CN102191264A - 一种重组水蛭素的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组水蛭素的生产方法:使用重叠PCR技术构建SUMO-HV融合基因;将含有双酶切位点的SUMO-HV融合基因与经过双酶切处理的质粒连接,构建重组水蛭素表达载体;将重组水蛭素表达载体转入大肠杆菌表达SUMO-HV融合蛋白;用物理方法或化学方法裂解重组大肠杆菌细胞,释放出SUMO-HV融合蛋白,使用镍离子亲和层析纯化,得到纯化后的SUMO-HV融合蛋白;将纯化后的SUMO-HV融合蛋白经酶切反应,释放出HV,经镍离子亲和层析分离得到含有His6标签的SUMO蛋白和不含His6的HV蛋白。应用本发明方法制备重组水蛭素蛋白,大大提高了产率,节省成本,操作简便。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域,具体涉及在原核细胞,尤其是在大肠杆菌中制备,并得到有高度生物学活性的重组水蛭素蛋白rHV的方法。
背景技术
在我国,水蛭是一种传统中药,中医认为它有破血,通经,逐淤等疗效,主要用于治疗瘕症,血瘀,闭经和跌打损伤。从水蛭以及其唾液腺中已经提取出多种有效成分,水蛭素是其中活性最显著研究的最多的一种。水蛭素(HV)是由65-66个氨基酸组成的小分子多肽,是迄今为止发现的最强的凝血酶天然特异抑制剂。水蛭素能与alpha-凝血酶形成非共价稳定复合物,因而完全破坏凝血酶裂解纤维蛋白原的能力,从而拮抗血液的凝聚。天然水蛭素有一系列变体,包括水蛭素变体1(HV1)和变体2(HV2),变体3(HV3)。动物实验与临床研究表明,水蛭素能高效的抗凝血,抗血栓形成,以及阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板反应等进一步血瘀现象。此外它还能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。因此,水蛭素是一种很有前途的抗凝化瘀药物,可用于各种血栓疾病,尤其是静脉血栓,弥漫性血管内凝血和脑血栓的治疗,也可以用于手术后动脉血栓的形成。水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用,它能阻止肿瘤细胞的转移,如纤维肉瘤,骨肉瘤,血管肉瘤,黑色素瘤,淋巴瘤和白血病细胞瘤,水蛭素配合放疗和化疗,能显著增强疗效。
动物实验和临床研究证明,皮下和静脉注射水蛭素均无明显毒副作用,无论是急性,还是亚急性的毒性实验,血压,心率,血相出血时间和血液化学成分均不受影响。呼吸***也没有影响,无过敏反应,一般无特异性抗体产生。而且水蛭素可以口服,蛋白质比较稳定,一定温度,酸碱条件下,以及一定条件下糜蛋白酶胰蛋白酶并不对其活性产生影响。
水蛭素具有重要的开发应用价值,但是由于水蛭有限,天然水蛭素提取产率极低,根本无法满足临床及研究需要。许多国家和地区均看重通过基因工程技术生产重组水蛭素。但因水蛭来源匮乏,使水蛭素的研究与临床应用受到限制。随着分子生物学和基因工程技术的发展,使其人工合成成为可能。自1986年以来,国外已有几个实验室成功地应用基因工程方法获得相当量的结构与药理活性与天然水蛭素基本相同的重组水蛭素。重组水蛭素由63-66个氨基酸组成,有三对二硫键。与天然水蛭素相比,重组水蛭素在第63位氨基酸酪氨酸上未硫酸脂化,活性略低,性质基本相同。
大肠杆菌表达***由于其生长迅速,表达量高,成本低廉,操作简单是目前最广泛使用的操作***,自1988年以来,已经有许多研究利用大肠杆菌成功表达出高活性的重组水蛭素。但是由于水蛭素具有三对二硫键,在大肠杆菌中表达量极低,很难折叠成正确构象,获得的重组蛋白生物活性大大低于天然水蛭素。所以许多措施被应用于增加水蛭素的可溶性表达。例如分泌信号肽的使用,融合表达技术及一些高拷贝表达载体的选择和强启动子的使用等等。
融合表达是指利用DNA体外重组技术,将两个或两个以上不同来源的基因或基因片段克窿在一起,构建成融合基因,然后在宿主细胞中进行表达。融合基因在宿主细胞中转录翻译后的产物应为单一的多肽序列,即融合蛋白。进行基因融合表达的目的通常有以下几点:(1)原核宿主的表达调控易于启动,融合蛋白大多可正确折叠,减少包涵体的形成,增加目的蛋白的表达量;(2)可以减少菌体内水解酶的作用,使目的蛋白特别是小分子目的蛋白得到保护;(3)简化表达产物的纯化及检测过程;(4)构建一些新型的活性蛋白,它通常是将两种或多种功能蛋白的基因融合表达,产生具有多功能或新功能的蛋白质。SUMO融合表达***比较于传统的融合蛋白表达***有两个明显的优势:(1)SUNO(small ubiquitin-related modifier,小泛素相关修饰因子)不仅能够提高蛋白质在大肠杆菌的表达量,尤其是一些毒性或者小肽,而且能够大大增加蛋白的可溶性。SUMO***已经成功应用于SARS CoV 3Cl蛋白酶,GFP,金属蛋白酶(MMP13)的可溶性表达。(2)SUMO蛋白酶具有高比活性和高度特异性,1U的SUMO蛋白酶可以切割100μgSUMO融合蛋白。与其他酶切割原理不同的是SUMO蛋白酶识别SUMO的空间结构,而不是一级结构,这就避免了靶蛋白的非特异切割。由于SUMO蛋白酶的N-端添加了His标签,所以大大简化该酶的去除以及目标产物的进一步纯化。而且经过切割的目标产物N-端不会携带多余的氨基酸。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高活性重组水蛭素的高效生产方法。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
一种重组水蛭素的生产方法,该方法包括如下步骤:
(1)使用重叠PCR技术构建SUMO-HV融合基因;
(2)将含有双酶切位点的SUMO-HV融合基因与经过双酶切处理的质粒连接,构建重组水蛭素表达载体;
(3)将重组水蛭素表达载体转入大肠杆菌表达SUMO-HV融合蛋白;
(4)用物理方法或化学方法裂解步骤(3)得到的重组大肠杆菌细胞,释放出SUMO-HV融合蛋白,使用镍离子亲和层析纯化,得到纯化后的SUMO-HV融合蛋白;
(5)将纯化后的SUMO-HV融合蛋白经酶切反应,释放出HV,经镍离子亲和层析分离得到含有His6标签的SUMO蛋白和不含His6的HV蛋白。
其中,所述的HV基因为编码水蛭素变体的基因,包括编码HV1的基因、或编码HV2的基因、或编码HV3基因、或编码与HV1、HV2和HV3中任意一种有95%以上氨基酸序列同源性且具有相同活性的蛋白的基因。即HV1、HV2和HV3中的任意一种,其氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加使得与HV1、HV2和HV3中的任意一种有95%以上氨基酸序列同源性且具有相同活性的蛋白,编码该蛋白的基因也在本发明的保护范围内。
编码SUMO的基因序列为Genebank序列号NM_001180818。
HV1的氨基酸序列为Genebank序列号P01050,编码上述HV1的基因序列可以为Genebank序列号A19993,但不局限于该基因序列。
HV2的氨基酸序列为Genebank序列号P09945,编码上述HV2的基因序列可以为如SEQ ID No.4所示,但不局限于该基因序列。
HV3的氨基酸序列为Genebank序列号P09944,编码上述HV3的基因序列可以为如SEQ ID No.5所示,但不局限于该基因序列。
步骤(1)中,所述SUMO的N端含有His6标签,HV位于SUMO的C端。
例如,
当HV为HV1时,若编码HV1的基因序列为Genebank序列号A19993,所构建的SUMO-HV1融合基因序列如SEQ ID No.1所示。
当HV为HV2时,若编码HV2的基因序列为SEQ ID No.4,所构建的SUMO-HV2融合基因序列如SEQ ID No.2所示。
当HV为HV3时,若编码HV3的基因序列为SEQ ID No.5,所构建的SUMO-HV3融合基因序列如SEQ ID No.3所示。
步骤(2)中,加在融合基因首、末两端的限制性内切酶识别位点可以是任意的II类限制性内切酶识别位点。
步骤(2)中,所述的重组水蛭素表达载体为pET28a/SUMO-HV。
步骤(4)中,用化学方法裂解细胞时,采用的裂解液是0.01M PBS,pH 7.2,5~10mM咪唑。
步骤(4)中,镍离子亲和层析纯化方法中,Binding Buffer为0.01M PBS,pH 7.2,5-10mM咪唑;Wash Buffer为0.01M PBS,pH 7.2,20-100mM咪唑;Elute Buffer为0.01M PBS pH 7.2,500mM咪唑。
步骤(5)中,酶切SUMO-HV融合蛋白所使用的酶是Ulp1。
步骤(5)中,镍离子亲和层析纯化方法中,Binding Buffer为0.01M PBS,pH 7.2,5-10mM咪唑;Wash Buffer为0.01M PBS,pH 7.2,20-100mM咪唑;Elute Buffer为0.01M PBS pH 7.2,500mM咪唑。
步骤(5)中,经镍离子亲和层析分离得到的HV蛋白,再经阴离子交换层析纯化,得到重组水蛭素蛋白HV。所述的阴离子交换树脂为Hi-TrapTM Q XL(GE Healthcare,1ml)。
有益效果:本发明方法首次构建了SUMO-HV融合蛋白表达***,原本在pET***中产量极低的水蛭素在SUMO融合表达***中可溶性表达得到大大提高,1L培养物能收获80mg SUMO-HV融合蛋白,这为下游的分离纯化带来了方便,而且获得的水蛭素蛋白的空间结构更接近于天然状态。采用本发明方法,以1L细菌培养物计算,最终可以获得可溶性的水蛭素为20mg,要远远高于其他大肠杆菌表达***获得的蛋白。应用本发明方法制备重组水蛭素蛋白,大大提高了产率,节省成本,操作简便。
附图说明
图1为SUMO-HV1融合基因构建图。
图2为pET28a/SUMO-HV1重组表达载体构建图。
图3为SUMO-HV1融合蛋白诱导表达及纯化的SDS-PAGE分析图,其中,1:未诱导全菌,2:诱导全菌,3-8:纯化后蛋白,M:蛋白分子量标准。
图4为SUMO-HV1融合蛋白经镍离子亲和层析His-Trap HP(GE Healthcare 5ml)紫外波形图。
图5为SUMO-HV1融合蛋白酶切及重组HV1蛋白纯化后的SDS-PAGE分析图,其中,1:SUMO-HV1融合蛋白,2:酶切混合物,3-4:纯化后重组HV1蛋白,5:未切SUMO-HV1融合蛋白与SUMO蛋白混合物,M:蛋白分子量标准。
图6为重组HV1蛋白经镍离子亲和层析His-Trap HP(GE Healthcare 5ml)紫外波形图。
图7为Q阴离子交换纯化重组HV1蛋白后的SDS-PAGE分析图,其中,1-2:重组HV1蛋白,3:Q阴离子交换纯化后重组HV1蛋白,M:蛋白分子量标准。
图8为重组HV1蛋白经阴离子交换Hi-TrapTM Q XL(GE Healthcare,1ml)紫外波形图。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1:重组水蛭素HV1的制备。
1)水蛭蛋白HV1,其氨基酸序列为Genebank序列号P01050;编码HV1的核苷酸序列,采用Genebank序列号A19993;
对于编码HV1蛋白的核苷酸序列(Genebank序列号A19993),在最后一个氨基酸密码子之后加上终止密码子TAA和限制性内切酶的识别位点;
2)SUMO蛋白,其氨基酸序列为Genebank序列号NP_010798.1;编码SUMO蛋白的核苷酸序列,其Genebank序列号NM_001180818;
对于编码SUMO蛋白的核苷酸序列(Genebank序列号NM_001180818),在第一个氨基酸密码子之前加上了限制性内切酶的识别位点;
根据上述序列分别设计引物如下:
P1:5’ATC ACT CAT ATG GGG TCG GAC TCA GAA G-3’
P2:5’GT ACA ATC AGT GTA AAC AAC ACC TCC AAT CTG TTC GCG GTG 3’
P3:5’GGA GGT GTT GTT TAC ACT GAT TGT AC 3’
P4:5’CG GGA TCC TTA TTG CAA GTA CTC CTC 3’
其中P1含有NdeI酶切位点,起始密码,His6标签以及SUMO上游互补序列,P2含有下游SUMO互补序列和HV1上游互补序列,P3含有与HV1上游互补序列,P2与P3含有互补区域,P4含有HV1下游互补序列和BamH I酶切位点以及终止密码子。
第一轮PCR,分别以P1,P2扩增SUMO基因,反应体系以及程序如下:
补H2O至50μl反应条件如下:
反应结束后,进行1.0%Agarose电泳鉴定并割胶回收目的条带。
以P3,P4扩增HV1基因。反应体系以及程序如下:
补H2O至50μl反应条件如下:
反应结束后,进行1.0%Agarose电泳鉴定并割胶回收目的条带。
以第一轮扩增的两种产物作为模板,以P1,P4为上下游引物,反应体系以及程序如下:
补H2O至50μl反应条件如下:
反应结束后,进行1.0%Agarose电泳鉴定并割胶回收目的条带,得到SUMO-HV1基因,其碱基序列如SEQ ID No.1所示。
3)构建含SUMO-HV基因的表达载体;
用表达载体pET28a,将合成的SUMO-HV1基因,(起始端含NdeI酶切位点,终止端含BamHI酶切位点),与pET28a分别经NdeI和BamHI双酶切处理,酶切条件为37℃水浴6小时。然后将酶切产物用1~2%的琼脂糖凝胶电泳,电泳15分钟,电压120伏。用凝胶回收试剂盒回收上述两个DNA片段。其过程为:a.在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸尽凝胶表面的液体并切碎。计算凝胶重量(提前记录1.5ml离心管重量),该重量作为一个凝胶体积(如100mg=100μl体积)。b.加入3个凝胶体积的Buffer DE-A,混合均匀后于70℃加热,间断混合(每2~3min),直至凝胶块完全熔化(约6~8min)。c.加0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B,混合均匀;当分离的DNA片段小于400bp时,加入1个凝胶体积的异丙醇。d.吸取步骤c中的混合液,转移到DNA制备管中,12,000×g离心1min。弃滤液。e.将制备管置回2ml离心管中,加500μl Buffer W1,12,000×g离心30s,弃滤液。f.将制备管置回2ml离心管中,加700μl Buffer W2,12,000×g离心30s,弃滤液。以同样的方法再用700μl Buffer W2洗涤一次12,000×g离心1min。g.将制备管置回2ml离心管中,12,000×g离心1min。h.将制备管置回1.5ml离心管中,在制备膜中央加25~30μl Eluent或去离子水,室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。酶切后基因片段和载体按体积比为3∶1混匀后加入T4连接酶,16℃连接过夜。将3)步骤中的连接液20μl全部加入200μl感受态细菌中,置冰上1h;42℃热休克90sec,迅速置冰中5min;加入800μl 37℃预热的LB培养液;37℃,220rpm振摇1h,离心后全部涂布于含50μg/ml Kan的LB平板,37℃倒置培养过夜。随机挑取单克隆至含30μg/ml Kan的3ml LB培养液的试管中,37℃220rpm振摇12h,抽提质粒(按Axygen质粒小量抽提试剂盒说明书进行),1.0%Agarose电泳检测纯度并大致定量;其步骤简要如下:a.取1~4ml在LB培养基中培养过夜的菌液,12,000×g离心1min,弃尽上清。b.加250μl Buffer S1悬浮细菌沉淀,悬浮需均匀,不应留有小的菌块。c.加250μl Buffer S2,温和并充分的上下翻转4~6次混合均匀使菌体充***解,直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min。d.加350μl Buffer S3,温和并充分的上下翻转混合6~8次,12,000×g离心10min。e.吸取步骤d中的离心上清并转移到制备管中,12,000×g离心1min,弃滤液。f.将制备管置回离心管中,加500μl Buffer W1,12,000×g离心1min,弃滤液。g.将制备管置回离心管中,加700μl Buffer W2,12,000×g离心1min,弃滤液;以同样方法再用700μl Buffer W2洗涤一次。弃滤液。h.将制备管置回2ml离心管中,12,000×g离心1min。i.将制备管移入新的1.5ml离心管中,在制备管膜中央加60~80μl Eluent或去离子水,室温静置1min。12,000×g离心1min。将上述抽提的质粒进行酶切鉴定。
4)在适合表达重组SUMO-HV1的条件下,培养4)中的转化子细胞。
挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/ml Kan的3ml LB培养液的试管中,37℃220rpm振摇过夜;次日按1∶100接种于50μg/ml Kan的50ml LB培养液中,37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.6(约2h);取出1ml培养物,12000g室温离心2min,弃上清,用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀;向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.2mmol/l,37℃220rpm振摇12h,诱导SUMO-HV表达;取出1ml培养物,12000g室温离心2min,弃上清,用100μl1×上样缓冲液重悬菌体沉淀,剩余培养物4℃4000g离心12min,弃上清,沉淀置-20℃冻存;聚丙烯酰胺电泳检测融合蛋白约占菌体总蛋白的30%。
5)用物理方法或化学试剂裂解细胞,抽提、纯化重组融合蛋白。
将1L诱导表达的培养菌体沉淀用50ml Binding-Buffer重悬后,超声破碎(功率200W,工作9sec,间歇5sec,共30min),4℃12000rpm离心15min,取上清,沉淀冻存于-20℃;利用AKTA层析***,上清液以5ml/min流速上样至Binding-Buffer预平衡的His-Trap HP(GE Healthcare 5ml);用Binding-Buffer以5ml/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线;用Washing-Buffer以5ml/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线;然后用Elution-Buffer以3ml/min流速洗脱,收集洗脱峰,用SDS-PAGE电泳检测。
6)酶切SUMO-HV融合蛋白。
将5)中纯化的SUMO-HV融合蛋白对2L 0.01M PBS pH 7.2透析24小时,每6小时换一次透析液。至完全去除咪唑。透析后蛋白和SUMO蛋白酶Ulp1按照1∶20-50的体积比例混匀,20℃水浴2-4小时。
7)纯化水蛭素蛋白HV。
将6)中酶切后透析袋中的混合物进行纯化,纯化如5)中所述采用His亲和层析。首先用0.01M PBS pH 7.210mM咪唑平衡层析柱,然后将酶切混合物上样,收集流出部分,SDS-PAGE电泳进行检测。
8)Q阴离子交换层析纯化水蛭素
首先用首先用0.01M PBS pH 7.2平衡柱子,然后用0.01M PBS pH 7.2,0.1M NaCl洗脱杂蛋白。目的蛋白用0.01M PBS pH 7.2,0.4M NaCl洗脱。
9)Chromozym TH比色法测定水蛭素活性
(1)用Tris缓冲液将凝血酶国家标准品稀释到终浓度为10IU/ml,待测水蛭素与重组水蛭素标准品分别用Tris缓冲液溶解为1mg/ml。
(2)将待测水蛭素与重组水蛭素标准品分别作1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000稀释
(3)取96孔酶标板,在A~F排分别加入稀释后的水蛭素溶液,每孔25μl;在G排加入25μlP孔的Tris缓冲液;每个稀释度做2个复孔,在A排加入25μlP孔的Tris缓冲液,B~G排加入10IUPml凝血酶溶液,每孔25μl,然后37℃保温5min
(4)在所有孔内加入Chromozym TH溶液,每孔25μl;37℃反应2min;(4)加入乙酸终止液,每孔125μl,检测A405值。
(5)计算结果:以水蛭素浓度(ng/ml)为横坐标,A405值为纵坐标,用统计学软件或作图法计算结果,用方程y=A+Bx进行直线回归。A405值反映凝血酶的活性,A405值越高,凝血酶活性也越高,表明水蛭素活性较低,反之,A405值越低,水蛭素活性较高;当A405值接近0时,表明凝血酶活性完全受到抑制,此时水蛭素活性与凝血酶活性相当,结果抗凝血酶活性见表1。
表1
实施例2:重组水蛭素HV2的制备。
水蛭蛋白HV2,其氨基酸序列为P09945;编码HV2的核苷酸序列,采用如SEQ ID No.4所示核苷酸序列;
对于编码HV2蛋白的核苷酸序列,在最后一个氨基酸密码子之后加上终止密码子TAA和限制性内切酶的识别位点;
SUMO蛋白,其氨基酸序列为Genebank序列号NP_010798.1;编码SUMO蛋白的核苷酸序列,其Genebank序列号NM_001180818;
对于编码SUMO蛋白的核苷酸序列(Genebank序列号NM_001180818),在第一个氨基酸密码子之前加上了限制性内切酶的识别位点;
根据上述序列分别设计引物如下:
P1:5’ATC ACT CAT ATG GGG TCG GAC TCA GAA G-3’
P2:5’GTGCAGTCGGTGTAGGTGAT ACC TCC AAT CTG TTC GCG GTG 3’
P3:5’GGA GGT ATCACCTACACCGACTGCAC 3’
P4:5’CG GGA TCC TTA CTGCAGGTATTCTTC 3’
其中P1含有NdeI酶切位点,起始密码,His6标签以及SUMO上游互补序列,P2含有下游SUMO互补序列和HV2上游互补序列,P3含有与HV2上游互补序列,P2与P3含有互补区域,P4含有HV2下游互补序列和BamH I酶切位点以及终止密码子。
PCR条件及方法同实施例1,得到SUMO-HV2基因,其碱基序列如SEQ ID No.2所示。
重组水蛭素表达载体pET28a/SUMO-HV2的构建、转入大肠杆菌中表达,蛋白的酶切及纯化等过程全部同实施例1,得到的HV2蛋白活性见表1。实施例3:重组水蛭素HV3的制备。
水蛭蛋白HV3,其氨基酸序列为P09944;编码HV3的核苷酸序列,采用如SEQ ID No.5所示核苷酸序列;
对于编码HV3蛋白的核苷酸序列(SEQ ID No.5),在最后一个氨基酸密码子之后加上终止密码子TAA和限制性内切酶的识别位点;
SUMO蛋白,其氨基酸序列为Genebank序列号NP_010798.1;编码SUMO蛋白的核苷酸序列,其Genebank序列号NM_001180818;
对于编码SUMO蛋白的核苷酸序列(Genebank序列号NM_001180818),在第一个氨基酸密码子之前加上了限制性内切酶的识别位点;
根据上述序列分别设计引物如下:
P1:5’ATC ACT CAT ATG GGG TCG GAC TCA GAA G-3’
P2:5’GTGCAGTCGGTGTAGGTGAT ACC TCC AAT CTG TTC GCG GTG 3’
P3:5’GGA GGT ATCACCTACACCGACTGCAC 3’
P4:5’CG GGA TCC TTATTCGTCGTACGCGTC 3’
其中P1含有NdeI酶切位点,起始密码,His6标签以及SUMO上游互补序列,P2含有下游SUMO互补序列和HV3上游互补序列,P3含有与HV1上游互补序列,P2与P3含有互补区域,P4含有HV3下游互补序列和BamH I酶切位点以及终止密码子。
PCR条件及方法同实施例1,得到SUMO-HV3基因,其碱基序列如SEQ ID No.3所示。
重组水蛭素表达载体pET28a/SUMO-HV3的构建、转入大肠杆菌中表达,蛋白的酶切及纯化等过程全部同实施例1,得到的HV3蛋白活性见表1。
Claims (5)
1.一种重组水蛭素的生产方法,其特征在于该方法包括如下步骤:
(1)使用重叠PCR技术构建SUMO-HV融合基因;
(2)将含有双酶切位点的SUMO-HV融合基因与经过双酶切处理的质粒连接,构建重组水蛭素表达载体;
(3)将重组水蛭素表达载体转入大肠杆菌表达SUMO-HV融合蛋白;
(4)用物理方法或化学方法裂解步骤(3)得到的重组大肠杆菌细胞,释放出SUMO-HV融合蛋白,使用镍离子亲和层析纯化,得到纯化后的SUMO-HV融合蛋白;
(5)将纯化后的SUMO-HV融合蛋白经酶切反应,释放出HV,经镍离子亲和层析分离得到含有His6标签的SUMO蛋白和不含His6的HV蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组水蛭素的生产方法,其特征在于所述的HV基因为编码水蛭素变体的基因,包括编码HV1的基因、或编码HV2的基因、或编码HV3的基因、或编码与HV1、HV2和HV3中任意一种有95%以上氨基酸序列同源性且具有相同活性的蛋白的基因。
3.根据权利要求1或2所述的重组水蛭素的生产方法,其特征在于步骤(1)中,所述SUMO的N端含有His6标签,HV位于SUMO的C端。
4.根据权利要求1所述的重组水蛭素的生产方法,其特征在于步骤(2)中,所述的重组水蛭素表达载体为pET28a/SUMO-HV。
5.根据权利要求1所述的重组水蛭素的生产方法,其特征在于步骤(5)中,经镍离子亲和层析分离得到的HV蛋白,再经Q阴离子交换纯化,得到重组水蛭素蛋白HV。
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CN 201110083156 CN102191264A (zh) | 2011-04-02 | 2011-04-02 | 一种重组水蛭素的生产方法 |
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