CN101573449B - 用于治疗慢性乙型肝炎的dna疫苗及其制备方法 - Google Patents

用于治疗慢性乙型肝炎的dna疫苗及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101573449B
CN101573449B CN2006800561033A CN200680056103A CN101573449B CN 101573449 B CN101573449 B CN 101573449B CN 2006800561033 A CN2006800561033 A CN 2006800561033A CN 200680056103 A CN200680056103 A CN 200680056103A CN 101573449 B CN101573449 B CN 101573449B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antigen
protein
hbv
gene
dna vaccination
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN2006800561033A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101573449A (zh
Inventor
成永喆
梁世涣
任世镇
李昌根
朴修形
宋万基
孙钟文
尹昇奎
金埰宁
金炳文
李圣熙
金源培
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
East-Asia Pharmaceutical Co Ltd
Dong A Pharmaceutical Co Ltd
Pohang University of Science and Technology Foundation POSTECH
Daewoong Pharmaceutical Co Ltd
Genexine Co Ltd
Original Assignee
East-Asia Pharmaceutical Co Ltd
Pohang University of Science and Technology Foundation POSTECH
Daewoong Pharmaceutical Co Ltd
Genexine Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by East-Asia Pharmaceutical Co Ltd, Pohang University of Science and Technology Foundation POSTECH, Daewoong Pharmaceutical Co Ltd, Genexine Co Ltd filed Critical East-Asia Pharmaceutical Co Ltd
Publication of CN101573449A publication Critical patent/CN101573449A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101573449B publication Critical patent/CN101573449B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/29—Hepatitis virus
    • A61K39/292—Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5434—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K2039/55527—Interleukins
    • A61K2039/55538—IL-12
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及用于治疗慢性乙型肝炎的DNA疫苗，其能有效地诱导对多重抗原特异的免疫应答，以及涉及用于制备DNA疫苗的方法，其中所述DNA疫苗包含编码乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、L蛋白质、核心以及聚合酶的抗原基因，并且优选进一步包含IL-12变体作为佐剂。所述疫苗的抗原基因通过密码子优化增强抗原的表达，并有效地诱导对所用抗原特异的抗体应答和细胞介导的免疫应答。因此，本发明的DNA疫苗能被有效用于治愈慢性乙型肝炎。

Description

用于治疗慢性乙型肝炎的DNA疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及用于治疗慢性乙型肝炎病毒的DNA疫苗，以及制备该DNA疫苗的方法。
背景技术
自从1966年第一次报道HBV(乙型肝炎病毒)，目前已知全世界超过3亿人感染HBV，并且大约5千万人新近感染HBV。世界范围内慢性乙型肝炎感染占肝癌患者的约80％，并且约75％的HBV病例被发现在亚洲国家。另外，HBV感染导致每四人中的一人患有严重的肝病，包括肝癌和死亡。HBV感染了大约5-8％的韩国人口。
在韩国，围产期间的母婴传播是HBV传播的主要来源。特别是，大约90％的被感染婴儿将发展成慢性HBV感染。
目前临床批准用于治疗慢性乙型肝炎的药物包括拉米夫定(lamivudine)以及α干扰素(IFN-α)。最近，阿德福韦(adefovir)和恩替卡韦(entecavir)已经被(美国)食品药品管理局(FDA)批准用于治疗慢性HBV感染。拉米夫定(商品名：Epivir-HBV；制造商：GlaxoSmithKline)是核苷类似物并且主要用于抑制HBV聚合酶的活性。在治疗期间，拉米夫定有效抑制病毒复制。不过，停止治疗后，大多数病人立即发生病毒反弹，导致肝损伤。拉米夫定的治疗有效性是暂时的，并且低至约20％。另外，拉米夫定的长期有效性受限于拉米夫定治疗期间HBV的YMDD突变体的出现，即，约24％在治疗一年后出现，约38％在治疗两年后出现，约54％在治疗三年后出现，以及约66％在治疗四年后出现，如Leung NW等人在Hepatology 2001，33：1527-1532的论文中所述。阿德福韦和恩替卡韦也作为HBV聚合酶的竞争性抑制剂。尽管阿德福韦和恩替卡韦展示出与拉米夫定基本相同的有效性水平，它们比拉米夫定具有小得多的抗药性HBV突变体的发生率，使得就抗药性而言治疗相对于拉米夫定得到改善(NEJM 2003，348：800；NEJM 2003，348：808)。然而，这些化学药物具有根本性的局限性，给药停止后，大多数病人的血清HBV DNA水平和丙氨酸转氨酶(ALT)水平可能再次增加。IFN-α(商品名：Intron-A；制造商：Schering-Plough)通常增大宿主的免疫应答，以此展示出诸如抑制HBV复制的疗效。然而，IFN-α可能导致严重的副作用，并且IFN-α的疗效仅为25-30％。因此，为了克服目前的治疗性药物的缺点，需要具有高安全性和有效性的新治疗药物。
许多最近的临床研究强调了CD4 T细胞免疫应答的重要性，如在Liver，1998，18：405；Vaccine.2001，19：2395中所述的，或CD8 T细胞免疫应答的重要性，如在J Exp Med.1995，181：1047；J Infect Dis.1993，168：1133中所述的，其更具效力，对多个抗原具有特异性(此后缩写为“多重特异性”)，用于慢性乙型肝炎患者的治疗和恢复。也就是说，从乙型肝炎自然恢复的患者显示多重特异的和持久的CD4和CD8 T细胞免疫应答，而慢性乙型肝炎患者显示出微弱的和临时的CD4和CD8 T细胞免疫应答，其仅针对一些HBV表位而诱导。另外，据报道，这些T细胞具有差的增殖能力和低的细胞因子合成能力。已经发现大约1-2％的慢性乙型肝炎患者自然治愈。慢性乙型肝炎的治疗标记物之一——HBsAg的血清转变之前，观察到细胞介导的免疫应答，因此细胞介导的免疫应答在慢性乙型肝炎的治疗中是重要的(J Hepatol，2006 2；[Epub ahead ofprint])。这些研究支持对能够诱导有效且多重特异性的细胞介导的免疫应答的治疗的需求，用于治疗乙型肝炎。
用于治疗乙型肝炎的首次尝试是使用表面抗原的重组蛋白质疫苗。在使用重组蛋白质疫苗治疗的最初6个月后，根据HBV DNA的消失和HBeAg血清转变的诱导，疫苗处理的组似乎被治愈。然而，用重组蛋白质疫苗治疗一年后，在重组蛋白质疫苗的有效性上，疫苗处理的组和安慰剂对照组之间没有差别(JHepatol，2001 34；917)。甚至当HBV大蛋白质被用作疫苗，既没有CD4 T细胞应答也没有抗原特异性CD8 T细胞应答被诱导(Vaccine，2002 20；3598)。这些结果表明，尽管重组蛋白质疫苗能有效阻止HBV感染，但它不适合用于乙型肝炎的治疗。另一个尝试是使用肽表位，特别是被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别的肽表位诱导CD8 T细胞应答。将HBV核心-特异性辅助T-细胞(Th)或CTL表位的肽以及作为对照的破伤风毒素(TT)给予正常个体，并且对抗原特异的CTL应答被很好的识别(J Clin Invest，1995 95；341)。然而，对慢性HBV患者的测试显示微弱的CTL应答，以及与病毒减少的相关性是可检测的(Hepatology，199930：531)。
用于治疗慢性乙型肝炎的另一个尝试是用于编码HBV抗原的DNA接种。DNA疫苗的优点在于抗原能在DNA中被体内表达，经受内源性和外源性加工被负载于MHC I类和II类上，因此同时诱导CD4和CD8 T细胞应答。在实践中，当编码包膜抗原的DNA疫苗被给予正常个体时，抗体应答和细胞介导的免疫应答均被诱导，并且没有检测到特别的副作用。然而，当编码包膜蛋白质的DNA疫苗(HBV PreS2-S)被给予慢性乙型肝炎患者时，仅在10位患者的1位中观察到HBVDNA的消失(Hepatology，200440：874)。另外，T细胞增殖能力被诱导给两位患者，但是诱导的T细胞应答仅为暂时和非常微弱的。因此，尽管免疫应答被诱导给若干患者，但仍然存在改善DNA疫苗的需要，其能以更有力和有效的方式诱导细胞介导的免疫应答。
发明内容
【技术方案】
本发明提供用于治疗慢性乙型肝炎的新DNA疫苗以及制备该DNA疫苗的方法。
优选地，该DNA疫苗包括编码乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、L蛋白质、核心和聚合酶的抗原基因。更优选地，该DNA疫苗包括这些抗原基因的密码子优化的抗原以增加表达水平。
在本发明中，所述DNA疫苗可以进一步包括提供IL-12，甚至IL-12变体，作为佐剂。
本发明进一步提供用于提供DNA疫苗的方法。
本发明还提供使用DNA疫苗治愈慢性乙型肝炎的方法。
附图描述
图1是HB-110的示意图，其是根据本发明的优选实施方式的DNA疫苗。HB-110包含三个表达载体：pGX10S/L，构建用于表达HBV表面抗原(HBsAg)和L蛋白质；pGX10核心/Pol，构建用于表达HBV核心和聚合酶；以及pGX10IL-12m，构建用于表达白细胞介素12变体。
图2说明通过密码子优化HBsAg的基因(图2A)和HBV核心的基因(图2B)而增强的基因表达。
图3图解表示了在C2C12和HeLa细胞中HB-100和HB-110DNA疫苗表达的HBsAg水平，如ELISA所测定的。
图4图解表示了在COS-7和HeLa细胞中HB-100和HB-110DNA疫苗表达的HBV L糖蛋白水平的比较，如蛋白质印迹和ELISA测定的。
图5图解表示了在COS-7细胞中HB-100和HB-110DNA疫苗表达的HBV核心抗原水平的比较，如放射免疫沉淀反应(RIP)测定的。
图6图解表示了在COS-7细胞中HB-110DNA疫苗表达的HBV聚合酶抗原水平，如蛋白质印迹测定的。
图7图解表示了在Balb/c小鼠中HB-100和HB-110DNA疫苗诱导的针对HBsAg和HBV核心抗原的抗体应答的比较。
图8图解表示了在Balb/c小鼠中HB-100和HB-110DNA疫苗诱导的对HBsAg、核心抗原、PreS1/S2抗原和聚合酶抗原具有特异性的细胞介导的免疫应答的比较。
图9图解表示了在有或没有HB-110的IL-12m的情况下、在Balb/c小鼠组中，IL-12m对抗体应答和细胞介导的免疫应答的增殖效力的比较。
图10图解表示了在HBV转基因小鼠中HB-100和HB-110DNA疫苗诱导的HBsAg-特异性抗体应答的比较。
图11图解表示了在HBV转基因小鼠中HB-100和HB-110DNA疫苗诱导的对HBsAg和PreS1/S2抗原具有特异性的细胞介导的免疫应答的比较。
图12图解表示了在HBV转基因小鼠中通过分别注射HB-110一次、两次和三次诱导的对多重抗原具有特异性的细胞介导的免疫应答的比较。
图13图解表示了当向HBV转基因小鼠中加入IL-12变体通过血清HBsAg水平的减少确定的IL-12m的治疗效果。
最佳实施方式
为了实现目标，在本发明的一个方面，提供了DNA疫苗，其包含编码乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、L蛋白质、核心和聚合酶的抗原基因，以及经密码子优化以增加表达水平的抗原基因。
换句话说，本发明提供DNA疫苗，其包含多重抗原，而不是单一抗原。为了增强慢性HBV感染的疗效，本发明的DNA疫苗能诱导对多重抗原具有特异性的免疫应答。特别是，除了使用在传统DNA疫苗中的HBV表面基因外，本发明的DNA疫苗还使用了作为HBV结构基因的核心，以及作为非结构基因的聚合酶。
另外，本发明的DNA疫苗通过密码子优化相当大地增加了多重抗原的表达水平。通常所知，宿主中病毒密码子的tRNA种类的数量不足导致有限的病毒蛋白质表达水平，这是避免宿主防御机制的一种方式(J MoI Biol.1982158：573)。为了增加病毒基因在人体内的表达水平，正在进行很多尝试，以提供在人类细胞中盛行的密码子的高表达水平和高GC含量。特别是，这些尝试主要使用HIV、HPV或HCV模式进行。可以确定的是，使用这些模式疫苗增加了表达水平，导致增强的抗体和细胞介导的免疫应答(J Virol.2003 77：4928 J Virol.200074：4839 GeneTher.200310：686)。至今，还没有报告提出通过密码子优化增强HBV模式的表达水平。本发明涉及开发DNA疫苗，其通过密码子优化HBV的各种抗原基因而具有增强的抗原表达率。
在优选方面，DNA疫苗包括分别表达抗原基因的表达载体。在优选的实施方式中，所述DNA疫苗包括编码HBsAg抗原和pre-S1/S2/S(L蛋白质)抗原的质粒(pGX10S/L)，HBsAg抗原是HBV表面基因；和编码核心抗原和聚合酶抗原的质粒(pGX10核心/Pol)(见图1)。
更具体而言，在用作用于治疗感染慢性HBV的患者的DNA疫苗的本发明的优选实施方式中，本发明的发明人开发了两种类型的表达基因型C的HBV抗原的质粒，并且分别命名为pGX10S/L和pGX10核心/Pol。
质粒pGX10S/L是表达载体，其被构建使得密码子优化的HBV S和L(大)糖蛋白(L蛋白质)抗原在巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下独立转录。S抗原(M54923)是由GenScript Corp.(www.genescript.com)密码子优化以便与人相容。L抗原(AF052576)也是由GenScript Corp.密码子优化以便与人相容。另外，为了有助于胞外分泌，人组织型纤溶酶原激活物(tpa)的信号序列被连接于L抗原的5′端，第2位的氨基酸即甘氨酸被丙氨酸取代，已知通过十四烷基化甘氨酸的分泌被抑制。然后，在第91-110位置的氨基酸被消除，已知这些氨基酸通过使得将L抗原保持在ER(内质网)中抑制L抗原的分泌(Virology 1995 213：57)(见图1)。
质粒pGX10核心/Pol是表达载体，其被构建使得核心和聚合酶(Pol)抗原的基因在CMV启动子的控制下独立地转录。核心抗原(M54923)被GenScriptCorp.(www.genescript.com)密码子优化用于基因合成。另外，类似于L抗原的情况，为了有助于胞外分泌，人组织型纤溶酶原激活物(tpa)的信号序列被连接于核心抗原的5′端。Pol抗原是用与pGX10 Pol相同的方式(Gene Ther.2006 13：1110-1117)构建的表达载体，其是本发明的发明人开发的治疗性DNA疫苗HB-100的组分之一，在以前的研究中被提出并被GenScript Corp.合成，其现在将被简略描述。为了为了有助于胞外分泌，单纯疱疹病毒(HSV)的糖蛋白gD的信号序列(gDs)被连接于Pol抗原的前部的5′端。另外，为了确认表达，流感病毒的HA表位被***gDs和Pol抗原之间(见图1)。
用于开发两种质粒的pGX10载体是这样的表达载体，其具有巨细胞病毒(CMV)的早期启动子/增强子序列和腺病毒三联前导序列/内含子，如图1中由TPL显示；SV40的聚(A)序列，如图1中由SVpA所显示的，并且已经在小型动物和临床研究中被用作DNA疫苗载体。关于pGX10载体的更详细的解释在本发明的发明人提交的以前的申请(韩国专利申请第2003-0028080号)中描述，在此通过引用的方式将其全部内容并入本文。
在另一个方面，本发明提供了进一步包括能增强细胞介导的免疫应答的免疫佐剂的DNA疫苗，因此促进了慢性HBV的疗效。优选地，本发明提供了包括编码白细胞介素12变体的基因作为免疫佐剂的DNA疫苗。
在本发明的一个优选实施方式中，提供了DNA疫苗，其包括表达编码白细胞介素12变体的基因的质粒(pGX10IL-12m，见图1)。
作为免疫佐剂用于DNA疫苗的白细胞介素-12变体是本发明的发明人以前开发的。与野生型白细胞介素-12相比，该变体型白细胞介素-12包括长效CD4和CD8 T细胞应答，其对丙型肝炎病毒(HCV)抗原具有特异性(Nat Biotechnol.2002 20：381，参见韩国专利第10-399728号等)。更具体而言，该白细胞介素12变体具有IL-12p40亚基突变体基因，其能分泌IL-12，但不是p40同型二聚体。特别是，包括IL-12p40亚基突变体基因的表达载体被构建以抑制IL-12p40的分泌，但是正常分泌IL-12p70，其通过用另一密码子替换IL-12p40的氨基酸残基222(人类)或220(小鼠)处的Asn的密码子，保持IL-12的免疫活性。已知IL-12p40作为活性形式的IL-12，IL-12p70的竞争性抑制剂。在本发明中，具有上述性质的IL-12变体可能对HBV抗原特异性免疫应答和疗效是有用的。
进一步地，本发明提供用于制备DNA疫苗的方法。
具有高的抗原表达率并能有效诱导细胞介导的免疫应答的多重特异性DNA疫苗，优选通过包含以下步骤的方法制备：(1)密码子优化编码乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、L蛋白质和核心的抗原基因；以及(2)将编码HbsAg、L蛋白质和核心的密码子优化的抗原基因以及编码聚合酶的基因***一个或多个表达载体，其中编码聚合酶的基因无论被密码子优化或未优化。
优选地，编码密码子优化的HBsAg和L蛋白质的基因被一起***单一表达载体。更优选地，此两种被一起***单一表达载体的基因分别由各自的启动子表达。还优选地，编码密码子优化的核心和聚合酶的基因被一起***单一表达载体，并且更优选地，这两个被一起***单一表达载体的基因分别由各自的启动子表达。在此，可以使用本领域技术人员知道的适当的表达载体，只要其能在真核细胞中表达。更优选地，pGX10载体可以被用作表达载体，如本发明的发明人提交的韩国专利申请第2003-0028080号中所公开的。
根据本发明的用于制备DNA疫苗的方法，可以进一步包括包含免疫佐剂。任何已知的免疫佐剂，只要其可以诱导细胞介导的免疫应答并且是安全的，都优选用作本发明的免疫佐剂。尤其是，免疫佐剂可以是包含编码IL-12变体的基因的表达载体，其是本发明的发明人以前开发的。在此，编码IL-12变体的基因优选进行突变，以便Asn的密码子——其是SEQ.ID.No 23代表的人的IL-12p40的氨基酸残基222，用不同氨基酸的另一个密码子取代，更优选地为用Leu、Gin或Ile的密码子取代。可选地，编码IL-12变体的基因优选进行突变，以便Asn的密码子——其是鼠IL-12p40的氨基酸残基220，用另一个密码子取代，更优选地为用Leu或Ile的密码子取代。根据本发明的优选实施方式的pGX10载体可以被用作表达载体，以表达IL-12变体，但不限于此。通过进一步包含编码作为免疫佐剂的IL-12变体的基因，根据本发明的DNA疫苗能进一步促进多重特异性T细胞免疫应答的诱导。
此外，本发明提供用于治愈慢性乙型肝炎的组合物，所述组合物包含作为活性成分的根据本发明的HBV疫苗，以及通过施用该组合物治愈乙型肝炎的方法。
如上所述，由于根据本发明的HBV疫苗诱导多重特异性T细胞免疫应答，其能有效地被用作治疗慢性HBV的疫苗。在此，本发明的疫苗不仅可以与编码IL-12变体或其它免疫佐剂的基因一起使用，并且可以与本领域广泛使用的药物载体或赋形剂一起使用。
疫苗组合物被配制用于人类或动物，并且能通过各种途径给药，包括口服、腹膜内、静脉内、皮下、肌肉内、皮内和鼻内给药。优选地，疫苗组合物被配制为注射剂给药。注射剂可以使用水性溶剂如盐水溶液或林格液；或非水溶剂如植物油、高级脂肪酸(例如，乙基油酸，或其类似物)、醇类(例如乙醇、苯甲醇、丙二醇、丙三醇或其类似物)制备。注射剂可以包括药物载体，包括用于防止降解的稳定剂，如抗坏血酸、亚硫酸氢钠、焦磷酸钠、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、维生素E、乙二胺四乙酸(EDTA)或其类似物，乳化剂、用于调节pH水平的缓冲剂、用于阻止微生物生长的防腐剂，如硝酸苯汞、乙基贡硫代水杨酸钠、苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苯酚、甲苯酚、苯甲醇或类似物。
根据本发明的组合物以药学上有效的量给药。术语“药学上有效的量”是指足以显示接种效果的足够剂量或足以防止发生副作用或过激免疫应答的小剂量。药学上有效的量取决于施用的抗原的类型，以及药学领域技术人员将知道的其它因素，例如，患者的年龄、体重、健康状况、性别、药物敏感性、给药途径或给药方法。根据本发明的组合物可以被一次给药，或可以被分为许多较小的剂量在变化的时间间隔给药。
如上所述，从首次用于实验的小鼠和HBV转基因小鼠模型观察到，与本发明的发明人以前制备的HB-100疫苗(即这样的DNA疫苗，其包含编非密码子优化的HBV核心、S蛋白质、聚合酶和PreS1/PreS2的基因和编码作为免疫佐剂的IL-12变体的基因)(Gene Therapy，2006 13：1110-1117)相比，包括编码密码子优化的HBV多重抗原的基因的根据本发明的HBV DNA疫苗展示出出色的抗体应答和细胞介导的免疫应答。特别是，根据本发明的HBV疫苗有效地诱导HBV抗原特异性免疫应答和疗效。特别是，可以确认，通过进一步包含编码作为免疫佐剂的IL-12变体的基因，根据本发明的DNA疫苗能进一步促进治疗应答的诱导。
因此，根据本发明的HBV DNA疫苗，与传统HBV DNA疫苗相比，能被更有效地用于慢性乙型肝炎的治疗。
通过具体实施例将更详细地描述本发明。以下被提供的实施例用于说明目的，并且不意图以任何方式限制本发明。
发明实施方式
<实施例1>构建用于HBV治疗的DNA疫苗的制备
实施例1-1：质粒pGX10S/L的制备
首先，为了实现HBsAg的密码子优化，具有5′-端EcoR I和3′-端Not I的基因序列被测定，HBsAg的基因(SEQ.ID.No 1)由Genscript Corp.合成，生成质粒pUC57-SCO。质粒pUC57-SCO用EcoR I和Not I消化，pGX10也用EcoR I和Not I消化。这些质粒被连接在一起以最终构建pGX10-SCO。在构建作为对照的pGX10 S中，由Genscript Corp.合成没有密码子修饰的基因，以与上述基本相同的方式产生质粒pUC57-S。在PreS1/S2的氨基酸序列中，甘氨酸被丙氨酸取代并且氨基酸91-110被去除的密码子优化的基因(SEQ.ID No 2)，首先由Genescript Corp.合成，然后获得质粒pUC57-PreS1/S2CO。TPAs(组织型纤溶酶原激活物信号序列)被形成，这样两个寡核苷酸：由SEQ.ID No 3代表的TPA-1和由SEQ.ID No 4代表的TPA-2 1具有基于核苷酸的EcoR I和Not I，如在PROTEIN EXPRES PURIF，199814：8-12中所公布的，以便互相地互补性结合，从而制备双链DNA。此后，制备的双链DNA被***至pSK(+)载体(由Stratagene生产)。然后，pSK(+)-TPAs用EcoR I和Not I消化，pUC57-PreS1/S2CO用EcoR I和Not I消化，然后DNA片段被连接在一起，从而获得pSK(+)-TPAs-PreS1/S2CO。
为了通过将衍生自pSK(+)-TPAs-PreS1/S2CO的TPAs-PreS1/S2CO基因与HBsAg抗原基因合并制备L蛋白质，合成包括Asp 718和Nco I限制性酶识别点的引物Asp718TPAs(SEQ.ID No 5)和包括Pst I限制性酶识别点和SCO的5′-端部分的序列的Pst I SCO引物(SEQ.ID No 6)。使用pSK(+)-TPAs-PreS1/S2CO作为模板进行PCR，并且PCR产物用Asp718和Pst I消化。pGX10-SCO载体用Pst I部分消化，即，只有位于SCO基因内的Pst I位点被消化，而位于pGX10载体一侧的Pst I位点不被消化。然后，部分消化的载体用Asp 718消化，只有SCO基因的5′-端部分被去除，接着仅使用载体部分连接在一起，从而制备pGX10-TPAs-LCO。接着为了扩增甚至包含SV40增强子的pGX10的CMV启动子的全部区域，合成SalI CMVp(SEQ.ID No 7)和Sal I SVpA/Enh引物(SEQ.ID No 8)。使用pGX10作为模板进行PCR，PCR产物立即与pGEM-T-Easy载体(由Promega制造)连接，从而构建pGEM-CMV-TPL-MCS-SVpA/Enh。然后，pGEM-CMV-TPL-MCS-SVpA/Enh用Asp 718和Xho I消化，得到的片段与pGX10-TPAs-LCO连接以构建pGEM-CMV-TPL-TPAs-LCO-SVpA/Enh。最终，载体用Sal I消化，并且CMV-TPL-TPAs-LCO-SVpA/EnhSCO片段被***至载体的限制性位点，这通过用SalI消化pGX10SCO产生，从而完成目标质粒pGX10S/L，该质粒以这样的方式在单一载体中使用双启动子同时表达S和L抗原：使用位于各自基因的5′-端部分的CMV启动子表达基因。
<实施例1-2>：质粒PGX10核心/Pol的制备
基于TPAs序列和核心蛋白的氨基酸序列，其已经在实施例1-1描述，融合蛋白质形式的基因由Genscript Corp.合成，生成具有5’-端EcoR I和3’-端NotI和Xho I限制酶识别点的质粒pUC57-TPAs-核心CO(SEQ ID.No 9)。质粒pUC57-TPAs-核心CO用EcoR I和Xho I消化，并且pGX10也用EcoR I和Xho I消化。这些质粒被连接在一起以最终构建pGX10-TPAs-核心CO(SEQ ID.No 9)。在构建作为对照的没有密码子优化的pGX10核心，以及具有密码子优化的pGX10核心CO和未融合的TPAs中，各自的基因由Genscript Corp.合成，通过以与上述基本相同的方式进行克隆生成目标基因。
为了表达Pol抗原，设计基因合成以便单纯疱疹病毒(HSV)的糖蛋白信号序列(gDs，AAN74642)和HA表位(AAB01168)使用两个甘氨酸残基作为连接体被连接于Pol抗原基因的N-末端区域，如在Gene Ther.2006 13：1110-1117中所述的。Pst I在5′-端形成和Not I在3′-端形成，并且基因合成由Genscript Corp.进行，从而获得gDs-HA-Pol(SEQ.ID No 10)被***至pUC57载体的pUC57-gDs-HA-Pol。获得的pUC57-gDs-HA-Pol用Pst I和Not I消化，pGX10用Pst I和Not I消化，并且得到的片段被连接在一起，从而构建pGX10-gDs-HA-pol。
为构建pGX10核心/Pol，pGEM-CMV-TPL-MCS-SVpA/Enh用Pst I和Xba I消化，pGX10-gDs-HA-Pol用Pst I和Xba I消化，并且得到的片段被链接在一起，从而构建载体pGEM-CMV-TPL-gDs-HA-Pol-SvpA/Enh。最终，构建的载体pGEM-CMV-TPL-gDs-HA-Pol-SvpA/Enh用Sal I消化，并且CMV-TPL-gDs-HA-Pol-SvpA/Enh部分被***至通过用Sal I消化pGX10-TPAs-核心CO获得的部分，从而完成在单一载体中使用双启动子同时表达核心和Pol抗原的质粒pGX10核心/Pol。
<实施例1-3>：质粒PGX10 IL-12m的制备
使用RT-PCR(PCR System 2400，Perkin Elmer)与来自NC37细胞的互补引物，用PMA(佛波醇十四烷乙酸酯)激活的人B细胞，编码820bp人p35亚基和1050bp人p40亚基的cDNAs(AF180563)被获得。hp35(S)(SEQ.ID No11)和hp35(AS)(SEQ.ID No 12)被用于扩增人p35亚基，并且hp40(S)(SEQ.ID No 13)和hp40(AS)(SEQ.ID No 14)被用于扩增人p40亚基。每一个被扩增的cDNA被亚克隆入载体pBluescriptSK+(Stratagene)中。每一个编码P35和p40亚基的基因被***至载体pBluescriptSK+的SmaI位点，从而制备pSK-hp35(3.8kb)和pSK-hp40(4.1kb)。
为了构建共表达编码p35和p40亚基的基因的双顺反子载体，EMCV的IRES基因通过RT-PCR产生并且用限制性酶EcoR V消化。得到的DNA片段被***至载体pSK的EcoR V位点以形成3.6kb的载体pSK-IRES。IRES(S)(SEQ.IDNo 15)和IRES(AS)(SEQ.ID No 16)被用于IRES的扩增。质粒pSK-hp35用限制性酶EcoRV和Not I消化并且被T4 DNA聚合酶填充以获得0.8kb的hp35片段。此DNA片段被***至通过用限制性酶EcoR V消化载体pSK-IRES形成的3.6kb的DNA片段以构建4.4kb的pSK-hp35/IRES。质粒pSK-hp35/IRES用限制性酶SmaI和CIa I消化，并且用连接酶连接以便除去hp35上游的限制性酶位点部分。通过用限制性酶Nco I和Not I消化pSK-hp40获得的1.1kb的hp40 DNA片段被***至pSK-hp35/IRES中以构建共表达编码p35和p40亚基的基因的质粒。由此获得的质粒被命名为pSK-hp35/IRES/hp40。
使用T7(S)(SEQ.ID No 17)引物和hp40-N222L反义(AS)(SEQ.IDNo 18)引物以及pSK-hp40作为模板进行初级PCR，以用亮氨酸取代hp40的氨基酸222——天冬酰胺。类似地，使用T3(AS)(SEQ.ID No 19)引物和hp40-N222L正义(S)(SEQ.ID No 20)引物进行次级PCR。其结果是，形成两个PCR片段，它们具有共同的位点，包括突变位点。使用那些片段的混合物作为模板和T7(S)引物以及T3(AS)引物进行三级PCR，以产生其融合产物。得到的融合DNA片段用限制性酶Ncol和NotI消化并且被***至3.0kb的载体pBluescriptSK+——其已经用限制性酶Smal消化，以构建4.1kb的质粒pSK-hp40-N222L。使用限制性酶Nco I和Not I获得质粒pSK-hp40-N222L的hp40-N222L片段，并且用质粒pSK-hp35-IRES-hp40的hp40片段取代，从而制备5.5kb的质粒pSK-hp35-IRES-hp40-N222L。最终，为了转移hp35-IRES-hp40-N222L片段至pGX10载体，使用hIL-12(S)(SEQ.ID No 21)和hlL-12(AS)(SEQ.ID No 22)作为引物和载体pSK-hp35-IRES-hp40-N222L作为模板进行PCR扩增，从而获得片段hp35-IRES-hp40-N222L。此片段用限制性酶Xhol消化并且被***至载体pGX10——其已经用限制性酶XhoI消化，以构建6.1kb的质粒pGX10-hIL-12m(或pGX10-hIL-12N22L)。
<实施例2>经密码子优化HBsAg和核心抗原表达效率的确认
本发明的发明人试图确认使用体内细胞培养***制备的质粒编码的抗原的表达效率。为了此目的，我们使用COS-7细胞(ATCC，CRL-1651)、C2C12细胞(ATCC，CRL-1772)和HeLa细胞(ATCC，CCL-2)。
为了确认HBsAg的表达效率，pGX10gDsS、pGX10S和pGX10SCO通过脂质转染法用pGX10和pGL2luc(Promega)作为对照载体转染，从而获得上清液和细胞，现在将简略描述。转染的前一天，细胞在每一60mm培养皿上铺板至大约80-90％汇合。转染的那一天，0.05μg的DNA和20μl的lipofectamine被加入至在两套微量离心管中的0.5ml无血清培养基(DMEM)(Biowhittacker，Cambrex)，然后温和搅拌，接着使混合后的溶液在室温下静置。30分钟后，得到的混合溶液被分散至细胞。转染后6小时，得到的产物用无血清DMEM培养基洗涤两次，并且更换新鲜的培养基，即，从无血清DMEM培养基至包含5％的FBS(胎牛血清)的DMEM培养基。转染后在10、24、35和48小时取上清液。48小时后收获细胞并置于1ml细胞培养物裂解缓冲液(Promega)中以收集细胞溶胞产物。为了使转染效率的变异标准化，即，为了消除可能由于质粒之间转染效力的差异而导致的变化，在转染前0.05μg的萤光素酶基因与制备的质粒混合，并且取具有基本相同萤光素酶活性水平的细胞溶胞产物和上清液进行ELISA分析。然后，HBsAg的表达水平使用HBsAg ELISA试剂盒(Dong-A Pharm.)测定。概括而言，取需要量的条并固定在框架上，并且浓缩的结合溶液和稀释的结合溶液以1∶25的比率混合。100μl的样品溶液被置于板的各个孔中，然后25μl进行的结合溶液被置于每个孔中，其然后在37℃下反应90分钟。反应完成之前，用底物缓冲溶液(1∶100)稀释底物溶液，并用洗涤溶液洗5次。剩余的洗涤溶液使用吸湿纸完全去除，并且100μl的进行的底物溶液被加入，接着在室温下反应。作为结果，从图2A确认，在HeLa细胞和C2C12细胞的细胞溶胞产物和上清液中，具有密码子优化的HBsAg基因的pGX10SCO的表达水平远高于具有野生型HBsAg基因的pGX10S。另外，pGX10SCO的表达水平高于HB-100疫苗的pGX10gDsS——其如在实施例3中所述，由本发明的发明人之前开发。
为了确认核心抗原的表达，以与如上述转染基本相同的方式实施程序。也就是说，pGX10-核心、pGX10-核心CO和pGX10tpa-核心CO通过脂质转染法(Invitrogen)转染至HeLa细胞。为进行RIP(放射免疫沉淀)，使用的培养基都被去除，并且细胞可以被放置于缺少胎牛血清(FBS)、蛋氨酸(Met)和半胱氨酸(Cys)的DMEM培养基中30分钟。在去除DMEM培养基后，在补充有100mCi[35S]Met和1％透析的FBS的培养基中进行4小时温育。在用冰冷的PBS洗涤两次之后，用0.5ml的细胞裂解液处理细胞并且置于冰上20分钟。在收集细胞之后，使用1cc的注射器剪切细胞若干次，进行离心，从而得到上清液(溶胞产物)。然后，与样品的量等同体积的NET凝胶缓冲液被加至每个获得的上清液(溶胞产物)样品中，并且3μl的HBV患者抗血清被加至其中，接着在4℃下温育6小时。在加入30μl的蛋白质A-G琼脂糖凝胶后，进一步在4℃下进行温育2小时。离心后，上清液被去除，然后1ml的RIPA缓冲液被加入进行漩涡，从而重新悬浮得到的溶液。在用洗涤缓冲液(10mM Tris-HCl(pH7.5)，0.1％NP-40)洗涤4次后，30μl的1×SDS凝胶加样缓冲液被加至得到的溶液并且然后煮沸5分钟。离心后，加载上清液进行SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)。在充分进行电泳之后，胶被浸泡在水杨酸中30分钟，然后干燥暴露于膜。作为结果，如从图2B所确认的，都具有密码子优化的HBsAg基因的pGX10核心CO和pGX10tpa-核心CO与pGX10核心相比具有增加的表达水平。
<实施例3>HB-110治疗疫苗的抗原表达的确认
本发明的发明人试图确认含有pGX10S/L、pGX10核心/Pol和pGX10IL-12m的HB-110中的每个抗原的表达效率
为了确认表达效率，HB-110和HB-100作为比较组被转染入C2C12细胞、HeLa细胞或COS-7细胞。HB-110通过混合50％的pGX10S/L、25％的pGX10核心/Pol和25％的pGX10IL-12m制备并且使用的HB-110的总量为2μg。HB-100是本发明的发明人之前制备的DNA疫苗，如Gene Therapy，2006 13：1110-1117中所公开，即，25％的pGX10gDsS、18.75％的pGX10S1/S2/X、18.75％的pGX10核心、12.5％的pGX10Pol和25％的pGX10IL-12m的组合物并且使用的HB-100总量是2μg。在pGX10S1/S2/X质粒中，X指HBV的X基因，即HBx。
为了确认从HB-110和HB-100的HBsAg的表达，使用C2C12细胞和HeLa细胞。如上所述，C2C12细胞和HeLa细胞在含有10％FBS(Gibco-BRL，USA)的DMEM中培养。5×105的细胞被分散在60mm的板中，细胞生长24小时，并且然后使用lipofectamine(Invitrogen)转染至2μg的每个HB-110和HB-100中。脂质转染法后48小时，收获细胞用于ELISA分析。转染效率的变异的标准化以上述方式进行。也就是说，萤光素酶基因在转染之前被混合在一起，并且取具有基本相同的萤光素酶活性水平的细胞溶胞产物和上清液用于ELISA分析。如从图3所确认的，在细胞溶胞产物和上清液中，HB-110的HBsAg的表达效率都高于HB-100的表达效率，HB-100是由本发明的发明人在之前制备开发的。
为了确认L糖蛋白的表达效率，2μg的每一HB-110和HB-100使用lipofectamine(Invitrogen)转染至COS-7细胞和HeLa细胞。在脂质转染法后48小时，收获细胞。取具有基本相同的萤光素酶活性水平的细胞溶胞产物用于电泳。在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳后，得到的产品进行免疫印迹。抗PreS1单克隆抗体(Aprogen Co.)被用于检测pre-S1/S2蛋白质。如图4的左视图所示，HB-110展示出增强的表达效率。HB-110编码的L蛋白质的全长通过ELISA分析进行检测。为了检测L蛋白质，作为捕获抗体(捕获Ab)的抗PreS1或抗PreS2单克隆抗体(Aprogen Co.)被稀释1000倍，并且使用包含在HBsAg ELISA试剂盒(Green-Cross)中的HRP-结合的抗-HBsAg多克隆抗体。如图4的右视图所示，HB-110和HB-100展示出预期的结果，即，HB-110确认在HeLa和COS-7细胞中L蛋白质的表达，而HB-100与pGX10-转染样品几乎不表达L蛋白质。
为了确认核心蛋白质在HB-110和HB-100中的表达，COS-7细胞被使用。COS-7细胞以上述方式转染，转染后48小时，收获细胞。取具有基本相同的萤光素酶活性水平的细胞溶胞产物进行电泳，并且然后进行RIP(放射免疫沉淀)。为了避免非特异性的结合，使用健康的人类血清进行预清除。为了检测核心蛋白质，RIP用慢性肝炎患者的血清进行。作为结果，如图5所示，由HB-110产生的核心蛋白质在细胞溶胞产物和上清液中被检测到，并且检测到的HB-110水平略高于HB-100。
为了确认Pol抗原在HB-110中的表达，COS-7细胞以上述方式转染，转染后48小时，收获细胞，取细胞溶胞产物用于电泳，接着进行免疫印迹。由于能直接检测聚合酶蛋白质的抗体无法获得，HA表位被连接于聚合酶的5′-端，并且使用抗HA单克隆抗体检测聚合酶蛋白质的表达，如从图6所确认的。Pol抗原在HB-110和HB-100中的表达水平相互基本相同(数据未显示)。可以想到，原因在于包括在表达载体pGX10中的gDs-HA-Pol形式的Pol抗原。
<实施例4>小鼠中HB-110的免疫原性的评估
本发明的发明人进行用于小动物免疫的实验。为此，将HB-110和HB-100分别溶解在200μl的PBS中，用作DNA疫苗。首次给药通过将200μl的DNA疫苗注射入两条腿(每条后腿肌肉100μl)进行，每组6Balb/c小鼠。第二和第三次肌内注射以2周间隔进行。在HB-100的情况下，25μg的pGX10gDsS、18.75μg的pGX10S1/S2/X、18.75μg的pGX10核心、12.5μg的pGX10Pol和25μg的pGX10IL-12m被使用。在HB-110的情况下，50μg的pGX10S/L、25μg的pGX10核心/Pol和25μg的pGX10IL-12m被使用。为调查免疫后诱导的抗体应答，各只小鼠在每个给药时间被麻醉，并且使用肝素化毛细管从每只小鼠的眶下静脉收集血液。为调查细胞介导的免疫应答，最后一次给药后的2周，收集脾细胞用于实验。
为调查抗体应答，从每只小鼠收集的血液在室温下放置一小时。然后，在10000rpm下离心5分钟，仅取上清液以获得血清。首先，HBsAg(FizgeraldAb&Ag，USA)被稀释为浓度0.1μg/ml，HBcAg(Koma biotech.USA)被稀释为浓度3μg/ml，并且这些质粒被分配至不同的96孔板(Nunc，F96微量板)，每板50μl，然后在37℃下放置2小时。每个96-孔板中的内含物被倒出，并用含有0.05％吐温20(Sigma)的PBS清洗溶液(由GibcoBRL制造的0.05％PBS-T)洗3次。小鼠血清用缓冲溶液稀释(1∶50)，通过加入5％脱脂奶至清洗溶液而制备，并以50μl被加入每孔，然后其在37℃下反应1.5小时。完成反应后，接着用清洗溶液(PBS-T，0.05％)清洗5次，HRP结合的抗小鼠免疫球蛋白(抗总IgG)抗体被缓冲液稀释3000倍并以50μl分配至每孔，接着在室温下反应一小时。然后，用测试缓冲溶液洗涤5次后，每50μl的N-四甲联苯胺(TMB)底物(由KPL制造)和过氧化物酶底物溶液B(由KPL制造)1∶1的混合溶液被加至每个孔，并在室温下静置。当每个孔的颜色变蓝时，每50μl的2N H2SO4被分配至每个孔以停止颜色反应。使用微量板读数仪在450nm下测量每个孔的吸光度。如图7中所示，当注射HB-110时，抗HBs抗体应答和抗-HBc抗体应答被有效诱导，与注射次数成比例，而在给予HB-100的小鼠中抗体应答非常弱。
收集取自3只免疫小鼠的脾细胞后，IFN-g ELISPOT分析被重复进行两次。特别是，用于IFN-g的包被抗体(BD Pharmingen)用PBS稀释为5μg/ml的浓度，并且50μl的稀释的抗体溶液被分配至96孔板(Millipore，0.45m，Bedford，MA)，然后在室温下放置超过12小时。剩余的抗体溶液被吸除。用PBS清洗板两次，200μl的培养基用于动物细胞培养(RPMI-1640，含有50单位/ml青霉素、50μg/ml链霉素、50μM-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、20单位/ml重组鼠IL-2和10％FBS(标准胚胎牛血清，HyClone)被加至每个孔。使板在37℃下放置超过2小时后，培养基被再次吸除。分离的脾细胞分别以1×106、3.3×105和1.1×105细胞/孔被加至每个孔。为了研究HBV抗原特异性免疫应答，20-mer肽(Peptron，Korea)基于HB-110的抗原的氨基酸序列使用10-氨基酸重叠而合成。合成的肽与抗原混合并加至孔最终达到1μg/孔。然后，96-孔板在37℃、5％CO2培养箱无搅动下培养20小时。温育后，96-孔板中的内含物被倒出，并用包含0.05％吐温20(Sigma)(PBS-T，0.05％)的PBS清洗溶液清洗三次。生物素结合的抗-IFN-g mAb(BD Pharmingen)用封闭缓冲液稀释，其通过加入1％的BSA至清洗溶液中制备，以将浓度调节为2μg/ml，其然后以50μl被加至每孔，接着反应2小时。用清洗溶液(PBS-T，0.05％)清洗5次后，该板用再次被封闭缓冲液稀释(1∶2000)的链霉抗生物素蛋白-AKP溶液填充，然后反应1小时。反应完成之后，用清洗溶液(PBS-T，0.05％)清洗7次。66μl的NBT(Promega)和33μl的BCIP(Promega)的混合物被加至10ml的碱性磷酸缓冲液中，然后50μl得到的溶液被加至每个孔以诱导显色。当观察到所需大小的点(10-30分钟)时，使用自来水停止颜色反应。96孔板在室温下干燥，并且然后使用显微镜测定分泌IFN-g的细胞的数目。如在显示细胞介导的免疫应答的图8中所示，与给予HB-100的组相比，在对HBsAg、核心和PreS1/S2抗原特异的斑点形成细胞(SFC)计数中，给予HB-110的组表现出统计学上显著的增强。另外，不仅当肽库用作刺激剂时，而且当HBsAg蛋白质或核心蛋白质被用作刺激剂时，HB-110显示增加的SFC计数，这表示HB-110比HB-100更有效地诱导CD4 T细胞应答。在对Pol抗原特异的细胞介导的免疫应答中，HB-110和HB-100以相似水平诱导免疫应答，这被认为原因在于Pol抗原以gDs-HA-Pol的形式包括在表达载体pGX10中。
为了确认在HB-110的组成中IL-12m增强的免疫的效果，每组9只Balb/c小鼠被用于试验中。对于实验组，以2周的间隔进行两次给药。也就是说，对于一组，第一次给药通过注射100μl的HB-110(50μg的pGX10S/L、25μg的pGX10核心/Pol和25μg的pGX10IL-12m)进行。第二次注射在2周的间隔时进行。对于另一组，包括25μg的pGX10载体以代替25μg的IL-12m的HB-110-IL-12m以两周的间隔注射两次。在第二次肌内注射后的第二个星期，抗体和细胞介导的免疫应答以上述方式被诱导。作为结果，如图9所示，给予包括IL-12m的HB-110的组，与没有IL-12m的HB-110-IL-12m对比，显示出增强的抗体和细胞介导的免疫应答，如通过ELISA和IFN-g ELISPOT分析观察。更具体而言，HBsAg特异性的细胞介导的免疫应答被增强了约两倍，对HBcAg特异性的细胞介导的免疫应答被增强约三倍。这表示当被用作免疫佐剂时，作为HB-110 DNA疫苗组成之一的IL-12m能有效地增强抗体和细胞介导的免疫应答。
<实施例5>HB-110在HBV转基因小鼠中的免疫原性和治疗效果的评估
为了评价本发明的发明人开发用于HBV治疗的DNA疫苗的疗效，HBV全基因组的复制在肝细胞中被检测的HBV转基因小鼠，被用于评估(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989，86：207)。如Balb/c小鼠模型，100μg的DNA样品被溶解于200ml的PBS中，并且得到的溶液被肌内注射入每只小鼠的腿中。如图10所示，使用每组3只小鼠并且以2周的间隔总共给药4次。在每次给药时，从每只小鼠眶下静脉收集血液。最后一次给药后两周，脾细胞被收集用于测量细胞介导的免疫应答。测定细胞介导的免疫应答和抗体应答的水平的方法与实施例4中所述的方法相同。如图10中所示，类似于从Babl/c小鼠观察到的结果，相对高水平的抗-HBs抗体应答被HB-110诱导至HBV转基因小鼠，并且诱导的抗-HBs抗体应答的水平与注射次数成比例增加。另一方面，非常弱的抗体应答水平被HB-100诱导至HBV转基因小鼠。如图11——其通过IFN-g ELISPOT分析显示细胞介导的免疫应答——中所示，对HBsAg特异性的总体细胞介导的免疫应答是弱水平的。换句话说，从给予HB-110的三只小鼠检测到每106个脾细胞5-12个ISCs(干扰素γ分泌细胞)。从给予HB-100的组的三只小鼠中的两只检测到每106个脾细胞不超过5个ISCs。同时，对PreS1/S2的细胞介导的免疫应答显著增加，这与对HBsAg的细胞介导的免疫应答不同。特别是，对PreS1/S2具有特异性的细胞介导的免疫应答被有效诱导至给予HB-110的所有三只小鼠。相反，给予HB-100的三只小鼠显示出非常弱的免疫应答，即每106脾细胞不超过5个ISCs。
HB-110DNA疫苗包括多重抗原。在这点上，本发明目的在于研究在HBV转基因小鼠中诱导每种抗原特异性细胞介导的免疫应答的能力以及为诱导显著免疫应答所需的注射次数。HB-110DNA疫苗被注射入每组3只小鼠，分别为一次、两次和三次，并且在HB-110注射后2周，收集脾细胞以研究细胞介导的免疫应答。作为结果，如图12中所示，随着注射次数的增加，总细胞介导的免疫应答增加，并且可检测水平的免疫应答被抗原诱导。在对HBsAg和PreS1/S2具有特异性的细胞介导的免疫应答的情况下，当注射HB-110一次时诱导的免疫应答是弱的。相反，当注射HB-110两次和三次时，免疫应答被更好地诱导。在对核心抗原具有特异性的细胞介导的免疫应答的情况下，当注射HB-110一次和两次时，诱导的免疫应答是弱的。相反，当注射HB-110三次时，免疫应答被更好地诱导。在对Pol抗原具有特异性的细胞介导的免疫应答的情况下，当HB-110被注射一次时，不可检测的免疫应答水平被诱导。同时，当HB-110被注射两次和三次时，微弱的免疫应答被诱导。
在用HB-110免疫的小鼠中，抗体和细胞介导的免疫应答被很好地诱导。为了确认HB-110的疗效，减少血清HBsAg水平的效果被测定。特别是，HB-110包含IL-12m作为免疫佐剂。本发明的目的在于研究IL-12m对HB-110的疗效的影响。另外，为研究血清HbsAg——其是转基因——的表达水平，HBsAg ELISA试剂盒(Green-Cross)被使用。基于购自Fizgerald Ab&Ag的HbsAg对表达水平进行定量，并且小鼠血清用PBS稀释50倍用作样品。如图13中所示，当仅表达pGX10S/L和pGX10核心/Pol抗原的质粒被给予小鼠而无IL-12m时，小鼠在血清HBsAg水平上显示出大约30％的减少。在另一面，当表达这些抗原的质粒被给予小鼠，pGX10IL-12m以HB-110的形式注射入质粒时，小鼠在血清HBsAg水平上显示出大约90％的减少。因此，本发明提出，IL-12m在疗效中发挥重要作用，如当使用HB-110DNA疫苗时在HBV转基因小鼠中所确认的。
【工业应用】
如上所述，本发明提供了DNA疫苗，其包含编码乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、核心抗原和聚合酶抗原的抗原基因，以至不仅抗体应答而且细胞介导的免疫应答可以是被有效诱导的免疫应答，其对多重抗原具有特异性，从而提供对慢性乙型肝炎显示出预防和治疗效果的理想的预防性和治疗性DNA疫苗。包括在DNA疫苗中的基因优选地编码已被密码子优化的抗原，以便优化抗原在哺乳动物中的表达。因此，本发明的DNA疫苗的表达水平能在哺乳动物中被增强，从而有效地诱导免疫应答。
Figure IYZ000005209891800011
Figure IYZ000005209891800021
Figure IYZ000005209891800031
Figure IYZ000005209891800041
Figure IYZ000005209891800051
Figure IYZ000005209891800061
Figure IYZ000005209891800071
Figure IYZ000005209891800081

Claims (14)

1.乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗，其包含编码S蛋白质、L蛋白质、核心和聚合酶的抗原基因，其中所述S和L蛋白质的抗原基因被一起***至单一表达载体，以及所述核心和聚合酶的抗原基因被一起***至其它表达载体，其中编码S蛋白质的抗原基因是SEQ ID No.1的核苷酸序列，编码L蛋白质的抗原基因是SEQ ID No.2的核苷酸序列，编码核心蛋白质的抗原基因是SEQ ID No.9的核苷酸序列，并且编码聚合酶的抗原基因是SEQ ID No.10的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的HBV DNA疫苗，其中被一起***至单一表达载体的两个抗原基因被各自的启动子分别表达。
3.权利要求1所述的HBV DNA疫苗，其中所述表达载体是如图1所示的pGX10载体。
4.权利要求1所述的HBV DNA疫苗，进一步包含免疫佐剂。
5.权利要求4所述的HBV DNA疫苗，其中所述免疫佐剂是编码人IL-12变体的基因，并且其中所述IL-12变体被突变，这样，SEQ.ID.No23代表的人IL-12p40的氨基酸残基222的Asn用Leu取代。
6.权利要求1至4和6中任意一项所述的HBV DNA疫苗，其中所述疫苗被用于慢性乙型肝炎的治疗。
7.权利要求1至4和6中任意一项所述的HBV DNA疫苗，进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。
8.制备根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗的方法，包括：
(1)密码子优化编码S蛋白质、L蛋白质和核心的抗原基因；以及
(2)将所述S和L蛋白质的密码子优化的抗原基因一起***单一表达载体，以及将所述核心的密码子优化的抗原基因和编码HBV聚合酶的抗原基因一起***其他表达载体。
9.权利要求8所述的方法，其中所述表达载体是如图1所示的pGX1O载体。
10.权利要求8所述的方法，其中被一起***至所述单一表达载体的两个抗原基因被各自的启动子分别表达。
11.权利要求8所述的方法，进一步包括含有免疫佐剂。
12.权利要求11所述的方法，其中所述免疫佐剂是编码人IL-12变体的基因，并且其中所述IL-12变体被突变，这样，SEQ.ID.No23代表的人IL-12p40的氨基酸残基222的Asn用Leu取代。
13.权利要求12所述的方法，其中作为编码IL-12变体的基因的免疫佐剂被包含入表达载体中。
14.权利要求1至4和6中任意一项所述的HBV DNA疫苗在制备用于治疗慢性乙型肝炎的药物中的用途。
CN2006800561033A 2006-08-14 2006-08-14 用于治疗慢性乙型肝炎的dna疫苗及其制备方法 Expired - Fee Related CN101573449B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2006/003181 WO2008020656A1 (en) 2006-08-14 2006-08-14 A dna vaccine for curing chronic hepatitis b and a method of preparing same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101573449A CN101573449A (zh) 2009-11-04
CN101573449B true CN101573449B (zh) 2013-09-18

Family

ID=39082171

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2006800561033A Expired - Fee Related CN101573449B (zh) 2006-08-14 2006-08-14 用于治疗慢性乙型肝炎的dna疫苗及其制备方法

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP2057268B1 (zh)
CN (1) CN101573449B (zh)
WO (1) WO2008020656A1 (zh)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8071561B2 (en) 2007-08-16 2011-12-06 Chrontech Pharma Ab Immunogen platform
US20090214593A1 (en) * 2007-08-16 2009-08-27 Tripep Ab Immunogen platform
US8445663B2 (en) 2009-02-02 2013-05-21 Chrontech Pharma Ab Compositions and methods that enhance an immune response
CN101502650B (zh) * 2009-03-10 2011-12-28 邢益平 密码子优化的乙型肝炎核酸疫苗
EP2461826A2 (en) * 2009-08-07 2012-06-13 Transgene SA Composition for treating hbv infection
US10076570B2 (en) 2009-08-07 2018-09-18 Transgene S.A. Composition for treating HBV infection
CN102233136B (zh) * 2010-04-30 2013-05-08 北京凯因科技股份有限公司 一种用于***的重组质粒疫苗及其组合物
CN102233137B (zh) * 2010-04-30 2013-02-20 北京凯因科技股份有限公司 一种用于治疗乙型肝炎的重组质粒dna疫苗组合物
WO2012065286A1 (zh) * 2010-11-19 2012-05-24 北京凯因科技股份有限公司 一种用于预防和治疗乙型肝炎的dna疫苗组合物
TWI575070B (zh) 2011-07-12 2017-03-21 傳斯堅公司 Ｈｂｖ聚合酶突變體
EP3522920A2 (en) 2016-10-10 2019-08-14 Transgene SA Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy
GB201705765D0 (en) * 2017-04-10 2017-05-24 Univ Oxford Innovation Ltd HBV vaccine
EA202091513A1 (ru) 2017-12-19 2020-09-09 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Вакцины против вируса гепатита b (hbv) и их применение
EA202091516A1 (ru) 2017-12-19 2020-11-03 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Способы и композиции для индукции иммунного ответа против вируса гепатита b (hbv)
EA202091517A1 (ru) 2017-12-19 2020-11-03 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Способы и устройство для доставки вакцин против вируса гепатита b (hbv)
WO2020255010A1 (en) * 2019-06-18 2020-12-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of recombinant interleukin 12 construct and hepatitis b virus (hbv) vaccines
EP3986455A1 (en) * 2019-06-18 2022-04-27 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Arenavirus vectors for hepatitis b virus (hbv) vaccines and uses thereof
WO2020255020A1 (en) * 2019-06-18 2020-12-24 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Combination of hepatitis b virus (hbv) vaccines and pd-l1 inhibitors
AR120096A1 (es) 2019-09-30 2022-02-02 Gilead Sciences Inc Vacunas para vhb y métodos de tratamiento de vhb
WO2022133230A1 (en) * 2020-12-18 2022-06-23 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Combination therapy for treating hepatitis b virus infection

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100399728B1 (ko) 2000-03-15 2003-09-26 주식회사 프로젠 ＩＬ-12 활성을 증가시키는 ＩＬ-12ｐ40 소단위체돌연변이 유전자 및 이를 ＤＮＡ 백신 면역증강제로이용하는 용도
KR100472297B1 (ko) 2001-09-27 2005-03-07 주식회사 두산 리소인지질의 수용성 조성물
KR20130049210A (ko) * 2003-10-21 2013-05-13 멜버른 헬스 Ｈｂｖ 변이체 검출 및 응용
US20080274134A1 (en) * 2004-06-15 2008-11-06 Norbert Schulke Hiv-1 Neutralizing Antibodies Elicited By Trimeric Hiv-1 Envelope Glycoprotein Complex
WO2006039739A1 (en) * 2004-10-13 2006-04-20 Melbourne Health Hepatitis b viral (hbv) mutants detection and application

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
L Frelin等.Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis C virus nonstructural 3/4A gene.《Gene Therapy》.2004,第11卷522-533. *
Mohamed Tarek M. Shata等.Attempted therapeutic immunization in a chimpanzee chronic HBV carrier with a high viral load.《J Med Primatol》.2006,第35卷165-171. *
Nicolas Fissolo等.DNA vaccines prime CD8+ T cell responses to epitopes of viral antigens produced from overlapping reading frames of a single coding sequence.《Eur. J. Immunol.》.2005,第35卷117-127. *
S-H Yang等.Correlation of antiviral T-cell responses with suppression of viral rebound in chronic hepatitis B carriers: a proof-of-concept study.《Gene Therapy》.2006,第13卷1110-1117. *
摆茹等.DNA疫苗免疫原性的研究策略.《免疫学杂志》.2005,第21卷(第3期),S28-S31. *
秦山等.乙肝基因疫苗系列质粒的构建及其在真核细胞中的表达.《华西医科大学学报》.2001,(第2期),172-174. *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2057268B1 (en) 2014-08-13
EP2057268A4 (en) 2011-03-09
WO2008020656A1 (en) 2008-02-21
EP2057268A1 (en) 2009-05-13
CN101573449A (zh) 2009-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101573449B (zh) 用于治疗慢性乙型肝炎的dna疫苗及其制备方法
CN102573903B (zh) 用于治疗hbv感染的组合物
CN108779472B (zh) 针对乙型肝炎病毒的疫苗
CN103998604B (zh) Hbv聚合酶突变体
JP2001500738A (ja) 細胞内疾患を処置するための組成物および方法
JP2014523878A (ja) Ｄ型肝炎ウイルス感染の治療又は予防のための酵母ベースの組成物及び方法
JP2021506767A (ja) Ｂ型肝炎免疫化レジメン及び組成物
CN103442732A (zh) 编码乙型肝炎病毒核心蛋白的核酸分子和包含其的疫苗
Loirat et al. Muscle-specific expression of hepatitis B surface antigen: no effect on DNA-raised immune responses
Hong et al. Lentivector expressing HBsAg and immunoglobulin Fc fusion antigen induces potent immune responses and results in seroconversion in HBsAg transgenic mice
JP2024028762A (ja) Ｂ型肝炎免疫化レジメン及び組成物
CN1889963A (zh) 方法
KR100841732B1 (ko) 만성 ｂ형 간염의 치료를 위한 ｄｎａ 백신 및 그의 제조방법
US20220339281A1 (en) Hepatitis b immunisation regimen and compositions
KR101320702B1 (ko) 절단된 ｈｂｃ 코어 단백질과 사포닌계 보조제를 포함하는백신
AU2008297093A1 (en) Polynucleotides allowing the expression and secretion of recombinant pseudo-virus containing foreign epitopes, their production, and use
Geissler et al. Intracellular retention of hepatitis B virus surface proteins reduces interleukin-2 augmentation after genetic immunizations
US20160324954A1 (en) Immunogenic compositions for inhibiting hepatitis d virus
Sanyal et al. A review of multiple approaches towards an improved hepatitis B vaccine
EP1274851B1 (en) A nucleic acid construct encoding a processing component derived from the n-terminal region of the hepatitis virus orf2, and an antigenic polypeptide
KR100902817B1 (ko) 플라스미드 ｄｎａ 및 재조합 아데노 바이러스를 이용한ｃ형 간염 바이러스에 대한 방어면역력을 증진시키는 백신
Yoon et al. DNA-mediated immunization of mice with plasmid encoding HBs antigen
US20090093428A1 (en) Nucleotide vector, composition containing such vector, and vaccine for immunization against hepatitis
KR20030089291A (ko) 고발현 효과를 갖는 ｄｎａ 백신용 벡터 및 이를 이용하여만든 간염 백신
US20160215023A1 (en) Simple vaccines from dna launched suicidal flaviviruses

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130918

Termination date: 20160814