CN105541977A - 鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白及制备方法与应用，属于生物工程领域。本发明的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的氨基酸序列如SEQ？ID？NO：1所示；然后利用基因工程技术，在其进行克隆的基础上，将其与原核表达载体pET-32a(+)连接，成功转化大肠杆菌BL21(DE3)表达***进行诱导、表达的基因工程产品；该蛋白的表达形式是OmpHM/His融合蛋白，表达的融合蛋白分子量为28kDa，将产品设计为融合表达主要是考虑便于纯化；同时表达蛋白保持蛋白的天然活性。产品可应用于检测鸭疫里默氏杆菌抗体的间接ELISA方法的检测抗原，也可作为预防鸭疫里默氏杆菌的基因工程亚单位疫苗。

Description

鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白及制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及一种鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白及制备方法与应用。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌(Riemerellaanatipestifer,RA)是一种革兰氏阴性菌，归于黄杆菌科(Flavobacteriaceae)，是鸭疫里默氏杆菌病的病原体，能够引起鸭、鹅、火鸡和多种禽类的一种慢性或急性败血症状的接触性传染疾病，呈世界性分布，发病率和死亡率高，已成为目前严重危害养鸭业的主要传染病之一。该病主要的临床症状主要表现为精神沉郁，瘫地、缩颈、拉黄绿色稀便等症状。病变特征是引起宿主的纤维素性气囊炎、脑膜炎、心包炎、肝周炎、以及干酪性输卵管炎，并伴有不同程度的败血症，对养殖业的发展存在着巨大的威胁。

目前已建立的用于检测鸭疫里默氏杆菌血清抗体的方法有琼脂扩散实验、凝集试验、ELISA等，这些检测方法或是灵敏度、特异性不高，或是由于使用抗原成分的不同而存在一些不足；而鸭疫里默氏杆菌的防治主要是抗生素进行治疗或用菌体疫苗来对相应血清型感染进行预防。OmpH属于孔蛋白，目前未见鸭疫里默氏杆菌OmpH研究和应用的相关研究报道。

发明内容

为克服现有技术存在的缺点与不足，本发明的目的之一在于提供一种鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白，该蛋白能作为鸭疫里默氏杆菌抗体的捕获剂等。

本发明的目的之二在于提供上述鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的制备方法，该方法可用于OmpH截段重组蛋白的大规模生产。

本发明的目的之三在于提供上述制备获得的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

上述的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的DNA序列如SEQIDNO:2所示。

上述的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：

A、以RA-CH-1基因组DNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的上、下游引物PCR扩增得到鸭疫里默氏杆菌OmpH截段基因片段(OmpHM)，与pMD19-T(simple)的连接，得pMD19-OmpHM；

B、用限制性内切酶BamHI和XhoI分别双酶切pMD19-OmpHM质粒和原核表达载体pET32a(+)，进行连接，得重组原核表达质粒pET32a-OmpHM；

C、将步骤B提取的重组质粒pET32a-OmpHM转化到表达宿主菌诱导表达，得鸭疫里默氏杆菌截段重组蛋白粗品。

进一步，将步骤C所得鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白粗品经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化后，得鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白；

进一步，步骤C中的宿主菌为菌株BL21(DE3)，在IPTG浓度＝1.2mmol/L，诱导温度为25℃条件下进行诱导表达9小时，得鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白。

本发明的有益效果在于：鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白是选取鸭疫里默氏杆菌OmpH基因编码蛋白的主要抗原域(81aa-151aa)，并命名为OmpHM；然后利用基因工程技术，在其进行克隆的基础上，将其与原核表达载体pET-32a(+)连接，成功转化大肠杆菌BL21(DE3)表达***进行诱导、表达的基因工程产品。该蛋白的表达形式是OmpHM/His可溶性融合蛋白，表达的融合蛋白分子量为28kDa，将产品设计为融合表达主要是考虑便于纯化；同时表达蛋白为可溶性表达形式，在蛋白的制备、纯化过程中避免了蛋白的变性、复性等过程，利于保持蛋白的天然活性。经原核表达***表达后的产品经Westernblot进行鉴定后表明具有与天然蛋白相似的免疫反应活性。

上述制备获得的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的应用主要体现在：

①本产品可作为检测鸭疫里默氏杆菌抗体的间接ELISA方法的检测抗原。

②可作为预防鸭疫里默氏杆菌的基因工程亚单位疫苗。

本发明的产品优点体现在：

①由于该检测抗原是鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白，并非全菌，以此应用该检测抗原进行检测时无散菌危险。

②以该蛋白作为抗原解决了鸭疫里默氏杆菌难培养，易污染的问题。

③作为ELISA抗原检测鸭疫里默氏杆菌抗体，特异性强，无交叉反应。

④性能稳定、生产成本低，适合工厂化生产，市场应用前景广。

⑤作为亚单位疫苗，具有良好的保护性。

更多有益效果，将在实施例中体现。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为OmpH截段基因的PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图。其中1为OmpH截段基因PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的特异性DNA条带；M为DNAMarker。

图2为重组质粒pMD19-OmpHM的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M为DNAMarker；1为重组质粒pMD19-OmpHM用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的两条特异性条带。

图3为pET32a-OmpHM的酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M为DNAMarker；1为重组表达质粒pET32a-OmpHM用XhoⅠ单酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的一条特异性条带；2为重组表达质粒pET32a-OmpHM用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳所获得的两条特异性条带；3为重组表达质粒pET32a-OmpHM用BamHⅠ单酶切。

图4为在37℃下，IPTG＝0.4mmol/L时诱导表达过夜的OmpH截段重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中M为蛋白质Marker；1为空载体pET-32a(+)表达菌用IPTG诱导后经SDS-PAGE电泳所得结果；2为重组表达质粒pET32a-OmpHM表达菌用IPTG诱导，得到的菌液进行超声波破碎、离心后，所得上清进行SDS-PAGE电泳的结果；3为重组表达质粒pET32a-OmpHM表达菌用IPTG诱导，得到的菌液进行超声波破碎、离心后，所得沉淀进行SDS-PAGE电泳的结果。

图5为37℃时不同IPTG浓度下含有重组质粒pET32a-OmpHM的宿主菌E.coliBL21(DE3)诱导表达4小时后，鸭疫里默氏杆菌OmpHM截段重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中，M为蛋白质Marker；1为IPTG的终浓度为0mmol/L；2为IPTG的终浓度为0.4mmol/L；3为IPTG的终浓度为0.8mmol/L；4为IPTG的终浓度为1.2mmol/L。

图6为不同温度下IPTG＝0.4mmol/L时含有重组质粒pET32a-OmpHM的宿主菌E.coliBL21(DE3)表达鸭疫里默氏杆菌OmpHM截段重组蛋白诱导表达4小时的SDS-PAGE电泳图。其中，M为蛋白质Marker；1为诱导温度为25℃；2为诱导温度为30℃；3为诱导温度为37℃。

图7为37℃和IPTG浓度为0.4mmol/L时不同诱导时间下含有重组质粒pET32a-OmpHM的宿主菌E.coliBL21(DE3)表达鸭疫里默氏杆菌OmpHM截段重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中M为蛋白质Marker；1为诱导0h；2为诱导5h；3为诱导7h；4为诱导9h。

图8为镍琼脂糖凝胶(Ni²⁺-NAT)亲和层析纯化后的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白SDS-PAGE电泳图。其中M为蛋白质Marker；1为经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化后的OmpH截段重组蛋白。

图9为鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白Western-blot图。其中M为预染蛋白质Marker；1为OmpH截段重组蛋白的免疫印迹条带。

图10为鸭疫里默氏杆菌玻片凝集试验结果图。在1:2、1:4、1:8和阳性对照孔里分别有细沙状凝集颗粒，1:16孔内没有凝集颗粒。

图11为鸭疫里默氏杆菌微量凝集实验图片。在1:8、1:16、1:32和阳性对照孔里均可见凝集颗粒；1:64孔内无凝集颗粒，仅有部分菌体沉淀在底部，与阴性对照孔相同。

图12为阴性对照组雏鸭人工感染鸭疫里默氏杆菌死亡后的病变组织器官。在心脏、肝脏、腹腔表面均可以看到一层纤维素性渗出物，形成一层荚膜。

图13为免疫鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的雏鸭人工感染鸭疫里默氏杆菌后存活下来的剖解情况。可见腹腔、肝脏和心脏表面均正常，未见纤维素性渗出以及坏死灶，各器官正常。

图14为RA攻毒鸭子重新分离RA的16sRNA的PCR鉴定。M为DNAMarker；1、2、3、4分别为分离菌株的菌落PCR；5为阴性对照。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。

部分氨基酸相应的缩写如下：

谷酰胺glnQ；甘氨酸glyG；丝氨酸serS；丙氨酸alaA；苏氨酸thrT；缬氨酸valV；异亮氨酸ileI；亮氨酸leuL；酪氨酸tyrY；苯丙氨酸pheF；组氨酸hisH；脯氨酸proP；天冬酰胺asnN；甲硫氨酸metM；谷氨酸gluE；色氨酸trpW；赖氨酸lysK；半胱氨酸cysC；精氨酸argR；天冬氨酸AspD。

实施例1鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的制备

1主要实验材料

质粒T-VectorpMD19(simple)，MaxDNAPolymerase，均购自大连宝生物工程有限公司；原核表达质粒pET32a(+)，Novagen公司产品；克隆宿主菌E.coliDH5α、表达宿主菌E.coliBL21(DE3)和RA-CH-1菌株，由四川农业大学禽病研究中心提供。

2实验方法

2.1RA–CH-1OmpH截段基因的克隆

2.1.1引物设计

根据GenBank已有的RA-CH-1OmpH基因序列选取其中的主要抗原域(81aa-151aa并命名为OmpHM)，利用PrimerPremier5.0软件设计一对引物。如SEQIDNO:3所示的上游引物:5’-CGCGGATCCGAGGCTCAGAGAACTGCT-3’(划线部分为BamHⅠ位点)；如SEQIDNO:4所示的下游引物:5’-CCGCTCGAGTCCTTTATAGATTAACCCC-3’(划线部分为XhoⅠ位点)。引物合成后，以适量灭菌去离子水溶解，使其终浓度为20mmol/L，-20℃保存备用。

2.1.2RA基因组DNA的提取

a、鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1株的培养：取冻干保存的菌种，用2mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)中稀释，然后接种于血平板，CO₂条件下37℃恒温静置18～24h(菌落呈圆形，微凸起，边缘整齐，奶油状，菌落直径2mm；显微镜下观察菌体呈短粗型)。经过菌落观察和镜检，挑取单个菌落于胰蛋白胨大豆肉汤培养基TSB(含1％小牛血清)中培养。

b、鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1株的扩大培养：将培养过夜的鸭疫里默氏菌菌液按1:100(含1％小牛血清)接种到胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)中，37℃水浴振荡培养致细菌生长到对数生长期。

c、鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1株DNA的提取，具体步骤如下：(1)取生长到对数期的菌液1ml，12000rpm离心2min，弃上清。(2)加入567μlTEBuffer、30μl10％SDS和3μl蛋白酶K，37℃水浴1h，溶解沉淀。(3)加入等量的酚/氯仿抽提DNA，12000rpm离心5min，取上清。重复该步骤一次。(4)加入等量氯仿/异戊醇提DNA，12000rpm离心5min，取上清。(5)加入两倍体积的无水乙醇洗，10％体积的3mol/L的醋酸钠，冰浴30min，12000rpm离心15min，弃上清。(6)用70％的乙醇洗涤沉淀两次，弃上清。(7)室温下自然干燥沉淀DNA，加入适量TE(pH8.0)溶解沉淀DNA，-20℃保存备用。

2.1.3PCR扩增鸭疫里默氏杆菌OmpH截段基因

PCR反应扩增鸭疫里默氏杆菌OmpH截段基因的反应体系如表1所示：

表1OmpH截段基因PCR反应体系

轻轻混匀，4000r/min瞬时离心后进行PCR。

反应参数：95℃5min，然后进入94℃40s、58℃40s、72℃60s，共35个循环，最后72℃延伸10min，于4℃保存备用。取5μlPCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，观察扩增片段的长度。

2.1.4鸭疫里默氏杆菌OmpH截段基因PCR产物的回收

按OMEGA公司DNA回收试剂盒说明书进行，回收后的DNA贮存于-20℃保存备用。

2.1.5T克隆

纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段基因与pMD19-T(simple)的连接

连接反应体系如表2所示：

表2OmpH截段基因与pMD19-T(simple)的连接的反应体系

将上述试剂加入PCR反应管中，小心混匀，瞬时离心后，于16℃连接过夜。

2.1.6DH5α感受态细胞的制备

采用氯化钙法制备新鲜的DH5α株大肠杆菌感受态细胞，简述如下：(1)无菌挑取平板上新鲜培养的DH5α单克隆菌落接种于5mLLB培养液中，于37℃振荡培养过夜；(2)取1mL上述培养液接种于100mLLB培养液中，37℃200r/min振荡培养2.5～3h，使OD600＝0.4～0.5左右；(3)将细菌培养物倒入灭菌后用冰预冷的离心管中，冰浴10min；(4)于4℃4000r/min离心10min，弃上清；(5)加10mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂，温和悬起细菌沉淀，冰浴30min；(6)于4℃4000r/min离心10min，弃上清，加4mL冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂再次重悬沉淀，加入终浓度为15％的灭菌甘油CaCl₂，混匀后分装为100μl/管，-4℃冰箱中保存过夜以提高转化效率。

2.1.7转化感受态细胞

将10μl连接体系全部取出加到100μlDH5α感受态细胞中，冰浴30min；再置于42℃温浴90s，之后再冰浴2min；然后立即加入890μlLB培养基，37℃水浴振荡培养45min，取200μl涂于含Amp的培养基上，置37℃培养箱中培养过夜。次日挑取单个白色菌落接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃水浴振荡培养18h后进行质粒抽提。

2.1.8T克隆质粒的抽提

按OMEGA公司质粒抽提试剂盒说明书进行操作，回收产物贮存于-20℃保存备用。

2.1.9T克隆质粒的PCR和酶切鉴定

将上一步抽提的重组质粒命名为pMD19-OmpHM，分别以BamHⅠ/XhoⅠ双酶切消化与XhoⅠ单酶切消化、BamHⅠ单酶切消化，1.0％凝胶电泳观察结果。同时做PCR扩增目的基因，T克隆质粒的酶切体系如表3所示：

表3T克隆质粒的酶切体系

2.1.10鸭疫里默氏杆菌OmpH截段基因序列测定

将酶切鉴定正确的质粒寄送上海英骏生物有限公司进行测序。

2.2原核表达质粒pET32a-OmpHM的构建、诱导表达与表达条件的优化

2.2.1原核表达质粒pET32a-OmpHM的构建与鉴定

a、目的片段的酶切与连接：限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切pMD19-OmpHM质粒和原核表达载体pET32a(+)，酶切体系如表4所示：

表4目的片段与载体酶切体系

37℃水浴4h，按OMEGA的DNA胶回收试剂盒使用说明分别回收目的片段后，按照表5所示的连接体系16℃连接过夜。

表5目的片段与原核表达载体的连接体系

b重组质粒的转化：采用氯化钙法制备DH5α感受态细胞。之后，取连接液10μl加到含100μl感受态DH5α的离心管中，混匀后冰浴30min；置于42℃水浴90s，然后迅速冰浴2min；加入不含Amp的LB液体培养基890μl，37℃振摇(150r/min)培养1～1.5h；取200μl培养物涂布于含Amp的LB平板，37℃培养过夜，次日挑取单个菌落接种于5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃培养12～16h，同时设立空载体转化组(空载体10μl+感受态DH5α100μl)、无载体对照组(灭菌超纯水10μl+感受态DH5α100μl)。

c菌液的PCR鉴定：

以重组质粒菌液为模板，SEQIDNO:3所示的上游引物:5’-CGCGGATCCGAGGCTCAGAGAACTGCT-3’(划线部分为BamHⅠ位点)；如SEQIDNO:4所示的下游引物:5’-CCGCTCGAGTCCTTTATAGATTAACCCC-3’(划线部分为XhoⅠ位点)。进行PCR反应，其方法和扩增条件同上，取PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳检测。

d重组质粒的酶切鉴定：将上述保存的克隆菌种接种于5mL含Amp的LB液体培养基中，37℃水浴振摇培养过夜，次日按常规方法提取重组质粒，然后用XhoⅠ单酶切、BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定该重组质粒，其酶切体系如表6所示：

表6亚克隆酶切体系中各组分含量

经过酶切和PCR鉴定，获得重组原核表达质粒pET32a-OmpHM。

2.2.2重组表达质粒pET32a-OmpHM的诱导表达

a重组质粒pET32a-OmpHM的提取：挑取已鉴定含阳性重组质粒pET32a-OmpHM的DH5α菌种划线接种于含Amp的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，次日取单个菌落接种于含Amp的LB液体培养基中，剧烈振荡培养10～16小时，离心收集菌液，按OMEGA质粒DNA小量提取试剂盒说明进行重组质粒的提取与纯化。

b重组质粒pET32a-OmpHM转化表达菌：采用氯化钙法制备E.coliBL21(DE3)感受态细胞，并将上述提取的重组质粒pET32a-OmpHM转化到表达宿主菌E.coliBL21(DE3)中。

c重组质粒pET32a-OmpHM的诱导表达：从上述LB固体培养基上，挑取阳性克隆菌，接种LB液体培养基，37℃培养过夜，次日取菌液按1:50的比例接入含Amp的LB液体培养基中，剧烈振荡培养至OD600＝0.4时，分别加入IPTG诱导培养，收集1mL培养菌液，4℃13000r/min离心2min，弃上清，沉淀中加入40μl超纯水和10μl10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，观察表达结果。

d重组质粒pET32a-OmpHM表达产物的可溶性分析：在37℃下IPTG浓度为0.4mmol/L时诱导表达过夜的菌液和空载体的菌液各200ml，分别按下步骤处理：4℃，10000r/min离心5min，菌体沉淀用20mL20mmolTris-HCl(pH8.0)悬浮；置-20℃过夜后，超声波(冰浴)间歇破碎菌体(600w，30sec/次，10次)，4℃，10000r/min离心10min，取上清备用①；沉淀用10mL尿素液(10mmol/LPBS+2mol/L尿素)悬浮，4℃，10000r/min离心10min后，沉淀再次用10mL洗液悬浮，重复洗涤三次后，用适量尿素溶液(10mmol/LPBS+8mol/L尿素)溶解沉淀②，低温保存备用。分别取适量的上清①和尿素溶液溶解的沉淀②，向其中加入40μl超纯水和10μl10×SDS上样缓冲液，100℃水浴加热变性10min，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，将凝胶用考马斯亮蓝染色后，观察结果。

2.2.3重组质粒pET32a-OmpHM表达条件的优化

a诱导剂IPTG的浓度优化：取含重组质粒pET32a-OmpHM的表达宿主菌BL21(DE3)，接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。次日按1:50转接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃培养培养至OD600值约0.4时，取其中4只试管，分别加入IPTG至终浓度为0mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L、1.2mmol/L37℃诱导4h后，按上述方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

b温度条件优化：取含重组质粒pET32a-OmpHM的表达宿主菌BL21(DE3)，接种于含Amp的5mLLB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。次日按1:50转接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃培养培养至OD600值约0.4时，取其中3只试管，分别加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，分别置于25℃、30℃、37℃诱导4h，按上述常规方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

c诱导时间优化：取含重组质粒pET32a-OmpHM的表达宿主菌BL21(DE3)，接种于含Amp的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。次日按1:50转接种于含Amp的LB液体培养基中，继续培养至OD600值约0.4时，加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，37℃分别诱导0、5、7、9h，吸取1mL培养液，按上述方法对样品进行处理，12％SDS-PAGE电泳，观察结果。

2.3鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的大量制备、纯化

2.3.1鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的大量制备(上清处理)

将诱导表达的500mL菌液于4℃10000r/min离心10min，将菌体沉淀用40mL20mmolTris-HCl(pH8.0)悬浮；超声波(冰浴)间歇破碎菌体(200w，30sec/次，5～10次)，4℃10000r/min离心10min。取上清即为可溶性鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白，4℃保存备用。

2.3.2鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的纯化

镍琼脂糖凝胶(Ni²⁺-NAT)亲和层析纯化鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白：根据融合蛋白的6-His标签对镍离子特殊的亲和作用，使带有标签的融合蛋白能够结合于镍琼脂糖凝胶上，改变洗脱液的条件将其洗脱，而达到纯化的目的。具体操作步骤为：

(1)装柱：镍琼脂糖凝胶装柱，柱床体积约为40mL；

(2)平衡：用平衡缓冲液约5个床体积平衡层析柱，流速为1mL/min；

(3)上样：将0.45μm滤膜过滤的可溶性上清蛋白样品约50mL，加入层析柱中，流速为0.4mL/min；

(4)洗涤：用平衡缓冲液再洗2-5个床体积，流速为1mL/min；

(5)洗脱：分别用含20、50、100mmol咪唑的洗脱缓冲液进行梯度洗脱，流速为1mL/min，收集各梯度的洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的分子量大小和纯度；

(6)清洗：用超纯水洗5个柱床体积，再用25％的乙醇洗3个柱床体积，流速为1mL/min，回收镍琼脂糖凝胶柱，于4℃中保存，获得纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白。

3实验结果

3.1鸭疫里默氏杆菌OmpH截段基因的扩增、T-克隆与鉴定结果

3.1.1鸭疫里默氏杆菌OmpH截段基因的PCR扩增结果

以RA-CH-1基因组DNA为模板对OmpH截段基因进行PCR扩增，其产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，获得了一条约234bp的特异性DNA条带(图1)。

3.1.2鸭疫里默氏杆菌OmpH截段基因T克隆鉴定结果

PCR产物经胶回收纯化后，与pMD19-T(simple)载体连接并转化感受态细胞DH5α，得到的T克隆命名为pMD19-OmpHM。对pMD19-OmpHM进行PCR、酶切(图2：重组质粒pMD19-OmpHM用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切得到两个片段，小片段的分子量大小约为234bp)和测序鉴定，结果表明T克隆所获得的OmpH截段基因DNA序列(SEQIDNO:2所示)同已知的鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1的OmpH截段基因DNA序列完全一致，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

3.2原核表达质粒pET32a-OmpHM的构建与鉴定、诱导表达及其优化结果

3.2.1重组表达质粒pET32a-OmpHM的构建与酶切鉴定

用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切T克隆质粒后回收目的片段，与经相同酶切的pET-32a表达载体进行连接并转化DH5α，得到重组表达质粒pET32a-OmpHM,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后得到两条片段，XhoⅠ、BamHⅠ单酶切后得到一条片段，且大小与理论值相符，表明重组原核表达质粒构建成功(图3)。

3.2.2重组质粒pET32a-OmpHM的诱导表达

在37℃条件下，IPTG加入浓度为0.4mmol/L，诱导表达过夜，空载体转化菌株在约20kDa处出现一特异性蛋白条带，为载体上标签蛋白本身大小；重组表达质粒pET32a-OmpHM表达的重组融合蛋白在大约28kDa处，与理论值相符；另外，表达蛋白可溶性分析结果显示其主要存在于上清中，说明重组表达蛋白在菌体中以可溶的形式存在(图4)。

3.2.3重组质粒pET32a-OmpHM表达条件的优化

aIPTG浓度的优化：在37℃条件下，加入IPTG使其终浓度分别为0mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L、1.2mmol/L诱导培养4h，结果显示：随IPTG浓度的增高，蛋白诱导量增加，且在IPTG浓度为1.2mmol/L略高于其它浓度(图5)。因此，选择1.2mmol/L的IPTG浓度作为诱导表达浓度。

b诱导温度条件的优化：IPTG终浓度为0.4mmol/L，分别于25℃、30℃、37℃诱导4h，结果显示，当温度在37℃时，诱导蛋白量较少，而当在25℃和30℃时表达量较高，且25℃时的表达量略高于30℃，故选择温度25℃作为最佳诱导温度(图6)。

c诱导时间的优化：在IPTG浓度为0.4mmol/L，37℃条件下，分别诱导0h、5h、7h、9h，结果表明3h诱导的蛋白表达量很少，5h-9h的重组蛋白表达量较高，且诱导9h的蛋白表达量略高于5h、7h(图7)，因此选择9h作为最佳诱导时间。

实施例2鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的纯化

将实施例1制得的含有鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的表达产物经过收集菌体、超声波破碎、收集上清等一系列处理后，镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化重组OmpH截段重组蛋白。蛋白样品过柱纯化后的UV曲线图显示出3个峰，峰1为穿透峰，峰2为50mmol咪唑洗脱峰，峰3为100mmol咪唑洗脱峰。同时收集不同浓度咪唑洗脱峰，进行SDS-PAGE电泳，检验纯度及浓度，结果显示：只有100mmol咪唑洗脱峰中含有大量高纯度的OmpH截段重组蛋白(图8)。将纯化的OmpH截段重组蛋白经超滤管浓缩后，用核酸蛋白仪测定蛋白的终浓度，分装后备用。

实施例3鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的Western-blot(蛋白免疫印迹)

一、实验方法

将实施例1获得的含有鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白作为检测鸭疫里默氏杆菌血清抗体的探针。

1SDS-PAGE凝胶配制

1.112％分离胶的配制

去离子水1215μl，1.5MTris-HCl(PH＝8.8)950μl，10％SDS37.5μl，10％AP37.5μl，TEMED1.5μl，30％丙烯酰胺1.5ml。

1.25％浓缩胶的配制

去离子水700μl，1.0MTris-HCl(pH＝6.8)125μl，10％SDS10.0μl，10％AP10.0ul，TEMED1.0μl，30％丙烯酰胺165μl。

2蛋白样品的处理

在OmpH截段重组蛋白样品中加入适量的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(0.5MTris-HCl(PH＝6.81.2ml)，甘油1ml，去离子水4.8ml，10％SDS2.0ml，0.1％BPB0.5ml)。100℃煮沸10min后10000r/min10min。

3电泳

待胶冷却到室温后，把蛋白样直接上到SDS-PAGE孔内，100v电泳90min。

4转膜

按照电转三明治的安装顺序安装，70v90min。

5封闭

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的洗涤液中，漂洗2min。

6一抗的孵育

一抗为鸭疫里默氏杆菌血清按1:200稀释，4℃孵育过夜，然后用PBS洗涤3次。

7二抗的孵育

HRP标记的二抗按照说明书1:3000稀释，4℃孵育1h，PBS洗涤3次。

8底物显色

加入酶底物DAB显色液，用去离子水终止反应，膜自然晾干，保存于暗处。

二、实验结论

通过Western-blot蛋白免疫印迹实验，鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白能够与鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1株的阳性血清产生良好的反应原性(如图9)，可作为检测鸭疫里默氏杆菌血清抗体的探针或捕获剂。

实施例4鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白作为鸭疫里默氏杆菌抗体捕获剂的间接ELISA试剂盒

鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白作为鸭疫里默氏杆菌抗体捕获剂的应用主要通过间接ELISA试剂盒进行说明。

固相载体：固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中固相载体的材料很多，如聚苯乙烯，其必须满足具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，可制成各种形式。ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联孔条或12联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特制的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。本发明中采用的是Corning公司的96孔酶标板。

抗体捕获剂：由于鸭疫里默氏杆菌的培养环境及营养要求高，不利于培养且易被其它杂菌污染，所以本发明中采用的抗体捕获剂为实施例2纯化后的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白截段重组蛋白。

酶标二抗：本发明中采用的酶标二抗为羊抗鸭IgG-HRP(辣根过氧化酶标记的羊抗鸭IgG，购自美国KPL公司)，也可采用其他非鸭动物的抗鸭IgG-HRP，除了以辣根过氧化酶标记，也可以采用其他酶标记，如磷酸酯酶。

底物：由于本发明采用的酶标二抗是羊抗鸭IgG-HRP，故显色底物为四甲基联苯胺(TMB)，购自天根生物科技有限公司。也可选用其它显色底物，当采用其他酶标记时，可采用与其有色结合物作为底物。

封闭液：封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭的手续与包被相类似。最常用的封闭剂是牛血清白蛋白，也有用小牛血清或明胶作为封闭剂的，此外脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂。

终止液：本发明采用的是2mol/LH₂SO₄。

一实验方法

1间接ELISA步骤

①将纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白用包被液稀释至终浓度为4μg/mL，依次加入酶标板中，l00μl/孔，4℃包被过夜；

②洗涤三次，弃液体，于每孔中加入300μl封闭液，37℃封闭30min；

③洗涤三次，弃液体，将各待检血清稀释后并上样，l00μl/孔，37℃孵育30min；

④洗涤三次，弃液体，于每孔加入稀释的羊抗鸭IgG-HRP酶标二抗，l00μl/孔，37℃孵育30min；

⑤洗涤三次，弃液体，于每孔加入TMB100μl，避光显色20min，然后加入2mol/LH₂SO₄终止液50μl/孔，轻拍混匀，用酶标仪测OD450nm值。

2抗原最佳包被浓度及血清最适稀释倍数的确定

将鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白用包被液倍比稀释并包被酶标板，l00μl/孔；将RA阳性血清和阴性血清分别用抗体稀释液体积倍比稀释，然后加入酶标板中，l00μl/孔。以方阵法进行试验，选择P/N(阳性血清OD450nm值/阴性血清OD450nm值)最大时的OmpH截段重组蛋白包被浓度和血清稀释倍数作为最佳抗原包被浓度和最适血清稀释倍数。

3抗原包被时间的优化

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白作为抗原并按最佳包被浓度进行包被，分别4℃包被过夜、37℃孵育1h后放4℃包被过夜和37℃孵育2h后放4℃包被过夜，每个样本重复检测3次，然后进行间接ELISA试验，选择最优的抗原包被时间。

4不同封闭液的优化

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白作为抗原并按最佳包被条件进行包被，分别用1％BSA、5％BSA、10％BSA和5％的脱脂奶粉进行封闭，每个样本重复检测3次，然后进行间接ELISA试验，选择最优的封闭液。

5一抗和二抗结合时间的优化

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白作为抗原并按最佳包被条件包被，用最佳封闭条件进行封闭，然后进行间接ELISA试验，一抗和二抗分别反应120min、90min、60min和30min，每个样本重复检测3次，选择最优的反应时间。

6酶标抗体最佳工作浓度测定

根据已确定的抗原最佳包被浓度和血清最适稀释倍数，将羊抗鸭IgG-HRP(辣根过氧化酶标记的羊抗鸭IgG，购自美国KPL公司)作不同体积倍数(1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400)稀释并进行间接ELISA试验，每个稀释度重复4次，求出平均P值和N值，从而确定羊抗鸭IgG-HRP酶标二抗的最佳工作浓度。

7TMB显色时间的优化

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白作为抗原并按最佳包被条件包被，用最佳封闭条件进行封闭，然后进行间接ELISA试验，TMB的底物显色时间分别为10min、20min和30min，每个样本重复检测3次，选择最优的显色时间。

8阴阳性临界值判定标准的确定

取20份RA阴性鸭血清，按照上述建立的间接ELISA方法进行检测。将20份阴性样品的OD450nm值的平均值(X)和3倍标准方差(SD)之和作为阴性样品值的上限，即待检样品的OD450nm值＞阴性样品OD450nm值的临界值(X+3SD)时判定为阳性，反之则为阴性。

9特异性试验

用已建立的间接ELISA方法分别检测鸭病毒性肝炎病毒(DHV)阳性血清、禽流感病毒(AIV)阳性血清、鸭沙门氏菌(Salmonellabacillus，SB)阳性血清、鸭大肠杆菌(E.coli)阳性血清、鸭肿头症病毒阳性血清、鸭疫里默氏杆菌RA-ATCC11845株和RA-CH-2株阳性血清，每份血清样本重复检测3次。

10稳定试验

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白包被constar酶标板，按照建立的间接ELISA方法检测5份待检血清，每份样品重复5孔，判定批内重复性。再用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白包被的5个不同批次的constar酶标板检测5份待检血清，判定批间重复。

11敏感性试验

将RA阳性血清进行体积倍比稀释，然后用已经建立的间接ELISA方法进行检测，同时用同样的血清样本进行琼脂扩散试验、玻片凝集试验、微量凝集试验和破碎后的RA-CH-1的全菌ELISA，所有检测试验重复操作3次，取平均值，比较其敏感性。

二实验结论

1抗原(抗体捕获剂)包被浓度和血清稀释度的确定

通过方阵滴定试验，鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1阳性血清和阴性血清的检测结果分别如表7和表8所示，当抗体捕获剂的包被浓度为4ug/mL，血清稀释体积倍数为1:200时，阳性血清OD450nm值为0.384，相应的阴性血清OD450nm值为0.017，P/N值最大(22.588)如表9所示。因此，抗体捕获剂最佳包被浓度为4ug/mL，抗体最适体积稀释倍数为1:200。

表7不同抗原包被浓度和血清稀释度的阳性血清检测结果

表8不同抗原包被浓度和血清稀释度的阴性血清检测结果

表9不同抗原包被浓度和血清稀释度的P/N值

2抗原包被条件的优化

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白作为抗原并按最佳包被浓度进行包被，分别于4℃包被过夜、37℃孵育1h后放4℃包被过夜和37℃孵育2h后放4℃包被过夜，然后进行间接ELISA试验，每个样本检测3次，结果如表10所示。4℃包被过夜后检测出的阳性值最高，且测定的数值比较稳定，故选择4℃包被过夜作为本方法的最佳抗原包被条件。

表10抗原包被条件的优化

3不同封闭液的优化

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白作为抗原并按最佳包被条件进行包被，分别用1％BSA、5％BSA、10％BSA和5％的脱脂奶粉进行封闭，然后进行间接ELISA试验，每个样本重复检测3次，选择最优的封闭液，结果如表11所示。4种不同类型和浓度的封闭液所得出的结果相差不多，本着节约的原则，故选择该1％BSA的封闭液作为本方法的最佳封闭液。

表11封闭液的优化

4一抗和二抗结合时间的优化

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白作为抗原并按最佳包被条件进行包被，用最佳封闭条件封闭，然后进行间接ELISA试验，一抗和二抗分别反应120min、90min、60min和30min，每个样本重复检测3次，选择最优的反应时间，结果如表12和表13所示。OD450nm值均随着一抗和二抗反应时间的增多而升高，故一抗和二抗的作用时间均选择120min。

表12一抗包被时间的优化

表13二抗包被时间的优化

5酶标抗体最适浓度的确定

结果见表14，当酶标羊抗鸭抗体IgG作1:400体积稀释时，P/N值最大为24.114，因此确定最佳酶标抗体体积稀释倍数为1:400。

表14酶标抗体最佳工作浓度的确定。

6TMB显色时间的优化

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白作为抗原并按最佳包被条件包被，用最佳封闭条件进行封闭，然后进行间接ELISA试验，TMB的底物显色时间分别为10min、20min和30min，每个样本重复检测3次，选择最优的显色时间。结果如表15所示，TMB在37℃下反应10min效果最优，故本方法的最优底物显色时间为10min。

表15TMB底物显色时间的优化

7阴阳性临界值判定标准的确定

用上述优化的各ELISA条件对20份RA阴性血清样品进行检测，每个样本重复检测3次,取平均值所得结果如表16所示。X值为0.21965，SD值为0.043646，确定阴阳性临界点为X+3SD＝0.21965+3×0.043646＝0.35，因此，当待测样品的OD450nm值大于0.35时判定为阳性，小于或等于时则判定为阴性。

表16RA阴性血清检测结果

8特异性试验

按已建立的间接ELISA方法对包括鸭疫里默氏杆菌在内的7种病原阳性血清分别进行测定，结果如表17所示，除鸭疫里默氏杆菌RA-ATCC11845株和RA-CH-2株阳性血清以外，其余5种阳性血清的OD450nm值均小于0.35，表明除这两种阳性血清以外，该抗原不与上述其它5种阳性血清发生交叉反应，由此说明建立的以鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白作为抗原检测RA抗体的ELISA方法具有较好的特异性，且该重组蛋白能够作为RA-CH-1、RA-ATCC11845和RA-CH-2不同血清型RA抗体检测的通用抗原。

表17特异性实验结果

9稳定试验

用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白包被constar酶标板，按照建立的间接ELISA方法检测5份待检血清，每份血清样品重复5孔；再用实施例2制备纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白包被的5个不同批次的constar酶标板检测5份待检血清，通过所得每份血清的OD_450nm值计算出平均OD_450nm值及标准方差(SD)，再计算出每份血清的批内及批间变异系数(CV)，结果如表18和表19所示。批内重复试验5组血清变异系数平均值为3.37％，且均低于10％，批间重复试验5组血清的变异系数平均值为3.34％，且均未超过10％，由此说明本研究建立的基于鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的间接ELISA方法具有较好的稳定性。

表18批内重复试验

表19批间重复试验

10敏感性试验

用同一份血清样本分别进行琼脂扩散试验、玻片凝集试验、微量凝集试验和破碎RA-CH-1全菌的ELISA检测并与本方法进行比较。琼扩试验不能出现沉淀线，故无法判定抗体效价。玻片凝集实验的效价为1:8(如图10)。微量凝集实验的效价为1:32(如图11)。破碎后的全菌ELISA效价为1：6400。利用本实验方法，结果如表20所示，随着RA-CH-1阳性血清稀释度的增加OD450nm值也明显随之下降，当血清稀释倍数为1:10400时，OD450nm值仍大于0.35，当稀释倍数为1:20800时，血清检测结果低于阴性值，因此，用本研究制备的纯化的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白作为抗原最低可检测到的阳性血清稀释倍数为1:10400。

表20敏感性实验结果

实施例5鸭疫里默氏杆菌OmpH截段基因亚单位疫苗的制备

1材料与方法

1.1试验动物分组

将24只1日龄樱桃谷肉鸭(其RA-CH-1抗体凝集试验为阴性)随机分组，实验组8只、阴性对照组8只，商品化疫苗阳性对照组8只。

1.2免疫及攻毒

用实施例2制得的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白纯化产物与弗氏佐剂等体积混合，经乳化后获得鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组基因亚单位疫苗，实验组的免疫程序如表21所示，商品化疫苗阳性对照组按疫苗说明书免疫，阴性对照组注射生理盐水。

所有动物17日龄(于OmpH截段重组基因亚单位疫苗二免后10天)肌肉注射鸭疫里默氏杆菌全菌，注射量为2.5×10⁹CFU/ml，每只注射1ml，观察动物的组织病变及死亡情况。

表21实验组免疫程序

1.3细菌分离鉴定

取死亡的动物的肝脏和脑组织划线TSA于37℃CO₂条件下培养过夜，对长出的菌落

进行PCR鉴定。PCR鉴定引物如下：

上游引物：5'-CGAAAGTGATAAGTTAGCCACCT-3'(SEQIDNO:5)；

下游引物：5'-GCAGCACCTTGAAAATTGTCC-3'(SEQIDNO:6)；

2结果

阴性组鸭子全部死亡，死亡率为100％，实验组存活4只，保护率为50％，商品化疫苗阳性对照组保护率为50％。然后对所有未死亡的动物进行剖解，阳性商品化对照组和实验组的动物均未发现病变，显示正常(如图13)。对死亡组的鸭子进行剖解可看到不同程度的病变(如图12)。对所有死亡组鸭子进行脑部的细菌分离和PCR鉴定，结果(如图14)表明，死亡鸭子均死于鸭疫里默氏杆菌的感染。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

2.权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白，其特征在于其DNA序列如SEQIDNO:2所示。

3.权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：

A、以RA基因组DNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的上、下游引物PCR扩增得到鸭疫里默氏杆菌OmpH截段基因片段，与pMD19-T(simple)连接，得pMD19-OmpHM；

B、用限制性内切酶BamHI和XhoI分别双酶切pMD19-OmpHM质粒和原核表达载体pET32a(+)，进行连接，得重组原核表达质粒pET32a-OmpHM；

C、将步骤B提取的重组质粒pET32a-OmpHM转化到表达宿主菌诱导表达，得鸭疫里默氏杆菌截段重组蛋白粗品。

4.根据权利要求3所述的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的制备方法，其特征在于：将步骤C所得鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白粗品经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化后，用100mM咪唑洗脱，得鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白。

5.根据权利要求3所述的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白的制备方法，其特征在于：步骤C中的宿主菌为菌株BL21(DE3)，在IPTG浓度＝1.2mmol/L，诱导温度为25℃条件下进行诱导表达9小时，得鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白。

6.权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白应用于作为检测鸭疫里默氏杆菌抗体的间接ELISA方法的检测抗原。

7.权利要求1所述的鸭疫里默氏杆菌OmpH截段重组蛋白应用于作为预防鸭疫里默氏杆菌的基因工程亚单位疫苗。