KR20070115580A

KR20070115580A - 클로스트리디움 박테리아를 위한 배지 및 클로스트리디움계독소를 얻기 위한 프로세스

Info

Publication number: KR20070115580A
Application number: KR1020067017946A
Authority: KR
Inventors: 핑 왕; 스테픈 도노반
Original assignee: 알러간, 인코포레이티드
Priority date: 2005-03-03
Filing date: 2005-03-03
Publication date: 2007-12-06
Also published as: US8841110B2; CA2556796C; EP1853622B1; JP5006803B2; IL177468A0; US20120149089A1; IL177467A; IL227909A; JP2012125251A; WO2006096163A1; AU2005327457A1; JP2012041356A; CA2556537A1; US9725705B2; US20210079370A1; DK1853623T3; US20220144887A1; JP5518024B2; IL177467A0; EP1853623A1

Abstract

클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 생성하는 보툴리눔 독소의 배양 및 발효를 위한 동물 산물이 없는(APF) 배지 및 프로세스가 제공된다. 얻어진 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 약제학적 조성물을 조제하거나 조성하는 데 사용될 수 있다. APF 배지는 실질적으로 낮아진 레벨의 고기 또는 낙농 부산물을 포함할 수 있으며, 동물 유래 산물 대신에 비-동물계 산물을 사용할 수 있다. 바람직하게, 사용되는 APF 배지는 동물 유래 산물이 없거나, 실질적으로 없다.

Description

클로스트리디움 박테리아를 위한 배지 및 클로스트리디움계 독소를 얻기 위한 프로세스{MEDIA FOR CLOSTRIDIUM BACTERIUM AND PROCESSES FOR OBTAINING A CLOSTRIDIAL TOXIN}

상호 참조

본 출원은 2003년 9월 25일 출원된 미국 특허출원 번호 10/672,876의 일부계속출원으로, 이 출원의 전체 내용이 본 명세서에 참조로 병합되어 있다.

본 발명은 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 얻기 위한 배지 및 프로세스에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 풍부한 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 얻기 위한, 실질적으로 동물 산물이 없는, 배지, 배양물 및 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아와 같은 미생물의 혐기성 발효 프로세스에 관한 것이다.

치료, 진단, 조사 또는 미용의 목적으로 사람 또는 동물에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물은 활성 성분을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 또한 하나 이상의 부형제, 완충제, 캐리어, 안정화제, 보존제 및/또는 벌크제를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물 중의 활성 성분은 보툴리눔 독소와 같은 생물제제일 수 있다. 보툴리눔 독소 약제학적 조성물을 제조하는 데 사용되는 보툴리눔 독소 활성 성분은 하나 이상의 동물 유래 산물(벌크 보툴리눔 독소를 얻는 데 사용되는 하나 이상의 배양 및 발효 배지 중의 고기 브로스 및 카세인 성분, 및 최종 조성된 보툴리눔 독소 약제학적 조성물 중의 혈액 분획 또는 혈액 유래 부형제와 같은)을 사용하는 다단계(multi step) 배양, 발효 및 조성 프로세스를 통하여 얻을 수 있다. 동물 유래 산물을 사용하는 방법을 통하여 생성된 활성 성분 생물제제를 포함하는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 경우, 환자가 다양한 병원체 또는 감염성 물질을 받아들이게 되는 위험성이 존재한다. 예를 들어, 프리온(prion)이 약제학적 조성물 중에 존재할 수 있다. 프리온은 단백질가수분해효소성 감염 물질로서, 정상적인 단백질을 만드는 동일한 핵산 서열로부터 비정상적인 구조 이형체(abnormal coformational isoform)를 발생시킬 수 있다는 가설이 있다. 또한, 번역후 단계에서 정상적인 이형체가 프리온 단백질 이형체로 되는 "리크루트먼트 반응(recruitment reaction)"시 감염성이 존재한다. 정상적인 내재성 세포 단백질이 병원체성 프리온 구조로 잘못 폴딩되는 것(misfold)을 유도한다는 것이 분명하다.

크로이츠펠트-야콥병은 사람 전염성 해면양 뇌증(transmissable spongiform encephalopathies)의 드문 신경퇴행성 질환으로, 전염성 물질은 프리온 단백질의 비정상적인 이형체임이 분명하다. 크로이츠펠트-야콥병이 있는 개체는 명백히 완전한 건강 상태로부터 6개월 이내에 무동성무언증(akinetic mutism)으로 악화될 수 있다. 그러므로, 동물 유래 산물을 사용하여 얻어지거나, 조성되는 보툴리눔 독소와 같은 생물제제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 경우, 크로이츠펠트-야콥병과 같은, 프리온 매개 질환을 얻게 될 위험성이 존재한다.

보툴리눔 독소

클로스트리디움 속은 127 종 이상이며, 형태 및 기능에 따라 구분된다. 혐기성, 그람 양성 박테리아 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)은 사람 및 동물에서 보툴리즘이라는 신경마비 질환을 일으키는, 강력한 폴리펩티드 신경독인, 보툴리눔 독을 제공한다. 클로스트리디움 보툴리눔의 포자는 토양에서 발견되며, 제대로 살균되지 않고 밀봉된, 집에서 통조림된 식품 용기에서 배양될 수 있어, 이러한 것들이 많은 보툴리즘의 원인이 된다. 보툴리즘 증상은 전형적으로 클로스트리디움 보툴리눔 배양물 또는 포자에 감염된 음식을 먹은 후 18 내지 36시간이 지나서 나타난다. 보툴리눔 독소는 독성이 감소되지 않은 채로 장 내막을 통과하여 말초 운동 뉴런을 공격할 수 있는 것으로 보인다. 보툴리눔 독소 중독의 증상은, 보행장애, 연하장애 및 언어장애, 호흡근육의 마비 및 사망으로 증상이 진행될 수 있다.

보툴리눔 독소 타입 A는 사람에게 알려진 가장 치명적인 천연 생물학제이다. 마우스에서 상업적으로 입수가능한 보툴리눔 독소 타입 A(정제된 신경독 복합체)의 LD₅₀은 약 50 피코그램이다. 몰을 기준으로 할때, 보툴리눔 독소 타입 A는 디프테리아보다 18억배, 시안화 나트륨보다 6억배, 코브로톡신 (cobrotoxin)보다 3천만배, 그리고, 콜레라보다 1천2백만배 더 치명적이다. Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, page 63-84(chapter 4) of Natural Toxins II, edited by B.R.Sigh et al., Plenum Press, New York(1976)(보툴리눔 독소 타입 A의 상기 한 LD₅₀0.3ng이 1U과 동일하다는 것은 약 0.05ng의 BOTOX®가 1유닛이라는 사실에 의해 보정된다). BOTOX

는 캘리포니아 어바인 소재 Allergan, Inc.사에서 상업적으로 입수가능한 정제된 신경독 복합체 보툴리눔 독소 타입 A의 상표명이다. 보툴리눔 독소 1 유닛(U)은, 체중이 각각 18-20g인 암컷 스위스 웹스터 마우스(Swiss Webster mice)에 복강내 주사를 통한 LD₅₀로서 정의할 수 있다. 다른 말로, 보툴리눔 독소 1 유닛은 암컷 스위스 웹스터 마우스 그룹의 50%를 죽일수 있는 보툴리눔 독소의 양이다. 면역학적으로 구별되는 7개의 보툴리눔 신경독은, 타입-특이적인 항체로 중화하여 구별되는 각각 신경독 세로타입(serotype) A, B, C₁, D, E, F 및 G로 특징지워진다. 상이한 세로타입의 보툴리눔 독소는 작용하는 동물 종 및 일으키는 마비의 정도 및 지속시간에 따라 차이가 있다. 예를 들어, 래트에서 발생하는 마비율로 측정할 때, 보툴리눔 독소 타입 A는 보툴리눔 독소 타입 B에 비하여 500배 더 강력한 것으로 측정되었다. 또한, 보툴리눔 독소 타입 B는, 보툴리눔 독소 타입 A 영장류 LD₅₀의 약 12배인 480U/kg을 영장류에 투여할 때도 독성이 없는 것으로 측정되었다. 보툴리눔 독소는 콜린성 운동 뉴런에 강한 친화도를 가지고 결합하고, 뉴런으로 들어가 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것으로 여겨진다.

보툴리눔 독소는 활동항진성 골격근을 특징으로 하는 신경근육 장애의 치료를 위해 임상 세팅에 사용되고 있다. 보툴리눔 독소 타입 A는 미국 식품의약청에 의해서, 12세 이상 환자에 대한 본태성 안검경련, 사시 및 반측안면 경련의 치료에 사용되는 것이 승인되었으며, 경부 디스토니아의 치료 및 미간 (안면) 주름의 처치 에 대해서도 승인되었다. FDA는 경부 디스토니아의 치료에 대하여 보툴리눔 독소 타입 B도 승인하였다. 보툴리눔 독소 타입 A의 말초 주사(예를 들어, 근육내 또는 피하)에 대한 임상 효과는 보통 주사후 일주일 이내에 나타나며, 종종 주사후 몇시간후에 나타나기도 한다. 일회 보툴리눔 독소 타입 A의 근육내 주사에 의한 증상 구제(즉, 이완된 근육 마비)의 전형적인 지속시간은 약 3 개월 내지 약 6개월일 수 있다.

모든 보툴리눔 독소 세로타입들이 신경근 접합부에서 신경전달물질 아세틸콜린의 방출을 억제하는 것이 분명하지만, 이들은 각각 상이한 신경분비 단백질을 공격하거나 및/또는 상이한 부위에서 이들 단백질을 절단한다. 보툴리눔 독소 타입 A는 아연 엔도펩티다아제이며, 세포내, 시냅토솜 관련 단백질 SNAP-25의 펩티드 결합을 특이적으로 가수분해한다. 보툴리눔 타입 E 또한 25 킬로달톤(kD)의 시냅토솜 관련 단백질(SNAP-25)를 절단하지만, 이 단백질 내에서, 보툴리눔 독소 타입 A와는 상이한 아미노산 서열을 대상으로 한다. 보툴리눔 독소 타입 B, C, F 및 G는 소포 관련 단백질(VAMP, 소위 시냅토브레빈이라 칭함)에 작용하며, 각각의 세로타입은 이 단백질의 상이한 부위들을 절단한다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 C₁은 신택신과 SNAP-25를 모두 절단하는 것으로 나타났다. 이러한 작용 메카니즘의 차이점이 다양한 보툴리눔 독소 세로타입 작용의 상대적인 효력 및/또는 지속시간에 영향을 줄 것이다.

세로타입에 관계없이, 독소 중독의 분자적 메카니즘은 유사하며, 적어도 3 단계로 구성되는 것으로 보인다. 이 과정의 첫번째 단계에서는, 중쇄(H 사슬)와 세포 표면 수용체의 특이적인 상호작용에 의해서, 독소가 표적 뉴런의 시냅스전 막에 결합한다; 이 수용체는 보툴리눔 독소 타입 및 파상풍 독소 타입 각각에 따라 다른 것으로 여겨진다. 세포 표면에 대한 독소의 표적화에는 H 사슬의 카르복실 말단 단편, Hc이 중요한 것으로 여겨진다.

두번째 단계에서는, 독소가 중독된 세포의 원형질막을 가로질러 통과한다. 일차로 독소는 수용체-매개 엔도시토시스를 통하여 세포에 의해서 감싸져서, 독소를 포함하는 엔도좀이 형성된다. 그리고 나서, 독소는 엔도좀을 빠져나와 세포의 세포질로 들어간다. 이 단계는 약 pH 5.5 이하에서 독소의 구조 변경을 유발하는 H 사슬의 아미노 말단 단편, H_N에 의해서 매개되는 것으로 여겨진다. 엔도좀은 엔도좀 내부 pH를 감소시키는 양성자 펌프를 가지는 것으로 알려져 있다. 구조적 위치이동으로 인해 독소의 소수성 잔기가 노출되어, 독소가 엔도솜 막으로 둘러싸일 수 있게 된다. 그리고 나서, 독소는 엔도솜 막을 통하여 시토졸로 전위된다 .

보툴리눔 독소 활성화 메카니즘의 마지막 단계는 H 사슬과 L 사슬을 연결하는 디설파이드 결합의 환원을 포함하는 것으로 여겨진다. 보툴리눔 독소의 전체 독성 활성은 완전독(holotoxin)의 L 사슬에 포함되며; L 사슬은 인식, 및 신경전달물질-함유 소포(vesicle)와 원형질 막의 세포질 표면과의 도킹, 및 원형질 막과 소포와의 융합에 꼭 필요한 단백질을 선택적으로 절단하는 아연(Zn++) 엔도펩티다아제이다. 보툴리눔 신경독, 보툴리눔독소 타입 B,D,F 및 G는 시냅토브레빈(또는 소 포-관련 막 단백질(VAMP)라 칭함), 시냅토솜 막 단백질의 분해를 야기한다. 시냅스 소포의 세포질 표면에 존재하는 VAMP은 대부분 이러한 분해작용 중 하나의 결과로 제거된다. 각각의 독소는 상이한 결합을 특이적으로 절단한다.

보툴리눔 독소 단백질 분자의 분자량은, 알려진 보툴리눔 독소 세로타입 7가지 모두에서, 약 150kD이다. 흥미롭게도, 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 보툴리눔 독소는 관련된 비독성 단백질과 함께 150kD 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 복합체로서 방출된다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 900k, 500Dk 및 300kD 형으로 생성될 수 있다. 보툴리눔 독소 타입 B 및 C₁은 500kD 복합체로서만 생성되는 것으로 보인다. 보툴리눔 독소 타입 D는 300kD 및 500kD 복합체로서 생성된다. 마지막으로, 보툴리눔 독소 타입 E 및 F는 약 300kD 복합체로서만 생성된다. 이 복합체들(즉, 분자량이 약 150kD 보다 큰 것)은 비독성 적혈구응집소 단백질 및 비독소 및 비독성 비적혈구응집소 단백질을 포함하는 것으로 여겨진다. 그러므로, 보툴리눔 독소 복합체는 보툴리눔 독소 분자(신경독 성분) 및 하나 이상의 비독성, 적혈구응집소 단백질 및/또는 비 독소, 비 적혈구응집소 단백질(후자는 NTNH 단백질로 칭할 수 있다). 이러한 두가지 비독소 단백질(보툴리눔 독소 분자와 함께 관련 신경독 복합체를 포함하는)은 보툴리눔 독소 분자 변성에 대한 안정성 및 독소가 섭취될 때 소화성 산에 대한 보호를 제공하는 데에 작용할 것이다. 또한, 보툴리눔 독소 복합체가 더 클수록(분자량이 약 150kD 이상), 보툴리눔 독소 복합체가 근육 주사된 부위로부터 보툴리눔 독소가 더 천천히 확산될 것이다. pH 7.3에서 적혈구로 복합체를 처치하거나, 약 pH 7-8의 적합한 완충액 중에서 복합체를 컬럼 크로마토그래피와 같은 분리 프로세스를 거치게 하여, 독소 복합체를 독소 단백질 및 적혈구응집소 단백질로 분해할 수 있다. 보툴리눔독소 단백질은 적혈구응집소 단백질 제거시 현저하게 불안정해진다.

모든 보툴리눔 독소 세로타입이, 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아에 의해서, 프로테아제에 의해 절단 또는 닉킹되어(nicked) 신경활성화되어야만 하는 비활성 단일 사슬 단백질로서 생성된다. 보툴리눔 독소 세로타입 A 및 G를 생성하는 박테리아 균주는 내재성 프로테아제를 지니며, 따라서 세로타입 A 및 G는 박테리아 배양물로부터 주로 활성형으로서 회수될 수 있다. 이와 대조적으로, 보툴리눔 독소 세로타입 C₁, D 및 E는 비단백분해성 균주에 의해 합성되므로, 배양물에서 회수될 때 전형적으로 비활성화된 상태이다. 세로타입 B 및 F는 단백분해성 및 비단백분해성 균주 모두에 의해서 생성되므로, 활성 또는 비활성 형으로 회수될 수 있다. 그러나, 예를 들어, 보툴리눔 독소 타입 B 세로타입을 생성하는 단백분해성 균주는 생성된 독소의 일부만을 절단한다. 닉킹되지 않은 분자에 대한 닉킹된 분자의 정확한 비율은 배양시간 및 배양물의 온도에 따라 다르다. 그러므로, 아마도 알려진대로 보툴리눔 독소 타입 A에 비해 보툴리눔 독소 타입 B은 효력이 상당히 낮기 때문에, 예를 들어, 소정 백분율의 어떤 표본의 보툴리눔 독소 타입 B 독소도 비활성일 것이다. 임상 표본에서 비활성 보툴리눔 독소 분자의 존재는 표본의 총체적인 단백질 부하에 기여할 것이며, 이는 임상적인 효과에는 기여하지 않으면서 항원성의 증가와 연관된다. 또한, 보툴리눔 독소 타입 B는 동일한 투여량에서, 근육내 주사시, 보툴리눔 독소 타입 A보다 활성 지속시간이 짧고, 효력이 떨어진다.

in vitro 연구에서, 보툴리눔 독소가, 뇌간 조직의 일차 세포 배양물로부터 아세틸콜린 및 노르에피네프린의 칼륨 양이온 유도 방출을 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 보툴리눔 독소는 척수 뉴런의 일차 배양물에서 글리신 및 글루타메이트의 유발 방출을 억제하며, 뇌 시냅토솜 표본에서 신경전달물질 아세틸콜린, 도파민, 노르에피네프린, CGRP 및 글루타메이트 각각의 방출을 억제하는 것으로 보고되었다.

다양하게 수정된 공지의 Schantz 프로세스를 사용한 클로스트리디움 보툴리눔의 혐기성 발효에 의해, 약제학적 조성물의 제조를 위한 보툴리눔 독소를 얻을 수 있다(예를 들어, Schantz E.J., et al., Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev 1992 Mar;56(1):80-99; Schantz E.J., et al. preperation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment, chapter 3 in Jankovic J., ed. Neurological Disease and Theraphy. Theraphy with botulinum toxin(1994), New York, Marcel Dekker;1994, pages 41-49, and; Schantz E.J., et al., Use of crystalline type A botulinum toxin in medical research, in:Lewis GE Jr, ed. Biomedical Aspects of Botulism(1981) New York, Academic Press, pages 143-50 참조).

보툴리눔 독소(150kD 분자) 및 보툴리눔 독소 복합체(300kDa 내지 900 kDa)를, 예를 들어, List Biological Laborotories, Inc., Campbell, Califonia; the Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, U.K.; Wako(Osaka, Japan) 및 Sigma Chemicals of St Louis, Missouri로부터 입수할 수 있다. 상업적으로 입수가능한 보툴리눔 독소 함유 약제학적 조성물로는 사용전에 0.9% 염화나트륨으로 재구성하는, 동결건조 분말 형태의 100 유닛 바이알로 된, Allergan, Inc., Irvine, califonia으로부터 입수가능한 BOTOX®(사람 혈청 알부민 및 염화나트륨이 있는 보툴리눔 독소 타입 A 신경독 복합체), 사용전에 0.9% 염화나트륨으로 재구성하는 분말형태인, lpsen Limited, Berkshire, U.K.로부터 입수가능한 Dysport®(사람 혈청 알부민 및 락토오즈가 있는 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A 독소 헤마글루티닌 복합체 제제) 및 MyoBloc™(보툴리눔 독소 타입 B, 사람 혈청 알부민, 소디움 숙시네이트 및 염화 나트륨을 약 pH 5.6으로 포함하는 주사액으로서, San Diego, Califonia의 Solstice Neurosciences로부터 입수가능(이전에는 Elan Corporation, Dublin, Ireland로부터 입수가능))가 포함된다.

보툴리눔 독소 타입 A가 다양한 임상 조건을 처치하는데 성공함에 따라 다른 보툴리눔 독소 세로타입도 관심을 끌었다. 따라서, 적어도 보툴리눔 독소 타입 A, B, E 및 F를 사람을 처치하는 데 사용임상적으로 사용하게 되었다. 또한, 순수한 보툴리눔 독소(약 150kDa)를 사람을 처치하는 데 사용하였다. 예를 들어, KOHL A., et al., Comparison of the effect of botulinum toxin A (Botox (R)) with the highly-purified neurotoxin (NT201) in the extensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000; 15 (Suppl 3): 165 참조. 한편, 보툴리눔 독소 복합체를 사용하는 것과 대조적로, 순수한 보툴리눔 독소(약 150kDa)를 사용하여 약제학적 조성물을 제조할 수 있다.

타입 A 보툴리눔 독소는 pH 4-6.8의 묽은 수용액에 용해되는 것으로 알려져 있다. 약 7 이상의 pH에서는 비독성 안정화 단백질이 신경독으로부터 분리되어, 그 결과 독성이 점차 소실되며, 특히 pH 및 온도가 상승할 때 그러하다. SCHANTZ E.J., et al. PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF botulinum toxin type A for human treatment (in particular pages 44-45), being CHAPTER 3 OF JANKOVIC, J., et al, THERAPY WITH BOTULINUM TOXIN, MARCEL DEKKER, Inc (1994) 참조.

일반적으로 효소에서 그렇듯이, 보툴리눔 독소들(이들은 세포내 펩티다아제임)의 생물학적 활성은, 적어도 일부분, 그들의 3차원적 구조에 따라 달라진다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A는 열, 다양한 화학물질, 표면 긁힘 및 표면 건조에 의해서 독성이 제거될 수 있다. 또한, 공지의 배양, 발효 및 정제에 의해 얻어진 독소 복합체를 아주 아주 낮은 독소 농도로 희석하여 약제학적 조성물 제제에 사용하는 경우, 적합한 안정화제가 없으면, 독소의 독성이 빠르게 제거된다는 것이 공지되어 있다. 대량으로 희석하면 특이적 독성이 빠르게 손실되기 때문에, 수 밀리그램 양의 독소를 밀리리터당 수 나노그램을 함유하는 용액으로 희석하는 것은 상당히 어렵다. 독소를 함유하는 약제학적 조성물을 제조한 후, 수개월 또는 수년동안 사용할 수 있기 때문에, 독소는 알부민 및 젤라틴과 같은 안정화제를 사용하여 안정화하여야만 한다.

하기와 같이, 다양한 임상 세팅에서 보툴리눔 독소를 사용하는 것이 보고되었다:

(1) 여러 근육부위에 1회 근육내 주사당 약 75-125 유닛의 BOTOX®를 사용하여, 경부 디스토니아(cervical dystonia)를 처치;

(2) 1회 근육내 주사당 5-10 유닛의 BOTOX®를 사용하여, 미간 주름(이마 주름)을 처치(5 유닛을 비근근에 근육내 주사하고, 10 유닛을 각각의 추미근에 근육내 주사)

(3) 치골직장근에 약 30-80 유닛의 BOTOX®를 괄약근내 주사하여 변비를 처치

(4) 윗눈꺼풀의 측면연골전 안윤근 및 아래 눈꺼풀의 측면연골전 안윤근에, 근육당 약 1-5 유닛의 BOTOX®를 근육내 주사하여 안검경련을 처치

(5) 외안근에 약 1-5 유닛의 BOTOX®를 근육내 주사하여 사시를 치료, 주사량은 주사하는 근육의 크기 및 원하는 근육마비 정도(즉, 원하는 디옵터 교정 정도)에 따라 달라짐.

(6) 하기와 같이, 상이한 5부위의 상지 굴근에 BOTOX®를 근육내 주사하여 졸중 후의 상지 경련을 처치

(a) 심지굴근 : 7.5 U 내지 30 U

(b) 천지굴근 : 7.5 U 내지 30 U

(c) 척측수근굴근 : 10 U 내지 40 U

(d) 요측수근굴근 : 15 U 내지 60 U

(e) 상완이두근 : 50 U 내지 200 U

한번에 각각 상기한 5가지 근육에 주사하여, 각 처치 때마다 환자의 상지 굴근에 90 U 내지 360 U의 BOTOX®를 근육내 주사.

(7) 25 U의 BOTOX®를 두부 주위에 주사(미간, 전두근 및 측두근에 대칭적으로 주사)하여 편두통을 처치

25 U을 주사한 후 3개월간 편두통의 발생빈도, 최대강도, 수반되는 구토 및 급성의 약물사용의 감소정도로 측정할 때, 편두통의 예방처치로서 비히클에 견줄만한 상당한 장점을 제공함.

보툴리눔 독소 타입 A는 12 개월 이상 효능을 지속할 수 있으며(European J. Neurology 6 (Supp 4): S111-S1150 : 1999), 어떤 상황에서는 27 개월동안 지속될 수 있다. The Laryngoscope 109: 1344-1346: 1999 참조. 그러나, BOTOX®의 근육내 주사의 일반적인 지속시간은 전형적으로 약 3 내지 4개월이다.

상업적으로 입수가능한 보툴리눔 독소 함유 약제학적 조성물이 BOTOX®(Allergan, Inc., of Irvine, Califonia으로부터 입수가능)라는 상표로 시중에 유통되고 있다. BOTOX®는 정제된 보툴리눔 독소 타입 A 복합체, 사람 혈청 알부민 및 염화나트륨으로 구성되며, 살균, 진공건조 형태로 포장되어 있다. 보툴리눔 독소 타입 A는, N-Z 아민 및 효모 추출물을 함유하는 배지에서 배양된 클로스트리디움 보툴리눔 홀 종(Hall strain)의 배양물로부터 제조한다. 배양물 용액으로부터 일련의 산 침전을 통하여, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체를 활성 고분자량 독소 단백질 및 관련 적혈구응집소 단백질로 구성되는 결정형 복합체로 정제한다. 결정 형 복합체를 염수 및 알부민을 포함하는 용액에 재-용해하고, 살균 여과(0.2미크론)한 후, 진공건조한다. 근육내 주사 전에, BOTOX®는 살균된, 방부제없는 염수로 재구성(reconstitute)될 수 있다. 각각의 BOTOX® 바이알은 방부제없는, 살균된, 진공-건조 형태로서, 약 100 유닛(U)의 클로스트리디움 보툴리눔 독소 타입 A 정제된 신경독 복합체, 0.5 밀리그램의 사람 혈청 알부민 및 0.9 밀리그램의 염화나트륨을 함유한다.

진공-건조된 BOTOX®를 재구성하기 위해서, 방부제없는, 살균된 일반 염수; (0.9% 염화 나트륨 주사액)을 사용하여, 적정량의 희석제를 알맞은 크기의 주사기에 넣는다. BOTOX®는 거품내기 또는 유사한 격렬한 교반에 의해서 변성되므로, 희석제는 서서히 바이알에 주입한다. 재구성된 BOTOX®는 냉장고(2 내지 8℃)에 보관하며, 재구성된 BOTOX®는 투명하고, 무색인 액체로, 입자 물질이 없다. 재구성된 BOTOX®는 30일까지 효능을 유지하는 것으로 보고되었다. Guttman C., Botox retains its efficiacy for blepharospasm treatment after freezing and storage, New York investigators find, Euro Times 2000 Noc/Dec;5(8):16 참조. 진공건조된 제품은 냉동고에서 -5℃이하로 보관한다.

일반적으로, 4가지 생리학적 그룹의 클로스트리디움 보툴리눔이 알려져 있다(I, II, III 및 IV). 혈청학적으로 구분되는 독소를 생성할 수 있는 미생물들이 하나 이상의 생리학적 그룹에서 나올 수 있다. 예를 들어, 타입 B 및 F 독소는 그룹 I 또는 II의 계통에 의해서 생성될 수 있다. 또한, 보툴리눔 신경독을 생성할 수 있는 다른 계통의 클로스트리디움계 종(C. baratii, F 타입; C.buturicum, E 타 입; C. novyi, C₁ 또는 D 타입)이 확인되었다.

클로스트리디움 보툴리눔 타입들의 생리학적 그룹을 하기 표 1에 열거하였다.

클로스트리디움 보툴리눔의 생리학적 그룹
그룹	독소 세로타입	생화학	젖 소화물	글루코오스 발효	리파아제	파지 및 플라스미드	표현형 관련 클로스트리디움 (비독성)
I	A, B, F	단백가수분해성 당분해성	+	+	+	+	C.sporogenes
II	B, E, F	비단백가수분해성 당분해성 향정신성	-	+	+	+
III	C, D	비단백가수분해성 당분해성	+ _	+	+	+	C. novyi
IV	G	단백가수분해성 비당분해성	+	-	-	-	C. subterminale

적합한 생리학적 그룹의 클로스트리디움 보툴리눔 미생물을 선택하여 이러한 독소 타입들을 생성할 수 있다. 그룹 I의 미생물들은 보통 단백가수분해성으로 칭해지며, 타입 A, B 및 F의 보툴리눔 독소들을 생성한다. 그룹 II의 미생물들은 당분해성으로, 타입 B, E 및 F의 보툴리눔 독소들을 생성한다. 그룹 III의 미생물들은 보툴리눔 독소 타입 C 및 D만을 생성하며, 상당량의 프로피온산을 생성한다는 점에서 그룹 I 및 II의 미생물들과는 구분된다. 그룹 IV 미생물들은 타입 G의 신경독만을 생성한다.

실질적으로 동물 산물이 없는 특이적인 배지를 사용하여 파상풍 독소를 얻는 것이 알려져 있다. 미국 특허 6,558,926 참조. 그러나, 이 특허에 기재된 "동물 산물이 없는" 배지조차도 박토-펩톤(Bacto-peptone), 고기 소화물(meat digest)을 사용한다. 특히, 클로스트리디움 테타니에 의한 파상풍 독소의 생성과 클로스트리디움 보툴리눔에 의한 보툴리눔 독소의 생성은 그에 따른 성장, 배지 및 발효 파라미터 및 고려사항이 상이하다. Johnson, E.A., et al., Clostridium botulinum and its neurotoxins: a metabolic and cellular perspective, Toxicon 39(2001), 1703-1722 참조.

생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 얻거나 생성하기 위한, 동물 유래 단백질과 같은 동물 산물이 없거나 실질적으로 없는 배지 및 프로세스가 필요하다.

개요

본 발명은 이러한 요구를 충족하여, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 얻기 위한, 동물 유래 단백질과 같은 동물 산물이 없거나 실질적으로 없는 배지 및 프로세스를 제공한다. 얻어진 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 활성 성분 약제학적 조성물을 제조하는 데 사용할 수 있다.

정의

본 명세서에서, 하기에 기재된 용어들은 다음의 정의를 가진다.

"약"은, 정량된 아이템, 파라미터 또는 기간의 수치가, 그 아이템, 파라미터 또는 기간의 ±10%의 범위를 포함한다는 것을 의미한다.

"투여" 또는 "투여하다"는 대상에 약제학적 조성물을 주는(즉, 투여하는) 과정을 의미한다. 여기서 언급한 약제학적 조성물은 예를 들어, 근육내(i.m.), 피부내, 피부하 투여, 척수강내 투여, 두개내, 복강내(i.p.) 투여, 국소(경피) 및 임플란트(즉, 폴리머 임플란트 또는 미니삼투압 펌프와 같은 서방형 장치) 투여경로에 의해서 "국부적으로 투여된다".

"동물 산물이 없는" 또는 "실질적으로 동물 산물이 없는"은 각각 "동물 단백질이 없는" 또는 "실질적으로 동물 단백질이 없는"의 의미를 포함하며, 혈액 유래, 혈액 풀드(blood pooled) 및 다른 동물 유래 산물들 또는 화합물들이 없거나 실질적으로 없다는 것을 의미한다. "동물"은 포유류(사람과 같은), 조류, 파충류, 어류, 곤충, 거미 또는 다른 동물종들을 의미한다. "동물"은 박테리아와 같은 미생물은 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 범주에 드는 동물 산물이 없는 배지 또는 방법 또는 실질적으로 동물 산물이 없는 배지 또는 방법은 보툴리눔 독소 또는 클로스트리디움계 보툴리눔 박테리아를 포함할 수 있다. 예를 들어, 동물 산물이 없는 방법 또는 실질적으로 동물 산물이 없는 방법은, 면역글로불린, 고기 소화물, 고기 부산물 및 젖 또는 낙농 산물 또는 소화물과 같은 동물 유래 단백질이 실질적으로 없거나 본질적으로 없거나 완전히 없는 방법을 의미한다. 따라서, 동물 산물이 없는 방법의 예로는 고기 및 낙농 산물 또는 고기 또는 낙농 부산물을 배제한 방법(박테리아 배양 또는 박테리아 발효 방법과 같은)이 있다.

"보툴리눔 독소"는 클로스트리디움 보툴리눔에 의해서 생성된 신경독뿐아니라, 변형, 재조합, 하이브리드 및 키메라 보툴리눔 독소를 의미한다. 재조합 보툴리눔 독소는 비-클로스트리디움계 종에 의해서 재조합적으로 제조된 그의 경쇄 및/또는 중쇄를 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, "보툴리눔 독소"라는 용어는 보툴리눔 독소 세로타입 A, B, C, D, E, F 및 G를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, 보툴리눔 독소는 또한 보툴리눔 독소 복합체(즉, 300, 600 및 900kDa 복합체) 뿐아니라 순수한 보툴리눔 독소(즉, 약 150kDa 신경독 분자)를 모두 포함하며, 이들 모두가 본 발명의 실시에 유용하다. "정제된 보툴리눔 독소"는 배양 또는 발효 프로세스로부터 보툴리눔 독소를 얻을 때 따라올 수 있는 다른 단백질 및 불순물로부터 분리된, 또는 실질적으로 분리된, 순수한 보툴리눔 독소 또는 보툴리눔 독소 복합체를 의미한다. 즉, 정제된 보툴리눔 독소는 적어도 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 비-보툴리눔 독소 단백질 및 불순물이 제거될 수 있다. 보툴리눔 C₂및 C₃ 사이토톡신은, 신경독이 아니며, 본 발명의 범주에서 배제된다.

"클로스트리디움계 신경독"은, 클로스트리디움 보툴리눔, 클로스트리디움 부티리쿰 또는 클로스트리디움 베라티와 같은 클로스트리디움계 박테리아로부터 생성된, 또는 천연의 신경독뿐아니라, 비-클로스트리디움계 종에 의해서 재조합적으로 제조된 클로스트리디움계 신경독을 의미한다.

"완전히 없는"(즉, "구성되는"이라는 용어)은 사용되는 장비 또는 프로세스의 검출 범위 내에서, 물질이 검출될 수 없거나, 그 존재가 확인될 수 없다는 것을 의미한다.

"본질적으로 없는"(또는 "본질적으로 구성되는")은 단지 흔적량의 물질만 검출될 수 있다는 것을 의미한다.

"변형 신경독"은 천연 보툴리눔 독소와 비교할 때, 그 아미노산의 적어도 하나가 삭제, 변형 또는 치환된 보툴리눔 독소를 의미한다. 또한, 변형 보툴리눔 독소는 재조합적으로 생성된 신경독, 또는 재조합적으로 생성된 신경독의 유도체 또는 단편일 수 있다. 변형 보툴리눔 독소는, 보툴리눔 독소 수용체에 결합하는 능력 또는 뉴런으로부터 신경전달물질 방출을 억제하는 능력과 같은, 천연 보툴리눔 독소의 생물학적 활성중 적어도 하나를 유지한다. 변형 보툴리눔 독소의 일례로는 하나의 보툴리눔 독소 세로타입(세로타입 A와 같은)으로부터의 경쇄, 및 이와 상이한 보툴리눔 독소 세로타입(세로타입 B와 같은)으로부터의 중쇄를 가지는 보툴리눔 독소가 있다. 변형 보툴리눔 독소의 또다른 예로는, 물질 P(substance P)와 같은, 신경전달물질과 커플링된 보툴리눔 독소가 있다.

"환자"는 의학 또는 수의학적 케어를 받는 사람 또는 비-사람 실험대상을 의미한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 조성물들을 포유류와 같은 어떤 동물을 처치하는 데 사용할 수 있다.

"약제학적 조성물"은 활성 성분이 보툴리눔 독소일 수 있는 제제를 의미한다. "제제(formulation)"라는 용어는 약제학적 조성물 중에 신경독 활성 성분 외에 적어도 하나의 추가적인 성분(알부민 및/또는 염화나트륨과 같은)이 있다는 것을 의미한다. 따라서, 약제학적 조성물은, 사람 환자와 같은 대상에, 진단, 치료 또는 미용을 위해 투여(즉, 근육내 또는 피하 주사에 의해서, 또는 저장소 또는 임플란트의 삽입에 의해서)하기에 적합한 제제이다. 약제학적 조성물은: 동결건조 또는 진공건조된 상태; 동결건조 또는 진공건조된 약제학적 조성물을 염수 또는 물로 재구성한 후의 용액; 또는 재구성이 필요없는 용액일 수 있다. 활성 성분은 보툴리눔 독소 세로타입 A, B, C₁, D, E, F 및 G 중 하나 또는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서 천연적으로 만들어질 수 있는 모든 보툴리눔 독소일 수 있다. 상기한 바와 같이, 약제학적 조성물은 액체 또는 고체일 수 있으며, 예를 들어, 진공건조될 수 있다. 약제학적 조성물의 구성 성분들이 단일 조성물 중에 포함될 수 있으며(즉, 필요한 재구성 유액을 제외한 모든 구성성분이 약제학적 조성물의 최종 조성시에 존재함), 또는 2-성분 시스템, 예를 들어, 약제학적 조성물의 최초 조성시에는 존재하지 않는 성분을 포함하는, 염수와 같은 희석액으로 재구성되는 진공건조된 조성물로서 포함될 수 있다. 2-성분 시스템(two-component system)은 2-성분 시스템의 제 1 성분과 함께 장기간 저장하기 쉽지 않은 성분들의 병합을 가능하게 하는 이점을 제공한다. 예를 들어, 재구성 비히클 또는 희석액은 사용기간 동안, 예를 들어, 1주일간의 냉장 저장시 미생물 성장으로부터 충분한 보호를 제공할 수 있는 보존제를 포함할 수 있으며, 보존제는 독소가 변성될 수 있는 기간인 2년의 냉동 저장 기간 동안에는 존재하지 않는다. 장기저장시 클로스트리디움 독소 또는 다른 성분들과 함께 존재할 수 없는 다른 성분들을 이러한 방법으로 병합할 수 있다; 즉, 사용할 시점 근처에 제 2 비히클(즉, 재구성 유액 중에)에 가하는 것이다. 보툴리눔 독소 활성 성분 약제학적 조성물을 조제하는 방법이 미국 특허 2003 0118598 A1 중에 기재되어 있다.

"실질적으로 없는"은 약제학적 조성물의 1 중량% 이하의 레벨로 존재하는 것을 의미한다.

"치료학적 제제"는 말초 근육의 과다활동(즉, 경련)을 특징으로 하는 장애 또는 질환과 같은, 장애 또는 질환을 처치하여 완화시키는 데 사용할 수 있는 제제를 의미한다.

본 발명은 적어도 감소된 레벨의 동물 또는 낙농 부산물을 포함하는, 바람직하게는 동물 또는 낙농 부산물이 실질적으로 없는 배지를 제공한다. "동물 또는 낙농 부산물"은 in vivo 또는 in vitro 에서, 동물(박테리아 제외) 세포 중의 또는 그에 의해서 제조된 화합물 또는 화합물들의 조합을 의미한다. 단백질, 아미노산, 및 질소와 같은 배지 성분의 바람직한 비-동물 공급원(source)으로는 식물, 미생물(효모와 같은) 및 합성 화합물을 포함한다.

또한, 본 발명은 동물 또는 낙농 부산물이 실질적으로 없는 배지를 적어도 하나 사용하여 보툴리눔 독소를 얻는 방법을 제공한다. 예를 들어, 동물 산물이 실질적으로 없는 발효 배지 중에서 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하여 보툴리눔 독소를 얻을 수 있다.

본 발명은 또한 동물 산물이 실질적으로 없고 식물 유래 산물을 포함하는 발효 배지 중에서 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하여 얻은 보툴리눔 독소를 포함한다. 또한, 동물 산물이 실질적으로 없고 몇가지 콩에 기초한 산물을 포함하는 발효 배지 중에서 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하여 보툴리눔 독소를 얻을 수 있다.

또다른 바람직한 실시형태에서, 동물 산물이 실질적으로 없고, 동물 유래 산물의 대체품으로서 가수분해된 콩을 포함하는 발효 배지 중에서 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하여 보툴리눔 독소를 얻을 수 있다. 바람직하게, 발효 배지 중의 성장은 적어도 세포 용해가 일어날 때까지 지속된다. 발효 배지의 접종에 사용되는 클로스트리디움 보툴리눔의 공급원은 클로스트리디움 보툴리눔을 포함하는 시드 배지(seed medium)로부터 얻을 수 있다. 바람직하게, 시드 배지 중에서 성장되어 발효 배지의 접종물로서 사용되는 클로스트리디움 보툴리눔은 급격한 증가 단계(exponential growth phase)에 있는 것이다. 시드 배지의 접종에 사용되는 클로스트리디움 보툴리눔의 공급원은 동결건조 배양물로부터 얻을 수 있다. 클로스트리디움 보툴리눔은 동물 젖 또는 두유 중의 배양물로서 동결건조될 수 있다. 바람직하게, 클로스트리디움 보툴리눔은 두유 중의 배양물로서 동결건조될 수 있다.

본 발명은 또한 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하기 위한 동물-유래 산물이 실질적으로 없는 배지를 포함하는 조성물을 제공한다.

일 실시형태에서, 조성물은, 비-동물 공급원으로부터 유래한 적어도 하나의 산물을 포함하고, 또한 클로스트리디움 보툴리눔을 포함하지만, 동물-유래 산물이 실질적으로 없는 배지를 포함한다.

또다른 실시형태에서, 본 조성물은, 식물로부터 유래한 적어도 하나의 산물을 포함하고, 또한 클로스트리디움 보툴리눔을 포함하지만, 동물-유래 산물이 실질적으로 없는 배지를 포함한다. 본 발명의 또다른 실시형태는 대두로부터 유래한 적어도 하나의 산물을 포함하고, 또한 클로스트리디움 보툴리눔을 포함하지만, 동물-유래 산물이 실질적으로 없는 배지를 포함하여 구성되는 조성물일 수 있다.

본 발명은: (1) 발효배지를 제공하는 단계(발효배지는 적어도 동물 유래 산물이 실질적으로 없으며, 약 4-8 중량%의 콩 유도체(soy derivative)를 포함한다); (2) 상기 발효 배지에서 보툴리눔 독소를 생성할 수 있는 조건하에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시키는 단계; (3) 발효 배지로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 회수하는 단계에 의해서, 생물학적으로 활성인 클로스트리디움계 독소(APF 배지의 보툴리눔 신경독과 같은)를 얻기 위한 방법을 포함한다. 이러한 방법에서, 발효 배지는 또한 약 0-3 중량%의 효모 추출물 및 약 0.5 내지 5 중량%의 글루코오스를 포함할 수 있다. 바람직하게, 발효 배지는 약 1-2 중량%의 글루코오스를 포함한다. 발효 단계는 약 5.0 내지 5.5 사이의 pH에서, 약 45시간 내지 약 75시간 동안, 약 33 내지 36℃ 사이의 온도에서, 혐기성 대기에서 실시될 수 있다.

생물학적으로 활성인 클로스트리디움 독소를 얻기 위한 방법은 (a) 동물 유래 산물이 실질적으로 없으며, 약 4-8 중량%의 콩 유도체를 포함하는 배양 배지를 얻는 단계, 및 (b) 상기 배양 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 배양하는 단계의 2가지 단계를 (발효 배지를 제공하는 상기 단계 (1) 전에) 더욱 포함할 수 있다.

특히, 이러한 방법에서, 발효배지로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 회수하는 단계 (3)은 APF 정제 프로세스이거나, 이를 포함할 수 있다.

생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 얻는 본 방법의 상세한 실시형태는

(a) 동물 유래 산물이 실질적으로 없으며 약 4-8 중량%의 콩 유도체를 포함하는 배양 배지를 얻고 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 그 배양 배지 내에서 배양하는 단계;

(b) (i) 약 4-8 중량%의 콩 유도체,

(ii) 약 0-3 중량%의 효모 추출물,

(iii) 약 1-2 중량%의 글루코오스를 포함하며, 동물 유래 산물이 실질적으로 없는 발효 배지를 제공하는 단계;

(c) (i) 약 5.0 내지 5.5의 pH에서 발효단계를 실시하고,

(ii) 약 45 시간 내지 75시간 동안 발효단계를 실시하고,

(iii) 약 33 내지 36℃의 온도에서 발효단계를 실시하고,

(iv) 혐기성 대기에서 발효단계를 실시하는 것을 포함하는 보툴리눔 독소의 생성이 가능한 조건 하에, 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 상기 발효 배지 중에서 발효시키는 단계; 및

(d) 상기 발효 배지로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 회수하는, APF 정제 프로세스의 회수단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 보툴리눔 독소를 배양하거나 발효시키기 위한 배지로서, 동물 산물이 실질적으로 없고 식물에서 유래한 단백질 산물을 포함하는 배지를 포함한다. 상기 배지는 약 4-8 중량%의 콩 유도체, 약 0-3 중량%의 효모 추출물 및 약 1-2 중량%의 글루코오스를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 동물 산물이 실질적으로 없는, 활성 성분이 보툴리눔 독소인 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 포함하며, 상기 방법은

(a) (i) 동물 유래 산물이 실질적으로 없는 발효 배지를 제공하고;

(ii) 보툴리눔 독소를 생성할 수 있는 조건 하에 상기 발효 배지중에 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하고;

(iii) 상기 발효 배지로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 회수하여생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 얻는 단계; 및

(b) 적합한 부형제와 함께 보툴리눔 독소를 조성하여, 동물 유래 산물이 실질적으로 없으며 활성성분이 보툴리눔 독소인 약제학적 조성물을 제조하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 (a) 동물 유래 산물이 실질적으로 없으며 약 4-8 중량%의 콩 유도체를 포함하는 발효 배지를 제공하는 단계; (b) pH 5.0 내지 5.5의 pH에서 상기 발효배지를 유지하여 상기 발효배지 중에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시키는 단계; 및 (c) 상기 발효배지로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 회수하는 단계에 의한, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 얻기 위한 방법을 포함한다.

마지막으로, 본 발명은 또한 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아 독소를 배양 및/또는 발효시키기 위한 동물 단백질이 없는 배지를 포함한다. 바람직하게, 상기 배지는 동물 유래 산물이 실질적으로 없으며 약 4-8 중량%의 콩 유도체; 약 0-3 중량%의 효모 추출물, 및; 약 1-2 중량%의 글루코오스를 포함한다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 미생물(클로스트리디움 보툴리눔 박테리아와 같은)의 배양 및 발효에 사용되는 동물 산물 또는 동물 부산물이 없거나 실질적으로 없이도 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 생산할 수 있는 배지 및 프로세스를 알아낸 것에 기초한다. 얻어진 보툴리눔 독소는 보툴리눔 독소 활성 성분 약제학적 조성물을 제조하는 데 사용할 수 있다. 즉, 본 명세서에서는 상당히 감소된 레벨의 고기 또는낙농 부산물을 가지는 성장 배지를 개시하며, 바람직한 배지 실시형태는 실질적으로 이러한 동물 산물이 없다.

본 발명은 놀랍게도 동물-류 산물이 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위한 배지에 필요하지 않다는 것을 알아낸 것, 특히, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위해 이러한 배지에 전형적으로 사용되는 동물에 기초한 산물을 식물에 기초한 산물로 대체할 수 있다는 것을 알아낸 것을 포함한다.

박테리아의 성장 및 발효를 위해 현재 사용되는 배지는 보통 하나 이상의 동물 유래 성분을 포함한다. 본 발명에 따르면, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위한 바람직한 배지는 총 배지 중량의 약 5 내지 약 10% 이하로 동물 유래 산물을 포함한다. 더욱 바람직하게, 본 발명의 범주에 속하는 배지는 총 배지 중량의 약 1 내지 약 5% 이하로 동물 유래 산물을 포함한다. 가장 바람직하게, 보툴리눔 독소의 생성을 위한 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위해 사용되는 모든 배지 및 배양물은 동물 유래 산물이 전혀 없다. 이러한 배지는 클로스트리디움 보툴리눔의 소량 또는 대량 발효를 위한 배지, 시드(1차) 배지 및 발효(2차) 배지를 접종하는 데 사용되는 클로스트리디움 보툴리눔의 성장 및 배양을 위한 배지뿐아니라 클로스트리디움 보툴리눔 배양물의 장기간 저장을 위해 사용되는 배지(예를 들어, 모 배양물)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 특정한 바람직한 실시형태에서, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장 및 보툴리눔 독소의 생성을 위한 배지는 동물에 기초한 산물을 대체하는 콩에 기초한 산물을 포함할 수 있다. 이와 달리, 콩에 기초한 산물 대신에, 쓴맛을 제거한 루피너스 캄페스트리스(Lupinus campestris)의 씨를 사용할 수 있다. 루피너스 캄페스트리스 씨의 단백질 성분은 콩의 단백질 성분과 매우 유사한 것으로 알려져 있다. 바람직하게, 이러한 배지는 가수분해되어 물에 용해가능한 콩 또는 루피너스 캄페스트리스 유래 산물을 포함한다. 그러나, 비용해성 콩 또는 루피너스 캄페스트리스 산물을 또한 본 발명에서 동물 산물을 대체하여 사용할 수 있다. 콩 또는 루피너스 캄페스트리스에 의해서 대체될 수 있는 일반적인 동물 유래 산물로는 비프 하트 인퓨젼(BHI), 박토-펩톤과 같은 동물 유래 펩톤 산물, 가수분해된 카세인, 및 동물의 젖과 같은 낙농 부산물이 포함된다.

바람직하게, 콩에 기초한 또는 루피너스 캄페스트리스에 기초한 산물을 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위한 배지는, 실질적으로 모든 동물-유래 산물이 식물-유래 산물로 대체되는 것을 제외하고는, 보통 사용되는 동물 산물을 포함한 배지와 유사하다. 예를 들어, 콩에 기초한 발효 배지는 콩에 기초한 산물, 글루코오스와 같은 탄소원, NaCl 및 KCl과 같은 염, Na₂HP0₄, KH₂P0₄와 같은 인산염-함유 성분, 철 및 마그네슘과 같은 2가 양이온, 철분말, 및 L-시스테인 및 L-티로신과 같은 아미노산을 포함하여 구성될 수 있다. 발효(2차) 배지의 접종을 위해 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물을 성장시키는 데 사용되는 배지(즉, 시드 또는 1차 배지)는 적어도 콩에 기초한 산물, NaCl과 같은 염의 공급원, 및 글루코오스와 같은 탄소원을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명은 동물-유래 산물이 실질적으로 없는 배지를 사용하여, 보툴리눔 독소의 생성을 최대화시키는 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위한 방법을 제공한다. 동물 부산물로부터 유래한 성분을 대체하는 콩 부산물을 포함하는 배지에서 발효시켜, 보툴리눔 독소의 생성을 위해 클로스트리디움 보툴리눔을 성장시킬 수 있다. 발효 배지를 위한 접종물은 유사한 스케일의 성장 배지(시드 배지)로부터 유래한 것일 수 있다. 발효 단계의 크기 및 부피에 따라, 배양물의 바이오매스(biomass)를 증가시키기 위해 시드 배지(seed medium)에서 연속되는 성장의 횟수는 다양하다. 발효 배지에 접종하기에 적합한 양의 클로스트리디움 보툴리눔을 성장시키기 위하여, 시드 배지에서의 성장을 포함하는 1단계 또는 다중 단계가 실시될 수 있다. 동물 유래 산물이 없는 클로스트리디움 보툴리눔 성장 방법에서, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장은 비-동물 유래 배지에서 보관된 배양물로부터 유래하는 것이 바람직하다. 저장된 배양물, 바람직하게는 동결건조된 배양물은 콩으로부터 유래하며 동물 부산물이 없는 단백질을 포함하는 배지에서 성장되어 제공된다. 저장된, 동결건조된 배양물로부터 직접 접종에 의해서 발효 배지의 클로스트리디움 보툴리눔이 성장된다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장은 2단계-시드 성장 및 발효로 진행된다. 이 두가지 단계 모두 혐기성 환경에서 진행된다. 시드 성장 단계는 일반적으로 저장된 배양물로부터 미생물의 양을 "스케일-업(scale-up)"하는 데 사용된다. 시드 성장 단계의 목적은 발효에 사용할 수 있는 미생물의 양을 증가시키는 것이다. 또한, 시드 성장 단계는 저장된 배양물 내의 상대적으로 휴지상태인 미생물이 원기를 회복하여 활발히 성장하는 배양물로 성장하도록 해준다. 또한, 발효 배지를 접종하는 데 사용되는 생육가능한 미생물의 부피 및 양은, 저장된 배양물에서 보다 활발히 성장하는 배양물에서 더욱 정밀하게 제어될 수 있다. 따라서, 발효 배지에 접종하기 위한 시드 배양물의 성장이 바람직하다. 또한, 발효 배지에 접종하기 위한 클로스트리디움 보툴리눔 양을 스케일-업 하는 시드 배지에서의 성장을 포함하는 연속되는 몇번의 단계들을 사용할 수 있다. 특히, 발효 단계에서의 클로스트리디움 보툴리눔의 성장은 직접 접종에 의해 저장된 배지로부터 직접 실시될 수 있다.

발효 단계에서, 시드 성장물로부터 클로스트리디움 보툴리눔을 포함하는 시드 배지의 일부분 또는 시드 배지 전체를 발효 배지를 접종하는 데 사용할 수 있다. 바람직하게, 시드 성장 단계로부터 클로스트리디움 보툴리눔을 가지는 시드 배지의 약 2-4%를 발효 배지를 접종하는 데 사용한다. 발효는 대규모의 혐기성 환경에서 최대량의 미생물을 생성시키는 데 사용된다(Ljungdahl et al., Manual of industrial microbiology and biotechnology (1986), edited by Demain et al, American Society for Microbiology, Washington, D.C. page. 84).

보툴리눔 독소는 단백질 정제 기술분야의 당업자에게 공지된 단백질 정제 방법을 사용하여 분리 및 정제할 수 있다(Coligan et al. Current Protocols in Protein Science, Wiley & Sons; Ozutsumi et al. Appl. Environ. Microbiol. 49 ; 939-943: 1985).

보툴리눔 독소의 생성시, 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물을 발효 배지의 접종을 위해서 시드 배지에서 성장시킬 수 있다. 시드 배지의 성장을 포함하는 연속되는 단계의 횟수는 발효단계에서 보툴리눔 독소 생산의 규모에 따라 다양하다. 그러나, 앞서 논의한 바와 같이, 발효 단계에서의 성장은 저장된 배양물로부터 접종하여 직접적으로 진행될 수 있다. 동물에 기초한 시드 배지는 일반적으로 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위하여, BHI, 박토-펩톤, NaCl 및 글루코오스를 포함하여 구성된다. 앞서 논의한 바와 같이, 동물에 기초한 성분이 비-동물 성분으로 대체되는 대체 시드 배지가 본 발명에 따라 제조될 수 있다. 이에 제한되지는 않지만, 예를 들어, 콩에 기초한 산물이, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장 및 보툴리눔 독소의 생성을 위한 시드 배지의 BHI 및 박토-펩톤을 대체할 수 있다. 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물은 비용해성 콩을 포함하는 배지에서 성장할 수 있지만, 콩에 기초한 산물은 물에 용해가능한 가수분해된 콩을 포함하는 것이 바람직하다. 성장 레벨 및 다음에 이어지는 독소 생성이 용해성 콩 산물로부터 유래한 배지에서 더 크다.

콩에 기초한 산물의 어떤 공급원(source)을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 바람직하게, 콩은 가수분해된 콩이며, 가수분해는 비-동물 효소를 사용하여 실시된다. 가수분해된 콩의 공급원은 다양한 상업적 공급자로부터 입수가 가능하다. 가수분해된 콩의 공급원은 Hy-Soy (Quest International), Soy peptone (Gibco) Bac-soytone (Difco), AMISOY (Quest), NZ soy (Quest), NZ soy BL4, NZ soy BL7, SE50M (DMV International Nutritionals, Fraser, N. Y. ), 및 SE50MK (DMV)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 가장 바람직하게, 가수분해된 콩의 공급원은 Hy-Soy 또는 SE50MK이다. 가수분해된 콩의 다른 가능한 공급원들이 공지되어 있다.

본 발명에 따른 시드 배지 중의 Hy-Soy의 농도는 25-200 g/L의 범위이다. 바람직하게, 시드 배지 중의 Hy-Soy의 농도는 50-150 g/L이다. 가장 바람직하게, 시드 배지 중의 Hy-Soy의 농도는 약 100 g/L이다. 또한, NaCl의 농도는 0.1-2.0 g/L 사이의 범위이다. 바람직하게, NaCl의 농도는 0.2-1.0 g/L 사이의 범위이다. 가장 바람직하게, 시드 배지 중의 NaCl의 농도는 약 0.5 g/L 이다. 글루코오스의 농도는 0.1g/L 내지 5.0g/L 사이의 범위이다. 바람직하게, 글루코오스의 농도는 0.5-2.0g/L 사이의 범위이다. 가장 바람직하게, 시드 배지 중의 글루코오스의 농도는 약 1.0g/L이다. 시드 배지의 다른 성분들과 함께 고압멸균하여 글루코오스를 멸균하는 것이 또한 바람직하나 본 발명에 필수적인 것은 아니다. 성장 전 시드 배지의 바람직한 pH 레벨은 7.5-8.5 사이의 범위이다. 예를 들어, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장 전 시드 배지의 pH는 약 8.1이다.

시드 배지에서의 클로스트리디움 보툴리눔의 성장은 하나 이상의 단계로 진행될 수 있다. 바람직하게, 시드 배지에서의 성장은 두 단계로 진행된다. 단계 1에서, 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물을 다량의 시드 배지 중에 현탁하고, 혐기성 환경 하에 34±1℃에서 24-48시간 동안 배양한다. 바람직하게, 단계 1에서의 성장은 약 48시간 동안 진행된다. 단계 2에서, 더욱 성장시키기 위하여 클로스트리디움 보툴리눔을 함유하는 단계 1 배지의 일부분 또는 전체를 사용하여 단계 2 시드 배지를 접종한다. 접종 후에, 단계 2 배지를 역시 혐기성 환경 하에 34±1℃에서 약 1-4일 동안 배양한다. 바람직하게, 단계 2 시드 배지에서의 성장은 약 3일간 진행된다. 어떤 단계에서든 시드 배지에서의 성장은, 시드 배지에서의 최종 성장물로 발효 배지를 접종하기 전에, 세포 용해를 야기하지 않는 것이 또한 바람직하다.

클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위한 동물 부산물을 함유하는 표준 발효 배지는 Mueller 및 Miller(MM; J. Bacteriol. 67: 271,1954)의 레시피에 기초할 수 있다. 동물 부산물을 함유하는 MM 배지의 성분들은 BHI 및 NZ-CaseTT를 포함한다. NZ-CaseTT는 상업적으로 입수가능한 펩티드 및 아미노산의 공급원으로, 동물 젖에서 발견되는 단백질의 일종인 카세인의 효소 소화로부터 유래한다. 본 발명은 비-동물에 기초한 산물이 발효 배지에서 BHI 및 NZ-CaseTT를를 대체할 수 있음을 입증한다. 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만, 콩에 기초한 산물이, 클로스트리디움 보툴리눔의 발효에 사용되는 MM 배지의 동물에 기초한 성분들을 대체할 수 있다. 바람직하게, 콩에 기초한 산물은 물에 용해가능하며, 가수분해된 콩으로부터 유래한 것이지만, 상기에서 논의한 바와 같이, 비용해성 콩 산물을 또한 본 발명의 실시에 사용할 수 있다.

콩에 기초한 산물의 어떤 공급원이든 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 바람직하게, 가수분해된 콩은 상표명 Quest International (Sheffield), Hy-Soy로 부터, 또는 상표명 DMV International Nutritionals (Fraser, N. Y. ), SE50MK로부터 얻는다. Soy peptone (Gibco) Bac-soytone (Difco), AMISOY (Quest), NZ soy (Quest), NZ soy BL4, NZ soy BL7, 및 SE50MK (DMV International Nutritionals, Fraser, N. Y.)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 공급원으로부터 용해가능한 콩 산물을 또한 얻을 수 있다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시형태에서, 클로스트리디움 보툴리눔의 발효에 사용되는 배지는 동물 부산물이 없으며 가수분해된 콩, 글루코오스, NaCl, Na₂HP0₄, MgSO₄7H₂O, KH₂P0₄, L-시스테인, L-티로신 및 철분말을 포함하여 구성된다. 시드 배지에서 설명한 바와 같이, 가수분해된 콩은 발효배지의 동물 부산물을 대체할 수 있다. 이러한 동물 부산물로는 BHI 및 NZ-CaseTT(효소적으로 소화된 카세인)이 포함된다.

보툴리눔 독소의 생성을 위한 발효 배지 중의 Hy-Soy의 농도는 바람직하게 약 10-100g/L 사이의 범위이다. 바람직하게, Hy-Soy의 농도는 약 20-60 g/L 사이의 범위이다. 가장 바람직하게, 발효 배지 중의 Hy-Soy의 농도는 약 35 g/L이다. 보툴리눔 독소의 최대 생성을 위하여, 발효 배지 중의 성분들의 특히 바람직한 농도는 약 7.5g/L 글루코오스; 5.0 g/L NaCl; 0.5g/L Na₂HPO₄ ; 175 mg/L KH₂PO₄; 50 mg/L MgS0₄7H₂0; 125 mg/L L-시스테인; 및 125 mg/L L-티로신이다. 사용되는 철분말의 양은 50mg/L 내지 2000mg/L의 범위일 수 있다. 바람직하게, 철분말의 양은 약 100mg/L 내지 1000 mg/L 사이의 범위이다. 더욱 바람직하게, 발효 배지에 사용되는 철분말의 양은 약 200mg/L 내지 600mg/L의 범위이다.

독소 생성의 최적 레벨을 위하여, 콩에 기초한 발효 배지의 초기 pH(고압멸균 전)는 바람직하게 약 5.0 내지 7.1 사이의 범위이다. pH 제어가 보툴리눔 회수를 향상시킨다는 것을 알아내었다. 바람직하게, 발효 배지의 초기 pH는 약 7이다. 실시예 7에서 설명한 바와 같이, 그 후에 pH를 감소시켜 pH 5-5.5로 유지시키면, 고수율의 안정한 보툴리눔 독소를 얻을 수 있다는 것을 알아내었다. 시드 배지에서 설명한 바와 같이, 글루코오스 및 철을 포함한 발효 배지의 성분들은 멸균을 위하여 함께 고압멸균하는 것이 바람직하다.

바람직하게, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위해 사용된 두번째 단계 시드 배지의 일부분을 사용하여 발효 배지를 접종한다. 발효는 약 34±1℃의 혐기성 챔버에서 약 7 내지 9일간 일어난다. 배지의 광학 밀도(O.D.)를 측정하여 성장을 모니터한다. 성장 측정(광학 밀도)에 의해서 결정될 때, 적어도 48시간동안 세포 용해가 진행된 후에, 발효를 중단하는 것이 바람직하다. 세포가 용해될 때, 배지의 O.D.가 감소한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, 클로스트리디움 보툴리눔의 장기간 보관 및 시드 배지의 접종을 위해 사용되는 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물은 4℃에서 저장되기 전에, 두유 중에서 성장 및 동결건조된다. 저장을 위해 동결건조된 동물 젖 중의 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물이 또한 보툴리눔 독소의 생성을 위해 사용될 수 있다. 그러나, 보툴리눔 독소의 생성 전체에 걸쳐 동물 부산물이 실질적으로 없는 배지를 유지하기 위해서, 클로스트리디움 보툴리눔의 초기 배양물을 동물의 젖이 아니라 두유에서 보존하는 것이 바람직하다.

본 발명의 실시형태를 하기의 도면으로 설명 및 도해한다.

도 1은 "N-공급원(즉, Hysoy + YE)% 대 효능 및 pH"에 대한 것으로, 결정한 보툴리눔 독소 활성을 나타내는 그래프이다: X 축에 표시된 wt% 양의 가수분해된 콩 농축물 및 효모 추출물 농도를 가진 APF 배지에 대해, 바(bar)의 상단에 표시된 경과된 발효 시간에서 다양한 APF 배지의 (1) 마우스 치사량 50(MLD 50)(속이 빈 바)이 왼쪽 Y 축에, 및; (2) SNAP 25 활성(빗금 바)이 왼쪽 Y 축에, APF 배지 pH에 대해서는 오른쪽 Y 축에 표시되어 있다. 도 1의 모든 배지는 또한 1 중량%의 글루코오스를 포함한다.

도 2는 세포 은행 생성, 배양 및 발효 단계에 걸쳐, 보툴리눔 독소를 얻기 위한 비-APF 프로세스(도 2의 위쪽)를본 발명의 범주에 속하는, 보툴리눔 독소를 얻기 위한 APF 프로세스(도 2의 아래쪽)와 비교한 요약 플로우 차트이다. 도 2는 채취 및 정제 단계는 생략하였다.

도 3은 APF 발효 프로세스에서 보툴리눔 독소 타입 A 복합체 생성에 대한 콩 단백질 농도의 효과를 비교한 그래프로, 여기서, 발효 배지는 1 wt%의 글루코오스 및 1 wt%의 효모 추출물을 포함한다. 도 3에서, X 축은 발효 배지에서 특정 가수분해 콩 단백질(HySoy)의 중량% 농도를 나타내며, 왼쪽 Y축은 최종 정제된 보툴리눔 독소 복합체의 효능을 나타내며, 오른쪽 Y 축은 다음 방정식으로 결정되는 완료된 세포 용해의 퍼센트를 나타낸다.

여기서, OD _{600 max}은 최대 성장 시점에 600nm에서 측정된 광학 밀도를 나타내고, OD_{600 종료점}은 발효 채취 시점에서의 광학밀도를 나타낸다.

특정한 방법을 설명한 하기의 실시예들이 본 발명에 포함되나, 본 발명의 범주를 제한하고자하는 것은 아니다. 클로스트리디움 보툴리눔 배양물은 List Laboratories, Campbell, Califonia와 같은 몇몇 공급원으로부터 얻을 수 있다. 모든 실험물질 및 배지는 이차 증류수를 사용하여 제조할 수 있다. 하기 모든 실시예에서, "클로스트리디움 보툴리눔"은 홀 A(Hall A; ATCC 수탁번호 3502) 계통의 클로스트리디움 보툴리눔 타입 A이다.

실시예 1

클로스트리디움 보툴리눔을 위한 동물 산물이 없는 시드 배지의 제조

배지 각 1 리터당 하기의 성분들을 사용하여, 대조구 시드 배지를 제조할 수 있다: NaCl(5g), 박토-펩톤(Bacto-peptone; 10g), 글루코오스(10g), BHI(1 리터가 될때까지), pH 8.1 (5 N NaOH로 조절).

배지 각 1 리터당 하기의 성분들을 사용하여, 테스트(동물 산물이 없는) 시드 배지를 제조할 수 있다: NaCl(5g), 소이-펩톤(Soy-peptone; 10g), 글루코오스(10g), Hy-Soy (35g/리터, 배지 유액 1 리터를 만들도록), pH 8.1 (5 N NaOH로 조절).

실시예 2

동물 산물이 없는 시드 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 배양하기

클로스트리디움 보툴리눔의 동결건조된 배양물을 각각 1ml의 실시예 1의 대조구 및 테스트 시드 배지에 현탁하고, 각각의 시드 배지를 10ml 담을 수 있는 두개의 튜브로 나누고(각각의 시드 배지를), 34℃에서 약 24-48시간 동안 배양할 수 있다. 그리고 나서, 1ml의 배양물을, 40ml의 (각각의) 시드 배지를 포함하는 125ml DeLong Bellco Culture Flask를 접종하는 데 사용할 수 있다. 접종된 배양물을 코이 혐기성 챔버(Coy Anaerobic Chamber; Coy Laboratory Products Inc., Grass Lake, Mich.)에서 33℃ ± 1℃에서 24시간 동안 배양할 수 있다.

실시예 3

클로스트리디움 보툴리눔을 위한, 동물 산물이 없는 발효 배지의 제조

배지 각 2 리터당 하기의 성분들을 사용하여, 기본 발효 배지를 제조할 수 있다: 글루코오스(15g), NaCl(10g), NaH₂P0₄(1g), KH₂P0₄(0.350g), MgS0₄7H₂0(0.1g), 시스테인-HC(0.250g), 티로신-HCl(0.250g), 철분말(1g), ZnCl₂ (0.250g), 및 MnCl₂ (0.4 g).

배지 각 2 리터당 하기의 성분들을 사용하여, 대조구 발효 배지를 제조할 수 있다: BHI (500ml; 건조중량 약 45.5g의 비프 하트 인퓨젼에 상응한다.), NZ-CaseTT (30g), 및 기본 배지(2리터가 될때까지), pH 6.8.

일차로 기본 발효 배지를 제조하고, pH 6.8로 조절할 수 있다. 그리고 나서, 비프 하트 인퓨젼(BHI)을 제조하고, 5N NaOH를 사용하여 pH 8로 조절한다. 그리고 나서, BHI를 기본 배지에 가한다. 다음으로, NZ-CaseTT를 제조한다. 그리고 나서, NZ-CaseTT를, 이미 비프 하트 인퓨젼을 가한 기본 배지에 가하고, HCl을 가하여 용해시킨다. 그리고 나서, 5N NaOH를 사용하여 pH를 6.8로 조절할 수 있다. 이어서 이 배지를 각각 16개의 100mm 테스트 튜브에 8ml씩 나누어 담은 후, 120℃에서 25분간 고압멸균(autoclaving)한다.

대조구 발효 배지에 존재하는 BHI를 테스트 질소원으로 대체하여 테스트 발효 배지(동물 산물이 없는)를 제조할 수 있다. 적합한 테스트 발효 배지 질소원으로는, Hy-Soy (Quest), AMI-Soy (Quest), NZ-Soy (Quest), NZ- Soy BL4 (Quest), NZ-Soy BL7 (Quest), Sheftone D (Sheffield), SE50M (DMV), SE50 (DMV), SE%) MK (DMV), Soy Peptone (Gibco), Bacto- Soyton (Difco), Nutrisoy 2207 (ADM), Bakes Nutrisoy (ADM) Nutrisoy flour, Soybean meal, Bacto-Yeast Extract (Difco) Yeast Extract (Gibco), Hy-Yest 412 (Quest), Hy-Yest 441 (Quest), Hy-Yest 444 (Quest), Hy-Yest (455 (Quest) Bacto-Malt Extract (Difco), Corn Steep, and Proflo (Traders)이 포함된다.

BHI를 빼고, 상응하는 질소원은 3N HCl 또는 5N NaOH를 사용하여 일차로 pH 6.8로 조절하는 것을 제외하고는 대조구 발효 배지에 대하여 설명한 바와 같이 테스트 발효 배지를 제조할 수 있다. 16개의 100ml 테트스 튜브에 배지를 8ml씩 배분한 다음, 120℃에서 20-30 분간 고압멸균할 수 있다.

실시예 4

동물 산물이 없는 발효 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔 성장시키기

테스트 시드 배지 배양물(동물 산물이 없는) 40㎕를 사용하여, 8ml 16 X 100mm 테스트 튜브에 들어있는 각각 8ml의 대조구 또는 테스트 발효 배지를 접종할 수 있다. 그리고 나서, 배양물을 33±1℃에서 24시간동안 배양한다. 그리고 나서, 튜브들을 혐기성 챔버에서 배양하여 박테리아가 성장하게 한다. 각각의 배지 에세이를 3중으로 실시한다(즉, 동일한 배지를 독립적으로 3회 접종하는 것을 포하며, 또한 분광광도계 사용시 바탕값으로 사용할 수 있는 비-접종 배지를 포함할 수 있다). 660 nm에서 Turner Spectrophotometer(Model 330)를 사용하여 24시간마다 성장정도(광학 밀도에 의해서 결정됨, OD)를 측정할 수 있다. 세포 용해가 약 48시간 동안 지속된 후에는 배양을 중단하여야 하며, 그 후, 보툴리눔 독소 생성을 측정할 수 있다.

배지 각 500ml 당 하기의 성분들을 포함하는, Hy-Soy 발효 배지를 사용하여 추가적인 실험을 실시한다: Hy-Soy(17.5g), 글루코오스(3.75g); NaCl(2.5g); Na₂HP0₄ (0.25g), MgS0₄7H₂0 (0.025g), KH₂P0₄ (0.0875g), L-시스테인 (0.0625g), L- 티로신 (0.0625g), 철분말 (0.25 g), pH 6.8

실시예 5

동물 산물이 없는 발효 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔을 성장시켜 얻은 보툴리눔 독소 생성의 결정

실시예 4에서 배양된 세포를 원심분리한 다음, 상청액의 pH를 결정한다. 표준 항독소를 가하고 응집전 경과시간을 측정하여, 주어진 샘플에서 보툴리눔 독소의 레벨을 측정할 수 있다. Kf(응집이 나타나는 데 필요한 시간, 분) 및 Lf(응집 한계(the limit of flocculation); 응집에 의해 정해질 때, 표준 항독소의 1 국제 유닛(1 international unit)과 동등함)을 결정할 수 있다. 주어진 배양을 위해 각각의 발효 튜브로부터 4ml의 발효 브로스(fermentation broth)를 취하여, 함께 합하여 총 12ml를 15ml 원심분리 튜브에서 섞을 수 있다. 튜브들을 5000rpm(3400g)으로 4℃에서 30분간 원심분리할 수 있다. 상청액 1ml씩을 0.1-0.6ml의 표준 보툴리눔 독소 항혈청을 포함하는 튜브에 가하고, 튜브들을 조심스럽게 흔들어서 내용물들을 섞을 수 있다. 그리고 나서, 튜브들을 45±1℃ 수조에 넣고, 시작 시간을 기록할 수 있다. 튜브들을 자주 체크하여, 응집이 시작될 수 있는 시간을 Kf로 기록할 수 있다. 응집이 처음 시작될 수 있는 튜브내 독소의 농도를 LfFF로 나타낼 수 있다. 응집이 두번째로 시작되는 튜브내 독소의 농도를 LfF로 나타낼 수 있다.

발효, 성장 및 독소 생성에 대하여 병렬 에세이를 실시할 수 있다:(a) 대조구 시드 배지(대조구 발효 배지를 접종하는 데 사용) 및 대조구 발효 배지, 및; (2) (동물 산물이 없는) 테스트 시드 배지(테스트 발효 배지를 접종하는 데 사용) 및 (동물 산물이 없는) 테스트 발효 배지. 특히, 동물 산물이 없으며, 또한 동물 산물이 없는 배양물로 접종되는 배지(동물 산물 대신에 콩에 기초한 산물로 대체)에서 클로스트리디움 보툴리눔의 발효는 약 50 이상의 Lf_toxin의 결과를 얻을 수 있 는 것으로 결정할 수 있다. 최소로, Lf_toxin은 약 10이다. 바람직하게, Lf_toxin은 적어도 20이다. 가장 바람직하게, Lf_toxin는 50이상이다.

또한, 다양한 콩 산물이 BHI가 배제된 발효 배지에서 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 지원하는 것으로 결정할 수 있다. 따라서, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장에 있어서 용해성 콩 제품이 BHI를 대체할 수 있다. 가장 좋은 농도는 12.5 또는 25g/L이다. Hy-Soy(Sheffield)가 가장 높은 성장정도를 제공한다. 비용해성 콩 제품은 덜 효과적이다.

또한, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장에 있어서 BHI를 대체하는 능력에 있어서 Quest Hy-Soy, DMV SE50MK, 및 Quest NZ-Soy가 효과적인 콩 산물이라는 것을 보여주는 결과를 얻을 수 있다. 결과는 성장에 있어 최적인 콩 산물(Quest Hy-Soy, DMV SE50MK, 및 Quest NZ-Soy와 같은)이 또한 독소 생성을 위한 BHI를 대체하는 데 있어서도 효과적이라는 것을 입증한다. 독소 생성에 있어서 최상의 콩 산물은 22.75 g/l의 Quest Hy-Soy이다. 이 산물의 더 높은 농도에서는 성장이 더 좋으나, 독소 생성이 향상되지 않는다. 제안된 SE50MK를 사용시, 농도가 더 높으면 성장이 증가되나 독소 생성이 증가되지는 않는다는 유사한 결과를 얻을 수 있다. 다른 한편, NZ-Soy는 더 높은 농도에서 더 높은 성장 및 더 높은 독소 생성을 제공한다.

마지막으로, 콩 산물이 효과적으로 BHI뿐아니라 NZ-CaseTT를 대체할 수 있다고 결정할 수 있다. 콩에 기초한 배지에서 NZ-CaseTT를 제거하면 약 2-4배 성장이 감소된다. NZ-CaseTT의 존재 및 부재 모두에 있어서 성장을 위한 최상의 콩 산물은 SE50MK이다. Hy-soy는 독소 생성을 위한 BHI와 NZ-CaseTT를 모두 대체할 수 있다. 그러나, 1 또는 2일이 걸리는 장기간의 발효 사이클이 필요하다. Hy-Soy는 독소 생성을 위한 배지에서 BHI와 NZ-CaseTT를 모두 대체할 수 있다. 그러나, 효모 추출물은 독소 생성을 억제할 수 있는 것으로 결정할 수 있다.

22.75 g/l의 Hy-Soy가 독소 생성을 위한 BHI 및 Hy-CaseTT 모두를 완전히 대체할 수 있는 것으로 결정할 수 있다. 성장에 대한 효과에 있어서는 56.88 g/l의 Hy-Soy가 최상인 것과 달리, 독소 생성 단계에서는 34.13g/l의 Hy-Soy가 최상일 수 있다.

따라서, 놀랍게도 Hy-Soy 또는 [Hy-Soy + Hy-Yeast]가 클로스트리디움 보툴리눔의 시드 성장을 위한 배지에서 BHI 및 박토-펩톤을 대체할 수 있는지 결정하였다. 또한, 클로스트리디움 보툴리눔에 의한 보툴리눔 독소 생성의 최대 레벨을 제공하는 시드 배지 성분들의 최적 농도를 결정하도록 실험을 설계할 수 있다. BHI 및 NZ-CaseTT가 없는 시드 배지 및 발효 배지에서의 클로스트리디움 보툴리눔 성장에 의한 독소 생성은 BHI 및 NZ-CaseTT를 포함하는 배지에서 얻어지는 레벨과 같거나 그 이상일 수 있다.

시드 배지에서의 성장을 위한 Hy-Soy 또는 [Hy-Soy + Hy-Yeast]의 최적 농도를 결정할 수 있다. 실험들은 Hy-Soy가 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위한 시드 배지에서 질소원으로서 및 이어지는 발효 단계에서 보툴리눔 독소의 생성을 위한 질소원으로서 BHI 및 박토-펩톤을 대체할 수 있다는 것을 확인시켜 준다. 또 한, 시드 배지에서의 질소원으로서의 Hy-Soy는, Hy-Soy + Hy-Yeast와 비교할 때, 이어지는 발효 단계에서 더 높은 레벨의 보툴리눔 독소를 제공할 수 있다. 최적 레벨의 독소를 생성하는 시드 배지에서의 Hy-Soy의 농도는 약 62.5g/l 내지 100g/l범위이다.

추가적인 실험들은 클로스트리디움 보툴리눔 발효에 의한 보툴리눔 독소의 최대 생성을 위한 시드 배지에서의 Hy-Soy의 최적 농도를 결정하기 위하여 설계될 수 있다. 즉, 시드 배지에서 30g, 50g, 75g 및 100g의 Hy-Soy가 모두 클로스트리디움 보툴리눔의 발효에 의한 보툴리눔 독소의 생성을 가져왔으며, 이는 질소원으로서 BHI 및 박토-펩톤을 함유하는 시드 배지에서 만들어지는 보툴리눔 독소의 레벨과 동등하거나 넘어서는 것이다.

시드 배지에서 100g/l 농도의 Hy-Soy가 이어지는 발효 단계에서 최대 레벨의 독소 생성을 가져온다는 것을 알 수 있다. 또한, 데이터는 시드 단계-1의 Hy-Soy 시드 배지가 24시간 후보다는 48시간 후에 더 큰 성장을 제공한다는 것을 나타낸다.

실시예 6

보툴리눔 독소를 얻기 위한 비-APF 프로세스

클로스트리디움 보툴리눔 박테리움을 발효시켜 클로스트리디움 독소를 얻었다. 따라서, 고도로 강력하고 고도로 정제된 클로스트리디움 보툴리눔 독소(즉, 벌크 독소)를 얻기 위해 변형된 Schantz(비-APF) 프로세스를 실시하였다. 변형된 Schantz(비-APF) 프로세스는 고수율의 보툴리눔 독소를 제공할 수 있다. Schantz 및 변형된 Schantz 프로세스는 모두 모든 발효 배지에 카제인을 사용한다.

모 배양물(stock culture) 제조

다양한 클로스트리디움 박테리아는 ATCC(American Type Culture Collection)(Manassas, Verginia)로부터 이용가능하다. 선택적으로, 클로스트리디움 보툴리눔을 토양을 포함하는 다양한 소스로부터 분리함으로써, 또는 부패 동물 시체의 (혐기성(anaerobic) 또는 유사-혐기성(quasi-anaerobic) 위치에서의) 디프(deep) 샘플링을 통해, 클로스트리디움 보툴리눔 세포 뱅크 바이알을 제조할 수 있다. 일반적으로, 클로스트리디움 보툴리눔은 보툴리즘으로 진단된 환자의 생리학적 유체 샘플(즉 상처 보툴리즘을 갖는 환자료부터의 상처 교환물)로부터 얻을 수 있다. 도 1의 최상부 반은 세포 뱅크 바이알을 제조하기 위해 및 보툴리눔 독소의 배양 및 발효를 위해 사용된 비-APF 프로세스를 요약한다.

자연 또는 환자 소스(source)로부터 얻어진 클로스트리디움 보툴리눔을 혈액 아가 플레이트 상에서 배양하고, 이어서 세포 뱅크 바이알 배지 내에 고도 성장 콜로니들을 접종한다. 클로스트리디움 보툴리눔에 사용된 세포 뱅크 바이알 배지는 다진 신선한 소고기를 포함하는 익힌 고기 배지였다. 활발히 성장하는 배지를 글리세롤 과 혼합하여, 이후에 사용하기 위해 동결된 클로스트리디움 보툴리눔 박테리움의 세포 뱅크 바이알(즉 모 배양물)을 제조하였다.

시드 배양(seed cultivations)

클로스트리디움 보툴리눔 세포 뱅크 바이알을 실온에서 녹인 후 네 배양 단계가 뒤따랐다. (1) 적합한 모르폴로지를 갖는 콜로니를 선택하기 위해, 녹인 세포 뱅크 바이알로부터의 분취액(aliquots)을, 예비-환원된(pre-reduced) 콜롬비아 혈액 아가 플레이트 상에서 박테리아를 스트리킹(streaking)하고 혐기적으로(anaerobically) 30-48시간동안 34℃±1°에서 배양하여 배양하였다. (2) 이어서 선택된 콜로니들을 카제인 성장 배지를 포함하는 테스트 튜브에 6-12시간동안 34℃에서 접종하였다. 이어서, 가장 빠른 성장 및 가장 높은 밀도를 갖는 튜브(성장 선택 단계)의 내용물을 두 셋-업(set-up) 혐기성 배양을 통해 더 배양하였다: (3) 1 리터 시드 배양 용기(bottle) 내의 34℃에서의 12-30 시간의 제 1 배양 후, (4) 카제인 성장 배지를 포함하는 25 리터 시드 발효기 내에서의 35℃에서의 6-16시간동안의 제 2 배양하였다. 이들 두 셋-업 배양은 pH 7.3의 물 중의 2% 카제인 가수분해물(카제인[우유 단백질] 소화물), 1% 효모 추출물 및 1% 글루코오스(덱스트로스)를 포함하는 영양 배지 내에서 실시되었다.

발효(fermentation)

셋-업 배양 후 60-96℃ 시간동안 35℃에서 카제인 함유 배지 내에서 상업적 규모(즉 115 리터) 발효기 내에서 조절된 혐기성 대기 하에 추가 배양하였다. 박테리아의 성장은 일반적으로 24-36 시간 후에 완료되며, 60-96 시간 발효 동안에 대부분의 세포는 용해(lysis)되어 보툴리눔 독소를 방출한다. Schantz 또는 변형된 Schantz 프로세스에서는 발효 배지 pH 의 조절이 요구되지 않는다. 세포 용해에 의해 방출된 독소는 배양 브로스 내에 존재하는 프로테아제에 의해 할성화되는 것으로 보인다. 선택적으로, 정화된 배양물이라고 하는 맑은 용액을 얻기 위해, 단일층 깊이 필터를 사용하여 이러한 배양 배지를 여과하여 전체 불순물(즉 전(whole) 세 포 및 파열된 세포)을 제거할 수 있다.

채취(Harvest)

독소의 채취는, 황산을 사용하여 pH를 3.5까지 낮추어 원료(raw) 독소를 20℃에서 침전시킴으로써 수행될 수 있다. 이어서, 원료 독소는 한외미세여과(ultramicrofiltration) 후 투석여과하여 농축되었다.

정제

이어서 채취된 조(crude) 독소를 소화(digestion) 용기에 옮기고 프로테아제 저해제 벤즈아미딘 하이드로클로라이드를 첨가하여 안정화시켰다. 핵산을 소화시키기 위해 DNase 및 RNase를 첨가하였다. 물질을 포함하는 독소는 UF/DF 및 3단계의 침전(차가운 에탄올, 염산 및 암모니아 설페이트 침전)단계를 거친다. 정제된 보툴리눔 신경독소 복합체(벌크 독소)를 2-8℃에서 인산나트륨/황산암모늄 내 현탁액으로서 저장하였다.

얻어지는 벌크 독소는 특이적 효과(potency)≥3×10⁷ U/mg, A₂₆₀/A₂₇₈ 0.60 이하 및 구별되는 젤 전기영동 상의 밴딩 패턴을 갖는 클로스트리디움 보툴리눔의 홀 A(Hall A) 균주로 만들어지고, 보툴리눔 독소 약제학적 조성물의 합성(compounding)에 사용하기 적합한 고품질 결정질 900 kD 보툴리눔 독소 타입 A 복합체였다.

합성은, 벌크 독소를 수배 희석하고, 하나 이상의 부형제(알부민 및 염화나트륨 등)와 혼합하여 독소 조성물을 형성하고, 조성물의 감압동결건 조(lyophilizing), 동결 건조 또는 진공 건조에 의해서와 같이, 독소 조성물의 저장 및 선적에 안정한 형태를 제조하는 것을 포함할 수 있다.

Schantz 또는 변형된 Schantz 프로세스로부터 얻어진 정제된 보툴리눔 독소 복합체는, pH 7-8 완충액 내 이온 교환 컬럼으로부터 용리시켜 보툴리눔 독소 분자로부터 비 독소 복합체 단백질을 분리시킴으로써, (발효된 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아의 타입에 따라) 약 150 kD의 분자량 및 1-2×10⁸ LD₅₀ U/mg 이상의 특이적 효과를 갖는 순수한 보툴리눔 독소 타입 A; 또는 약 156 kD의 분자량 및 1-2×10⁸ LD₅₀ U/mg 이상의 특이적 효과를 갖는 정제된 보툴리눔 독소 타입 B, 또는 약 155 kD의 분자량 및 1-2×10⁷ LD₅₀ U/mg 이상의 특이적 효과를 갖는 정제된 보툴리눔 독소 타입 F를 얻을 수 있다.

실시예 7

보툴리눔 독소를 얻기 위한 APF 배지 및 프로세스

이 실시예 7은 고도로 강력하고 고도로 정제된 클로스트리디움 보툴리눔 독소 타입 A(즉 벌크 독소)를 얻기 위해 실시된 APF 프로세스를 설명한다. 상기 프로세스는 다른 보툴리눔 독소 세로타입(serotypes)과 함께 사용될 수 있다.

모 배양물 제조

실시예 6에서 설명된 바와 같이, ATCC로부터, 자연의 다양한 소스로부터 또는 보툴리즘 환자로부터 클로스트리디움 보툴리눔을 얻을 수 있다. 도 1의 최저부 반은 셀 뱅크 바이알을 제조하기 위해 및 보툴리눔 독소의 배양 및 발효를 위해 사용된 APF 프로세스를 요약한다. APF 세포 뱅크 바이알은 플랜트(plant) 아가 플레이트 상에서 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하여 제조하였다. 플랜트 아가 플레이트는 콩(soy) 유도체 HySoy(Quest)를 효모 추출물 및 글루코오스와 3:1:1(중량%) 비율로 아가와 함께 혼합하고 세팅시킴으로써 제조되었다. 다른 시판 APF 아가 플레이트 또는 플레이트 제조용 탈수된 분말이 또한 적합한 것으로 밝혀졌다. 이어서 선택된 고성장 콜로니를 APF 셀 뱅크 바이알 배지 내에 접종하였다. 사용된 APF 세포 뱅크 바이알 배지는 가수분해된 콩 단백질, 효모 추출물(효모의 배양이나 이로부터 얻는 효모 추출물의 제조 프로세스에 어떤 동물 산물도 사용되지 않았다. 영양성분의 다른 비율(즉, 6:1:1, 6:0:1 및 6:3:1)이 또한 적합한 것으로 밝혀졌다.) 및 글루코오스를 3:1:1의 비율로 포함하였다. 사용된 가수분해된 콩(HySoy) 및 효모 추출물(HyYeast) 농축물은 Quest International로부터 입수하였다. APF 배지 내 클로스트리디움 보툴리눔 배양물을 글리세롤과 결합시키고, 냉동바이알(cryovials)에 분취하고, 이후에 사용하기 위해 동결하였다. 생존능력의 손실 없이 1년 이상동안 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 저장하기 위하여 진보된 APF 배지가 사용될 수 있다. 냉동바이알 내의 이들 동결된 배양물 및 글리세롤 혼합물은 APF 세포 뱅크 바이알이다.

시드 배양

APF 세포 뱅크 바이알을 실온에서 녹인 후 단일 배양 단계가 뒤따랐다: 이어서 1 리터 시트 배양 용기는 동일한 APF 배지(APF 세포 뱅크 바이알[저장] 배지는 APF 발효[성장] 배지와 상이할 수 있다)를 사용하여 APF 세포 뱅크 바이알 내용물로 직접(즉 혈액 아가 배양물 또는 튜브 성장 단계를 개재시키지 않고) 접종되었고, 혐기성(질소) 대기에서 7.0의 초기 배지 pH로 35℃에서 15 내지 24시간동안 유지되었다.

발효(fermentation)

다음으로 시드 용기 배양물을, 혐기성(질소) 대기에서 최초 배지 pH를 7.0으로 하여, 35℃에서 52-72시간동안 유지된 APF 배지(가수분해된 콩 단백질, 효모 추출물 및 1% 글루코오스)를 포함하는 상업 규모 10 리터 제조 발효기로 옮겼다. 발효 개시 약 15시간 후(배양물 pH는 자연적으로 6.0 이하까지 감소되었음)에, HCl을 배양물에 가하여 pH 5.0-5.5 범위의 pH 제어 프로그램을 시작한다. 활성 보툴리눔 독소의 허용가능한 수율을 얻기 위하여 APF 발효 배지의 pH를 좁은 범위 이내로 조절할 필요가 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, pH 5-5.5 사이로 이와 같이 pH를 조절하면 보툴리눔 독소의 효과의 열화 및 손실이 실질적으로 방지되는 것으로 밝혀졌다. 발효동안에 세포의 대부분이 용해되고 보툴리눔 독소를 방출하며, 세포 용해에 의해 방출된 독소는 배양물 브로스 내에 존재하는 프로테아제에 의해 활성화되는 것으로 생각된다. 이러한 배양 배지를 단일층 깊이 필터를 사용해 여과하면 전체 불순물(즉 전 세포 및 파열된 세포)이 제거되고 그 결과 정화된 배양물이라고 하는 맑은 용액이 얻어진다.

채취(Harvest)

이어서 보툴리눔 독소의 채취는 실시예 6에서와 같이 프로세스될 수 있다 (즉, 황산 침전 후 미세여과에 이어서 투석여과).

정제

이어서 독소의 정제는 실시예 6에서 설명된 바와 같이 프로세스될 수 있다: 즉 벤즈아미딘 하이드로클로라이드, 및 DNase 및 RNase의 첨가, 황산 침전, 차가운 에탄올 침전, 포스페이트 완충액 추출, 염산 침전, 포스페이트 완충액 추출 및 벌크 독소 저장.

실시예 6의 채취 및 정제 프로세스에 대한 대안으로서, 컬럼 크로마토그래피 프로세스가 실시될 수 있다.

얻어지는 벌크 독소는 특이적 효과(potency)≥3×10⁷ U/mg, A₂₆₀/A₂₇₈ 0.60 이하 및 구별되는 젤 전기영동 상의 밴딩 패턴을 갖는 클로스트리디움 보툴리눔의 홀 A(Hall A) 균주로 만들어지고, 보툴리눔 독소 약제학적 조성물의 합성(compounding)에 사용하기 적합한 고품질 결정질 900 kD 보툴리눔 독소 타입 A 복합체이다. 따라서, 보툴리눔 독소의 이러한 APF 프로세스는 고품질 독소를 생성할 수 있다.

APF 프로세스로부터 얻어진 정제된 보툴리눔 독소 복합체는, pH 7-8 완충액 내 이온 교환 컬럼을 통과시켜 이로부터 용리시켜 보툴리눔 독소 분자로부터 비 독소 복합체 단백질을 분리시킴으로써, (발효된 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아의 세로타입에 따라) 약 150 kD의 분자량 및 1-2×10⁸ LD₅₀ U/mg 이상의 특이적 효과를 갖는 보툴리눔 독소; 또는 약 156 kD의 분자량 및 1-2×10⁸ LD₅₀ U/mg 이상의 특이적 효과를 갖는 정제된 보툴리눔 독소 타입 B, 또는 약 155 kD의 분자량 및 1-2×10⁷ LD₅₀ U/mg 이상의 특이적 효과를 갖는 정제된 보툴리눔 독소 타입 F를 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명자의 APF 배지를 사용함으로써 본 발명자는 보툴리눔 독소의 1.02×10⁸ LD₅₀ U/mg 의 특이적 효과를 갖는 보툴리눔 독소 타입 A 복합체를 얻을 수 있었다.

이 실시예 7에서, 1 wt% 또는 2 wt% 글루코오스를 갖는 APF 배지를 사용하였고(1% 글루코오스는 배양 배지 100ml당 글루코오스 1g을 의미하고, 2% 글루코오스는 배양 배지 각 100ml에 대해 글루코오스 2g이 존재하는 것을 의미한다), 1% 글루코오스 APF 배지 내에서 약 20시간 발효 후 vs 2% 글루코오스 APF 배지 내 약 40시간 발효 후에, (배양물의 피크 광학 밀도[광학 밀도는 600nm에서 측정되었다]로 결정되는 바와 같이) 최대 박테리아 성장이 일어나지만, 배지의 글루코오스 함량이 그렇게 변화됨에 따라 피크 광학 밀도는 크게 변하지 않은 것으로 결정되었다. 세포 자가분해 및 독소 방출의 결과, 약 55 시간의 발효 후 (활성 독소에 대하여 SNAP-25 어세이로 결정되는 바와 같이) 1% 글루코오스 APF 배지 내에서 최대량의 활성 보툴리눔 독소가 얻어졌으나, 2% 글루코오스 APF 배지에서는 이후에 (활성 독소에 대하여 SNAP-25 어세이로 결정되는 바와 같이) 배지 내에서 상기 양의 활성 보툴리눔 독소가 존재하였고, 65 시간의 발효 후에 여전히 증가하는 것으로 생각되 었다. 따라서, 더 신속한 보툴리눔 독소 방출은 보다 적은(1%) 글루코오스 APF 배지 존재량을 사용하여 일어났으며, 더 효율적인 독소 제조 프로세스(즉 시간 단위 당 더 많은 양의 독소가 얻어짐)는 보다 적은(1%) 글루코오스 APF 배지를 사용하여 실시될 수 있는 것으로 나타났다.

도 1로 알 수 있는 바와 같이, APF 배지 내 보툴리눔 독소를 제조하기 위한 최적의 파라미터는 다음 파라미터: (1) APF 발효 배지 내의 가수분해된 콩 단백질 약 6 중량%(도 1의 "HySoy Conc."), (6 중량% 콩은 배양 배지 100ml 당 콩 단백질 6g을 의미한다); (2) APF 발효 배지 내 0% 내지 3% 효모 추출 농축물(도 1의 "YE Conc."); (3) 혐기성(질소 대기) 조건 하 33-35℃의 온도에서 50-72 시간의 발효; (4) 초기 세포 성장 후에 발효 기간 전반에 걸쳐 약 pH 5.0 내지 5.5로 유지된 발효 배지의 pH, 및 (5) APF 발효 배지 내 1 중량% 글루코오스를 결합시킨 것으로 또한 결정되었다.

따라서, 보다 많은 단백질이 APF 배지 내에 (HySoy 및 YE의 총량으로서) 존재함에 따라 도 1에 도시된 바와 같이, 배지의 pH는, 얻어지는 낮은 독성 안정성과 함께 증가하는 경향이 있으며, 배지 내 동일한 총 단백질 영양분 함량으로 pH가 낮춰졌을 때 독소 산물 수율은 급격하게 증가하였다. 비-APF 프로세스에서, 총 단백질 함량은, pH가 상승하는 경향이 없도록 낮춰지고, 따라서 독소 산물에 유해한 효과를 갖도록 pH가 상승되지 않는다. 도 1은, 배지의 pH가 약 5.3 내지 5.5의 좁은 범위 이내로 조절되었을 때 (MLD50 및 SNAP-25 어세이로 결정된 바와 같이) 일관되게 더 활성이었다는 것을 도시한다. 도 1은 또한, 6% 가수분해된 콩 및 1% 효모 추 출물을 포함한 배지를 사용하여 더 높은 독소 수율(SNAP 25 어세이로 결정된 바와 같이)이 얻어졌다는 것을 보여준다.

사용된 SNAP-25 어세이는, 보툴리눔 독소의 SNAP-25 단백질 가수분해 활성을 측정하기 위한 ELISA 계 방법이었다. SNAP-2는 25kDa 분자량의 시냅토솜 관련 단백질에 대한 약자이다. SNAP-25는 뉴런 엑소시토시스(neuronal exocytosis)에 관여하는 206 아미노산 원형질막 단백질이다. 어세이는 문헌(Ekong T., et al., Recombinant SNAP-2 is an effective substrate for Clostridium botulinum type A toxin endopeptidase activity in vitro, Microbiology(1997), vol 143, pages 3337-3347)에 개시된 방법에 기초한다. 어세이는, 폴리스티렌 96 웰 미량역가 플레이트에 결합된 끝을 자른(truncated) SNAP-2 단백질(206 아미노산 잔기 단백질) 및 환원된 보툴리눔 독소 타입 A에 의한 SNAP-25의 아미노산들 197 및 197 간의 효소 가수분해로 만들어진 분해 산물(197 아미노산 잔기 펩티드)을 인식하는 모노클로날 항체를 사용한다. 이어서 분해된 산물에 결합된 모노클로날 항체는 이차 항체(호오스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제[HRP]에 컨쥬게이트된 염소 항마우스 IgG)로 검출되고, 이는 발색성 기판(TMB)의 존재시 색이 변화한다.

MLD50(마우스 50% 치사량) 어세이는 어세이 시작시 각각 17-22g이 나가는 암놈 마우스들(약 4주령)에 보툴리눔 독소를 복강내 주입하여 보툴리눔 독소의 효과를 측정하는 방법이다. 각 마우스는 머리를 아래로 기울인 반듯이 드러누운 위치로 유지되며, 염수 내 보툴리눔 독소의 수회 일련 희석물 중 하나가 25 내지 27 게이지 3/8" 내지 5/8" 니들을 사용하여 약 30도의 각으로 오른쪽 하무 복부 내에 복강 내 주입된다. 각 희석물에 대하여 뒤이은 72시간에 걸쳐 치사율이 기록된다. 희석물은, 가장 많이 농축된 희석물이 주입받은 마우스의 약 80%의 치사율을 나타내고 가장 낮은 농도의 희석물이 주입받은 마우스의 20% 이하의 치사율이 되도록 제조된다. 치사율 감소 범위가 단조로운 희석물이 적어도 네개가 되어야 한다. 단조로운 감소 범위는 80% 이상의 치사율과 함께 개시된다. 넷 이상의 단조로운 감소율 내에서, 가장 큰 두 비율 및 가장 작은 두 비율들이 감소되어야 한다(즉, 등가가 아니다). 마우스의 50%가 주입 관찰 기간 후 3일 이내에 사망하는 희석물은 보툴리눔 독소의 일 단위(1U)를 포함하는 희석물로 정의된다.

유의적으로, 이 APF 프로세스는, 적어도: (1) 세포 뱅크 바이알 익힌 고기 배지를 APF 배지로대체하고; (2) 혈액 아가 콜로니 선택 단계를 없애고; (3) 연이은 카제인 배지 계 튜브 성장 단계를 없애고; (4) 비-APF 발효 배지를 APF 배지로 완전히 대체함으로써 실시예 6의 비-APF 프로세스와 상이하다.

도 2는 산업 규모(비-APF) Schantz 프로세스(실시예 6) 및 실시예 7의 산업 규모의 APF 프로세스 간의 세포 뱅크 형성, 배양 및 발효 단계를 통한 차이를 요약해 나타낸다. 도 2는 채취 및 정제 단계는 생략한다.

APF 배지는 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아에 대해 선별하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 실시예 6 및 실시예 7의 초기 배양 단계의 동시 실행으로, APF 배지 내 또는 상의 보툴리눔 독소의 성장 및 생산에 도움이 되는 특성을 갖는 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 분리 및 성장시킬 수 있다. 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아의 비-APF 배지로부터 APF 배지로의 이동은, 새로운 환경에 적합화될 수 있는 박테리아를 풍부하게 하고 선택하거나 새로운 환경에서 성장 및 생산될 수 없는 박테리아를 선택적으로 소멸시킨다.

본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 특허 및/또는 인용문헌은, 그 내용 전체가 본 명세서에 참조로 병합되어 있다.

본 발명을 특정한 바람직한 방법들과 관련하여 자세히 설명하였으나, 본 발명의 범주를 벗어나지 않는 한 다른 실시형태, 변형 및 수정이 가능한 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 광범위하게 다양한 동물 산물이 없는 시스템 및 프로세스가 본 발명의 범주에 속한다.

따라서, 하기 청구의 범위의 진의 및 범주는 상기한 바람직한 실시형태의 설명에 제한되어서는 안된다.

Claims

(a) 동물 유래 산물이 실질적으로 없고 약 4-8 중량%의 콩 유도체를 포함하는 발효 배지를 제공하는 단계;

(b) 보툴리눔 독소의 생성이 가능한 조건 하에 상기 발효배지 중에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시키는 단계, 및;

(c) 상기 발효배지로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 회수하는 단계를 포함하는, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 얻기 위한 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 발효배지가 약 0-3 중량%의 효모 추출물을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 발효배지가 약 1-2 중량%의 글루코오스를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 발효 단계가 약 5.0 내지 5.5의 pH에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 발효 단계가 약 45시간 내지 75시간동안 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 발효 단계가 약 33 내지 36℃의 온도에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 발효 단계가 혐기성 대기 중에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 발효 배지를 제공하는 단계 전에, 동물 유래 산물이 실질적으로 없으며 약 4-8 중량%의 콩 유도체를 포함하는 배양 배지를 얻고, 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 그 배양배지 중에서 배양하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 회수 단계가 동물 단백질이 없는(APF) 정제 프로세스인 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 동물 유래 산물이 실질적으로 없으며 약 4-8 중량%의 콩 유도체를 포함하는 배양 배지를 얻고 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 그 배양 배지 내에서 배양하는 단계;

(b) (i) 약 4-8 중량%의 콩 유도체,

(ii) 약 0-3 중량%의 효모 추출물,

(iii) 약 1-2 중량%의 글루코오스를 포함하며, 동물 유래 산물이 실질적으로 없는 발효 배지를 제공하는 단계;

(c) (i) 초기 세포 성장 후에 약 5.0 내지 5.5의 pH에서 발효단계를 실시하고,

(ii) 약 45 시간 내지 75시간 동안 발효단계를 실시하고,

(iii) 약 33 내지 36℃의 온도에서 발효단계를 실시하고,

(iv) 혐기성 대기에서 발효단계를 실시하는 것을 포함하는 보툴리눔 독소의 생성이 가능한 조건 하에, 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 상기 발효 배지 중에서 발효시키는 단계; 및

(d) 상기 발효 배지로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 회수하는, APF 정제 프로세스의 회수단계를 포함하는, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 얻기 위한 방법.
동물 유래 산물이 실질적으로 없으며 식물로부터 유래한 단백질 산물을 포함하는 보툴리눔 독소를 배양하거나 발효시키기 위한 배지.
제 11 항에 있어서, 약 4-8 중량%의 콩 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
제 11 항에 있어서, 약 0-3 중량%의 효모 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
제 11 항에 있어서, 약 1-2 중량%의 글루코오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 배지.
동물 유래 산물이 실질적으로 없으며,

(a) 약 4-8 중량%의 콩 유도체;

(b) 약 0-3 중량%의 효모 추출물, 및;

(c) 약 1-2 중량%의 글루코오스를 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 배양 및/또는 발효시키기 위한 배지.
(a) (i) 동물 유래 산물이 실질적으로 없는 발효 배지를 제공하고;

(ii) 보툴리눔 독소를 생성할 수 있는 조건 하에 상기 발효 배지중에 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하고;

(iii) 상기 발효 배지로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 회수하여생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 얻는 단계; 및

(b) 적합한 부형제와 함께 보툴리눔 독소를 조성하여, 동물 유래 산물이 실질적으로 없으며 활성성분이 보툴리눔 독소인 약제학적 조성물을 제조하는 단계를 포함하는, 동물 산물이 실질적으로 없는 활성 성분이 보툴리눔 독소인 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
(a) 동물 유래 산물이 실질적으로 없으며 약 4-8 중량%의 콩 유도체를 포함하는 발효 배지를 제공하는 단계;

(b) 초기 세포 성당 후에 pH 5.0 내지 5.5의 pH에서 상기 발효배지를 유지하여 상기 발효배지 중에서 클로스트리디움 보툴리눔 박테리아를 발효시키는 단계; 및

(c) 상기 발효배지로부터 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 회수하는 단계를 포함하는, 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소를 얻기 위한 방법.