CN1680552A

CN1680552A - 水稻的一种耐逆相关基因及其编码蛋白与应用

Info

Publication number: CN1680552A
Application number: CN 200410029952
Authority: CN
Inventors: 储成才; 王秋韫; 吴耀荣
Original assignee: WEIMINGKAITUO AGRO-BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd BEIJING
Current assignee: Beijing Kaituodien Biological Technology Development Center Co., Ltd.
Priority date: 2004-04-06
Filing date: 2004-04-06
Publication date: 2005-10-12
Anticipated expiration: 2024-04-06
Also published as: CN100348723C

Abstract

本发明公开了水稻的一种耐逆相关基因及其编码蛋白与应用，其目的是提供水稻的一种耐逆相关基因及其编码蛋白与利用该基因提高植物耐逆性的方法。本发明所提供的水稻的一种耐逆相关基因，选自下述核苷酸序列之一：1)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的多核苷酸序列。实验证明，将上述水稻耐逆相关基因导入水稻中，可显著提高水稻对干旱、高盐和低温等胁迫的耐受性。本发明将在培育耐逆性增强的植物中发挥重要作用。

Description

水稻的一种耐逆相关基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域中水稻的一种耐逆相关基因及其编码蛋白与应用，特别涉及水稻的一种耐逆相关基因及其编码蛋白与利用该基因提高植物耐逆性的方法。

背景技术

在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达(Shinozaki，K.and Yamaguchi-Shinozaki，K.(1994).Molecular responses to drought and cold stress.Curr.Opin.Biotechnol 7，161-167；Thomashow，M.F.(1999).Plant cold acclimation：freezing tolerancegenes and regulatory mechanisms.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50,571-599)，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类(Kasuga，M.，Liu，Q.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1999).Improving plantdrought，salt，and freezing tolerance by gene transfer of a singlestress-inducible transcription factor.Nature biotechnol.17，287-291)：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。其中，转录因子在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。

在植物的整个基因组中，编码转录因子的基因占了很大一部分，比如，拟南芥中编码转录因子的基因至少有1500个(Riechmann，J.L.，Heard，J.，Martin，G.，Reuber，L.，Jiang，C.-Z.，Keddie，J.，Adam，L.，Pineda，O.，Ratcliffe，O.J.，Samaha，R.R.，Creelman，R.，Pilgrim，M.，Broun，P.，Zhang，J.-Z.，Ghandehari，D.，Sherman，B.K.，and Yu，G.-L.(2000).Arabidopsis transcription factors：genome-wide comparative analysis among eukaryotes.Science 290，2110)，占整个基因组的5％以上。这些转录因子大多属于大的基因家族，有的基因家族又可包括许多亚族，而且有些转录因子家族是植物所特有的。目前已知在植物中与胁迫相关的转录因子主要有：具有AP2结构域的AP2(APETALA2)/EREBP(ethyleneresponsive element binding protein)转录因子家族、含有碱性区域和亮氨酸拉链的bZIP(basic region/leucine zipper motif transcription factors)类转录因子、含有保守的WRKY氨基酸序列的WRKY转录因子家族、含有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)和亮氨酸拉链的MYC家族和具有色氨酸簇(Trp cluster)的MYB家族。这五个转录因子家族，除WRKY家族不参与植物的水胁迫反应外，其它四个家族均参与调节植物对干旱、高盐和低温等的逆境胁迫反应。其中，AP2/EREBP类转录因子在高等植物中广泛存在，它是植物所特有的一类转录因子，近年来，在拟南芥、烟草、玉米、水稻、大豆和油菜中均有报道(Elliott，R.C.，Betzner，A.S.，Huttner，E.，Oakes，M.P.，Tucker，W.Q.，Gerentes，D.，Perez，P.，and Smyth，D.R.(1996).AINTEGUMENTA，an APETALA2-like gene of Arabidopsis with pleiotropic rolesin ovule development and floral organ growth.Plant Cell 8，155-168；Kevin，M.K.，Leonore Reiser，and Robert，L.F.(1996).The AINTEGUMENTA gene ofArabidopsis required for ovule and female gametophyte development is relatedto the floral homeotic gene APETALA2.Plant Cell 8，137-153)，这表明AP2/EREBP类转录因子在高等植物中普遍存在并具有重要作用。

AP2转录因子家族成员的主要特点是含有一个高度保守的、具有三个β折叠的DNA结合区，称作AP2域(AP2 domain)，序列分析显示，AP2蛋白除了至少含有一个AP2域的共同特征外，其它氨基酸序列高度不同。在AP2域中，有两个保守序列，一个是碱性的YRG区，是由19-22个氨基酸组成的高度保守的一段序列，它含有YRG这几个保守的氨基酸序列，YRG元件已经被证明参与与DNA的结合；第二个保守区是RAYD区，RAYD区是由42-43个氨基酸组成的一段氨基酸序列，它的核心结构是一个由18个氨基酸组成的双亲性的α-螺旋结构，这个核心结构的氨基酸序列高度保守(Okamour，J.K.，Brian Caster，Raimundc Villarroel，Marc Van Montagu，andJofuku，K.D.(1997).The AP2 domain of APETALA2 defines a large new familyof DNA binding proteins in Arabidopsis.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94，7076-7081)，RAYD元件可能参与蛋白与蛋白的相互作用。同时，研究还发现，在YRG和RAYD保守区中，有几个氨基酸残基在是极度保守的，比如RAYD保守区中第40个氨基酸——甘氨酸，在所有的AP2蛋白中都是不改变的，它对于AP2蛋白发挥其生理功能很重要(Jofuku，K.D.，den Boer，B.G.，Van Montagu，M.，and Okamuro，J.K.(1994).Control of Arabidopsis flower and seed development by thehomeotic gene APETALA2.Plant Cell 6，1211-1225)。

根据AP2域数目的不同，可以把AP2转录因子家族分为两个亚家族：AP2-like家族和EREBP-like家族。AP2-like家族成员最主要的特征是在其蛋白结构中含有两个AP2域，这两个AP2域被一个由25-26个氨基酸组成的铰链区连接，铰链区的氨基酸序列也是高度保守的，AP2-like家族的另一个特征是，在其YRG序列中均含有WEAR/WESH这样一段高度保守的氨基酸序列。AP2-like家族主要在植物发育中起作用，比如拟南芥基因AP2(homeotic gene APETALA2)是这个家族中的成员之一，它不仅参与调控花分生组织的建立、花器官的分化，同时还能够调控其它与花发育有关的同源异型基因的表达，在拟南芥花发育过程中起重要作用，而且，它还参与拟南芥子房发育和种子发育过程的调节(Jofuku，K.D.，den Boer，B.G.，VanMontagu，M.，and Okamuro，J.K.(1994).Control of Arabidopsis flower and seeddevelopment by the homeotic gene APETALA2.Plant Cell 6，1211-1225)，该家族的另一成员ANT，在拟南芥的子房发育和雌配子体的发育过程中起关键作用。

EREBP-like家族的成员的特征是仅含有一个AP2域，而且在YRG保守区中没有WEAR/WESH，而是由7个氨基酸——WAAEIRD组成的一个高度保守的结构(Okamour，J.K.，Brian Caster，Raimundc Villarroel，Marc Van Montagu，and Jofuku，K.D.(1997).The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA bindingproteins in Arabidopsis.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94，7076-7081)。据估计，在拟南芥中，EREBP-like家族有124个成员之多(Riechmann，J.L.，Heard，J.，Martin，G.，Reuber，L.，Jiang，C.-Z.，Keddie，J.，Adam，L.，Pineda，O.，Ratcliffe，O.J.，Samaha，R.R.，Creelman，R.，Pilgrim，M.，Broun，P.，Zhang，J.-Z.，Ghandehari，D.，Sherman，B.K.，and Yu，G.-L.(2000).Arabidopsistranscription factors：genome-wide comparative analysis among eukaryotes.Science 290，2110)，家族如此庞大，也许与EREBP-like转录因子在植物体中所参与的广泛的生物学作用有关。EREBP-like转录因子参与植物对低温、干旱、病原侵害、机械伤害等的胁迫应答反应，并受乙烯、水杨酸、茉莉酮酸的调节(Singh，K.，Foley，R.C.，and Onate-Sanchez，L.(2002).Transcription factors in plantdefense and stress responses.Curr.Opin.Plant Biol 5，430-436)。

EREBP-like转录因子能够与GCC盒(GCC box)和DRE/CRT(dehydrationresponsive element/C-repeat)两种顺式作用元件结合。GCC盒的序列是AGCCGCC，它存在于植物与抗性有关的基因的启动子中，它对于乙烯诱导的PR基因(pathogenesis related genes)的表达是必须和足够的(Fujimoto，S.Y.，Ohta，M.，Usui，A.，Shinshi，H.，and Ohme-Takagi，M.(2000).Arabidopsisethylene-responsive element binding factors act as transcriptionalactivators or repressors of GCC box-mediated gene expression.Plant Cell 12，393-404)；而DRE/CRT序列存在于植物对干旱、高盐和低温等环境胁迫的抗性有关的基因的启动子中，它们的过量表达能使植物抵抗干旱、高盐和冷害的袭击，所以，EREBP-like家族成员在植物的生物胁迫和非生物胁迫中都起重要的调节作用。同时，他们还发现，在拟南芥中，一些EREBP蛋白在GCC介导的转录调控中起激活作用，而另一些则起转录抑制作用(Fujimoto，S.Y.，Ohta，M.，Usui，A.，Shinshi，H.，and Ohme-Takagi，M.(2000).Arabidopsis ethylene-responsive element bindingfactors act as transcriptional activators or repressors of GCC box-mediatedgene expression.Plant Cell 12 393-404)。

与AP2-like亚家族结合的顺式作用元件目前还没有报道，但它识别的序列很可能与EREBP-like亚家族识别的序列不同，因为直接与GCC盒结合的EREBP-like成员的氨基酸序列在AP2-like亚家族成员中并不存在(Allen，M.D.，Yamaguchi，K.，Ohme-Takagi，M.，Tateno，M.，and Suzuki，M.(2003).A novel mode of DNArecognition by a b-sheet revealed by the solution structure of the GCC-boxbinding domain in complex with DNA.EMBO J.17，5484-5496)。

DREB(DRE-binding protein)类转录因子是AP2家族中EREBP-like亚家族中的一个成员。根据其结构上的同源性，拟南芥中的DREB类转录因子可以将其分为DREB1和DREB2两大类。DREB1包括CBF1/DREB1B、CBF2/DREB1C、CBF3/DREB1A、CBF4/DREB1D、DREB1E和DREB1F六个成员，其中CBF1/DREB1B、CBF2/DREB1C、CBF3/DREB1A位于拟南芥的第四染色体上，目前研究的比较透彻(Gilmour，S.J.，Zarka，D.G.，Stockinger，E.J.，Salazar，M.P.，Houghton，J.M.，and Thomashow，M.F.(1998).Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family ofAP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR geneexpression.Plant J.16，433-442；Liu，Q.，Kasuga，M.，Sakuma，Y.，Abe，H.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1998).Twotranscription factors，DREB1 and DREB2 with an EREBP/AP2 DNA binding domainseparate two cellular signal transduction pathways in drought-andlow-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell.10，1391-1406)，CBF4/DREB1D位于第五条染色体上(Nakamura，Y.，Sato，S.，Asamizu，E.，Kaneko，T.，Kotani，H.，Miyajima，N.，and Tabata，S.(1998).Structural analysis of Arabidopsis thaliana chromosome 5：VII.Sequence features of the regions of 1,013,767 bp covered by sixteen physicallyassigned P1 and TAC clones.DNA Res.5，297-308；Thomashow，M.F.，Gilmour，S.J.，Stockinger，E.J.，Jaglo-Ottosen，K.R.，and Zarka，D.G.(2001).Roleof Arabidopsis CBF transcriptional activators in cold acclimation.PlantPhysiol 112，171-175)，DREB1E和DREB1F位于第一条染色体上(Sakuma，Y.，Liu，Q.，Dubouzet，J.G.，Abe，H.，Shinozaki，K.，and Yamaguchi-Shinozaki，K.(2002).DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs，transcription factors involved in dehydration-and cold-inducible geneexpression.Biochem Biophys Res Commun.290，998-1009)。CBF1、CBF2和CBF3受低温诱导表达，而不受干旱和高盐诱导(Liu，Q.，Kasuga，M.，Sakuma，Y.，Abe，H.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1998).Twotranscription factors，DREB1 and DREB2 with an EREBP/AP2 DNA binding domainseparate two cellular signal transduction pathways in drought-andlow-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell.10.1391-1406；Shinwari，Z.K.，Nakashima，K.，Miura，S.，Kasuga，M.，Seki，M.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1998).AnArabidopsis gene family encoding DRE/CRT binding proteins involved inlow-temperature-responsive gene expression.Biochem Biophys Res Commun.250，161-170)。但目前，不同的研究者对于DREB1的表达模式的报道并不一致，也许是不同的实验条件所造成的。

DREB2类转录因子包括DREB2A和DREB2B两个成员(Nakashima，K.，Shinwari，Z.K.，Sakuma，Y.，Seki，M.，Miura，S.，Shinozaki，K.，and Yamaguchi-Shinozaki，K.(2000).Organization and expression of two Arabidopsis DREB2 genesencoding DRE-binding proteins involved in dehydration-andhigh-salinity-responsive gene expression.Plant Mol Biol.42，657-665)。DREB2A位于拟南芥的第五条染色体上，DREB2B位于第三条染色体上。除了均含有AP2域和核定位信号外，它们在序列上与DREB1类转录因子没有明显的同源性。DREB2类蛋白中含有一段富含丝氨酸/苏氨酸的保守序列，DREB2的表达模式与DREB1不同，它们受干旱和高盐诱导(Gilmour，S.J.，Zarka，D.G.，Stockinger，E.J.，Salazar，M.P.，Houghton，J.M.，and Thomashow，M.F.(1998).Low temperatureregulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activatorsas an early step in cold-induced COR gene expression.Plant J.16，433-442；Sakuma，Y.，Liu，Q.，Dubouzet，J.G.，Abe，H.，Shinozaki，K.，andYamaguchi-Shinozaki，K.(2002).DNA-binding specificity of the ERF/AP2domain of Arabidopsis DREBs.transcription factors involved in dehydration-and cold-inducible gene expression.Biochem Biophys Res Commun.290，998-1009)，而不受低温诱导表达。所以，DREB1和DREB2在胁迫诱导条件下的信号传导途径可能不同。

DREB类转录因子能够与DRE/CRT顺式作用元件结合，诱导启动子中含有DRE/CRT顺式作用元件(TACCGACAT)的基因的表达，这些基因都是与植物对干旱、高盐和低温等环境胁迫的抗性有关的基因。DRE/CRT的核心序列是ACCGAC，普遍存在于干旱、高盐或低温胁迫应答基因的启动子中，比如rd29A、kin1、cor6.6、cor15a、rd17和erd10等，对这些胁迫条件下的基因诱导表达起调控作用。所以，在植物对干旱、高盐或低温胁迫的分子应答中，一个DREB转录因子可以调控一群启动子中含有DRE/CRT元件的与胁迫耐性相关的基因的表达。

在植物中过量表达DREB类转录因子能够显著增强植物对干旱、高盐或低温等胁迫环境的抗性。在拟南芥中过量表达CBF1，转基因植物比没有转基因的植物对低温具有更强的耐性(Jaglo-Ottosen，K.R.，Gilmour，S.J.，Zarka，D.G.，Schabenberger，O.，and Thomashow，M.F.(1998).Arabidopsis CBF1overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance.Science280，104-106)；过量表达CBF3，转基因拟南芥获得了对干旱、高盐和低温胁迫的较高的抵抗能力(Gilmour，S.J.，Sebolt，A.M.，Salazar，M.P.，Everard，J.D.，andThomashow，M.F.(2003).Overexpression of the Arabidopsis CBF3transcriptional activator mimics multiple biochemical changes associatedwith cold acclimation.Plant Physiol.124，1854-1865；Kasuga，M.，Liu，Q.，Miura，S.，Yamaguchi-Shinozaki，K.，and Shinozaki，K.(1999).Improving plantdrought，salt，and freezing tolerance by gene transfer of a singlestress-inducible transcription factor.Nature biotechnol.17，287-291)，但同时也引起转基因植物的高度矮化，而用诱导型启动子比如rd29A的启动子代替组成型启动子就可以克服这个负面效应，在提高植物耐逆性能的同时不会造成植物其它性状的改变。

水稻中也存在能够识别DRE/CTR顺式作用元件或其核心序列并与之结合的DREB类转录因子。2003年，Dubouzet等从水稻中分离得到了与五个拟南芥DREB类转录因子同源的序列的cDNA，并命名为OsDREB1A、OsDREB1B、OsDREB1C、OsDREB1C、OsDREB2A，其中，OsDREB1A、OsDREB1B被低温、高盐和机械损伤诱导，OsDREB2A受干旱、高盐和低温诱导表达，而且，在拟南芥中过量表达OsDREB1A和OsDREB2A的转基因植株都表现了较高的耐干旱、高盐和低温的性能。而且，近年来已经从大麦、黑麦、番茄和油菜里得到了与拟南芥中的DREB转录因子序列上同源、功能上相同或相似的基因，这些研究结果表明，DREB类转录因子在植物界是广泛存在的，并且在不同的植物体中，它们执行着相似或相同的功能。

大量对转录因子研究的结果表明，一个转录因子可能对一类相关性状的很多基因实施调节控制，从而有效改变植物的相关特性，同时很多研究结果也表明，在植物体内，包括拟南芥、烟草、大麦和玉米等，过量表达DREB类转录因子的植株都表现了较高抵抗干旱、高盐和低温胁迫耐逆性能。所以，通过转基因的方法去改善作物的耐逆性，是一种行之有效的途径。

水稻是世界上最重要的粮食作物，也是单子叶植物的模式植物，它为全球近一半的人口提供食物。然而，干旱、高盐和低温等逆境胁迫，每年都会在全世界范围内造成水稻大面积的减产，全球约有40％的水稻种植区受到不同程度的环境胁迫。随着全球人口的不断增加和可耕种面积的逐年减少，提高水稻产量成为全球所共同面临的一个紧迫的挑战，而减少逆境胁迫所造成的产量损失，就能够在很大程度上缓解粮食危机。

旱稻作为和水稻亲源关系极为相近却具有相对极端生态型的禾谷类作物，对旱稻相关基因资源的研究和发掘，有着极为重要的意义。一方面，旱稻和水稻在进化上亲源关系极为相近，可以充分利用水稻的全基因组序列信息；另一方面，转基因受体材料本身的调控机制上的差异，很大程度上与基因来源(基因供体材料)和转基因受体材料的亲源关系远近密切相关，因此导入近源作物的目的基因可最大程度地克服这些障碍。从旱稻中分离克隆的基因，将可用于水稻和其它禾谷类作物的耐逆基因工程，培育出真正的耐逆品种。

发明创造内容

本发明的目的是提供水稻的一种耐逆相关基因及其编码蛋白。

本发明所提供的水稻耐逆相关基因，名称为OsCBF4，来源于稻属水稻(Oryzasativa L.)，是下述核苷酸序列之一：

1)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的多核苷酸序列。

其中，所述与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列可为序列表中的SEQ ID №：1(来源于巴西旱稻)或SEQ ID №：3(来源于日本晴)；它们均编码序列表中的SEQ ID №：2的氨基酸残基序列。

序列表中的SEQ ID №：1和SEQ ID №：3的cDNA序列均由660个碱基组成，它们的开放阅读框架为自5’端第1到第660位碱基。

水稻的一种耐逆相关基因编码蛋白，名称为OsCBF4，来源于稻属水稻(Oryzasativa L.)，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

序列表中序列2的氨基酸残基序列是由219个氨基酸残基组成的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体及细胞系，如重组载体pMD18-T Vector-OsCBF4和含有该基因的大肠杆菌(E.coli)DH5α均属于本发明的保护范围。

扩增OsCBF4中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的第二个目的是提供一种提高植物耐逆性的方法，包括以下步骤：

(a)构建一种DNA片段，使其包含OsCBF4基因；

(b)用所构建的DNA片段或含有所述DNA片段的质粒转化植物细胞；

(c)筛选出被转化的植物细胞；

(d)使被转化的植物细胞再生出完整植株，得到耐逆性提高的转基因植物。

使步骤(d)中被转化的植物细胞再生出完整植株后，可对该转基因植株进行扩繁，可使转基因植物的耐逆性(耐旱或耐盐碱)进一步改善和提高。所述转基因植物的扩繁包括无性繁殖和/或种子繁殖。所述耐逆性提高包括抗旱或耐盐、耐低温、抗病虫害等性能的改善和提高。

在上述方法中，步骤(a)所述的DNA片段还包括组成性或组织特异性或诱导表达(ABA、干旱、盐碱或化学诱导等)的启动子序列。

在本发明的方法中，所述组成性表达启动子可以是CaMV 35S，玉米Ubiquitin，水稻actinl启动子等；所述组织特异性表达启动子可以是根特异性表达启动子、叶片特异性表达启动子或维管特异性表达启动子；所述诱导表达启动子可以是低温、ABA、干旱、盐碱或化学诱导等的启动子序列。

在本发明的方法中，所述DNA片段可为含有由组成性或组织特异性表达或诱导表达(ABA、干旱、盐碱或化学诱导等)启动子控制的OsCBF4基因的DNA分子；也可是人工合成的DNA片段。所述DNA片段可***在用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体质粒如pBin 19，pCambia或pBI 101等，和可在原核生物中繁殖的其他质粒如pUC，pBluescript或PCR载体质粒中。将所述DNA片段***这些质粒的方法可通过现有技术中已知的方法进行。

所述控制OsCBF4基因表达的诱导表达***可以是异源诱导***，也可以是植物内源诱导***如热激，除草剂，干旱、盐胁迫或低温胁迫等诱导***等。

本发明的方法中，所述植物细胞可来源于烟草、油菜、棉花、大豆、杨树、桉树、马铃薯、牧草等双子叶植物，或水稻、玉米、小麦、大麦、高梁、谷子、草坪草等单子叶植物的愈伤组织、茎尖、叶片等组织或器官。

本发明的方法中，所述DNA片段可通过原生质体-化学介导法(Ca²⁺，PEG)，基因枪介导法，农杆菌介导法，电激法，花粉管导入，微注射等方法中的任何一种方法或几种方法的组合转化植物细胞。

本发明的方法中，所述被转化的植物细胞指利用上述转化方法将OsCBF4基因或与其同源的克隆基因导入并通过分子手段证明是阳性的植物细胞。

本发明的方法中，所述被转化的植物细胞的筛选可利用抗生素或其他筛选标记基因完成，如含新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因的细胞或愈伤组织可由卡那霉素或其替衍生代物如G 418等进行筛选；含潮霉素磷酸转移酶(Hygromycinphosphotransferase)基因的细胞或愈伤组织可由潮霉素进行筛选等。在获得抗性愈伤组织细胞后可采用Southern或PCR法，点杂交等分子检测手段对其进行检测，以确定其含有OsCBF4或其同源克隆基因。

本发明的方法中，使被转化的植物细胞再生出的完整植株主要指通过离体由包含有上述DNA元件的转化细胞再生的植株，也包括非离体的其他营养繁殖方法再生的植株。

本发明基于AP2类转录因子(包括DREB类转录因子)在植物耐逆中的重要作用及旱稻在禾谷类作物的耐逆基因工程中的重要作用，以巴西旱稻(Brazilian uplandrice)和日本晴为材料，利用消减抑制杂交的方法，结合基因芯片杂交的结果，分离得到一个耐逆相关基因OsCBF4。实验证明，将OsCBF4导入水稻中，可显著提高水稻对干旱、高盐和低温等胁迫的耐受性。本发明将在培育耐逆性增强的植物中发挥重要作用。

附图说明

图1为OsCBF4与已知的拟南芥DREB类转录因子的进化关系树

图2为受盐诱导的巴西旱稻和日本晴的RT-PCR电泳图谱

图3为受盐诱导的日本晴的RT-PCR电泳图谱

图4为9311、日本晴、兰胜、巴西旱稻经盐处理12天的照片

图5为9311、日本晴、兰胜、巴西旱稻经低温处理4天的照片

图6为部分转基因植株的PCR检测电泳图谱

图7为转基因T0代植株经60天盐处理的照片

图8为部分T1代植株盐胁迫处理7天的照片

图9为部分T1代植株低温胁迫处理7天的照片

图10为部分T1代植株干旱胁迫处理5小时的照片

具体实施方式

水稻(Oryza sativa L.)品种9311，日本晴，兰胜，巴西旱稻(Iapar 9)等被用于以下实施例的各种实验

实施例1、OsCBF4的获得

1、抑制性消减杂交获得水稻盐胁迫差异表达片段

巴西旱稻和日本晴的种子分别在37℃浸种两天，露白后铺在放有两层纱布的平皿上培养，培养条件为28℃，持续光照强度为2500lux，光周期为16/8小时。培养两周后，将巴西旱稻和日本晴的幼苗分别移至150mM NaCl溶液中胁迫处理，同时设对照，分不同的时间点取根(时间点从15分钟到2天)。按照王关琳等(2002)方法分别提取总RNA，然后按照Clontech试剂盒(Clontech PCR-Select cDNASubtraction Kit，购自Clontech公司)的步骤进行操作，构建抑制性消减杂交cDNA文库。按照Clontech试剂盒的步骤依次进行酶切、连接、点杂交、及两轮PCR扩增，获得差异表达的片段。差异表达的片段与pMD 18-T Vector(TAKARA，大连)连接，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株，随机选择700个阳性克隆进行测序。所获得的差异表达片段在NCBI和BGI数据库中进行比对分析，结果显示表达差异最大的为一349bp的cDNA片段，与拟南芥CBF4基因具有较大的同源性，在水稻中为单拷贝，没有内含子，命名为OsCBF4。

2、OsCBF4的克隆及验证

设计引物forward primer：5’＞TTA AGC TTA TGG ACA CCG AGG ACA CGT C＞3’和reverse primer 5’＞TTA AGC TTT CAG TCC ATC CAT AGC TTG T＞3’，按常规PCR方法分别从巴西旱稻和日本晴基因组中将该基因克隆出来，装入pMD 18-TVector，得到重组质粒pMD18-T Vector-OsCBF4，通过CaCl₂法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12-16小时，提取质粒，PCR和酶切鉴定后，序列测定。

抑制性消减杂交所获得的克隆测序结果表明，OsCBF4是所获得丰度差异最大的一个片段，所得EST长为349bp中，有344个核苷酸完全相同。序列测定结果表明OsCBF4全长660bp，其中来自巴西旱稻的OsCBF4全长cDNA序列如序列表中的序列1所示，来自日本睛的OsCBF4全长cDNA序列如序列表中的序列3所示，序列1与序列3仅白5′端的第402位碱基存在差异，它们均编码由219个氨基酸残基组成的如序列2所示的编码蛋白，位于水稻基因组的第一条染色体上，有一个典型的AP2保守区，与AP2/EREBP的DNA结合区具有96.7％的同源性，与AtCBF4具有50.6％的同源性。基于氨基酸序列比较得到的结果建立了OsCBF4与拟南芥已知的DREB类的转录因子的进化树，如图1所示，表明OsCBF4在氨基酸序列上与拟南芥中的AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3和AtCBF4的同源性分别是50.2％，49.6％，49.3％，50.6％。

实施例2、OsCBF4在巴西旱稻和日本晴的根中受盐诱导的表达模式

取野生型日本晴和巴西旱稻的种子，先在37℃浸种两天，露白后铺在放有两层纱布的平皿上，于28℃光照(2500lux，16/8)培养。10天后，换1/4×Hogland营养液继续培养两天，然后将日本晴和巴西旱稻的幼苗移至加有150mM NaCl的1/4×Hogland营养液中进行盐胁迫处理，分别在0、0.5、1、3、6、12和24小时这7个时间点快速取日本晴和巴西旱稻的根和叶片，迅速在液氮中冷冻，-80℃保存，然后按照王关琳等(2002)方法提取水稻日本晴和巴西旱稻的不同组织的总RNA，然后按照Promega公司的Reverese Transcription System(cat.^#3500，购自Promega公司)说明书的步骤对盐处理的日本晴和巴西旱稻的不同时间点的根部总RNA进行反转录，然后分别以5’＞TTA AGC TTA TGG ACA CCG AGG ACA CGT C＞3’和5’＞TTAAGC TTT CAG TCC ATC CAT AGC TTG T＞3’为正向和反向引物，用RT-PCR方法进行PCR扩增40个循环，扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳，结果如图2所示，表明OsCBF4在巴西旱稻中受盐诱导后的表达量远远高于相同处理条件下OsCBF4在日木晴中的表达量，在巴西旱稻和日本晴根中，OsCBF4的表达在盐诱导30分钟内迅速达到最高峰，1小时时开始明显下降，至6小时已完全检测不到。

实施例3、OsCBF4在日本晴不同器官组织中的表达模式

取野生型日本晴种子，先在37℃浸种两天，露白后铺在放有两层纱布的平皿上，于28℃光照(2500lux，16/8)培养。10天后，换1/4×Hogland营养液继续培养两天，然后将日本晴幼苗移至加有150mM NaCl的1/4×Hogland营养液中进行盐胁迫处理，分别在0、0.5、1、6、12、24和48小时这7个时间点快速取日本晴的根和叶片，迅速在液氮中冷冻，-80℃保存，然后按照王关琳等(2002)方法提取水稻日本晴不同组织的总RNA，然后按照Promega公司的Reverese TranscriptionSystem(cat.^#3500，购自Promega公司)说明书的步骤对盐处理的日本晴的根和叶片的不同时间点的总RNA进行反转录，然后分别以5’＞TTA AGC TTA TGG ACA CCG AGGACA CGT C＞3’和5’＞TTA AGC TTT CAG TCC ATC CAT AGC TTG T＞3’为正向和反向引物，用RT-PCR方法进行PCR扩增40个循环，扩增产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行电泳，结果如图3所示，表明OsCBF4在同一品种不同器官组织中的表达模式不同，在日本晴根中，OsCBF4在盐诱导后迅速表达，30分钟即达到其最大表达量，1小时即开始下降，至6小时已检测不到；而在叶中，6小时开始表达，然后表达量迅速下降，至12小时时检测不到其表达。这个现象暗示着在植物受到高盐胁迫后，其根部最先感受并产生相应的胁迫反应，然后，才经过一系列的信号传导途径将胁迫信号传至地上部分，也暗示着OsCBF4可能在植物盐胁迫的信号传导过程中起感应胁迫信号或传递胁迫信息的信号分子的作用。图3中，阴性对照为未经盐处理的日本晴植株，阳性对照为日本晴基因组DNA。

实施例4、不同水稻品种耐逆性能检测

取野生型9311，日本晴，兰胜和巴西旱稻的种子，先在37℃浸种两天，露白后铺在放有两层纱布的平皿上，于28℃光照(2500lux，16/8)培养。10天后，换1/4×Hogland营养液继续培养两天，然后进行胁迫处理，同时设野生型的日本晴做对照。盐处理：将水稻幼苗移至加有150mM NaCl的1/4×Hogland营养液中，相同培养条件下处理12天；冷处理：将水稻幼苗移至4℃培养箱中处理4天。结果如图4和图5所示，图4表明9311、日本晴、兰胜、巴西旱稻对高盐处理的耐受能力不同，相同培养条件下的这四个不同的水稻品种150mmol/L NaCl处理12天，9311叶片卷曲、干枯死亡，日本晴嫩叶全部卷曲、干枯，老叶叶尖卷曲、干枯，兰胜嫩叶全部卷曲、干枯，老叶无卷曲，而巴西旱稻仅叶尖稍有卷曲。图5表明9311、日本睛、兰胜、巴西旱稻对低温的耐逆能力不同，相同培养条件下的这四个不同的水稻品种4℃处理4天，9311叶片全部干枯，日本晴、兰胜嫩叶叶片干枯卷曲，只有最下面的一片老叶伸展，巴西旱稻叶片直立、伸展，没有胁迫表型。这说明巴西旱稻无论是在耐盐还是在耐低温上都明显优于其他几个品种。

实施例5、农杆菌介导法转化水稻

用HindIII酶切实施例1中构建的pMD18-T Vector-OsCBF4(其中的OsCBF4为序列表中的SEQ ID №：1的DNA序列)重组质粒，用玻璃奶回收OsCBF4基因片段，纯化后的片段用Klenow Fragment补平后与经SmalI酶切、脱磷后的双元载体pCAMBIA 1300-35S-tOCS(Cambia，Australia)连接，热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12-16小时，提取质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定，随后转入农杆菌AGL1。

挑取农杆菌单菌落接种于20ml YEB液体培养基(含氨苄青霉素50mg/L，利福平50mg/L)中，28℃，150rpm振荡培养2-3天。于4℃下5000rpm离心3分钟，去上清，重悬于AAM培养基(含0.1mmol/L乙酰丁香酮)中，28℃避光振荡培养1-2小时，至OD₆₀₀＝0.6-0.9。选按常规植物组织培养方法制备的日本晴的生长状态良好、颗粒状愈伤组织浸入农杆菌培养液中摇动20分钟后，静置30分钟，取出用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织接种于共培养基(NB培养基+10g/L葡萄糖+1mg/L己酰丁香酮)上培养。2-3天后，将愈伤组织放入广口瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直到水中不见丝状菌体，然后在含500mg/L羧苄青霉素的无菌水中浸泡30-60分钟，最后再冲洗一遍，置于无菌滤纸上凉干，转入NB共培养基共培养。

侵染后的水稻愈伤组织于NB共培养基共培养3-5天后，转至含30mg/L潮霉素和400mg/L头饱霉素)的NB培养基(N₆大量元素+B₅微量元素+B₅有机成分+300mg/L水解酪蛋白+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+7-8g/L琼脂，pH5.8)上筛选3周，再转入含50mg/L潮霉素和200mg/L头饱霉素的NB培养基上筛选4周，随后抗性愈伤组织转入预分化培养基(NB培养基+1mg/L奈乙酸+2mg/L6-苄基氨基嘌呤+5mg/L脱落酸)，光照培养3周，再转入分化培养基(NB培养基+1mg/L奈乙酸+2mg/L6-苄基氨基嘌呤)上进行分化，再生植株在壮苗培养基(1/2MS无机盐+0.5mg/L奈乙酸+0.25mg/L多效唑)上生根后移至温室中。一个月后取植株叶片，按常规方法提取总DNA，以5’＞AGC TGC GCC GAT GGT TTC TAC AA＞3’和5’＞ATC GCC TCG CTC CAGTCA ATG＞3’为正向和反向引物，进行PCR扩增潮霉素磷酸转移酶基因，检测所获得的植株是否为阳性植株，结果表明获得了13株阳性的转基因植株，图6给出部分转基因植株的PCR检测结果。图6中，N为阴性对照，未被转基因的植株；P为阳性对照(证明为转基因的阳性水稻植株)；151-162为不同的转基因株系的编号。

实施例6、转基因T0代植株耐逆性能鉴定

将实施例5中的过表达OsCBF4的阳性转基因植株在温室中培养，待其产生分蘖后，取每一阳性转基因植株的部分分蘖进行耐盐和干旱试验，同时设相同生长状态的野生型日本晴对照。

盐处理：转移至盐池中的阳性植株分蘖，恢复生长15天后进行盐处理，用0.5％NaCl溶液连续灌溉2个月；

干旱处理：转移至培养容器中的阳性植株分蘖，恢复生长15天后进行干旱处理16天，从处理即日起不再浇水。

结果表明过表达OsCBF4的阳性转基因株系，其对高盐和干旱的耐受能力明显增强。图7表明在盐池中用0.5％的NaCl处理转基因水稻和野生型的日本晴对照，60天后对照死亡，而部分转基因株系的生长状态尚好。图7中，箭头所示151、154、155、157、159为不同的转基因株系的编号，WT为野生型的日本晴对照。

实施例7、转基因T1代植株耐盐性鉴定

收获T0代阳性转基因水稻种子，将阳性转基因植株的151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163株系的种子(T1代)先在37℃浸种两天，露白后铺在放有两层纱布的平皿上，于28℃光照(2500lux，16/8)培养。10天后，换1/4×Hogland营养液继续培养两天，然后将水稻幼苗移至加有100mM NaCl的1/4×Hogland营养液中，相同培养条件下进行盐胁迫处理7天，同时设野生型的日本晴做对照。部分T1代植株耐盐试验的结果如图8所示，表明对照的叶片卷曲、干枯，而三个转基因株系叶片伸展，没有胁迫表型。图8中，151、154、157为阳性转基因株系的株号；WT为野生型，日本晴对照。

继续上述盐胁迫处理至野生型对照死亡后，除去胁迫条件，在正常的培养条件下恢复生长15天后统计分离比，结果如表1所示，表明T1代植株对盐胁迫的耐受性明显提高，并表现出3∶1的分离比(复水后存活植株数目：死亡植株数目)，说明表型与转基因直接连锁。表1中，151-163是不同的阳性转基因株系的株号。

表1.过表达OsCBF4阳性株系T1代不同处理条件下分离比分析

株系	分离比(活：死)
	分离比(活：死)	100mM NaCl
	WT151152153154155156157158159160161162163	100mM NaCl	0∶4027∶1032∶827∶527∶929∶90∶4020∶1325∶58∶327∶3226∶724∶60∶40

实施例8、转基因T1代植物耐低温性鉴定

收获T0代阳性转基因水稻种子，将阳性转基因植株的151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163株系的种子(T1代)先在37℃浸种两天，露白后铺在放有两层纱布的平皿上，于28℃光照(2500lux，16/8)培养。10天后，换1/4×Hogland营养液继续培养两天，然后将水稻幼苗移至加有100mMNaCl的1/4×Hogland营养液中，将培养苗放入10℃培养条件下进行低温处理7天，同时设野生型的日本晴做对照。部分T1代植株的耐低温处理试验结果如图9所示，表明阳性转基因株系151、154、157的T1代和野生型的日本晴对照(WT)10℃处理第7天时，对照的叶片卷曲、干枯，而三个转基因株系仅叶尖部分稍有卷曲。试验结果亦显示，T1代植株对低温的耐受能力明显高于野生型。

实施例9、转基因T1代植株干旱处理试验结果

收获T0代种子，将阳性转基因植株的151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163株系的种子先在37℃浸种两天，露白后铺在放有两层纱布的平皿上，于28℃光照(2500lux，16/8)培养。10天后，换1/4×Hogland营养液继续培养两天后，用纱布吸去其根部残留的水份，转移到干净无水的平皿中进行干旱处理5小时，部分T1代植株干旱处理结果如图10所示，表明对照的叶片干枯、茎杆脱水弯曲，不能直立，而三个转基因株系的生长状态良好，叶片稍下垂，茎杆直立。

序列表

<160>3

<210>1

<211>660

<212>DNA

<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)

<400>1

atggacaccg aggacacgtc gtcggcttcg tcctcgtcgg tgtcgccgcc gtcgtcgccg 60

ggcggcgggc accaccaccg gctgccgccg aagcggcggg cggggcggaa gaaattccgg 120

gagacgcggc acccggtgta ccgcggtgtg cgcgcgcggg cggaggggag caggtgggtg 180

tgcgaggtgc gcgagccgca ggcgcaggcg cgcatctggc tcggcaccta cccgacgccg 240

gagatggcgg cgcgcgcgca cgacgtcgcg gccatcgccc tccgcggcga gcgcggcgcc 300

gagctcaact tcccggactc cccctccacg ctcccgcgcg cgcgcacggg gtcgcccgag 360

gacatccgcc tcgccgccgc gcaggccgcc gagctgtacc gccgcccgcc gccgccgctg 420

gcattgccgg aggatccgca ggaaggcacg agtggcggcg gcgccaccgc cacctcgggg 480

cgtccggctg ccgtgttcgt ggacgaggac gccatcttcg acatgccggg gctgatcgac 540

gacatggcga gggggatgat gctgacgccg ccggcgattg ggagatctct cgacgactgg 600

gccgccatcg acgacgacga tgaccattac cacatggact acaagctatg gatggactga 660

<210>2

<211>219

<212>PRT

<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)

<400>2

Met Asp Thr Glu Asp Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ser Val Ser Pro

1 5 10 15

Pro Ser Ser Pro Gly Gly Gly His His His Arg Leu Pro Pro Lys Arg

20 25 30

Arg Ala Gly Arg Lys Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro Val Tyr Arg

35 40 45

Gly Val Arg Ala Arg Ala Glu Gly Ser Arg Trp Val Cys Glu Val Arg

50 55 60

Glu Pro Gln Ala Gln Ala Arg Ile Trp Leu Gly Thr Tyr Pro Thr Pro

65 70 75 80

Glu Met Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Ile Ala Leu Arg Gly

85 90 95

Glu Arg Gly Ala Glu Leu Asn Phe Pro Asp Ser Pro Ser Thr Leu Pro

100 105 110

Arg Ala Arg Thr Gly Ser Pro Glu Asp Ile Arg Leu Ala Ala Ala Gln

115 120 125

Ala Ala Glu Leu Tyr Arg Arg Pro Pro Pro Pro Leu Ala Leu Pro Glu

130 135 140

Asp Pro Gln Glu Gly Thr Ser Gly Gly Gly Ala Thr Ala Thr Ser Gly

145 150 155 160

Arg Pro Ala Ala Val Phe Val Asp Glu Asp Ala Ile Phe Asp Met Pro

165 170 175

Gly Leu Ile Asp Asp Met Ala Arg Gly Met Met Leu Thr Pro Pro Ala

180 185 190

Ile Gly Arg Ser Leu Asp Asp Trp Ala Ala Ile Asp Asp Asp Asp Asp

195 200 205

His Tyr His Met Asp Tyr Lys Leu Trp Met Asp

210 215

<210>3

<211>660

<212>DNA

<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)

<400>3

atggacaccg aggacacgtc gtcggcttcg tcctcgtcgg tgtcgccgcc gtcgtcgccg 60

ggcggcgggc accaccaccg gctgccgccg aagcggcggg cggggcggaa gaaattccgg 120

gagacgcggc acccggtgta ccgcggtgtg cgcgcgcggg cggaggggag caggtgggtg 180

tgcgaggtgc gcgagccgca ggcgcaggcg cgcatctggc tcggcaccta cccgacgccg 240

gagatggcgg cgcgcgcgca cgacgtcgcg gccatcgccc tccgcggcga gcgcggcgcc 300

gagctcaact tcccggactc cccctccacg ctcccgcgcg cgcgcacggg gtcgcccgag 360

gacatccgcc tcgccgccgc gcaggccgcc gagctgtacc ggcgcccgcc gccgccgctg 420

gcattgccgg aggatccgca ggaaggcacg agtggcggcg gcgccaccgc cacctcgggg 480

cgtccggctg ccgtgttcgt ggacgaggac gccatcttcg acatgccggg gctgatcgac 540

gacatggcga gggggatgat gctgacgccg ccggcgattg ggagatctct cgacgactgg 600

gccgccatcg acgacgacga tgaccattac cacatggact acaagctatg gatggactga 660

Claims

1、水稻的一种耐逆相关基因，是下述核苷酸序列之一：

2)编码序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的多核苷酸序列。

2、根据权利要求1所述的基因，其特征在于：所述与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列为序列表中的SEQ ID №：1或SEQ ID №：3。

3、水稻的一种耐逆相关基因编码蛋白，是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQID №：2衍生的蛋白质。

4、含有权利要求1或2所述基因的表达载体及细胞系。

5、一种提高植物耐逆性的方法，包括以下步骤：

(a)构建一种DNA片段，使其包含水稻耐逆相关基因；所述水稻耐逆相关基因，选自下述核苷酸序列之一：1)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的多核苷酸序列；

(c)筛选出被转化的植物细胞；

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(a)所述的DNA片段还包括组成性或组织特异性或诱导表达启动子序列。

7、根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述DNA片段***在用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体质粒和可在原核生物中繁殖的其他质粒中。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体质粒为pBin 19，pCambia或pBI 101；所述可在原核生物中繁殖的其他质粒为pUC，pBluescript或PCR载体质粒。

9、根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述植物细胞来源于双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为烟草、油菜、棉花、大豆、杨树、桉树、马铃薯和牧草；所述单子叶植物为水稻、小麦、大麦、玉米、高梁、谷子和草坪草。

10、根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述DNA片段通过原生质体-化学介导法，基因枪介导法，农杆菌介导法，电激法，花粉管导入和微注射方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞。