CN102159333A - 归一化样品中生物分子含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种归一化样品中生物分子含量的方法，其包括以下步骤：a)提供反应容器，该容器的容器表面至少部分官能化，优选在容器内部官能化，以使该容器表面能够在高盐条件下可逆地结合生物分子；b)进行至少一个样品制备步骤；c)在高盐条件下使所制备样品中的生物分子结合于容器表面(“结合和归一化步骤”)；d)任选洗涤(“洗涤步骤”)；和e)进行至少一个后续反应(图6b)。本申请还涉及用于上述方法的反应容器。

Description

归一化样品中生物分子含量的方法
技术领域
本发明涉及归一化样品中生物分子含量的方法、应用和设备。所述方法、应用和设备适合应用于生物化学、分子生物学、分子遗传学、微生物学、分子诊断和/或分子法医学等领域。
技术背景
归一化样品中生物分子含量在样品分析，例如分子诊断、基因表达分析、基于有效物质的转录水平分析、分子法医学、测序或基因分型中起到重要作用。
之所以进行归一化的原因是，在一些情况下待测生物分子，特别是核酸和/或蛋白质在样品中的含量不同。此外，制备样品的加工步骤，例如裂解、细胞变性、分离步骤或逆转录可能以不同效率水平提供待研究的生物分子。
在这两种情况下，意味着由于上述不确定因素样品中生物分子含量未知会影响进一步制备和分析步骤的重现性和准确性，或者导致需要额外的定量步骤。
对于包含随后准备采用已知方法(聚合酶链反应(PCR)、逆转录、免疫-PCR)检测的核酸的样品的制备而言，这尤其重要。在这种情况下，协调工艺参数，特别是样品中的生物分子含量非常重要，以便达到所需的循环数。
在过去几十年中聚合酶链反应(PCR)已经被建立为体外DNA扩增的体系。同时，由于该技术不仅是用于定性分析的扩增技术，还发展成用于定量分析的″实时″PCR，所以PCR已成为广泛使用的分析和测定工具。目前，检测所谓的信使RNA(mRNA)，即某些基因片段的RNA转录物是一项标准应用。在这方面，用引物(常常是多聚dT)和酶(逆转录酶)将样品中所有mRNA均转录成DNA(cDNA)，通过PCR试验检测如此形成的cDNA。因 此，可能以一步或两步方式进行这些试验。在一步方式中，逆转录(RT)以及PCR试验本身在PCR仪中进行，而在两步方式中，逆转录单独进行后，将一份反应物加入PCR主混物中。然而，不同样品的mRNA水平可能差异很大，此外，RT的效率也会导致一些波动。这有时导致引入PCR反应的cDNA量差异很大。
在现有技术中，通常在开始逆转录之前测定样品的RNA含量，例如借助OD检测法或荧光检测法进行测定。通常不在cDNA水平上进行定量测定，因为逆转录完成后核苷酸、核糖体RNA和其它组分的存在会使cDNA的定量分析复杂化。
这种定量分析特别适合在所谓的两步法中应用，在两步法中样品制备(例如通过裂解、细胞变性、分离步骤或逆转录)和进一步样品加工(例如通过PCR)在不同步骤中和/或在不同容器中进行，因此可能在两个步骤之间进行吸移步骤。这一步骤也适合将已经制备的样品直接进行PCR分析的方法中应用。
就现有技术的两步PCR的情况来看，在单独容器中进行逆转录，然后将其吸移到PCR主混物中。此时，可在逆转录后通过分光光度法测定cDNA含量一次。然而，因为需要付出额外劳动通常省去这一步，并且只有一份RT反应物用于qPCR。为了防止PCR主混物的过度稀释，最多只将10％的主混物量作为一等份加入其中。这意味着在使用2.5μL的25-μL PCR中，只将略多于10％的逆转录产物用于PCR反应，或者再一次重申必须避免使用较大体积。同时，额外的吸移步骤进一步导致不精确，正如任何手工操作那样。还存在交叉污染的额外风险。
在本发明方法中，不需要考虑PCR反应试验中的额外体积，因为cDNA可逆地结合于反应容器中的限定表面。
以前的方法不适用于在同一容器中制备样品(例如，通过裂解和/或逆转录)和进一步样品加工(例如通过PCR)，如果可能的话使该容器保持封闭的方法(所谓的一步法)。
在现有技术的一步法中，使用任选经分光光度法定量测定的一定量的生物分子(如mRNA)。在同一反应容器中进行逆转录和PCR法本身。因此， 由于在过程中如果可能的话不打开反应容器，能够将全部逆转录体系都转移到PCR反应中。然而对所用样品而言，生物分子(例如mRNA)含量可能差异很大，并且样品制备步骤(例如逆转录)的效率也引起波动，有时进而导致样品制备步骤完成后产物(如cDNA)量差异很大，然后引入后续反应(如PCR)，导致反应结果不具重复性。此外，由于额外反应体积通常为20μL，所以不可能用PCR的惯用体积25μL进行操作。通常在50-μL或100-μL体系中进行一步法RT-PCR。
在本发明方法和本发明设备中，利用本发明产生的结合表面，而不是用OD测量法或荧光测量法，在设备中归一化(例如)核酸的绝对量。相对而言，所谓的“持家方法”代表内参或内标，也可用于指示生物***的状态。可利用持家基因评估该试验的质量，因为就某些持家基因而言，其在某些细胞类型中的表达水平存在标准值。
然而，必须注意到在该方法中，归一化的精确度受到可能的不确定性的很大限制。因此，没有理想的持家基因；即在任何情况下均可观察到基因表达的物种、类型、阶段或状态特异性变化，即使使用多个持家基因也无法完全消除这种变化。
此外，US 20070231892披露了一种扩增核酸的方法，其中在容器中使生物样品裂解物与所谓的“电荷开关”表面相接触，以结合裂解物中所含的核酸。然后去除未结合的裂解物，扩增结合的核酸。就所述“电荷开关”材料而言，pH改变时表面电荷发生变化。这种弱离子交换剂的特性出现在，例如，pH低于表面基团的pK值时，因此这些表面基团具有正表面电荷。然后，可结合带负电的生物分子，具体是核酸。另一方面，当pH高于表面基团的pK值时，电荷从正电荷改变为中性或负电荷，以便再次释放带负电的生物分子，具体是核酸。因此，通过使用具有不同pH值和低盐浓度的合适缓冲液(″低盐缓冲液″)，可通过pH控制结合和释放过程。
具体说，所述“电荷开关”材料具有阴离子交换剂特性。此种方法的一个缺点是无法将合适材料永久性地共价连接到，例如聚丙烯制成的微反应容器表面上。所述材料通常通过简单堆积固定在表面上。然而无法保证永久性粘附于表面，这使得这些方法的重复性备受质疑，也使得相应包被 容器不可能用于多种应用。
此外，由于广泛存在的RNA酶，使用″电荷开关″材料、通常使用阴离子交换剂在所述条件下从生物样品中分离RNA也困难重重。在普遍使用的低盐条件下依然如此，因此RNA在数秒内严重降解，难以甚至不可能对其进行检测。
定义
具体说，在本发明含义内，术语“核酸”指(但不限于)天然的，优选线性、分支或环状的核酸，如RNA，具体是mRNA、单链和双链病毒RNA、siRNA、miRNA、snRNA、tRNA、hnRNA或核酶，基因组、细菌或病毒DNA(单链和双链)，染色体和附加体DNA，游离循环的核酸等，合成或修饰的核酸，如质粒或寡核苷酸，具体是引物、探针或用于PCR的标准品，用地高辛、生物素或荧光染料标记的核酸，或者所谓的“肽核酸”(PNA)。
术语“归一化样品中生物分子含量”应指保证样品中的生物分子含量不超过特定程度的步骤(根据本发明，依据容器表面(优选容器内)的至少一部分的大小和结合特性)。这是一种将生物分子含量确定到某特定值的方法。这包括随后丢弃超过所述程度的生物分子，也意味着如果样品含有少于上述特定程度的生物分子，则无法成功进行归一化。
具体说，在本发明含义内，术语“固定”指(但不限于)可逆地固定在合适的固相上。
具体说，术语“膜”指(但不限于)能够可逆地结合生物分子的固相。
具体说，术语“高盐缓冲液”指(但不限于)高盐浓度(优选离液物质)缓冲液，优选≥100mM，更优选≥500mM，更优选≥1M。
术语“高盐条件”指(但不限于)使用高盐缓冲液，优选含有离液盐的高盐缓冲液的环境。使用高盐[缓冲液]，优选含有离液盐的高盐缓冲液降低核酸在水中的溶解度。原因是氢桥的降解，以及相关联的核酸在水中的二级和三级结构稳定性降低。如果随后提供极性表面作为氢桥供体，则核酸结合于该表面，因为它们在该位置上比在水中更稳定。如果盐浓度降低，水再一次变成优于极性表面的氢桥供体，因而核酸从表面上解离。
具体说，术语“离液物质”或“离液盐”指(但不限于)能改变蛋白质和 /或核酸的二级、三级和/或四级结构，但至少不改变其一级结构的物质，它能降低极性物质在水中的溶解度和/或加强疏水性相互作用。优选的离液物质是盐酸胍、(异)硫氰酸胍、碘化钠、高氯酸钠、碘化钾、(异)硫氰酸钠和/或脲。
具体说，术语“硅烷醇基团”指(但不限于)氧化硅(无定形、结晶)或组成为SiO2x(OH)α(OEt)β的聚硅酸(其中化学剂量因子α是x和β的函数，即α＝4(1-x)-β)。二氧化硅或聚硅酸可含有一个或多个下述替代物，或者也可被下述氧化物完全替代。
B2O3(0-30％)，
Al2O3(0-100％)，
TiO2(0-100％)，
ZrO2(0-100％).
所述材料可能也是表面官能化的。例如，可用硅烷进行硅烷化，以处理硅烷醇基团。表面可能是疏水的，或者可能施加了阴离子基团和/或阳离子基团和/或螯合剂。例如，可施加三乙酸腈(NTA)部分，作为螯合剂基团。这能使吸附表面适合待结合的生物分子。
另一种观点是利用硅烷化过程将含卤素的原子转移自由基引发剂施加到硅烷醇基团上，以便利用硅烷醇基团上的“嫁接”过程产生聚合物链。这种方法也称为接枝共聚，需要链终止、歧化或再化合倾向轻微的聚合过程。必须将引发剂施加于硅烷醇基团，以进行接枝共聚。这可通过用含卤素的硅烷处理PECVD硅酸盐层实现。或者，将引发剂直接引入PECVD过程。在这方面，将挥发性的含卤素化合物加入过程气体(PECVD过程中的前体)中。如果在这种含卤化物表面上进行ATRP，则原位产生共价结合所述表面的聚合物(均聚物、共聚物、嵌段共聚物)。合适的单体是可自由基聚合(radically polymerizable)的化合物，如丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、苯乙烯和苯乙烯衍生物。
原子转移自由基聚合(ATRP)是原位自由基聚合的一种形式。有机卤化物借助原子转移过程通过Cu(I)/Cu(II)氧化还原平衡形成自由基。氧化还原平衡导致自由基浓度大大降低。因此，歧化或再化合引起的链终止反应被大大抑制。
术语“扩增反应”指允许一种或多种分析物，优选核酸的浓度至少翻倍的 方法。
在此处介绍等温和热循环扩增反应的区别。在前者中，在整个过程中温度保持恒定，而在后者中，运行热循环，籍此控制反应和扩增。
下面是优选的等温扩增反应的例子：
●环介导的等温扩增(LAMP)，
●基于核酸序列的扩增(NASBA)，
●滚环链反应(RCCR)或滚环扩增(RCA)和/或
●转录介导的扩增(TMA)。
下面是优选的热循环扩增反应的例子：
●连接酶链反应(LCR)，和/或
●聚合酶链反应(PCR)。
术语“聚合酶链反应”(PCR)指体外扩增核酸的方法，如Bartlett和Stirling(2003)所述。
术语“连接酶链反应”(LCR)指非常少量核酸的检测方法，其功能类似于聚合酶链反应，但使用不同的酶(连接酶，而非聚合酶)。每条DNA链使用两个样品，连接形成样品。一个循环得到的扩增产物常常只有30-50bp长，将其本身再用于后续循环，作为补充引物的起点。
术语“环介导的等温扩增”(LAMP)指使用识别靶序列上特定区域并与其结合的六种不同引物的等温扩增方法。LAMP使用具有链置换活性的DNA聚合酶，在大约65℃的恒定温度下进行。在一个步骤中扩增和检测靶序列。
术语“基于核酸序列的扩增”(NASBA)指一种扩增RNA的方法(Compton，1991)。将RNA基质加入反应混合物，第一引物结合该基质3′末端区域中的互补序列。然后，用逆转录酶将与基质互补的DNA链多聚化。然后，用RNA酶H消化该RNA基质(RNA酶H只消化RNA-DNA杂交体中的RNA，而不消化单链RNA)。然后，使第二引物结合于DNA链的5′端。这一引物被T7 RNA聚合酶用作合成与该DNA链互补的RNA分子的起点，然后该RNA分子可再次用作起点基质。NASBA通常在41℃的恒定温度下进行，在某些情况下能够比PCR提供更快和更优的结果。
术语“转录介导的扩增”(TMA)指美国基因探针公司(Gen-Probe)开发的等 温扩增方法，其类似于NASBA，同样使用RNA聚合酶和逆转录酶(Hill，2001)。
术语“滚环链反应”(RCCR)或“滚环扩增”(RCA)指按照滚环原理仿效普通核酸复制的扩增方法，参见US 5,854,033等。
术语“免疫-PCR”(IPCR)具体指检测靶分子的方法，其中使用来自靶点特异性抗体和核酸分子的嵌合偶联物。
从性质上看，所述靶分子主要包括蛋白质和/或寡肽，因为最容易产生该类分子物质的高度特异性抗体。然而，所述靶分子还可包括其他生物分子物质，例如寡糖和多糖或脂质，只要可产生抗此种生物分子物质的高度特异性抗体以便用免疫-PCR检测该抗体即可。
核酸分子用作标记或探针时，用聚合酶链反应(PCR)扩增它以便产生信号。核酸扩增的非常高的效率和结合的高度特异性导致，与检测靶分子的标准方法(例如ELISA法)相比灵敏度提高100至10,000倍。IPCR是1992年开发的(Sano等(1992))。
术语“逆转录”指将mRNA转录成DNA(所谓″cDNA″)的方法，其中通常使用逆转录酶(也称为RNA依赖性DNA聚合酶)。后者首先通过RNA依赖性聚合酶活性由单链RNA合成RNA-DNA杂交体链。该蛋白的独立部分，即RNA酶H部分负责随后降解RNA部分。再通过DNA依赖性DNA聚合酶活性从单链DNA链形成双链DNA。然后，用PCR扩增和检测以此方式产生的cDNA。
与其他DNA聚合酶相同的是，逆转录酶也需要引物来启动DNA合成。在这种情况下，常常使用所谓的寡d(T)引物，即多个胸腺嘧啶碱基，它与mRNA的3′末端的聚(A)尾互补。
常常联合使用逆转录和后续PCR(也称为RT-PCR)来检测样品中一种或多种mRNA的含量，例如用于基因表达分析、产生基因表达概况等。在所谓的“两步RT-PCR”中，使用不同引物等进行逆转录和后续PCR，而在“一步RT-PCR”中，用于逆转录的基因特异性引物也可以用于后续PCR，以便在同一容器中连续进行这两个反应。根据所用逆转录酶(通常是病毒来源的)在较低温度下具有变性作用，而正如众所周知的那样，所用DNA聚合酶(如Taq聚合酶)只在相对较高的温度下具有变性作用，因此进行逆转录的温度低于后续 PCR的温度。优选采用热可逆性抑制的所谓的“热启动”DNA聚合酶。从逆转录的较低温度水平到PCR的较高温度水平转变时，一方面能变性逆转录酶，另一方面能通过消除热可逆性抑制激活DNA聚合酶。所述热可逆性抑制可通过，例如，采用结合DNA聚合酶活性中心的抗体实现，或者也可通过，例如，用醛可逆性地共价或非共价化学修饰聚合酶实现(参见例如，本申请人的US6,183,998)。综述还可参见Birch等(1996)。
术语“实时PCR”也指定量PCR或qPCR(避免与逆转录PCR相混淆)，它是基于已知聚合酶链反应(PCR)的原理，也能定量测定扩增的DNA。在PCR循环期间记录荧光测量值，从而进行定量测定(因此称为“实时”)。荧光与PCR产物量成正比。在运行(由多个循环组成)结束时，在PCR指数期根据接受到的荧光信号进行定量测定。只有在PCR指数期(在运行中持续数个循环)才可能正确定量，因为在此期间存在最优反应条件。因此，该方法不同于只能在PCR(如竞争性PCR)进行之后进行定量分析，且通常包括PCR片段的凝胶电泳分离的其它定量PCR方法。
染料如溴化乙啶、SYBR绿I和FRET探针或所谓的双染料寡核苷酸(也称为TaqMan探针)均适合于该检测。
术语“CT值”(阈值循环数)指第一次可检测到扩增产物的PCR循环数；通常测定荧光，表明第一次比背景荧光显著提高的最近一个循环。
在PCR反应的前期，模板(即待扩增DNA)量仍然有限，然而在扩增后期，产物量增加时受到已有产物的抑制，产物片段互相杂交的比例升高，初始产物逐步被耗尽。只有在这两个阶段之间，扩增循环数和扩增产物量之间存在指数关系(“指数期”)。用所述CT值确定指数期开始的时间点。
而且，低CT值表明少数PCR循环就足以使荧光第一次显著增加到背景噪声以上(即存在相对大量模板)，而高CT值相应地表明需要大量PCR循环才能达到这一目的(即存在较少的模板)。
术语“酶联免疫吸附实验”(ELISA)指基于酶促颜色反应的免疫检测方法。
使用ELISA时，可能检测样品(血清、奶、尿液等)中的蛋白质、病毒和低分子量化合物如激素、毒素和杀虫剂。在这方面，利用特异性抗体结合待检测物质(抗原)的特性。事先用酶标记抗体或抗原。酶催化的反应用作存在抗原的 证据。酶转化所谓的底物，通常通过颜色变化、荧光或化学发光检测反应产物。信号强度通常与抗原浓度相关，因此ELISA也可用于定量检测。
下述术语“杂交捕获试验”(HCA)指将所研究的靶DNA与RNA样品仪器孵育形成RNA-DNA杂交体的方法。杂交体结合于表面，然后用酶标记的抗体孵育。具体说，杂交捕获试验用于双基因公司(Digene)的HPV试验。
下述术语“嵌套式PCR”指将已被扩增的DNA片段再次扩增的方法；该方法用第一次反应所用的引物对内侧的第二个引物对进行。
发明目的
本发明的目的是至少基本克服现有技术中的所述缺点，并提供，特别是可广泛应用的归一化样品中生物分子含量的方法、应用和/或设备。
本发明的一个具体目的是提供更适合归一化样品中的生物分子，并适合与上述一步法和两步法一起使用的方法、应用和/或设备。
另一目的是提供可广泛应用的归一化样品中核酸含量的方法、应用和设备。
另一目的是提供可广泛应用的归一化逆转录RNA，优选mRNA产生的cDNA的含量的方法、应用和设备。
另一目的是提供可广泛应用的归一化样品中核酸，具体是RNA含量的方法、应用和设备。
具体说，本发明的一个目的是提供归一化样品中生物分子的方法、应用和设备，其特征是准确度和重复性高。
另一目的是提供归一化样品中核酸含量的方法、应用和设备，其允许多次使用反应容器。
通过本发明的独立方法权利要求所述的方法实现这些目的。因此，提供一种用于归一化样品中生物分子含量的方法，其包括以下步骤：
a)提供反应容器，该容器的容器表面至少部分官能化，优选在容器内部官能化，以使该容器表面能够在高盐条件下可逆地结合生物分子，
b)进行至少一个样品制备步骤，
c)在高盐条件下使所制备样品中的生物分子结合于容器表面(“结合 和归一化步骤”)，
d)任选洗涤(“洗涤步骤”)，和
e)进行至少一个后续反应。
与现有技术的已知方法不同，在本发明中反应容器的表面第一次用作在高盐条件下可逆地结合确定量生物分子的吸附表面，因此用作归一化样品中生物分子含量的装置。因此，将该反应容器的表面官能化以使其能够在高盐条件下可逆地结合生物分子。官能化的类型也具体取决于结合的生物分子类型。这将在下文中进一步讨论。通过表面大小、样品接触的表面、该表面的化学官能化类型、生物分子与表面的孵育时间和所用结合缓冲液的严格性来调整该表面可结合的生物分子的量。
而且，所述高盐条件(定义如上)有助于使存在的任何RNA酶失活。不像电荷开关物质和阴离子交换剂中存在低盐条件那样，这能保证样品中所含RNA可以基本完全和完整地分离，并供给检测步骤。
在现有技术中如前所述的所谓的“两步法”中，需要至少一个额外的吸移步骤，以便将分离的生物分子转移到新反应容器中，然后进行后续反应(如果需要)。该步骤也视作在cDNA水平归一化的机会。以此方式可补偿细胞输入、RNA质量和数量以及RT效率的差异，因此可比较和解释该结果。
在一步法RT-PCR中，使用本文提及的方法在RNA输入水平进行归一化，因为cDNA原位合成且与聚合酶直接反应。以此方式可补偿细胞输入以及RNA质量和数量的差异。
前述与这些步骤相关联的缺点在本发明方法中不复存在。生物分子可逆地结合本发明反应容器的表面，直到本发明表面被饱和，从而归一化生物分子的量。因此，在本发明方法中不再需要单独对分离的生物分子进行定量的步骤。而且，后续反应可直接在本发明容器中进行，无需额外的吸移步骤。
这种归一化还有根据各种样品的细胞输入、RNA质量/数量和逆转录效率的不同校正表达数据的优点(后一原理仅适用于两步法RT-PCR)。
优选将所述后续反应与样品制备步骤在同一容器中进行。然而，这不是绝对必需的。例如，结合和归一化步骤后，可从反应容器中取出一个或 多个等份并转移到一个或多个新反应容器中，以便在其它反应容器中进行至少一个后续反应。
特别优选的是，所述生物分子是核酸。
具体说，可以利用常规扩增方法，例如PCR检测核酸。
然而，所述生物分子通常也可以是可用抗体检测的任何生物分子。具体考虑的是可用寡核苷酸-标记的抗体(“免疫-PCR”)或用ELISA(见下)检测的蛋白质。
所述至少一个样品制备步骤也优选选自下组：
●细胞裂解，
●细胞变性，
●分离生物分子，
●纯化生物分子，
●从RNA到DNA的逆转录(RT)，和/或
●酶促反应和/或样品加工。
所述的酶促反应和/或样品加工可能优选包括用RNA酶、DNA酶和/或蛋白酶消化样品。
所述至少一个后续步骤也优选选自下组：
●扩增反应，
●酶联免疫试验(ELISA)，和/或
●杂交捕获试验。
特别优选的是，所述扩增反应是选自下组的反应：
●聚合酶链反应(PCR)，
●嵌套式PCR，
●逆转录(RT)，
●免疫-PCR。
然而，通常可提供所述至少一种生物分子的任何其它可能的检测反应。
本发明方法的一个特别合适的例子是包括以下步骤的方法：从mRNA至cDNA的逆转录(样品制备步骤)，通过结合于容器表面归一化形成的cDNA(结合和归一化步骤)和随后通过实时PCR检测cDNA的扩增(后续反 应)。该方法在表1中称为“工作流程1”。
在这种方法中，在本发明容器中直接进行逆转录，孵育后产生的cDNA可逆地结合于本发明表面。因而表面被饱和，以此方式可能结合确定量的cDNA。在后续洗涤步骤中去除过量的cDNA。洗涤步骤后，可在同一反应容器中对cDNA进行实时PCR。
与现有技术的方法相比，本发明此种方法的优点是在逆转录后既不需要对所得cDNA进行定量测定的步骤也不需要额外的吸移到新反应容器的步骤。这导致方法简化或缩短，因而显著降低了劳动量和/或操作成本，并降低了额外吸移步骤引起的交叉污染和/或不准确的风险。
与现有技术的方法相比，本发明此种方法的另一个优点是，尽管不用对所得的cDNA进行定量测定，但不管最初使用的RNA用量是多少都将有归一化量的cDNA用于PCR。此外，可以在25μL体积中进行操作，这是PCR中的惯用体积，因此会显著节约成本。
逆转录以及后续PCR优选在同一容器中进行，如上所述。然而，也可以在结合和归一化步骤后，从反应容器中取出一个或多个等份并转移到一个或多个新反应容器中，以便在其它反应容器中进行PCR。
本发明方法的另一合适例子是能够裂解样品且随后收获mRNA，例如使用恰根(QIAGEN)产品RNA轻便试剂盒(RNeasy)，或者分离mRNA，例如使用恰根产品OT试剂盒(Oligotex)和/或TC试剂盒(TurboCapture)(样品制备步骤)；通过结合于容器表面归一化释放或分离的mRNA(结合和归一化步骤)；随后从mRNA至cDNA的逆转录(后续反应)的方法。任选地，逆转录可后接额外的结合和归一化步骤和额外的后续反应，例如对所产生cDNA进行实时PCR(见表1，工作流程6)。
或者，可将简单的杂交反应用作后续反应；在这种情况下可省略额外的结合和归一化步骤(见表1，工作流程2)。
本发明方法的工作流程的其它例子见表1。工作流程1-5包括一步法，因为在这些方法过程中，不需要打开反应容器加入新反应试剂。工作流程6是一个两步法，因为在这种情况下在mRNA水平和cDNA水平进行归一化；即在两个反应之间打开容器以启动第二个结合和归一化步骤。
Figure DEST_PATH_GSB00000523890000011
逆转录和任选的下述第二个后续反应(具体是PCR)可以与样品制备步骤在同一容器中进行。然而，也可以在第一个或任选的第二个结合和归一化步骤后，从反应容器中取出一个或多个等份并转移到一个或多个新反应容器中，以便在其它反应容器中进行所述至少一个后续反应。
在所述归一化步骤中，例如可从样品中分离10至50ng生物分子(优选RNA和/或DNA)，这取决于修饰表面的大小和所建立的结合条件。
本发明还提供：
a)结合缓冲液用于结合和归一化步骤，和/或
b)洗涤缓冲液用于洗涤步骤。
提供的至少部分官能化的容器表面也优选包含：
a)硅烷醇基，
b)不饱和的有机酸，
c)羧基、磺酸盐/酯基团(sulfonate group)和其它极性基团，和/或
d)含羟基的金属氧化物和半金属氧化物。
与上述电荷开关材料不同，可使用合适方法(见下)一致地将所述基团永久结合(通常是共价结合)于微反应容器和PCR容器的表面。
可通过“Boom原理”了解核酸与二氧化硅基质的结合，参见例如EP819696(也参见Vogelstein和Gillespie(1979)和Boom等(1990))。
就来自样品的核酸的选择性结合而言，在含有离液物质如硫氰酸胍的缓冲液中培育该样品。任选地裂解细胞，使获得的蛋白质变性，并释放核酸(如果其尚未游离)，由于离液物质的存在溶解核酸周围的水合物外壳。核酸通过二氧化硅基质的硅烷醇基团(SiOx或SiOH基团)和核酸的磷酸主链的阴离子电荷之间的氢桥结合于二氧化硅表面。然后，可通过洗涤去除样品的其余组分。最后，在PCR条件下释放DNA或RNA。
按照本发明，核酸与阴离子交换剂表面的结合基于核酸的磷酸主链的阴离子电荷和阴离子交换剂表面的阳离子表面电荷。季铵基团属于强碱性阴离子交换剂基团，因为其电荷取决于结合缓冲液的pH。伯胺、仲胺和叔胺称为弱碱性阴离子交换剂。在较高pH值下，这些胺以去质子化形式存在，导致其缺失交换剂功能。因此，弱碱性阴离子交换剂的交换能力显著依赖 所用结合缓冲液的pH。
在表面上具有羟基的金属氧化物和半金属氧化物具体是氧化钛、氧化铝和氧化锆，分别例如TiO2、Al2O3和ZrO2中观察到与硅烷醇基团，具体是SiO2类似的现象。在离液盐存在的条件下，核酸也结合这些基团，相应地，在所述条件下可能使用包被或官能化的表面以结合核酸。
所述不饱和有机酸必须是可聚合的，即必须含有至少一个不饱和C＝C键(″插烯基团″)，如马来酸。此外，它们不可以纯形式使用，因为如果以纯形式使用它们无法附连于聚丙烯。因此，利用(例如)PECVD工艺将不饱和有机酸与乙烯基硅烷一起施加于表面。
以此方式结合的不饱和有机酸提供能够在高盐条件下可逆地结合核酸的羧基(-COO-或-COOH基团)。在这方面，不饱和有机酸只是将羧基引入PECVD-包被的聚合物以产生具有氢桥供体官能团的极性表面的一种方式。
在高盐条件下核酸的水溶性降低。原因是氢桥的降解，以及相关联的核酸在水中的二级和三级结构稳定性降低。如果随后提供极性表面作为氢桥供体，则核酸结合于该表面，因为它们在该位置上比在水中更稳定。如果盐浓度降低，水再一次变成优于极性表面的氢桥供体，因而核酸从表面上解离。
本发明还提供用于进行上述方法的反应容器，该容器的容器表面至少部分官能化，优选在容器内部官能化，以使该容器表面能够在所述工艺条件下可逆地结合生物分子。
按照本发明官能化的反应容器的区域在每个反应容器上优选占0.01mm2-10cm2的表面积，特别优选占0.01mm2-1cm2的表面积，非常优选占0.01mm2-500mm2的表面积，更优选占0.01mm2的表面积，更特别优选占100mm2的表面积。这意味着，例如，96-孔PCR板、PCR 8-条或多路滴定板具有所述包被的表面积乘以其孔数。
可通过选择性调节官能化表面的特性(具体是官能团的类型和密度)以及尺寸精确设定所研究反应容器对所研究生物分子的结合容量。除表面外，还可通过结合缓冲液的接触时间和严格性影响结合的生物分子的量。然而，目的是通过用生物分子完全饱和反应容器提供的表面实现归一化。
每个反应容器的结合容量优选在1ng-40μg的范围，特别优选在1ng-4μg、更优选1ng-2μg、特别优选在1ng-500ng的范围。
例如，假定每个反应容器的结合容量为50ng，这意味着事先已经进行裂解、细胞变性、分离步骤或逆转录的所研究样品含有大于50ng的所研究生物分子，多出的生物分子无法结合，在后续洗涤步骤中除去。因此，可能丢失有关所研究生物分子的定量含量的信息。然而，对大多数可能的应用而言，丢失绝对定量信息是可接受的。
相反，这意味着如果样品含有少于50ng所研究的生物分子，则不能完全利用结合容量，因此无法进行归一化。
这意味着在实践中，倾向于调整结合容量(方法见上)，以使其倾向于低于或等于样品中生物分子预计含量的下限。
提供的至少部分官能化的容器表面优选包含：
a)硅烷醇基，
b)不饱和的有机酸，
c)羧基、磺酸盐/酯基团和其它极性基团，和/或
d)含羟基的金属氧化物和半金属氧化物。
优选将上述官能团
a)通过等离子体涂布法施加于反应容器的材料上，
b)通过湿化学法施加于反应容器的材料上，和/或
c)由反应容器本身的材料特性决定。
优选在环境压力的等离子体中，按照本发明通过等离子体涂布法将硅烷醇基团施加于本发明反应容器的材料上，参见例如，弗朗浩夫表面工程和薄膜IST学院(Fraunhofer Institute for Surface Engineering and Thin Films IST)的DE102006036536B3和DE 000010322696B3，通过引用将其全文纳入本文。
该方法也称为“等离子体增强的化学气相沉积”(PECVD)。该方法是化学气相沉积(CVD)的一种具体形式，其中通过等离子体辅助的化学反应将薄层施加于表面上。为此，在反应室中将强电场施加于待包被基材和反电极之间，点燃等离子体。该等离子体导致气相沉积介质，也称为反应气的键断裂，并将其分解成单个自由基进一步以气相反应。气相反应产物以薄膜形式沉积在基材上 (层厚为50-300nm)。与CVD法相比，由于等离子体的应用，用PECVD法(也称为电晕放电)能实现较高的沉积速率和较低的沉积温度。
沉积给定材料的基本要求是这种材料必须能够以气相聚集体状态提供；这常常用所谓的前体，即在某一温度下具有给定蒸气压且含有在化学结合形式中包含准备沉积的材料的化合物来实现。以此方式，所用沉积介质已经在气相中，因此可方便地从位于反应室外的气体供应***引入反应室内并供给等离子体。因此，例如，“钻石样碳”(DLC)或含碳气态乙炔(C2H2)或甲烷可用作产生含碳涂层的前体。例如，四甲基硅烷(TMS)、四乙氧基硅烷(TEOS)或四甲氧基硅烷(TMOS)适合产生二氧化硅涂层。例如，对沉积TiO2、Al2O3和ZrO2而言存在其它合适前体。
将前体送入等离子体的放电区，此处气体裂解成被加速的离子。常常同时送入氧气，以燃烧前体中可能存在的有机成分，以便(例如)用四甲基硅烷产生二氧化硅涂层(然而，不是用乙炔产生含碳涂层)。
然后，气态离子与待涂布工件的表面高速碰撞，进而还原和形成所研究的涂层。常常在表面材料和涂层材料之间形成共价键，以保证涂层永久结合于材料。
因此，由于C-C和C-H键的均裂，在等离子体中聚丙烯(PP)表面上形成自由基。这些自由基可与涂布材料的氧、硅或碳形成共价键。
因此，涂布材料共价结合于聚丙烯表面。在以TEOS为前体的SiO2涂层的情况下，通过(例如)Si-O-C和Si-C键与PP形成共价结合。在有机单体作为前体的情况下，通过(例如)C-C和C-O-C键与PP形成共价结合。
然而，即使在不形成共价键时，依此方式也能形成非常耐久的涂层。
PECVD法也允许在等离子体中以气相产生有机聚合物，并沉积到底物上。在这种情况下，例如，可使用单体如马来酸酐、丙烯酸酯、乙烯基硅烷和其它可聚合前体(单体)。在载体气体中也可省去氧气，以防止有机组分氧化。
然而，也可使用这种方法沉积含硅烷醇基的层，其直接产生阴离子交换剂层。前体氨基丙基三甲氧基硅烷允许(例如)在PECVD层中直接产生硅烷醇基和阴离子交换剂基团。
也可通过选择合适的前体产生含有羧基的二氧化硅层。
也可利用前体乙烯基三甲氧基硅烷和马来酸酐在聚丙烯上产生含羧基层。
可能用PECVD法由气相的相应前体(金属醇盐和半金属醇盐)再加入氧气产生金属氧化物和半金属氧化物，并沉积到(例如)聚丙烯上。
除金属醇盐和半金属醇盐外，例如，也可通过PECVD原位产生和涂布气相丙烯酸酯聚合物和其它不饱和化合物。通过适当地选择单体(例如，HEMA、丙烯酸、马来酸酐等)和乙烯基硅烷，可将有机单体如马来酸酐和硅烷(乙烯基硅烷)的混合共聚物沉积在聚丙烯上。在这种情况下，产生具有羧基以及硅烷醇基的聚合物。
具体说，羟基(孪位、邻位)、二醇基、羧基、氨基和硅烷醇基是合适的化学官能团，用于在聚丙烯上提供具有氢桥供体特性的表面材料。
在本发明范围内，原位产生马来酸酐和乙烯基硅烷的共聚物。本发明的优点是，此种前体混合物的蒸气压足够通过PECVD进行气相聚合，并在聚丙烯(即反应容器材料)上形成良好的粘附层。
例如，苯乙烯磺酸可用作通过PECVD沉积磺酸盐/酯基团的前体。
与上述CVD法不同，在PECVD法中温度大致保持为室温。因此，PECVD法也适合涂布塑料，例如本发明反应容器中常常使用的聚丙烯和聚乙烯。
本发明发明人也证明，可通过合适的涂布设备，利用四乙氧基硅烷以及乙烯基硅烷和马来酸酐的含羧基共聚物作为前体，涂布微反应容器，特别是PCR反应容器(″8-条″、96孔板、多路滴定板)、一次性反应容器和移液器尖头的内表面。相应装置见图7。
所示装置也可以平行设置，因而允许同时涂布多个反应容器。
例如，溶胶凝胶工艺是优选的将硅烷醇基施加到材料上的湿化学方法。将前体与确定量的水和可能的催化剂溶解于溶剂(如水)中。优选将四乙氧基硅烷(TEOS)用作二氧化硅前体。
然而，本发明硅烷醇基可能具体受限于本发明反应容器材料本身的特性，例如当材料为玻璃时的特性。
按照本发明，所述反应容器也优选是选自下组的容器：
a)PCR容器、PCR 8-条或PCR 96孔板，
b)毛细管或微流体通道，
c)一次性反应容器，
d)移液器尖头，和/或
e)多路滴定板。
所述的微反应容器可以是，例如，可任选密封的容积为0.1-2mL的容器，在口语中通常将其称为PCR反应容器(ABI，Thermo等)。这些容器通常由聚丙烯、聚乙烯、COC、PET或聚碳酸酯制成。
这也类似地适用于所述移液器尖头，其通常作为一次性制品与自动移液器(在口语中常常称为“艾本德(Eppendorf)移液器”)一起使用。
在本发明范围内，微量滴定板是具有多个反应容器(“孔”)的单位。这类微量滴定板通常具有6-1536个孔。典型的微量滴定板形式见表2。
表2
此外，提供一种实施上述方法的试剂盒，所述试剂盒至少具有：
a)结合缓冲液，
b)洗涤缓冲液，
c)实施样品制备步骤，优选逆转录(RT)的任选试剂，
d)实施后续反应，优选聚合酶链反应(PCR)的任选试剂，和
e)任选至少一个如上所述的反应容器。
洗涤缓冲液也优选含有水、Tris、络合剂、多元醇、去污剂和聚合物、共聚物和/或三元共聚物。
结合缓冲液优选含有离液物质。特别优选的是，至少一种物质选自下 组：
●盐酸胍，
●(异)硫氰酸胍，
●碘化钠，
●碘化钾，
●(异)硫氰酸钠，和/或
●尿素，
或其混合物。
用于使cDNA结合于阴离子交换剂表面的结合缓冲液优选为低盐缓冲液。优选将pH设定为低于表面或表面基团的pK值，以便在结合步骤中使阴离子交换剂带上正表面电荷，从而能够结合带负电的核酸。
本发明也提供本发明反应容器和/或本发明试剂盒在归一化样品中生物分子含量中的应用。
这优选包括在本发明反应容器中通过逆转录(RT)从RNA，优选mRNA产生的cDNA，所述cDNA随后进行聚合酶链反应(PCR)。
免责声明
按照本发明使用的上述组件、要求保护的组件和示范性实施方式中描述的组件的大小、性状、材料选择或技术设计不受任何特殊限制，因此应用领域已知的选择标准可具有不受限制的适用性。此外，以下实施例对本专利申请的保护范围没有限制性影响，本申请的保护范围仅受权利要求书的限定。
附图和实施例
本发明主题的进一步细节、特征和优点可参见所附权利要求书及以下附图说明和实施例部分，其中通过举例的方式阐述了本发明的多个示例性实施方式和应用领域。
图1：是来自人全血的用于本发明反应容器的PAXGene RNA的CT值的图示。
图2：是来自人全血的用于本发明反应容器的PAXGene RNA和比较例 的CT值的图示。
图3：是来自人全血的用于本发明反应容器的QIAamp RNA和比较例的CT值的图示。
图4：是来自Jurkat细胞的用于本发明反应容器的QIAamp RNA和比较例的CT值的图示。
图5：是在不同培育时间下来自Jurkat细胞的用于本发明反应容器的QIAamp RNA的CT值的图示。
图6：显示本发明工作流程的总方案。
图7：显示用于将按照本发明官能化的表面施加到反应容器内部的装置70。
下面通过示范性实施方式更详细地解释本发明，但本发明不应受限于此。
实施例1
进行以下步骤：
用四乙氧基硅烷(TEOS)在大气压等离子体中涂布本发明所用的表面改性的反应容器(PCR容器，0.2mL，薄壁，PCR软条，来自拜载公司(Biozym))。
来自人全血的PAXGene RNA和QIAamp RNA以及来自Jurkat细胞的QIAamp RNA用于进行该测试。在恰根(QIAGEN)QT(QuantiTect)试剂盒和OS(Omniscript)试剂盒的帮助下，利用聚dT引物进行逆转录。
将6M GuHCl，0.1M邻苯二甲酸氢钾(pH 2.5)用作结合缓冲液，将TE缓冲液配制的2％Nonidet P40和0.1mg/mL聚(甲基乙烯基醚-交替-马来酸)用作洗涤缓冲液。在ABI7700中采用ABI TaqMan 
Figure BPA00001331255100212
β-肌动蛋白样品试剂盒进行PCR。
测试方案见表3：
  编号：  方法步骤
  1.  按照生产商方案在涂有二氧化硅的本发明PCR容器中进行逆转录
  2.  每个容器中加入50μL结合缓冲液
  3.  室温培育20分钟
  4.  完全吸除液体
  5.  每个容器中加入120μL洗涤缓冲液
  6.  完全吸除液体
  7.  加入25μL PCR主混物并进行PCR。
表3
事先用纳米滴(Nanodrop)ND-1000分光光度计对逆转录中所用的RNA进行定量测定。
作为对照，在每个实验中，测试未涂布PCR容器中的RT测试等份，并将RT反应等份直接吸入PCR主混物中。
在每个PCR实验中，进行八倍测定；即标出的数值对应于八个单独数值的平均值，误差线代表标准差。
实施例2
图1显示对来自人全血的PAXGene RNA进行QT cDNA合成得到的cDNA的TaqMan 
Figure BPA00001331255100221
运行结果。所用RNA量有小幅变化(113-293ng)。
结果令人惊讶地显示，采用本发明反应容器时，由135至180ng RNA样品可获得相对均一的CT水平(18.4至19.1)，因此实现了CT值的归一化。
实施例3
图2同样显示对来自人全血的PAXGene RNA进行QT cDNA合成得到的cDNA的TaqMan 运行结果。RNA用量从150到450ng不等(第1-5列)，此外在每个实验中，将一份逆转录反应液吸入含有PCR主混物的未处理的容器中(第6-10列)。就这些等份而言，标出其中所含的RNA起始量。与实施例1相比RNA用量范围差别较大。
结果表明，采用本发明反应容器时，由150至450ng RNA样品可获得相对均一的CT水平(17.9至18.9)，因此同样实现了CT值的归一化。不出所料，在未处理反应容器中进行的对照测试表明，逆转录反应中用作原料的RNA越多，相应CT值下降越多。
实施例4
图3显示对来自人全血的QIAamp RNA进行OS cDNA合成得到的cDNA的TaqMan 
Figure BPA00001331255100231
运行结果。RNA用量从100到1100ng不等，同样在未涂布容器中进行对照测试。
结果表明，采用本发明反应容器时，由100至1100ng RNA样品可获得相对均一的CT水平(约17.2)，因此同样实现了CT值的归一化。不出所料，在未处理反应容器中进行的对照测试表明，逆转录反应中用作原料的RNA越多，相应CT值下降越多。
实施例5
图4显示对Jurkat RNA进行OS cDNA合成得到的cDNA的TaqMan 
Figure BPA00001331255100232
运行结果。RNA用量从100到1100ng不等，同样在未涂布容器中进行对照测试。
结果表明，使用本发明反应容器时，对100至1100ng RNA样品能实现CT值的归一化。在未处理反应容器中进行的对照测试再次表明，逆转录反应中用作原料的RNA越多，相应CT值下降越多。
实施例6
图5显示对Jurkat RNA进行OS cDNA合成得到的cDNA的TaqMan 
Figure BPA00001331255100233
运行结果。RNA用量从100至800ng不等。此外，选择不同培育时间，即100-400ng RNA培育240分钟，500-800ng RNA培育20分钟。
结果令人惊讶地表明，通过将培育时间从20分钟延长到240分钟，可能将最少量RNA(100ng)的CT值降低到较大量RNA(500-800ng)(20分钟培育时间)的饱和水平。从该实施例中也可明显看出，对平均用量300至400ngRNA和较长培育时间(240分钟)而言，可以在相对较低的CT水平(15.9)实现饱和。
图6a显示本发明工作流程的总方案，包括样品制备步骤2、结合和归一化步骤3、洗涤步骤4和后续反应6。该后续反应可任选后接第二个结合和归一化步骤和第二个后续反应(见表1)。
图6b中显示，所述工作流程也可在PCR条中进行。
图7显示用于将按照本发明官能化的表面施加到反应容器内部的装置70。
所述装置具有其中设置扁平电极72的室71。该室还具有用于引入前体气体的引气装置73和涂层电极74。例如，该前体气体是四乙氧基硅烷(TEOS)。将该引气装置73和涂层电极74设置在图7所示设备中，形成其性状适合待涂布反应容器75(在本实施例中，是容积为0.2mL的聚丙烯PCR微反应容器，在口语中称为“艾本德容器”)内部的联合装置。
然后，利用频率发生器76将高频交流电压(例如13.56MHz)施加于扁平电极72和涂层电极74之间，在该反应容器内点燃等离子体。等离子体导致前体气体的键断裂，并将其分解成单个自由基沉积在基材上，从而在沉积位置上引起二氧化硅分子的化学沉积反应。
采用按照本发明官能化的反应容器时，依此方式产生的官能化表面导致生物分子结合于反应容器内(例如，在离液盐存在下核酸与官能化表面上的硅烷醇基结合)。
所述装置也适合同时涂布多个反应容器，例如，多个“艾本德容器”或者具有多个孔的多路滴定板。
反应容器的涂布表面的大小主要取决于电极大小，在0.2-mL PCR容器中可以是10mm2至300mm2。
实施例7
通过PECVD法，在大气压力下用四乙氧基硅烷涂布容积为0.2mL的聚丙烯PCR容器。获得的核酸结合容量最高达500ng。
涂布期间产生的表面受PECVD法所用电极(阴极、阳极)的大小和相对位置等因素的限定。在本例中，其大小约为150mm2。
参考文献： 
●Bartlett和Stirling(2003)，Methods Mol.Biol.226：3-6 
●Sano等(1992)，Science 258，120-122 
●Birch等(1996)，Nature 381，445 
●Vogelstein和Gillespie(1979)，PNAS 76：615-619 
●Boom等(1990)，J.Clin.Microbiol.1990年3月；28(3)：495-503 
●Compton(1991)，Nature 350，91 
●Hill(2001)，Expert Reviews of Molecular Diagnostics 1，445 

Claims (17)

1.一种用于归一化样品中生物分子含量的方法，其包括以下步骤：
a)提供反应容器，该容器的容器表面至少部分官能化，优选在容器内部官能化，以使该容器表面能够在高盐条件下可逆地结合生物分子，
b)进行至少一个样品制备步骤，
c)在高盐条件下使所制备样品中的生物分子结合于容器表面(“结合和归一化步骤”)，
d)任选洗涤(“洗涤步骤”)，和
e)进行至少一个后续反应。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物分子是核酸。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述至少一个样品制备步骤选自下组：
细胞裂解，
细胞变性，
分离生物分子，
纯化生物分子，
从RNA到DNA的逆转录，和/或
酶促反应和/或样品加工。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一个后续反应选自下组：
扩增反应，
酶联免疫试验(ELISA)，和/或
杂交捕获试验。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述扩增反应是选自下组的反应：
聚合酶链反应(PCR)，
逆转录(RT)，
环介导的等温扩增(LAMP)，
基于核酸序列的扩增(NASBA)，
滚环链反应(RCCR)或滚环扩增(RCA)，
转录介导的扩增(TMA)，
连接酶链反应(LCR)，
嵌套式PCR，和/或
免疫-PCR。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，
a)在结合和归一化步骤中使用结合缓冲液，和/或
b)在洗涤步骤中使用洗涤缓冲液。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，至少部分官能化的所述容器表面含有
a)硅烷醇基，
b)不饱和的有机酸，
c)羧基、磺酸盐/酯基团和其它极性基团，和/或
d)含羟基的金属氧化物和半金属氧化物。
8.一种用于实施前述权利要求中任一项所述方法的反应容器，其中所述反应容器的容器表面至少部分官能化，优选在容器内部官能化，以使该容器表面能够在所述工艺条件下可逆地结合生物分子。
9.如权利要求8所述的反应容器，其特征在于，至少部分官能化的所述容器表面含有
a)硅烷醇基，
b)不饱和的有机酸，
c)羧基、磺酸盐/酯基团和其它极性基团，和/或
d)含羟基的金属氧化物和半金属氧化物。
10.如权利要求9所述的反应容器，其特征在于，权利要求9中所述的官能团
a)通过等离子体涂布法施加于反应容器的材料上，
b)通过湿化学法施加于反应容器的材料上，和/或
c)由反应容器本身的材料特性决定。
11.一种用于实施前述权利要求中任一项所述方法的试剂盒，其至少包括
a)结合缓冲液，
b)洗涤缓冲液，
c)实施样品制备步骤，优选逆转录(RT)的任选试剂，
d)实施后续反应，优选聚合酶链反应(PCR)的任选试剂，和
e)任选包括至少一个如权利要求8-10中任一项所述的反应容器。
12.如前述权利要求中任一项所述的试剂盒或方法，其特征在于，所述洗涤缓冲液含有水、Tris、络合剂、多元醇、去污剂以及聚合物、共聚物和/或三元共聚物。
13.如前述权利要求中任一项所述的试剂盒或方法，其特征在于，所述结合缓冲液含有离液物质。
14.如权利要求13所述的试剂盒或方法，其特征在于，所述离液物质是选自下组的至少一种物质：
盐酸胍，
(异)硫氰酸胍，
碘化钠，
碘化钾，
(异)硫氰酸钠，和/或
尿素，
或其混合物。
15.前述权利要求中任一项所述的反应容器和/或试剂盒在归一化样品中生物分子含量中的应用。
16.前述权利要求中任一项所述的反应容器和/或试剂盒在归一化cDNA含量中的应用，其中所述cDNA是在所述反应容器中通过逆转录(RT)由RNA，优选mRNA产生的并且所述cDNA随后进行聚合酶链反应(PCR)。
17.一种检测生物分子，优选核酸，特别优选RNA的方法，包括前述权利要求中任一项所述的方法步骤。
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