CN1831010A - 一个玉米抗逆转录调控因子及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个玉米抗逆转录调控因子及其编码基因与应用。该玉米抗逆转录调控因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与LTRE顺式元件相互作用提高植物抗逆性能的蛋白质。该调控因子可作用于多个抗非生物逆境相关基因启动子区的LTRE顺式作用元件，调控多个抗非生物逆境相关基因的表达，提高植物对干旱、低温、盐渍等非生物逆境的抵抗能力。LBF对培育耐逆植物品种特别是耐逆玉米品种，提高农作物特别是玉米的产量具有重要意义。

Description

一个玉米抗逆转录调控因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物中与胁迫相关的转录调控因子及其编码基因与应用，特别是涉及一个玉米中抗低温、干旱和盐渍等非生物胁迫的转录调控因子及其编码基因与其在培育抗逆性提高植物中的应用。

背景技术

低温冷害是农业生产中常发生的自然灾害，极大限制了早春作物的种植和晚秋作物的收获。

研究表明，在低温条件下，植物会积极地调动体内的防卫体系来抵御外来的逆境胁迫，这时在植物体内将发生很大变化，如心蛋白的合成，代谢的转变，抗逆境物质的积累等(Hans J，Adaptations to environmental stresses.，Plant Cell，1995，7：1009-1111)。植物对低温胁迫的抵抗并非仅依靠某一、两个功能基因完成，有很多蛋白参与了植物抵御低温胁迫的反应，目前，已发现与低温胁迫相关的基因100多个，它们协同作用调控植物的生理、生化及代谢变化，提高植物对低温胁迫的抗性，已有的研究结果也证明了这一观点。如Steponkus等人把COR15a基因转化到拟南芥中(Steponkus P.L.，Mode of action of the COR15a gene on the freezing toleranceof Arabidopsis.PNAS，1998，1998：14570-14575)，Zhu B等人把HVA1基因转化到水稻中(Zhu B，Overexpression of a 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase geneand analysis of tolerance to water-and salt-stress in transgenic rice.，Plant Sci，1998，139：41-48)，经上述方法获得的转化植株的抗寒性能虽有所提高，但实际效果并不理想。

为提高植物的抗非生物逆境性能，人们进行了大量关于植物抗非生物逆境基因的研究，并开始转向与非生物逆境密切相关的转录调控基因的研究，因为转录因子可以调控与抗逆相关的一系列基因的表达，而不单单是一个基因在起作用，因此转录因子在提高植物抗逆境能力方面起到重要作用，并逐渐成为研究热点。近年来，取得了令人满意的研究成果，如DREB1A(DRE binding factor)因子，可结合DRE(Droughtresponse element)顺式元件，调控RD29A，RD17，ERD10，KIN1，COR15a等基因的表达(Qiang Liu，Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP/AP2DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways indrought-and low-temperature-responsive gene expression，respectively，inArabidopsis.Plant Cell，1998，10：1391-1406；Mie Kasuga，Improving plant drought，salt，and freezing tolerance by gene transfer of a single stess-inducibletransciption factor.，Nature Biotechnology，1999，17：287-291)；ABF(ABREbinding factor)因子，可结合ABRE(ABA response element)顺式元件，调控RD28B，RAB18，ICK1等基因的表达(Joung-youn Kang，Arabidopsis Basic Leucine ZipperProteins That Mediate Stress-Responsive Abscisic Acid Signaling.，Plant Cell，2002，14：343-357)。转基因实验结果表明上述转录因子可显著提高植株对非生物逆境胁迫的抵抗能力。

与抗寒有关的转录调控基因的研究首先从模式植物拟南芥开始，Kisten R.等人分离到拟南芥CBF1(C-repeat binding factor)因子，CBF1可与C-repeat顺式元件相互作用，调控COR6.6，COR15a，COR47，COR78等基因的表达(Kirsten R，ArabidopsisCBF1 Overexpression Induces COR Genes and Enhances Freezing Tolerance.，Science，1998，280：104-106)，转基因实验结果表明，转有CBF1基因的拟南芥的抗寒性能得到显著提高。此外，经研究发现与抗寒相关的多个功能基因的启动子区均含有低温响应元件(LTRE)，如COR15a基因，COR78/LTI78/RD29A基因，KIN1，KIN2基因和RAB18基因(刘强，张桂友，陈受宜.植物转录因子的结构与调控作用.科学通报，2000，45(14)：1465-1474)。最近，Ming-Jun Gao等人从油菜中分离到与LTRE顺式元件相互作用的BNCBFs(Brassica napus CBFs)因子，BNCBFs受低温诱导表达(Ming-Jun Gao，Regulation and characterization of four CBF transcriptionfactors from Brassica napus.Plant Molecular Biology，2002，49：459-471)。但目前与LTRE顺式元件相互作用的反式因子在单子叶植物，尤其是在重要农作物玉米中还未见研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一个玉米抗逆转录调控因子及其编码基因。

本发明所提供的玉米抗逆转录调控因子，名称为LBF(LTRE Binding Protein)，来源于玉米属玉米(Zea mays L.)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与LTRE顺式元件相互作用提高植物抗逆性能的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：1由267个氨基酸残基组成，与LTRE结合的DNA核心序列是“CGAC”。

上述玉米抗逆转录调控因子的编码基因(LBF)是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID №：2由1042个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第117-第920位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增LBF中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

利用植物表达载体，将本发明的LBF的编码基因导入植物细胞，可获得对逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。

使用LBF构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明LBF的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是玉米、水稻、小麦等单子叶植物，也可以是大豆、油菜、棉花等双子叶植物。

本发明从重要农作物玉米中分离、克隆得到LTRE结合蛋白LBF，属于AP1类转录因子，是具有与LTRE结合特异性的转录调控因子，能够调控更多逆境相关基因的表达，LBF所结合的DNA核心元件序列为“CGAC”，这与已报导的CBF1，DREB1A，BNCBF，osDREB等转录因子明显不同，它们结合的DNA核心序列均为“CCGAC”，实验证明该调控因子可作用于多个抗非生物逆境相关基因启动子区的LTRE顺式作用元件，调控多个抗非生物逆境相关基因的表达，提高植物对干旱、低温、盐渍等非生物逆境的抵抗能力。LBF对培育耐逆植物品种特别是耐逆玉米品种，提高农作物特别是玉米的产量具有重要意义。

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为LBF在酵母细胞内与LTRE的结合特异性分析结果

图2为LBF与LTRE体外结合的功能分析(EMSA实验)结果

图3为LBF与LTRE结合的DNA核心序列分析结果

图4为LBF在酵母体内的LTRE结合特异性及转录激活功能验证

图5为LBF基因在盐、干旱、过氧化氢、ABA、低温等逆境条件下的表达

图6为LBF在玉米幼胚发育过程中的特异表达情况

图7为LBF转基因拟南芥的抗寒试验结果

图8为LBF转基因拟南芥的抗盐试验结果

图9为LBF转基因拟南芥的抗旱试验结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物和DNA片段均由北京赛百盛生物工程公司合成，所述测序工作均由上海博亚生物技术有限公司完成。

实施例1、LBF基因的获得

一、玉米幼胚cDNA文库的构建

1、玉米幼胚总RNA的提取和mRNA的分离

取玉米品种齐319授粉后第17天(17dpp)的幼胚1g，用RNAgents Total RNAIsolation System试剂盒(Promega公司)提取上述玉米幼胚的总RNA，然后用PolyATtract mRNA Isolation System(Promega公司)从上述玉米幼胚的总RNA中分离出mRNA。

2、玉米17dpp幼胚cDNA文库的构建

以步骤1获得的玉米17dpp幼胚的mRNA为模板，用GibcoBRL公司的SuperScriptTMPlasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning试剂盒并严格按试剂盒说明书进行操作构建玉米17dpp幼胚的cDNA文库，最后得到库容量为5.2×10⁶cfu的玉米17dpp幼胚的cDNA文库。

二、用酵母单杂交法从玉米17dpp幼胚cDNA文库中筛选LBF编码基因

1、4mer LTRE诱饵载体及4mer mutant LTRE(mLTRE)挽救载体的构建

1)合成LTRE顺势作用元件(两段互补DNA片段)，序列如下：

LTRE(+)：5’-ATTTCATGGCCGACCTGCTTTTT-3’

LTRE(-)：5’-AAAAAGCAGGTCGGCCATGAAAT-3’

各取20μL浓度均为1μg/μL的LTRE(+)和LTRE(-)，混匀，加入4μL浓度为3M的NaOAc和100μL无水乙醇，在-20℃下放置30分钟后离心沉淀DNA，将沉淀用70％乙醇洗一次，然后经干燥使乙醇挥发后，加入6.5μL无菌水和1μL 10×T₄多核苷酸激酶(Promega公司)缓冲液进行退火，退火条件为：88℃2min，65℃10min，37℃10min，25℃5min；再加入1.5μL 20mM的ATP和1μL T₄多核苷酸激酶，37℃反应2小时后，用酚氯仿(混合比例为1∶1)和氯仿各抽提一次，用无水乙醇沉淀DNA。加入2μL 10×连接酶缓冲液，1μL连接酶(5units/μL)，17μL无菌水，16℃连接12-24小时，进行2％琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到了大小约80bp的DNA片段，用DNA片段快速纯化/回收试剂盒(鼎国公司)回收该片段，并将其克隆到经SpeI酶切和补平的载体pBSK+(Clontech公司)中，经测序得到含转录因子与LTRE顺势作用元件结合的DNA核心元件序列的双链DNA片段的重组载体，命名为pL4。

2)合成含突变的LTRE顺势作用元件，合成序列如下：mLTRE(+)：5’-ATTTCATGattagttTGCTTTTT-3’和mLTRE(-)：5’-AAAAAGCAaactaatCATGAAAT-3’，用同样方法，得到含突变的转录因子与LTRE顺势作用元件结合的DNA核心元件序列的双链DNA片段的重组载体，命名为pmL4。

3)将质粒载体pL4和pmL4均用BamHI和Xba I双酶切后纯化，再分别与经同样处理的载体pRS315His(Leu⁺)(Wilson TE et al，Identification of the DNA bindingsite for NGFI-B by genetic selection in yeast.Science 252：1296-300(1991)；用T₄ DNA连接酶连接，得到含有LTRE DNA片段的诱饵载体pRSL4(Leu⁺)和含有mLTREDNA片段的挽救载体pRSmL4(Leu⁺)。

2、玉米17dpp幼胚cDNA文库的筛选

制备酵母yWAM2(Leu^-，His^-，Trp^-)(Cheng X，Boyer JL，Juliano RL.Selectionof peptides that functionally replace a zinc finger in the Sp1 transcriptionfactor by using a yeast combinatorial library.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997，94：14120-14125)感受态细胞，把诱饵载体pRSL4(Leu⁺)转化到酵母菌株yWAM2(Leu^-，His^-，Trp^-)中，转化方法参照Two Hybrid System TRAFO protocol进行，获得整合有pRSL4的酵母菌株yL4(His^-，Trp^-)；然后用酵母菌株yL4(His^-，Trp^-)对步骤一构建的玉米17dpp幼胚cDNA文库进行筛选，转化方法同上，将转化细胞涂到His^-选择培养基(Sigma公司)上，在28℃下培养3-5天，待酵母长出后，提取酵母质粒，提取方法可参照文献(Christine Guthrie，Method I：Quick Plasmid DNAPreparations from Yeast，Methods in Enzymology，1991，194：322)进行；然后将酵母质粒转化E.coli DH5α，提取阳性克隆的质粒并用Not I和Sal I进行酶切分析，表明能够切出约1.2Kb的DNA片断，将所获得的阳性克隆进行序列分析，结果表明获得了与诱饵载体中LTRE顺势作用元件相结合的文库蛋白的编码基因，该基因具有序列表中SEQ ID №：2的多核苷酸序列，由1042个碱基组成，其开放阅读框架为自5’端第117-第920位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质。在GeneBank中搜索该基因的全序列，未发现相同的序列。对其所编码的蛋白进行氨基酸残基序列分析，发现其具有与AP1类转录因子相同的保守结构域，自N端第60-第123位氨基酸残基为AP1类转录因子的保守结构域，证明利用酵母单杂交的方法获得了玉米中与LTRE顺式元件相互作用的反式因子的编码基因，将其命名为LBF，将该基因所编码的蛋白命名为LBF。

实施例2、LBF与LTRE的结合特异性分析

一、LBF在酵母细胞内与LTRE的结合特异性分析

将重组载体pL4和pmL4转化酵母yWAM2(Leu^-，His^-，Trp^-)，得到整合有pL4的酵母菌株yWAM2/pL4和整合有pmL4的酵母菌株yWAM2/pmL4，再把实施例1中经筛库得到的含有LBF基因的质粒转化分别转化重组酵母yWAM2/pL4和yWAM2/pmL4，然后在28℃下，在His^-选择培养基上培养3-5天，结果如图1所示(图中A为重组酵母yWAM2/pL4，图中B为重组酵母yWAM2/pmL4)，只有重组酵母yWAM2/pL4能够生长，而重组酵母yWAM2/pmL4不能够生长，表明LBF在酵母体内能够特异结合LTRE元件，从而激活报告基因HIS3基因的表达，故能够在His^-选择培养基上生长，相反由于LBF不能与mLTRE结合，不能激活报告基因HIS3基因的表达，因而在His^-选择培养基上也不能生长，证明LBF在酵母体内具有LTRE的结合特异性。

二、LBF与LTRE体外结合的功能性分析(EMSA实验)

1、获得纯化的LBF蛋白

把LBF的全长基因克隆到原核表达载体pGEX4T-1(Amersham Pharmacia Biotech公司)中，然后将重组表达载体转化E.coli BL21，在37℃下，用0.3mM IPTG诱导表达2-3小时，将表达产物进行SDS-PAGE电泳检测，表达有分子量约为56KD的蛋白，与预期的LBF(29.4KD)及融合的26KD GST蛋白的大小相符。按照Amersham PharmaciaBiotech公司的MicroSpin^TM GST Purification ModuLe protocol对表达的LBF蛋白进行纯化，用于EMSA实验。

2、同位素标记LTRE和mLTRE探针

LTRE探针序列为：5’-ATTTCATGGCCGACCTGCTTTTT-3’

mLTRE探针序列为：5’-ATTTCATGattagttTGCTTTTT-3’

采用Promega公司的DNA 5’End-Labeling System对LTRE和mLTRE探针进行同位素标记，反应体系为：LTRE(或mLTRE)探针1μL，T₄PNK 10×buffer 5μL，γ-³²P-ATP3μL，T₄PNK(10U/μL)2μL，H₂O 39μL；反应条件为：37℃20分钟；加2μL 0.5MEDTA，68℃10分钟灭活；37℃10分钟；4℃保存备用。

3、LBF蛋白与DNA结合反应及非变性SDS-PAGE检测

LBF蛋白与DNA结合的反应体系为：5×结合缓冲液(含125mM HEPES-KOH pH7.6；50％甘油；250mM KCl)4μL，LBF(步骤1制备的经纯化的LBF蛋白)约4μg(9μL)，1M DTT 1μL，步骤2标记的LTRE(或mLTRE)探针1μL，H₂O 4μL。将其混合后冰浴30分钟进行反应，然后加3μL上样缓冲液(含0.025％溴酚蓝的无菌水)，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，5.4％聚丙烯酰胺胶的配方为：30％丙烯酰胺9mL，10×电泳缓冲液5mL(含甘氨酸142.7g/L，EDTA 3.92g/L，Tris 30.28g/L)，50％甘油2.5mL，去离子水33mL，10％APS 400μL，TEMED 25μL。待胶凝后，用1×电泳缓冲液电泳，先预电泳10分钟(300V)，然后上样，继续电泳1小时(300V)；电泳结束后用滤纸粘下胶，将较用保鲜膜封好后，压X光片1小时；洗片，显影2分钟，定影5分钟。结果如图2所示(泳道1为LBF蛋白，泳道2为LBF蛋白)，泳道1出现了一条明显的电泳条带，是LTRE被LBF蛋白阻滞的结果，相反，mLTRE则不受LBF蛋白阻滞，表明LBF基因的表达产物在体外同样具有LTRE的结合特异性。

实施例3、LBF与LTRE结合的DNA核心序列分析

对LTRE可能的核心序列“GCCGACC”分别进行定点突变，m1-m7的突变序列如下(带下划线的碱基为突变位点)：

LTRE：5’-ATTTCATG GCCGACCTGCTTTTT-3’(CK)

m1：5’-ATTTCATG aCCGACCTGCTTTTT-3’

m2：5’-ATTTCATGG tCGACCTGCTTTTT-3’

m3：5’-ATTTCATGGC tGACCTGCTTTTT-3’

m4：5’-ATTTCATGGCC aACCTGCTTTTT-3’

m5：5’-ATTTCATGGCCG gCCTGCTTTTT-3’

m6：5’-ATTTCATGGCCGA tCTGCTTTTT-3’

m7：5’-ATTTCATGGCCGAC tTGCTTTTT-3’用与实施例2相同的方法进行EMSA实验，结果如图3所示，泳道1-7分别为LBF与m1、m2、m3、m45、m5、m6、m7探针序列的结合产物，泳道CK为对照，表示LBF与LTRE探针序列的结合产物，表明LBF与LTRE结合的DNA核心序列是“CGAC”。

为了进一步确证LBF与LTRE顺式元件结合的特异性，将分别进行单碱基突变的m1-m7的顺式元件构建到pRS315His(Leu⁺)上，转化酵母(方法同实施例1、2)。在His^-选择培养基上培养，28℃培养3天，分别计数，结果在转化效率完全一致的情况下，m1和m7与野生型LTRE(CK)生长菌落数基本一致，m2上生长的菌落数约为野生型的30％，m3、m4、m5、m6则没有菌落生长。表明m2中的碱基突变对LBF与LTRE的结合虽有影响，但LBF仍能够与LTRE结合，这与EMSA的体外实验结果一致，证明LBF所结合的DNA核心序列是“CGAC”。

实施例4、LBF在酵母细胞中的转录激活试验

把LBF全长的cDNA克隆到酵母表达载体YepGAP(Trp⁺)(Qiang Liu，Twotranscription factors，DREB1 and DREB2，with an EREBP/AP2DNA binding domainseparate two cellular signal transduction pathways in drought-and low-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.PlantCell，1998，10：1391-1406)中，得到含有LBF全长基因的重组酵母表达载体，命名为YepGAPLBF，然后将YepGAPLBF分别转化实施例2中的含有LTRE元件的重组酵母yWAM2/pL4和含有mLTRE元件的重组酵母yWAM2/pmL4中，并在His^-选择培养基上，28℃培养3-5天，结果如图4所示(A为YepGAPLBF转化含有mLTRE元件的重组酵母yWAM2/pmL4，B为YepGAPLBF转化含有LTRE元件的重组酵母yWAM2/pL4)，表明用YepGAPLBF转化的含有LTRE元件的酵母能够生长，而含有mLTRE元件的酵母不能生长，表明LBF在酵母体内能够特异结合LTRE元件，从而激活报告基因HIS3的表达，故能够在His-选择培养基上生长，相反由于LBF不能与mLTRE结合，不能激活报告基因HIS3基因的表达，因而在His^-选择培养基上也不能生长，因此，LBF在酵母体内不但具有与LTRE的结合特异性，而且具有转录激活功能。

实施例5、LBF在非生物逆境条件下及幼胚发育过程中的表达特异性分析

一、LBF在非生物逆境条件下的表达特异性分析

1、玉米材料的处理

取玉米种子，吸胀24hr，种植于花盆中，在28℃、光照时间12hr/天条件下，培养约20天，待玉米苗长出三叶一芯，进行下述不同条件的处理：

1)冷害处理：将玉米苗置于2℃培养箱中，在12hr/天光照条件下，培养48hr，取出并洗去根上的土，用液氮速冻，-80℃保存备用。

2)盐渍处理：分别将玉米苗置于0.6％，0.8％，1％的NaCl溶液中，在12hr/天光照条件下，培养3天，取出并洗去根上的土，用液氮速冻，-80℃保存备用。

3)干旱处理：分别将玉米苗置于含水量为8％(混和920g干土和80mL水)，10％，13％的土壤中，在12hr/天光照条件下，培养3天，取出并洗去根上的土，用液氮速冻，-80℃保存备用。

4)ABA处理：分别将玉米苗置于10^-4M、10^-5M、10^-6M的ABA溶液中(取5mgABA用0.1N KOH溶解后，定容至95mL水中即为10^-4M)，在12hr/天光照条件下，培养24hr，取出并洗去根上的土，用液氮速冻，-80℃保存备用。

5)H₂O₂处理：分别将玉米苗置于10mM H₂O₂(1.13mL 30％H₂O₂/L)，60mM H₂O₂(6.78mL30％H₂O₂/L)，150mM H₂O₂(14.95mL 30％H₂O₂/L)的水溶液中，在12hr/天光照条件下，培养24hr，取出并洗去根上的土，用液氮速冻，-80℃保存备用。

6)水处理(HCK)：将玉米苗直接置于水中，在12hr/天光照条件下，培养24hr，-80℃保存备用。

7)对照的处理(CK)：直接取未经任何处理的玉米苗于-80℃冻存作为对照。

2、玉米材料中RNA的提取及DNA的去除

1)取经上述不同方法处理的玉米材料各约200mg，液氮研磨，用RNAgents TotalRNA Isolation System试剂盒(Promega公司)并参照试剂盒说明书的操作流程提取RNA。

2)将RNA溶于85μL水中，加入5μL RQ1 RNA Free DNase(1U/μL)(Promega公司)和10×缓冲液10μL，37℃保温5min，去除DNA的污染。

3)加入100μL的酚氯仿抽提一次，取上清，用等体积的异丙醇沉淀RNA，在将RNA沉淀用70％乙醇洗一次，将RNA溶于50μL无菌水中，

4)定量RNA的浓度为1μg/μL。

3、RT-PCR法统一模板DNA浓度

1)以步骤2提取的经不同处理的玉米材料的RNA为模板，反转录合成其cDNA，反应体系及反应条件为：取Oligo dT₁₈ 1μL(0.5μg/μL)、RNA 5μL(1μg/μL)、dNTP1μL(10mM)和水27μL，混匀后65℃5min，0℃2min；加入5×First-Strand缓冲液10μL、DTT(100mM)5μL和RNase Inhibitor 10U(40U/μL)，混匀后42℃2-5min；加入SuperScipt II 1μL(200u/μL)(Gibcol BRL公司)，混匀后42℃50min，70℃15min灭活，备用。

2)根据GenBank上登录的玉米肌动蛋白基因(Maize Actin1，Accession NO.J01238)设计如下引物：

mAct1 F：5’-CAC CTT CTA CAA CGA GCT CCG-3’

mAct1 R：5’-TAA TCA AGG GCA ACG TAG GCA-3’

以步骤1)获得的经不同处理的玉米材料的cDNA为模板，在引物mAct1 F和mAct1R引导下，进行PCR扩增，PCR反应体系为：模板1μL，2×PCR缓冲液10μL，10mM dNTP1μL，10μM mAct1 F 1μL，10μM mAct1 R 1μL，Taq 1U，灭菌水6μL。PCR反应条件为：先94℃2min；再94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，共30个循环；最后，72℃5min。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，表明扩增出了大小为405bp的条带，如果是以植物材料的基因组DNA为模板，则可扩增出512bp的条带(含有长度为107bp的内含子序列)。然后根据PCR产物的电泳结果对模板DNA进行稀释，调整模板DNA的用量，直至用mAct1 F和mAct1 R引物扩增出的DNA条带的量基本一致，使每微升溶液中模板cDNA的含量基本一致。

4、LBF基因的PCR扩增

1)根据实施例1获得的LBF基因序列设计引物，引物序列如下：

引物1：5’-CTT GAG CAC GTG CCT GTG AA-3’

引物2：5’-TTA ACT TTG CTA GTA GTA GCT CC-3’

以步骤3统一浓度的经不同处理的玉米材料的cDNA为模板，在引物1和引物2的引导下，进行PCR扩增，PCR反应体系为：模板1μL，2×PCR缓冲液10μL，10mMdNTP 1μL，10uM mAct1 F 1μL，10uM mAct1 R 1μL，Taq 1U，灭菌水6μL。PCR反应条件为：先94℃2min；然后94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，共30个循环；最后72℃5min。反应结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示(泳道A-P分别表示：A：CK1(未经任何处理)，B：2℃低温处理，C：8％H₂O干旱处理，D：10％H₂O干旱处理，E：13％H₂O干旱处理，F：HCK(水处理)，G：10^-6M ABA，H：10^-5M ABA，I：10^-4M ABA，J：10mM H₂O₂，K：60mM H₂O₂，L：150mM H₂O₂，M：0.6％NaCl，N：0.8％NaCl，O：1％NaCl，P：CK为对照)，电泳结果表明LBF基因的表达受低温、ABA和过氧化氢等逆境条件诱导。

二、LBF在玉米幼胚发育过程中的表达特异性分析

用与步骤一相同的方法，分别提取玉米授粉后第15、17、21、23和25天幼胚的RNA，用RT-PCR法分析LBF基因在幼胚发育期间的表达情况，结果如图6所示，泳道1-5分别表示第15、17、21、23和25天LBF基因的表达情况，表明LBF的表达量随着幼胚的发育明显增加，这与种子发育过程中细胞逐渐脱水，渗透胁迫增强，逆境增强呈现直接对应关系。

实施例6、LBF基因的拟南芥转化及转基因植株的生理分析实验

一、LBF基因的拟南芥转化及转基因植株的检测

1、植物表达载体的构建及农杆菌的转化

把LBF基因克隆到载体pBI121中，得到植物表达载体，命名为pBI121-LBF；将pBI121-LBF用CaCl₂法转化大肠杆菌JM109，提质粒进行酶切鉴定，挑出阳性克隆测序，表明获得了整合有植物表达载体pBI121-LBF的重组子，将其转化到农杆菌LBA4404中。

2、拟南芥转化

1)拟南芥的培养

将拟南芥种子先在4℃下进行2-3天的春化处理，然后每盆播种7-10粒种子(营养土和蛭石按2∶1混合)；置于温室中培养(22℃，光照16h/天)，待拟南芥抽出初生苔后，剪去初生苔，待其抽出更多的次生苔，且少数开始结荚时，可用于下述转化。

2)农杆菌的培养

挑取转化有pBI121-LBF的重组农杆菌单菌落接种于3mL YEB(Kan 50mg/L，利福平50mg/L)液体培养基中，28℃250rpm培养30小时；按1∶400转接入200mL新鲜的YEB(Kan 50mg/L，利福平50mg/L)液体培养基中，28℃250rpm培养约14小时，测OD₆₀₀≈1.5；在4℃7500rpm下离心10min收集菌体；重悬菌体于二倍体积(400mL)的渗透液(1/2MS盐+5％蔗糖，pH5.7，121℃灭菌15min；用之前加入终浓度为0.044uM6-BA，VB6 1mg/L，VB1 10mg/L，SILWET 0.02％)。

3)转化拟南芥

把拟南芥的花蕾浸入步骤2)中含有重组农杆菌的渗透液中，抽真空(25 IN Hg，保持5分钟)；转化完毕后，将植株套上塑料袋，水平放置，使其在低光强度下生长24-48小时后，即可正常培养。

4)收集种子进行筛选

收集转化植株的种子，称25-30mg种子放入1.5mL离心管中，加入1mL 75％乙醇(含0.05％Tween 20)，于摇床上摇10分钟(300rpm)，离心去上清；加入1mL 95％乙醇洗一次，离心去上清；重复一次；在超净台中加入0.3mL无水乙醇，移到无菌滤纸上，吹干；把吹干的种子撒到1/2MS平板(Kan 50mg/L)上；4℃，放2天后，在22℃、光照条件为16h/天下培养；将阳性植株(T₀代)移栽到盆中培养，并收集种子进行T₁代筛选。

3、PCR检测转基因拟南芥

转基因拟南芥基因组DNA的提取，包括以下步骤：

1)取0.1-0.2g转基因拟南芥植物叶，在液氮中研磨，转移至1.5mL离心管中。

2)加入0.7mL CTAB(含Tris 100mM，NaCl 1.4M，20mM EDTA，CTAB 2％，巯基乙醇0.1％)，60℃水浴30分钟，每隔10分钟，颠倒一次。

3)加0.7mL酚氯仿(1∶1)，颠倒几次，10000rpm离心5分钟，转移上清至一新的离心管，加等体积的氯仿异戊醇(24∶1)，混匀，10000rpm离心5分钟。转移上清至一新的离心管。

4)加等体积的异丙醇，颠倒混匀，10000rpm离心10分钟，除去上清，用70％乙醇洗一次，抽干，将DNA沉淀溶于50μL无菌水中，用于PCR检测。

根据pBI121中35S启动子序列和LBF的基因序列设计引物，引物序列如下：

引物3：(正向引物)5’-TCTGCCGACAGTGGTCCCAA-5’

引物4：(反向引物)5’-TTAACTTTGCTAGTAGTAGCTCC-5’

以转基因拟南芥的基因组DNA为模板，在引物3和引物4的引导下，进行PCR反应，PCR反应体系为(20μL)：转基因植株DNA 1μL(20ng-50ng)，10×PCR缓冲液2μL，MgCl₂(2.5mM)2μL，Taq酶0.2μL，dNTP(2.5mM)2μL，引物3和引物4各10μM，加无菌水至20μL。PCR反应条件为：先94℃5分钟；再94℃45秒，60℃45秒，72℃60秒，共35个循环；最后72℃延伸5分钟。反应结束进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到转化有LBF基因的阳性植株(扩增出约1000bp大小的目的条带)。

二、LBF转基因拟南芥植株的生理分析实验

1、抗寒实验

把LBF转基因植株与未转基因植株置于-6℃，保持6小时；然后转移到正常的生长条件下继续培养，结果表明：转基因植株的存活率为95％，未转基因的植株存活率为5％，LBF能够明显提高植株的抗寒性能，如图7所示(A为转基因植株，B为未转基因植株)。

2、抗盐实验

将LBF转基因植株与未转基因植株置于600mM的NaCl中浸泡3小时；22℃、光照培养24小时；转移到拟南芥正常的生长条件下继续培养，结果表明：转基因植株的存活率为80％，未转基因的植株存活率为15％，LBF能够明显提高植株的抗盐性能，如图8所示(A为转基因植株，B为未转基因植株)。

3、抗旱实验

把LBF转基因植株与未转基因植株置于拟南芥正常的生长条件下不给水连续培养15-20天，结果表明：转基因植株的存活率为80％，未转基因的植株存活率为10％，LBF能够明显提高植株的抗旱性能，如图9所示(A为转基因植株，B为未转基因植株)。

                                 序列表

<160>2

<210>1

<211>267

<212>PRT

<213>玉米属玉米(Zea mays L.)

<400>1

Met Asp Thr Ala Gly Leu Val Gln His Ala Thr Ser Ser Ser Ser Thr

1               5                   10                  15

Ser Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ser Glu Gln Gln Ser Arg Lys Ala

            20                  25                  30

Ala Trp Pro Pro Ser Thr Ala Ser Ser Pro Gln Gln Pro Pro Lys Lys

        35                  40                  45

Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Val Phe

    50                  55                  60

Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Ala Ala Gly Arg Trp Val Cys Glu Val

65                  70                  75                  80

Arg Val Pro Gly Arg Arg Gly Ala Arg Leu Trp Leu Gly Thr Tyr Leu

                85                  90                  95

Ala Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala His Asp Ala Ala Ile Leu Ala Leu

            100                 105                 110

Gln Gly Arg Gly Ala Gly Arg Leu Asn Phe Pro Asp Ser Ala Arg Leu

        115                 120                 125

Leu Ala Val Pro Pro Pro Ser Ala Leu Pro Gly Leu Asp Asp Ala Arg

    130                 135                 140

Arg Ala Ala Leu Glu Ala Val Ala Glu Phe Gln Arg Arg Ser Gly Ser

145                 150                 155                 160

Gly Ser Gly Ala Ala Asp Glu Ala Thr Ser Gly Ala Ser Pro Pro Ser

                165                 170                 175

Ser Ser Pro Ser Leu Pro Asp Val Ser Ala Ala Gly Ser Pro Ala Ala

            180                 185                 190

Ala Leu Glu His Val Pro Val Lys Ala Asp Glu Ala Val Ala Leu Asp

        195                 200                 205

Leu Asp Gly Asp Val Phe Gly Pro Asp Trp Phe Gly Asp Met Gly Leu

    210                 215                 220

Glu Leu Asp Ala Tyr Tyr Ala Ser Leu Ala Glu Gly Leu Leu Val Glu

225                 230                 235                 240

Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ala Trp Asp His Gly Asp Cys Cys Asp Ser

                245                 250                 255

Gly Ala Ala Asp Val Ala Leu Trp Ser Tyr Tyr

            260                 265

<210>2

<211>1042

<212>DNA

<213>玉米属玉米(Zea mays L.)

<400>2

caagctcgag acaagaaacc agaaccagct cactcctcac tccacttcca ctcccaacag     60

caagctcaag cagtcagtca ccggcagggg tcagggtcac agtcacagca gcagccatgg    120

acacggccgg cctcgtccag cacgcgacct cctcgtcttc cacctccacc tcggcgtcgt    180

cgtcctcgtc cgagcagcag agccgcaagg cggcgtggcc gccgtcgacc gcttcctcac    240

cacagcagcc gcccaagaag cgccccgcgg ggcgcacaaa gttccgggag acgcggcacc    300

cggtgttccg cggcgtgcgg cggcggggcg ccgcgggccg gtgggtgtgc gaggtgcgcg    360

tcccggggag gcgcggcgcg cggctgtggc tcggcaccta cctcgccgcc gaggcggcgg    420

cgcgcgcgca cgacgccgcg atactcgccc tgcagggccg cggcgcgggg cgcctcaact    480

tcccggactc cgcgcggctg ctcgccgtgc cgcccccgtc cgcgctcccg ggcctggacg    540

acgcccgccg cgcggcgctc gaggccgtcg cggagttcca gcgccgctct gggtccgggt    600

ccggggccgc cgacgaagcg acctcgggcg cgtctcctcc ctcctcgtcg ccgtcgctgc    660

cggacgtttc tgcggctggc tcgccggcgg cggcgcttga gcacgtgcct gtgaaggccg    720

acgaagcagt ggcgttggac ttggacggcg acgtgttcgg gcccgactgg ttcggggaca    780

tgggcctgga gttggatgcg tactacgcca gcctcgcgga agggttgctc gtggagccgc     840

cgccgccgcc ggcggcctgg gatcatggag actgctgtga ctccggagct gcggacgtcg     900

cgctctggag ctactactag caaagttaac aataataagc ttgacagcca accccaaaag     960

ccccccaact gattgtattc acctctgtaa caaaattcaa attgatttcc cagcaaatga    1020

acttcaaaaa aaaaaaaaaa aa                                             1042

Claims (10)

1、一个玉米抗逆转录调控因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与LTRE顺式元件相互作用提高植物抗逆性能的蛋白质。

2、根据权利要求1所述的抗逆转录调控因子，其特征在于：所述抗逆转录调控因子与LTRE结合的DNA核心序列是CGAC。

3、编码权利要求1所述玉米抗逆转录调控因子的基因。

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：它具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5、根据权利要求4所述的基因，其特征在于：它具有序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列。

6、含有权利要求3或4或5所述玉米抗逆转录调控因子基因的植物表达载体。

7、含有权利要求3或5或5所述玉米抗逆转录调控因子基因的转基因细胞系和宿主菌。

8、扩增权利要求3或4或5所述基因中任一片段的引物。

9、一种培育抗逆性提高植物的方法，是构建含有权利要求3或4或5所述基因的植物表达载体，再将构建的植物表达载体转化目的植物。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述目的植物为玉米、水稻、小麦、大豆、油菜或棉花。

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