CN1858060B - 固相多肽合成依非巴特的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固相多肽合成依非巴特的制备方法，包括如下步骤：(1)以RinkAmide树脂、Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸，最后一个肽链使用S-苄基巯基丙酸(Map(SBz1))；(2)然后加入切肽试剂(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT)切肽；(3)以***为溶剂，沉淀并收集还原型依非巴特粗品；(4)将还原型依非巴特粗品溶于水中，用氨水调节PH到7.5-10.0，通空气氧化，收集氧化型依非巴特粗品；(5)将收集的粗品通过C18柱分离纯化，获得目标产物。本发明的优点是采用Rink Amide MBHA树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸的方法，接肽收率高。选用Fmoc-Har(Pbf)-OH，原料来源方便，每步接肽收率均在99％以上，切肽后收率为：95.4％，总收率为：23％。由此可见，本发明的方法便于工业化实施，具有较大的产业化前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种依非巴特的制备方法，具体涉及固相多肽合成依非巴特的制备方法。
背景技术
依非巴特，英文名为Eptifibatide，结构式为：
分子式为C35H49N11O9S2
依非巴特在临床上为一种可以静注的特异性GP II b/IIIa受体拮抗剂。通过阻止纤维原与GP II b/IIIa受体结合，从而抑制血小板聚集和防止血栓形成，临床上本品作为肝素或阿司匹林的辅助用药。
依菲巴特为人工合成的环状七肽，是血小板糖蛋白GP II b/IIIa受体拮抗剂，可阻断由各种激活剂引起的血小板聚集反应，是已知最强的特异性血小板聚集抑制剂，主要用于防止心肌供氧动脉闭塞，心脏病发作，不稳定性心绞痛、无Q波心肌梗塞、冠脉介入治疗引起的猝死。
该品种由美国COR Therapeutics公司开发，于1998年由COR Therapeutics公司与Schering-Plough公司合作使其在美国上市，商品名Integrelin。
中国专利申请号02145292.X公开了一种依菲巴特的制备方法，以Fmoc-Rink AmideAM树脂为启始原料，第五个保护氨酸为S-三苯基巯基丙酰-N，N-二叔丁氧羰基-高精氨酸，原料来源困难，不容易制备，推广应用有困难。存在着使用剧毒、腐蚀性试剂的缺陷。
发明内容
本发明的目的是公开一种固相多肽合成依非巴特的制备方法，以克服现有技术存在的缺陷。
本发明的方法包括如下步骤：
(1)以Rink Amide树脂、Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸，最后一个肽链使用S-苄基巯基丙酸(Map(SBzl))；
所说的Rink Amide树脂、Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂为一种常用的氨基树脂，可采用市售产品，如天津南开和成科技有限公司牌号为HC RAm04-1的产品；
(2)然后加入切肽试剂(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT)切肽；
(3)以***为溶剂，沉淀并收集还原型依非巴特粗品(MW＝833.96)；
(4)将还原型依非巴特粗品溶于水中，用氨水调节PH到7.5-10.0，通空气氧化，收集氧化型依非巴特粗品；
(5)将收集的粗品通过C18柱分离纯化，获得目标产物。总收率可达到23％以上。
按照本发明，以Rink Amide树脂、Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸，最后一个肽链使用S-苄基巯基丙酸(Map(SBzl))的方法包括如下步骤：
Rink Amide树脂、Rink Amide MBHA树脂或Rink Amide AM树脂
→Fmoc-Cys-树脂→Fmoc-Pro-Cys-树脂
→Fmoc-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys-树脂
→Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys-树脂
→Fmoc-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys-树脂
→Map(SBzl)-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys-树脂。
更为具体的包括如下步骤：
(1)树脂的预处理：将Rink Amide树脂、Rink Amide MBHA树脂或Rink AmideAM树脂，用DMF浸泡使树脂充分溶胀，氮气吹干，加入六氢吡啶的DMF溶液，10～35℃反应20～40分钟，氮气吹滤去除六氢吡啶，DMF洗涤，氮气吹干。
六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶∶DMF＝1∶3～5体积比；
六氢吡啶的DMF溶液中，Rink Amide MBHA树脂的浓度比为：1克/5～15ml。
(2)Fmoc-Cys(Trt)-树脂的制备：
将步骤(1)预处理的树脂与Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW：585.7)、TBTU(MW：321)、HOBT(MW：135.1)、NMM(MW＝101.2)和DMF混合，将混合物在20～35℃的条件下反应0.5～1.5小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；
NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比；
Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
然后加入六氢吡啶的DMF溶液，20～35℃反应20～40分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干，获得Fmoc-Cys(Trt)-树脂；
六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10～40％；
六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为：1克/5～15ml；
反应通式为：
应通式为：
(3)Fmoc-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备：
在步骤(2)的Fmoc-Cys(Trt)-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，20～35℃反应20～40分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干。加入Fmoc-Pro-OH(MW：337.4)、TBTU(MW：321)、HOBT(MW：135.1)、NMM(MW＝101.2)和DMF混合，20～35℃反应0.5～2小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Pro-Cys(Trt)-树脂；
NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比；
反应体系中：
Fmoc-Pro-OH的摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10～40％；
六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为：1克/5～15ml；
反应通式为：
(4)Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备：
在步骤(3)的Fmoc-Pro-Cys(Trt)-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，20～35℃反应20～40分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干。加入Fmoc-Trp-OH(MW：426.5)、TBTU(MW：321)、HOBT(MW：135.1)、NMM(MW＝101.2)和DMF混合，20～35℃反应0.5～2小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂；
NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比；
反应体系中：
Fmoc-Trp-OH的摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10～40％；
六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为：1克/5～15ml；
反应通式为：
(5)Fmoc-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备
在步骤(4)的Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，20～35℃反应20～40分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干。加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH(MW：411.5)、TBTU MW：321)、HOBT(MW：135.1)、NMM(MW＝101.2)和DMF混合，将混合物20～35℃反应0.5～2小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂；
NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比；
反应体系中：
Fmoc-Asp(OtBu)-OH的摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍
六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10～40％；
六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为：1克/5～15ml；
反应通式为：
(6)Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备
在步骤(5)的Fmoc-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，20～35℃反应20～40分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干。加入Fmoc-Gly-OH(MW：297.3)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，将混合物20～35℃反应0.5～2小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂；
NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比；
反应体系中：
Fmoc-Gly-OH的摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10～40％；
六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为：1克/5～15ml；
反应通式为：
(7)Fmoc-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备
在步骤(6)的Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，20～35℃反应20～40分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干。加入Fmoc-Har(Pbf)-OH(MW：662.8)、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，将混合物20～35℃反应0.5～2小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂；
NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比；
反应体系中：
Fmoc-Har(Pbf)-OH的摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
六氢吡啶的DMF溶液中，六氢吡啶的体积浓度为10～40％；
六氢吡啶的DMF溶液中，树脂的重量的体积浓度为：1克/5～15ml；
反应通式为：
(8)Map(SBzl)-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备
在步骤(7)的Fmoc-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，20～35℃反应20～40分钟，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干。加入Map(SBzl)-OH(MW：196)、TBTU、HOBT、NMM和DMF，将混合物20～35℃反应0.5～2小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；
NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比；
反应体系中：
Map(SBzl)的摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
TBTU摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
HOBT摩尔数为树脂摩尔数的2-6倍；
甲醇洗涤，抽干，氮气吹干，得保护还原型依非巴特树脂；
(8)切肽
将切肽试剂加入保护的依非巴特树脂，20～35℃反应2～4小时，过滤，抽干，滤液加***沉淀，过滤收集沉淀得还原型依非巴特粗品(MW＝833.96)，收率为96％；
所说的切肽试剂为
TFA/HBr/HAc/TIS/EDT＝800-900ml/25-40ml/5-20ml/40-60ml/20-30ml)；
反应通式为：
(9)氧化(二硫键的形成)
将还原型依非巴特粗品溶于水中，加入浓度为0.1～1.5mol/L的氨水，调节pH到7.5-10.0，通空气15～30小时氧化，过滤；
反应通式为：
(10)纯化
滤液流经C18柱进行纯化，流动相：0.1MNH4Ac∶乙腈(85∶15)；流速为：200-400ml/min；用HPLC跟踪收集所需要的流出液。样品峰合并后，采用常规的方法去盐、除乙腈、冻干，约得白色疏松块状物成品(MW：831.96)；总收率约23％(以Rink Amide-树脂的61.9mmol计)。
S-苄基巯基丙酸(Map(SBzl)的制备：
将巯基丙酸300克及1000毫升蒸馏水，加入3000毫升的三颈瓶内，加浓氨水至pH8以上，用冰水浴冷却至10℃，猛烈搅拌。2小时内滴加300毫升氯化苄，保持pH9左右，继续在室温搅拌2小时，过滤，用蒸馏水洗涤，然后取出固体，置于烧杯内用蒸馏水研洗后过滤，再用95％乙醇洗涤，干燥后得约300克S-苄基巯基丙酸(Map(SBzl))。
由上述公开的技术方案可见，本发明的方法，采用Rink Amide MBHA树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸的方法，接肽收率高。选用Fmoc-Har(Pbf)-OH，原料来源方便，最后一个肽链使用S-苄基巯基丙酸(Map(SBzl))，简化了工艺，降低了成本；采用切肽试剂(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT)进行切肽，加入***沉淀粗品的方法，避免使用氟化氢等剧毒试剂，三废污染少，且提高收率，采用C18柱进行分离纯化，避免使用TFA(三氟醋酸)进行纯化，减少三废，纯化收率高达25％以上，每步接肽收率均在99％以上；切肽后收率为：95.4％，总收率为：23％。由此可见，本发明的方法便于工业化实施，具有较大的产业化前景。
具体实施方式：
实施例和前述过程中所采用的原料列表如下
实施例1
肽链制备：
称取Rink Amide MBHA树脂72克(150目，0.86mmol/g，61.9mmol)，装入专用的反应器中，开启合成仪总电源，打开工作站，调用事先编著的接肽程序，用800mlDMF浸泡，使树脂充分溶胀，氮气吹干。加入800毫升20％六氢吡啶的DMF溶液，25℃振摇35分钟。氮气吹滤去六氢吡啶，分别用DMF、洗涤三次，氮气吹干。
Fmoc-Cys(Trt)-树脂的制备：
加Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW：585.7，树脂摩尔数的2-6倍)108.9g，TBTU(MW：321，树脂摩尔数的2-6倍)59.7g，HOBT(MW：135.1，树脂摩尔数的2-6倍)25.1g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤三次，氮气吹干。
加入500毫升20％六氢吡啶的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干，用DMF洗涤五次，氮气吹干。
Fmoc-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备：
Fmoc-Pro-OH(MW：337.4，树脂摩尔数的2-6倍)62.8g，TBTU(MW：321，树脂摩尔数的2-6倍)59.7g，HOBT(MW：135.1，树脂摩尔数的2-6倍)25.1g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤三次，氮气吹干。
加入500毫升20％六氢吡啶的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干，用DMF洗涤五次，氮气吹干。
Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备：
加Fmoc-Trp-OH(MW：426.5，树脂摩尔数的2-6倍)79.3g，TBTU(MW：321，树脂摩尔数的2-6倍)59.7g，HOBT(MW：135.1，树脂摩尔数的2-6倍)25.1g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400ml DMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤三次，氮气吹干。
加入500毫升20％六氢吡啶的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干，用DMF洗涤五次，氮气吹干。
Fmoc-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备：
加Fmoc-Asp(OtBu)-OH(MW：411.5，树脂摩尔数的2-6倍)76.5g TBT(MW：321，树脂摩尔数的2-6倍)59.7g，HOBT(MW：135.1，树脂摩尔数的2-6倍)25.1g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤三次，氮气吹干。
加入500毫升20％六氢吡啶的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干，用DMF洗涤五次，氮气吹干。
Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备：
加Fmoc-Gly-OH(MW：297.3，树脂摩尔数的2-6倍)55.3g、TBTU(MW：321，树脂摩尔数的2-6倍)59.7g，HOBT(MW：135.1，树脂摩尔数的2-6倍)25.1g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤三次，氮气吹干。
加入500毫升20％六氢吡啶的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干，用DMF洗涤五次，氮气吹干。
Fmoc-Har(pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备：
加Fmoc-Har(Pbf)-OH(662.8，树脂摩尔数的2-6倍)123.3g、TBTU(MW：321，树脂摩尔数的2-6倍)59.7g，HOBT(MW：135.1，树脂摩尔数的2-6倍)25.1g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤三次，氮气吹干。
加入500毫升20％六氢吡啶的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干，用DMF洗涤五次，氮气吹干。
Map(SBzl)-Har(Pbf)-Cly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备：
加Map(SBzl)-OH(MW：196，树脂摩尔数的2-6倍)36.5g、TBTU(MW：321，树脂摩尔数的2-6倍)59.7g，HOBT(MW：135.1，树脂摩尔数的2-6倍)25.1g，NMM 41.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤三次，氮气吹干。
再用无水甲醇洗涤三次。抽干后，放入真空氮气吹干器中氮气吹干，称重，得保护依非巴特树脂约97g。
切肽：
取97g保护的依非巴特树脂转移到切肽瓶中，冷却下，边搅拌边加入切肽试剂：(TFA/HBr/HAc/TIS/EDT＝850ml/34ml/11ml/51ml/25ml)，25℃搅拌3小时。过滤，抽干，滤液加无水***沉淀，过滤收集沉淀得约37g还原型依非巴特粗品(MW＝833.96，44.4mmol)，收率为95.4％。
氧化(二硫键的形成)：
将37g还原型依非巴特粗品溶于40L纯化水中，在搅拌下缓慢加入1mol/L氨水，调节PH到8，通空气，搅拌24小时，过滤。
纯化：
滤液经C18柱纯化，流动相：0.1MNH4Ac∶乙腈(85∶15)；流速为：300ml/min；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液。样品峰合并后去盐、除乙腈、冻干，约得11.8g白色疏松块状物成品(MW：831.96，14.2mmol)；总收率约23％(以Rink Amide-树脂的61.9mmol计)。
Claims (5)
1.一种固相多肽合成依非巴特的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以Rink Amide MBHA树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸，最后接上S-苄基巯基丙酸；
(2)然后加入切肽试剂TFA/HBr/HAc/TIS/EDT切肽；
(3)以***为溶剂，沉淀并收集还原型依非巴特粗品；
(4)将还原型依非巴特粗品溶于水中，用氨水调节pH到7.5-10.0，通空气氧化，收集氧化型依非巴特粗品；
(5)将收集的粗品通过C18柱分离纯化，获得目标产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)树脂的预处理：将Rink Amide MBHA树脂，用DMF浸泡使树脂充分溶胀，氮气吹干，加入六氢吡啶的DMF溶液，10～35℃反应20～40分钟，氮气吹滤去除六氢吡啶，DMF洗涤，氮气吹干；
(2)Fmoc-Cys(Trt)-树脂的制备：
将步骤(1)的树脂与Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反应0.5～1.5小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Cys(Trt)-树脂；
(3)Fmoc-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备：
在步骤(2)的Fmoc-Cys(Trt)-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，20～35℃反应20～40分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干；加入Fmoc-Pro-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反应0.5～2小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Pro-Cys(Trt)-树脂；
反应通式为：
(4)Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备：
在步骤(3)的Fmoc-Pro-Cys(Trt)-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，20～35℃反应20～40分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干；加入Fmoc-Trp-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反应0.5～2小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂；
反应通式为：
(5)Fmoc-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备
在步骤(4)的Fmoc-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，20～35℃反应20～40分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干；加Fmoc-Asp(OtBu)-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反应0.5～2小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂；
反应通式为：
(6)Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备
在步骤(5)的Fmoc-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂中、加入六氢吡啶的DMF溶液，20～35℃反应20～40分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干；加入Fmoc-Gly-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，反应0.5～2小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂；
反应通式为：
(7)Fmoc-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备
在步骤(6)的Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，反应20～40分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干；加入Fmoc-Har(Pbf)-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF混合，将混合物20～35℃反应0.5～2小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干；获得Fmoc-Har(pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂；
反应通式为：
(8)Map(SBzl)-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂的制备
在步骤(7)的Fmoc-Har(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Trp-Pro-Cys(Trt)-树脂中，加入六氢吡啶的DMF溶液，反应20～40分钟，氮气吹干，用DMF洗涤，氮气吹干；加入Map(SBzl)-OH、TBTU、HOBT、NMM和DMF，反应0.5～2小时，氮气吹干，DMF洗涤，氮气吹干，甲醇洗涤，氮气吹干，获得带保护基的还原型依非巴特树脂；
(9)切肽
将切肽试剂加入保护的还原型依非巴特树脂，反应2～4小时，过滤，抽干，滤液加***沉淀，过滤收集沉淀得还原型依非巴特粗品；
所说的切肽试剂为TFA/HBr/HAc/TIS/EDT的混合物；
反应通式为：
(10)氧化
将还原型依非巴特粗品溶于水中，加入氨水，调节pH到7.5-10.0，通空气15～30小时氧化，以HPLC跟踪反应进程；
反应通式为：
(11)纯化
滤液流经C18柱进行纯化，流动相为0.1M NH4Ac和乙腈；流速为：200～800ml/min；收集所需要的流出液，采用常规的方法去盐、除乙腈、冻干，得成品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(11)中，流动相为0.1M NH4Ac∶乙腈＝75～85∶25～15，体积比。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所说的切肽试剂的比例为TFA/HBr/HAc/TIS/EDT＝850ml/34ml/11ml/51ml/25ml。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，切肽温度为20～35℃。
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