CN1950501B

CN1950501B - 放线菌来源的amp脱氨酶及其应用

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Publication number: CN1950501B
Application number: CN2005800137893A
Authority: CN
Inventors: 水口凉子; 森茂治; 东本笃树; 安藤启一; 结城健介
Original assignee: Amano Enzyme Inc
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 2004-04-28
Filing date: 2005-04-26
Publication date: 2012-06-13
Anticipated expiration: 2025-04-26
Also published as: JP4663631B2; EP1760148B1; CN1950501A; WO2005105991A1; EP1760148A1; US20080248524A1; JPWO2005105991A1; EP1760148A4; DK1760148T3; US7709240B2

Abstract

以提供微生物来源的耐热性AMP脱氨酶作为课题。公开具有以下性质的AMP脱氨酶：(1)催化5′-腺苷酸+H₂O→5′-肌苷酸+NH₃的反应；(2)在65℃以下的温度稳定(醋酸缓冲液(pH5.6)中)；(3)凝胶过滤测定的分子量为48000±2000；(4)最适pH在5.6左右(McIlvaine缓冲液中)。

Description

放线菌来源的AMP脱氨酶及其应用

技术领域

本发明涉及AMP脱氨酶。具体而言，本发明涉及微生物来源的AMP脱氨酶及其应用。

背景技术

AMP脱氨酶又称为腺苷脱氨酶、AMP氨基水解酶等，催化水解腺苷酸使其脱去氨基生成肌苷酸和氨的反应。AMP脱氨酶广泛存在于动物活体组织中，目前已从不同种的多种组织中分离出来(藤岛铁郎和吉野宏，Amino Acid-Nucleic Acid，第16号，45-55(1967)，非专利文献1；Magdale’naRosinova’等，Collection Czechoslov.Chem.Commun.第43卷，2324-2329(1978)，非专利文献2；特开昭55-120788号公报，专利文献1)。另一方面，主要从工业利用的观点出发，人们广泛进行了微生物来源的AMP脱氨酶的研究。关于丝状菌来源的AMP脱氨酶的研究尤其多，部分AMP脱氨酶，例如蜂蜜曲霉菌(Aspergillus melleus)来源的AMP脱氨酶等，试图用于工业以增强酵母提取物的味道。

专利文献1：特开昭55-120788号公报

非专利文献1：藤岛铁郎和吉野宏，Amino Acid-Nucleic Acid，第16号，45-55(1967)

非专利文献2：Magdalc’na Rosinova等，Collection Czechoslov.Chem.Commun.第43卷，2324-2329(1978)

发明内容

目前，在酵母提取物的制备过程中，一般使用核酸酶和AMP脱氨酶来增强味道。通常，核酸酶的最适温度是约65℃。另一方面，目前使用的蜂蜜曲霉菌(Aspergillus melleus)来源的AMP脱氨酶的最适温度是约50℃。因此，制备中，高温下使两种酶同时作用是不可能的。必须分别进行核酸酶处理和AMP脱氨酶处理。如果，AMP脱氨酶有良好的耐热性，就能与核酸酶同时作用，从而可缩短制备工序。此外，由于用这两种酶的处理过程可在高温下进行，所以制备过程中处理温度不必暂时降到AMP脱氨酶的反应温度约50℃，可有效防止杂菌的污染。如此，特别在工业应用上，耐热性AMP脱氨酶有许多优势，迫切希望能发现这样的酶。

基于以上背景，本发明人等筛选了微生物，作为AMP脱氨酶的来源。结果发现，链霉菌属的放线菌能生产出热稳定性高的AMP脱氨酶。此外还发现，鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)产生的AMP脱氨酶热稳定性尤其好。

获得以上发现后，本发明人等试图鉴定该酶(鼠灰链霉菌来源的AMP脱氨酶)。结果如后面的实施例所述，成功鉴定了该酶，明确了其氨基酸序列和碱基序列。基于该成果，可以以重组体形式生产该酶。此外，应用基因重组技术可提高该酶的生产性，并对酶本身进行改良。

本发明是基于以上成果而完成的，提供以下内容：

具有以下性质的AMP脱氨酶：

(1)催化5′-腺苷酸+H₂O→5′-肌苷酸+NH₃的反应；

(2)在65℃以下的温度稳定(醋酸缓冲液(pH5.6)中)；

(3)分子量为48000±2000(凝胶过滤测定)、60000±3000(SDS-PAGE测定)；

(4)最适pH在5.6左右((McIlvaine)缓冲液中)；

具有以下性质的放线菌来源的AMP脱氨酶：

(1)催化5′-腺苷酸+H₂O→5′-肌苷酸+NH₃的反应；

(2)在65℃以下的温度稳定(醋酸缓冲液(pH5.6)中)。

根据[2]中所述的AMP脱氨酶，其中放线菌是属于链霉菌属的放线菌。

根据[2]中所述的AMP脱氨酶，其中放线菌选自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)、纤维黄链霉菌(Streptmyces celluloflavus)、灰链霉菌(Streptmyces griseus)。

一种酵母提取物的制备方法，它包括使[1]～[4]中任一项所述的AMP脱氨酶作用的步骤。

一种调味料的制备方法，其中，使[1]～[4]中任一项所述的AMP脱氨酶作用于5′-核苷酸，使5′-核苷酸脱酰胺化。

一种AMP脱氨酶的制备方法，其特征在于，在营养培养基中培养链霉菌属的放线菌，在培养液中生成[1]中所述的AMP脱氨酶，将其收集。

根据[7]中所述的制备方法，其中放线菌选自鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)、纤维黄链霉菌(Streptmyces celluloflavus)、灰链霉菌(Streptmyces griseus)。

含有以下(a)或(b)的分离的AMP脱氨酶：

(a)具有序列号1的氨基酸序列的蛋白质；

(b)具有序列号1的部分氨基酸序列修改了的氨基酸序列，作为AMP脱氨酶发挥作用的蛋白质。

一种分离的核酸分子，它编码[9]所述的AMP脱氨酶。

根据[10]所述的分离的核酸分子，它具有以下(a)～(c)中任一项的碱基序列：

(a)序列号3～5中任一项的碱基序列；

(b)(a)中部分碱基被修改了的碱基序列，且对作为AMP脱氨酶发挥作用的蛋白质进行编码的碱基序列；

(c)在严格条件下同与(a)或(b)的碱基序列互补的碱基序列进行杂交的碱基序列，且对作为AMP脱氨酶发挥作用的蛋白质进行编码的碱基序列。

一种载体，它持有[9]～[11]中任一项所述的核酸分子。

一种转化体，它导入了[9]～[11]中任一项所述的核酸分子。

一种AMP脱氨酶的生产方法，它包括以下步骤(1)及(2)：

(1)在能产生上述核酸分子编码的蛋白质的条件下培养[13]中所述的转化体的步骤；及

(2)回收所产生的蛋白质的步骤。

本发明的AMP脱氨酶热稳定性良好，在较高温度的条件下也可发挥作用。因此，可以在杂菌污染危险小的状况下进行酶促反应。此外，可与在高温下发挥作用的其它酶，例如在酵母提取物的制备过程中使用的核酸酶等，同时作用，从而使制备工序简化、缩短。

附图说明

图1：是比较了蜂蜜曲霉菌(Aspergillus melleus)和鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)产生的AMP脱氨酶的热稳定性的图。横轴表示反应温度，纵轴表示残存的脱氨酶活性(％)。

图2：是比较了蜂蜜曲霉菌(Aspergillus melleus)和鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)产生的AMP脱氨酶的磷酸酶活性/脱氨酶活性(P/D)的表。

图3：是比较了蜂蜜曲霉菌(Aspergillus melleus)和鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)产生的AMP脱氨酶的IMP转换率的图。

图4：是表示酵母提取物的制备过程中，鼠灰链酶菌(Streptomycesmurinus)来源的AMP脱氨酶发挥作用时的IMP转换率的图。(a)是与现行的制备方法同样地分别进行核酸酶处理和脱氨酶处理时的测定结果。(b)是核酸酶处理与脱氨酶处理同时进行时的结果。

图5：是表示鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶纯化过程中的色谱结果。(a)是用HiPrep^TM16/10ButylFF的色谱结果图，(b)是用Superose12的色谱结果。

图6：图6(a)是一个表，总结了鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶纯化过程中总酶活性量、总蛋白质量、比活性和收率。图6(b)是用SDS-PAGE(CBB染色)分析纯化酶的结果。泳道II是样品(纯化的酶)。泳道I是蛋白质分子量标记的条带。从高分子量开始顺次是磷酸化酶b(M.W.97400)、牛血清白蛋白(M.W.66267)、醛缩酶(M.W.42400)、碳酸酐酶(M.W.30000)、胰蛋白酶抑制剂(M.W.20100)、溶菌酶(M.W.14400)的条带。

图7：图7(a)是表示鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶的反应温度与活性的关系的图。表示将65℃反应时的活性值设为100％时的相对活性(％)。图7(b)是表示鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶的热稳定性的图。

图8：图8(a)是表示鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶的pH与活性的关系的图。表示将pH5.6时反应的活性值设为100％时的相对活性(％)。图8(b)是表示鼠灰链酶菌(Streptomycesmurinus)来源的AMP脱氨酶的pH稳定性的图。

图9：是总结了鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶的底物特异性的表。表示将AMP的酶活性设为100％时的相对活性。

图10：是用色谱聚焦分析鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶的结果图。

图11：是总结了鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶的各种性质的表。为了进行比较，显示了桔青霉(Penicilliumcitrinum)来源的核酸酶和蜂蜜曲霉菌(Aspergillus meleus)来源的AMP脱氨酶的最适pH等。

图12：是比较了灰链霉菌灰色亚种(Streptomyces griseus subsp.griseus)、灰链霉菌(Streptomyces griseus)及纤维黄链霉菌(Streptomycescelluloflavus)产生的AMP脱氨酶的热稳定性及底物特异性的表。

图13：是分析鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶的N末端氨基酸序列及内部氨基酸序列的结果。

图14：是鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶的限制性内切酶图谱。

图15：是穿梭载体pSV1的构建流程图。

图16：是AMP脱氨酶表达载体pSVSAD的构建流程图。

图17：是表示导入了AMP脱氨酶基因的转化体SAD-1产生的AMP脱氨酶的活性测定结果的表。表中ND表示“未检测出”。

图18：是表示转化体(SAD-1)产生的AMP脱氨酶的热稳定性的图。横轴表示反应温度，纵轴表示残存的脱氨酶活性(％)。

图19：是总结了转化体(SAD-1)来源的AMP脱氨酶的底物特异性的表。表示将AMP的酶活性设为100％时的相对活性。

：图20：表示转化体(SAD-1)来源的AMP脱氨酶的SDS-PAGE(CBB染色)分析结果。泳道II是对照样品(宿主培养上清)，泳道III是样品(转化体培养上清)。泳道I是蛋白质分子量标记的条带。从高分子量开始顺次是磷酸化酶b(M.W.97000)、牛血清白蛋白(M.W.66000)、卵清蛋白(M.W.45000)、碳酸酐酶(M.W.30000)、胰蛋白酶抑制剂(M.W.20100)的条带。

图21：是表示成功鉴定出的放线菌来源的AMP脱氨酶的氨基酸序列及其编码序列(包括启动子区域和终止子区域)的图。

图22：图21的继续。

图23：成功鉴定出的放线菌来源的AMP脱氨酶的氨基酸序列(不包含信号肽)。

图24：成功鉴定出的放线菌来源的AMP脱氨酶的氨基酸序列(包含信号肽)。

图25：成功鉴定出的编码放线菌来源的AMP脱氨酶的序列(包括启动子区域和终止子区域)。

图26：图25的断续。

图27：成功鉴定出的编码放线菌来源的AMP脱氨酶的基因的启动子区域的序列。

图28：成功鉴定出的放线菌来源的AMP脱氨酶的结构基因的序列。

图29：成功鉴定出的编码放线菌来源的AMP脱氨酶的基因的终止子区域的序列。

具体实施方式

本发明的第一方面涉及AMP脱氨酶。本发明的AMP脱氨酶来源于放线菌。本发明的AMP脱氨酶的来源并不限定于放线菌的特定种类。本发明人等的研究结果证明，鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)以及纤维黄链霉菌(Streptmyces celluloflavus)和灰链霉菌(Streptmyces griseus)产生的AMP脱氨酶具备高耐热性。

本发明的AMP脱氨酶催化下面的反应：5′腺苷酸+H₂O→5′-肌苷酸+NH₃(性质(1))。由此可知，本发明的AMP脱氨酶作用于5′-腺苷酸(AMP)。如后面的实施例所示，本发明的一种实施方案，鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶对5’-dAMP(5’-脱氧腺苷酸)、ADP(腺苷5′-二磷酸)、ATP(腺苷5′-三磷酸)也有良好的作用。因此，本发明的AMP脱氨酶不仅适用于以AMP为底物的反应，而且适用于以它们中任何一种作底物的反应。

另一方面，本发明的AMP脱氨酶热稳定性良好，在65℃以下的温度稳定(性质(2))。这里所讲的“在65℃以下的温度稳定”是指，将用醋酸缓冲液调成pH5.6的酶溶液在65℃处理30分钟时，以未处理时的酶活性为标准(100％)，残存5％以上，优选10％以上，更优选30％以上，更进一步优选50％以上，最优选90％以上的活性(在低于65℃温度条件下进行同样处理时，通常残存活性更高)。由于具备如此优良的热稳定性，即使在高温下(例如60℃、65℃、70℃)，本发明的AMP脱氨酶也能很好的发挥作用。

如后面的实施例所述，作为具备以上性质的AMP脱氨酶之一，本发明人等发现了鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)产生的酶，并成功地纯化了该酶。对所得AMP脱氨酶进行详细研究时发现，它具有以下性质。

(3)通过凝胶过滤测定时其分子量为48000±2000。通过SDS-PAGE测定时其分子量为60000±3000。

(4)最适pH在5.6左右((McIlvaine)缓冲液中)；

(5)起效pH在约4.5～约8.5((McIlvaine)缓冲液中)

(6)稳定pH在约6.0～约8.5((McIlvaine)缓冲液中)

(7)反应温度在约40℃～约70℃(醋酸缓冲液中(pH5.6))

(8)最适温度在65℃左右(醋酸缓冲液中(pH5.6))

(9)温度稳定性在65℃以下稳定(醋酸缓冲液中(pH5.6))

起效pH的范围是，以最适pH下AMP脱氨酶活性为基准(100％)时相对活性大约50％以上的范围。另一方面，稳定pH的范围是，未处理、最适pH下AMP脱氨酶活性为基准(100％)时，残存活性在大约50％以上的范围。

关于热稳定性，用醋酸缓冲液调成pH5.6的酶溶液在65℃处理30分钟时，以未处理时的酶活性为基准(100％)，残存约90％的活性。即使处理温度上升到70℃，也可保持约55％的活性。

此外，反应温度的范围是以最适温度下AMP脱氨酶活性为基准(100％)时相对活性大约70％以上的范围。

另一方面，对底物特异性进行研究时发现，鼠灰链酶菌(Streptomycesmurinus)来源的AMP脱氨酶对3’-AMP、5’-dAMP、ADP、ATP、腺苷、及cAMP(环腺苷3，’5’-一磷酸)也起效，但对2’-AMP、腺嘌呤、5’GMP、5’UMP、及5’-CMP无效。特别对5’dAMP、ADP、ATP能发挥良好作用。对腺苷的作用较弱，为5’-AMP作用的1/10以下。

此外，未检测出磷酸酶活性。与此相对，蜂蜜曲霉菌(Aspergillusmelleus)来源的以往的AMP脱氨酶可检测出夹杂的磷酸酶活性。在混杂的磷酸酶活性极少这一点上，鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶与以往的AMP脱氨酶显著不同。

若混杂有磷酸酶，AMP脱氨酶作用于5′-AMP而产生的呈味成分肌苷酸进一步分解成肌苷，从而丧失呈味性，因此，极少混杂磷酸酶的鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶在产业上有利。

总之，鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶具有以上的性质(3)～(8)、热稳定性、底物特异性、及混杂的磷酸酶极少等特征。

需要指出的是，作为一个原则，在热稳定性等各种实验中AMP脱氨酶活性用后面的实施例中所示的方法(脱氨酶活性测定方法)进行测定。

本发明的第二方面涉及AMP脱氨酶的制备方法(调制方法)，其特征在于，它包括以下步骤：

a)培养链霉菌属的放线菌的培养步骤；

b)从上述培养步骤后的培养液中纯化AMP脱氨酶的纯化步骤。

步骤a中使用的放线菌的种类无特殊限定，只要是可以预想能生产出热稳定性良好的AMP脱氨酶即可。例如，可使用鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)、纤维黄链霉菌(Streptmyces celluloflavus)和灰链霉菌(Streptmyces griseus)。可应用常规方法进行放线菌的培养。也可应用包含葡萄糖、蔗糖、龙胆二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖浆、有机酸等碳源；硫酸铵、碳酸铵、磷酸铵、醋酸铵或蛋白胨、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、麸、肉提取物等氮源的培养基；必要时可应用包含钾盐、镁盐、钠盐、磷酸盐、锰盐、铁盐、锌盐等无机氯化物(无机离子)的培养基。可向培养基中添加维生素、氨基酸等以促进放线菌的生长。培养基的pH调整为，例如5.0～8.0，优选5.5～7.5。培养温度在，例如15℃～50℃，优选20℃～40℃，更优选25℃～35℃。培养时间无特殊限定，例如1日以上，3日以上，5日以上。培养方法可利用，例如振荡培养法、通过发酵罐进行的需氧深部培养法。

上述各种培养条件等可根据培养对象作适当调整，只要是能生产本发明的AMP脱氨酶的生产条件即可，其条件等不受限定。

可从将放线菌培养了预期时间的培养液中或菌体中回收AMP脱氨酶。从培养液中回收时，例如将培养上清过滤、离心除去不溶物后，可通过联合应用硫酸铵沉淀等盐析、透析、各种色谱等进行分离、纯化，获得AMP脱氨酶。优选，通过硫酸铵沉淀等盐析分级后，进行疏水性色谱及凝胶过滤。

另一方面，当从菌体内回收时，例如可以通过加压处理、超声波处理等将菌体破碎后，与上面同样进行分离、纯化，获得AMP脱氨酶。通过过滤、离心等预先从培养液回收菌体后，也可进行上述一系列工序(菌体的破碎、分离、纯化)。

需指出的是，作为原则，各纯化工序中，以AMP脱氨酶活性为指标进行分级，继续下面的步骤。

本发明的第三方面涉及上述本发明的AMP脱氨酶的应用。本发明的AMP脱氨酶与常规的AMP脱氨酶(即，目前应用的蜂蜜曲霉菌(Aspergillusmelleus)等来源的AMP脱氨酶)有同样的各种应用。但是，利用耐热性良好这一特征，更适于优选在高温下进行反应的应用。这里“优选在高温下进行反应的应用”是指，从制备效率和杂菌污染等观点考虑，优选使AMP脱氨酶在高温下进行反应的应用。其具体例包括酵母提取物的制备。酵母提取物的制备过程中，通常通过核酸酶处理和AMP脱氨酶处理来增强味道(味道改善)。若使用热稳定性良好的本发明的AMP脱氨酶，可与在高温下实施的核酸酶处理同时进行AMP脱氨酶处理。这样，可使制备过程简化、短程化，同时可有效防止酶处理过程中的杂菌污染。

利用本发明的AMP脱氨酶的酵母提取物的制备方法中，作为一优选实施方案，实施如下步骤，即向酵母溶菌液中添加核酸酶和AMP脱氨酶，高温下作用。可按常规方法制备酵母溶菌液。例如，对10％啤酒酵母或面包酵母等的悬浮液(pH7.0)进行加热处理，添加市售的溶菌酶YL-NL「AMANO」或YL-15(均为AMANO ENZYME公司制品)溶菌，制备酵母溶菌液。可从不同的制造商(例如AMANO ENZYME公司)获得核酸酶，可从中适当选择适宜应用的。也可应用按常规方法从微生物等中制备出的核酸酶。也可并用多种核酸酶。核酸酶与AMP脱氨酶的添加量可以根据使用的酶的种类和活性值而适当设定。工作温度设为核酸酶与AMP脱氨酶均工作的温度。例如，60℃～80℃、优选65℃～75℃、更优选约70℃进行反应。

(分离的AMP脱氨酶)

如后面的实施例所示，本发明人等成功地鉴定出鼠灰链酶菌来源的AMP脱氨酶的氨基酸序列及编码该序列的基因序列。由此，可利用重组体生产AMP脱氨酶。

本发明的其它方面涉及基于以上成果的分离的AMP脱氨酶。本发明的AMP脱氨酶含有例如具有序列号1中氨基酸序列的蛋白质。如后面的实施例所示，可以验证该蛋白质实际上具有AMP脱氨酶活性。另外，包括信号肽的序列示于序列号2中。

本发明的一实施方案提供AMP脱氨酶，它含有与具有序列号1或2中氨基酸序列的蛋白质比较时其功能相同，但其部分氨基酸序列不同的蛋白质(以下称作“同源蛋白质”)。所谓“部分氨基酸序列不同”代表性地指由于构成氨基酸序列的1～数个氨基酸缺失、置换，或者1～数个氨基酸附加、***，或者它们联合造成氨基酸序列发生突变(变化)。这里氨基酸序列不同的允许范围是只要其保持AMP脱氨酶的功能，即催化5′-腺苷酸+H₂O→5′-肌苷酸+NH₃反应的功能(称为“AMP脱氨酶活性”)即可。只要能满足该条件，对氨基酸序列不同的位置无特殊限定，也可多个位置不同。这里所说的多个是指，例如不满全部氨基酸约30％的数目，优选不满约20％的数目，更优选不满约10％的数目，更进一步优选不满约5％的数目，最优选不满约1％的数目。也就是说，同源蛋白质与序列号1或2中的氨基酸序列有，例如约70％以上，优选约80％以上，更优选约90％以上，更进一步优选约95％以上，最优选约99％以上的同源性。

优选通过在非必须氨基酸残基(与AMP脱氨酶活性无关的氨基酸残基)发生置换的保守的氨基酸置换获得同源蛋白质。这里“保守的氨基酸置换”是指将某氨基酸残基置换成具有同样性质侧链的氨基酸残基。氨基酸残基依其侧链可分为碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)这样的多个族类。保守的氨基酸置换优选为同一家族内的氨基酸残基间的置换。

在此，两个氨基酸序列或两个核酸序列(以下使用“两个序列”作为包括这些序列的术语)间的同源性(％)可例如按下面的程序测定。首先，排列两个序列使之最适于比较(例如，可在第一个序列中导入缺口(gap)以适于与第二个序列比对)。当第一个序列中特定位置的分子(氨基酸残基或核苷酸)与第二个序列中对应位置的分子相同时，那么在该位置的分子相同。两个序列的同源性(％)是一个两个序列中共通的相同位置数目的函数(即同源性(％)＝相同位置数/位置总数×100)。优选地，为了两个序列最佳比对而导入的缺口数及其长度也要考虑到。

两个序列的比较及同源性的确定可应用数学运算法则完成。具体地可用于序列比较的数学运算法则有Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-68中记载的Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl..Acad.Sci.USA 90：5873-77中修改了的运算法则，但不限定于此。该运算法则整合到Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中记载的NBLAST程序和XBLAST程序中(version2.0)。为了获得与本发明的核酸同源的核苷酸序列，例如可利用NBLAST程序，以score＝100、wordlength＝12进行BLAST核苷酸检索。为了获得与本发明的蛋白质同源的氨基酸序列，例如可利用XBLAST程序，以score＝50、wordlength＝3进行BLAST多肽检索。为了获得用于比较的缺口比对，可利用Altschul等(1997)AminoAcids Research 25(17)：3389-3402中记载的Gapped BLAST。利用BLAST及Gapped BLAST时可应用相应程序(例如，XBLAST及NBLAST)中缺省的参数。详细而言，可参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov。可能用于序列比较的其它数学运算法则的例子有Myers和Miller(1988)Comput ApplBiosci.4：11-17中记载的运算法则。该运算法则整合到例如GENESTREAM网络服务器(IGH Montpellier、法国)或ISREC服务器中可利用的ALIGN程序中。氨基酸序列的比较中利用ALIGN程序的时候，例如可以使用PAM120残基质量表，设定缺口长度罚分(penalty)＝12、缺口罚分＝4。

两个氨基酸序列的同源性的确定可应用GCG软件包的GAP程序，使用Blossom62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重＝12、10、8、6、或4，缺口长度权重＝2、3、或4。两个核酸序列的同源度的确定可应用GCG软件包(可应用http://www.gcg.com)的GAP程序，缺口权重＝50，缺口长度权重＝3。

本发明的AMP脱氨酶(包括同源蛋白质)中，对于那些天然放线菌中含有的酶而言，可从该放线菌中通过提取、纯化等操作进行制备。另外，也可根据本说明书或附加的序列表中公开的序列信息，应用基因工程学技术制备本发明的AMP脱氨酶(包括同源蛋白质)。例如，用编码本发明AMP脱氨酶的DNA转化适当的宿主细胞，通过回收转化体表达的蛋白质而进行制备。可根据目的而适当纯化回收的蛋白质。作为重组蛋白质进行制备时，可进行各种修饰。例如，将编码本发明AMP脱氨酶的DNA与其它适当的DNA***到同一载体，若应用该载体生产重组蛋白质，可获得本发明的AMP脱氨酶连接了其它肽乃至蛋白质的重组蛋白质。此外，也可进行添加糖链和/或脂质的修饰，或者在N末端或C末端进行加工的修饰。通过以上修饰，可使重组蛋白质的提取、纯化简化，或添加生物学功能等。

这里，与本发明的AMP脱氨酶相关的使用时的“分离”是指，从其原本环境(例如天然物质时的天然环境)中取出的状态，即通过人为处理，使其以不同于原来的存在状态而存在。

分离状态的AMP脱氨酶通常不包括产生菌的菌体成分。优选，杂质成分(杂质蛋白质、利用重组DNA技术生产时来源于宿主的其它成分、培养液成分等)的含有量极少。本发明的分离的AMP脱氨酶，杂质蛋白质的含量例如在总蛋白量的50％以下，优选40％以下，更优选30％以下，更进一步优选20％以下。

(编码AMP脱氨酶的核酸分子)

本发明的其它方面涉及编码AMP脱氨酶的核酸分子。

本说明书中术语“核酸”包括DNA(包括cDNA和基因组DNA)、RNA(包括mRNA)、DNA类似物和RNA类似物。本发明的核酸的形式没有限定，即单链和双链均可。优选双链DNA。另外，要考虑密码子的简并。也就是说，可含有任意碱基序列，只要能得到目的蛋白质作为其表达产物即可。

本说明书中“编码特定蛋白质的核酸”是指，当表达它时可获得该特定蛋白质的核酸。不仅包括有与该蛋白质的氨基酸序列相对应的碱基序列的核酸，而且也包括在这样的核酸中添加了不编码氨基酸序列的序列的核酸(例如包含1个或多个内含子的DNA)。

本说明书中的术语“分离的核酸”是指，当是天然存在的核酸时，代表性地指，从天然状态下与之共存的其它核酸中分离出来的核酸。但是，也可包含部分其它核酸成分，例如天然状态下与之比邻的核酸序列等。

当利用例如cDNA分子等基因重组技术生产核酸时，“分离的核酸”是指优选实质上不包含细胞成分和培养液等状态的核酸。同样，当通过化学合成生产核酸时，“分离的核酸”是指优选实质上不包含dNTP等前体(原材料)和合成过程中使用的化学物质等状态的核酸。

核酸既可作为载体或组成物的一部分存在，也可作为外源性分子存在于细胞内，只要是以人为操作的结果存在即为“分离的核酸”。

只要没有特殊指出，本说明书中仅是描述“核酸”时是指分离状态的核酸。

本发明的核酸分子编码上述本发明的AMP脱氨酶。也就是说，本发明的核酸分子编码具有序列号1或2中氨基酸序列的蛋白质或其同源蛋白质。本发明的核酸分子的一具体实施方案是具有序列号3中碱基序列的DNA。该碱基序列是成功鉴定出的编码AMP脱氨酶基因的DNA，包括5′非翻译区(启动子区域)和3′非翻译区(终止子区域)。由于该DNA中原本即有启动子和终止子与结构基因的组合(天然状态的组合)，所以当利用该DNA进行AMP脱氨酶生产时，可期待良好的基因表达。因此，可构建高效的AMP脱氨酶生产体系。

本发明的其它实施方案提供由序列号3中碱基序列组成，缺失其5′非翻译区或其一部分，以及3′非翻译区或其一部分中任何一个以上的DNA。所讲DNA的具体例包括具有序列号4或5的碱基序列的DNA。序列号4的碱基序列是成功鉴定出的编码AMP脱氨酶的结构基因(包括编码信号肽的区域)的DNA。同样，序列号5的碱基序列是成功鉴定出的编码AMP脱氨酶的结构基因(不包括编码信号肽的区域)的DNA。

本发明的核酸，可参照本说明书中或附加的序列表公开的序列信息，利用标准的基因工程学技术、分子生物学技术、生物化学技术等，制备成分离状态。

例如，本发明的核酸，可以该核酸的碱基序列或其互补序列的全部或部分作探针，利用杂交技术，从放线菌基因组DNA文库中分离出来。此外，可应用设计的与该核酸的碱基序列的一部分特异杂交的合成寡核苷酸引物，利用核酸扩增反应(例如PCR)，从放线菌基因组DNA文库或放线菌基因组或放线菌核酸提取物中扩增和分离。通常，寡核苷酸引物可应用市售的自动化DNA合成装置等容易地合成。

可根据使用的文库种类而选用斑点杂交法或者菌落杂交法等(参照Molecular Cloning，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork等)。例如，当利用应用质粒构建的文库时，可利用菌落杂交法。可应用有本发明核酸特异序列的探针筛选携有目的核酸的克隆。当选择了目的克隆后，可以该克隆携有的核酸为模板，通过应用目的核酸序列特异的引物进行PCR法等，作为扩增产物而获得本发明的核酸。

可以将所得克隆携有的核酸亚克隆到适当的载体中供以后应用。如此，可进行例如转化用的重组载体的构建，或适于解读碱基序列的质粒的构建。

本发明的其它实施方案提供一种核酸，当与序列号3～5任一项中的碱基序列比较时，其编码的蛋白质功能相同，但其部分碱基序列不同的核酸(以下称作“同源核酸”)。作为同源核酸的例子包括，其碱基序列以序列号3～5的碱基序列为基准，包含1个或数个碱基的置换、缺失、***、附加或逆位，且编码具有AMP脱氨酶活性蛋白质的DNA。碱基的置换、缺失等可发生在数个位点。这里的“数个”是指，该核酸编码的蛋白质的立体结构中，因氨基酸残基的位置和种类的不同而异，例如2～40碱基、优选2～20碱基，更优选2～10碱基。

上述碱基的置换、缺失、***、附加或逆位等突变中，也包括天然产生的突变，例如基于携有AMP脱氨酶基因的微生物的个体差异、种属不同等的突变。

作为同源核酸的其它例子还包括以SNP代表的因核苷酸多态性而造成的上述碱基的差异。

上述同源核酸，可通过导入突变而获得，例如通过限制性内切酶处理、核酸外切酶和DNA连接酶等处理、位点特异性突变导入法(MolecularCloning，Third Edition，Chapter 13，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)和随机突变导入法(Molecular Cloning，Third Edition，Chapter13，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)等。此外，也可通过紫外线照射等其它方法而获得同源核酸。还可利用公知的突变处理方法而获得，例如通过紫外处理携有AMP脱氨酶基因的放线菌，其后分离改变的基因等。

同源核酸的制备方法的具体例如下。从携有同源核酸的天然放线菌中提取基因组(染色体)DNA，用适当的限制性内切酶处理后，用本发明的核酸分子(例如具有序列号3中碱基序列的DNA)或其一部分作探针进行筛选，选择、分离严格条件下进行杂交的DNA。当可利用包含携有同源核酸克隆的基因组(染色体)DNA文库时，可通过用本发明的核酸分子(例如具有序列号3中碱基序列的DNA)或其一部分作探针，在严格条件下筛选该文库来获得。

本发明的其它实施方案涉及具有与序列号3～5碱基序列互补碱基序列的核酸。

本发明的其它实施方案提供与序列号3～5碱基序列、或其中任何一种的互补碱基序列至少有约60％、70％、80％、90％、95％、99％、或99.9％同源碱基序列的核酸。同源性越高越好。

本发明的其它实施方案涉及具有与序列号3～5碱基序列或与其同源碱基序列互补的碱基序列在严格条件下进行杂交的碱基序列的核酸。这里“严格条件下”是指形成所谓特异杂交，而不形成非特异杂交的条件。这样的严格条件是本领域技术人员公知的，例如可参照Molecular Cloning(Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)及Currentprotocols in molecular biology(edited by Frederick M.Ausubel et al.，1987)设定。作为严格条件，例如用杂交液(50％甲酰胺，10×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml变性鲑鱼***DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))在约42℃～约50℃下进行孵育，其后用0.1×SSC、0.1％SDS，在约65℃～约70℃下洗涤的条件。更优选的严格条件包括，例如应用50％甲酰胺，5×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、10μg/ml变性鲑鱼***DNA、50mM磷酸缓冲液(pH7.5))作为杂交液的条件。

(载体)

本发明的其它方面涉及含有本发明核酸的载体。本说明书中的术语“载体”是指能将***到其中的核酸输送到细胞等靶标内的核酸性分子。

本发明载体的制备可通过将本发明的核酸(典型为DNA)重组到已存的载体中或经过改变的载体内进行。原则上可应用任何载体作为原材料，只要其能保持本发明的核酸即可，但也可根据使用目的(克隆、多肽的表达)、或考虑宿主细胞的种类而选择适当的载体。

转化用的载体，典型地，包括AMP脱氨酶基因(例如具有序列号4中碱基序列的DNA)、启动子和终止子。为了实现启动子对结构基因的正确转录，从上游向下游依次排列启动子、AMP脱氨酶基因和终止子。

本发明的载体优选表达载体。“表达载体”是指，能将***到其中的核酸导入到目的细胞(宿主细胞)内，且能在该细胞内表达的载体。表达载体通常包含核酸表达所必要的启动子序列和促进表达的增强子序列等。可使用包含选择标记的表达载体。应用这种表达载体时，可利用选择标记验证是否导入了表达载体(及其程度)。

本发明的核酸向载体内的***、选择标记基因的***(必要时)、启动子的***(必要时)等可使用标准的重组DNA技术(例如可参照Molecular Cloning，Third Edition，1.84，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，应用限制性内切酶和DNA连接酶的众所周知的方法)。当构建携有包含启动子区域的DNA(例如其有序列号3中碱基序列的DNA)的载体时，可以分别准备该DNA的启动子区域和其它区域，分别将它们重组到载体中，从而构建重组载体。这种情况下，以正确发挥启动子功能为条件，可在载体内二者(启动子区域与其它区域)间***其它的序列。此外，可以首先构建携带启动子区域的载体，其后再连接其它区域。

以上重组载体可用于宿主的转化。也就是说，应用以上重组载体，可制备导入了本发明核酸分子的转化体。

(转化体及其应用)

转化用载体可用于宿主的转化。也就是说，应用上述转化用载体，可制备导入了本发明核酸分子的转化体。

对供于转化的宿主种类无特殊限定，鼠链酶菌(IFO 14802等)、变铅青链酶菌变铅青链酶菌(TK24等)、灰链酶菌灰色亚种(Streptomycesgriseus subsp.griseus)、灰链酶菌(Streptomyces griseus)、纤维黄链酶菌(Streptomyces celluloflavus)、蓝色链酶菌(Streptomyces coelicolor)、茂原链酶菌(Streptomyces mobaraensis)、除虫链酶菌(Streptomyces avermitilis)等放线菌优选适于用作宿主。也可用大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)等作为宿主。

可用公知的方法将转化用载体导入宿主(转化)。例如，按照应用原生质菌体的D.A.Hopwood等的方法(PRACTICAL STREPTOMYCESGENETICS P.229-252(The John Innes Foundation、2000))进行。

转化体可用于AMP脱氨酶的生产。具体而言，在可表达本发明的核酸编码的蛋白质(AMP脱氨酶)的条件下培养导入了本发明的核酸的转化体，可以使之产生AMP脱氨酶。根据所使用的宿主适当选用培养基。例如，可应用市售的各种培养基，或者向其中添加了脯氨酸、亮氨酸、硫胺素等促进转化体生长、筛选、蛋白质表达等必要成分的培养基。

可从培养预期的时间后的培养液或菌体中回收目的蛋白质(AMP脱氨酶)。产生到菌体外时从培养液回收，此外从菌体内回收。从培养液回收时，可通过例如将培养上清过滤、离心除去不溶物后，联合应用硫酸铵沉淀等盐析、透析、各种色谱等进行分离、纯化，获得目的蛋白质。另一方面，当从菌体内回收时，可通过例如加压处理、超声波处理等将菌体破碎后，与上面同样进行分离、纯化，获得目的蛋白质。也可通过过滤、离心等预先从培养液回收菌体后，进行上述一系列过程(菌体的破碎、分离、纯化)。由于本发明的AMP脱氨酶通常产生在菌体外，所以其分离、纯化比较容易。

以下，列举实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限定于这些实施例。

实施例1

鼠灰链酶菌来源的AMP脱氨酶的纯化

1.实验方法和材料

以下实验中使用菌株、酶液的制备方法、及酶活性的测定方法如下。

<使用菌株>

使用鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)IFO 14802、灰链酶菌灰色亚种(Streptomyces griseus subsp.griseus)JCM4681、灰链霉菌(Streptomycesgriseus)IFO3355(NBRC3355)及纤维黄链酶菌(Streptomyces celluloflavus)IFO13780(NBRC13780)。鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)IFO14802如下保藏于国际保藏部门。

国际保藏部门

名称：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保存中心

住所：

305-8566 日本国茨城県っくば市東1丁目1番3号中央第6

保藏日：2004年3月29日

保藏序号：FERM BP-08673

<酶液的制备方法>

(1)蜂蜜曲霉菌(Aspergillus melleus)来源的酶液

用水稀释市售的AMP脱氨酶[脱氨酶(50,000u/mg品)|(商标名，AMANO ENZYME公司制品)，作为酶液。

(2)鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的酶液

添加SolpeeNY 2％、Meast PlG 0.5％、NaCl 0.3％、KH₂PO₄0.1％、食物添加MgSO₄ 0.05％、可溶性淀粉3％，调整成pH5.7，121℃灭菌30分钟。接种鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)IFO 14802，27℃预培养1天，培养5天，制备成粗酶液。

(3)放线菌来源的酶液

添加大豆粉A 2％、NaCl 0.3％、KH₂PO₄ 0.1％、食物添加 MgSO₄ 0.05％、可溶性淀粉3％，调整成pH5.7，121℃灭菌30分钟。接种细菌，27℃预培养1天，培养5天，制备成粗酶液。

<酶活性测定方法>

(1)AMP脱氨酶活性测定方法

以反应时OD₂₆₅的碱少为指标测定酶活性。将0.017M的5’AMP-2Na与1/15M磷酸盐缓冲液(pH 5.6)以1∶2的比例混合，向1.5ml混合液中添加0.5ml样品溶液作为反应液，37℃反应15分钟。15分钟后添加2％高氯酸溶液终止反应，然后取100μl。加水到5ml，测定OD₂₆₅。同样测定反应时间为0分的样品作为对照。以上条件下，60分钟吸光度差减少0.001时作为1单位。

(2)磷酸酶活性的测定方法

将0.025M的5’IMP-2Na与0.036M巴比妥钠-盐酸缓冲液(pH 5.6)以1∶2的比例混合，向1.5ml混合液中添加0.5ml样品溶液作为反应液，37℃反应30分钟。反应终止后取200μl，用5ml的6％高氯酸溶液终止反应。加入0.05M的阿米酚溶液0.25ml混合后，加入0.067M钼酸铵盐溶液0.25ml混合，再加入水0.25ml混合。接着流水中放置15分钟后，测定OD₇₅₀。同样测定反应时间为0分的样品作为对照。以上条件下，30分钟吸光度差增加0.001时作为1单位。

2.实验结果

(1)热稳定性

比较蜂蜜曲霉菌(Aspergillus melleus)及鼠灰链酶菌(Streptomycesmurinus)产生的AMP脱氨酶的热稳定性。对于蜂蜜曲霉菌(Aspergillusmelleus)及鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)，在规定的温度下处理用上述方法制备的1％酶溶液后，测定残存的AMP脱氨酶活性(pH 5.6)。处理温度为30℃、40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、及75℃。另外，处理时间为30分钟。

测定结果如图1所示。结果表明鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶的热稳定性非常良好。

(2)夹杂的磷酸酶

测定蜂蜜曲霉菌(Aspergillus melleus)及鼠灰链酶菌(Streptomycesmurinus)夹杂的磷酸酶活性。从测定结果所得磷酸酶活性/脱氨酶活性(P/D)，如图2的表所示。结果表明蜂蜜曲霉菌(Aspergillus melleus)存在夹杂的活性。另一方面，鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)中未检测出磷酸酶活性。也就是说，该结果表明鼠灰链酶菌(Streptomycesmurinus)产生的AMP脱氨酶中夹杂的磷酸酶活性极低。

(3)IMP转换反应

通过HPLC检测蜂蜜曲霉菌(Aspergillus melleus)及鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)产生的AMP脱氨酶的IMP转换率。具体而言，用1/15M磷酸缓冲液(pH7.0)制备1.1％AMP溶液，向5ml1.1％AMP溶液中添加0.5ml酶溶液，50℃反应4小时，其后100℃加热处理10分钟，滤膜过滤(0.45μm)，通过HPLC进行分析。

测定结果如图3所示。鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)产生的AMP脱氨酶的IMP转换率(变化速度)与蜂蜜曲霉菌(Aspergillus melleus)来源的AMP脱氨酶相同。如上所述，鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)不存在夹杂磷酸酶活性，所以进行副产物的确定。结果，副产物的(次黄嘌呤)比率比蜂蜜曲霉菌(Aspergillus melleus)少(结果未示出)。

(4)实用化试验

进行下面的试验(试验1、试验2)以验证鼠灰链酶菌(Streptomycesmurinus)来源的AMP脱氨酶在实际的酵母提取物的制备过程中的有效性。

a)试验1

试验1中，与现行的制备方法同样，分别进行核酸酶处理和脱氨酶处理。具体而言，按以下顺序进行处理，求出IMP转换率。首先，向酵母溶菌液(YL-15、0.2％)中添加核酸酶「AMANO」G(AMANO ENZYME公司制、0.1％w/w酵母固体)，70℃、pH 5的条件下反应3小时。接下来，添加待测酵母(蜂蜜曲霉菌(Aspergillus melleus)来源的AMP脱氨酶试剂“Deamizyme(50,000u/mg产品)”(商标名，AMANO ENZYME公司制、0.01～0.04％w/w酵母固体)，或者由鼠灰链酶菌(Streptomycesmurinus)制备的粗酶溶液)，50℃、pH 6的条件下反应5小时。接着进行热处理后，进行HPLC分析。鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶的添加量取其活性值与“Deamizyme(50,000u/mg产品)”(商标名，AMANO ENZYME公司制)的添加量活性值相同的量。

b)试验2

试验2中同时进行核酸酶处理和脱氨酶处理。具体而言，按以下顺序进行处理，求出IMP转换率。首先，向酵母溶菌液(YI-15、0.2％)中添加核酸酶“AMANO”G(AMANO ENZYME公司制、0.1％w/w酵母固体)及待测酵母(蜂蜜曲霉菌(Aspergillus melleus)来源的AMP脱氨酶试剂“Deamizyme(50,000u/mg产品)”(商标名，AMANO ENZYME公司制、0.01～0.04％w/w酵母固体)，或者由鼠灰链酶菌(Streptomycesmurinus)制备的粗酶溶液)，70℃、pH 5的条件下反应规定时间(3小时或5小时)。接着进行热处理后，进行HPLC分析。鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶的添加量取其活性值与Deamizyme(50,000u/mg产品)的添加量活性值相同的量。

试验1的结果如图4(a)所示。图4(a)表明鼠灰链酶菌(Streptomycesmurinus)来源的AMP脱氨酶与蜂蜜曲霉菌(Aspergillus melleus)来源的AMP脱氨酶(Deamizyme：50,000u/mg产品)具有同等的IMP转换率。

另一方面，试验2的结果如图(b)所示。图中3hrs是与鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶同时作用3小时时的测定结果，同样5hrs是作用5个小时时的测定结果。需要指出的是，使用蜂蜜曲霉菌(Aspergillus melleus)来源的AMP脱氨酶(Deamizyme：50,000u/mg产品)时(无论3小时的反应还是5小时的反应)没有IMP的生成。如图4(b)所表明的，使用鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶时，即使在高温下与核酸酶同时作用也有IMP的生成。由此可以验证，鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶与核酸酶同时进行反应是可能的。

(5)鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶的各种酶学性质

尝试按以下程序纯化鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶。首先，按上述方法培养鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)(IFO14802)，用超滤膜(AIP1010)将产生的酶浓缩2倍，向浓缩液中加入水，进一步除去浓缩的低分子级分后，冷冻干燥，作为粗酶。将粗酶溶解到纯化水中，用48％的饱和硫酸铵进行沉淀。将沉淀级分溶解到20mM KPB(pH7.0)中，作为酶溶液。将所得酶溶液通过用含30％硫酸铵的20mM KPB(pH7.0)平衡过的HiPrep^TM16/10 ButylFF(Pharmacia制)。然后，用含30％～0％硫酸铵的20mM KPB(pH7.0)、硫酸铵30％～0％的浓度剃度进行洗脱。其后，进行浓缩，将活性级分供给Superose 12柱(Pharmacia制)进行凝胶过滤，用含150mM NaCl的50mM KPB pH7.0进行洗脱。收集活性级分(级分15和16)作为纯化酶。HiPrep^TM16/10ButylFF进行的色谱结果如图5(a)所示，用Superose 12进行的色谱结果如图5(b)所示。此外，各阶段的总酶活性量、总蛋白质量、比活性及收率示于图6(a)的表中。最后阶段的比活性是粗酶的96倍。

将纯化的酶进行SDS-PAGE(CBB染色)，验证蛋白质的纯度。SDS-PAGE的结果如图6(b)所示。泳道II是样品(纯化酶)。显示单一的条带，表明纯化酶的纯度高。泳道I是蛋白质分子量标志的条带。从高分子量开始顺次是磷酸化酶b(M.W.97400)、牛血清白蛋白(M.W.66267)、醛缩酶(M.W.42400)、碳酸酐酶(M.W.30000)、胰蛋白酶抑制剂(M.W.20100)、溶菌酶(M.W.14400)的条带。

检测反应温度与所得纯化酶活性的关系。测定结果如图7(a)所示。图7(a)的图表表示以在65℃进行反应时的活性值作为100％时的相对活性(％)。图7(a)的图表表明在40℃～70℃的广域范围内有高活性。此外，即使在反应温度达75℃时还有约50％的活性。这表明该酶在较广范围的温度条件下也有良好的功效。

接下来，按以下程序检测该酶的热稳定性。用pH5.0的醋酸缓冲液将2.8μg(总蛋白量)酶溶液(0.15ml)调成pH 5.6后，在各温度下(40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃)处理30分钟，测定残存活性(相对于未处理时的酶活性％)。测定结果如图7(b)所示。65℃以下的处理条件下维持大约90％以上的活性。此外，即使在70℃进行处理时也维持大约55％的活性。这表明该酶有极优的热稳定性。

下面，检测pH与该酶活性的关系。测定结果如图8(a)所示。图8(a)的图表表示以在pH5.6进行反应时的活性值作为100％时的相对活性(％)。pH在约4.5～约8.5的范围内有比较高的反应性，在约5.0～约8.0的范围内有约70％以上的反应性。此外，即使在pH9.0的条件下还有约40％的反应性。

接下来，按以下程序检测该酶的pH稳定性。用pH3～8的(McIlvaine)缓冲液，pH8～10的(Atkins-pantin)缓冲液将2.8μg(总蛋白量)酶溶液(0.15ml)调成各条件的pH，30℃放置30分钟后，测定残存活性(相对于pH7.0处理时的酶活性％)。测定结果如图8(b)所示。结果表明，pH在约6.0～约8.5的范围内维持比较高的活性，在约6.5～约8.0的范围内维持约80％以上的活性。

(6)鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶的底物特异性

据报道金霉素链酶菌(Streptomyces aureofaciens)来源的腺苷脱氨酶有广泛的底物特性，例如具有AMP催化能力等(非专利文献2)。基于该考虑，为了确认上述方法获得的鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的脱氨酶是AMP脱氨酶(AMP-deaminase)还是腺苷脱氨酶(Adenosine-deaminase)，检测了其底物特异性。结果如图9的表所示。图中表示以对5’AMP的酶活性为100％时的相对活性。该酶对5’AMP最有效。此外，对3’AMP、5’dAMP、ADP、ATP、腺苷(Adenosine)及3′5′-cyclic AMP也起效，但对2’AMP、腺嘌呤(adenine)没有一点作用。特别对5’dAMP、ADP及ATP作用良好。从以上结果可以确认，用上述方法获得的鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的脱氨酶是AMP脱氨酶。此外，该酶也可用于以5’dAMP、ADP及ATP作底物进行的反应中。

(7)鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶的各种酶学性质

通过色谱聚焦来获得上述方法获得的鼠灰链酶菌(Streptomycesmurinus)来源的AMP脱氨酶的等电点。使用MonoP柱(Pharmacia制)，分别用0.075MTris-醋酸缓冲液(pH9.3)将起始缓冲液(Start Buffer)、用盐酸将洗脱缓冲液(Poly buffer 96)调成pH4.0，最终体积达100ml。此外，进行3ml的预梯度(Pre-gradient)、30ml的梯度洗脱(gradient eluent)、30ml的洗脱(eluent)。色谱聚焦的结果如图10所示。从结果认为同功酶至少2个(pI 8.12、7.02)，主要级分的等电点为8.12。包括以上结果所得等电点，鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶的各种性质总结于图11的表中。如表中所示，鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶，其凝胶过滤的分子量大约48000±2000(SDS-PAGE的分子量60000±3000)、最适pH约5.6、最适温度约65℃、等电点8.12、Km值0.95mM、Vmax为3.5×10⁷μmol/min/mg。

(8)从链霉菌属寻找AMP脱氨酶的生产菌

以上的研究结果显示，属于链霉菌属的放线菌之一的鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)产生耐热性AMP脱氨酶，所以预测从链霉菌属的其它株也有可能获得耐热性AMP脱氨酶。于是，从AMANO ENZYME保存菌株中的链霉菌属中筛选AMP脱氨酶生产菌。结果发现灰链霉菌灰色亚种(Streptomyces griseus subsp.griseus)、灰链霉菌(Streptomycesgriseus)、及纤维黄链酶菌(Streptomyces celluloflavuys)3株是生产AMP脱氨酶的菌株。检测了这3株菌生产的AMP脱氨酶的热稳定性和底物特异性。结果如图12所示。热稳定性试验中使用培养所得粗酶溶液，处理条件为65℃、30分钟。以未处理时的活性为100％，求出残存活性。至于底物特异性(对腺苷的特异性)，是以用AMP为底物时的活性值为100％时的相对活性。

如图12所示，上述3株菌株，其热稳定性比蜂蜜曲霉菌(Aspergillusmelleus)来源的脱氨酶好。该结果提示，链霉菌属的放线菌产生的脱氨酶通常有热稳定性高的倾向。以上3株产生的脱氨酶对AMP的作用比腺苷的好，所以可以确认是AMP脱氨酶。

实施例2

鼠灰链酶菌来源的AMP脱氨酶的鉴定

1.氨基酸序列分析

按上述实施例的程序培养鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)IFO14802，得到纯化酶。但是纯化到应用HiPrep^TM16/10ButylFF(Pharmacia)的丁基琼脂糖(Butyl Sepharose)柱为止。应用凝胶PAG Mini“DAIICHI”10/20(第一化学药品)，对分级样品进行SDS-PAGE。用加入0.01％SDS的Towbin缓冲液(Tris 25mM、甘氨酸192mM、甲醇5％)作电转缓冲液，将电泳后的凝胶转移到PVDF膜上。电转的条件是，应用缓冲液槽型电转装置，恒压20V、4℃条件下进行18小时。电转后进行CBB(考马斯亮蓝R-250)(Fluka)染色，切出相当于该酶的条带，作为N末端氨基酸序列分析用的样品。同样，对电泳后的凝胶进行CBB染色，切出相当于该酶的条带，作为分析内部氨基酸序列用的样品。对这些样品进行氨基酸序列分析的结果如图13所示。

2.从鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)IFO14802提取基因组DNA

按上述实施例的程序培养鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)IFO14802，用布氏漏斗和吸滤烧瓶过滤培养液，获得菌体。将菌体1g混悬到含4mg/ml溶菌酶(Roche Diagnostics)、2mg/ml无色肽酶(Achromopeptitase)(和光纯药)的10ml TE(10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA)溶液中混悬，30℃溶菌1小时。添加2.4ml 0.5mM EDTA溶液、260μl 10mg/ml蛋白酶E(科研化学)，再30℃溶菌5分钟。接着加入1.4ml 10％SDS溶液，上下混合，37℃培养2小时。加入用含0.1M NaCl的TE溶液平衡过的12ml苯酚搅拌5分钟后，再加入12ml氯仿，进一步搅拌5分钟。其后离心(1,500g、室温、5分钟)获得上清。该操作重复2次，向所得上清中添加72μl的10mg/ml RNase A(Sigma-AldrichJapan)，37℃下孵育1小时。添加4.5ml 5M NaCl，混合后添加11.25ml的30％聚乙二醇6000(和光纯药)溶液，混合，4℃放置一晚。用巴氏吸管吸取沉淀出的基因组DNA，用70％乙醇洗涤，风干后，溶解到TE溶液中1ml中，获得1mg/ml的基因组DNA溶液。

3.合成引物的设计

考虑到上述内部氨基酸序列分析的结果，设计下面的合成引物(Invitrogen)。

引物IS-F 5’-TTC GGI GAG GTI ACI GCI CGI CAY MG-3’(序列号：6)

氨基酸序列N末端-F G E V T A R H R G-C末端

引物IS-R 3’-CTY CGI CTR CTG CCI CTG CGI CTC AA-5’(序列号：7)

氨基酸序列 N末端-E A D D G D A E F R-C末端

4.Southern杂交、菌落杂交用探针的制备

以上面所得鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)IFO 14802来源的基因组DNA为模板进行PCR反应。应用TaKaRa LA Taq^TM with GC buffer(宝酒造)，向反应体系中加入2μM上述合成引物IS-F、IS-R，50ng作为模板的基因组DNA。96℃孵育3分钟后，进行96℃·45秒、66℃·1分钟、72℃·3分钟的35个循环的反应，最后72℃孵育10分钟。琼脂糖电泳后，用GENECLEAN^TMIII(BIO101)提取特异扩增的约240bp的DNA片段。将提取的DNA片段亚克隆到pGEM^TM-T Easy(Promega)后，再次提取***的DNA片段，然后用DIG High Prime(Roche Diagnostics)进行DIG标记，作为AMP脱氨酶基因的探针。

5.Southern杂交

用任意的限制性内切酶完全消化基因组DNA，以每个泳道6μg的添加量进行琼脂糖电泳。电泳结束后用0.25N HCl溶液处理30分钟，用电泳中使用的缓冲液中和后，通过应用0.4N NaOH溶液的碱性印迹印到Zeta-Probe^TM膜上(Bio-Rad)。用2016 VacuGene(Pharmacia LKBbiotechnology)在真空度50cm·H₂O下转移90分钟。印迹后，用2xSSC(NaCl0.3M、柠檬酸钠33.3mM)溶液洗膜，风干后，80℃孵育30分钟，将DNA固定到膜上。用上述探针对固定化了的膜进行Southern杂交，用DIG Nucleic Acid Detection Kit(Roche Diagnostics)进行检测。如此，制备出该酶基因的限制性内切酶图谱(图14)。

6.菌落杂交

用限制性内切酶NotI(宝酒造)完全消化12μg基因组DNA后，通过琼脂糖电泳切出长度为3.8kbp的DNA片段，接着用GENECLEAN^TMIII(BIO 101)抽提，作为制备文库用的***物。同时，用NotI(宝酒造)完全消化pBluescriptII KS(+)(Stratagene)后，用碱性磷酸酶(宝酒造)脱磷酸后作为制备文库用的载体。用Ligation Kit ver.2(宝酒造)连接***物与载体，用Hanahan的方法(J Mol Biol.1983 Jun 5；166(4)：557-80，Hanahan D.，Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids)转化大肠杆菌DH5感受态细胞(东洋纺绩)。将所得克隆接种到LA平板(氨苄西林(Sigma-Aldrach Japan)100μg/ml)，使每块板形成大约500个菌落，37℃培养一晚，使菌落生成。将所形成的总共大约9500个菌落转到Nylon Membranes for Colony and Plaque Hybridization(Roche Diagnostics)上，将DNA固化到膜上。用前面所讲的探针进行菌落杂交，用DIG NucleicAcid Detection Kit(Roche Diagnostics)检测出显示强信号的菌落。以上操作方法均按使用的试剂所附说明书使用。所得克隆命名为pSAD，它是包含鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)IFO14802来源的AMP脱氨酶基因的克隆。

7.AMP脱氨酶基因的碱基序列的分析

首先应用M13 Primer M4、M13 Primer RV(宝酒造)从***物外侧开始进行碱基序列分分析。根据用分离的克隆和探针对DNA片段进行碱基序列分析所明确的该酶基因序列，再度设计合成引物(Sigma Genosys)，进行碱基序列分析。重复进行该操作，通过引物足迹(primer walking)分析全长DNA序列。使用BigDye^TM Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit和dGTP BigDye^TM Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Applied Biosystems Japan)进行碱基序列分析，用 ABI PRISM^TM 310Genetic Analyzer(Applied Biosystems Japan)进行分析。以下是用于碱基序列分析的合成引物。

MAD-F1：5’-AAGCAACTCGCCGACCAG-3’(序列号8)

MAD-F2：5’-TGGTCCATGCAGGACTTC-3’(序列号9)

MAD-F3：5’-CTGGAGAACTACAGCCTC-3’(序列号10)

MAD-F4：5’-CAGATCCTCGGCGTCAAG-3’(序列号11)

MAD-F5：5’-CTCCAGTACGCCTTCCTG-3’(序列号12)

MAD-F6：5’-GTCGGGTCCTGGACACCG-3’(序列号13)

MAD-F7：5’-TATACCGTCCGGTAGGTC-3’(序列号14)

MAD-F8：5’-GGACAGGAAGACGGACAC-3’(序列号15)

MAD-F9：5’-GATTGGCCGAGAAGTACG-3’(序列号16)

MAD-R1：5’-TGGTCGGCGAGTTGCTTG-3’(序列号17)

MAD-R2：5’-CAGGGACAGGACACTGAG-3’(序列号18)

MAD-R3：5’-GATGTCGACATGGCCCTG-3’(序列号19)

MAD-R4：5’-CCCAGTCGATCGCGTGAG-3’(序列号20)

MAD-R5：5’-TGGTCGTTCCGTGAAGGC-3’(序列号21)

MAD-R6：5’-CTCGAACGCCGCGAACGC-3’(序列号22)

MAD-R7：5’-CTGGGTGTGCGCGATGTC-3’(序列号23)

MAD-R8：5’-CACCATCATCGCCACCTG-3’(序列号24)

分析结果鉴定的全部碱基序列(序列号3)显示于图21～22及图25～26中，此外，通过应用同源性检索和模体检索的注释，明确了其启动子区域、编码区域(序列号4)和终止子区域(图21～22)。启动子区域的序列、编码区域的序列和终止子区域的序列分别示于图27、28和29中。根据碱基序列而推断的氨基酸序列示于图23(不含信号肽，序列号1)、图24(包含信号肽，序列号2)。

8.放线菌用载体pIJ702的获得

在以下的培养基条件下培养携有质粒pIJ702的变铅青链酶菌(Streptomyces lividans)3131(ATCC 35287)，30℃培养2天。

YEME培养基+0.5％甘氨酸+50μg/ml硫链丝菌素(和光纯药)

酵母提取物 3g

蛋白胨 5g

麦芽提取物 3g

氯化镁 1g

葡萄糖 10g

蔗糖 340g

甘氨酸 5g

50mg/ml硫链丝菌素溶液(二甲基亚砜溶液)1ml/L(pH7.0)

将培养后的培养基200ml离心(12,000g、4℃、10分钟)，将所得菌体悬浮到TE-Sucrose(50mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、25％Sucrose)10ml中。加入2ml含30mg/ml溶菌酶(Sigma-Aldrich Japan)的TE-Sucrose和4ml的0.25mM EDTA溶液，37℃孵育30分钟。孵育后，加入2ml20％SDS溶液，再加入5ml 5M NaCl溶液，轻轻搅拌后，0℃孵育1晚。然后，离心(100,000g、4℃、40分钟)，向所得上清中加入30％的聚乙二醇6000(和光纯药)溶液使得终浓度为10％，0℃孵育4.5小时。其后，离心(900g、4℃、5分钟)，将沉淀溶解到含50mM NaCl的TE溶液中。随后添加16.8g氯化铯和1.2ml溶解到TE溶液中浓度为10mg/ml的溴化乙锭溶液，离心(1,300g、室温、15分钟)，除去残渣后，再次离心(230,000g、20℃、12小时)。离心后，在紫外照射下获得质粒DNA层。接下来，用经TE溶液饱和的正丁醇萃取，除去溴化乙锭。萃取重复3次。用 TE作透析外液对所得质粒DNA溶液进行透析，4℃、透析1晚。其后，用TE溶液饱和的苯酚抽提1次，氯仿/异戊基醇抽提2次。然后加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)溶液和2倍体积的乙醇，-80℃静置30分钟。其后，离心(12,000g、4℃、15分钟)，回收沉淀，用70％乙醇洗涤沉淀，使之干燥。将之溶解到TE溶液200μl中。通过以上操作，最终获得大约10μg量的DNA。

9.穿梭质粒pSV1的构建

首先，准备用限制性内切酶BamHI消化大肠杆菌用载体pUC19(宝酒造)的DNA片段，用Bcl I(宝酒造)消化放线菌用载体pIJ702所得含硫链丝菌素抗性基因(tsr)的DNA片段，用 DNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造)进行连接，制备成pUCTSR。接下来准备用Kpn I、Cla I(宝酒造)消化pUCTSR所得的DNA片段(长片段)和用Kpn I、Cla I(宝酒造)消化pIJ702所得DNA片段(短片段)，用DNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造)将它们进行连接后，转化大肠杆菌DH5株(东洋纺)中。所得转化体携有的将pUC 19片段与pIJ702片段连接在一起的质粒，将之称作穿梭载体pSVl，用于后面的操作(图15)。

10.表达载体pSVSAD的构建

用限制性内切酶Not I(宝酒造)消化携有AMP脱氨酶基因的pSAD，准备该基因片段。另外准备用限制性内切酶Xba I消化穿梭质粒pSVl所得载体片段。用DNA Blunting Kit(宝酒造)使两者末端平滑化，分别作为***片段、载体片段。再用碱性磷酸酶Alkaline Phosphatase(宝酒造)对pSV1来源的载体片段进行脱磷酸处理。用DNA Ligation Kit Ver.2(宝酒造)连接***片段与载体后，转化大肠杆菌DH5细胞株(东洋纺)。所得质粒作为表达载体pSVSAD，用于转化(图16)。

11.变铅青链酶菌(Streptomyces lividans)TK24原生质体的制备

变铅青链酶菌(Streptomyces lividans)TK24来源于变铅青链酶菌(Streptomyces lividans)66，具有链霉素抗性，由D.A.Hopwood(John InnesInstitute、Colney Lane、Norwich NR4 7UH、U.K.)提供。用YEME培养基(0.5％甘氨酸)培养变铅青链酶菌(Streptomyces lividans)TK24，30℃、培养2天。200ml培养后的培养基离心(1,300g、室温、10分钟)，将所得菌体悬浮到72ml 0.35M蔗糖溶液中。接着将悬浮液离心(1,300g、室温、10分钟)，将菌体再悬浮到60ml含1mg/ml溶菌酶(Sigma-Aldrich Japan)的P缓冲液中，30℃、孵育2.5小时。孵育后，用脱脂棉将悬浮液过滤除去残渣。然后将所得滤液离心(1,300g、室温、10分钟)，用P缓冲液25ml洗涤沉淀。该洗涤重复2次，然后将沉淀悬浮到1ml P缓冲液中，作为原生质体悬浮液。

P缓冲液

TES[N-Tris(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸]5.73g

蔗糖 103g

氯化镁 2.03g

硫酸钾 0.5g

氯化钙 3.68g

微量元素溶液 2ml/L(pH7.4)

独立制备1％磷酸钾溶液，使用前每100mlP缓冲液中加1ml该溶液。

微量元素溶液

氯化锌 40mg

氯化铁 200mg

氯化铜 10mg

氯化锰 10mg

四硼酸钠 10mg

钼酸铵 10mg/L

12.变铅青链酶菌(Streptomyces lividans)TK24的转化

混合以下各溶液，使其总量达121μl。

含AMP脱氨酶表达质粒pSVSAD(4μg)的TE溶液 1μl

变铅青链酶菌TK24原生质体 100μl

0.35M蔗糖溶液 20μl

接下来，用吸液管添加1.5ml含20％聚乙二醇1000的P缓冲液，轻轻混合，室温放置2分钟。将该混合液离心(1,700g、室温、10分钟)，收集沉淀。用P缓冲液洗涤所得原生质体沉淀2次。再将团块悬浮到0.3mlP缓冲液中后，每100μl滴到R-2培养基中。然后，将在55℃保温的R-2上层琼脂糖培养基灌注到平板上，每板3ml，使原生质体分散到整个平板。在净化台中将平板干燥2小时，直到上层琼脂糖培养基固化。干燥后30℃培养16小时，然后添加3ml含200μg/ml 硫链丝菌素的R-2上层琼脂糖培养基覆盖平板表面，干燥2小时。再在30℃下将平板培养4天，获得硫链丝菌素抗性的转化体(SAD-1)。

分别如下制备R-2/A及R-2/B，然后混合它们制备成R-2培养基。含琼脂的培养基作为R-2平板，含琼脂糖的培养基作为R-2上层琼脂糖培养基。制备平板时混合R-2/A、R-2/B，再以每200ml终体积1ml的比例混合1％KH₂PO₄。

R-2/A

硫酸钾 0.5g

氯化镁 20.2g

氯化钾 5.9g

葡萄糖 20.0g

脯氨酸 6.0g

酪蛋白水解物 0.2g

微量元素溶液 4.0ml

琼脂 44.0g/L或琼脂糖5.0g/L

R-2/B

TES 11.5g

酵母提取物 10.0g

蔗糖 203g/L(pH7.4)

13.转化体的培养

按上面实施例的程序(<酶液的制备方法>)添加ソルピ一NY 2％、ミ一ストPlG 0.5％、KH₂PO₄ 0.1％、MgSO₄ 0.05％、可溶性淀粉3％，调整成pH5.7，121℃灭菌30分钟。接种转化体SAD-1与转化的宿主变铅青链酶菌(Streptomyces lividans)TK24，30℃预培养2天，培养5天，取培养上清的一部分，作为以下测定AMP脱氨酶活性的样品。

14.AMP脱氨酶活性测定

按照实施例中所示的方法(<酶活性的测定方法>的栏目)测定上面所得样品的酶活性。将0.017M的5’AMP-2Na与1/15M磷酸盐缓冲液(pH5.6)以1∶2的比例混合，向1.5ml混合液中添加0.5ml样品溶液作为反应液，37℃反应15分钟。15分钟后添加2％高氯酸溶液终止反应，然后取100μl。加水到5ml，测定OD₂₆₅。同样测定反应时间为0分的样品作为对照。以下条件下，60分钟吸光度差减少0.001时作为1单位。测定结果如图17所示。在同样条件下培养变铅青链酶菌TK24的培养上清作为对照(Control)样品。

从图17可以看出，转化体SAD-1的培养上清中有高AMP脱氨酶活性。从该结果可以验证成功获得了AMP脱氨酶基因。另外，提示实际上可应用该基因构建AMP脱氨酶生产体系。

15.转化体(SAD-1)来源的AMP脱氨酶的热稳定性

测定转化体(SAD-1)产生的AMP脱氨酶的热稳定性。在规定的温度下处理用上述方法制备的SAD-1培养上清，然后，测定残存的AMP脱氨酶活性(pH 5.6)。处理温度为30℃、40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、及75℃。处理时间是30分钟。

测定结果如图18所示。结果表明与图1所示的鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶有同样的热稳定性。

16.转化体(SAD-1)来源的AMP脱氨酶的底物特异性

为了确认上述方法获得的转化体(SAD-1)来源的脱氨酶是AMP脱氨酶(AMP-deaminase)还是腺苷脱氨酶(Adenosine-deaminase)，检测其底物特异性。结果如图19所示。图中表示以对5’AMP的酶活性为100％时的相对活性。该酶对5’AMP最有效。此外，对3’AMP、5’dAMP、ADP、ATP、腺苷(Adenosine)及3′5′-cycilc AMP也起效，但对2’AMP、腺嘌呤(adenine)没有一点作用。特别对5’dAMP、ADP及ATP作用良好。从以上结果可以确认，转化体(SAD-1)来源的脱氨酶与鼠灰链酶菌(Streptomyces murinus)来源的AMP脱氨酶类似，是AMP脱氨酶。此外，该酶也可用于以5’dAMP、ADP及ATP作底物进行的反应中。

17.转化体(SAD-1)来源的AMP脱氨酶的生产验证

将SAD-1的培养上清进行SDS-PAGE(CBB染色)，验证转化体对该酶的生产。SDS-PAGE的结果如图20所示。泳道II是对照样品(宿主培养上清)，泳道III是转化体(SAD-1)培养上清。泳道III中存在泳道II中没有的条带，说明转化体产生了新的酶蛋白质。泳道I是蛋白质分子量标记的条带。从高分子量开始顺次是磷酸化酶b(M.W.97000)、牛血清白蛋白(M.W.66,000)、卵清蛋白(M.W.45000)、碳酸酐酶(M.W.30000)、胰蛋白酶抑制剂(M.W.20100)的条带。

如上所述，本发明人等成功克隆了编码鼠灰链酶菌来源的AMP脱氨酶的基因。此外，应用放线菌的转化体系，成功获得了导入了该基因的转化体，并验证了该基因的表达。这些成果表明该酶可以重组体形式生产。因此，实现了稳定供给，并且可通过基因重组来提高该酶的生产性和对酶本身进行的改良。例如(1)利用具有高生产性的启动子提高生产性能；(2)利用生产性能高的菌株作为宿主进行高生产性转化体的制备，以及利用该转化体构建高生产体系；(3)可以通过改变碱基序列、氨基酸序列进行生产性能的提高、稳定性的提高，和/或底物特异性的改良等。

产业上利用的可能性

本发明的AMP脱氨酶具有良好的热稳定性。因此，适用于希望在高温下进行反应的应用中。例如，在酵母提取物的制备过程中，作为增强味道用的酶；或者作为制备调味料5’-肌苷酸用的酶应用。

此外，通过利用作用于AMP以外的底物这一特性，本发明的AMP脱氨酶可在以ADP，ATP、5’dAMP等底物为原材料的各种反应中应用。

该发明不限定于上述发明的实施方式及实施例中的说明。只要不脱离权利要求范围内，业内人士很容易想到的各种不同的实施方式也包括在本发明内。

本说明书中提到的论文、公开专利公报、专利公报等内容，其所有内容均在此引用作为参考。

序列表

<110>天野酶株氏会社

山下凉子

森茂治

东本笃树

安藤启一

结城健介

<120>放线菌来源的AMP脱氨酶及其应用

<130>P0403301

<150>JP P2004-134464

<151>2004-04-28

<160>24

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>491

<212>PRT

<213>鼠灰链酶菌

<400>1

Ala Pro Pro Pro Arg Gln Ala Thr Ala Ala Glu Ala Arg Thr Asp Ala

1 5 10 15

Tyr Leu Arg Ser Val Lys Asp Arg Pro Ala Ala Leu Arg Ala Phe Phe

20 25 30

Arg Gln Leu Pro Lys Gly Gly Asp Leu His Asn His Leu Ser Gly Ala

35 40 45

Val Asn Thr Asp Tyr Leu Ile Glu Leu Ala Ala Glu Asp Gly Leu Cys

50 55 60

Ile Asp Ala Thr Met Thr Ala Val Pro Ser Pro Cys Gly Pro Gly Thr

65 70 75 80

Arg Pro Ala Ala Asp Ala Arg Thr Asp Arg Ala Phe His Asp Ala Ile

85 90 95

Val Arg Ala Trp Ser Met Gln Asp Phe Pro Pro Asp Glu Asn Gly His

100 105 110

Asp His Phe Phe Asp Thr Phe Gly Lys Phe Gly Glu Val Thr Trp Arg

115 120 125

His Arg Gly Lys Leu Leu Ala Gln Val Ala Asp Thr Val Val Ala Asn

130 135 140

Asn Gln Ser Tyr Leu Glu Thr Met Val Thr Pro Ala Ser Asp Gly Ala

145 150 155 160

Lys Gln Leu Ala Asp Gln Val Gly Trp Asp Ala Asp Leu Thr Ala Leu

165 170 175

His Arg Lys Leu Ala Ala Gly Gly Lys Leu Asp Lys Leu Val Ala Asp

180 185 190

Ala Arg Lys Glu Ala Asp Asp Gly Asp Ala Glu Phe Arg Ala Thr Glu

195 200 205

His Cys Gly Thr Ala Lys Ala Arg Pro Ala Cys Gly Leu Thr Val Arg

210 215 220

Trp Ile Ser Gln Ala Ser Arg Gly Ser Ser Pro Val Arg Val Phe Thr

225 230 235 240

Gln Leu Asp Leu Gly Met Arg Len Ala Glu Ala Asp Ser Arg Phe Val

245 250 255

Ala Val Asn Leu Val Gln Pro Glu Asp Trp Asp Ser Ser Leu Glu Asn

260 265 270

Tyr Ser Leu Gln Met Arg Met Val Gly Tyr Leu Arg Thr Val Tyr Pro

275 280 285

Lys Ala His Val Thr Leu His Ala Gly Glu Leu Trp Pro Gly Leu Val

290 295 300

Lys Pro Glu Ala Leu Lys Phe His Ile Ala Glu Ala Val Asp Ile Ala

305 310 315 320

His Thr Gln Arg Val Gly His Gly Val Asp Leu Val His Glu Asp Asn

325 330 335

Trp Gln Arg Thr Ala Arg Thr Met Ala Ala Arg Gln Ile Ala Val Glu

340 345 350

Val Pro Phe Ser Ser Asn Ala Gln Ile Leu Gly Val Lys Gly Ala Glu

355 360 365

His Pro Phe Thr Thr Tyr Arg Arg Tyr Gly Val Pro Val Val Leu Ala

370 375 380

Thr Asp Asp Pro Gly Val Ser Arg Ile Asp Ile Ser His Glu Tyr Gln

385 390 395 400

Tyr Ala Ala Ala Thr Tyr Gly Leu Gly Tyr Pro Glu Leu Lys Asp Leu

405 410 415

Ala Arg Ala Ser Leu Gln Tyr Ala Phe Leu Pro Gly Ala Ser Leu Trp

420 425 430

Gln Gly Asn Pro Thr Ala Gln Gly Tyr His Pro Val Ala Ala Cys Arg

435 440 445

Ala Glu Arg Pro Gly Gln Pro Val His Ser Ala Ala Cys Arg Arg Leu

450 455 460

Leu Asp Gly Ser Ala Arg Ala Arg Leu Glu Trp Arg Gln Glu Ala Ala

465 470 475 480

Phe Ala Ala Phe Glu Arg Ala His Ala Arg Gly

485 490

<210>2

<211>519

<212>PRT

<213>鼠灰链酶菌

<400>2

Met Leu Gly Thr Leu Ser Val Leu Ser Leu Leu Ser Ala Leu Pro Ala

1 5 10 15

Ala Ala Gln Pro Ala Arg Ala Ala Ala Arg Pro Ala Ala Pro Pro Pro

20 25 30

Arg Gln Ala Thr Ala Ala Glu Ala Arg Thr Asp Ala Tyr Leu Arg Ser

35 40 45

Val Lys Asp Arg Pro Ala Ala Leu Arg Ala Phe Phe Arg Gln Leu Pro

50 55 60

Lys Gly Gly Asp Leu His Asn His Leu Ser Gly Ala Val Asn Thr Asp

65 70 75 80

Tyr Leu Ile Glu Leu Ala Ala Glu Asp Gly Leu Cys Ile Asp Ala Thr

85 90 95

Met Thr Ala Val Pro Ser Pro Cys Gly Pro Gly Thr Arg Pro Ala Ala

100 105 110

Asp Ala Arg Thr Asp Arg Ala Phe His Asp Ala Ile Val Arg Ala Trp

115 120 125

Ser Met Gln Asp Phe Pro Pro Asp Glu Asn Gly His Asp His Phe Phe

130 135 140

Asp Thr Phe Gly Lys Phe Gly Glu Val Thr Trp Arg His Arg Gly Lys

145 150 155 160

Leu Leu Ala Gln Val Ala Asp Thr Val Val Ala Asn Asn Gln Ser Tyr

165 170 175

Leu Glu Thr Met Val Thr Pro Ala Ser Asp Gly Ala Lys Gln Leu Ala

180 185 190

Asp Gln Val Gly Trp Asp Ala Asp Leu Thr Ala Leu His Arg Lys Leu

195 200 205

Ala Ala Gly Gly Lys Leu Asp Lys Leu Val Ala Asp Ala Arg Lys Glu

210 215 220

Ala Asp Asp Gly Asp Ala Glu Phe Arg Ala Thr Glu His Cys Gly Thr

225 230 235 240

Ala Lys Ala Arg Pro Ala Cys Gly Leu Thr Val Arg Trp Ile Ser Gln

245 250 255

Ala Ser Arg Gly Ser Ser Pro Val Arg Val Phe Thr Gln Leu Asp Leu

260 265 270

Gly Met Arg Leu Ala Glu Ala Asp Ser Arg Phe Val Ala Val Asn Leu

275 280 285

Val Gln Pro Glu Asp Trp Asp Ser Ser Leu Glu Asn Tyr Ser Leu Gln

290 295 300

Met Arg Met Val Gly Tyr Leu Arg Thr Val Tyr Pro Lys Ala His Val

305 310 315 320

Thr Leu His Ala Gly Glu Leu Trp Pro Gly Leu Val Lys Pro Glu Ala

325 330 335

Leu Lys Phe His Ile Ala Glu Ala Val Asp Ile Ala His Thr Gln Arg

340 345 350

Val Gly His Gly Val Asp Leu Val His Glu Asp Asn Trp Gln Arg Thr

355 360 365

Ala Arg Thr Met Ala Ala Arg Gln Ile Ala Val Glu Val Pro Phe Ser

370 375 380

Ser Asn Ala Gln Ile Leu Gly Val Lys Gly Ala Glu His Pro Phe Thr

385 390 395 400

Thr Tyr Arg Arg Tyr Gly Val Pro Val Val Leu Ala Thr Asp Asp Pro

405 410 415

Gly Val Ser Arg Ile Asp Ile Ser His Glu Tyr Gln Tyr Ala Ala Ala

420 425 430

Thr Tyr Gly Leu Gly Tyr Pro Glu Leu Lys Asp Leu Ala Arg Ala Ser

435 440 445

Leu Gln Tyr Ala Phe Leu Pro Gly Ala Ser Leu Trp Gln Gly Asn Pro

450 455 460

Thr Ala Gln Gly Tyr His Pro Val Ala Ala Cys Arg Ala Glu Arg Pro

465 470 475 480

Gly Gln Pro Val His Ser Ala Ala Cys Arg Arg Leu Leu Asp Gly Ser

485 490 495

Ala Arg Ala Arg Leu Glu Trp Arg Gln Glu Ala Ala Phe Ala Ala Phe

500 505 510

Glu Arg Ala His Ala Arg Gly

515

<210>3

<211>3822

<212>DNA

<213>鼠灰链酶菌

<400>3

gcggccgccg ttcgtgctca gtggtgcccg tggttccccg cgagccggtg caggaccgcc 60

cccgccatgg cctcctcgcc ccgggcgttg gggtgcgccg gggccgcggg cgcggccggc 120

tggagcggct cgatccagcg gtccgcgggc gccttgcaca tgtcgtggcc cacggtcgga 180

ccgtatgtgt ccacgtactc ggcgcggttg cgcccggcca ccgtgcgcag catcaggttc 240

agccgcttct cggtgtcccg cagataggcg aagtcgccct gtgcgaaggg gacctgcggg 300

aagcagccca ccccgtcgtc gggcagcaga tcggggtagc cgacgaccac gacccgggcg 360

tgcggcgccc gcgcgtgcac ggcccgcagc acctcggtga ccttcggcgc ggtccgccgt 420

accgcgagcg ccagcgcgtc ctgcccggac gcctcgtagg agcgctcgca gggactgccc 480

gtcgggtcct ggacaccgag ccgggcgcag gtggcgatga tggtgccgaa cccgacgtcg 540

ttgccgccta tttggagcgt caccaggtcc gtgttccgtg aaacggcgtc cagctggggc 600

ccgttggtgc cctgggcctg ccacatctgc acggtcgtcg cgcccgagca gctgacgtcg 660

gtgaacgtcg tcgccctcgc ccgccgcgcc accagcgacg ggtaattccg gtcggagcgg 720

gcgcagtcgg catccacctg ggtgggtatg cccgggcccg aggtgtagga gtcgccgagc 780

gccacgtagt ccaggcggtg gccgcggccc gccggatgcg cggcggccgg agtggtggcg 840

gcggcgacca gggcgcagcc gcccaccacc gccgccagga ccgccgcccg ccgccgggct 900

ctcgccccgt ccgccggacg cctgtcgttc gtcatggttc ccccctggga ccggtacacg 960

gcgcggacgg cgccgccctg gagcggccct cacgcgatcg actgggtctg tataccgtcc 1020

ggtaggtccc gccgaccaga agcgcgagcc catgagttcg ggggagaacg cggcggggag 1080

ccgccggcgg ggcgcggtgc cggcggcggt gcgcgacccc gcgccccggc ctcaggcgcc 1140

ggacgcggcg acggccggcg cgggctcctg gagcagcgag tcgtcctccg gccgggcccc 1200

ggacagccgg tggcgtgccg cgatcagggc catgtcgaca tcccgcgtcc cggtggccac 1260

gcacagcgtg tacgagatgt ccgcgagccg ctgctgcgcc ctcggggtgc tctcctcggc 1320

gccgagcagc gcgagggtct cgtactgggt gatgaggtcc ttcagcacgg cggggtgtgc 1380

catcagcatg gggtcggcct cctggtgtct cgccgatcta cgacgtcaca ggcgcgacta 1440

cccgggccgg cgccccgcat gccaccccgg tggtccccgg tcccgcgcgc accgcccttt 1500

ccggacagga agacggacac gtcacccgca cgggtgctct ccggccggta tgcgccggtc 1560

gggcccccgt cgccgccctc cgtcgctgat catgcacctg tgagtctgca cacccgaagt 1620

gccgtaccgc gccgggtcgt tccggccgtg ctcggcaccc tcagtgtcct gtccctgctg 1680

tccgccctgc ccgccgccgc gcagcccgcg cgtgccgcgg cccggcccgc cgcgccgccg 1740

ccccggcagg ccacggccgc cgaggcgcgg accgacgcct acctccgctc ggtcaaggac 1800

cggcccgcgg ccctgcgggc cttcttccgg cagctcccca agggcgggga cctgcacaac 1860

cacctctccg gagcggtgaa cacggactac ctcatcgagc tggccgccga ggacggcctg 1920

tgcatcgacg cgacgatgac cgccgtcccc tcgccctgcg gccccggcac gcgccccgcc 1980

gccgacgccc gcaccgaccg cgccttccac gacgcgatcg tgcgcgcctg gtccatgcag 2040

gacttcccgc ccgacgagaa cgggcacgac cacttcttcg acaccttcgg caagttcggc 2100

gaggtcacct ggcggcaccg gggcaagctg ctcgcgcagg tcgccgacac cgtcgtcgcc 2160

aacaaccagt cgtacctgga gacgatggtc acccccgcct ccgacggcgc caagcaactc 2220

gccgaccagg tgggctggga cgccgatctg accgccctgc accgcaagct ggccgcgggc 2280

ggcaagctgg acaagctggt cgcggacgcc cgcaaggagg ccgacgacgg cgacgccgag 2340

ttccgcgcca ccgagcactg cggcaccgcg aaggcccggc ccgcctgcgg gctcacggtc 2400

cgctggatct cccaggcgtc ccggggcagt tcaccggtgc gggtcttcac ccagctggac 2460

ctcggcatgc ggctcgccga ggcggactcc cgcttcgtcg ccgtcaacct ggtgcagccg 2520

gaggactggg acagctcgct ggagaactac agcctccaga tgcgcatggt cggctatctg 2580

cgcaccgtgt acccgaaggc ccatgtcacc ctgcacgcgg gcgagttgtg gcccggactg 2640

gtcaagcccg aggcgctgaa gttccatatc gccgaggcgg tggacatcgc gcacacccag 2700

cgcgtcggac acggtgtcga cctcgtccac gaggacaact ggcagcgcac cgcccgcacc 2760

atggcggccc ggcagatcgc cgtcgaggtg cccttctcca gcaacgccca gatcctcggc 2820

gtcaagggtg ccgagcaccc cttcacgacg taccgccgct acggcgtccc ggtcgtcctc 2880

gccaccgacg accccggtgt ctcgcgcatc gacatcagcc acgagtacca gtacgccgcc 2940

gccacctacg gcctcggcta cccggagctg aaggacctgg cccgcgcctc cctccagtac 3000

gccttcctgc ccggcgcgag cctgtggcag ggcaacccca ccgcccaggg ctaccacccg 3060

gtcgcggcct gccgcgccga gcgccccgga cagcccgtgc acagcgcggc ctgccgtcgg 3120

ctcctcgacg gcagcgcccg ggcgcgcctg gagtggcgcc aggaggccgc gttcgcggcg 3180

ttcgagcggg cgcacgcccg ggggtgaccc ggttccggcc gcggccgtgc ggacggccgc 3240

ggccggaatg catcgattgg ccgagaagta cgaggtcata caaccggatg acccgattcc 3300

gtgcgggagc gcgggtcggg tcttcgccat tacccgggct ttgcgacgac gtttccggta 3360

accccacgca cccccgtcgt cacggcccgt accgtgcagg gatgcctctc ccttaagatc 3420

atcacatcgt catcacatag ccttcacgga acgaccactt tcggccgatc gcgttccggg 3480

tcctcgtgac ggggcagacg cggtacgcgc cccgcgccta gcctcccggg ccatgcgatc 3540

acctctgctg agacgcctcg gtctcaccgc cgtcctcgcc gtcgtcctcg ccgtcttcgg 3600

cttcagcacc atcgccagcg cggacccgga cccggccgcc ctcaccttca gcaccgacag 3660

cgccaccacc acccccggtg gttcggtcaa gctgtcgatg acgctgacca acaacaagac 3720

gtacgacgtc ctgttcgtgt accagacgat cgatccgacc tggctgacca cccagcgtcc 3780

ggacctgaag tacagcttcg ccggctgcac cctggcggcc gc 3822

<210>4

<211>1560

<212>DNA

<213>鼠灰链酶菌

<400>4

gtgctcggca ccctcagtgt cctgtccctg ctgtccgccc tgcccgccgc cgcgcagccc 60

gcgcgtgccg cggcccggcc cgccgcgccg ccgccccggc aggccacggc cgccgaggcg 120

cggaccgacg cctacctccg ctcggtcaag gaccggcccg cggccctgcg ggccttcttc 180

cggcagctcc ccaagggcgg ggacctgcac aaccacctct ccggagcggt gaacacggac 240

tacctcatcg agctggccgc cgaggacggc ctgtgcatcg acgcgacgat gaccgccgtc 300

ccctcgccct gcggccccgg cacgcgcccc gccgccgacg cccgcaccga ccgcgccttc 360

cacgacgcga tcgtgcgcgc ctggtccatg caggacttcc cgcccgacga gaacgggcac 420

gaccacttct tcgacacctt cggcaagttc ggcgaggtca cctggcggca ccggggcaag 480

ctgctcgcgc aggtcgccga caccgtcgtc gccaacaacc agtcgtacct ggagacgatg 540

gtcacccccg cctccgacgg cgccaagcaa ctcgccgacc aggtgggctg ggacgccgat 600

ctgaccgccc tgcaccgcaa gctggccgcg ggcggcaagc tggacaagct ggtcgcggac 660

gcccgcaagg aggccgacga cggcgacgcc gagttccgcg ccaccgagca ctgcggcacc 720

gcgaaggccc ggcccgcctg cgggctcacg gtccgctgga tctcccaggc gtcccggggc 780

agttcaccgg tgcgggtctt cacccagctg gacctcggca tgcggctcgc cgaggcggac 840

tcccgcttcg tcgccgtcaa cctggtgcag ccggaggact gggacagctc gctggagaac 900

tacagcctcc agatgcgcat ggtcggctat ctgcgcaccg tgtacccgaa ggcccatgtc 960

accctgcacg cgggcgagtt gtggcccgga ctggtcaagc ccgaggcgct gaagttccat 1020

atcgccgagg cggtggacat cgcgcacacc cagcgcgtcg gacacggtgt cgacctcgtc 1080

cacgaggaca actggcagcg caccgcccgc accatggcgg cccggcagat cgccgtcgag 1140

gtgcccttct ccagcaacgc ccagatcctc ggcgtcaagg gtgccgagca ccccttcacg 1200

acgtaccgcc gctacggcgt cccggtcgtc ctcgccaccg acgaccccgg tgtctcgcgc 1260

atcgacatca gccacgagta ccagtacgcc gccgccacct acggcctcgg ctacccggag 1320

ctgaaggacc tggcccgcgc ctccctccag tacgccttcc tgcccggcgc gagcctgtgg 1380

cagggcaacc ccaccgccca gggctaccac ccggtcgcgg cctgccgcgc cgagcgcccc 1440

ggacagcccg tgcacagcgc ggcctgccgt cggctcctcg acggcagcgc ccgggcgcgc 1500

ctggagtggc gccaggaggc cgcgttcgcg gcgttcgagc gggcgcacgc ccgggggtga 1560

<210>5

<211>1476

<212>DNA

<213>鼠灰链酶菌

<400>5

gcgccgccgc cccggcaggc cacggccgcc gaggcgcgga ccgacgccta cctccgctcg 60

gtcaaggacc ggcccgcggc cctgcgggcc ttcttccggc agctccccaa gggcggggac 120

ctgcacaacc acctctccgg agcggtgaac acggactacc tcatcgagct ggccgccgag 180

gacggcctgt gcatcgacgc gacgatgacc gccgtcccct cgccctgcgg ccccggcacg 240

cgccccgccg ccgacgcccg caccgaccgc gccttccacg acgcgatcgt gcgcgcctgg 300

tccatgcagg acttcccgcc cgacgagaac gggcacgacc acttcttcga caccttcggc 360

aagttcggcg aggtcacctg gcggcaccgg ggcaagctgc tcgcgcaggt cgccgacacc 420

gtcgtcgcca acaaccagtc gtacctggag acgatggtca cccccgcctc cgacggcgcc 480

aagcaactcg ccgaccaggt gggctgggac gccgatctga ccgccctgca ccgcaagctg 540

gccgcgggcg gcaagctgga caagctggtc gcggacgccc gcaaggaggc cgacgacggc 600

gacgccgagt tccgcgccac cgagcactgc ggcaccgcga aggcccggcc cgcctgcggg 660

ctcacggtcc gctggatctc ccaggcgtcc cggggcagtt caccggtgcg ggtcttcacc 720

cagctggacc tcggcatgcg gctcgccgag gcggactccc gcttcgtcgc cgtcaacctg 780

gtgcagccgg aggactggga cagctcgctg gagaactaca gcctccagat gcgcatggtc 840

ggctatctgc gcaccgtgta cccgaaggcc catgtcaccc tgcacgcggg cgagttgtgg 900

cccggactgg tcaagcccga ggcgctgaag ttccatatcg ccgaggcggt ggacatcgcg 960

cacacccagc gcgtcggaca cggtgtcgac ctcgtccacg aggacaactg gcagcgcacc 1020

gcccgcacca tggcggcccg gcagatcgcc gtcgaggtgc ccttctccag caacgcccag 1080

atcctcggcg tcaagggtgc cgagcacccc ttcacgacgt accgccgcta cggcgtcccg 1140

gtcgtcctcg ccaccgacga ccccggtgtc tcgcgcatcg acatcagcca cgagtaccag 1200

tacgccgccg ccacctacgg cctcggctac ccggagctga aggacctggc ccgcgcctcc 1260

ctccagtacg ccttcctgcc cggcgcgagc ctgtggcagg gcaaccccac cgcccagggc 1320

taccacccgg tcgcggcctg ccgcgccgag cgccccggac agcccgtgca cagcgcggcc 1380

tgccgtcggc tcctcgacgg cagcgcccgg gcgcgcctgg agtggcgcca ggaggccgcg 1440

ttcgcggcgt tcgagcgggc gcacgcccgg gggtga 1476

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物IS-F

<220>

<221>混杂_特征

<222>(6)..(6)

<223>n代表肌苷

<220>

<221>混杂_特征

<222>(12)..(12)

<223>n代表肌苷

<220>

<221>混杂_特征

<222>(15)..(15)

<223>n代表肌苷

<220>

<221>混杂_特征

<222>(18)..(18)

<223>n代表肌苷

<220>

<221>混杂_特征

<222>(21)..(21)

<223>n代表肌苷

<400>6

ttcggngagg tnacngcncg ncaymg 26

<210>7

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物IS-R

<220>

<221>混杂_特征

<222>(6)..(6)

<223>n代表肌苷

<220>

<221>混杂_特征

<222>(12)..(12)

<223>n代表肌苷

<220>

<221>混杂_特征

<222>(21)..(21)

<223>n代表肌苷

<400>7

aactcngcgt cnccgtcrtc ngcytc 26

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物MAD-F1

<400>8

aagcaactcg ccgaccag 18

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物MAD-F2

<400>9

tggtccatgc aggacttc 18

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物MAD-F3

<400>10

ctggagaact acagcctc 18

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物MAD-F4

<400>11

cagatcctcg gcgtcaag 18

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物MAD-F5

<400>12

ctccagtacg ccttcctg 18

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物MAD-F6

<400>13

gtcgggtcct ggacaccg 18

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物MAD-F7

<400>14

tataccgtcc ggtaggtc 18

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物MAD-F8

<400>15

ggacaggaag acggacac 18

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物MAD-F9

<400>16

gattggccga gaagtacg 18

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物MAD-R1

<400>17

tggtcggcga gttgcttg 18

<210>18

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物MAD-R2

<400>18

cagggacagg acactgag 18

<210>19

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物MAD-R3

<400>19

gatgtcgaca tggccctg 18

<210>20

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物MAD-R4

<400>20

cccagtcgat cgcgtgag 18

<210>21

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物MAD-R5

<400>21

tggtcgttcc gtgaaggc 18

<210>22

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物MAD-R6

<400>22

ctcgaacgcc gcgaacgc 18

<210>23

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物MAD-R7

<400>23

ctgggtgtgc gcgatgtc 18

<210>24

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物MAD-R8

<400>24

caccatcatc gccacctg 18

Claims

1.由以下(a)构成的分离的AMP脱氨酶：

(a)由序列号1的氨基酸序列构成的蛋白质。

2.根据权利要求1记载的分离的AMP脱氨酶，具有以下性质：

(1)作用

对作用于以腺苷作为构成成分的5’-核苷酸，使该5′-核苷酸脱氨基的反应进行催化；

(2)底物特异性

作用于以腺苷作为构成成分的5’-核苷酸的5′AMP、5′dAMP、ADP、ATP、3′5′cyclic AMP，并且对5′AMP最有效；

(3)作用温度

在40℃～70℃的范围下相对活性为50％以上，其中，所述相对活性是以65℃进行反应时的活性值为100％时的相对活性；

(4)温度稳定性

在pH5.6的醋酸缓冲液中，在65℃以下稳定；

(5)最适pH

在McIlvaine缓冲液中，最适pH在5.6；

(6)pH稳定性

在McIlvaine缓冲液中，在pH为6.0～8.5时稳定

(7)分子量

用凝胶过滤测定的分子量为48000±2000、用SDS-PAGE测定的分子量为60000±3000。

3.根据权利要求2所述的AMP脱氨酶，其中以腺苷作为构成成分的5’-核苷酸是5′-腺苷酸。

4.一种酵母提取物的制备方法，它包括使权利要求1～3中任一项所述的AMP脱氨酶作用的步骤。

5.一种调味料的制备方法，包括使权利要求1～3中任一项所述的AMP脱氨酶作用于以腺苷作为构成成分的5’-核苷酸，使该5’-核苷酸脱去氨基。

6.一种AMP脱氨酶的制备方法，其特征在于，在培养基中培养鼠灰链霉菌，在培养液中生成权利要求1～3中任一项所述的AMP脱氨酶，并收集它。

7.一种分离的核酸分子，它编码权利要求1所述的AMP脱氨酶。

8.根据权利要求7所述的分离的核酸分子，是由以下(a)构成的碱基序列：

(a)序列号3～5中任一项的碱基序列。

9.一种载体，它携有权利要求7或8所述的核酸分子。

10.一种转化体，它导入有权利要求7或8所述的核酸分子。

11.一种AMP脱氨酶的生产方法，它包括以下步骤(1)及(2)：

(1)在能产生上述核酸分子编码的蛋白质的条件下培养权利要求10所述的转化体的步骤；及

(2)回收所产生的蛋白质的步骤。