JP2007532115A - 大腸菌転写能を実質的に欠如したクルイベロマイセス・ラクチスにおけるクルイベロマイセス・ラクチス−プロモーター変異株の構築および使用方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図3
Description
機能的シャトルベクターは酵母細胞に導入して発現される前に細菌内でクローニングされた遺伝子を生成することを可能にする。しかしながら、強い酵母発現系PLAC4を用いる酵母発現系は、大腸菌のような細菌宿主細胞においてPLAC4の制御下にある遺伝子からタンパク質が予期せず発現されることにより悪影響をうけることがある。このプロモーター活性は、その翻訳生成物が細菌に対して有害である可能性がる遺伝子のクローニング効率を阻害することがある。
原栄養菌株K.lactis GG799株(MATα[pGK11+])を常法によりYPD培地(酵母エキス1%、ペプトン2%、グルコース2%)に30℃で成長し、維持した。GG799細胞の形質転換前に、関心のある遺伝子を含有するpGBN1系またはpKLAC1系発現ベクターの1μgをSacII消化により線状化した。線状化発現ベクターを市販のコンピテントK.lactisGG799細胞[ニュー・イングランド・バイオラブズ社(New England Biolabs)、ビバリー市、マサチュセッツ州)]の統合的形質転換(integrative transformation)に供給元の指示に従って用いた。pGBN1、pGBN1PGK1、pGBN1Hyb、pGBN1PBI、またはpGBN1PBII-PBIIIベクターで形質転換した細胞のコロニーを200μg/mlのG418(シグマ社、セントルイス市、ミズーリー州)を含有するYPD寒天プレート上で30℃で2〜3日間成長させることにより選択した。pKLAC1系ベクターで形質転換した細胞のコロニーは酵母カーボン・ベース[ニュー・イングランド・バイオラブズ社(New England Biolabs)、ビバリー市、マサチュセッツ州)]1.17%、5mMアセトアミド[ニュー・イングランド・バイオラブズ社(New England Biolabs)、ビバリー市、マサチュセッツ州)]および30mMリン酸ナトリウム緩衝液pHを含有する寒天プレート上で30℃で4〜5日間成長させることにより選択した。異種遺伝子を発現するK.lactis株はガラクトース2%を含有するYP培地(YPGal)中で30℃で48〜96時間培養した。
本発明で用いるプライマーを表1に示す。PCRによる増幅を高信頼度ディープ・ベント[Deep Vent(登録商標)]DNAポリメラーゼ[ニュー・イングランド・バイオラブズ社(New England Biolabs)、ビバリー市、マサチュセッツ州)]を用いて行った。典型的なPCR混合物は0.2mM dNTP(各種)、各プライマー0.5μg、1×サーモプール緩衝液[ニュー・イングランド・バイオラブズ社(New England Biolabs)、ビバリー市、マサチュセッツ州)]およびテンプレートDNA100ngを全反応液100μlに含有するものであった。熱サイクルは典型的には、「ホット・スタート」95℃5分間と、94℃30秒、58℃30秒および72℃(DNAのkb当り1分間)の連続インキュベーションを30サイクルとからなる。熱サイクル後、最終発現を72℃で10分間行った。
プロモーター変異体はすべて統合的発現ベクターpGBN1に存在する野生型PLAC4、K.lactis/大腸菌シャトル・ベクターに由来し、このベクターは2317bpのPLAC4 DNAを含有し、このDNAはpUC19プラスミドDNAにより1663bpフラグメントと654bpフラグメントに分離されている(図1)。この分離はSacIIにより認識される独自の制限部位において起きる。2830bpのUC19ベクターDNAがこの独自の制限部位に挿入されている。これにより、上記発現ベクターがSacIIまたはBstXIを用いた消化および酵母細胞への導入の後にK.lactis染色体の天然LAC4遺伝子座に統合することが可能になる。加えて、K.lactis染色体のLAC4以外の遺伝子座へのベクターの統合を指令するK.lactis DNAをベクター挿入することができる。pUC19 DNA配列の代わりに、細菌の複製原点と選択性マーカー遺伝子を含有する任意のDNAを用いることができる。野生型PLAC4配列またはpGBN1にクローニングされた任意のPLAC4突然変異体あるいはハイブリッドの位置は分泌リーダー配列のためのコード領域のすぐ上流である。
一連の4種類のPLAC4変異体を生成してPLAC4の大腸菌プロモーター活性を図2のBに示すようにPBIおよびPBII/PBIIIにおける点突然変異を置換または導入することにより除去した。
(i)pGBN1PGK1ベクターは1067bpの天然PLAC4の代わりに485bpのサッカロマイセス・セレビシアエ(S.cerevisiae)PGK1プロモーター(PPGK1)を導入し、それによりガラクトース−応答性上流活性化配列(UASIおよびUASII)と3種のプリブノー・ボックス様配列のすべてをともに除去する。
(ii)pGBN1HybベクターはPLAC4の3´末端を含む283bpの代わりにPPPGK1の3´末端からの283bpを導入し、その結果3種類のプリブノー・ボックス様配列のすべてが欠失したが、両UAS配列は無傷のまま残った。
(iii)pGBN1PBIベクターは、PLAC4のヌクレオチド−204と−209の間のPBIのプロブノー・コンセンサス配列を除去する6点突然変異を含む。
(iv)pGBN1PBII-PBIIIベクターは、PLAC4のヌクレオチド−136と−144の間のPBIIおよびPBIIIのプロブノー・コンセンサス配列を除去する5点突然変異を含む。
GFPをpGFPuvプラスミド[クロンテク(Clontech)社、米国カリフォルニア州パロ・アルト市]をテンプレートとして用い、プライマーP7およびP8でPCR増幅した。増幅されたGFPをイン−フレーム(in−frame)で種々のpGBNベクター(前節参照)のBglII/NotI部位のα−MFプレプロ・ドメインを用いてクローニングした。種々のpGBN−GFP構築物を含む細菌の溶解産物を100μg/mlアンピシリンを含有するLB培地において30℃で一夜成長させた培養物50mlから調製した。培養物を遠心分離し、細胞ペレットをドライアイスで凍結し、室温で融解し、溶解緩衝液(50mM NaCl、1mM EDTAを含有する20mM Tris−HCl pH7.5)10μl中に再懸濁した。細胞をソニケーター[Sonicator(登録商標)][ヒート・システムズ−ウルトラソニクス(Heat Systems−Ultrasonics)社、米国ニューヨーク州プレインビュー市]で段階7で15秒間破砕し、細胞残滓(cell debrfis)を15、000×gで10分間遠心分離することにより除去した。各溶解産物のタンパク質濃度をその280nmにおける吸収を測定することにより決定した。各様海産物中のタンパク質(100μg)をTris−グリシン 10〜20%SDS−ポリアクリルアミド・ゲル上で分離し、ニトロセルロースに移し、0.05%ツイーン(Tween)20および5%脱脂ミルク(w/v)を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS−T)中で4℃で一夜ブロックした。5%脱脂ミルクを含有するPBS−Tに1:1000希釈した抗GFPモノクローナル抗体[クロンテク(Clontech)社、米国カリフォルニア州パロ・アルト市]を用いてブロットをプローブした後、5%脱脂ミルク(w/v)を含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS−T)に1:2000に希釈した西洋わさびオキシダーゼ結合抗マウス第2抗体(KPL社、米国ミヅーリー州ゲイザーズバーグ市)とともにインキュベーションした。タンパク質−抗体複合体をルミグロ(LumiGlo)検出試薬[セル・シグナリング・テクノロジー(Cell Signaling Technology)社、米国マサチュセッツ州ビバリー市]を用いて検出した。大腸菌内で生成されたGFPの量をモレキュラー・イメージャー(molecular imagerf)FX[バイオラッド(Bio−Rad)社、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ市]およびクウォンティティ・ワン(Quantity One)ソフトウェアを用いて写真濃度測定(densitometry)により測定した。
プライマーP9およびP10を用いてHSAをコードする遺伝子を増幅し、次いでこれを種々のpGBNベクターのXhoI/NotI部位のα−MF配列デイン・フレーム(in−frame)でクローニングした。プライマー9はHSAオープン・リーディング・フレームのすぐ上流のK.lactis Kex1プロテアーゼ切断部位(KR↓)をコードしてゴルジ内のタンパク質の正確な処理を確実にするように設計されている。統合されたpGBN−HSA DNAを含有するK.lactis株をYPGalの2ml培養物中で30℃で48時間成長させた。HSAの分泌レベルを15μlの使用済み培地を10〜20%Tris−グリシン・ゲル上で分離し、次いでクマシー(Coomassie)染色することにより視覚的に評価した。EKLをコードするDNAフラグメントをプライマーP11およびP12でPCRF増幅し、クローニングしてPLAC4変異体を含有する種々のpGBNベクターのXhoI/BglII制限部位に、またはpKLAC1ベクター(下記参照)に導入した。種々のpGBN−EKLまたはpKLAC1−EKLベクター中のEKLのDNA配列をヌクレオチド配列決定により確認した。統合されたpKLAC1−EKL構築物を含有するK.lactis株によるエンテロキナーゼの分泌の評価を、細胞をYPGal 2ml中で30℃で48時間成長し、使用済み培地のエンテロキナーゼ活性下記のように測定することによって行った。
pKLAC1−EKLを統合したK.lactisの飽和培養物1mlを15、800×gで1分間ミクロ遠心することにより使用済み培地を分離して細胞を除去した。エンテロキナーゼ活性を、蛍光性ペプチド基質GDDDDK−β−ナフチルアミド[ベイチャム(Bachem)社、米国ペンシルバニア州プラッシア市]を用いて測定した。使用済み培地(50μl)をエンテロキナーゼ測定緩衝液(0.88mM GD4K−β−ナフチルアミド、ジメチルスルホキシド17.6%を含有する124mM Tris−HCL pH8.0)50μlと混合し、蛍光強度(励起337nm、発光420nm)を経時的に測定した。精製エンテロキナーゼ[ニュー・イングランド・バイオラブズ(New England Biolabs)、マサチュセッツ州ビバリー市]の測定量と関連する酵素活性の量の、使用済みK.lactis培地中に存在する活性に対する比較を用いてK.lactis株により分泌された活性エンテロキナーゼの量を評価した。YPGal培地がエンテロキナーゼ測定に対して有する軽い阻害的効果を補償するために、精製エンテロキナーゼを先ず未トランスフェクションK.lactis細胞の培養物からの使用済み培地に希釈してからエンテロキナーゼ活性を上記のように測定する。
PLAC4の変異体がK.lactisにおいて異種遺伝子の発現を指令することが可能であるか否かを試験紙、HSAをコードする遺伝子をクローニングしてpGBNベクターのそれぞれに導入し、HSAをその高発現および野生型PLAC4のから発現されたときのK.lactisからの効率的分泌によりリポーター・タンパク質として選択した(フリア他、バイオ・テクノロジー第9巻第968〜975行(1991年)(Fleer et al.,Bio.Technol.9:968−975(1991))。統合されたpGBN1−HSA発現ベクターのそれぞれを含有するK.lactis株をYPGal培地で飽和するまで成長し、使用済み培地に分泌されたタンパク質をSDS−PAGEにより分離し、クマシー(Coomassie)染色により検出した。HSAは66kDaバンドとして移動し、このバンドは未濃縮使用済み培地において容易に検出可能であり、その同一性を抗HSA抗体を用いるウェスタン・ブロッティングにより確認した。統合されたpGBN1PBI−HSA、pGBN1Hyb−HSAおよびpGBN1PBII-PBII−HSAベクターを含有するK.lactis株は、HSAが野生型PLAC4から発現されるpGBN1−HSAを保持する対照株に匹敵する量でHSAを分泌した(図3のB、レーン2)。これらのデータは、PLAC4のPBI、PBIIおよびPBIII配列の突然変異または欠失がプロモーターがK.lactis内で機能する能力を顕著に変更しないことを示している。pGBN1PGK1−HSAを保持する細胞(図3のB、レーン3)からは野生型PLAC4(図3のB、レーン2)または他のPLAC4変異体(図3のB、レーン4〜6)のいずれかからHSAを発現する細胞に比してHSAの分泌が顕著に少ないことは注目に値する。このことはガラクトース誘導発現に必要とされる両UAS配列が欠失されたためにPPGK1からのHSA発現がガラクトース含有培地では抑制されることと一貫性がある。
牛エンテロキナーゼは商業的に重要なプロテアーゼであり、改変された融合タンパク質からアフィニティー標識を截断するのによく用いられる。大腸菌におけるエンテロキナーゼの商業的生産は細菌においてそのタンパク質が毒性を有するために低収率である。K.lactis
K.lactisからタンパク質を商業的に分泌するための新規なK.lactis統合性発現ベクター(pKLAC1)を形成した。このベクターは、PBI(図2のB、pGBN1PBI)に突然変異を含み、PBI−欠失LAC4プロモーター、K.lactisα接合因子分泌リーダー配列、多重クローニング部位、K.lactisLAC4転写ターミネーター、PADHIから発現されたアスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)amdS遺伝子を含む選択性マーカー・カセット、並びに大腸菌複製原点およびアンピシリン耐性遺伝子を(5′から3′への順序で)含み、大腸菌におけるその増殖を可能にするPLAC4-PBIに基づいている。
Claims (24)
- 酵母細胞内に組換タンパク質を生成する方法であって、
(a)目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入されたベクターであって、さらに、細菌内にクローニングされた際に遺伝子の発現が顕著に減少するように改変された改変PLAC4を含むベクターを得ること、
(b)酵母細胞を前記ベクターで形質転換すること、
(c)前記酵母細胞中に有効量の前記組換えタンパク質を生成すること
を含む方法。 - 前記酵母細胞はクルイベロマイセス・ラクチス(K.lactis)酵母細胞であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記細菌は大腸菌(E.coli)であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記改変PLAC4は1つ以上のプリブノー・ボックス(Pribnow box)様配列に突然変異を有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上のプリブノー・ボックス様配列はPBI、PBIIおよびPBIIIであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記突然変異は2つ以上のプリブノー・ボックス様配列に存在することを特徴とする請求項5に記載の方法。
- 前記改変PLAC4はヌクレオチド−198〜−212に対応する前記プロモーターの第1の領域に1つ以上の突然変異を有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記改変PLAC4はヌクレオチド−133〜−146に対応する前記プロモーターの第2の領域に1つ以上の突然変異を有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記改変PLAC4は前記プロモーターの第1の領域および第2の領域に1つ以上の突然変異を有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記改変PLAC4のヌクレオチド−1〜−283はサッカロマイセス・セレビシアエ(S.cerevisiae)からのホスホグリセレート・キナーゼプロモーターのヌクレオチド−1〜−283により置換されていることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記形質転換された酵母細胞内の前記ベクターはエピソーム・プラスミドであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記形質転換された酵母細胞内の前記ベクターは統合性プラスミドであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ベクターは酵母分泌シグナル・ペプチドをコードするDNA配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ベクターは選択性マーカーをコードするDNA配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記形質転換された酵母細胞の少なくとも50%が組換タンパク質を発現することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 改変PLAC4プロモーターを含むDNAベクター。
- さらにクルイベロマイセス・ラクチス(K.lactis)α−接合因子を含むことを特徴とする請求項16に記載のDNAベクター。
- さらにアスペルギルス・ニデュランス(A.nidulans)アセトアミダーゼ選択性マーカー遺伝子を含むことを特徴とする請求項16に記載のDNAベクター。
- さらに組換タンパク質をコードする遺伝子の挿入用の多重クローニング部位を含むことを特徴とする請求項16に記載のDNAベクター。
- さらにPLAC4ターミネーターを含むことを特徴とする請求項16に記載のDNAベクター。
- 請求項16に記載の前記ベクターを含む宿主酵母細胞。
- 請求項16に記載の前記ベクターを含み宿主細菌細胞。
- 請求項16に記載のベクター、任意にコンピテント酵母細胞、および使用指示を含むキット。
- TTATCATTGT(配列番号22)がAGAACAGAGA(配列番号23)に改変され、かつTATTATTCTがGAGAGCTCTGに改変された改変PLAC4プリブノー・ボックス。
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