CN1834108B - 红毛五加复合多糖、制备工艺、用途及该复合多糖组合物 - Google Patents
红毛五加复合多糖、制备工艺、用途及该复合多糖组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种从红毛五加茎皮中提取、分离、纯化得到的重均分子量在20,000-40,000道尔顿之间，主要由***半乳聚糖蛋白(Arabinogalactan proteins or AGPs)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I(Rhamnogalacturonan Is or RGIs)、半乳糖醛酸聚糖(Homogalacturonansor HGs)和***半乳聚糖(Arabinogalactans or AGs)组成的复合多糖。取适量的红毛五加复合多糖，加入一种或多种药学上可以接受的辅剂，制成注射剂。每个注射剂量单位至少含30mg本发明物质。用于治疗中性粒细胞减少症、贫血、血小板减少症，病毒感染性疾病和作为抗癌的辅助剂。可以是单独用药，也可与其它多糖或G-CSF等联合用药。
Description
本发明涉及中药制药领域。具体涉及一种从红毛五加茎皮中提取、纯化得到的重均分子量在20,000-40,000道尔顿之间，主要由***半乳聚糖蛋白(AGPs)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I(RG I)、半乳糖醛酸聚糖(HGs)和***半乳聚糖(AGs)组成的复合多糖及其制备工艺、制剂及其用途，同时本申请还提供了所述红毛五加复合多糖与黄芪提取物、当归提取物、甘草提取物或G-CSF的组合物，通过组合能够使各组分协同增效。
红毛五加(Acanthopanax giraldii，Harms)为五加科五加属多年生落叶灌木，生长于海拔1300-3500米的灌木丛林中，主要分布于陕西、甘肃、四川、宁夏、青海、河南、湖北等省，药用部位为茎皮。
中医认为：红毛五加皮性味辛、温，功效为驱风湿、通关节、强筋骨，用于治疗拘挛疼痛、风寒湿痹。随着现代医学、药学和分子生物学的发展，人们对于红毛五加茎皮的药理作用也有了进一步的认识。郭辉等(西北药学杂志.1996.3(11).117-119)，(中医药研究.14.(1).8-9)对红毛五加茎皮水提物的药理作用研究表明：红毛五加茎皮水提物能改善环磷酰胺造成的小鼠免疫功能低下，提高荷瘤小鼠血浆肿瘤坏死因子(TNF)的水平。张莅峡等(中国中医基础医学杂志.1999.5(3).25-27)对红毛五加茎皮粗多糖进行了抗病毒活性方面的研究，结果发现其对水泡性口炎病毒(VSV)、单纯疱疹病毒I型(HSV-1)和柯萨基病毒B3型(CB3V)均有明显的抑制作用。陈萍等(中药药理与临床.1994.(3).17-19)对红毛五加茎皮粗多糖进行了对抗叠氮胸苷(AZT)抑制小鼠造血功能和免疫反应的药理研究发现：红毛五加茎皮水提物粗多糖可对抗AZT引起的小鼠造血和免疫抑制的毒性反应，使其外周血白细胞、骨髓造血干细胞和粒、单系祖细胞数目增加，脾脏T淋巴细胞增殖，白细胞介素2(IL-2)的含量升高。因此，探讨以红毛五加多糖作为有效部位用于生血，提高免疫功能及抗病毒感染等，很有前景。
本发明提供一种从红毛五加茎皮中提取、纯化得到的重均分子量在20,000-40,000道尔顿之间，主要由***半乳聚糖蛋白(AGPs)、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I(RGIs)、半乳糖醛酸聚糖(HGs)和***半乳聚糖(AGs)组成的复合多糖，其糖组成(Mole％)为：***糖(Ara)：28.9，鼠李糖(Rha)：8.93，木糖(Xyl)：1.57，半乳糖醛酸(GalA)：36.0，半乳糖(Gal)：19.1，葡萄糖(Glc)：4.31，4-甲氧基葡萄糖醛酸(4-o-me-GlcA)：1.20。多糖含量为95％以上。以普鲁蓝多糖系列做为多糖标准对照品，用分子筛凝胶过滤高效液相色谱-RI-HPLC检测，其重均分子量为20,000-40,000道尔顿。
主要工艺流程如下：红毛五加茎皮经干燥洗净后，加水在100℃提取(加水量为4-5倍，每次提取1.5小时，共提取3次)。提取液60-65℃减压浓缩至稀稠膏状，冷却后进行30-40％醇沉，4℃静置8-12小时。收集上清液，喷雾干燥，即得红毛五加复合多糖粗品。将红毛五加复合多糖粗品用水溶解，浓度为4-6％，用截留分子量为10K的超滤膜超滤(MWCO＝10,000)，保留液上SP Sepharose离子交换柱，洗脱液为pH5-6，30-50mM的缓冲液(取分析纯的酸及其盐，用水分别配制所需浓度的溶液，按不同比例混合即得)，缓冲液可以选自柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液等。收集流出液共3个柱体积，用截留分子量为5K的超滤膜超滤(MWCO＝5,000-8,000)，保留液经70％乙醇沉淀两次，离心，收集沉淀。沉淀加水反溶，浓度为20-30％，喷雾或冷冻干燥，即得红毛五加复合多糖，多糖含量在95％以上。
或收集红毛五加水提取物经醇沉后的上清液，回收乙醇后用截留分子量为10K的超滤膜超滤及以后的步骤，同样得到红毛五加复合多糖。
本发明还提供了红毛五加复合多糖注射剂的制备方法：取适量的红毛五加复合多糖，加入一种或多种药学上可以接受的助溶剂、分散剂、载体或赋形剂，混合后制成适当注射剂如粉针、水针或冻干粉针。每个注射剂量单位至少含30mg本发明物。
本发明提供的红毛五加复合多糖用于治疗中性粒细胞减少症、贫血、血小板减少症、病毒感染性疾病和作为抗癌辅助药。可以是单独用药，也可与其它多糖或G-CSF等药物联合用药。
本发明提供的红毛五加复合多糖在生血、提高机体免疫功能方面的药理作用为：体外实验的结果表明，单独使用红毛五加复合多糖时，其浓度在50-400ug/ml时，可有效地刺激用植物血凝素(PHA)活化的人的外周血单核细胞产生白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。
红毛五加复合多糖与黄芪多糖、当归多糖、甘草多糖或G-CSF组合后，能够发挥协同增效作用。当红毛五加复合多糖和黄芪多糖(参考封士兰等.黄芪多糖生产工艺研究.中成药.1997.19(12).5-6.中的工艺并加以改良后提取，纯化而得，多糖含量在95％以上)合并用药，红毛五加复合多糖浓度为100ug/ml，黄芪多糖浓度为100ug/ml时，与单独使用红毛五加复合多糖或黄芪多糖，浓度为200ug/ml比较，刺激用PHA活化的人的外周血单核细胞产生IL-6、GM-CSF和G-CSF的能力增强。当红毛五加复合多糖和G-CSF合并用药，红毛五加复合多糖用量为100mg/kg/d，G-CSF用量为100ug/kg/d，与单独使用红毛五加复合多糖，用量为100mg/kg/d，或单独使用G-CSF用量为100ug/kg/d相比较，刺激Balb/c小鼠产生粒/巨噬细胞集落形成细胞(GM-CFC)和红系爆增式集落形成细胞(BFU-E)的能力明显增强。
体内实验的结果表明，对接受放疗的Balb/C小鼠单独使用红毛五加复合多糖，当用药量为50-200mg/kg/d，皮下注射给药，连续使用7天，与安慰剂组比较，白细胞和血小板的恢复提前了4-7天。进一步的研究表明，给药组小鼠骨髓造血干细胞和粒、单系祖细胞数目增加，脾脏T淋巴细胞增殖。当红毛五加复合多糖和黄芪多糖合并用药，用药量为红毛五加复合多糖100mg/kg/d，黄芪多糖100mg/kg/d，用法同上时，与单独使用红毛五加复合多糖或黄芪多糖，用药量为200mg/kg/d组相比较，白细胞的恢复提前了2-4天。当红毛五加复合多糖和当归多糖(参考张林维等.当归多糖的分离纯化及其部分性质的研究.生物学杂志.1998.15(3).12-14.并加以改良后提取，纯化而得。多糖含量在95％以上)合并用药时，用药量为红毛五加复合多糖100mg/kg/d，当归多糖100mg/kg/d，用法同上时，与单独使用红毛五加复合多糖或当归多糖，用药量为200mg/kg/d组比较，白细胞、血小板和红细胞的恢复都提前了。当红毛五加复合多糖和G-CSF合并用药，用药量为红毛五加复合多糖200mg/kg/d，G-CSF 1-3ug/kg/d，用法同上时，与单独使用G-CSF，用药量为1-3ug/kg/d或单独使用红毛五加复合多糖，用药量为200mg/kg/d组比较，白细胞、血小板和红细胞的恢复都提前了3-4天。对接受化疗的Balb/C小鼠单独使用红毛五加复合多糖时，当用药量为50-200mg/kg/d，皮下注射给药，连续使用7天时，与安慰剂组比较，白细胞和血小板的恢复提前了4-7天。当红毛五加复合多糖和黄芪多糖合并用药，用药量为红毛五加复合多糖100mg/kg/d，黄芪多糖100mg/kg/d，用法同上时，与单独使用红毛五加复合多糖或黄芪多糖，用药量为200mg/kg/d组相比较，白细胞的恢复提前了2-4天。当红毛五加复合多糖与当归多糖合并用药，用药量为红毛五加复合多糖100mg/kg/d，当归多糖100mg/kg/d，用法同上时，与单独使用红毛五加复合多糖或当归多糖，用药量为200mg/kg/d组比较，白细胞，血小板和红细胞的恢复都提前了。当红毛五加复合多糖和G-CSF合并用药，用药量为红毛五加复合多糖200mg/kg/d，G-CSF 1-3ug/kg/d，用法同上时，与单独使用G-CSF，用药量为1-3ug/kg/d时或单独使用红毛五加复合多糖，用药量为200mg/kg/d组比较，白细胞、血小板和红细胞的恢复都提前了3-4天。
本发明提供的红毛五加复合多糖在抗病毒方面的药理作用为：体外实验的结果表明，单独使用红毛五加复合多糖时，其浓度在50-200ug/ml时，对水泡性口炎病毒(VSV)、单纯疱疹病毒I型(HSV-1)和柯萨奇病毒B3型(CB3V)均有明显的抑制作用。当红毛五加复合多糖和甘草多糖(参考周蓉等.甘草多糖的分离纯化及高效毛细管电泳分析.分析化学.1999.27(2).245.提供的方法并加以改良后提取，纯化而得。多糖含量在95％以上)合并用药，其浓度在50-200ug/ml时，除了对水泡性口炎病毒(VSV)、单纯疱疹病毒I型(HSV-1)和柯萨奇病毒B3型(CB3V)均有明显的抑制作用外，对腺病毒III型(ADVIII)和柯萨奇病毒A16型(CA16V)也有明显的抑制作用。体内实验的结果表明，给鸡法氏囊病毒攻毒雏鸡单独使用红毛五加复合多糖，用量在20mg/天，连续使用5天，持续观察14天。与对照组动物死亡60％相比较，用药组动物100％存活。给犬细小病毒和犬瘟症患犬单独使用红毛五加复合多糖，用量在75-150mg/d时，连续使用3-7天，持续观察28天。与目前临床上采用的常规治疗相比，治愈率明显升高，没有复发的情况。
本发明提供的红毛五加复合多糖在辅助抗癌方面的药理作用为：给S-180荷瘤小鼠皮下注射红毛五加复合多糖，当用药量为100-300mg/kg/d，连续使用14天，可显著提高荷瘤小鼠脾脏NK细胞的杀伤力，P＜0.01。同时，诱导荷瘤小鼠脾脏细胞生成IL-2和IFN-γ等细胞因子。将红毛五加复合多糖加到COlO205和HT-29等人类肿瘤细胞株的细胞悬液中，浓度为25-500ug/ml，在5％CO2培养箱，37℃培养48小时，未见刺激COlO205和HT-29等人类肿瘤细胞株生长的作用。
具体实施方式
实施例1
红毛五加多糖粗品的制备
红毛五加茎皮40kg，加水提取三次，每次加水160kg，提取1.5小时，提取温度为100℃。合并提取液65℃减压浓缩至稀稠膏状，调整体积至20L，静置过夜，加入95％乙醇至终浓度35％，搅拌均匀，4℃放置10小时，5000×g离心10min，收集上清液，喷雾干燥，得红毛五加多糖粗品690g。多糖含量为16.8％。
实施例2
红毛五加多糖精品的制备
将红毛五加多糖粗品400g用水溶解，浓度为4％，用截留分子量为10K的超滤膜超滤，保留液体积为8L，上200×300mm SP Sepharose离子交换柱，洗脱液为pH5.2，50mM的乙酸-乙酸钠缓冲液，收集流出液共30L，用截留分子量为5K的超滤膜超滤，得保留液6L，加入95％乙醇至终浓度70％，4℃放置10小时，5000×g离心5min，收集沉淀。沉淀加水反溶至6L，，加入95％乙醇至终浓度70％，4℃放置10小时，5000×g离心5min，收集沉淀。沉淀加水反溶至7L，喷雾干燥，得红毛五加多糖精品97g(红毛五加复合多糖)，多糖含量为97％。
实施例3
红毛五加复合多糖冻干粉针剂的制备
取实施例2所得红毛五加复合多糖30g，用含1.0％甘露醇、0.4‰的吐温-80、pH5.0，50mM的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，调整终体积至2000ml。0.22um滤膜除菌过滤，分装到1000个10ml西林瓶中，冻干即得。
实施例4
红毛五加复合多糖诱导PHA活化的人的外周血
单核细胞生成GM-CSF，G-CSF和IL-6
实验共分为10组：第1组试药为实施例1，浓度为50ug/ml。第2组试药为实施例1，浓度为100ug/ml。第3组试药为实施例1，浓度为200ug/ml，。第4组试药为实施例1，浓度为400ug/ml。第5组试药为实施例2，浓度为50ug/ml。第6组试药为实施例2，浓度为100ug/ml。第7组试药为实施例2，浓度为200ug/ml，。第8组试药为实施例2，浓度为400ug/ml。第9组试药为猪苓多糖注射剂(连云港东风制药厂)，浓度为400ug/ml。作为阳性对照。第10组为空白对照。
从健康人全血中分离、洗涤得到人外周血单核细胞，用RPMI-1640培养基调整细胞数到1×106/ml，依次加入各管，每管1.0ml。再加入药液0.5ml(除空白对照外)，PHA液0.5ml(至终浓度4ug/ml)。37℃，5％二氧化碳培养箱培养24小时，离心，收集上清。用相应的ELISA试剂盒分别检测GM-CSF，G-CSF和IL-6的生成量，用加药组产生的细胞因子量比空白对照组产生的细胞因子量(S/C)为表示活性的单位。
下表显示不同纯度、不同浓度的红毛五加多糖
诱导生成GM-CSF，G-CSF和IL-6的数量
| 试药名称 | 试药浓度(ug/ml) | G-CSF(S/C) | GM-CSF(S/C) | IL-6(S/C) |
| 实施例1 | 50 | 3.9 | 0.9 | 39.1 |
| 实施例1 | 100 | 4.6 | 0.8 | 67.1 |
| 实施例1 | 200 | 8.9 | 1.9 | 87.4 |
| 实施例1 | 400 | 11.7 | 2.7 | 125.7 |
| 实施例2 | 50 | 10.8 | 2.8 | 176.4 |
| 试药名称 | 试药浓度(ug/ml) | G-CSF(S/C) | GM-CSF(S/C) | IL-6(S/C) |
| 实施例2 | 100 | 16.0 | 5.0 | 330.6 |
| 实施例2 | 200 | 19.7 | 7.7 | 380.6 |
| 实施例2 | 400 | 24.7 | 10.7 | 508.1 |
| 猪苓多糖 | 400 | 9.2 | 5.2 | 16.0 |
从以上结果可以看出：红毛五加多糖的粗品和精品(红毛五加复合多糖)均能诱导PHA活化的人的外周血单核细胞生成GM-CSF，G-CSF和IL-6，且生成量与药物浓度呈正相关。精品的活性显著高于粗品。
实施例5
红毛五加复合多糖与黄芪多糖合用强化PHA活化的人的外周血
单核细胞诱导生成GM-CSF，G-CSF和IL-6
试药共分为4组：第1组试药为实施例2，浓度为200ug/ml。第2组试药为黄芪多糖，浓度为200ug/ml。第3组试药为实施例2+黄芪多糖，浓度各为100ug/ml。第4组试药为猪苓多糖注射剂(连云港东风制药厂)，浓度为400ug/ml。作为阳性对照。未加药组作为空白对照。
从健康人全血中分离、洗涤得到人外周血单核细胞，用RPMI-1640培养基调整细胞数到1×106/ml。加入各管，每管1.0ml。各管再加入药液0.5ml(空白对照除外)，PHA液0.5ml(至终浓度4ug/ml)。37℃，5％二氧化碳培养箱培养24小时，离心，收集上清。用相应的ELISA试剂盒检测GM-CSF，G-CSF和IL-2的生成量，用加药组产生的细胞因子量/空白对照组产生的细胞因子量(S/C)表示活性。
下表显示红毛五加复合多糖与黄芪多糖合用强化诱导生成
G-CSF，GM-CSF和IL-6
| 试药名称 | 试药浓度(ug/ml) | G-CSF(S/C) | GM-CSF(S/C) | IL-6(S/C) |
| 实施例2 | 200 | 19.7 | 7.7 | 380.6 |
| 黄芪多糖 | 200 | 14.8 | 8.5 | 410.2 |
| 实施例2+黄芪多糖 | 100+100 | 25.1 | 12.8 | 690.8 |
| 猪苓多糖 | 400 | 7.4 | 4.4 | 23.9 |
从以上结果可以看出：当红毛五加复合多糖与黄芪多糖合用时，刺激用PHA活化的人的外周血单核细胞产生IL-6，GM-CSF和G-CSF的能力增强。
实施例6
红毛五加复合多糖和G-CSF合用刺激Balb/c小鼠产生
GM-CFC和BFU-E的能力明显增强。
试药分为4组：第1组.实施例2，用量100mg/kg/d。第2组.G-CSF(重组人粒细胞集落刺激因子.商品名：惠尔血.麒麟鲲鹏(中国)生物药业有限公司)用量100ug/kg/d。第3组.实施例2+G-CSF，用量为实施例2100mg/kg/d，G-CSF 100ug/kg/d。第4组.安慰剂组。
雌性Balb/c小鼠，体重18-22g，随机分组，每组5只。皮下注射给药，每日一次，连续给药7天。取外周血，分离单核细胞，洗涤后用含有EPO(红细胞生成素)、IL-3、IL-6和干细胞因子等的培养基调整细胞数为1×105个/ml，依次加入35mm的培养皿，每皿加入1.0ml。5％CO2培养箱，37℃饱和湿度培养7天，在显微镜下计数含50个细胞的集落(BFU-E)。各皿加入染色剂1ml，5％CO2培养箱，37℃饱和湿度培养3.5小时，在显微镜下计数棕色的细胞集落(GM-CFC)。
下表显示红毛五加复合多糖和G-CSF合用刺激Balb/c小鼠产生
GM-CFC和BFU-E的能力明显增强。
从以上结果可以看出：当红毛五加复合多糖和G-CSF合用刺激Balb/c小鼠产生GM-CFC和BFU-E的能力明显增强。
实施例7
红毛五加复合多糖促进接受放疗小鼠外周血象的恢复
Balb/c雌性小鼠，体重18-22g，随机分组，每组15只。试药分为4组：第1组为实施例2，用量为50mg/kg/d。第2组为实施例2，用量为100mg/kg/d。第3组为实施例2，用量为200mg/kg/d。第4组为安慰剂组。第5组为正常对照组。
各组小鼠在0天接受X射线照射，照射量为500cGy。从照射当日开始皮下注射给药，每天一次，连续用药一周。各组小鼠每3日尾静脉采血1次，计数外周血白细胞(WBC)，红细胞(RBC)和血小板(PLT)，连续观察4周。
下表显示外周血WBC(×109/L)的变化
下表显示外周血RBC(×1012/L)的变化
下表显示外周血PLT(×109/L)的变化
从以上结果可以看出：第1组RBC的恢复较对照组提前了3天，P＜0.05。WBC的恢复较对照组提前了4天，P＜0.01。PLT的恢复较对照组提前了3天，P＜0.05。第2组RBC的恢复较对照组提前了3天，P＜0.05。WBC的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。PLT的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。第3组RBC的恢复较对照组提前了3天，P＜0.05。WBC的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。PLT的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。
从以上结果可以看出：当红毛五加复合多糖的用量在50-200mg/kg/d时，可以促进接受放疗小鼠外周血象的恢复，特别是促进PLT和WBC的恢复，且恢复的情况与用药量呈正相关。
实施例8
红毛五加复合多糖与当归多糖合用促进
放疗小鼠外周血象全面恢复
Balb/c雌性小鼠，体重18-22g，随机分组，每组15只。试药分为4组：第1组为实施例2，用量为200mg/kg/d。第2组为当归多糖，用量为200mg/kg/d。第3组为实施例2+当归多糖，用量为各100mg/kg/d。第4组为安慰剂组。第5组为正常对照组。
各组小鼠在0天接受X射线照射，照射量为500cGy。从照射当日开始皮下注射给药，每天一次，连续用药一周。各组小鼠每3日尾静脉采血1次，计数外周血WBC，RBC和PLT。连续观察4周。
下表显示外周血WBC(×109/L)的变化
下表显示外周血RBC(×1012/L)的变化
下表显示外周血PLT(×109/L)的变化
结果发现：第1组RBC的恢复较对照组提前了4天，P＜0.05。WBC的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。PLT的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。第2组RBC的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。WBC和PLT的恢复与对照组近似，P＞0.05。第3组RBC的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。WBC的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。PLT的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。
从以上结果可以看出：联合使用红毛五加复合多糖和当归多糖，具有互补作用，比单纯用红毛五加复合多糖的RBC恢复时间提前，比单独用当归多糖的WBC、PLT的恢复时间提前，可使照射后小鼠的外周血象尽快全面恢复。
实施例9
红毛五加复合多糖与黄芪多糖合用进一步促进接受化疗小鼠
外周血WBC的提前恢复
Balb/c雌性小鼠，体重18-22g，随机分组，每组15只。试药分为4组：第1组为实施例2，用量为200mg/kg/d。第2组为黄芪多糖，用量为200mg/kg/d。第3组为实施例2+黄芪多糖，用量为各100mg/kg/d。第4组为安慰剂组。第5组为正常对照组。
各组小鼠在0天接受丝裂霉素C，尾静脉给药，给药量3.5mg/kg/d。连续用药3天。化疗当日开始皮下注射给药，每天一次，连续用药14天。各组小鼠每3日尾静脉采血1次，计数外周血WBC，RBC和PLT。连续观察4周。
下表显示外周血WBC(×109/L)的变化
下表显示外周血RBC(×1012/L)的变化
下表显示外周血PLT(×109/L)的变化
结果发现：第1组RBC的恢复较对照组提前了3天，P＜0.05。WBC的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。PLT的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。第2组RBC的恢复与对照组相似，P＞0.05。WBC的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。PLT的恢复较对照组提前了4天，P＜0.05。第3组RBC的恢复较对照组提前了3天，P＜0.05。WBC的恢复较对照组提前了11天，P＜0.01。PLT的恢复较对照组提前了7天，P＜0.01。
从以上结果可以看出：联合使用红毛五加复合多糖和黄芪多糖，与二者单独使用组相比，既具有互补作用，使接受化疗后小鼠的WBC，PLT均提前恢复。且对WBC的恢复有增效作用。
实施例10
红毛五加复合多糖与G-CSF合用促进
化疗小鼠外周血象全面恢复
Balb/c雌性小鼠，体重18-22g，随机分组，每组15只。试药分为4组：第1组为实施例2，用量为200mg/kg/d。第2组为G-CSF，(重组人粒细胞集落刺激因子.商品名：惠尔血.麒麟鲲鹏(中国)生物药业有限公司)用量为3ug/kg/d。第3组为实施例2+G-CSF，用量为实施例2 200mg/kg/d，G-CSF 3ug/kg/d。第4组为安慰剂组。第5组为正常对照组。
各组小鼠在0天接受丝裂霉素C，尾静脉给药，给药量3.5mg/kg/d。连续用药3天。化疗当日开始皮下注射给药，每天一次，连续用药14天。各组小鼠每3日尾静脉采血1次，计数外周血WBC，RBC和PLT。连续观察4周。
下表显示外周血WBC(×109/L)的变化
下表显示外周血RBC(×1012/L)的变化
下表显示外周血PLT(×109/L)的变化
从以上结果可以看出：当红毛五加复合多糖和G-CSF合并用药，与单独使用G-CSF或红毛五加复合多糖比较，具有增效作用，白细胞、血小板和红细胞的恢复都提前了3-4天。
实施例11
红毛五加复合多糖单用或与甘草多糖合用
在体外的抗病毒作用
所选病毒有5种：水泡性口炎病毒(VSV)、单纯疱疹病毒I型(HSV-1)、柯萨奇病毒B3型(CB3V)，腺病毒III(ADVIII)和柯萨奇病毒A16型(CA16V)。其中，VSV、HSV-1和ADVIII的宿主选用L929细胞，CA16V的宿主选用Vero细胞，CB3V的宿主选用Hela细胞。试药有7种：第1组为实施例1，浓度为200ug/ml。第2组为实施例2，浓度为100ug/ml。第3组为实施例2，浓度为200ug/ml。第4组为甘草多糖，浓度为100ug/ml。第5组为甘草多糖，浓度为200ug/ml。第6组为实施例2+甘草多糖，浓度各为100ug/ml。第7组为三氮唑核苷，浓度为200ug/ml。同时设病毒对照和细胞对照。
96孔细胞培养板感染病毒2小时后，加入上述药液，置5％CO2培养箱内，37℃培养。每天在倒置显微镜下观察细胞病变。连续观察3天，记录各孔病变情况。
下表显示红毛五加复合多糖单用或与甘草多糖合用
对病毒导致细胞病变的抑制作用
“+”表示有病变。其数量的多少表示病变的程度。“-”表示未观察到明显病变。
从以上结果可以看出：红毛五加复合多糖浓度在100-200ug/ml时，对VSV、HSV-1和CB3V导致的细胞病变有明显的抑制作用。且精品的活性显著高于粗品。甘草多糖浓度在100-200ug/ml时，对ADVIII和CA16V导致的细胞病变有明显的抑制作用。两者合用后，抗病毒谱变宽。
实施例12
红毛五加复合多糖对鸡法氏囊病毒的体内抗病毒作用
4周龄雏鸡，体重200-250g，经鸡法氏囊病毒攻毒后随机分为3组，每组20只，雌雄各半。第1组：对照组，不给药。第2组：口服给药组，实施例2加入饮水中，20mg/天。连续给药5天。第3组，肌肉注射给药组，实施例2用量为20mg/天，注射总体积为1ml。连续给药5天。连续2周观察用药组和对照组动物的死亡情况。实验期间，死亡动物需取出法氏囊，称重。第14天，处死所有存活动物，取出法氏囊，称重。
下表显示第14天用药组和对照组动物的一般状态，
死亡率和法氏囊重量
| 组别 | 一般状态 | 死亡率 | 法氏囊重量 |
| 对照组 | 消瘦，生长缓慢 | 60％ | 5-7g |
| 口服给药组 | 良好，体重增加 | 0 | 1-2g |
| 组别 | 一般状态 | 死亡率 | 法氏囊重量 |
| 注射给药组 | 良好，体重增加 | 0 | 1-2g |
从以上结果可以看出：口服或肌肉注射给予红毛五加复合多糖，用量在20mg/天时，可以明显减轻法氏囊的感染和病变，防止鸡法氏囊病毒攻毒动物的死亡。
实施例13
红毛五加复合多糖在临床上对犬瘟热和
犬细小病毒感染的疗效
实验共分4组。第1组：临床确诊为犬细小病毒感染的小型犬41只，体重1000-5000g，静脉给实施例2。体重1000-2500g的动物75mg/d，体重2500-5000g的动物150mg/d，每天1次，连续用药3-7天。第2组：临床确诊为犬细小病毒感染的小型犬20只，体重1000-5000g，按常规疗法治疗，作为对照。第3组：临床确诊为犬瘟热的小型犬37只，体重1000-5000g，静脉给药。用法同上。连续用药3-7天。第4组：临床确诊为犬瘟热的小型犬18只，体重1000-5000g，按常规疗法治疗，作为对照。观察动物的治愈情况和死亡情况，随访至4周，了解有无复发。
下表显示不同时间段各组动物的死亡情况和疾病复发情况
| 组别 | 3天死亡率/复发率 | 7天死亡率/复发率 | 28天死亡率/复发率 |
| 1 | 10％/0 | 17％/0 | 17％/0 |
| 2 | 35％/0 | 49％/0 | 49％/13％ |
| 3 | 19％/0 | 23％/0 | 23％/0 |
| 4 | 31％/0 | 46％/0 | 46％/16％ |
犬瘟热和犬细小病毒感染是两种严重的动物疾病，不经治疗死亡率＞95％。红毛五加复合多糖用量在75-150mg/d时，与目前临床采用的治疗方案比较，患病动物的死亡率低，治愈动物在28天内没有复发。
根据以上结果可以将红毛五加复合多糖单独用于治疗中性粒细胞减少症、贫血、血小板减少症、病毒感染性疾病和作为抗癌辅助药。或与黄芪多糖、当归多糖、甘草多糖或G-CSF组合，以起到协同增效的作用。
Claims (10)
1.一种从红毛五加(Acanthopanax giraldii，Harms)茎皮中提取、分离、纯化复合多糖的方法，其特征在于包括以下步骤：红毛五加茎皮，水提，30-40％乙醇沉淀，收集上清液，用截留分子量为10K的超滤膜超滤，保留液经过阳离子交换柱，用pH5-6、30-50mM的缓冲液洗脱，收集流出液，流出液经过截留分子量为5K的超滤膜超滤，超滤后所得保留液经70％的乙醇沉淀两次，所得沉淀物即为所述的红毛五加复合多糖。
2.权利要求1所述的方法，洗脱液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液或乙酸-乙酸钠缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在经过2次70％醇沉过程制备得到复合多糖沉淀后，加水将沉淀溶解，经喷雾或冷冻干燥得到精制的复合多糖。
4.用权利要求1或2所述方法得到的复合多糖，其特征在于此复合多糖是由***半乳聚糖蛋白、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I、半乳糖醛酸聚糖和***半乳聚糖组成的，多糖含量在95％以上，以普鲁蓝多糖系列做为多糖标准对照品，用分子筛凝胶过滤高效液相色谱-RI-HPLC检测，其重均分子量为20,000-40,000道尔顿。
5.含有根据权利要求1-4中任一权利要求所述的红毛五加复合多糖的注射剂，是由所述的红毛五加复合多糖加入一种或多种药学可以接受的辅料制成，每个注射剂量单位中至少含红毛五加复合多糖30mg。
6.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的红毛五加复合多糖在制备治疗中性粒细胞减少症、贫血、血小板减少症、病毒感染性疾病的药物和制备抗癌辅助药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述的抗癌辅助药物为放、化疗辅助用药。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述的病毒感染性疾病为水泡性口炎病毒、单纯疱疹病毒I型、腺病毒III型、柯萨奇病毒B3型、柯萨奇病毒A16型、鸡法氏囊病毒、犬细小病毒感染引起的疾病和犬瘟病。
9.一种组合物，其中含有根据权利要4所述的红毛五加复合多糖，及选自黄芪多糖、当归多糖、甘草多糖中的任意一种，红毛五加复合多糖与所述植物多糖的重量配比为1∶1。
10.一种组合物，其中含有根据权利要求4所述的红毛五加复合多糖及粒细胞集落刺激因子，红毛五加复合多糖与粒细胞集落刺激因子的重量配比为1∶0.000015。
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