将表达异源基因的乳酸克鲁维酵母菌株在含有2％半乳糖(YPGal)的YP培养基中培养48-96小时。
聚合酶链式反应
 用于本研究的引物列于表1中。用高保真的DeepVentTm DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)进行PCR扩增。典型的PCR混合物含有0.2mM dNTPs、0.5μg的每种引物、1×Thermopol缓冲液(New England Biolabs，MA)和100ng模板DNA，总反应体积为100μl。热循环通常由下述组成：95℃“热启动”5分钟，然后进行30个循环的连续温育：94℃30秒、58℃30秒和72℃(每kb的DNA为1分钟)。
热循环之后，最后在72℃延伸10分钟。
在pGBN1中构建乳酸克鲁维酵母PLAC4变体
 所有启动子变体衍生自存在于整合型表达载体pGBN1中的野生型PLAC4，所述pGBN1为乳酸克鲁维酵母/大肠杆菌穿梭载体，其含有2317bp的PLAC4DNA，被划分为1663和654bp的片段，它们通过pUC19质粒DNA分隔开(图1)。该划分发生在被SacII识别的独特的限制性位点上。2830bp的pUC19载体DNA序列被***该独特的限制性位点。这允许在用SacII或BstXI消化，并导入酵母细胞之后，将表达载体整合入乳酸克鲁维酵母染色体中的天然LAC4基因座的启动子区域。此外，可以将指导载体整合入乳酸克鲁维酵母染色体中除LAC4外的其他位置的乳酸克鲁维酵母DNA***载体中。含有细菌复制起点和选择性标记基因的任何DNA可以用于代替pUC19DNA序列。野生型PLAC4序列，或克隆入pGBN1的任何PLAC4突变体或杂合子的位置在紧接着分泌前导序列的编码区域的上游。
 此外，pGBN1含有编码Sc α-MF前-原结构域的DNA，其在紧接着PLAC4的下游，用于引导异源表达的蛋白的分泌。最后，pGBN1携带由PADH1表达的遗传霉素(geneticin)(G418)抗性基因，用于在酵母中进行显性选择。为了产生质粒pGBN1PGK1，将含有酿酒酵母PGK1启动子488个碱基对的PmlI/HindIII片段克隆到质粒pGBN1的HpaI/HindIII位点，以替代天然PLAC4的1067个碱基对(图2B)。使用质粒pGBN1PGK1作为模板，使用引物P1和引物P2扩增酿酒酵母PGK1启动子的283个碱基对。将283bp的片段克隆入质粒pGBN1的SnaBI/HindIII位点，以产生质粒pGBN1杂合。引物P3被设计用于将突变引入推定的Pribnow盒样序列(PBI)，该序列位于大肠杆菌主要转录起始位点的上游，如图2B详细示出的。使用质粒pGBN1作为模板，使用引物P2和P3扩增PBI中含有突变的PLAC4片段。使用引物P2和P4，由该初始PCR获得的扩增的DNA用作第二次PCR的模板。将最终的DNA产物克隆入质粒pGBN1的SnaBI/HindIII位点，以产生质粒pGBN1PBI。使用互补引物P5和P6，使用PCR编织方法(PCR knittingmethod)来突变PBII和PBIII序列(图2B)，PBII和PBIII序列位于大肠杆菌次要转录起始位点的上游。引物P2和P5，以及引物P4和P6分别用于扩增586bp和160bp突变的PLAC4DNA片段。每一扩增DNA产物用QiaQuickTM PCR纯化旋转柱层析(Qiagen，Valencia，CA)纯化，合并用作第二扩增反应的模板，该第二扩增反应含有引物P2和P4。将含有诱变的PBII和PBIII位点的扩增的PLAC4DNA片段克隆入质粒pGBN1的SnaBI/Hind III位点，产生质粒pGBN1PBII-PBIII。
PLAc4中Pribnow盒样序列的靶向诱变
 产生一系列的四个PLAC4变体，通过在PBI和PBII/PBIII中进行替换或引入点突变，来消除PLAC4的大肠杆菌启动子活性，如图2B中所示。
 (i)载体pGBN1PGK1整合了485bp的酿酒酵母PGK1启动子(PPGK1)，替换了1067bp的天然PLAC4，从而除去了两个半乳糖应答性上游激活序列(UASI和UASII)和所有三个Pribnow盒样序列。
 (ii)载体pGBN1杂合整合了PPGK1的3＇端的283bp，替换了包含PLAC4的3＇端的283bp，从而剔除所有三个Pribnow盒样序列，但是留下了完整的两个UAS序列。
 (iii)载体pGBN1PBI含有6点突变，其除掉了PLAC4的核苷酸-204和-209之间的PBI的Pribnow共有序列。
 (iv)载体PGBN1PBII-PBIII含有5点突变，其除掉了PLAC4的核苷酸-136和-144之间的PBII和PBIII的Pribnow共有序列。
GFP在大肠杆菌中克隆和表达分析
 使用质粒pGFPuv(Clontech，Palo Alto，CA)作为模板，用引物P7和P8经PCR扩增GFP。将扩增的GFP与α-MF前-原结构域按同一阅读框，克隆入各种pGBN载体(参见上面部分)的BglII/NotI位点。由50ml过夜培养物，制备含有各种pGBN-GFP构建物的细菌的裂解物，所述过夜培养物于30℃培养在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。离心培养物，将细胞沉淀在干冰上冷冻，在室温下融解，并重新悬浮于10μl的裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，含有50mM NaCI、1mM EDTA)中。使用SonicatorTM(Heat Systems-Ultrasonics，Plainview，NY)在设置为7时破碎细胞15秒，以15,000×g离心10分钟，除去细胞残骸。通过测量其在280nm处的吸光率，测定每一裂解物的蛋白浓度。在Tris-甘氨酸10-20％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离每一裂解物中的蛋白(100μg)，并转移到硝化纤维上，在含有0.05％Tween 20(PBS-T)和5％脱脂牛奶(w/v)的磷酸盐缓冲盐水中，在4℃，封闭过夜。用以1∶1000稀释在含有5％脱脂牛奶的PBS-T中的抗-GFP单克隆抗体(Clontech，Palo Alto，CA)探查印迹，然后用以1∶2000稀释在含5％脱脂牛奶的PBS-T中的辣根过氧化物酶偶联的抗鼠二次抗体(KPL，Gaithersberg，MD)温育。用LumiGlo检测试剂(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)检测蛋白-抗体复合物。使用分子成像仪FX(BioRad，Hercules，CA)和Quantity One软件，通过光密度测定法测量大肠杆菌中产生的GFP的量。
 测试每一PLAC4变体驱动大肠杆菌表达编码GFP的报告基因的能力，该报告基因与酿酒酵母α-交配因子前-原结构域一起以同一阅读框内的方式克隆入每种pGBN载体。通过Western分析方法分析大肠杆菌裂解物中存在的由PLAC4变体产生的GFP。通过光密度测定法测定得知，相比野生型PLAC4产生的GFP(图3A，泳道2)，通过突变除去PBI序列，导致GFP表达减少87％(图3A，泳道5)。然而，对于PBII和PBIII序列的突变(图3A，泳道6)，没有检测到GFP表达的下调。通过用PPGK1DNA进行替换，以删除PLAC4中的所有三个Pribnow盒样序列(图3A，泳道3和4)，导致完全检测不到GFP表达。这些结果表明，在大肠杆菌中大部分的PLAC4表达取决于PBI序列的存在。肠激酶和HSA在乳酸克鲁维酵母中的克隆和表达
 引物P9和P10用于扩增编码HSA的基因，该基因随后与α-MF序列一起按阅读框被克隆入各种pGBN载体的XhoI/NotI位点。设计引物P9，以编码乳酸克鲁维酵母Kex1蛋白酶切割位点(KR↓)，从而确保蛋白在高尔基体中的正确加工，所述切割位点在紧接着HSA开放阅读框的上游。在30℃，将含有整合的pGBN-HSA DNA的乳酸克鲁维酵母细胞株在2ml YPGa1培养物中培养48小时。通过在10-20％Tris-甘氨酸凝胶上分离15μl的消耗培养基(spent culture medium)，然后进行考马斯染色，以可视化的方式评价HSA的分泌水平。用P11和P12引物经PCR扩增编码EKL的DNA片段，并与α-MF前-原结构域一起按阅读框克隆入含有PLAc4变体的各种pGBN载体的XhoI/BglII限制性位点，或克隆入载体pKLAC1(参见下面的内容)。通过核苷酸测序确认各种pGBN-EKL或pKLAC1-EKL载体中的EKL的DNA序列。通过将细胞在30℃在2ml YPGa1中培养48小时，并分析消耗培养基的肠激酶活性，评价含有整合的pKLAC 1-EKL构建物的乳酸克鲁维酵母细胞株分泌肠激酶的情况，如下所述。
肠激酶活性分析
 通过在15，800×g微离心1ml的pKLAC1-EKL整合的乳酸克鲁维酵母的饱和培养物1分钟，除去细胞，来分离消耗培养基。使用生荧光肽底物GDDDDK-β-萘酰胺(Bachem，King of Prussia，PA)，测量肠激酶活性。将消耗培养基(50μl)与50μl肠激酶分析缓冲液(124mMTris-HClpH 8.0，含有0.88mM GD4K-β-萘酰胺、17.6％二甲基亚砜)混合，并随时间变化测量荧光强度(激发波长337nm，发射波长420nm)。将与已测定量的纯化肠激酶(New England Biolabs，Beverly，MA)相关的酶活性的量与存在于耗尽乳酸克鲁维酵母培养基中的活性相比较，比较结果用于估计由乳酸克鲁维酵母细胞株分泌的活性肠激酶的量。为了补偿YPGal培养基对肠激酶分析的轻微的抑制作用，在按上面的描述测量肠激酶活性之前，首先将纯化的肠激酶稀释入来自未转染的乳酸克鲁维酵母细胞培养物的消耗培养基。
在乳酸克鲁维酵母中PLAC4变体保留完全的启动子活性[52] 为了测试PLAC4变体是否能指导异源基因在乳酸克鲁维酵母中表达，将编码HSA的基因克隆入每一pGBN载体。选择HSA作为报告蛋白，是因为当由野生型PLAC4表达时，其从乳酸克鲁维酵母中高水平表达并有效分泌(Fleer，et al.Bio.Technol.9∶968-975(1991))。将含有每种整合型pGBN1-HSA表达载体的乳酸克鲁维酵母细胞株在YPGal培养基中培养至饱和状态，通过SDS-PAGE分离消耗培养基中分泌的蛋白，并通过考马斯染色检测。HSA在未浓缩的消耗培养基中容易进行检测，其以66kDa的带迁移，用抗-HSA抗体通过Western印迹确认其身份。含有整合的pGBN1PBI-HSA、pGBN1杂合-HSA和pGBN1PBII-PBIII-HSA载体的乳酸克鲁维酵母株分泌HSA，分泌量与含有pGBN1-HSA的对照株相当，在对照株中HSA由野生型PLAC4表达(图3B，泳道2)。这些数据表明，PLAC4的PBI、PBII和PBIII序列的突变或删除并没有显著地改变启动子在乳酸克鲁维酵母中发挥功能的能力。也值得注意的是，相比利用野生型PLAC4(图3B，泳道2)或其他PLAC4变体(图3B，泳道4-6)表达HSA的细胞，含有pGBN1PGK1-HSA(图3B，泳道3)的细胞分泌明显较少的HSA。这与这样的观点一致，即，利用PPGK1进行的HSA表达在含有半乳糖的培养基中被遏制，原因是由半乳糖诱导的表达所需要的UAS序列已被删除。
PLAC4变体对牛肠激酶的克隆效率的影响
 牛肠激酶是商业上重要的蛋白酶，该酶常常用于切割工程化的融合蛋白中的亲和标记。在大肠杆菌中商业生产肠激酶受到产量低的困扰，这可归因于该蛋白在细菌中的毒性作用。这里显示了在乳酸克鲁维酵母中表达肠激酶可以作为解决在细菌中表达不足的手段。在大肠杆菌中装配乳酸克鲁维酵母表达载体——其中编码EKL的DNA置于野生型PLAC4的下游——的大量尝试，导致广泛地分离出在EKL编码序列中含有功能丧失型突变(loss-of-function mutation)的克隆(例如，阅读框错移或过早终止)。在这里说明了在大肠杆菌中显示出被降低或消除的表达的PLAC4变体，从而有助于在被导入酵母之前，在大肠杆菌中将毒性EKL基因克隆入乳酸克鲁维酵母表达载体。使用高保真的聚合酶经PCR扩增EKL基因，并克隆入pGBN1载体中的各种PLAC4变体的下游(参见图2B)。对众多的分离的克隆的整个EKL基因(708bp)进行测序，以确定功能丧失型突变的存在。当克隆至pGBN1中的野生型PLAC4的控制之下时，被检测的12个克隆中的11个(92％)含有功能丧失型突变。然而，克隆到载体pGBN1PGK1(9个克隆被测序)或pGBN1杂合(7个克隆被测序)中的EKL未发现突变，这些载体含有完全缺少大肠杆菌启动子功能的PLAC4变体。此外，克隆到载体pGBN1PBI(9个克隆被测序)中的EKL未发现突变，其中由于PBI中的突变的缘故，大肠杆菌表达减少～87％。此外，pGBN1PBII-PBIII中的10个EKL克隆中的3个(30％)含有功能丧失型突变。总而言之，这些数据表明，大肠杆菌中野生型PLAc4的功能不利地影响着毒性基因的克隆效率，并且表明在大肠杆菌中缺少该功能或功能严重降低的PLAc4变体更适于在细菌中装配乳酸克鲁维酵母表达构建物。
构建pKLACl，一种整合型乳酸克鲁维酵母表达载体
 已经制造了用于在商业上从乳酸克鲁维酵母分泌蛋白的新型乳酸克鲁维酵母整合型表达载体(pKLACl)。该载体基于PLAC4-PBI-变体，其在PBI中含有突变(参见图2B，PGBN1PBI)，该载体含有(以5＇至3＇顺序)：PBI缺陷型LAC4启动子，乳酸克鲁维酵母α-交配因子分泌前导序列，多克隆位点，乳酸克鲁维酵母LAC4转录终止子，含有利用PADH1表达的构巢曲霉(Aspergillus nidulans)amdS基因的选择性标记盒，和大肠杆菌复制起点和允许其在大肠杆菌中增殖的氨苄青霉素抗性基因。
 用SacII或BstXI消化该载体，产生线性表达盒，当其导入乳酸克鲁维酵母细胞后，该线性表达盒整合入乳酸克鲁维酵母染色体的PLAC4基因座的启动子区域。在含有5mM乙酰胺的酵母碳基培养基上，通过氮源选择方法，分离转化的酵母。仅在该表达盒(含有amdS基因)整合入染色体后，乙酰胺可以被转化成简单氮源(美国专利6,051，431)。
 使用引物13和14，由乳酸克鲁维酵母基因组DNA经PCR扩增编码乳酸克鲁维酵母α-MF前-原结构域的DNA，并克隆入pLitmus29(New England Biolabs，Beverly，MA)的SacI/XhoI位点。随后将克隆的乳酸克鲁维酵母α-MF序列经HindlII1和XhoI消化进行切割，并克隆入质粒pGBN1PBI的HindIII/XhoI位点，产生质粒pGBN1PBI-K1α-MF。使用引物P15和P16，克隆的amdS基因作为模板(DSM Biologics B.V.，Delft，Netherlands)，扩增含有除了前128bp之外的整个构巢曲霉amdS基因的1520bp DNA片段。将该片段克隆入质粒pGBN1PBI-K1α-MF的BamHI/SmaI位点，替换G418抗性基因，产生质粒pGBN1PBI-K1α-MF-1520。用引物P16和P17经PCR扩增amdS基因5＇端的剩余128bp，用BamHI消化，克隆入载体pGBN1PBI-K1α-MF-1520的BamHI位点，通过DNA测序确认片段正确的定向。所得的载体命名为pKLAC1(GenBank登记号AY968582)，并可以通过商业途经从New EnglandBiolabs，Beverly，MA获得。
 载体pKLAC1被用于在成功地在大肠杆菌中装配表达载体(pKLAC1-EKL)后，由乳酸克鲁维酵母细胞分泌肠激酶。将含有整合的pKLAC1-EKL的细胞株在YPGa1培养基中培养2天。通过测量荧光肽的切割速率，分析消耗培养基中的肠激酶蛋白水解活性。对来自七个pKLAC1-EKL整合细胞株的培养物上清液进行活性测量，显示所有七个细胞株都分泌活性肠激酶(KLEK)(图5)。然而，这七个细胞株中的两个(KLEK-S1和KLEK-S4)比其他五个分泌更高水平的肠激酶活性。Southern分析证明，细胞株KLEK-S1和KLEK-S4含有多个串联拷贝的整合的pKLAC1-EKL。基于分泌的酶活性与已知数量的纯化肠激酶的活性的比较，如上所述，从生长于摇瓶中的细胞株KLEK-S1分泌出的肠激酶的产量估计为～1.1mg/L。
表1.用于本研究的寡核苷酸
*工程化的限制性位点用下划线标出
Figure IYZ000001658276700011
Figure IYZ000001658276700031
Figure IYZ000001658276700041
Figure IYZ000001658276700051

Claims (21)

1.在酵母细胞中产生重组蛋白的方法，包括：
(a)获得载体，在所述载体中已经***有编码目标蛋白的基因，所述载体还包括：修饰的PLAC4，其在鉴定为Pribnow盒样I、Pribnow盒样II或Pribnow盒样III的序列的至少一个序列中具有一个或多个核苷酸置换，其中，当所述载体在细菌中克隆时，所述一个或多个核苷酸置换导致基因表达的显著减少；
(b)用所述载体转化酵母细胞；和
(c)与使用野生型酵母启动子在酵母细胞中获得的数量相比，使用修饰的启动子在所述酵母细胞中产生相似数量的所述重组蛋白。
2.根据权利要求1的方法，其中所述酵母细胞是乳酸克鲁维酵母(K.lactis)细胞。
3.根据权利要求1的方法，其中所述细菌是大肠杆菌(E.coli)。
4.根据权利要求1的方法，其中所述置换在两个或多个Pribnow盒样序列中。
5.根据权利要求1的方法，其中所述修饰的PLAC4在所述启动子的第一区域中具有一个或多个突变，所述第一区域对应于核苷酸-198至-212。
6.根据权利要求1的方法，其中所述修饰的PLAC4在所述启动子的第二区域中具有一个或多个突变，所述第二区域对应于核苷酸-133至-146。
7.根据权利要求1的方法，其中所述修饰的PLAC4中的核苷酸-1至-283被来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的磷酸甘油酸激酶启动子的核苷酸-1至-283替换。
8.根据权利要求1的方法，其中所述转化的酵母细胞中的所述载体是附加型质粒。
9.根据权利要求1的方法，其中所述转化的酵母细胞中的所述载体是整合型质粒。
10.根据权利要求1的方法，其中所述载体含有编码酵母分泌信号肽的DNA序列。
11.根据权利要求1的方法，其中所述载体含有编码选择性标记的DNA序列。
12.根据权利要求1的方法，其中至少50％的所述被转化酵母细胞表达重组蛋白。
13.DNA载体，含有：在Pribnow盒样I序列中具有突变的修饰的PLAC4启动子。
14.根据权利要求13的DNA载体，还包含乳酸克鲁维酵母α-交配因子。
15.根据权利要求13的DNA载体，还包含构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶选择性标记基因。
16.根据权利要求13的DNA载体，还包含用于***编码重组蛋白的基因的多克隆位点。
17.根据权利要求13的DNA载体，还包含PLAC4终止子。
18.宿主酵母细胞，包含权利要求13的载体。
19.宿主细菌细胞，包含权利要求13的载体。
20.试剂盒，包含：权利要求13的载体；任选地包含感受态酵母细胞；和使用说明书。
21.修饰的PLAC4 Pribnow样盒，其中TTATCATTGT被修饰为AGAACAGAGA，TATTATTCT被修饰为GAGAGCTCT。
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