ES2548584T3 - Un procedimiento para la destrucción de bacterias - Google Patents

Abstract

Un procedimiento ex vivo para producir la muerte de células bacterianas que comprende: (a) la exposición de una célula bacteriana donante en un cultivo bacteriano heterogéneo a condiciones en las que un elemento genético movilizable que codifica un componente receptor para un fago puede transferirse de dicha célula donante a una célula receptora que no es sensible a la unión del fago, con lo que dicho elemento movilizable se transfiere a la célula receptora y le confiere a dicha célula receptora sensibilidad a la unión del fago; y (b) la administración del fago para infectar las células que expresan el receptor, donde dicha infección resulta en la muerte de las células sensibles.

Description

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Klebsiella. Infección de heridas de accidentes de tráfico: en su mayoría organismos del suelo y anaerobios (especies de Clostridium, especies de Bacteroides).

[0050] Los cultivos bacterianos heterogéneos que se encuentran en el entorno pueden incluir al menos dos

5 especies bacterianas, incluida una de las especies siguientes: especies de Escherichia, especies de Salmonella, especies de Shigella, especies de Pseudomonas, especies de Klebsiella, especies de Proteus, especies de Bacillus, micobacterias del suelo y Streptomyces. Esta lista no excluye otros tipos de especies bacterianas que pueden estar representados en la población.

10 [0051] Pueden existir subconjuntos o subpoblaciones que contienen plásmidos, por ejemplo, algunas bacterias pueden tener diversos plásmidos diferentes o combinaciones de los mismos, los cuales pueden conferir diversas ventajas selectivas en determinadas condiciones. Ciertos plásmidos pueden codificar uno o más genes de resistencia a antibióticos o de virulencia. Los plásmidos de grupos Inc sirven típicamente para impedir la coexistencia de otros plásmidos del grupo de incompatibilidad en el mismo huésped. Véanse, por ejemplo, Femández-López y

15 col. (2006) "Dynamics of the IncW genetic backbone imply general trends in conjugative plasmid evolution", FEMS Microbiol. Rev. 30(6): 942-66, PMID: 17026718; y Adamczyk y Jagura-Burdzy (2003) "Spread and survival of promiscuous IncP-1 plasmids", Acta Biochim. Pol. 50(2): 425-53, PMID: 12833168. A menudo, la heterogeneidad en una especie puede reflejar la falta de presión selectiva entre formas diferentes o la incompleta selección de un fenotipo individual preferido.

20 [0052] Los tectivirus, miembros de la familia Tectiviridae, se refieren a un cierto fago de amplio espectro de huéspedes. Aunque los tectivirus son una forma de fagos de amplio espectro de huéspedes, existen otros, y otros más se descubrirán con la caracterización apropiada o con los criterios de selección pertinentes. Los criterios de clasificación pueden basarse en combinaciones de características estructurales y funcionales compartidas por los

25 miembros del género o la especie. En particular, existen otros fagos similares, por ejemplo de las familias Inoviridae, Leviviridae y Podoviridae, cuya infectividad depende de plásmidos. En particular, estos ejemplos incluyen fagos cuyo espectro de huéspedes se define por que los huéspedes tienen plásmidos especiales, por ejemplo, que codifican un receptor para el fago respectivo. Como tales, estos plásmidos confieren la capacidad para la unión del fago y la infección por el mismo de huéspedes compatibles con el plásmido.

30 [0053] Entre otros fagos dependientes de plásmidos se incluyen: los plásmidos IncP proporcionan sensibilidad a ciertos fagos de la familia Inoviridae, por ejemplo, PR64FS e If1. Según se describe en otra parte, los plásmidos IncP, IncN e IncW proporcionan sensibilidad a ciertos fagos de la familia Tectiviridae, por ejemplo, PRD1, PR4, PR3, PR5, PR772 y L17. Los plásmidos IncD proporcionan sensibilidad a ciertos fagos de la familia Leviviridae o de ARN,

35 incluidos, por ejemplo, los fagos D; R687, R711b, R778b y R840; el plásmido codifica estructuras que se asemejan a los fagos M y pilH α y el fago se une a los lados y el extremo de los pelos sexuales. La formación de placas muestra cierta sensibilidad a la temperatura, a menudo con mayor sensibilidad a menor temperatura. Los plásmidos IncM proporcionan sensibilidad a fagos de ARN, por ejemplo, el fago M, que parece funcionar en muchos organismos que contienen estos plásmidos. Los plásmidos IncX, IncM, IncN, IncP1, IncU, IncW y el plásmido R775 parecen

40 proporcionar sensibilidad a fagos filamentosos que se adsorben a los extremos de los pelos sexuales, incluidos, por ejemplo, los fagos X y R6K. Los plásmidos IncC proporcionan sensibilidad a fagos de ARN, incluido, por ejemplo, el fago C-1; o fagos filamentosos, incluido, por ejemplo el fago C-2. Los plásmidos IncC, IncD e IncJ proporcionan sensibilidad a fagos de la familia Siphoviridae, incluido, por ejemplo, el fago J. El plásmido Folac proporciona sensibilidad al fago Folac. Los plásmidos IncP también proporcionan sensibilidad al fago filamentoso Pf3 (véase

45 Luiten y col. (1985) J. Virol. 56(1): 288-276) y los segmentos de unión al receptor en este pueden usarse para el direccionamiento de un agente destructivo, ya se trate de un fago intacto u otra actividad ligada al dominio de unión al receptor (véanse, por ejemplo, los documentos WO 2007/130655 y PCT/US2007/010972). Igualmente, los plásmidos IncI o IncN proporcionan sensibilidad al fago filamentoso Ike y los plásmidos IncI, IncN e IncP confieren sensibilidad al fago filamentoso I2-2. Véase, por ejemplo, Bradley y col. (1983) J. Bact. 154(1): 505-507.

50 [0054] Varios de los tectifagos descritos afectan a diferentes organismos grampositivos, por ejemplo, Bam35 actúa sobre B. thuringiensis, AP50 sobre B. antracis, PhiNS1 sobre B. acidocaldarius, GIL16 y GIL01 sobre B. thuringiensis, y pBCLIN sobre B. cereus.

55 [0055] Un fago de amplio espectro de huéspedes será un fago cuyo espectro de huéspedes es típicamente más amplio que lo que corresponde según el dogma de la alta especificidad de los huéspedes bacterianos. Véanse, por ejemplo, Bamford y col. (1995) "Bacteriophage PRD1: a broad host range DSDNA tectivirus with an internal membrane", Adv. Virus Res. 45: 281-319, PMID: 7793328; y Saren y col. (2005) "A snapshot of viral evolution from genome analysis of the tectiviridae family", J. Mol. Biol. 350(3): 427-40, PMID: 15946683. Típicamente, el fago de

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indica generalmente al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 % o, con mayor preferencia, al menos aproximadamente el 90 % y, aún con mayor preferencia, al menos aproximadamente el 95 % de pureza, ya se trate de una proteína, un ácido nucleico u otra estructura u otra clase de moléculas.

5 [0061] La práctica de esta invención puede implicar la construcción de ácidos nucleicos recombinantes y la expresión de genes en células huésped, preferentemente, células huésped bacterianas. A menudo será aplicable un uso de codones optimizados para un huésped específico. Los procedimientos de clonación molecular para alcanzar esto fines son conocidos en la técnica. Los expertos en la materia conocen bien una amplia diversidad de

10 procedimientos de clonación y amplificación in vitro adecuados para la construcción de ácidos nucleicos recombinantes tales como vectores de expresión. Algunos ejemplos de estas técnicas y de instrucciones suficientes para dirigir a los expertos en la materia a través de numerosos ejercicios de clonación se encuentran en Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., eds., Current Protocols, una empresa

15 conjunta de Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc. (suplemento de 1999) (Ausubel). Las células huésped adecuadas para la expresión de los polipéptidos recombinantes son conocidas por los expertos en la materia e incluyen, por ejemplo, células procariotas, como E. coli, y células eucariotas, incluidas células de insectos, mamíferos y hongos (por ejemplo, Aspergillus niger).

20 [0062] Algunos ejemplos de protocolos suficientes para dirigir a los expertos en la materia a través de procedimientos de amplificación in vitro, incluida la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación con replicasa Qβ y otras técnicas mediadas por polimerasas de ARN se encuentran en Berger, Sambrook y Ausubel, así como en Mullis y col. (1987) patente de los EE. UU. n.o 4.683.202; PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications (Innis y col., eds.), Academic Press Inc., San Diego, CA (1990)

25 (Innis); Arnheim y Levinson (1 de octubre de 1990) C&EN 36-47; The Journal of NIH Research (1991) 3: 81-94; Kwoh y col. (1989) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli y col. (1990) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 87: 1874; Lomell y col. (1989) J. Clin. Chem. 35: 1826; Landegren y col. (1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu y Wallace (1989) Gene 4: 560; y Barringer y col. (1990) Gene 89:117. En Wallace y col., patente de los EE. UU. n.o 5.426.039, se describen procedimientos mejorados para la clonación de ácidos

30 nucleicos amplificados in vitro.

[0063] El término “ácido nucleico” se refiere a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en forma mono o bicatenaria y, a menos que se limite en otro sentido, abarca los análogos conocidos de los nucleótidos naturales que hibridan con los ácidos nucleicos de manera similar a los nucleótidos de origen natural. A menos que

35 se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico concreta incluye la secuencia complementaria de la misma.

[0064] Un “casete de expresión recombinante” o simplemente, un “casete de expresión” es una construcción de ácido nucleico, generada de forma recombinante o sintética, con elementos de ácido nucleico que son capaces de afectar la expresión de un gen estructural en huéspedes compatibles con tales secuencias. Los casetes de 40 expresión incluyen al menos promotores y, opcionalmente, señales de terminación de la transcripción. Típicamente, el casete de expresión recombinante incluye un ácido nucleico que ha de transcribirse (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido deseado) y un promotor. También pueden usarse factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión, según se describe en este documento. Por ejemplo, un casete de expresión también puede incluir secuencias nucleotídicas que codifican una secuencia señal que dirige la secreción 45 de una proteína expresada por la célula huésped. En un casete de expresión también pueden incluirse señales de terminación de la transcripción, potenciadores y otras secuencias de ácido nucleico que influyen en la expresión génica. En realizaciones preferidas, un casete de expresión recombinante que codifica una secuencia aminoacídica que comprende un receptor para un fago se expresa en una célula huésped bacteriana. En otra realización, un casete de expresión recombinante que codifica una secuencia aminoacídica que comprende una proteína 50 terapéutica se expresa en una célula huésped bacteriana. En otra realización, un casete de expresión policistrónica que codifica una secuencia aminoacídica que comprende un receptor para un fago se expresa en una célula huésped bacteriana. En otra realización, un casete de expresión policistrónica se expresa en una célula bacteriana para la producción de más de una proteína, por ejemplo, un receptor para un fago y una proteína terapéutica. En otro ejemplo de expresión de más de una proteína recombinante, un casete de expresión puede incluir más de un

55 casete de expresión monocistrónica.

[0065] Una “secuencia heteróloga” o un “ácido nucleico heterólogo”, según se usan en este documento son aquellos que se originan a partir de una fuente exógena a la célula huésped concreta o, si son de la misma fuente, están modificados con respecto a su forma original. Por lo tanto, un gen de un receptor para un fago heterólogo en

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una célula huésped bacteriana incluye un gen que codifica un receptor modificado que es endógeno de la célula huésped concreta. La modificación de la secuencia heteróloga puede tener lugar además, por ejemplo, por tratamiento del ADN con una enzima de restricción para generar un fragmento de ADN que puede ligarse operativamente al promotor. Las técnicas tales como la mutagénesis dirigida también son útiles para modificar una

5 secuencia heteróloga.

[0066] El término “ligado operativamente” se refiere a un ligamiento funcional entre una secuencia de control de la expresión de un ácido nucleico (como un promotor, una secuencia señal o una disposición de sitios de unión para factores de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en que la secuencia de control de la

10 expresión afecta a la transcripción y/o traducción del ácido nucleico que corresponde a la segunda secuencia.

[0067] “Proteína”, “polipéptido” o “péptido” se refieren a un polímero en el que los monómeros son aminoácidos y están unidos entre sí mediante enlaces amida, alternativamente denominados polipéptidos. Cuando los aminoácidos son aminoácidos α, puede usarse el isómero óptico L o el isómero óptico D. Adicionalmente, se 15 incluyen también aminoácidos no naturales, por ejemplo, β-alanina, fenilglicina y homoarginina. En la presente invención pueden usarse también aminoácidos que no están codificados por genes. Además, en la invención pueden usarse aminoácidos que han sido modificados para incluir grupos reactivos. Todos los aminoácidos usados en la presente invención pueden ser isómeros D o L. Generalmente se prefieren los isómeros L. Además, en la presente invención también son útiles otros peptidomiméticos. Para una revisión general, véase Spatola, A. F., en

20 Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, B. Weinstein, eds., Marcel Dekker, Nueva York, pág. 267 (1983).

[0068] El término “recombinante”, cuando se usa con referencia a una célula, indica que la célula replica un ácido nucleico heterólogo o expresa un péptido o una proteína codificados por un ácido nucleico heterólogo. Las 25 células recombinantes pueden contener genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula. Las células recombinantes pueden contener también genes que se encuentran en la forma nativa de la célula, donde los genes han sido modificados y reintroducidos en la célula por medios artificiales. El término también abarca células que contienen un ácido nucleico endógeno de la célula que ha sido modificado sin retirar dicho ácido nucleico de la célula; tales modificaciones incluyen aquellas obtenidas por sustitución génica, mutación de sitios

30 específicos y técnicas relacionadas. Una “proteína recombinante” es aquella que ha sido producida en una célula recombinante. En realizaciones preferidas, una célula bacteriana recombinante produce un receptor para un fago recombinante.

III. Mecanismos generales de resistencia a antibióticos, agrupaciones RMF, factores de virulencia

35 [0069] Según se indica anteriormente, los antibióticos han revolucionado la práctica de la medicina al evitar muchos de los problemas presentados por las enfermedades infecciosas. El descubrimiento de la penicilina inició esta estrategia y se han explotado muchos mecanismos de acción diferentes para impedir el crecimiento de la flora microbiana. En respuesta, han evolucionado muchos mecanismos bacterianos para eludir las actividades de los

40 antibióticos y prácticamente todos los antibióticos han conducido a la adopción de estrategias de resistencia por los huéspedes diana. Entre los muchos mecanismos de acción, se han desarrollado antibióticos que alteran la síntesis de la pared celular, la función de la membrana celular, la síntesis de proteínas, la síntesis de ácidos nucleicos y la actividad metabólica. Además, los muchos medios de resistencia a menudo se encuentran genéticamente agrupados o ligados entre sí, con frecuencia de forma extracromosómica, para poder transferirse entre huéspedes

45 de manera eficiente. Generalmente, las agrupaciones extracromosómicas están en plásmidos R, pero pueden estar en otras formas genéticas relacionadas, por ejemplo, plásmidos F o fagos. Véase, por ejemplo, Torres y col. (2007) "Current concepts in antibiotic-resistant gram-negative bacteria", Expert Rev. Anti Infect. Ther. 5(5): 833-43.

[0070] Los factores de virulencia son estructuras que proporcionan funciones importantes en la patogenicidad

50 microbiana. Véase, por ejemplo, Finlay and Falkow (1997) "Common themes in microbial pathogenicity revisited", Microb. Mol. Biol. Rev. 16: 136-139. Existen diversas definiciones de patogenicidad microbiana y los patógenos pueden distinguirse de sus homólogos no virulentos por la presencia de dichos genes de virulencia. Varios grupos han explorado el dilema de lo que constituye exactamente un factor de virulencia. Se ha sugerido que las proteínas que se piensa que son necesarias para la patogenicidad se ordenan en tres categorías: (1) genes de virulencia

55 “verdaderos”, (2) aquellos que se asocian con virulencia, como los reguladores de la expresión de los factores “verdaderos”, y (3) genes de “estilo de vida” virulento que la bacteria necesita para hacer posible la colonización del huésped. Esencialmente, un factor de virulencia es cualquier fracción producida por un patógeno que es esencial para causar una enfermedad en un huésped. Véase, por ejemplo, Wassenaar y Gaastra (2001) "Bacterial virulence: can we draw the line?" FEMS Microbiol. Lett. 9995: 1-7.

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complemento y de cascadas de coagulación. El malestar fisiológico que implica la pirogenicidad y mitogenicidad conduce eventualmente a la septicemia y la muerte. Sin embargo, bajos niveles de LPS usados, por ejemplo, como adyuvante, aumentan favorablemente la resistencia microbiana del huésped e inducen la producción por las células T de más interferón γ, que potencia la actividad antivírica. El lípido A, como componente del LPS, es un fuerte

5 potenciador biológico y puede reforzar el sistema inmunitario.

[0079] Las exotoxinas son secretadas por células patógenas viables. Las exotoxinas proteínicas bacterianas están entre las toxinas más potentes conocidas. A menudo están codificadas por bacteriófagos o plásmidos y hay muchas clases, todas ellas fuertemente antigénicas pero intrínsecamente inestables. Algunas actúan en la superficie

10 de la célula huésped, mientras que la mayoría (toxinas A/B) se unen a la membrana de la diana con un receptor (subunidad B) y suministran una segunda porción (subunidad A) directamente al citoplasma. Algunas toxinas más especializadas implican la “inyección” de la proteína en el huésped por medio de un sistema de secreción único del “tipo III”. Este último se encuentra solamente en algunos enteropatógenos gramnegativos. Las toxinas también pueden agruparse de acuerdo con su actividad biológica en ciertas células, como leucotoxinas, neurotoxinas, etc.

15 [0080] Una toxina típica A/B bien estudiada es la exotoxina diftérica (TD) de Corynebacterium diphtheriae. El receptor específico usado es el factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina; la subunidad A detiene la síntesis de proteínas del huésped y provoca la muerte celular. Sin embargo, la toxina puede usar también endocitosis mediada por receptores del huésped (EMR) para entrar en la célula a través de un endosoma. Una

20 subunidad A en el citoplasma es suficiente para causar la muerte y la bacteria puede liberar hasta 5.000 moléculas en una hora.

[0081] Las toxinas de acción superficial normalmente inducen sus efectos al unirse a moléculas de la célula diana o al formar poros en la membrana a través de los que se produce la lisis celular. Este grupo incluye la toxina

25 vacuolizante de Helicobacter pylori, la hemolisina de E. coli y los “superantígenos” pertenecientes a Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus. A partir de la elucidación de la estructura cristalina, es posible clarificar la función de tales proteínas a nivel molecular. En los receptores de linfocitos T indiferenciados de unión inespecífica por medio de complejos MHC-II, se desencadena una liberación masiva de citocinas inflamatorias que causa un síndrome de choque tóxico similar a la fiebre piógena.

30 [0082] Los sistemas de secreción del tipo III (SSTT) de algunos enteropatógenos gramnegativos son un grupo inusual de exotoxinas. Están compuestos de dos grupos de proteínas; fracciones estructurales y efectores, que están codificados conjuntamente en islas de patogenicidad de gran tamaño en el cromosoma bacteriano. Aunque la mayor parte de los componentes estructurales proteínicos de los SSTT muestran homología de secuencia, los

35 efectores afectan a la célula huésped de diversas maneras con el fin de facilitar la diseminación bacteriana. Por ejemplo, las seis exotoxinas Yop secretadas por Yersinia pestis afectan drásticamente al citoesqueleto de actina, lo que interfiere con la fagocitosis mediada por integrinas y permite la absorción de la bacteria intracelular facultativa. Las proteínas Ipa de S. flexneri contribuyen a la muerte de los neutrófilos por necrosis, lo que permite al patógeno entrar en las células huésped por medio de la rotura de la barrera epitelial. Algunas características comunes a estos

40 efectores incluyen: la falta de una señal sec tradicional que se observa en otras exotoxinas secretadas, extensivo acompañamiento por proteínas accesorias (también codificadas en las islas de patogenicidad de los SSTT) cuando se encuentran en el citoplasma bacteriano y una posible señal de translocación dentro del ARNm que codifica cada toxina.

45 [0083] El entorno del huésped es típicamente ideal para las bacterias en todos los sentidos, excepto en uno: hay abundante hierro, pero firmemente unido en grupos hemo, ferritina, transferrina o lactoferrina. Este puede ser el factor limitante en las infecciones. Por consiguiente, algunos patógenos han desarrollado factores de virulencia sideróforos que intervienen en la liberación del hierro del huésped para consumo del parásito. Algunos ejemplos incluyen la enteroquelina de Escherichia y Salmonela spp. que secuestran hierro unido al huésped mediante altas

50 constantes de unión. Algunos experimentos que implican la deleción de los siete genes de la enteroquelina de Salmonella han demostrado que los patógenos pierden su virulencia cuando se inyectan en modelos de ratón. Por lo tanto, los sideróforos son esenciales para la virulencia.

[0084] La mayoría de los patógenos bacterianos gramnegativos usan cuatro sistemas de secreción para

55 transportar las toxinas proteínicas de su citoplasma al huésped o a la matriz extracelular. Numerados del tipo I a IV, respectivamente, los sistemas son usados por diferentes grupos de exotoxinas, como la secreción del tipo I de la hemolisina de E. coli a través del periplasma. Aunque las proteínas del tipo I tienen una señal de secreción, no se escinde nada durante el transporte y todo el proceso opera como un mecanismo en una etapa que implica un poro a través de las membranas interna y externa. Muchos de los genes de exotoxinas secretados específicamente están

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agrupados en islas de patogenicidad próximas a los genes de sus aparatos de secreción respectivos.

[0085] La mayoría de la exotoxinas A/B, como las de Corynebacterium diphtheriae y Vibrio cholerae se transportan a la superficie de la célula bacteriana por medio del sistema del tipo II, en dos etapas. Después de la 5 escisión del extremo amino en el citoplasma bacteriano y del transporte de la proteína por la maquinaria sec, se forma un intermedio periplásmico. Este pasa entonces a través de un segundo conjunto de proteínas transmembranales. Las exotoxinas segregadas del grupo IV también usan las proteínas sec de la membrana interna, pero pasan a través de la membrana externa por medio de su extremo carboxilo, como la fracción CagA de Helicobacter pylori. El sistema de secreción del tipo III, ya descrito anteriormente, secreta efectores a través de una

10 “aguja” macromolecular especializada que inyecta las exotoxinas directamente en el citoplasma de la célula huésped.

[0086] Estos numerosos factores de virulencia están codificados frecuentemente en plásmidos que se transfieren entre las cepas bacterianas huésped. Los medios para disminuir el número de huéspedes o de plásmidos 15 en una población que tiene dichos plásmidos pueden conseguirse utilizando los procedimientos descritos en este documento. Los plásmidos o elementos movilizables pueden representar dianas mucho más amplias que simplemente los plásmidos de resistencia a fármacos antibacterianos, pero incluyen aquellos que codifican algunos

o todos estos diversos elementos de virulencia diferentes.

20 IV. Sistemas de conjugación; elementos movilizables; transferencia de ADN

[0087] Un plásmido es típicamente un replicón o pieza de ADN replicable que se hereda de forma estable en estado extracromosómico. En la bibliografía antigua, se usaba el término episoma para plásmidos capaces de integrarse en el cromosoma, pero hace mucho tiempo que este término está en desuso. Típicamente, un plásmido

25 existe como una pieza circular cerrada covalentemente de ADN bicatenario que tiene la capacidad de replicarse de forma autónoma y es esta propiedad la que conduce a su aislamiento y reconocimiento físico. La naturaleza covalente cerrada de su estructura permite separarlos del ADN cromosómico por electroforesis en gel o por gradientes de densidad flotante de cloruro de cesio. Véase, por ejemplo, bact.wisc.edu o libros de texto básicos o monografías sobre microbiología o biología molecular.

30 [0088] Prácticamente todos los plásmidos tienen dos características en común: tienen funciones de replicación y típicamente se ordenan en grupos de incompatibilidad, que restringen qué plásmidos pueden coexistir en un huésped individual.

35 [0089] En el caso más simple, la función de replicación deriva de uno o más orígenes de replicación con las proteínas transactivas necesarias para la replicación codificadas por el plásmido mismo o “tomadas en préstamo” de la maquinaria de replicación normal del huésped. El amplio espectro de huéspedes de algunos plásmidos se explica al menos en parte por sus múltiples sistemas de replicación, que les permiten funcionar en una diversidad de huéspedes distintos, por ejemplo, orígenes de replicación promiscuos, múltiples orígenes alternativos, una

40 combinación o similares.

[0090] Los plásmidos se ordenan típicamente en solo uno de los muchos grupos de incompatibilidad existentes. Dos plásmidos son incompatibles si cualquiera de ellos es menos estable en presencia del otro de lo que lo era por sí mismo. Hasta ahora se han descrito más de 30 grupos de incompatibilidad, sin límite superior a la vista. 45 La incompatibilidad, cuya designación genotípica es inc, es frecuentemente una consecuencia necesaria del deseo de un plásmido de mantener un cierto número de copias en una célula. Si los plásmidos de un grupo de incompatibilidad dado tienen un cierto número de copias que intentan mantener, cuando dos plásmidos del mismo grupo de incompatibilidad se encuentran en la misma célula, resulta una competición. El plásmido que sea capaz de replicarse más rápidamente o tenga alguna otra ventaja estará representado en un grado desproporcionado entre

50 las copias permitidas por el sistema de incompatibilidad. Sorprendentemente, los plásmidos también pueden ser incompatibles cuando los dos poseen las mismas funciones para el reparto de los mismos en las células hijas.

[0091] En los plásmidos se encuentran a menudo diversas características adicionales. Muchos plásmidos contienen genes que no están implicados en la replicación ni en la incompatibilidad. Tales genes pueden codificar

55 propiedades como la resistencia a antibióticos (y por lo tanto, dan lugar a los términos factores de “resistencia” o “R”), la degradación de macromoléculas complejas, la producción de bacteriocinas, la resistencia a diversos metales pesados, la síntesis de antibióticos o factores de virulencia necesarios para la infección de huéspedes animales o vegetales.

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62 kb y codifica al menos 20 genes tra. También contiene tres copias de IS3, una copia de IS2 y una copia de una secuencia A, así como genes de incompatibilidad y replicación. El factor F puede existir en tres estados diferentes: “F+” se refiere a un factor en un estado autónomo extracromosómico que contiene solo la información genética descrita anteriormente. El estado “Hfr” (que se refiere a “alta frecuencia de recombinación”) describe la situación

5 cuando el factor se ha integrado en el cromosoma, presumiblemente debido a sus diversas secuencias de inserción. Finalmente, el estado “F’” o estado (F prima) se refiere al factor cuando existe como elemento extracromosómico pero con el requerimiento adicional de que contiene alguna sección del ADN cromosómico unida covalentemente al mismo. Una cepa que no contiene ningún factor F se denomina “F-“.

10 [0096] Al aparear una cepa F+ con una cepa F-, se observa una rápida y eficiente transferencia de F+ (aproximadamente un 50 % de transferencia en una hora), pero la transferencia cromosómica solo tiene lugar en el orden de 10-5 a 10-7 por célula donante. Probablemente, esto es debido a la rara formación espontánea de Hfr. Según se menciona anteriormente, las formas Hfr surgen por integración en el cromosoma debido a las secuencias de inserción del plásmido. Estas parecen causar la integración en sitios preferidos, de manera que se encuentra una

15 diversidad de Hfr diferentes que difieren con respecto a sus orígenes de transferencia y dirección de transferencia. Cuando se realiza un cruzamiento entre una cepa Hfr y una cepa F-, se observa la transferencia de marcadores cromosómicos con alta frecuencia (10-2 a 10-5). Esta transferencia está orientada y depende del tiempo. Dado que la transferencia comienza en el sitio oriT del factor F, una porción del factor F se transfiere en primer lugar, seguida del resto del cromosoma. Si se transfiere todo el cromosoma, se transferirá la otra porción del factor F. El factor F mismo

20 no se integra en el receptor, ya que no hay homología para tal integración, pero el ADN cromosómico transferido puede integrarse por recombinación homóloga. La transferencia de la totalidad del cromosoma de E. coli lleva aproximadamente 100 minutos, pero con gran frecuencia se produce la separación espontánea de la pareja de apareamiento. Tal separación significa que los marcadores que se transfieren tardíamente a menudo no se transfieren en absoluto y se obtiene un gradiente de transferencia que tiende a ser del orden de 103 (es decir, los

25 marcadores tempranos se transfieren aproximadamente 103 veces más frecuentemente que los marcadores más distales). El resultado neto es que frecuentemente no se consigue transferir todo el cromosoma. En cruzamientos entre una cepa F’ y una cepa F-, pueden producirse dos eventos de donación posibles, dependiendo del genotipo del donante. Si la cepa donante es Rec-, el plásmido se mantendrá como elemento extracromosómico en el donante y será la única información genética transferida en la conjugación. Sin embargo, si la célula donante es Rec+, parte

30 de F’ se integrará por recombinación homóloga en el cromosoma del donante, que entonces actuará como Hfr. Típicamente, por esta razón se emplean donantes Rec para tales análisis.

[0097] Una “limitación” de los factores F clásicos es que su uso se restringe generalmente a E. coli y especies muy próximas. En estos organismos, los plásmidos F’ son plásmidos conjugativos de gran tamaño y bajo número de 35 copias capaces de movilización cromosómica, pero su tamaño es demasiado grande para manejarlos físicamente con facilidad. Para su uso en los procedimientos descritos, se crearán nuevas variantes, por ejemplo, versiones diseñadas, o se optimizarán en cuanto a su eficiencia de transferencia, expresión o sensibilidad al fago empleado. Algunas nuevas variantes preferidas son de menor tamaño, por ejemplo, comprenden menos nucleótidos que los factores F naturales. Otras nuevas variantes de los factores F clásicos proporcionan mayor ligamiento, por ejemplo,

40 entre un origen de replicación y un ácido nucleico que codifica un receptor para tectivirus.

[0098] Algunos plásmidos de una diversidad de otros grupos de incompatibilidad, con una amplia gama de propiedades, han sido útiles en el análisis genético. Los aislados naturales varían en el número de copias (desde aproximadamente una por célula a cientos de copias), tamaño (varias kb a cientos de kb), estabilidad, capacidad

45 conjugativa, espectro de huéspedes y resistencia a fármacos. Además, dado que muchas de estas propiedades son producto de uno o un pequeño conjunto de genes, se ha diseñado una amplia gama de plásmidos para obtener un conjunto específico de propiedades útiles, incluida una serie de sitios de clonación únicos para la manipulación in vitro. Los manuales especializados describen las posibilidades generales y en la bibliografía se describen continuamente nuevas versiones.

50 [0099] El término “sistema de formación de parejas de apareamiento” es aplicable a los plásmidos para conjugación, junto con otros sistemas que permiten la transferencia eficaz de ADN, por ejemplo, por transducción o transformación. Véanse, por ejemplo, Schrödera y Lankab (2005) "The mating pair formation system of conjugative plasmids -A versatile secretion machinery for transfer of proteins and DNA", Plasmid 54: 1-25; Dale y Park (2004)

55 Molecular Genetics of Bacteria (4.a edición), Wiley, ISBN-10: 047085085X, ISBN-13: 978-0470850855; Brooks (2007) Medical Microbiology (24.a edición), McGraw-Hill Medical, ISBN-10: 0071476660, ISBN-13: 978-0071476669; Demuch y Lamont (eds., 2006) Bacterial Cell-to-Cell Communication: Role in Virulence and Pathogenesis (Advances in Molecular and Cellular Microbiology), Cambridge University Press, ISBN-10: 0521846382, ISBN-13: 9780521846387; Phillips (ed., 2004) Plasmid Biology, ASM Press; ISBN-10: 1555812651, ISBN-13: 978-1555812652;

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Thomas (2000) Horizontal Gene Pool: Bacterial Plasmids and Gene Spread, CRC Press, ISBN-10: 9057024624, ISBN-13: 978-9057024627; y otros libros de texto de microbiología o bacteriología.

[0100] En el contexto de un mecanismo de conjugación, las células pueden convertirse de F-a F+ en la

5 población. Como los plásmidos contienen frecuentemente marcadores de resistencia, la selección en el contexto de un antibiótico asegurará la predominancia del plásmido que contiene el fenotipo. En caso de que el plásmido codifique también el receptor para un fago, la asociación del marcador de resistencia con el marcador de sensibilidad al fago hace que la combinación del antibiótico con la exposición al fago disminuya significativamente la población bacteriana, de manera suficiente para que el sistema inmunitario u otro sistema de eliminación bacteriana

10 del huésped minimice la población. En muchos casos, la combinación puede funcionar de forma sinérgica, de modo que cantidades por debajo del umbral del antibiótico y el fago pueden controlar eficazmente la infección. Además, los tratamientos temporales con el fago y el antibiótico pueden ser coincidentes o separados.

V. Fago de amplio espectro de huéspedes; género Tectiviridae

15 [0101] El dogma clásico de los fagos establece que la unión y la infección son procesos con un espectro de huéspedes muy limitado y que la mayoría de los fagos carecen de la capacidad de unirse a una multiplicidad de huéspedes diferentes y/o de replicarse en ellos. La descripción de la familia de fagos Tectiviridae sugiere que la naturaleza especial del amplio espectro de huéspedes es inusual. Los mecanismos específicos del limitado espectro

20 de huéspedes pueden ser debidos a una observación selectiva y a la combinación de una interacción típicamente de alta especialización de las funciones de unión, infección, replicación y lisis de la célula huésped.

[0102] Por el contrario, el reconocimiento del valor potencial de los fagos de amplio espectro de huéspedes significa que puede llevarse a cabo la selección del carácter de amplia selectividad. Partiendo de un fago con un 25 espectro de huéspedes relativamente amplio, pueden aplicarse procedimientos de selección para ampliar su especificidad de huésped. Puede llevarse a cabo una mutagénesis de los componentes de especificidad de huésped del fago, por ejemplo, las proteínas de unión específica en los extremos de las fibras de la cola. Los genes que confieren especificidad de unión pueden identificarse por medios genéticos estándar para determinar qué proteínas del fago están implicadas. Por ejemplo, en el fago PRD1, se ha identificado la proteína P2 como el principal receptor

30 para la célula diana. Los estudios combinados del receptor del fago y la proteína del huésped permitirán ampliar el espectro de unión y el análisis bioinformático puede identificar también otras especies que expresen receptores de fagos similares. El análisis estructural de la interacción receptor-proteína de unión permitirá la mutagénesis o el diseño de receptores diana que serán reconocidos por proteínas de unión menos selectivas.

35 [0103] Además de la especificidad de unión, parte de la limitación del espectro de huéspedes puede estar relacionada con las etapas posteriores de la infección por el fago después de la unión. Por lo tanto, las funciones de infección, replicación y lisis se modificarán para que una mayor promiscuidad tenga lugar con éxito en un espectro más amplio de cepas huésped. Alternativamente, una regulación restrictiva de estas funciones puede atenuarse por procesos de mutagénesis y selección.

40 [0104] En particular, será deseable encontrar medios para que la función restrictiva cruce la línea divisoria entre bacterias gramnegativas y grampositivas, la cual refleja las diferencias estructurales entre las estructuras de la pared celular externa. En particular, la estructura de la pared celular de las bacterias grampositivas es aparentemente similar a la estructura de la pared celular interna de las bacterias gramnegativas. Como tales, los

45 elementos estructurales comunes de los huéspedes dentro de las bacterias gramnegativas serán sensibles a los fagos que puedan alcanzar dichas estructuras. Por lo tanto, puede ser útil combinar o modificar los fagos para incorporar medios para digerir las regiones locales de la pared celular externa de las cepas gramnegativas. Las actividades enzimáticas para ello estarán presentes en los fagos normales que ataquen a las bacterias gramnegativas desde fuera de la pared celular externa. Véase Padmanabhan y col. "Phage Derived Antimicrobial

50 Activities", documento WO/2007/130655. Ya sea que la actividad enzimática esté asociada al fago o se administre separadamente, la digestión de la pared celular externa puede proporcionar accesibilidad para que el fago entre en contacto con la membrana celular interna.

[0105] Debe señalarse que, en ciertas circunstancias, la célula huésped puede quedar incapacitada a pesar

55 de una infección abortiva. El proceso de infección puede fracasar por fallo de las funciones de replicación o de lisis mientras que el proceso infectivo de inyección de ADN puede por sí mismo incapacitar y destruir la célula sin que se produzcan más fagos. En ciertas circunstancias, esto consigue el resultado deseado de prevenir el crecimiento adicional o las funciones de virulencia de la célula bacteriana huésped, o de que esta sirva como reservorio para un plásmido que le confiera sensibilidad a un fago y/o resistencia a antibióticos a dicha célula bacteriana.

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remediación ambiental.

[0113] Además, las funciones de los fagos deseadas pueden alcanzarse frecuentemente usando fagos que no estén intactos. Los fragmentos o partes de fagos, por ejemplo, piocinas, colas, enzimas, pueden sustituir a los

5 tectivirus intactos para afectar eficazmente a las funciones genéticas. Las funciones de los elementos movilizables pueden ser afectadas por la degradación indirecta de los ácidos nucleicos que tiene lugar cuando se rompen las células.

VII. Aplicaciones prácticas

10 [0114] Las aplicaciones prácticas de la presente invención incluyen, por ejemplo, tratamiento sanitario de aguas y residuos públicos, tratamiento de bacterias en ámbitos hospitalarios, procesamiento de alimentos, eliminación terapéutica o ambiental de plásmidos codificantes de resistencias o virulencia, higienización eficaz o evaluación/detección de infecciones y presión selectiva para la adquisición de un plásmido seguida de una etapa

15 para destruir las células que contienen el plásmido. Otras aplicaciones de la reducción de las especies bacterianas con plásmidos pueden llevarse a cabo en instalaciones para animales, por ejemplo, sobre las superficies adecuadas de los edificios y equipos, en las que no es deseable la presencia de bacterias perjudiciales. Además, los procedimientos pueden aplicarse a animales de granja, por ejemplo (ganado bovino lechero y de carne, cerdos, pollos, peces, gambas y similares), una aplicación para reducir la presencia general de bacterias que contienen

20 elementos plasmídicos no deseables.

[0115] Una aplicación importante es el tratamiento de artículos que pueden contaminarse en el uso normal, por ejemplo, catéteres, sistemas de monitorización hospitalarios, instrumentos clínicos y equipos. Los emplazamientos, equipos, entornos o similares en los que las bacterias diana pueden representar un peligro para la 25 salud pública pueden tratarse usando los procedimientos y composiciones proporcionados. Los emplazamientos de interés incluyen instalaciones públicas, especialmente de salud pública, en las que existe el propósito u oportunidad del manejo de materiales que contienen las bacterias diana, especialmente aquellas con los marcadores de virulencia o resistencia a antibióticos. Estos materiales pueden incluir productos de desecho, por ejemplo, líquidos, sólidos o aire. Las superficies que tocan muchas personas son importantes, incluidos los tiradores de las puertas, los

30 grifos, los botones de los ascensores, etc.

[0116] Las plantas de tratamiento de residuos acuosos pueden incorporar estos procedimientos para eliminar el huésped diana o el elemento movilizable del efluente. Los sitios de residuos sólidos pueden introducir estos procedimientos para minimizar la posibilidad de brotes de infecciones o la liberación del elemento movilizable que 35 podría transmitir sus genes a lugares indebidos. A la inversa, las áreas o los equipos de preparación de alimentos necesitan limpiarse regularmente y la invención proporciona composiciones y medios para eliminar eficazmente las bacterias diana, especialmente las más peligrosas que contienen los elementos movilizables. Los entornos médicos y otros entornos públicos sometidos a contaminación pueden justificar medios similares para minimizar el crecimiento y la diseminación de los microorganismos diana y la transferencia de elementos movilizables

40 seleccionados. Los procedimientos pueden usarse en contextos en los que se desea la eliminación de las bacterias diana por esterilización, incluidos los sistemas de filtración de aire, por ejemplo, para unidades de cuidados intensivos o entornos de circulación limitada como aviones, submarinos, etc.

[0117] Algunas aplicaciones alternativas incluyen el uso en un contexto veterinario o médico. Los medios para

45 determinar la presencia de bacterias concretas o para identificar dianas específicas permiten identificar fuentes adicionales para el uso de estas técnicas. La inclusión de actividades bactericidas o bacteriostáticas en los agentes de limpieza, incluida la limpieza de animales y mascotas, puede aplicarse en combinación con estas técnicas.

[0118] El fago puede usarse para eliminar huéspedes que contienen los plásmidos que confieren sensibilidad.

50 En condiciones de selección con antibióticos que requieren que los huéspedes contengan el plásmido que tiene el gen de resistencia, los huéspedes también expresarán el receptor para el fago, lo que hará dichas células sensibles a la infección por dicho fago que, por tanto, destruirá las células que contienen el plásmido.

[0119] Los procedimientos de la invención pueden usarse para transferir la sensibilidad a fagos entre especies

55 bacterianas que típicamente no interaccionan. Como ejemplo, plásmidos conjugativos que se transfieren entre bacterias que típicamente tienen huéspedes animales, por ejemplo, vertebrados o mamíferos, pueden transferirse a bacterias que típicamente infectan huéspedes diferentes, por ejemplo, invertebrados, como insectos, o plantas. Alternativamente, las bacterias que típicamente infectan huéspedes vegetales o invertebrados pueden usarse como fuente de un plásmido conjugativo para su transferencia a bacterias que típicamente tienen un huésped vertebrado o

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