CN1840187A - 高活性凝血酶抑制剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高活性凝血酶抑制剂的制备方法，以凝血酶的天然特异抑制剂水蛭素为改造对象，应用DNA家族改组技术，将水蛭素HV1、HV2、HV3基因进行改组，构建水蛭素噬菌体展示的改组文库，以凝血酶为包被抗原，对噬菌体改组库进行3轮“吸附、洗脱、扩增”的富集淘选，再经ELISA筛选得到多个与凝血酶具有高亲和力的噬菌体单克隆。对这些克隆进行原核诱导表达，检测纯化表达产物的抗凝血酶活性，获得抗凝血酶活性较天然的水蛭素更强的水蛭素蛋白。采用本发明所制备的高活性凝血酶抑制剂具有以下优点：1)抗凝血酶活性更强，疗效显著；2)分子量小，不具有免疫原性；3)安全，无明显毒副作用。

Description

高活性凝血酶抑制剂的制备方法

技术领域

本发明属于应用基因工程技术，涉及用DNA家族改组技术进行体外基因随机重组，增加基因的多样性，结合高效快捷的筛选***，从中获得具有更好生物学功能的表达产物，具体涉及一种高活性凝血酶抑制剂的制备方法。

背景技术

当今血栓性心脑血管疾病已成为威胁人类健康的大敌，探索和研究有效防治此病的药物是一项十分紧迫的任务。抗凝和抗血小板治疗是当今心血管疾病的重要里程碑，传统的抗凝药，如非组分肝素(UFH)、低分子肝素、丙酮苄羟香豆素等，作为血浆凝血***抑制剂已在临床广泛使用，但有一定的局限性，其作用依靠血小板抗凝血因子III活性，对已凝结的血块没有作用，能被血小板因子IV和肝素酶灭活等。此外，其狭窄的治疗窗和诱发血小板减少症(HIT)表明其存在安全性问题。寻找更有效的抗凝、抗栓制剂已成为当今心血管药物研究领域的主要研究方向之一。

水蛭始载于《(神农本草经》，千百年来，水蛭一直是祖国医学中重要的活血化瘀药，具有破血、逐瘀、通经作用。从水蛭及唾液腺中分离提纯出的活性成分—水蛭素(hirudin)是由65-66个氨基酸组成的小分子蛋白质。水蛭素对凝血酶有极强的抑制作用，是迄今为止所发现的最强的凝血酶天然特异抑制剂。动物试验与临床研究表明，水蛭素具有高效的抗凝血、抗血栓形成活性，以及防止凝血因子活化和血小板反应等发生的功能。与传统的抗凝血酶分子相比，水蛭素具有专一性强，用量小，疗效显著以及无明显毒副作用；不依赖于体内抗凝血酶III，对因遗传或后天原因缺乏抗凝血酶III的病人同样有效；分子量小，不具有免疫原性等优点，成为优于肝素的理想抗凝抗血栓制剂，可用于各种血栓性疾病的预防和治疗，在现代医药学中具有广阔的应用前景。

DNA改组(DNA shuffling)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种分子水平上的体外定向进化技术，它使得进化速度较常规的定向进化大大加快，同时比随机诱变显著地提高了良性突变的概率。通过基因在分子水平上的有性重组，改变基因或基因家族原有的核苷酸序列，增加基因的多样性，并赋予表达产物以新功能。该技术已在基础研究、生物制药、工业酶改造等方面取得巨大成功，被誉为定向进化的技术革命。DNA改组最初采用单个基因进行，其缺点是改组文库中有意义的重组体较少。自然界中存在许多物种来源不同、基因序列有所差异但功能相似的基因家族。采用这些基因家族进行改组事实上就是在体外模拟达尔文进化的过程，大大提高了体外进化的效率，DNA家族改组(DNA family shuffling)已逐渐成为DNA改组的主要方法。

DNA改组的效果必须由改组后的基因表达产物的功能来验证。因此，灵敏可靠的选择或筛选方法是DNA改组技术成功与否的关键。噬菌体表面展示(phage display)是一种用于筛选和改造功能性多肽的生物技术。其基本原理主要是利用某些单链丝状噬菌体如M13、fd等感染的可分泌特性，以及将外源基因***这些噬菌体外膜蛋白PIII的末端构成融合蛋白时，既不影响噬菌体的感染特性，同时保留外源基因产物的结构和生物学功能的性质，使外源基因在噬菌体表面有效地表达，并可通过测定噬菌体单链DNA顺序推导出所融合外源基因的氨基酸序列。该技术的最大优点是实现了基因型和表型的转换，利用其配体的特异性亲和力，可对蛋白质或多肽进行高效率的筛选。

天然水蛭素来源匮乏，产量有限，限制了其临床应用；再加之水蛭素有多种变异体，以前的研究工作每次只能对某一种水蛭素变异体进行重组表达，无法实现对多个变异体同时进行快速进化，以进一步提高水蛭素编码蛋白的功能。

发明内容

本发明的目的在于，应用基因工程技术，提供一种高活性凝血酶抑制剂的制备方法，该方法首先对改造对象进行DNA家族改组，获得多样性的改组基因，构建噬菌体展示的改组文库，经凝血酶亲和淘选及ELISA筛选，获得高亲和力的噬菌体克隆，对所得克隆的表达产物的活性进行检测，由此获得高活性的凝血酶抑制剂。

实现上述发明目的的技术解决方案是：

一种高活性凝血酶抑制剂的制备方法，按下述步骤进行：

1)根据凝血酶抑制剂的基因序列，选择水蛭素HV1、HV2、HV3作为改造对象，采用分段合成寡核苷酸片段，互补寡核苷酸片段退火配对后，经PCR扩增而获得目的基因。

2)取等量的上述3种纯化后的PCR产物，用DNaseI消化，回收50bp左右片段，经无引物PCR进行随机组装，有引物PCR扩增，回收目的片段，获得水蛭素的DNA家族改组基因。

3)将DNA家族改组基因定向克隆入经SfiI和NotI双酶切的噬菌体表达载体pCANTAB5E中，转化E.coli TG1细胞，加入M13KO7辅助噬菌体进行超感染，获得水蛭素的噬菌体改组文库。

4)以凝血酶为包被抗原，对噬菌体改组库进行3轮“吸附、洗脱、扩增”的筛选，随着包被抗原浓度的不断降低，洗涤次数及洗涤力度的不断加强，改组文库中凝血酶特异的水蛭素突变体得到了有效富集。

5)扩增第3轮筛选所得的噬菌体克隆，用ELISA鉴定各噬菌体单克隆与凝血酶的结合活性，获得能与凝血酶产生高亲和力结合的阳性克隆。

6)将ELISA筛选出的阳性噬菌体感染HB2151，加入IPTG诱导表达，提取菌体的周质提取液，经HiTrap Anti-E Tag亲和纯化柱进行纯化，ChromozymTH为发色底物，测定其水蛭素变异体抑制凝血酶的活性，得到高活性的凝血酶抑制剂。

采用本发明所制备的高活性凝血酶抑制剂具有以下优点：1)抗凝血酶活性更强，疗效显著；2)分子量小，不具有免疫原性；3)安全，无明显毒副作用。

本发明可望为各种血栓性疾病的预防和治疗提供一种更为有效的新型制剂。

附图说明

图1是本发明的高活性凝血酶抑制剂的制备流程图。

图2是表达产物的SDS-PAGE和western blot鉴定。

具体实施方式

1.目的基因的合成

(1)水蛭素基因及PCR引物的设计

根据水蛭素HV1、HV2、HV3的氨基酸序列，设计3个基因的编码序列及PCR引物序列，水蛭素基因均分为8个单链核苷酸片段，DNA合成由上海生工生物工程公司完成。各基因及相应PCR引物的序列如下：

①HV1基因序列

1    tatgcggcccagccggccgttgtttacactgactgtactgaatctggtcaaaacttgtgt

61   ttgtgtgaaggttctaacgtttgtggtcaaggtaacaagtgtatcttgggttctgacggt

121  gaaaagaaccaatgtgttactggtgaaggtactccaaagccacaatctcacaacgacggt

181  gacttcgaagaaattccagaagaatacttgcaagcggccgcaggt

PCR正向引物：5′-ta g cgg ccc agc cgg ccg ttg ttt aca ct(SfiI)

PCR反向引物：5′-act  gcg gcc gct tgc aag ta(NotI)

PCR正向引物及反向引物的5’端分别带有SfiI和NotI酶切位点。

②HV2基因序列

1    tatgcggcccagccggccattacttacactgattgtacagaatcgggtcaaaatttgtgc

61   ctctgcgagggaagcaatgtttgcggtaaaggcaataagtgcatattgggttctaatgga

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PCR正向引物：5′-ta g cgg ccc agc cgg cca tta ctt aca ct(SfiI)

PCR反向引物：5′-act  gcg gcc gct tgt aaa ta(NotI)

PCR正向引物及反向引物的5’端分别带有SfiI和NotI酶切位点。

③HV3基因序列

1    tatgcggcccagccggccatcacctacactgactgtaccgaatctggtcaaaacttgtgt

61   ttgtgtgaaggttctaacgtttgtggtaagggtaacaagtgtatcttgggttctcaaggt

121  aaggacaaccaatgtgttactggtgaaggtactccaaagccacaatctcacaaccaaggt

181  gacttcgaaccaatcccagaagacgcttacgatgaagcggccgcaggt

PCR正向引物：5′-ta g cgg ccc agc cgg cca tca cct aca ct(SfiI)

PCR反向引物：5′-act  gcg gcc gct tca tcg ta(NotI)

PCR正向引物及反向引物的5’端分别带有SfiI和NotI酶切位点。

(2)寡核苷酸片段的5’羟基磷酸化

对化学合成的核苷酸片段进行磷酸化反应，20μL反应体系组成如下：寡核苷酸200pmol，10×反应缓冲液2μL，ATP(1mmol/L)1μL，T4多聚核苷酸酸激酶2μL。37℃水浴60min，70℃保温10min中止反应。

(3)互补寡核苷酸片段的退火配对

将等摩尔的磷酸化的互补寡核苷酸片段在80μL终体积退火缓冲液中混合，95℃水浴保温5min，70℃保温10min，然后缓慢冷却至室温，将此退火混合物用乙醇沉淀备用。

(4)PCR扩增目的基因

退火产物经T4连接酶连接后作为模板，以相应的PCR引物按如下参数进行PCR扩增：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸50s，共进行30个循环。扩增的PCR产物于琼脂糖凝胶中进行电泳，回收的目的基因克隆入pMD-18T载体中，转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒送北京三博远志生物技术公司测序。所得的水蛭素基因HV1、HV2、HV3与射击序列一致。

2.水蛭素基因的DNA家族改组

(1)DNaseI消化

在100μl体系中(40mmol/L Tris-HCl pH7.5，8mmol/L MgCl₂，5mmol/LDTT)，加入纯化后的3种基因PCR产物各约1μg，0.5U DNaseI，15℃反应30min，95℃10min终止。产物进行琼脂糖凝胶电泳，切下50bp左右片段，用DNA小片断回收试剂盒回收。

(2)DNA改组

①无引物PCR随机组装

于50μL PCR体系中加入约1μg DNaseI消化后的回收片段，2.5U Taq酶，94℃预变性3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，45个循环，72℃延伸5min。

②有引物PCR扩增

将无引物PCR产物1∶50稀释进行有引物PCR，100μL PCR体系加入引物(HF、HR)至0.5mmol/L，2.5U Taq，2.5μL无引物PCR产物，94℃预变性3min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 50s，35个循环，72℃延伸5min。从第2轮PCR产物中电泳回收目的片段，获得水蛭素的DNA家族改组基因。

HF引物：5′-cct ttc tat  gcg gcc cag ccg gcc(SfiI)

HR引物：5′-acc ggc gca cct  gcg gcc gc(NotI)

3.水蛭素噬菌体改组库的构建

用SfiI和NotI酶切改组基因片段，与经同样双酶切的pCANTAB5E载体在T4 DNA连接酶作用下进行连接。纯化的连接产物经电转化感受态E.coliTG1。取少量转化产物转化菌梯度稀释后铺板，计数菌落，测定库容。其余的菌液涂于SOBAG平板，30℃培养24h。用2×YT培养基收集细菌集落，取一部分悬于10mL 2×YTAG培养基中，调整至A₆₀₀约为0.3，37℃，250r/min振荡培养1h。加入5×10¹⁰pfu的M13KO7辅助噬菌体进行超感染，继续振荡培养1h，离心，菌体重悬于2×YTAK培养基中，37℃过夜培养，次日离心收集上清，加入1/5体积的PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体，冰浴1h，离心弃上清，以2×YT溶解沉淀，瞬时离心，上清即为噬菌体改组库，0.45μm滤膜过滤后于4℃保存备用。

4.噬菌体改组库的亲和淘选

(1)凝血酶的包被

PBS稀释凝血酶(Sigma产品，T-4648)为20mg/L，将凝血酶溶液加到90mm塑培养皿中，置湿盒中于4℃包被过夜。弃包被液，加入5g/L BSA室温封闭2h。

(2)噬菌体亲和淘选

封闭的培养皿经PBS/Tween 20洗涤3次，加入改组噬菌体库于室温轻摇吸附2h。经Tween 20浓度为1mL/L的PBST洗板10次，加洗脱缓冲液(0.2mol/L HCl/Gly，pH2.2)室温解离15min，再加入中和缓冲液(1mol/LTris·HCl，pH9.1)中和。加入当日培养的E.coli TG1菌液10mL，37℃缓摇吸附30min进行感染，取10μl测定cfu，其余菌液继续培养至1h，离心，菌体重悬至2×YTAK中。37℃ 250r/min振荡培养12-16h，PEG/NaCl溶液沉淀噬菌体，溶于PBS缓冲液中，并经0.45μm的滤膜过滤除菌。取1μL重组噬菌体溶液测定扩增后的滴度，进行下一轮淘选。

第2轮淘选：将10mg/L的凝血酶包被在培养皿中，加入经PBSM封闭的噬菌体抗体库，于室温下反应2h，倒出噬菌体溶液，用Tween 20浓度为3mL/L的PBST洗板15次，再用PBS洗涤酶标板20次。加入洗脱缓冲液以洗脱噬菌体抗体，经中和缓冲液溶液中和，测定回收率并扩增噬菌体。

第3轮分别重复第2轮。但为了富集特异结合的噬菌体，适当降低凝血酶的浓度(5mg/L)和所投入的噬菌体库的量，将PBST中Tween 20的浓度加大为5mL/L，洗板20次，第3轮淘选得到的噬菌体测定滴度，保留菌落。

经3轮噬菌体亲和淘选，噬菌体回收率呈一个增加的趋势，第3轮比第1轮增加了约57.2倍(表1)，表明特异结合的噬菌体得到有效富集。

表1噬菌体改组库的富集

Panninground	Thrombin(mg/L)	Phages input(cfu)	Phages output(cfu)	Recoveryratio
					1	20	5.3×1012	4.4×106	8.30×10-7
2	10	2.1×1011	6.4×106	3.05×10-5
					3	5	2.0×1011	9.5×106	4.75×10-5

5.用ELISA法筛选阳性噬菌体

取PBS稀释凝血酶0.25mg/L 100μL/孔包被酶标板，4℃静置过夜。弃包被液，20g/L脱脂奶粉的PBSM 200μl室温封闭1h。洗涤包被板，将亲和淘选所得到的单克隆噬菌体与PBSM等体积含混合，室温孵育30min，96孔板中每孔加入100μL，37℃孵育2h。PBST洗涤6遍，加入稀释后的HRP-M13mAb，37℃孵育1h，PBST洗涤6遍后，加入OPD显色，测定A₄₉₂值，筛选阳性噬菌体(表2)。将ELISA测定值较高的阳性克隆，送交北京三博远志生物技术有限公司进行测序。

表2噬菌体克隆的ELISA测定值(A₄₉₂)

克隆号	1	2	3	4	5	6	7	8
									A492	0.510	0.097	0.695	0.031	0.105	0.147	0.096	0.319
克隆号	9	10	11	12	13	14	15	16
									A492	0.213	0.903	0.142	0.205	0.428	0.180	0.088	0.158

6.水蛭素变异体的表达、纯化

挑选ELISA测定值较高的克隆噬菌体感染HB2151，铺板后，挑取单克隆接种到2×YTAG培养基中，培养至对数生长期，离心，菌体重悬于2×YT培养基中，加人IPTG至1mmol/L诱导表达4h，收集菌体，重悬于100uL的周质提取液(1g/L溶菌酶，200g/L蔗糖，1mmol/L EDTA，30mmol/L Tris-HCl，pH8.0)，冰上放置10min，离心，弃沉淀，上清为周质蛋白混合液，经HiTrapAnti-E Tag亲和纯化柱进行纯化。

7.水蛭素变异体蛋白水平的检测

将纯化的表达产物进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色后，在相对分子量约10kD处出现了一条表达带，为PIII signal-hirudin-E tag融合蛋白。表达蛋白用HRP-anti E-tag抗体作Western blot分析，发现在相对分子量10kD处有一条清晰的显色条带(附图2)，说明水蛭素在E.coli HB2151中实现了可溶性表达。

8.水蛭素抗凝血酶活性分析

从第3轮淘选得到的变异体中挑选ELISA测定值较高的1号、3号、8号、10号和13号克隆经DNA测序，确定变异体的突变位点，并在大肠杆菌HB2151中诱导表达，表达产物纯化后，以Chromozym TH为发色底物，于405nm波长下测定其水蛭素变异体抑制凝血酶的活性，计算各水蛭素变异体的相对活性(表3)。

表3水蛭素变异体及其抗凝血酶活性

Clone	Hirudinvariants	Antithrombotic actiVity(ΔA405 value*)	Relativeactivity(％)
				1	HV1-D5G	0.139	43
3	HV1-K27Q	0.233	72
				8	HV1-S50P	0.081	25
10	HV2-N47K	0.538	166
				13	HV2-E57D	0.123	38
Wild type	HV1	0.318	98
				Wild type	HV2	0.324	100
Wild type	HV3	0.308	95

^*ΔA₄₀₅＝A405(pCANTAB 5E-HV)-A₄₀₅(pCANTAB 5E).

水蛭素抗凝血酶活性分析结果显示，10号克隆相对活性高于野生型水蛭素HV2，3号活性略有下降，1、8、13号的相对活性下降较明显，表明经DNA家族改组可获得较野生型抗凝血酶活性更强的水蛭素变异体HV2-N47K，其相应的DNA及氨基酸序列如下：

1    attacttacactgattgtacagaatcgggtcaaaatttgtgcctctgcgagggaagcaat

      I  T  Y  T  D  C  T  E  S  G  Q  N  L  C  L  C  E  G  S  N

61   gtttgcggtaaaggcaataagtgcatattgggttctaatggaaagggcaaccaatgtgtc

      V  C  G  K  G  N  K  C  I  L  G  S  N  G  K  G  N  Q  C  V

121  actggcgaaggtacaccgaaacctgaaagccataataacggcgatttcgaagaaattcca

      T  G  E  G  T  P  K  P  E  S  H  N  N  G  D  F  E  E  I  P

181  gaagaatatttacaa

      E  E  Y  L  Q

凝血酶抑制剂改造对象还可采用水蛭素变异体HV1、HV2、HV3、HM1及HM2中的任意一种基因，或者水蛭素变异体HV1、HV2、HV3与HM1或HM2中任意一种基因或两种基因的混合物，或者山蛭素、theromin或haemadin之一，或水蛭素与上述3种分子之一、之二或全部的混合物，均可按照上述方法制备高活性的凝血酶抑制剂。

Claims (4)

1、一种高活性凝血酶抑制剂的制备方法，其特征在于：按下述步骤进行：

1)根据凝血酶抑制剂的基因序列，选择水蛭素HV1、HV2、HV3作为改造对象，采用分段合成寡核苷酸片段，互补寡核苷酸片段退火配对后，经PCR扩增而获得目的基因。

2)取等量的上述3种纯化后的PCR产物，用DNaseI消化，回收50bp左右片段，经无引物PCR进行随机组装，有引物PCR扩增，回收目的片段，获得水蛭素的DNA家族改组基因。

3)将DNA家族改组基因定向克隆入经SfiI和NotI双酶切的噬菌体表达载体pCANTAB5E中，转化E.coli TG1细胞，加入M13K07辅助噬菌体进行超感染，获得水蛭素的噬菌体改组文库。

4)以凝血酶为包被抗原，对噬菌体改组库进行3轮“吸附、洗脱、扩增”的筛选，随着包被抗原浓度的不断降低，洗涤次数及洗涤力度的不断加强，改组文库中凝血酶特异的水蛭素突变体得到了有效富集。

5)扩增第3轮筛选所得的噬菌体克隆，用ELISA鉴定各噬菌体单克隆与凝血酶的结合活性，获得能与凝血酶产生高亲和力结合的阳性克隆。

6)将ELISA筛选出的阳性噬菌体感染HB2151，加入IPTG诱导表达，提取菌体的周质提取液，经HiTrap Anti-E Tag亲和纯化柱进行纯化，ChromozymTH为发色底物，测定其水蛭素变异体抑制凝血酶的活性，得到高活性的凝血酶抑制剂。

2、如权利要求1所述的高活性凝血酶抑制剂的制备方法，其特征在于，所述凝血酶抑制剂改造对象可采用水蛭素变异体HV1、HV2、HV3、HM1及HM2中的任意一种基因。

3、如权利要求1所述的高活性凝血酶抑制剂的制备方法，其特征在于，所述凝血酶抑制剂改造对象可采用水蛭素变异体HV1、HV2、HV3与HM1或HM2中任意一种基因或两种基因的混合物。

4、如权利要求1所述的高活性凝血酶抑制剂的制备方法，其特征在于，所述凝血酶抑制剂改造对象可采用山蛭素、theromin或haemadin之一，或水蛭素与上述3种分子之一、之二或全部的混合物。

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