CN1950513B - 使用固氮弓菌的脱氢酶由链烷酮制备旋光醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备式(I)的旋光醇的方法,其中n是0至5的整数;Cyc代表任选取代的单核或多核、饱和或不饱和碳环或杂环,并且R1代表卤素、SH、OH、NO2、NR2R3或NR2R3R4+X-,其中R2、R3和R4独立地代表H或低碳烷基或低碳烷氧基,且X-代表抗衡离子。根据本发明,在存在还原等同物的情况下,在包含式(II)的链烷酮的培养基中孵育选自脱氢酶、醛还原酶和羰基还原酶类的酶(E),其中n、Cyc和R1如上所定义。将式(II)的化合物酶促还原成式(I)的化合物,并借助于酶(E)使牺牲醇反应成相应的牺牲酮并从反应培养基中至少部分去除牺牲酮,由此使反应过程中消耗的还原等同物再生,然后分离由此制得的产物(I)。
Description
技术领域
本发明涉及通过将相应的酮酶促还原来制备旋光链烷醇的方法,特别涉及制备(1S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)丙-1-醇和(1S)-3-氯-1-(2-噻吩基)丙-1-醇。
背景技术
(1S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)丙-1-醇(“度洛西汀(Duloxetine)醇”)是度洛西汀合成中的组成单元。度洛西汀 是目前处于审批阶段,预期用于抑郁和失禁适应症领域的药物。
EP-B-0273658描述了如下制备与度洛西汀相对应的碱的方法:在曼尼希反应中使2-乙酰噻吩与甲醛和二甲胺反应、将由此获得的曼尼希碱的酮基还原成外消旋(S)-3-N,N-二甲氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇,用氟化萘基使醇官能醚化并最终将二甲氨基转化成甲氨基官能。使用手性原材料或通过外消旋物在最终产物阶段的分解,例如通过使用旋光酸的盐或通过在手性固定相上的色谱法,获得所需的萘基酯对映体。
US-5,362,886描述了类似的方法,其包括在酮基还原之后获得的外消旋丙醇中加入S-苯乙醇酸。将以该方法获得的醇的S-对映体用于随后的反应阶段。
EP-A-0457559也描述了与EP-B-0273658类似的方法。在此,使用不对称还原***LAH-lcb(氢化铝锂[(2R,2S)-(-)-4-二甲氨基-1,2-二苯基-3-甲基-2-丁醇])将曼尼希醇的酮基还原成醇的S-对映体形式。在此,除成本外,缺点还在于LAH-lcb还原***的敏感性仅能稳定数分钟。
W.J.Wheeler和F.Kuo在Labelled Compounds andRadiopharmaceuticals杂质,XXXVI卷,第3期,213至223页中描述了 制备度洛西汀的方法。最后,在存在催化量的在DMPU(二甲基亚丙基脲)中的苄基氯-双(三苯膦)钯(II)的情况下,使噻吩-2-羰基氯在Stille偶联中与乙烯基三正丁基锡烷反应以产生式(V)的1-(噻吩-2-基)-丙烯酮。
随后用氯化氢处理,将其转化成式(VI)的3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮
然后使用手性oxazaborylidine和BH3将由此方式获得的氯丙酮还原以获得式(VII)的(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇
通过随后与碘化钠反应并随后与甲胺反应,将由此方式获得的醇转化成(S)-3-甲氨基-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇。随后相继与氢化钠、1-氟萘和氯化氢反应,产生了盐酸盐形式的度洛西汀。
Hal=卤素
T.Stillger等人在Chemie Ingenieur Technik(74)1035-1039页,2002,描述了使5-氧代己酸乙酯酶促对映体选择性还原以产生(S)-5-羟基己酸乙酯的底物(substrate)偶联辅因子再生法。
发明概述
因此,本发明的目的在于发现立体有择还原取代链烷酮(例如3-甲氨基-1-(2-噻吩基)丙酮和3-氯-1-(2-噻吩基)丙酮)的方式,其用于尽可能以廉价方法定量制造产品的反应法。
由于意外地发现具有脱氢酶活性的酶,特别是可以由固氮弓菌属(Azoarcus)的微生物制成的酶,能够立体有择地催化上述反应,同时进行辅因子再生,由此实现了该目的。
本发明首先涉及制备式I的旋光链烷醇的方法
其中
n是0至5的整数;
Cyc是任选取代的单核或多核、饱和或不饱和碳环或杂环,且
R1是卤素、SH、OH、NO2、NR2R3或NR2R3R4+X-,其中R2、R3和R4彼此独立地为氢或低碳烷基或低碳烷氧基且X-是抗衡离子,
该方法包括在存在还原等同物(equivalent)的情况下,在包含式II的链烷酮的培养基中孵育选自脱氢酶、醛还原酶和羰基还原酶类的酶(E),
其中n、Cyc和R1如上所定义,
将式II的化合物酶促还原以产生式I的化合物,并借助于酶(E)使牺牲醇(sacrificial alcohol)反应以产生相应的牺牲酮并从反应培养基中至少部分去除所述牺牲酮,从而使反应过程中消耗的还原等同物再生,并分离形成的产物(I)。
根据本发明特别合适的酶(E)是醛-酮还原酶超家族的醛-酮还原酶家族的酶(K.M.Bohren,B.Bullock,B.Wermuth和K.H.Gabbay J.Biol.Chem.1989,264,9547-9551)和短链醇脱氢酶/还原酶[SDR]。在例如H. B.Persson,M.Krook,S.Atrian,R.Gonzalez-Duarte,J.Jeffery和D.Ghosh,Biochemistry,1995,34,6003-6013页或U.Oppermann,C. Filling,M.Hult,N.Shafqat,X.Q.Wu,M.Lindh,J.Shafqat,E.Nordling,Y.Kallberg,B.Persson和H.Jornvall,Chemico-Biological Interactions,2003,143,47-253页中详细描述了后一类酶。
在所述酶类中,短链醇脱氢酶特别合适。
本发明的特别合适的实施方案是在上述方法中使用酶(E),其中E具有多肽序列
(i)SEQ ID NO:2或
(ii)与SEQ ID NO:2相比,其中多达25%的氨基酸基团已经通过缺失、***、取代或其结合改变,且保持了SEQ ID NO:2的至少50%酶活性。
在特别优选的实施方案中,该方法用于制备式III的1-(2-噻吩基)-(S)-丙醇的衍生物。
其中R1=Cl或NHCH3,
其中在包含式IV的1-(2-噻吩基)丙酮衍生物的培养基中
将该化合物酶促还原以产生式III的化合物,并分离形成的基本对映纯性产物。
优选在该方法中使用具有脱氢酶活性的酶,其可以由固氮弓菌属、Azonexus、Azospira、Azovibrio、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、高铁杆菌属(Ferribacterium)、Petrobacter、Propionivibrio、四瓣藻属(Quadricoccus)、红环菌属(Rhodocyclus)、Sterolibacterium、Thauera和陶厄氏菌属(Zoogloea)的微生物制成。
特别优选的是固氮弓菌属的脱氢酶。
由于其氨基酸序列,固氮弓菌属物种EbN1苯基乙醇脱氢酶可以包括在短链醇脱氢酶/还原酶[SDR]中。在例如,H. ,B.Persson,M.Krook,S.Atrian,R.Gonzalez-Duarte,J.Jeffery和D.Ghosh,Biochemistry,1995,34,6003-6013页或U.Oppermann,C.Filling,M.Hult,N.Shafqat,X.Q.Wu,M.Lindh,J.Shafqat,E.Nordling,Y.Kallberg,B.Persson和H.Jornvall,Chemico-Biological Interactions,2003,143,247-253页中详细描述了所述类型的酶。在SDR类中,各个代表物的氨基酸序列可以互相差别很大。然而,已知特殊的氨基酸或氨基酸区域在SDR类中高度保守。C.Filling,K.D.Berndt,J.Benach,S.Knapp,T.Prozorovski,E.Nordling,R.Ladenstein,H.Jornvall和U.Oppermann,Journal of Biological Chemistry,2002,277,25677-25684页描述了重要的保守SDR区。
固氮弓菌属的实例是Azoarcus anaerobius、Azoarcus buckelii、Azoarcus communis、Azoarcus evansii、Azoarcus indigens、Azoarcustoluclasticus、Azoarcus tolulyticus、Azoarcus toluvorans、固氮弓菌属物种、固氮弓菌属物种22Lin、固氮弓菌属物种BH72、固氮弓菌属物种CC-11、固氮弓菌属物种CIB、固氮弓菌属物种CR23、固氮弓菌属物种EB1、固氮弓菌属物种EbN1、固氮弓菌属物种FL05、固氮弓菌属物种HA、固氮弓菌属物种HxN1、固氮弓菌属物种mXyN1、固氮弓菌属物种PbN1、固氮弓菌属物种PH002、固氮弓菌属物种T和固氮弓菌属物种ToN1。
特别优选使用固氮弓菌属物种EbN1脱氢酶。
在本发明方法的特别优选实施方案中,具有脱氢酶活性的酶选自包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或由其衍生出的下述序列的酶——其中最多25%,优选最多20%,特别优选最多15%,特别是最多10、9、8、7、6、5、4、3、2、1%的氨基酸残基已经通过缺失、取代、***或缺失、取代和***的结合方式改变,其中与SEQ ID NO:2相比,改变的多肽序列保持了SEQ ID NO:2的至少50%,优选65%,特别优选80%,特别是高于90%的活性。在这点上,SEQ ID NO:2的酶活性是指以对映体选择性方式将式(IV)的酮(其中R1=Cl)还原以产生具有通式(III)的(S)醇的能力。在实施例3和4中陈述了测定酶活性的确切条件。
在添加还原等同物,特别是NADH或NADPH的情况下进行本发明的方法。使用牺牲醇,优选异丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇、3-己醇使反应过程中消耗的还原等同物再生,其中的牺牲醇在反应条件下通过酶(E)氧化成相应的牺牲酮。
在本发明的优选实施方案中,加入的牺牲醇不仅用再生使消耗的还原等同物,还充当助溶剂。优选在液体2-相***中操作,其中一相由水或水可混溶性溶剂构成,另一相由牺牲醇构成。优选使用2-戊醇作牺牲醇。
相对于所用的每摩尔链烷酮(II),还原等同物的用量优选为0.001至100毫摩尔,特别优选为0.01至1毫摩尔。
本发明的方法包括,从反应混合物中至少部分去除在消耗的还原等同物再生过程中通过牺牲醇的氧化制成的牺牲酮。优选从反应培养基中完全去除形成的牺牲酮。这可以通过多种方法实现,例如使用选择性膜或通过萃取或蒸馏法。优选通过蒸馏的方法去除酮。在通过蒸馏去除酮的同时,通常同时还去除了部分牺牲醇,有时还额外去除了部分水相。通常通过进一步加入牺牲醇并且如果合适,进一步加入水,以平衡这些蒸馏损耗。蒸馏率为反应体积的0.02%/分钟至2%/分钟,优选0.05%/分钟至1%/分钟。反应器护套温度优选在反应器内部温度以上5-70开,优选10-40开。
蒸馏在1-500毫巴,优选10-200毫巴的压力范围内进行得尤其顺利。
优选实施方案包括在选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单孢菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、红球菌科(Rhodococcaceae)和诺卡氏菌科(Nocardiaceae)的细菌微生物存在下使通式II,例如式IV的化合物反应。所述微生物尤其可以是已经用上述定义的具有脱氢酶活性的酶编码的核酸构建体转化的重组微生物。
本发明特别涉及
-从天然来源分离或重组制备产生具有脱氢活性的酶的微生物,
-繁殖所述微生物,
-合适时,从所述微生物中分离所述具有脱氢酶活性的酶,或从所述微生物制备包含所述酶的蛋白质组分,及
-将根据阶段b)的微生物或根据阶段(c)的酶转移到包含式I的化合物的培养基中。
此外,本发明涉及包含如上定义的多肽的编码序列的编码核酸序列。
本发明进一步涉及包含有效连接到至少一个调节核酸序列上的如上定义的编码核酸序列的表达盒。
本发明进一步涉及包含至少一个这种表达盒的重组载体。
本发明还涉及用至少一种本发明的载体转化的原核或真核宿主。
最后,本发明涉及使用如上定义的具有脱氢酶活性的酶或使用产生所述酶的微生物制备式I或III的化合物,并涉及其的进一步加工,例如用以制备度洛西汀(式VIII)
发明详述
A.一般术语和定义
除非另行说明,适用下列通用含义:
“卤素”是氟基、氯基、溴基或碘基,特别是氟基或氯基。
“低碳烷基”是含有1至6个碳原子的直链或支链烷基,例如甲基、乙基、异丙基或正丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基、正戊基或2-甲基丁基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2-乙基丁基。
“低碳链烯基”是上述含有2至6个碳原子的烷基的单或多,优选单或二不饱和类似物,双键可以位于碳链的任何位置。
“低碳烷氧基”是上述烷基的氧封端的类似物。
“芳基”是单核或多核,优选单核或双核,任何取代的芳基,特别是经由任何环位置键合的苯基或萘基,例如1-或2-萘基。如何合适,这些芳基可以包含1个或2个相同或不同的选自上述卤素、低碳烷基、低碳烷氧基或三氟甲基的取代基。
取代链烷酮,(S)-链烷醇及其衍生物
可根据本发明通过酶促催化获得的链烷醇是上式(I)的那些,其中
n是0至5的整数;
Cyc是任选取代的单核或多核、饱和或不饱和碳环或杂环,且
R1是卤素、SH、OH、NO2、NR2R3或NR2R3R4+X-,其中R2、R3和R4彼此独立地为氢或低碳烷基或低碳烷氧基且X-是抗衡离子。
可用于酶促合成的上式II的链烷酮本身是已知的化合物并可通过应用公知的有机合成法获得(参照例如EP-A-0 273 658)。
在上述化合物中,n优选为0、1或2,特别是1。
可以提出的碳环或杂环基团Cyc的实例具体是含有最多4个,优选1或2个相同或不同的选自O、N和S的环杂原子的单核或双核,优选单核基团:
这些碳环或杂环具体含有3至12个,优选4、5或6个环碳原子。可以提出的实例是环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、它们的单或多不饱和类似物,例如环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环己二烯基、环庚二烯基;以及含有1至4个选自O、N和S的杂原子的5至7元饱和或单或多不饱和杂环基团,如果合适,杂环可以与另一杂环或碳环稠合。必须特别提到由吡咯烷、四氢呋喃、哌啶、吗啉、吡咯、呋喃、噻吩、吡唑、咪唑、唑、噻唑、吡啶、吡喃、嘧啶、哒嗪、吡嗪,苯并呋喃、吲哚和喹啉生成的杂环基团。
在这种情况下,基团Cyc可以经由任何环位置,优选经由环碳原子键合到链烷酮或链烷醇上。
合适的Cyc基团的实例是2-噻吩基、3-噻吩基;2-呋喃基、3-呋喃基;2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基;2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基;4-甲基-2-噻吩基、3-乙基-2-噻吩基、2-甲基-3-噻吩基、4-丙基-3-噻吩基、5-正丁基-2-噻吩基、4-甲基-3-噻吩基、3-甲基-2-噻吩基;3-氯-2-噻吩基、4-溴-3-噻吩基、2-碘-3-噻吩基、5-碘-3-噻吩基、4-氟-2-噻吩基、2-溴-3-噻吩基和4-氯-2-噻吩基。
基团Cyc可以进一步被单或多取代,例如,单或二取代。取代基优选位于环碳原子上。合适的取代基的实例是卤素、低碳烷基、低碳链烯基、低碳烷氧基、-OH、-SH、-NO2或NR2R3,其中R2和R3如上所定义,优选为卤素或低碳烷基。
R1具体是卤素、NR2R3或NR2R3R4+X-,其中R2、R3以及R2、R3和R4彼此独立地为卤素或低碳烷基或低碳烷氧基,且X-是抗衡离子,优选基团R2、R3和R4任一个是氢。合适的抗衡离子的实例是酸阴离子,例如在制备酸加成盐时制成的阴离子。其实例,例如在EP-A-0 273 658中提及,其经此引入本文。基团R1的优选实例具体是氟基或氯基以及NR2R3,其中R2和R3相同或不同,是氢或甲基、乙基或正丙基;R1特别优选为氯基或-NH甲基。
C.具有脱氢酶活性的合适的酶
具有脱氢酶活性的酶优选包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
本发明还包括明确公开的具有脱氢酶活性的酶的“功能等同物”及其在本发明方法中的应用。
在本发明中,明确公开的酶的“功能等同物”或类似物是与这些酶不同但是仍然具有所需生物活性(例如,底物特异性)的多肽。由此,“功能等同物”是指,例如,将3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮还原成相应的S-醇并具有含有SEQ ID NO:2中所列氨基酸序列的酶的至少50%,优选60%,特别优选75%,非常特别优选90%活性的酶。功能等同物还优选在pH 4至10之间稳定并有利地具有pH 5至8的pH最佳范围及20℃至80℃的温 度最佳范围。
根据本发明,“功能等同物”还特别是指,在上述氨基酸序列的至少一个序列位点上具有与明确公开的氨基酸不同的氨基酸,但仍然具有上述生物活性之一的突变体。“功能等同物”由此包括通过一个或多个氨基酸添加、氨基酸取代、氨基酸缺失和/或氨基酸倒置获得的突变体,所述改变可以在任何序列位点上发生,只要其产生具有本发明的特性谱的突变体。特别地,当突变体和未改变多肽的反应性模式(pattern)在性质上相符,也就是以不同的速率转化相同的底物时,也存在功能等同性。
可以在下表中找到合适的氨基酸取代的实例:
原始残基 | 取代实例 |
Ala | Ser |
Arg | Lys |
Asn | Gln;His |
Asp | Glu |
Cys | Ser |
Gln | Asn |
Glu | Asp |
Gly | Pro |
His | Asn;Gln |
Lle | Leu;Val |
Leu | Lle;Val |
Lys | Arg;Gln;Glu |
Met | Leu;lle |
Phe | Met;Leu;Tyr |
Ser | Thr |
Thr | Ser |
Trp | Tyr |
Tyr | Trp;Phe |
Val | Lle;Leu |
根据本发明,“功能等同物”还特别是指,在上述氨基酸序列的至少一个序列位点上具有与明确公开的氨基酸不同的氨基酸,但仍然具有上述生物活性之一的突变体。“功能等同物”由此包括通过一个或多个氨基酸添加、氨基酸取代、氨基酸缺失和/或氨基酸倒置获得的突变体,所述改变可以在任何序列位点上发生,只要其产生具有本发明的特性谱的突变体。特别地,当突变体和未改变多肽的反应性模式在性质上相符,也就是以不同的速率转化相同的底物时,也存在功能等同性。
上述意义上的“功能等同物”也是所述多肽的“前体”、所述多肽的“功能衍生物”及其“盐”。
在本文中,“前体”是具有或没有所需生物活性的多肽的天然或合成前体。
术语“盐”是指本发明蛋白质分子的羧基的盐及氨基的酸加成盐。羧基的盐可以以本身已知的方式制备并包含无机盐,例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐和锌盐,以及含有有机碱的盐,例如胺,例如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶和类似物。本发明还涉及酸加成盐,例如无机酸(例如盐酸或硫酸)的盐,或有机酸(例如乙酸和草酸)的盐。
也可以通过已知技术在官能氨基酸侧基或在它们的N-末端或C-末端上制备本发明的多肽的“功能衍生物”。这种衍生物包括,例如,羧酸基团的脂族酯、羧酸基团的酰胺,这些酰胺可通过与氨或与伯胺或仲胺反应获得;自由氨基的N-酰基衍生物,这些衍生物是通过与酰基的反应制成;或自由羟基的O-酰基衍生物,这些衍生物是通过与酰基的反应制成。
“功能等同物”自然还包括可由其他微生物获得的多肽以及天然存在的变体。例如,可以通过序列比较确定同源序列区域并可以根据本发明的具体准则确定等同的酶。
“功能等同物”还包括本发明的多肽的片段,优选各个结构域或序列 基序,这些片段具有,例如,所需的生物功能。
此外,“功能等同物”是包含任何上述多肽序列或其衍生的功能等同物,以及至少一个在功能上与其不同并与其在N-末端或C-末端功能性连接的其他异源序列(即融合蛋白各部分间相互没有显著的功能损害)的融合蛋白。这种异源序列的非限制性实例是例如信号肽或酶。
本发明包含的“功能等同物”也是明确公开的蛋白质的同源物。所述同源物与明确公开的氨基酸序列之一具有使用Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad,Sci.(美国)85(8),1988,2444-2448的算法计算出的至少60%,优选至少75%,特别是至少85%,例如90%,95%或99%的同源性本发明的同源多肽的同源性百分率具体指基于本文明确描述的某一氨基酸全长的氨基酸残基一致性百分率。
在蛋白质可能糖基化的情况下,本发明的“功能等同物”包含上述类型蛋白质的脱糖基或糖基化形式,以及可通过改变糖基化类型获得的改性形式。
本发明的蛋白质或多肽的同源物可以通过突变,例如通过蛋白质的点突变或截短产生。
可以通过例如筛选突变体(例如截短突变体)的组合文库来鉴定本发明蛋白质的同源物。例如,可以通过核酸水平的组合诱变(例如,通过合成寡核苷酸混合物的酶促连接)产生蛋白质变体的花斑文库(variegatedlibrary)。有多种方法可用于从简并的寡核苷酸序列制备可能的同源物的文库。可以在DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成,接着可将合成基因连接到合适的表达载体上。基因简并集的使用使得可能在一种混合物中提供编码需要的一组可能的蛋白质序列的全部序列。合成简并寡核苷酸的方法为技术人员所公知(例如,Narang,S.A.(1983)Tetrahedron 39:3;Itakura等(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等人(1984)Science198:1056;Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11:477)。
在先技术公开了多种用于筛选通过点突变或截短制备的组合文库的基因产物的技术,以及多种用于筛选cDNA文库以寻找具有所选特性的基因 产物的技术。可以使这些技术适用于快速筛选通过本发明同源物的组合诱变产生的基因文库。通过高通量分析筛选大基因文库最常使用的技术包括将基因文库克隆进可复制的表达载体、将得到的载体文库转入合适的细胞并在所需活性的鉴定便于分离载体的条件下表达组合基因,所述载体编码其产物已被检测的基因。可与筛选实验组合应用提高文库中功能性突变体频率的递归系综诱变(Recursive ensemble mutagenesis,REM)技术,以鉴定同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 89:7811-7815;Delgrave等人(1993)Protein Engineering 6(3):327-331)。
D.脱氢酶的编码核酸序列
本发明特别涉及本发明的具有脱氢酶活性的酶的编码核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列,例如cDNA和mRNA)。优选例如根据SEQ IDNO:2的氨基酸序列或者其特征部分序列的编码核酸序列,或者包含根据SEQ ID NO:1的核酸序列或其特征部分序列的核酸序列。
本文所述的所有核酸序列可以根据本身已知的方法从核苷酸结构单元的化学合成制备,例如通过双螺旋的各个重叠的互补核酸结构单元的片段缩合。寡核苷酸可按已知方式化学合成,例如通过亚磷酰胺酸法(Voet,Voet,第二版,Wiley Press New York,896-897页)。在Sambrook等人(1989),Molecular Clonging:A laboratory manual,Cold Spring HarborLaboratory Press中描述了合成的寡核苷酸的装配并借助于DNA聚合酶Klenow片段和连接反应填补缺口,以及普通的克隆法。
本发明还涉及编码上述任一多肽的核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列,例如cDNA和mRNA)以及使用例如人工核苷酸类似物得到的它们的功能等价物。
本发明涉及本发明的多肽或蛋白质或其生物活性片段的分离的编码核酸分子,并涉及可用作例如杂交探针或识别或扩增本发明编码核酸的引物的核酸片段。
本发明的核酸分子还可包含基因编码区3’和/或5’端的非翻译序列。
本发明还包含与具体描述的核苷酸序列互补的核酸分子或其片段。
本发明的核苷酸序列可能产生可用于鉴定和/或克隆其他细胞类型和生物中同源序列的探针和引物。这些探针和引物通常含有在“严格”条件(见下文)下与本发明核酸序列的有义链或相应反义链的至少约12、优选至约25(例如大约40、50或75)个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区。
“分离的”核酸分子与该核酸天然来源中存在的其他核酸分子分离,另外,如果通过重组技术产生,则基本上不含其他细胞材料或培养基;如果是化学合成则不含化学前体或其他化学物。
本发明的核酸分子可按照标准分子生物学技术和按照本发明提供的序列信息来分离。例如,可通过使用任一明确公开的全长序列或其片段作为杂交探针和标准杂交技术(例如Sambrook.J.、Fritsch,E.F.和Maniatis,T,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold SpringHarbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY,1989中所述)从适当的cDNA文库中分离cDNA。另外,可使用基于任一公开序列产生的寡核苷酸引物,通过聚合酶链式反应分离含有该序列或其片段的核酸分子。通过这种方法扩增的核酸可以克隆进入合适的载体,并通过DNA序列分析描述特征。此外本发明的寡核苷酸可使用标准合成方法(例如使用自动DNA合成仪)制备。
原则上可从所有生物中鉴定和分离本发明的核酸序列。有利地,可从真菌、酵母、古细菌或细菌中分离本发明的核酸序列或其同源物。此处可能提到的细菌指革兰氏阴性和革兰氏阳性菌。本发明的核酸优选从革兰氏阴性细菌,有利地从α-蛋白菌(proteobacteria)、β-蛋白菌或γ-蛋白菌中分离,特别优选从伯克氏菌目(Burkholderiales)、嗜氢菌目(Hydrogenophilales)、嗜甲基菌目(Methylophilales)、奈瑟氏球菌目(Neisseriales)、亚硝化单胞菌目(Nitrosomonadales)、普罗卡杆菌目(Procabacteriales)或红环菌目(Rhodocyclales)细菌中分离,非常特别优选从红环菌科(Rhodocyclaceae)细菌,尤其优选从固氮弓菌属,尤其是从Azoarcus anaerobius、Azoarcus buckelii、Azoarcus communis、 Azoarcus evansii、Azoarcus indigens、Azoareus toluclasticus、Azoarcustolulyticus、Azoarcus toluvorans、固氮弓菌属物种、固氮弓菌属物种22Lin、固氮弓菌属物种BH72、固氮弓菌属物种CC-11、固氮弓菌属物种CIB、固氮弓菌属物种CR23、固氮弓菌属物种EB1、固氮弓菌属物种EbN1、固氮弓菌属物种FL05、固氮弓菌属物种HA、固氮弓菌属物种HxN1、固氮弓菌属物种mXyN1、固氮弓菌属物种PbN1、固氮弓菌属物种PH002、固氮弓菌属物种T和固氮弓菌属物种ToN1中分离。
特别优选使用来自固氮弓菌属物种EbN1的脱氢酶。
可使用例如普通杂交方法或PCR技术,通过例如基因组或cDNA文库从其他生物中分离本发明的核酸序列。这些DNA序列在标准条件下与本发明序列杂交。有利地使用保守区(如活性位点)的短寡核苷酸进行杂交,这些保守区可以通过技术人员已知的方式与本发明地脱氢酶进行比较来鉴定。然而,也可以使用本发明核酸的较长片段或全序列进行杂交。所述标准条件根据使用的核酸(寡核苷酸、长片段或全序列)或根据用于杂交的核酸类型(DNA或RNA)而变化。因此,例如DNA:DNA杂交体的解链温度比同样长度的DNA:RNA杂交体约低10℃。
根据核酸,标准条件指例如在42至58℃的温度,在具有0.1至5×SSC(1×SSC=0.15M NaCl、15mM柠檬酸钠、pH 7.2)浓度的水性缓冲溶液或另外存在50%甲酰胺中,例如42℃、5×SSC、50%甲酰胺。DNA:DNA杂交体的有利杂交条件为0.1×SSC且温度为大约20℃至45℃,优选为大约30℃至45℃。DNA:RNA杂交体的有利杂交条件为0.1×SSC且温度为大约30℃至55℃,优选为大约45℃至55℃。这些给出的杂交温度为通过约100个核苷酸长度且G+C含量为50%的核酸在不存在甲酰胺时的情况下计算出的解链温度。DNA杂交的实验条件描述于相关的遗传学教科书,例如Sambrook等,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,1989,并可使用技术人员所公知的公式计算,例如作为核酸长度、杂交类型或G+C含量的函数。技术人员可在以下教科书中找到杂交的其他信息:Ausubel等编,1985,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley& Sons,New York;Hames和Higgins编,1985,Nucleic Acids Hybridization:A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press,Oxford;Brown编,1991,Essential Molecular Biology:A Practical Approach,IRLPress at Oxford University Press,Oxford。
本发明还涉及明确公开的或可衍生的核酸序列的衍生物。
因此,本发明的其他核酸序列也可能衍生自例如SEQ ID NO:1并通过添加、取代、***或缺失一个或多个核苷酸与其相区别,且仍然编码具有需要的特性谱的多肽。
本发明还包括含有“沉默”突变或与明确提到的序列相比按照特定来源生物或宿主生物的密码子选择进行修饰的核酸序列,以及其天然存在的变体例如剪切变体或等位变体。
本发明还涉及通过保守核苷酸取代(即所述氨基酸被相同电荷、大小、极性和/或溶解性的氨基酸取代)得到的序列。
本发明还涉及明确公开的核酸通过序列多态性衍生的分子。由于天然变异,这些遗传多态性可存在于种群内的个体间。这些天然变异通常导致基因的核苷酸序列中1到5%的差异。
本发明核酸序列的衍生物是指例如在推断的氨基酸水平上,在完整序列区具有至少40%同源性、优选至少60%同源性、更特别优选至少80%、85%、90%、93%、95%或98%同源性的等位变体(关于氨基酸水平的同源性,可以参考上文关于多肽的注解)。有利的是,在序列的某些部位同源性可以更高。
另外,衍生物也指本发明核酸序列的同源物,例如真菌或细菌同源物、截短序列、编码或非编码DNA序列的单链DNA或RNA。因此,例如在DNA水平,在完整DNA区至少有40%、优选60%、特别优选70%、更特别优选80%的同源性。
另外,衍生物指例如与启动子的融合体。位于核苷酸序列上游的所述启动子可以通过一个或多个核苷酸的取代、***、倒置和/或缺失被修饰,却对该启动子的功能或效率没有不利影响。另外,可以通过修饰其序列提 高所述启动子的效率,或者该启动子可被更有效的启动子(包括不同种生物的启动子)完全取代。
衍生物还指改变了起始密码子上游从-1到-1000碱基或终止密码子下游从0到1000碱基区域的核苷酸序列,以修饰(优选为提高)基因表达和/或蛋白质表达的变体。
另外,本发明还包括在“严格条件”下与前述编码序列杂交的核酸序列。这些多核苷酸可通过筛选基因组文库或cDNA文库鉴定,并可在适当时使用合适的引物通过PCR方法从中扩增,接着使用例如合适的探针进行分离。另外,本发明的多核苷酸也可以化学合成。这一特性意味着多或寡核苷酸能在严格条件下与基本互补的序列结合,而在这些条件下非互补的配偶体间没有非特异的结合。为此,序列应为70-100%,优选90-100%互补。互补序列能彼此特异结合的特性被利用,例如在Northern或Southern印迹技术或PCR或RT-PCR中的引物结合。为此,通常使用长度可达30个碱基对的寡核苷酸。严格条件是指,例如在Northen印迹技术中,为洗脱非特异杂交的cDNA探针或寡核苷酸,在温度55-70℃,优选为60-65℃下使用洗脱液,例如含有0.1%SDS的0.1×SSC缓冲液(20×SSC:3M氯化钠、0.3M柠檬酸钠,pH 7.0)。在该过程中,只有如前述高度互补的核酸仍然彼此结合。严格条件的设置为技术人员所公知,并在例如Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中有描述。
E.本发明的构建体的实施方案
本发明还涉及含有在调控核酸序列的遗传控制下,编码本发明多肽的核酸序列的表达构建体;以及含有至少一个所述表达构建体的载体。
这些本发明的构建体优选含有特定编码序列5’上游启动子和3’下游终止子,并在适当位置含有其他通用调控元件,每种元件均与编码序列有效连接。
“有效连接”指启动子、编码序列、终止子和适当位置的其他调控元件以使每个调控元件均能在编码序列的表达中发挥自身作用的方式顺次排列。有效连接序列的实例如靶向序列和增强子、多腺苷酸化信号等等。其他调控元件包括可选择标记、扩增信号、复制起点等等。合适的调控序列在例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中有所描述。
本发明的核酸构建体具体指含有本发明的脱氢酶基因,其有利地与一个或多个用于控制(例如增强基因表达)的调控信号有效或功能性连接。
除这些调控序列之外,所述序列的天然调控仍然存在于实际的结构基因上游,并在适当时可被遗传修饰,以关闭天然调控而提高基因的表达。然而,核酸构建体的构建也可以更简单,即没有额外的调控信号***编码序列上游,且不去除原有启动子及其调控。反之,以使得调控不再发生并提高基因表达的方式突变天然调控序列。
优选的核酸构建体还有利地含有与使核酸序列表达增强的启动子功能性连接的一个或多个上述增强子序列。其他有利的序列(例如其他调控元件或终止子)也可被***DNA序列的3’末端。构建体中可存在一个或更多拷贝的本发明核酸。为选择构建体,构建体适当时还可以含有其他标记,例如抗生素抗性或营养缺陷互补基因。
本发明方法的有利调控序列存在于例如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、lambda-PR或lambda-PL的启动子中,这些启动子可有利的用于革兰氏阴性菌中。其他有利的调控序列存在于例如革兰氏阳性启动子amy和SPO2中,酵母或真菌启动子ADC1、Mfalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。在本文中,和例如来自汉森酵母(Hansenula)的丙酮酸脱羧酶甲醇氧化酶的启动子也是有利的。也可用人工启动子来调控。
核酸构建可通过***到载体(例如使基因在宿主中得到最佳表达的质粒或噬菌体)而在宿主生物中有利的的表达。除了质粒和噬菌体以外,载 体还指其他技术人员已知的载体,即例如病毒(如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒等)、转座子、IS元件、噬粒、粘粒和线性或环形DNA。这些载体可在宿主生物中自主复制或随染色体复制。这些载体构成了本发明的另一实施方案。合适的质粒为,例如大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、Igt11或pBdCI,链霉菌属(Streptomyces)中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361,芽孢杆菌(Bacillus)中的pUB110、pC194或pBD214,棒状杆菌(Corynebacterium)中的pSA77或pAJ667,真菌中的pALS1、pIL2或pBB116,酵母中的2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23或植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述的质粒是可能的质粒的一小部分。其他质粒为技术人员所熟知并可以在例如Cloning Vectors(Pouwels P.H.等人编辑,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985,ISBN 0 444 904018)一书中找到。
为了表达存在的其他基因,核酸构建体有利地额外含有增强表达的3’和/或5’末端调节序列,为实现最佳表达,取决于宿主生物和选择的基因对它们进行选择。
这些调控序列旨在使基因的特定表达及蛋白质表达成为可能。取决于宿主生物,这是指例如基因只在诱导后表达或过表达,或被瞬时表达和/或过表达。
在这点上,调控序列或因子可优选具有正面影响,并因此提高引入基因的基因表达。因此,通过使用强转录信号(例如启动子和/或增强子),调节元件可在转录水平被有利地加强。然而,另外也可通过例如提高mRNA稳定性来增强翻译。
在载体的另一实施方案中,含有本发明核酸构建体或本发明核酸的载体还可以有利地以线性DNA的形式引入微生物,并通过异源或同源重组整合入宿主生物基因组。该线性DNA可由线性化载体(如质粒)或仅由本发明的核酸构建体或核酸组成。
为了异源基因在生物体中的最佳表达,可有利地按照该生物使用的特定密码子选择来修饰核酸序列。密码子选择可以在所述生物其他已知基因的计算机评估基础上方便的确定。
本发明的表达盒通过将适当的启动子与适当的核苷酸编码序列以及终止子信号或多腺苷酸化信号融合而制备。为此,使用常规重组和克隆技术,例如在T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,NY(1989)和T.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY(1984)和在Ausubel,F.M.等人,Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中所描述的。
通过将重组核酸构建体或基因构建体有利的***能使基因在宿主中最佳表达的宿主特异载体而使其在适当的宿主生物中表达。载体为技术人员所熟知,并可以在例如“Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等人编辑,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985)中找到。
F.根据本发明可使用的宿主
可以借助本发明的载体或构建体制备转化了例如至少一种本发明载体并可用于产生本发明的多肽的重组微生物。有利地将上述本发明的重组构建体引入合适的宿主***并表达。在这一点上,优选使用技术人员熟悉的克隆和转染方法,例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔法、逆转录病毒转染等等,以在特定表达体系中表达所述核酸。合适的***描述于CurrentProtocols in Molecular Biology,F.Ausubel等人编辑,Wiley Interscience,New York 1997或Sambrook等人的Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989。
根据本发明,也可以通过同源重组制备微生物。为此,制备含有本发 明基因或编码序列的至少一个片段的载体,为了修饰(例如功能性破坏)本发明的序列(“敲除”载体),适当时在其中引入至少一个氨基酸的缺失、至少一个氨基酸的添加或至少一个氨基酸的取代。引入的序列也可以是例如来自相关微生物的同源物或可来自哺乳动物、酵母或是昆虫来源。另外,可以按如下方式设计用于同源重组的载体,其内源基因经同源重组突变或者修饰,而仍然编码功能蛋白质(例如,可修饰上游调控区以引起内源蛋白质的表达改变)。本发明基因的修饰片段存在于同源重组载体中。用于同源重组的适当载体的构建描述于如Thomas,K.R.和Capecehi,M.R.(1987)Cell 51:503。
用于本发明核酸或核酸构建体的适当的重组宿主生物原则上是所有的原核或真核生物。使用的有利的宿主生物为微生物,如细菌、真菌或酵母。使用有利的为革兰氏阳性或革兰氏阴性菌,优选肠杆菌科、假单胞菌科、根瘤菌科、链霉菌科和诺卡氏菌科的细菌,特别优选埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、沙门氏菌属(Salmonella)、农杆菌属(Agrobacterium)和红球菌属(Rhodococcus)的细菌。极其优选大肠杆菌属和种。另外,其他有利的细菌可见于α-蛋白菌、β-蛋白菌或γ-蛋白菌的组。
在这点上,本发明的一种或多种宿主生物体优选包含至少一种本发明中所述的并为本发明的具有脱氢酶活性的酶的编码核酸序列、核酸构建体或载体。
取决于宿主生物,以技术人员公知的方法培养或生长本发明方法中所使用的生物。微生物一般在有氧条件下培养于含有通常以糖形式存在的碳源、通常以有机氮源形式(例如酵母提取物)或盐形式(如硫酸铵)存在的氮源、微量元素(如铁、锰、镁盐),及适当时含有维生素的液体培养基中,温度为0℃到100℃之间,优选10℃到60℃之间。在这点上,营养液的pH可保持或不保持恒定,即培养时可调节或不调节。培养可是分批的、半分批的或连续的。营养素可在发酵起始时引入或半连续或连续地加 入。酮可直接加入培养物中或在培养后有利的加入。酶可依照实施例中所述方法从生物体中分离,或作为粗提取物用于反应。
G.本发明的多肽的重组制备
本发明另外涉及重组制备本发明多肽或其功能性、生物活性片段的方法,其中培养产生多肽的微生物,适当时诱导所述多肽的表达,将后者从培养物中分离出来。如果需要的话,也可以通过这种方法以工业规模生产多肽。
重组微生物可通过已知方法培养和发酵。例如,可以在20到40℃pH6到9的条件下在TB或LB培养基中繁殖细菌。合适的培养条件在例如T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook的Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,NY(1989)中有详细描述。
多肽不分泌进培养基中时,裂解细胞,通过已知蛋白质分离方法从裂解液中获得产物。可通过高频超声、通过高压(例如弗氏压碎器)、通过渗透压、通过去污剂、水解酶或有机溶剂的作用、通过匀浆器或通过所列方法中两种或多种的组合裂解细胞。
多肽的纯化可通过已知的层析方法如分子筛层析(凝胶过滤),例如Q琼脂糖层析、离子交换层析和疏水层析,以及其他常用方法如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳。合适的方法在例如Cooper,T.G.,Biochemische Arbeitsmethoden的The Tools of Biochemistry(原始题目),Verlag Walter de Gruyter,Berlin,New York或在Scopes,R.,ProteinPurification,Springer Verlag,New York,Heidelberg,Berlin中有所描述。
可以有利地通过例如载体***或寡核苷酸有利的分离重组蛋白质,所述寡核苷酸通过特定的核苷酸序列延伸cDNA并因而编码修饰的多肽或融合蛋白质从而简化纯化。例如,这类合适的修饰为作为锚的“标签”,例如已知的6组氨酸锚,或可以作为抗原被抗体识别的表位(在例如Harlow,E.和Lane,D.,1988,Antibodies:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press中有所描述)的修饰。这些锚可用于将蛋白质附着于固体载体上,例如可以填充入层析柱或微滴定板上或另一支持物的聚合物基质。
同时,这些锚还可以用于鉴定蛋白质。此外,可以单独或与所述锚组合使用常用标记(如荧光染料、与底物反应后形成可检测的反应产物的酶标记或者放射性标记),以鉴定蛋白质从而衍生所述蛋白质。
H.实施本发明的方法以制备(S)-链烷醇
根据本发明使用的具有脱氢酶活性的酶可以作为游离或固定化酶在本发明的方法中使用。
本发明的方法有利地在0℃至95℃,优选10℃至85℃,特别优选15℃至75℃之间进行。
在本发明的方法中,pH值有利地保持pH 4至12,优选pH 4.5至9,特别优选pH 5至8。
在本发明的方法中,对映纯性或手性产物或旋光醇是指表现出对映体富集性(enrichment)的对映体。优选在该方法中实现至少70%ee,优选至少80%ee,特别优选至少90%ee,非常特别优选至少98%ee的对映体纯度。
可以为本发明的方法所使用含有本发明的核苷酸、核苷酸构建物或载体的生长细胞。也可以使用静息的或破碎的细胞。破碎的细胞是指例如通过如溶剂处理为可渗透的细胞,或通过酶处理、通过机械处理(如弗氏压碎器或超声)或通过其他方法破碎的细胞。通过这种方法获得的粗提取物有利地适用于本发明的方法。纯化的或部分纯化的酶也可以用于该方法。可在反应中有利的使用的固定微生物或酶同样适用。
当用于本发明的方法时,方便地在萃取之前例如通过过滤或离心去除游离微生物或酶。
由本发明的方法制备的产物,例如(1S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)丙-1-醇可以有利地由水性反应溶液通过萃取或蒸馏获得。为了提高收率,萃取可 以重复数次。合适萃取剂的实例是甲苯、二氯甲烷、乙酸丁酯、二异丙醚、苯、MTBE或乙酸乙酯之类的溶剂,但不限于这些溶剂。或者,由本发明的方法制备的产物,例如(1S)-3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-丙-1-醇可以有利地通过萃取或蒸馏或/和结晶从反应溶液的有机相中分离。萃取可以重复数次以提高收率。合适萃取剂的实例是甲苯、二氯甲烷、乙酸丁酯、二异丙醚、苯、MTBE或乙酸乙酯之类的溶剂,但不限于这些溶剂。
在浓缩有机相之后,通常获得具有良好化学纯度的产物,也就是超过80%化学纯度。在萃取之后,也可以将包含产物的有机相仅部分浓缩并可以使产物结晶。为此,有利地将该溶液冷却至0℃至10℃。还可以直接从有机溶液或从水溶液中进行结晶。结晶产物可以再重悬于用于重新结晶的相同或不同的溶剂中,并重结晶。如果需要,随后有利的至少进行一次的结晶可以进一步提高产物的对映体纯度。
以用于该反应的底物为基础,上述加工类型能够以60%至100%,优选80%至100%,特别优选90%至100%的收率分离本发明方法的产物,例如3-甲氨基-1-(2-噻吩基)丙-1-酮。分离的产物以大于90%,优选大于95%,特别优选大于98%的高化学纯度为特征。此外,如果需要,可以有利地通过结晶进一步提高产物具有高对映体纯度。
本发明的方法可以分批、半分批或连续进行。
该方法可以有利地在例如Biotechnology,卷3,第二版,Rehm等人编著,(1993),特别是第二章中所述的生物反应器中进行。
以上说明和以下实施例仅用于阐述本发明。本发明同样包括技术人员所显而易见的各种可能的修改。
本发明的方法的优点是式(I)的旋光链烷醇的特别高收率或链烷酮(II)的几乎定量转化。
实验部分:
实施例1:通过合成寡核苷酸的方式克隆固氮弓菌属物种EbN1的苯基乙醇脱氢酶
固氮弓菌属物种EbN1的苯基乙醇脱氢酶的基因序列记录于数据库中(Genbank ID 25956124,区域:25073至25822)。根据已知方法合成基因的寡核苷酸衍生自苯基乙醇脱氢酶基因的核酸序列。表1概括了所述寡核苷酸的DNA序列。图3显示了各个寡核苷酸相对于整个固氮弓菌属物种EbN1苯基乙醇脱氢酶基因的位置。在例如Y.P.Shi,P.Das,B.Holloway,V.Udhayakumar,J.E.Tongren,F.Candal,S.Biswas,R.Ahmad,S.E.Hasnain和A.A.Lal,Vaccine 2000,18,902-2914页中描述了制备合成基因的方法。所得序列于公开的序列相同。
用限制性内切酶NdeI和BamHI消化PCR产物并克隆到已由此消化的pDHE19.2载体(DE19848129)中。将连接混合物转入大肠杆菌XL1 Blue(Stratagene)。将pDHEEbN1质粒转入大肠杆菌菌株TG10 pAgro4pHSG575(TG10:衍生自大肠杆菌TG1的RhaA-(Stratagene);pAgro4:Takeshita,S;Sato,M;Toba,M;Masahashi,W;Hashimoto-Gotoh,T(1987)Gene 61,63-74;pHSG575:T.Tomoyasu等人(2001),Mol.Microbiol.40(2),397-413)。
该重组大肠杆菌被称作大肠杆菌LU 11558。
表1
制备固氮弓菌属物种EbN1苯基乙醇脱氢酶的合成基因的寡核苷酸
#1 | GAGCGATTTGCGGTCGAAGGTGCCGACATCGCAATCGCGGATCTGGTGCCG GCCCCGGAAGCCGAGGCAGCAATCAGGAACCTCGGTCGGCGCGT |
#2 | GCACCTTCGACCGCAAATCGCTCCGCAATTGCCCGCCCGATGCCGTTGGCA CCGCCGGTAATTACTGCAAGCTTGTCCTTCAGTCTTTGCGTCAT |
#3 | AAACGTGGAGATGACCTGCTTTCCGAATGCTTCTACGTCGCCAGGTTGCGAG ACATCGCACTTCACGGTCAGAACGCGCCGACCGAGGTTCCTGA |
#4 | GGACCTGGGGAAGGACGGAATCACTGTTAACGCCATCGCGCCGAGCCTTGT CCGCACGGCAACAACCGAAGCTTCTGCATTGTCCGCGATGTTCGAC |
#5 | GAAAGCAGGTCATCTCCACGTTTGGTCGCTGCGACATCCTCGTCAACAACGC GGGAATTTACCCGCTGATTCCTTTTGACGAGCTGACCTTTGAAC |
#6 | AGGAACGCAGCTGCGCCCGTCAGATCCAGGGGCACCTGAAGACGCGGAATC GCCTGAAGCATGTTTGGCAGCACGTCGAACATCGCGGACAATGCAG |
#7 | GATTCCGTCCTTCCCCAGGTCCGAGGCAAGGGCGCGGGTAAAGCCTATGTT TGCCGCTTTCGTGCTGATGTAATGGGTATACGCCTCGATCTTTAGC |
#8 | GAAGGCTTTTGTCCCCGGGATGAAGAGGAACGGGTGGGGACGCATCATCAA CCTGACTTCGACGACATATTGGCTAAAGATCGAGGCGTATACCC |
#9 | CATCCCGGGGACAAAAGCCTTCGCCATAAGAAAACCTGAATCGACGTTGATC TCGAATGTTTTCTTCCACTGTTCAAAGGTCAGCTCGTCAAAAG |
#10 | GACGGGCGCAGCTGCGTTCCTGGCTTCCGATGACGCCAGTTTTATTACAGG CCAGACGCTCGCGGTTGATGGCGGTATGGTGAGACACTGA |
#11 | TCAGTGTCTCACCATACCGCCATC |
#12 | ATGACGCAAAGACTGAAGGACAAG |
实施例2:通过PCR方法克隆固氮弓菌属物种EbN1的苯基乙醇脱氢酶
固氮弓菌属物种EbN1的苯基乙醇脱氢酶的基因序列已经记录于数据库中(Genbank ID 25956124,区域:25073至25822)。寡核苷酸(引物MKe0387和MKe0388)衍生自苯基乙醇脱氢酶基因的核酸序列,其用于如下通过PCR扩增方法来克隆脱氢酶基因。
PCR:
模板 | 引物 | 产品长度 |
来自固氮弓菌属物种EbN1的 亚克隆DNA或来自固氮弓菌 属物种EbN1的染色体DNA | MKe0387和MKe0388 | 大约750bp |
引物:
引物号 | 序列(5’->3’) | 位置 |
MKe0387 | GGGAATTCCATATGACGCAAAGACTGAAGG | N-末端引物 |
MKe0388 | CGCGGATCCTCAGTGTCTCACCATACCGCC | C-末端引物 |
将等摩尔量(各130纳克)的引物MKe0387和MKe0388混合。根据 标准Stratagene方案使用PfuTurbo聚合酶(Roche Applied Science)和下列温度梯度程序进行PCR:95℃5分钟;95℃45秒、55℃达45秒和75℃1分钟,进行30个循环;72℃10分钟;10℃直至使用。通过琼脂糖胶电泳(1.2%E-Gel,Invitrogen)和柱层析(GFX试剂盒,AmershamPharmacia)分离PCR产品(大约0.75kB),然后测序(测序引物:MKe0387和MKe0388)。所得序列与公开序列相同。用限制性内切酶Ndel和BamHI消化PCR产物并克隆到已由此消化的pDHE19.2载体(DE19848129)中。将连接混合物转入大肠杆菌XL1 Blue(Stratagene)。由此获得的质粒中的***物,pDHEEbN1(通过为相应的克隆测序,揭示该***物)是SEQID NO:1中所示的核酸序列。
将pDHEEbN1质粒转入大肠杆菌菌株TG10 pAgro4 pHSG575(TG10:衍生自大肠杆菌TG1的RhaA-(Stratagene);pAgro4:Takeshita,S;Sato,M;Toba,M;Masahashi,W;Hashimoto-Gotoh,T(1987)Gene 61,63-74;pHSG575:T.Tomoyasu等人(2001),Mol.Microbiol.40(2),397-413)。
该重组大肠杆菌被称作大肠杆菌LU 11558。
实施例3:大肠杆菌LU 11558的重组苯基乙醇脱氢酶的提供
在100毫升锥形烧瓶(bafflers)中,大肠杆菌LU 11558在20毫升LB-Amp/Spec/Cm(100微克/升氨苄青霉素;100微克/升壮观霉素;20微克/升氯霉素)、0.1mM IPTG、0.5克/升鼠李糖中37℃将培养18小时,以5000*g离心10分钟,用10mM TRIS*HCl,pH 7.0洗涤一次,并再重悬于2毫升相同的缓冲剂中。在振动球磨机(vibratory mill)(3×5分钟,中间在冰上冷却却)中用0.7毫升玻璃珠(d=0.5毫米)破碎大肠杆菌LU11558细胞糊(cell paste),由此制备无细胞的蛋白质粗提物。
实施例4:大肠杆菌LU 11558重组脱氢酶活性的测定
在每种情况下,在100毫升锥形烧瓶(bafflers)中,6种转化体在20 毫升LBAmp/Spec/Cm(100微克/升Amp;10毫克/升Spec;20微克/升Cm)、0.1mM IPTG、0.5克/升鼠李糖中37℃将培养18小时,以5000*g离心10分钟,用10mM Tris/HCl pH 7.0洗涤一次,并再重悬于2毫升相同的缓冲剂中。在含有50微升/毫升葡萄糖DH、100mM葡萄糖、10mMNaCl、1mM NADH、1mM NADPH的900微升50mM MES pH6中及10mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮,将100毫升细胞悬浮液振荡培养20分钟。根据与实施例4类似的方式分析反应混合物。平均而言,制造0.13mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇,相当于6.6U/l的培养悬浮液的活性。在包含已经通过在振动球磨机(3×5分钟,中间在冰上冷却却)中用0.7毫升玻璃珠(d=0.5毫米)破碎细胞获得的粗提物的类似反应混合物中,测得0.21mM3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇,相当于10.7U/l的活性。在培养过程中不添加鼠李糖的对照实验中没有可检测的3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇。
实施例5:3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮和3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的分析
可以通过HPLC测定3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮和3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇的浓度。除浓度外,还可以根据静止和流动相的选择测定ee值。
a)非手性分析
使用下列***定量分析该反应:
静止相:Chromoltih SpeedROD RP18,50*4,6微米,Merck(Darmstadt,德国),加热至45℃
流动相:洗脱剂A:10mM KH2PO4,pH 2.5
洗脱剂B:乙腈
梯度:0-0.5分钟,35%B;0.5-10分钟35至80%B;1.0-1.2分钟
80%B;1.2-1.3分钟80%-35%B;1.3-2.0分钟35%B;
流速:1.5毫升/分钟
检测:在230和260纳米进行UV检测
停留时间:3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮:大约1.6分钟
3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇:大约1.3分钟
使用可靠材料,制造校准系列,根据其可以测定未知样品的浓度。
b)手性分析
静止相:Chiracel OD-H,250*4,6微米,Daicel,加热至40℃
流动相:洗脱剂A:正己烷
洗脱剂B:异丙醇
用2.5%B等度洗脱(isocratic)
流速:1.0毫升/分钟
检测:在230和260纳米进行UV检测
停留时间:3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮:大约9.5分钟
(1S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇:大约16.6分钟
(1R)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇:大约18.3分钟
使用可靠材料,制造校准系列,根据其可以测定未知样品的浓度。
实施例6:大肠杆菌LU 11558重组脱氢酶活性的测定
在每种情况下,在100毫升锥形烧瓶(bafflers)中,6种大肠杆菌LU11558转化体在20毫升LBAmp/Spec/Cm(100微克/升Amp;50毫克/升Spec;10微克/升Cm)、0.1mM IPTG、0.5克/升鼠李糖中37℃培养18小时,以5000*g离心10分钟,用10mM Tris/HCl pH 7.0洗涤一次,并再重悬于2毫升相同的缓冲剂中。在含有50微升/毫升葡萄糖DH(实施例......)、100mM葡萄糖、10mM NaCl、1mM NADH、1mM NADPH及10mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮的900微升50mM MES pH6中,将100毫升细胞悬浮液振荡培养20分钟。根据与实施例4类似的方式分析反应混合物。平均而言,制造0.13mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇,相当于6.6U/l的培养悬浮液的活性。在含有已经通过在振动球磨机(3×5分钟,中间在冰上冷却却)中用0.7毫升玻璃珠(d=0.5毫米)破碎细胞获得的粗提物的类似反应混合物中,测得0.21mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇,相当于10.7U/l的活性。在培养过程中不添加鼠李糖的对照实验中没有可检测的 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇。
实施例7:使用包含2-戊醇的固氮弓菌属物种EbN1的重组脱氢酶制备(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇
在0.75升反应器中,在221毫升50mM KH2PO4和250毫升2-丙醇中将大肠杆菌LU11558(1-20克/升生物量)的静息细胞与0.2mM NAD+和185mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮(12.5毫升)在40℃(250转/分钟)搅拌。通过用5M NaOH滴定,使反应保持在pH 5.5。通过HPLC分析监测反应直至有机相中50-350mM TACA的浓度。
实施例8:使用包含2-戊醇的固氮弓菌属物种EbN1的重组脱氢酶制备(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇
在4升反应器中,在1432毫升50mM KH2PO4和2000毫升2-丙醇中将大肠杆菌LU11558(1-20克/升生物量)的静息细胞与0.2mM NAD+和370mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮(200毫升)在40℃(250转/分钟)搅拌。通过用5M NaOH滴定,使反应保持在pH 5.5。通过HPLC分析监测反应直至有机相中100-650mM TACA的浓度。
实施例9:使用包含2-戊醇的固氮弓菌属物种EbN1的重组脱氢酶制备(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇
在4升反应器中,在1432毫升50mM KH2PO4和2000毫升2-丙醇中将大肠杆菌LU11558(1-20克/升生物量)的静息细胞与0.2mM NAD+和370mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮(200毫升)在40℃(250转/分钟)搅拌。通过用5M NaOH滴定,使反应保持在pH 5.5。施加大约85毫巴的真空和50-70℃的护套温度。在反应过程中以2-10毫升/分钟的蒸馏速率连续再加入蒸馏量的水和所得2-丙醇。通过HPLC分析监测反应直至有机相中300-700mM TACA的浓度。使3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮反应至0-30%的残留部分。
实施例10:使用包含2-戊醇的固氮弓菌属物种EbN1的重组脱氢酶制备(S)-3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-醇
在0.75升反应器中,在221毫升50mM KH2PO4和250毫升2-丙醇中将大肠杆菌LU11558(1-20克/升生物量)的静息细胞与0.2mM NAD+和200mM 3-氯-1-(噻吩-2-基)丙-1-酮(12.5毫升)在40℃(250转/分钟)搅拌。通过用5M NaOH滴定,使反应保持在pH 5.5。通过HPLC分析监测反应直至有机相中50-320mM TACA的浓度。
Claims (6)
1.制备式I的旋光链烷醇的方法
其中
n是0至5的整数;
Cyc是任选取代的单核或多核、饱和或不饱和碳环或杂环,且
R1是卤素、SH、OH、NO2、NR2R3或NR2R3R4+X-,其中R2、R3和R4彼此独立地为氢,或1至6个碳原子的低碳烷基或低碳烷氧基,且X-是抗衡离子,
该方法包括在存在NADH或NADPH的情况下,在包含式II的链烷酮的培养基中孵育下述酶,
其中n、Cyc和R1如上所定义,
所述酶的多肽序列是SEQ ID NO:2,
将式II的化合物酶促还原以产生式I的化合物,并借助于所述酶使牺牲醇反应以产生相应的牺牲酮并从反应培养基中至少部分去除所述牺牲酮,由此使反应过程中消耗的NADH或NADPH再生,并分离形成的产物(I),
所述牺牲醇是异丙醇、2-丁醇、2-戊醇、2-己醇或3-己醇,所述牺牲酮是丙酮、2-丁酮、2-戊酮、2-己酮或3-己酮。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述酶由根据SEQ ID NO:1的核酸序列或由其功能等同物编码。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其中所用牺牲醇是2-戊醇。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其中通过蒸馏从反应培养基中至少部分去除反应过程中由牺牲醇形成的牺牲酮。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述反应在已用根据权利要求1定义的酶的编码核酸构建体转化的重组微生物的存在下进行。
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