CN1844192A

CN1844192A - ABA型聚肽－b－聚四氢呋喃－b－聚肽三嵌段共聚物的合成

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Publication number: CN1844192A
Application number: CNA2006100671618A
Authority: CN
Inventors: 冯增国; 李海宾; 田振; 张爱英
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2006-04-06
Filing date: 2006-04-06
Publication date: 2006-10-11
Anticipated expiration: 2026-04-06
Also published as: CN100365043C

Abstract

本发明是一种ABA型聚肽－b－聚四氢呋喃－b－聚肽三嵌段共聚物的合成方法。该嵌段共聚物是以端氨基聚四氢呋喃为引发剂引发由氨基酸与三光气生成的α－氨基酸－N－羧基内酸酐(NCA)开环聚合得到的。根据NCA与引发剂的摩尔投料比，以及引发剂分子量的不同，能够制备不同嵌段长度的ABA型三嵌段共聚物，其中B段为聚四氢呋喃，A段为聚肽均聚或共聚物(其结构式如I所示)。该共聚物可以通过改变各嵌段分子量，以及均聚和共聚肽嵌段化学组成制备得到。该合成高分子可应用于再生医学的细胞与组织工程培养的支架材料、药物控释和基因转染治疗的载体，大分子前体药物，生物材料表面修饰等领域。

Description

ABA型聚肽-b聚四氢呋喃-b聚肽三嵌段共聚物的合成

技术领域

本发明属于生物医用高分子材料领域，主要涉及一类以聚四氢呋喃为中心嵌段的聚醚聚肽三嵌段共聚物及其合成方法。该聚醚聚肽三嵌段共聚物具有良好的生物相容性、力学性能和可降解性，其力学性能和降解性能可通过聚醚与聚肽嵌段的分子量及其组成变化来调节。该嵌段共聚物主要适用于再生医学中细胞与组织工程培养的支架、药物控释和基因转染的载体，大分子前体药物，生物材料表面修饰等领域。

背景技术

化学合成聚氨基酸或聚肽化合物具有与天然蛋白质或多肽相似的结构与性质(Hayashi T.Polymer Journal，1993，25：481)，显示出与细胞和组织良好的生物相容性；同时由于聚肽主链上存在大量肽键，在机体内极易受到酶的作用，从而能降解生成无毒的小肽或氨基酸产物，能够被机体吸收和代谢，因而具有优良的生物降解性和安全性。它们是当前再生医学中细胞与组织工程培养的支架和药物控释载体的理想生物材料，经脱保护基处理后也可广泛用于基因转染载体，大分子前体药物，生物材料表面修饰等领域。

化学合成聚肽同样含有大量的氢键使其具有稳定的二级结构，加之它们的憎水、静电和偶极-偶极等相互作用，使之具有了自组装特性。如能做到使合成聚肽具有窄的分子量分散，它就有可能通过自组装形成类似于天然蛋白质的纳米结构。合成聚肽独特的分子结构使其有别于传统的合成高分子材料，并具有很多传统高分子材料所不具备的性能，如良好的生物相容性、可降解性、自组装行为、液晶现象及力学性能等，是生物医用材料理想的选材。无论是开环聚合后直接得到的，还是经脱保护基处理后所生成的合成聚肽，都可作为细胞与组织工程培养的支架材料，所形成的支架不仅具有可控的生物降解性和适宜的力学性能，同时也具有大量可供细胞粘附生长进行识别的活性位点。另外，聚肽的自组装行为为开发控释药物新剂型提供了条件，使得药物具有了可控释、靶向输送、不溶性药物吸收率大大提高及可降解等诸多优点。聚赖氨酸及其共聚物等在基因转染中扮演着高分子载体的作用，通过与外源基因复合形成纳米颗粒将其送入细胞核内而发挥治疗作用，在治疗与遗传有关的疑难病症方面将发挥重要作用。合成聚肽材料作为药物控释和基因转染载体材料，已成为目前合成生物医用高分子研究领域的重要方向(Yoda R.J Biomater Sci Polym Ed，1998，9(6)：561；Pack D.W.NatureReview Drug Discovery，2005，4：581)。经脱保护基处理后的聚肽更是提供了大量可供进一步进行化学修饰的反应基团，如氨基，羧基，羟基等，在这些基团上接枝上像紫杉醇，阿霉素等抗癌药物可制成大分子前提药物，不仅能够大大降低抗癌药物的毒性，而且还可提高药物在肿瘤部位的蓄积浓度，明显改善药物的治疗效果(Haag R and Kratz F.Angew Chem Int Ed，2006，45：1198)。

天然蛋白质水凝胶已经广泛应用于食品、化妆品、药物载体和组织工程支架材料等领域。由于这种材料因产地、来源等的不同造成其性质均一性差，以及潜在的人与动物间可能出现的交叉感染等疾病，导致其不适合应用于生物医学材料领域。于是近年来人们纷纷转向化学合成聚肽水凝胶的研究。例如，Deming等人(Nature 2002，417：424)合成了一系列两亲二嵌段聚肽水凝胶，发现该水凝胶的性质可以通过改变两嵌段的分子结构与链段长度来予以调节。同时Taek等人(Angew Chem Int Ed 2005，44：7964)发现含有聚γ-苄基-L-谷氨酸酯的两嵌段共聚物在甲苯溶液中能够自组装形成有机凝胶体。Anderson等人(Biomed MaterSymp，1970，5：197)所制备γ-的苄基-L-氨酸酯与亮氨酸的共聚物具有十分优良的组织亲和性，在植入实验小鼠体内200天后，植入体周围有十分明显的新组织生长，该共聚物还具有良好的生物降解性能，降解速度随共聚组分的改变而变化。陈学思等首先以聚乙二醇单甲醚作引发剂，辛酸亚锡为催化剂，引发脂肪族环酯单体开环聚合得到了聚乙二醇单甲醚-脂肪族聚酯二嵌段共聚物。然后再将该共聚物的端羟基转变为苯丙氨基酸酯，并以其为大分子引发剂，再引发γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧基内酸酐等开环聚合得到聚乙二醇-脂肪族聚酯-聚氨基酸三嵌段共聚物(2003，CN 1440995A)。

另外通过调节聚肽嵌段侧链基团的亲、疏水性也可达到改变降解速度的目的，同时也可改变材料的力学性能，自组装行为等其它性能。林嘉平等(MacromoRapid Commun，2004，25：1241-6)用三乙胺引发γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧基内酸酐制备了均聚γ-苄基-L-谷氨酸酯，然后通过酯交换反应将聚乙二醇接枝在均聚肽链上，并研究了它的自组装行为。Jeong等(Polymer，2003，44：583-91)制备了两亲性可生物降解的聚天冬氨酸-g-聚己内酯共聚物，并制备出相应的聚合物胶束。这些材料因聚肽嵌段的存在所呈现出来的优异性质决定了它们在生物医用材料领域中将有着广泛的应用前景。

目前组织工程中大量采用的合成生物降解材料主要为聚乙交酯(PGA)、聚丙交酯(PLA)、聚ε-己内酯(PCL)等聚酯类化合物。虽然它们都具有良好的物理机械性能和生物相容性，可参与机体的吸收与代谢，不产生细胞毒性，但其分子结构中都缺乏供细胞粘附生长进行识别的活性位点，在其应用时毫不例外地都要进行材料表面改性处理才能使细胞生长良好。另外，有越来越多的证据表明，这些材料在临床应用中，还会出现由降解产生的酸性物质所引起的周围组织非特异性无菌性炎症反应；同时由酸性产物蓄积所造成的自催化作用能加快材料降解和崩解，最终造成支架整体塌陷；以及由降解所形成的羟基羧酸局部浓度过高造成pH值下降而导致大量细胞中毒、甚至死亡的现象。与此相比，化学合成的聚肽均聚与共聚物的分子结构由氨基酸单元组成，并具有手性以及生物体内广泛存在的α-螺旋，β-折叠等二级结构，因而与细胞、组织以及其它生物体显示出良好的生物相容性，其降解产物主要是易被生物体吸收的各种氨基酸，不会造成机体中毒引发炎症。此外，它们还有着良好的力学性能、成膜性和可纺性，使其在再生医学中细胞与组织工程领域成为替代可降解脂肪族聚酯的新型支架材料和表面修饰材料。

目前聚肽嵌段聚合物中常常引入聚乙二醇作为亲水链段来改善材料的亲水性。尽管聚乙二醇有良好的生物相容性，抗凝血性、无毒和低免疫性，但是由于聚乙二醇极易吸水，会导致材料的力学性能大幅度降低，使用场合受到限制。因此，本发明用聚四氢呋喃代替聚乙二醇作为中间嵌段，以提高材料的抗湿强度。聚四氢呋喃在医用聚氨酯材料中经常作为聚醚软段，已在人工血管、人工心脏、各类导管、填充物等植入材料中得到广泛使用。本发明采用聚四氢呋喃作为中间嵌段不会影响到材料的生物相容性和安全性。

发明内容(概述)

本发明目的旨在提供一种新型ABA型聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物的合成方法。制备步骤如下：

a)以无水四氢呋喃为溶剂，将各种氨基酸及其衍生物与三光气反应生成相应的NCA，然后产物用无水石油醚沉淀，过滤，干燥，得产品。

b)以无水N，N-二甲基甲酰胺为溶剂，在无水、无氧条件下以端氨基聚四氢呋喃为大分子引发剂引发相应氨基酸的NCA开环聚合形成ABA型聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，再用无水甲醇沉淀出所要产物，然后真空干燥得最终产品。通过调节端氨基聚四氢呋喃大分子引发剂分子量及其与不同氨基酸NCA的摩尔投料比，可以得到不同分子量、不同组成的的嵌段共聚物。

上述制备方法中，不同氨基酸及其衍生物首先通过重结晶得到纯度符合聚合要求的原料。

上述制备方法中，不同氨基酸NCA的制备，温度一般可控制在25℃～65℃反应，时间为0.5～6小时。

上述制备方法中，不同氨基酸NCA分别用无水乙酸乙酯/无水石油醚重结晶多次，熔点与文献值相符，元素分析实测值与理论值相差小于3‰。真空条件下保存待用。

上述制备方法中，端氨基聚四氢呋喃大分子引发剂在60℃～140℃下真空干燥2～12小时，然后降至室温。

上述制备方法中，端氨基聚四氢呋喃引发NCA开环聚合反应时间为48～96小时，反应温度范围20℃～60℃。

上述制备方法中，用无水甲醇作为沉淀剂沉淀出ABA型聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽嵌段共聚物，然后在20℃～60℃下真空干燥24小时，得最终产物。

本发明制得的产物为ABA型聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽嵌段共聚物的结构以聚γ-苯甲基-L-谷氨酸酯-b-聚四氢呋喃-b-聚γ-苯甲基-L-谷氨酸酯为例。

具体实施方式

实施例1

聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚四氢呋喃-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)合成

将5g端氨基聚四氢呋喃加到烧瓶中，在120℃真空干燥2小时，自然冷却至室温。在无水、惰性气体保护下，将含25g γ-苄基-L-谷氨酸-N-羧基内酸酐(BLG-NCA)的N，N-二甲基甲酰胺溶液加入烧瓶中。在室温、搅拌下，连续反应72小时。然后将反应液缓慢滴加到过量的无水甲醇溶液中，有白色沉淀生成，过滤，洗涤，40℃下真空干燥24h，称重，得最终产物。所得结果见表1。

表1聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)-b-聚四氢呋喃-b-聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)的

实验结果

编号	A/I	Yield(％)	DP(PBLG)	Mn
编号	A/I	Yield(％)	DP(PBLG)	Mn	1	10	73	12	3500
2	20	75	16	4700	1	10	73	12	3500
2	20	75	16	4700	3	30	76	28	7500
4	50	80	45	10911	3	30	76	28	7500
4	50	80	45	10911	5	80	82	60	14042

上表中A/I指端氨基聚四氢呋喃与单体BLG-NCA的摩尔投料比；产率为聚合物重量与端氨基聚四氢呋喃和BLG-NCA单体总重量之比；DP(PBLG)为¹H NMR测得的聚(γ-苄基-L-谷氨酸酯)的聚合度；Mn为由¹H NMR测定得到的ABA三嵌段聚合物的数均分子量。

实施例2

聚(γ-甲基-L-谷氨酸酯)-b-聚四氢呋喃-b-聚(γ-甲基-L-谷氨酸酯)合成

将2.3g端氨基聚四氢呋喃加到烧瓶中，在120℃真空干燥2小时，自然冷却至室温。在无水、惰性气体保护下，将含12g γ-甲基-L-谷氨酸-N-羧基内酸酐(MLG-NCA)的N，N-二甲基甲酰胺溶液加入烧瓶中。在室温、搅拌下，连续反应72小时。然后将反应液缓慢滴加到过量的无水甲醇溶液中，有白色沉淀生成，过滤，洗涤，40℃下真空干燥24h，称重，得最终产物。所得结果见表2。

表2聚(γ-甲基-L-谷氨酸酯)-b-聚四氢呋喃-b-(聚γ-甲基-L-谷氨酸酯)的

实验结果

编号	A/I	Yicld(％)	DP(PMLG)	Mn
编号	A/I	Yicld(％)	DP(PMLG)	Mn	1	10	73	9	2387
2	20	75	17	3531	1	10	73	9	2387

上表中A/T指端氨基聚四氢呋喃与单体MLG-NCA的摩尔比；产率为聚合物重量与端氨基聚四氢呋喃和MLG-NCA单体总重量之比；DP(PMLG)由¹H NMR测定得到的聚(γ-甲基-L-谷氨酸酯)的聚合度；Mn为由¹H NMR测定得到的ABA三嵌段聚合物的数均分子量。

实施例3

聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)-b-聚四氢呋喃-b-聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)合成

按表3中的投料比，首先将端氨基聚四氢呋喃加到烧瓶中，在120℃真空干燥2小时，自然冷却至室温。然后在无水、惰性气体保护下，将含γ-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-羧基内酸酐(BZL-Lys NCA)的N，N-二甲基甲酰胺溶液加入烧瓶中。在室温下搅拌，连续反应72小时。反应结束后将反应液缓慢滴加到过量的无水甲醇溶液中，有白色沉淀生成，过滤，洗涤，40℃下真空干燥24h，得最终产物。所得结果见表3。

表3聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)-b-聚四氢呋喃-b-聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)

的实验结果

编号	A/I	Yield(％)	DP(PZLL)	Mn
编号	A/I	Yield(％)	DP(PZLL)	Mn	1	20	65	18	5821
2	40	77	34	10018	1	20	65	18	5821
2	40	77	34	10018	3	60	81	60	16820

上表中A/I指端氨基聚四氢呋喃与单体BZL-NCA的摩尔比；产率为聚合物重量与端氨基聚四氢呋喃和BZL-NCA单体总重量之比；DP(PZLL)由¹H NMR测定得到的聚(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸)的聚合度；Mn为由¹H NMR测定得到的ABA三嵌段聚合物的数均分子量。

实施例4

ABA型聚(ε-三氟乙酰基-L-赖氨酸)-b-聚四氢呋喃-b-聚(ε-三氟乙酰基-L-赖氨酸)的合成

按表4中的投料比，首先将端氨基聚四氢呋喃加到烧瓶中，在120℃真空干燥2小时，自然冷却至室温。然后在无水、惰性气体保护下，将含ε-三氟乙酰基-L-赖氨酸-N-羧基内酸酐(TFA-Lys NCA)的N，N-二甲基甲酰胺溶液加入烧瓶中。在室温搅拌下，连续反应72小时。反应结束后将反应液缓慢滴加到过量的蒸馏水中，有白色沉淀生成，过滤，洗涤，40℃下真空干燥24h，得最终产物。所得结果见表4

表4聚(ε-三氟乙酰基-L-赖氨酸)-b-聚四氢呋喃-b-聚(ε-三氟乙酰-L-赖氨酸)

的实验结果

编号	A/I	Yield(％)	DP(PTLL)	Mn
编号	A/I	Yield(％)	DP(PTLL)	Mn	1	40	36	28	7377
2	60	50	34	8722	1	40	36	28	7377
2	60	50	34	8722	3	80	48	45	11189

上表中A/I指端氨基聚四氢呋喃与单体TFA-Lys NCA的摩尔比；产率为聚合物重量与端氨基聚四氢呋喃和BZL-NCA单体总重量之比；DP(PTLL)由元素分析测定聚(ε-三氟乙酰基-L-赖氨酸)的聚合度；Mn为ABA三嵌段聚合物的数均分子量，由元素分析测定得到。

Claims

1、一种ABA型聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，此共聚物包括：

(a)共聚物中聚四氢呋喃嵌段的分子量范围为800至10,000；

(b)共聚物中聚肽嵌段是由端氨基聚四氢呋喃作为引发剂引发各种保护和未保护的氨基酸-N-羧基内酸酐(NCA)开环聚合得到的，可以通过NCA与引发剂摩尔投料比变化来控制该嵌段的分子量与组成。

该二嵌段共聚物可以直接作为生物可降解材料用于再生医学中细胞与组织工程培养支架的制备和作为药物控释的载体材料。也可通过脱保护基反应制成含有活性羧基或氨基等反应基团的聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，用于基因转染治疗，大分子前体药物，生物材料表面修饰等领域。

2、根据权利要求1的聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，其中所述的端氨基聚四氢呋喃聚醚的分子量范围从800至10,000可变。

3、根据权利要求1的聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，其中聚肽嵌段可由氨基酸-N-羧基内酸酐通过开环聚合制备得到。而氨基酸-N-羧基内酸酐可由各种氨基酸及其衍生物与(三)光气反应制备得到，所涉及到的氨基酸及其衍生物包括有谷氨酸(Glu)及其衍生物，如γ-苄基-L-谷氨酸酯，γ-甲基-L-谷氨酸酯，γ-乙基-L-谷氨酸酯等；赖氨酸(Lys)及其衍生物，如ε-苄氧羰基-赖氨酸，ε-叔丁氧羰基-赖氨酸，ε-三氟乙酰基-赖氨酸等；还可包括有亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)、异亮氨酸(Ile)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)、天门冬氨酸(Asp)、丝氨酸(Ser)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、精氨酸(Arg)、天门冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)等。

4、根据权利要求1的聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，其中端氨基聚四氢呋喃与NCA的摩尔投料比例为1∶10至1∶200，在此范围内聚合反应可控，共聚物的分子量可以通过改变投料比加以调控。

5、根据权利要求1的聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，其中该共聚物的分子量范围从1,800至50,000变化。

6、根据权利要求1的聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，其中的聚肽嵌段可以是由同一种氨基酸-N-羧基内酸酐经开环聚合制备得到的聚氨基酸均聚物。

7、根据权利要求1的聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，其中聚肽嵌段的组成也可以是由两种或两种以上的氨基酸-N-羧基内酸酐单体，通过先后加料顺序，经开环聚合制备得到的聚氨基酸嵌段共聚物。

9、根据权利要求1的聚肽-b-聚四氢呋喃-b-聚肽三嵌段共聚物，其中聚肽嵌段的组成可以采用-锅投料法，由两种或两种以上的氨基酸-N-羧基内酸酐单体，经开环聚合制备得到的聚氨基酸无规共聚物。