CN1911955A - 一种乌骨鸡活性肽的制备方法 - Google Patents

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一种乌骨鸡活性肽的制备方法，它是以乌骨鸡为原料，通过先进的酶解和膜分离技术，制得肽含量高、分子量小于6000Da、易于被人体吸收的活性肽，它具有抗疲劳、补血、提高免疫等生物活性，尤其适合于各类虚症人群的滋补和治疗，同时制备工艺科学合理，环保无污染，分离过程为常温操作，节省能源，操作简便易行，效率高，适合于工业化生产。

Description

一种乌骨鸡活性肽的制备方法
                        技术领域
本发明涉及一种乌骨鸡活性肽的制备方法。
                        背景技术
乌骨鸡是我国长期饲养的特有药用保健鸡种，乌骨鸡作为传统中药，既可配药入复方，又可单独食用，具有补肝肾、益气血、退虚热、治心腹痛等功效。也常用于年老体衰及体质虚弱、营养不良、肝炎、糖尿病、腹泻、贫血、久泻、久痢等病，均有明显疗效。乌骨鸡对各类虚症，如气虚、血虚、脾虚、肾虚、心虚等均有较好疗效。对于小儿体质虚弱，年老体衰，特别是妇科诸症，尤为有效。食用者自觉体力充沛、精力旺盛、睡眠良好、工作效率提高、各种症候减轻；乌骨鸡的主要营养和功效成分为乌骨鸡的蛋白质，乌骨鸡蛋白质在被人体摄入后，经体内各种蛋白酶水解成游离氨基酸和小分子肽后被人体吸收，发挥各种营养和活性作用，由于人的个体差异，乌骨鸡的蛋白质的消化率和吸收利用率各不相同。现代科学研究证实：小分子肽比氨基酸具有更高的生物活性和营养价值，且小分子肽可以通过肠道全部吸收和利用，直接经血液循环转运至全身各器官和组织而发挥生物活性功能。故此将乌骨鸡蛋白质经酶解制备成具有活性功能的小分子肽，将提高乌骨鸡的营养和药用价值。
目前乌骨鸡已被广泛开发为药品和保健食品，如乌鸡白风丸(片、口服液)，乌鸡补酒等。这些产品对乌骨鸡的处理，大多是水煮或酸，蛋白酶水解，对水解产物与水解程度缺乏控制，有的则将乌骨鸡蛋白完全水解成游离氨基酸。目前现有的公开专利技术和非专利文献也均未涉及采用蛋白酶酶解和膜分离技术专门制备乌骨鸡活性肽的方法，例如：授权公开号为CN1168394C的《一种乌鸡营养成分的提取工艺》采用先水煮乌鸡，后木瓜蛋白酶水解，再用虫蜡脱油技术制备的营养液，该营养液中既存有大量游离氨基酸也有分子量范围不明的蛋白质和肽。与此性质类似的专利文献有：公开号为CN1640416A的《乌鸡补血液》，申请号为CN93104579.7的《乌鸡口服液》。而本发明则是一种以乌骨鸡蛋白为底物，采用蛋白酶酶解和膜分离技术专门制备乌骨鸡活性肽的方法。本发明涉及的蛋白酶酶解是一些经优化的酶解方案。
                        发明内容
本发明的目的在于提供一种乌骨鸡活性肽的制备方法，制备的乌骨鸡活性肽肽含量高、分子量小于6000Da、易于被人体吸收。
本发明的技术方案为：以乌骨鸡为原料经蛋白酶解、膜分离技术制备一种乌骨鸡活性肽，主要成分为蛋白质，肽含量为50％以上，乌骨鸡活性肽分子量小于6000Da。其特征在于工艺步骤为：(A)乌骨鸡经宰杀、脱毛、去内脏、头、爪后破碎、打浆成肉糜；或乌骨鸡经宰杀后的脱骨鸡肉打浆成肉糜。(B)将上述肉糜，加入1.5至10倍量的水搅拌均匀后，升温至75～90℃保温20～30分钟，再调整温度至35℃-75℃，调PH值6-9，加入枯草杆菌中性蛋白酶或风味蛋白酶或复合蛋白酶或木瓜蛋白酶进行酶解；蛋白酶用量为肉糜所含蛋白质重量的0.2～1.5％，酶解时间为1～9小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为85-100℃，灭酶时间10-30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至20℃-80℃，除去上层脂肪，取酶解液经离心过滤或板框压滤机初滤，滤材为纯绵帆布或尼龙滤布，再经无机陶瓷膜或有机膜精滤，精滤后再经有机复合膜超滤、纳滤，截留收获分子量为150～6000Da的肽，再浓缩、干燥即得。
作为一种优选方案，步骤B中酶解液精滤为：滤液用无机陶瓷膜或有机膜微滤除去杂蛋白、筋膜碎片，其特征在于无机陶瓷膜材质为氧化铝、氧化锆或氧化锑，截留粒子范围为0.05～1μm。有机膜材质为聚砜、醋酸纤维、聚四氟乙烯或聚丙烯类等有机高分子材料，截留粒子范围为0.05～1μm。
作为一种优选方案，步骤B中酶解液超滤为：滤液用有机复合膜截留收获分子量小于6000Da的肽。其特征在于有机复合膜材质为芳香聚酰胺、聚哌嗪酰胺类或聚醚砜类，截留分子量范围为小于6000Da。
作为一种优选方案，步骤B中酶解液纳滤为：滤液用有机复合膜截留收获分子量小于6000Da的肽后，再经纳滤除去大部分水分、游离氨基酸，其特征在于有机复合膜材质为芳香聚酰胺、聚哌嗪酰胺类或聚醚砜类，截留分子量范围为150-1000Da。
作为一种优选方案，步骤B中的干燥为真空干燥或喷雾干燥或冷冻干燥；喷雾干燥时，设备进口热风温度为85℃～130℃，出风口温度为30℃～75℃。
本发明的优点是：乌骨鸡活性肽肽含量高、分子量小于6000Da、易于被人体吸收，并具有抗疲劳、补血、提高免疫力等生物活性，制备工艺科学合理，环保无污染，分离过程为常温操作，节省能源，操作简便易行，效率高，适合于工业化生产。
根据制备方法的不同，我们选择采用本发明的制备方法和其他方法制备的乌骨鸡活性肽进行活性实验对比，活性对比实验如下：
1.抗疲劳功能实验
取昆明种小鼠45只，体重18～22g，雌雄各半，随机分为3组，给药组取本发明制备所得乌骨鸡活性肽灌胃给药7天，剂量为1.24g/kg体重，生理盐水对照组灌胃以给药组同等体积的生理盐水，其他制备方法组为剂量相同的蛋白酶水解后所制备的乌骨鸡活性肽，每天一次，于末次给药30min后将小鼠尾根部负荷7％体重的铅丝，放入水温20±0.5℃、水深20cm的玻璃缸内游泳，并开始计时。当小鼠头部沉入水中10s不能浮出水面者即为体力耗竭，计为小鼠游泳时间。结果见表1。结果表明本发明所制备的乌骨鸡活性肽能更显著地延长小鼠游泳时间，说明本发明所制备的乌骨鸡活性肽有更为明显的抗疲劳作用。
          表1乌骨鸡多肽对小鼠游泳时间的影响
组别   动物数(只) 游泳时间(min)
  生理盐水组乌骨鸡活性肽组(其他制备方法)乌骨鸡活性肽组(本发明制备方法)     151515     101±24140±31**171±33**
与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01
2.补血功能实验
取小鼠60只，均分为4组，分别为空白对照组、模型组，乌骨鸡活性肽给药组(其他制备方法)、乌骨鸡活性肽给药组(本发明制备方法)。每日灌胃以乌骨鸡活性肽1.24g/kg。正常对照组与模型组小鼠给予同等容量生理盐水。模型组及乌骨鸡活性肽组小鼠分别于给药第3日、6日皮下注射乙酰苯肼20mg/kg，40mg/kg，从第5日起，每日腹腔注射环磷酰胺40mg/kg，连续四日。正常对照组小鼠同时注射等容量生理盐水。于末次给药1.5h后眼眶后静脉取血，测定红细胞数和血红蛋白含量。结果见表2。结果表明乌骨鸡活性肽能显著增加血虚模型组小鼠红细胞数和血红蛋白含量，有补血作用。同时也可以看出比较之下本发明方法制备的乌骨鸡活性肽能更好的起到补血的作用。
         表2乌骨鸡活性肽对血虚模型小鼠红细胞数和血红蛋白含量的影响
组别   动物数(只) Hb(g/L) RBC(×1012/L)
生理盐水组模型组乌骨鸡活性肽组(其他制备方法)乌骨鸡活性肽(本发明制备方法)     15151515   160.7±8.2**134.7±19.0149.2±15.52*159.9±6.7**   9.54±0.67**6.01±0.696.71±0.89*7.24±0.85**
与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01
3.增强免疫功能实验
取昆明种小鼠45只，体重11～15g，雌雄各半，随机分为3组，分别为生理盐水组，乌骨鸡活性肽给药组(其他制备方法)、乌骨鸡活性肽给药组(本发明制备方法)。灌胃给药7天，剂量为1.24g/kg体重，生理盐水对照组灌胃以给药组同等体积的生理盐水，每天一次，于末次给药后24小时，颈椎脱位处死，称体重，摘出胸腺及脾脏称重，以胸腺或脾脏重量与体重之比作胸腺或脾指数。结果见表3。结果表明乌骨鸡活性肽能显著增加小鼠胸腺指数和脾指数，有增强小鼠免疫功能作用。同时也可以看出比较之下本发明方法制备的乌骨鸡活性肽具有更好的增强小鼠免疫功能的作用。
             表3乌骨鸡活性肽对小鼠免疫器官重量的影响( x±SD)
组别 动物数(只) 胸腺指数 脾指数
生理盐水组乌骨鸡活性肽组(其他制备方法)乌骨鸡活性肽(本发明制备方法)     151515 4.22±0.455.08±0.9*5.16±0.6** 5.76±0.846.61±0.81*6.73±0.91*
与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01
                     具体实施方式
实施例1
取乌骨鸡50公斤、宰杀、脱毛、去内脏、头、爪后破碎、打浆成肉糜。
将将上述肉糜，加入2倍量的水搅拌均匀后，升温85℃保温25分钟，再调整并维持温度至45±1℃，调PH值6.9，此时混合物中含蛋白质约1 3公斤，底物浓度为8.7％，加入诺维信产中性蛋白酶200g进行酶解；酶解时间为4小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为85℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至30℃，分离除去上层脂肪，取酶解液经离心过滤初滤，滤材为纯绵帆布，再经截留粒径0.1μm的氧化锆陶瓷膜精滤，滤过压0.15Mpa，滤液再经截留分子量小于6000Da的聚醚砜类有机复合膜超滤，滤过压0.15Mpa，截留收获分子量为小于6000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为90℃，出风口温度为35℃。
上述干燥步骤完成后制得乌骨鸡活性肽成品10.6公斤(收率81.5％)，肽含量为70.6％，蛋白质分子量小于6000Da。
实施例2
取乌骨鸡50公斤，预处理，酶解工艺，初滤，精滤，超滤工艺同实施例1。超滤后的酶解液再经截留分子量范围300-1000Da的聚酰胺类有机复合膜纳滤，滤过压0.15～0.45Mpa，截留收获分子量为小于1000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为90℃，出风口温度为35℃。
上述干燥步骤完成后制得乌骨鸡活性肽成品6.8公斤(收率52.3％)，肽含量为95％，蛋白质分子量小于1000Da。
实施例3
取乌骨鸡50公斤、宰杀、脱毛、去内脏、头、爪后破碎、打浆成肉糜。
将将上述肉糜，加入4倍量的水搅拌均匀后，升温85℃保温20分钟，再调整并维持温度至55±1℃，调PH值7.5，此时混合物中含蛋白质约13公斤，底物浓度为5.2％，加入诺维信产风味蛋白酶200g进行酶解；酶解时间为4小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为90℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至30℃，分除上层脂肪，取酶解液经板框压滤机初滤，滤材为尼龙滤布，再经截留粒径0.1μm的氧化锆陶瓷膜精滤，滤过压0.15Mpa，滤液再经截留分子量小于6000Da的聚醚砜类有机复合膜超滤，滤过压0.2Mpa，截留收获分子量为小于6000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为95℃，出风口温度为35℃。
上述干燥步骤完成后制得乌骨鸡活性肽成品11.4公斤(收率87.7％)，肽含量为73.6％，蛋白质分子量小于6000Da。
实施例4
取乌骨鸡50公斤，预处理，酶解工艺，初滤，精滤，超滤工艺同实施例3。超滤后的酶解液再经截留分子量范围300-1000Da的聚酰胺类有机复合膜纳滤，滤过压0.3Mpa，截留收获分子量为小于1000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为95℃，出风口温度为35℃。
上述干燥步骤完成后制得乌骨鸡活性肽成品7.8公斤(收率60％)，肽含量为95％，蛋白质分子量小于1000Da。
实施例5
取乌骨鸡50公斤、宰杀、脱毛、去内脏、头、爪后破碎、打浆成肉糜。
将将上述肉糜，加入3倍量的水搅拌均匀后，升温85℃保温28分钟，再调整并维持温度至55±1℃，调PH值6.5，此时混合物中含蛋白质约13公斤，底物浓度为6.5％，加入木瓜蛋白酶250g进行酶解；酶解时间为6.5小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为88℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至30℃，除去上层脂肪，取酶解液经板框压滤机初滤，滤材为纯绵帆布，再经截留粒径0.1μm的氧化锆陶瓷膜精滤，滤过压0.15Mpa，滤液再经截留分子量小于6000Da的聚醚砜类有机复合膜超滤，滤过压0.18Mpa，截留收获分子量为小于6000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为95℃，出风口温度为35℃。
上述干燥步骤完成后制得乌骨鸡活性肽成品10.3公斤(收率79.2％)，肽含量为56.1％，蛋白质分子量小于6000Da。
实施例6
取乌骨鸡50公斤，预处理，酶解工艺，初滤，精滤，超滤工艺同实施例5。超滤后的酶解液再经截留分子量范围300-1000Da的聚酰胺类有机复合膜纳滤，滤过压0.4Mpa，截留收获分子量为小于1000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为95℃，出风口温度为35℃。
上述干燥步骤完成后制得乌骨鸡活性肽成品5.4公斤(收率41.5％)，肽含量为96％，蛋白质分子量小于1000Da。
实施例7
取乌骨鸡50公斤、宰杀、脱毛、去内脏、头、爪后破碎、打浆成肉糜。
将将上述肉糜，加入3倍量的水搅拌均匀后，升温85℃保温22分钟，再调整并维持温度至50±1℃，调PH值8，此时混合物中含蛋白质约13公斤，底物浓度为6.5％，加入诺维信复合蛋白酶180g进行酶解；酶解时间为7.5小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为90℃，灭酶时间30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至30℃，除去上层脂肪，取酶解液经板框压滤机初滤，滤材为尼龙滤布，再经截留粒径0.1μm的氧化锆陶瓷膜精滤，滤过压0.15Mpa，滤液再经截留分子量小于6000Da的聚醚砜类有机复合膜超滤，滤过压0.18Mpa，截留收获分子量为小于6000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为95℃，出风口温度为35℃。
上述干燥步骤完成后制得乌骨鸡活性肽成品8.7公斤(收率66.9％)，肽含量为64.7％，蛋白质分子量小于6000Da。
实施例8
取乌骨鸡50公斤，预处理，酶解工艺，初滤，精滤，超滤工艺同实施例7。超滤后的酶解液再经截留分子量范围300-1000Da的聚酰胺类有机复合膜纳滤，滤过压0.35Mpa，截留收获分子量为小于1000Da的肽液，然后浓缩、喷雾干燥，即得。喷雾干燥时，设备进口热风温度为95℃，出风口温度为35℃。
上述干燥步骤完成后制得乌骨鸡活性肽成品5.2公斤(收率40％)，肽含量为97％，蛋白质分子量小于1000Da。

Claims (5)

1、一种乌骨鸡活性肽的制备方法，其特征在于工艺步骤为：(A)乌骨鸡经宰杀、脱毛、去内脏、头、爪后破碎、打浆成肉糜；或乌骨鸡经宰杀后的脱骨鸡肉打浆成肉糜；(B)将上述肉糜，加入1.5至10倍量的水搅拌均匀后，升温至75～90℃保温20～30分钟，再调整温度至35℃-75℃，调PH值6-9，加入枯草杆菌中性蛋白酶或风味蛋白酶或复合蛋白酶或木瓜蛋白酶进行酶解；蛋白酶用量为肉糜所含蛋白质重量的0.2～1.5％，酶解时间为1～9小时；酶解后酶解液升温灭酶，灭酶温度为85-100℃，灭酶时间10-30分钟；灭酶后酶解液冷却降温至20℃-80℃，除去上层脂肪，取酶解液经离心过滤或板框压滤机初滤，滤材为纯绵帆布或尼龙滤布，再经无机陶瓷膜或有机膜精滤，精滤后再经有机复合膜超滤、钠滤，截留收获分子量为150～6000Da的肽，再浓缩、干燥即得。
2、如权利要求1所述的乌骨鸡活性肽的制备方法，其特征在于无机陶瓷膜的材质为氧化铝、氧化锆或氧化锑，截留粒子范围为0.05～1μm，有机膜的材质为聚砜、醋酸纤维、聚四氟乙烯或聚丙烯类有机高分子材料，截留粒子范围为0.05～1μm。
3、如权利要求1所述的乌骨鸡活性肽的制备方法，其特征在于超滤所用的有机复合膜材质为芳香聚酰胺、聚哌嗪酰胺类或聚醚砜类，截留分子量范围为小于6000Da。
4、如权利要求1所述的乌骨鸡活性肽的制备方法，其特征在于钠滤所用有机复合膜材质为芳香聚酰胺、聚哌嗪酰胺类或聚醚砜类，截留分子量范围为150-1000Da。
5、如权利要求1所述的乌骨鸡活性肽的制备方法，其特征在于干燥的方法为真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥；在喷雾干燥时，设备进口热风温度为85℃～130℃，出风口温度为30℃～75℃。
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