CN1818076A - 核酸标记方法 - Google Patents

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CN1818076A CNA200510124689XA CN200510124689A CN1818076A CN 1818076 A CN1818076 A CN 1818076A CN A200510124689X A CNA200510124689X A CN A200510124689XA CN 200510124689 A CN200510124689 A CN 200510124689A CN 1818076 A CN1818076 A CN 1818076A
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格伦·H·麦高尔
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Abstract

在本发明的一个方面，提供了末端标记RNA(总RNA，mRNA，tRNA或片段化的RNA)的方法。在本发明的一个方面，T4RNA连接酶用于将3’－标记的AMP或CMP供体连接于RNA受体分子。在另一实施方案中，焦磷酸分子3′－AppN－3′－接头－可检测部分被用作供体分子。在本发明的另一个方面，提供了检测样品中目的RNA的存在的方法，方法具有下列步骤：提供含有可能或可能不具有所述目的RNA的RNA的样品；用片段化试剂处理样品来提供RNA片段；由所述片段除去磷酸基来提供具有游离3′OH基团的片段；连接具有本发明标记试剂的所述片段；提供具有针对所述目的RNA的探针的核酸阵列；将标记的核酸片段杂交于所述核酸阵列；以及测定所述探针的杂交程度来测定所述目的RNA的存在。

Description

核酸标记方法
相关申请
这些是2003年7月11日申请的美国专利申请10/617,992的部分继续，该申请要求2002年7月12日申请的美国临时申请6,395,580的优先权，这些申请的内容在这里全部引入作为参考用于所有的目的。
发明领域
本发明涉及核酸标记化合物。这些标记化合物具有可检测的部分或一些部分，其是允许通过合适的设备或试验检测携带其的RNA或其片段的分子或复合体。具体地，本发明涉及可用于标记RNA分子或片段的3′末端的核酸标记化合物。本发明的核酸标记化合物可通过使用称作RNA裂解酶的酶连接于RNA。这种标记方法据说是用于使其从需要转化RNA为DNA的其它方法中区分开。本发明也涉及利用核酸微阵列对标记的RNA进行的分析。
发明背景
在病态和健康细胞中以及在在不同发育阶段的细胞中的基因表达通常是不同的。在此情况下监控基因表达的能力给研究人员和医务工作者提供了强有力的诊断工具。
人们例如可以通过测定目的基因的转录产物也即核酸(例如，mRNA)的存在与否监控基因表达。可通过用可检测部分化学或生物化学标记mRNA然后与基因的核酸探针杂交来完成对核酸的监控。在探针位置检测标记的核酸表明靶基因已经表达。
现在已经发展了多种RNA检测方法。这些包括“Northern”印迹以及利用放射性同位素诸如32P。也已经开发了非放射性检测技术。Langer等，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 1981，6633-6637，例如，公开了特定生物素标记的核苷。Lockhart等的美国专利6,344,316，公开了用非放射性核苷酸标记末端的酶催化法。这些参考文献在这里引入作为参考。
然而，仍需要其可用于有效以及精确的标记RNA和监控基因表达的RNA标记化合物。
发明概述
在本发明的一个方面，提供了可用于将可检测部分连接到RNA分子或其片段的3′末端上的化合物。在本发明的一个方面，提供了下式化合物：
其中B是杂环的碱基部分；X是允许核酸标记化合物连接于RNA分子或RNA片段的3′OH基团的官能团；Y选自-H，-OH，-OR，-SR，-NHR，或卤素；L是接头基团；且Sig是可检测的标记或部分。
在本发明的另一方面，提供了下式核酸标记化合物：
其中L是接头且Sig是可检测的部分；B1是腺嘌呤且B选自腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶。
在本发明的另一个方面，化合物具有诸如下式的多重信号源：
其中B是杂环的碱基部分，L1是第一接头，L2是第二接头，Sig是可检测部分且n是从1到6的整数。
在本发明的另一方面，提供了末端标记RNA(总RNA，mRNA，cRNA或片断RNA)的方法。在一个实施方案中，T4RNA连接酶用于将3’-生物素化的AMP或CMP供体连接于RNA受体分子。在另一实施方案中，3′-APPN-3′-接头-生物素型的焦磷酸盐被用作供体分子被连接于RNA受体分子。
在本发明的另一个方面，提供了分析核酸微阵列上的核酸群的方法，包括提供核酸群或将核酸群转化为核酸片段；利用连接酶将核酸群或片段连接于核酸标记分子来形成标记的核酸群或片段；将标记的核酸群或片段杂交于一系列核酸探针，并且测定探针的杂交信号来显示核酸群中核酸的水平。
附图说明
图1：基于各自四个重复，比较重复末端-标记的(平均连接)与内部-标记的cRNA(平均标准)。通过连接进行的末端标记与内部-标记的cRNA相比产生更大量的信号和更高的靶强度(如通过平均平均差异测定的)。
发明详述
本发明具有很多优选的实施方案并且依赖于许多本领域公知的专利申请及其它参考文献。因此，当以下引用或重复提及专利，申请或其它参考文献时，应能理解其被通过引入作为参考用于所有目的以及用于所列举的问题。
如在此申请中使用的，单数形式的“a”，“an”，和“the”包括复数含义，除非上下文中清楚地说明。例如，术语“药物”包括大量的药物，包括其混合物。
个体不限于人，也可以是其它生物体包括但不限于哺乳动物，植物，细菌，或来源于任意上述的细胞。
在此公开中，本发明的不同方面可以是范围形式。应能理解范围形式的描述仅仅是为方便和简短起见并且不应理解为对本发明范围呆板的限制。因此，范围的描述应被认为特定地公开了所有可能的子范围以及在那些范围内的个体数值。例如，范围诸如由1到6的描述应理解为具有特定公开的子范围诸如1到3，由1到4，由1到5，由2到4，由2到6，由3到6等等，以及那些范围内的个体数字，例如，1，2，3，4，5，以及6。这些应用与范围的宽度无关。
本发明的应用可使用，除非另有陈述，传统方法以及有机化学，聚合物技术，分子生物学(包括重组技术)，细胞生物学，生物化学，以及免疫学的描述，其在本领域技术人员的知识范围之内。这些传统方法包括聚合物阵列合成，杂交，连接，以及利用标记进行杂交的检测。合适技术的特定例证可在下文中实施例中参考。然而，其它相同的常规方法当然也可以被使用。这些传统的方法和描述可在标准的实验手册中发现，诸如Genome Analysis：A Laboratory Manual Series(Vols.I-IV)，Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cells：A LaboratoryManual，PCR Primer：A Laboratory Manual，and Molecular Cloning：ALaboratory Manual(all from Cold Spring Harbor Laboratory Press)，Stryer，Biochemistry，(WH Freeman)，Gait，″Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach″1984，IRL Press，London，所有的整体引入作为用于所有的目的的参考。
本发明在某些优选的实施方案中可利用固体基质包括阵列。适用于聚合物(包括蛋白质)阵列合成的方法和技术已描述在U.S.S.N09/536,841，WO00/58516，U.S.专利5,143,854，5,242,974，5,252,743，5,324,633，5,384,261，5,424,186，5,451,683，5,482,867，5,491,074，5,527,681，5,550,215，5,571,639，5,578,832，5,593,839，5,599,695，5,624,711，5,631,734，5,795,716，5,831,070，5,837,832，5,856,101，5,858,659，5,936,324，5,968,740，5,974,164，5,981,185，5,981,956，6,025,601，6,033,860，6,040,193，6,090,555，和6,136,269，PCT申请PCT/US99/00730(国际公开号WO 99/36760)和PCT/US01/104285，以及美国系列申请Nos.09/501,099和091122,216中，其全部整体引入作为参考用于所有的目的。优选的阵列购自Affymetrix，Inc.(Santa Clara，CA)。参见 www.affymetrix.com。
在特异性实施方案中描述合成技术的专利包括美国专利5,412,087，6,147,205，6,262,216，6,310,189，5,889,165和5,959,098。核酸阵列描述在许多上述的专利中，但相同的技术被用于多肽阵列。
本发明也涉及许多将聚合物连接于固体基质的应用。这些应用包括基因表达监控，绘谱，文库筛选，基因分型，以及诊断。基因表达监控，以及绘谱方法可显示于美国专利5,800,992，6,013,449，6,020,135，6,033,860，6,040,138，6,177,248和6,309,822中。基因分型及其应用显示于USSN 10/013,598，和U.S专利5,856,092，6,300,063，5,858,659，6,284,460和6,333,179中。其它应用概括在美国专利5,871,928，5,902,723，6,045,996，5,541,061以及6,197,506中。
本发明也在特定的优选的实施方案中公开了样品制备方法。例如，参见基因表达，绘谱，基因定型专利及其它上述的专利，以及USSN09/854,317，Wu和Wallace，Genomics 4，560(1989)，Landegren等，Science241，1077(1988)，Burg，美国专利5,437,990，5,215,899，5,466,586，4,357,421，Gubler等，1985，Biochemica et Biophysica Acta，DisplacementSynthesis of Globin Complementary DNA：Evidence for SequenceAmplification，transcription amplification，Kwoh等，Proc.Nati.Acad.Sci.USA 86，1173(1989)，Guatelli等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，87，1874(1990)，WO 88/10315，WO 90/06995和6,361,947。
本发明也在特定的优选的实施方案中公开了配体间杂交的检测。参见美国专利5,143,854，5,578,832；5,631,734；5,834,758；5,936,324；5,981,956；6,025,601；6,141,096；6,185,030；6,201,639；6,218,803和6,225,625以及PCT申请PCT/US99/06097(公开为WO99/47964)，各自整体引入作为参考用于所有的目的。
本发明也利用了用于各种目的诸如探针设计，数据管理，分析，和装置操作的多种计算机程序产品以及软件。参见美国专利5,593,839，5,795,716，5,733,729，5,974,164，6,066,454，6,090,555，6,185,561，6,188,783，6,223,127，6,229,911和6,308,170。
另外，本发明可具有优选的实施方案，包括通过因特网提供遗传信息的方法。参见临时申请60/349,546。
定义
“核酸阵列”是指连接于(优选通过单个末端共价键)一或多个固体支持物的大量不同的寡核苷酸或多核苷酸，其中当有大量的支持物时，各个支持物具有大量的寡核苷酸或多核苷酸。术语“阵列”可指支持物上寡核苷酸或多核苷酸的全部集合或其子集。寡核苷酸或多核苷酸种类的空间分布在两个阵列之间可能不同，但是，在优选的实施方案中其基本上是相同的。可以理解甚至当两个阵列被设计和合成为相同时，寡核苷酸或多核苷酸探针的丰度，组成，以及分布仍然有差异。这些差异优选地为非实质性的和/或通过利用在这里描述的对照进行补偿。术语寡核苷酸和多核苷酸在本申请中可互换使用并且一个术语的使用不应作为对本发明限制来出现。
术语“核酸”或“核酸分子”是指单-或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有限制，应包括能以类似于天然存在的核苷酸行使功能的天然核苷酸的已知类似物。
寡核苷酸或多核苷酸是2到约1000个核苷酸的单链核酸，更典型地2到约500个核苷酸的长度。
在这里使用的术语“探针”定义为能够通过一或多种化学键，通常通过碱基对互补，通常通过氢键形成结合于互补序列的靶核酸的寡核苷酸或多核苷酸。如在这里使用的，寡核苷酸或多核苷酸探针可包括天然的(即，A，G，C或T)或修饰的碱基(7-脱氮鸟苷，肌苷，等等)。此外，寡核苷酸或多核苷酸探针中的碱基可以通过除了磷酸二酯键之外的键连接，只要其不干扰杂交。因此，寡核苷酸或多核苷酸探针可以是肽核酸，其中组成碱基通过肽键而不是磷酸二酯键相连接。寡核苷酸或多核苷酸探针通常可称为核酸探针。
“靶核酸”是指寡核苷酸或多核苷酸探针特异性与其杂交的核酸(通常获自生物样品且因此也是指为样品核酸)。可以理解靶核酸可衍生自基本上任意核酸的来源(例如，包括但不限于化学合成，扩增反应，法医学样品，等等)。检测一或多种靶核酸的存在或者缺少，或者测定一或多种靶核酸的量。待检测的靶核酸优选地具有和与其特异性结合(杂交)的相应探针的核酸序列互补的核苷酸序列。术语靶核酸可指与探针特异性杂交，或希望检测其丰度(浓度)和/或表达水平的总序列(例如，基因或mRNA)的大的核酸的特异性子序列。
术语“与支持物结合”是指直接或间接地与其结合，包括通过共价键，氢键，离子相互作用，疏水性相互作用，或其它进行连接。
“可检测的部分”或“标记的部分”是指能够通过各种设备和或当部分连接于例如核酸时检测试验(包括物理的，化学的，电学的和/或基于计算机的)部分的试验方法进行检测的分子或分子的复合体和或粒子。
“基本上结合”是指探针核酸和靶核酸之间的互补杂交并且包含少量的错配，所述错配可通过降低杂交介质的严格性来获得以实现靶寡核苷酸或多核苷酸序列的目的检测。
术语“特异性杂交于”是指当序列存在于复合混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中时，分子优选地在严格条件下结合，双联或杂交于特定的核苷酸序列。
术语“严格条件”是指探针优选地杂交于其靶亚序列，且较小程度的杂交于，或根本不杂交于其它序列的条件。严格条件是序列依赖的且在不同的环境中不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。通常，所选严格条件为在规定的离子强度和pH下低于特异性序列的热熔点(Tm)约5℃。Tm是50％互补于靶序列的探针与处于均衡状态的靶序列杂交的温度(在规定的离子强度，pH，和核酸浓度下)。(如靶序列通常过量存在，在Tm处，50％的探针处于均衡状态)。典型地，严格条件是其中的盐浓度至少为约0.01到1.0M Na离子浓度(或其它盐)，pH 7.0到8.3并且对短探针(例如10到50个核苷酸)而言该温度至少为约30℃。严格条件也可通过添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。
术语“背景”或“背景信号强度”是指标记的靶核酸和寡核苷酸或多核苷酸阵列(例如，寡核苷酸或多核苷酸探针，对照探针，阵列基质，等等)的组分之间的非特异性结合或其它相互作用产生的杂交信号。背景信号也可通过阵列组分自己的固有荧光来产生。单个背景信号可被计算为整个的阵列，或不同的背景信号可计算为阵列的各个区域。在一个优选的实施方案中，背景计算为阵列或阵列区域中最低1％到10％探针的平均杂交信号强度。在表达监控阵列(即，即其中探针被预先选定杂交于特异性核酸(基因))中，可以计算各靶核酸不同的背景信号。当计算各个靶基因的不同背景信号时，计算各基因最低1％到10％的探针的背景信号。当然，本领域的技术人员应能理解当探针与特定基因较好杂交且因此好象特定地结合于靶序列时，它们不应该被用于背景信号计算中。或者，背景可计算为通过杂交于与样品中发现的所有序列不互补的探针产生的平均杂交信号强度(例如，当样品是哺乳动物来源时，针对反义核酸或者针对在样品中未发现的基因，诸如细菌基因的基因的探针)。背景还可以计算为由完全缺少任意探针的阵列区域产生的平均信号强度。
术语“定量测定”当用于测定核酸丰度或浓度(例如，基因的转录水平)的上下文中时是指绝对或相对的定量分析。绝对的定量分析可以通过包含已知浓度的一或多种靶核酸(例如，对照核酸诸如BioB或具有已知量的靶核酸本身)以及参照未知与已知靶核酸(例如通过生成标准曲线)的杂交强度来完成。或者，相对的定量分析可通过比较两种或多种基因之间或两种或多种处理之间的杂交信号来定量测定杂交强度的变化以及，通过显示转录水平来完成。
核酸标记
在本发明的一个方面，通过检测一或多种连接于样品核酸的标记来检测杂交的核酸。标记可以通过本领域技术人员公知的大量任意的方式被掺入。然而，在优选的实施方案中，标记在样品核酸制备的扩增步骤过程中同时掺入。例如，用标记的引物或标记的核苷酸进行的聚合酶链式反应(PCR)将提供标记的扩增产品。核酸(例如DNA)在标记的脱氧核苷酸三磷酸酯(dNTPs)的存在下扩增。扩增的核酸可以被片段化，暴露于寡核苷酸阵列，且通过与阵列相关的标记的量来测定杂交的程度。在优选的实施方案中，转录扩增，如上所述，利用标记的核苷酸(例如荧光素标记的UTP和/或CTP)将标记或部分掺入转录的核酸中。
或者，标记可以直接添加到最初的核酸样品(例如mRNA，polyAmRNA，cDNA，等等)中或扩增完成后添加到扩增产物中。这些标记可以导致扩增产物的产量增加以及减少扩增反应需要的时间。将标记连接于核酸的方式包括，例如切口平移或末端标记(例如用标记的RNA)通过核酸的激酶酶解以及随后将连接样品核酸的核酸接头连接于标记(例如，荧光基团)。
在许多应用中，其可用于直接标记核酸样品而不必通过扩增，转录或其它核酸转化步骤。其尤其适用于当希望从细胞提取总的细胞质RNA或者poly A+RNA(mRNA)并且将这些材料杂交而且无需中间步骤的情况。参见美国专利No.6,344,316，其整体引入作为参考。
末端标记可利用末端转移酶(TdT)来进行。末端标记还可以通过将标记的核苷酸或寡核苷酸或多核苷酸或其类似物连接于靶核酸或探针的末端来完成。参见美国专利6,344,316。
在本发明的一个方面，描述了末端标记核酸及其有用试剂的方法。在本发明的一个优选的实施方案中，所述方法包括提供核酸，提供标记的核苷酸或寡核苷酸或多核苷酸以及将核苷酸或寡核苷酸或多核苷酸酶促连接到核酸的方法。因此，在本发明的一个方面，其中核酸是RNA时，标记的核糖核苷酸可利用RNA连接酶连接于RNA。RNA连接酶催化单链RNA(或DNA，但是与RNA反应更加有效)的5′磷酸基与另一片段RNA(或DNA)的3′-OH末端的共价连接。应用这些酶的特定要求描述在，The Enzymes，XV卷，B部分，T4RNA连接酶，Uhlenbeck和Greensport，第31-58页；以及Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1982)的5.66-5.69中，所有的这些整体引入作为参考。
根据本发明的一个方面，提供了将标记直接添加于核酸(例如提取的RNA)而不是在核酸聚合步骤中将标记***核苷酸中的方法。根据本发明的一个方面，这些可通过将标记的核糖核苷酸或短的标记寡核糖核苷酸添加于单链核酸的末端来完成。
根据本发明的一个方面，RNA标记化合物可直接连接于RNA分子的′3-OH基团而没有任何分子处理。例如微RNA(miRNAs)是小的非编码RNAs(大约15-25个核苷酸)的广义类别。人们相信这些RNAs在基因表达的调控中起作用。例如在线虫(Caenorhabditis elegans)中，lin-4和let-7miRNAs控制幼虫发育过程中神经元和真皮细胞的命运特化的时间。Lagos-Quintana M，Rauhut R，Lendeckel W，Tuschl T：Identificationof novel genes coding for small expressed RNAs.Science 2001，294：853-858。已广泛研究了参与植物和动物中miRNAs生物起源的酶促机制。III型RNAse样Dicer，和Argonaute蛋白一起，裂解miRNA发夹前体(70到75核苷酸)来由发夹的一个臂产生稳定的，～22个核苷酸的miRNA。Ke XSLiu CM，Liu DP，Liang CC：MicroRNAs：key participants in generegulatory networks.Curr Opti：Chem Biol 2003，7：516-523。
本领域的技术人员能够理解miRNAs具有游离的3’OH基团。因此，本发明的核酸标记分子可直接连接到这些RNAs的末端而没有mRNA或cRNA所需要的预片段化或去磷酸化。
RNA在Mg2+存在下通过加热随机地片段化。这些通常产生具有5′OH基团和磷酸化3′末端的RNA片段。根据本发明的一个方面，碱性磷酸酶用来由RNA片段的3′末端除去磷酸基。根据本发明的一个方面，包括具有可检测的部分和具有5′-末端磷酸的核糖核苷酸的供体然后利用T4RNA连接酶被连接于RNA片段的3′OH基团来提供标记的RNA。根据本发明，供体也称为核酸标记化合物。
T4RNA连接酶通过形成3′到5′磷酸二酯键，将ATP为水解AMP和PPi，催化5′磷酰基-末端核酸供体连接于3′羟基-末端核酸受体。尽管微小受体必须是三核苷二磷酸，二核苷焦磷酸(NppN)和单核苷3′，5′-二磷酸(pNp)在分子间反应中是有效的供体。参见Hoffmann和McLaughlin，Nuc.Acid.Res.15，5289-5303(1987)，其内容整体引入作为参考。
适用于本发明的可检测的标记包括通过分光镜，光化学，生物化学，免疫化学，电学，光学或化学方法可检测的任意组合物。本发明中有用的标记包括用标记的链霉亲和素结合物染色的生物素，磁珠(例如，DynabeadsTM)，荧光染料(例如，荧光素，德克萨斯红，若丹明，绿色荧光蛋白，等等，参见，例如，Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)，放射性标记(例如，3H，125I，35S，14C，或32P)，酶(例如，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶以及其它通常用于ELISA的)，以及比色分析标记诸如胶体金(例如，高效率的40-80纳米直径粒度范围的散射绿光金颗粒)或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯，聚丙烯，乳胶，，等等)磁珠。这些标记应用的专利教导包括美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。
荧光标记是优选的因为其提供非常强的信号以及低的背景。其通过快速扫描方法可高分辨率和高敏感性地进行光学检测。核酸样品全部可以用单个标记，例如，单荧光标记进行标记。或者，在另一实施方案中，不同的核酸样品可以同时杂交，其中各个核酸样品具有不同的标记。例如，一个靶可以具有绿色荧光标记并且第二靶可以具有红色荧光标记。扫描步骤将红色标记结合的位点与绿色荧光标记结合的位点区分开来。每一核酸样品(靶核酸)可以独立于其它样品进行分析。
杂交
核酸杂交简单地包括在探针及其互补靶可以通过碱基互补配对形成稳定的杂交双链体条件下提供变性探针和靶核酸。然后洗去没有形成杂交双链体的核酸留下通常通过检测连接的可检测的标记或部分检测的杂交核酸。通常认为通过增加温度或减少含有核酸的缓冲液的盐浓度，或添加化学试剂，或提高pH值使核酸变性。在低严谨性条件(例如，低温和/或高盐和/或高的靶浓度)下，甚至当退火的序列不完全互补时也将形成杂交双链体(例如，DNA:DNA，RNA:RNA，或RNA:DNA)。因此杂交的特异性在较低严谨性条件下降低了。相反，在较高严谨性条件下(例如，较高的温度或较低的盐浓度)成功的杂交要求较少的错配。
本领域的技术人员能够理解可选择杂交条件来提供任意的严紧度。在优选的实施方案中，在6X SSPE-T约40℃到约50℃(0.005％TritonX-100)低严谨性下进行杂交来确保杂交然后随后在较高严谨性条件(例如，1×SSPE-T 37℃)下进行冲洗来消除错配的杂交双链体。可在逐渐增加的较高严谨性条件(例如，在37℃到50℃降至低至0.25×SSPE-T进行连续冲洗直至获得理想的杂交特异性。严谨性还可以通过添加诸如甲酰胺的试剂来增加。杂交特异性可通过试验探针的杂交与可存在的不同对照(例如，表达水平对照，正常对照，错配对照等等)的杂交比较来进行评价。
通常杂交特异性(严谨性)和信号强度之间有一个折衷。因此，在优选的实施方案中，在产生一致结果并且提供大于约背景强度的10％的信号强度的最高严谨性下进行冲洗。因此，在优选的实施方案中，杂交阵列可在依次提高严谨性溶液的条件下冲洗并且在每一冲洗之间进行读数。由此产生的数据系列的分析将揭示上述的冲洗严谨性，即其杂交模式没有可察觉的改变并且其提供充分的用于特定目的寡核苷酸或多核苷酸探针的信号。
在优选的实施方案中，在杂交过程中通过使用洗涤剂(例如，C-TAB)或阻断试剂(例如，***DNA，cot-1DNA，等等)减少背景信号以减少非特异性的结合。在尤其优选的实施方案中，在约0.1到约0.5mg/ml DNA(例如，鲱鱼精DNA)存在下进行杂交。阻断剂在杂交中的应用对于本领域技术人员来说是公知的(参见，例如，上文P.Tijssen中第8章)。
RNAs或DNAs之间形成的双链体在溶液中的稳定性通常次序为RNA:RNA＞RNA:DNA＞DNA:DNA。长探针与靶具有良好的双链体稳定性，但是比较短的探针具有较差的错配识别力(错配识别力是指测定的完全匹配的探针和单个碱基错配探针之间杂交信号比)。较短的探针(例如，8-聚物)非常好的识别错配，但是总的双链体稳定性较低。
通过利用寡核苷酸或多核苷酸类似物探针赋予的改变的双链体稳定性可通过下述来确定，例如，与靶寡核苷酸或多核苷酸杂交的寡核苷酸或多核苷酸类似物阵列随着时间变化的荧光信号强度。数据允许特定杂交条件的优化，例如，室温(将来用于简单的诊断应用)。
验证改变的双链体稳定性的另一方式是通过下面杂交随时间产生的的信号强度。上述利用DNA靶和DNA芯片的实验表明信号强度随时间而增加，而且较稳定的双链体比较不稳定的双链体更快的产生较高的信号强度。一定时间后信号达到平稳状态或“饱和”，由于所有的结合位点都被占据。这些数据允许杂交的优化，以及在特定温度下确定最好的条件。杂交条件的优化方法是本领域技术人员公知的(参见，例如，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，Vol.24：Hybridization With Nucleic Acid Probes，P.Tijssen，ed.Elsevier，N.Y.，(1993))。
标记的核苷酸
根据本发明的一个方面，T4RNA连接酶用于将核酸标记化合物酶促掺入RNA或片段化RNA群中。T4RNA连接酶通过形成3′到5′磷酸二酯键，水解ATP为AMP和PPi，催化5′磷酰基-末端核酸供体连接于3′羟基-末端核酸受体。尽管微小受体必须是三核苷二磷酸，但二核苷焦磷酸(NppN)和单核苷3′，5′-二磷酸(pNp)在分子间反应中是有效的供体。参见，例如，Richardson，R.W.和Gumport，R.I.(1983)，Nuc.AcidRes：11，6167-6185和England，T.E.，Bruce，A.G.，和Uhlenbeck，O.C.(1980)，Meth.Enzymo165，65-74，其内容整体引入作为参考。
在本发明的一个方面，公开了在杂交于DNA微阵列之前末端标记片段化RNA(总RNA，mRNA，cRNA或片断RNA)的方法。***利用T4RNA连接酶来将3′-生物素化的AMP(或CMP)供体连接于RNA受体分子的3′-末端。T4RNA连接酶催化具有5′-末端磷酸的寡核苷酸或多核苷酸供体分子与具有3′-末端羟基的寡核苷酸或多核苷酸受体分子之间的核苷酸间磷酸二酯键的形成。尽管微小受体必须是三核苷酸二磷酸，但二核苷焦磷酸(NppN)和单核苷3′，5′-二磷酸(pNp)在分子间反应中是有效的供体。
这些技术可用于标记RNA靶并且通常利用有效的标记部分和酶。可利用目前的GeneChipArray(Affymetfix，Inc.，Santa Clara，CA)表达方案(除了体外转录用标准核苷酸进行)然后去磷酸化以及如本发明公开的连接于合适的核酸标记化合物来产生cRNA。
可检测的分子
可检测的部分直接或间接地提供信号。当标记基团在适合刺激导入后自发地发射信号，或产生信号时产生直接信号。放射性标记，诸如3H，125I，35S，14C或32p，以及磁性粒子，诸如DynabeadsTM，是直接和自发提供信号的基团的非限制性实例。在刺激物存在下直接提供信号的标记基团包括下列非限制性实例：胶体金(40-80nm直径)，其高效率散射绿光；荧光标记，诸如荧光素，德克萨斯红，若丹明，和绿色荧光蛋白质(Molecular Probes，Eugene，Oregon)，其吸收和随后发光；化学发光的或生物发光标记，诸如发光氨，洛粉碱，吖啶盐和虫萤光素，其由于化学或生物反应产生电子刺激且随后发光；自旋标记物，诸如钒，铜，铁，锰和硝基氧自由基，其通过电子自旋共振(ESR)光谱法进行；染料，诸如喹啉染料，三芳基甲烷染料和吖啶染料，其吸收特定波长的光；以及有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯，聚丙烯，乳胶，等等)磁珠。参见美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。
可检测的部分提供间接信号，其中其与自发发射信号，或在导入适合刺激后产生信号的第二化合物相互作用。
生物素是尤其优选的可检测部分。生物素通过与链霉亲和素形成结合物产生信号，然后检测链霉亲和素。参见Hybridization With NucleicAcid Probes。在Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology中；Tijssen，P.，Ed.；Elsevier：New York，1993；Vol.24。如在ELISA测定中的酶，诸如辣根过氧化酶或碱性磷酸酶，其连接于标记-抗体-抗体中的抗体，也产生间接信号。在优选的实施方案中，多信号基团被掺入到核酸标记化合物中。在本发明尤其优选的实施方案中，多生物素基团可增加或增强待检测的Sig基团的能力。
优选的可检测部分是荧光基团。荧光基团通常产生高信噪比，由此在检测过程提供增加的分辨率和敏感性。优选地，荧光基团吸收具有高于约300纳米的波长，更优选地高于约350纳米，且最优选地高于约400纳米。通过荧光基团发射的光的波长优选地高于约310纳米，更优选地高于约360纳米，且最优选地高于约410纳米。
荧光可检测的部分选自各种结构的类别，包括下列非限制性的实例：1-和2-氨基萘，p，p′二氨基芪，芘，四级菲啶盐，9-氨基吖啶，p，p’-二氨基二苯甲酮亚胺，蒽，氧杂羰花青，marocyanine，3-氨基马萘雌酮，苝，二苯并唑，二-p-噁唑基苯，1，2-苯并吩嗪(benzophenazin)，视黄醇，二-3-氨基吡啶盐，嚏根苷配基，四环素，sterophenol，苯并咪唑基苯胺，2-氧代-3-色烯(chromen)，吲哚，呫吨(xanthen)，7-羟基香豆素，吩噁嗪，水杨酸酯，毒毛旋花苷配基，卟啉，三芳基甲烷，黄素，呫吨染料(例如，荧光素和若丹明染料)；花青染料；4，4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-indacene染料和荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白质，藻胆蛋白)。
大量的荧光化合物适用于包括在本发明中。这些化合物的非限制性实例包括：丹磺酰氯；荧光素，诸如3，6-二羟基-9-苯基呫吨氢醇；若丹明异硫氰酸酯；N-苯基-1-氨基-8-磺化萘(sulfonatonaphthalene)；N-苯基-2-氨基-6-磺化萘(sulfonatonaphthanlene)；4-乙酰氨基-4-异硫氰酸二苯乙烯-2，2’-二磺酸；芘-3-磺酸；2-甲苯氨基萘(toluidinonapththalene)-6-磺酸酯；N-苯基，N-甲基-2-氨基萘-6-磺酸酯；溴化乙锭；stebrine；auromine-0，2-(9’-anthroyl)棕榈酸酯；丹磺酰基磷脂酰乙醇胺；N，N′-二-十八烷基氧杂羰花青；N，N′-己二基氧杂羰花青；部花青，4-(3’-芘基)butryate；d-3-氨基脱氧-马萘雌酮；12-(9′-anthroyl)硬脂酸酯；2-甲基蒽；9-乙烯基蒽；2，2’-(亚乙烯基-p-亚苯基)二苯并唑；p-二[2-(4-甲基-5-苯基噁唑基)]苯；6-二甲氨基-1，2-苯并吩嗪(benzophenzin)；视黄醇；二(3’-氨基吡啶)-1，10-decandiyl二碘化物；嚏根苷配基的磺基萘基腙(sulfonaphthylhydrazone of hellibrienin)；金霉素；N-(7-二甲氨基-4-甲基-2-氧代-3-色烯基)马来酰亚胺；N-[p-(2-苯并咪唑基)苯基]马来酰亚胺；N-(4-氟蒽基)马来酰亚胺；二(高香草酸)；刃天青(resazarin)；4-氯代-7-硝基-2，1，3-苯并噁二唑；部花青540；试卤灵；玫瑰红和2，4-二苯基-3(2H)-呋喃酮。优选地，荧光可检测的部分是荧光素或若丹明染料。
另一个优选的可检测部分是胶体金。胶体金颗粒通常直径为40到80纳米。胶体金可以各种方式连接于标记化合物。在一个实施方案中，核酸标记化合物的接头部分端接硫醇基团(-SH)，且硫醇基团通过配价键直接结合于胶体金。参见Mirkin等，Nature 1996，382,607-609。在另一个实施方案中，其间接地连接，例如通过抗生物素的胶体金共轭物和生物素酰化的标记化合物之间的相互作用。金标记化合物的检测可通过使用银增强方法来增强。参见Danscher等，J.Histotech 1993，16，201-207。
根据本发明，提供了检测目的RNA存在的方法，该方法具有下列步骤：提供可能具有或可能不具有所述目的RNA的样品；将RNA连接于具有下式的标记试剂：
Figure A20051012468900311
其中B为杂环碱基部分；X为允许核酸标记化合物连接到所述片段的3′OH基团的官能团；Y选自-H，-OH，-OR，-SR，-NHR或卤素；L为接头基团；并且Sig为提供给标记RNAs的可检测的部分；提供具有针对所述目的RNA的探针的核酸阵列；将标记RNAs杂交于所述的核酸阵列；以及测定所述探针杂交的程度以测定所述目的RNA的存在。
在本发明的上述方面，RNA包括microRNA。对于较长的RNAs诸如cRNAs或mRNAS而言，该方法可进一步地包括用片段化试剂处理样品来提供RNA片段的步骤；以及在提供所述样品的步骤之后和所述连接步骤之前除去所述片段的磷酸基来提供具有游离的3′OH基团的片段。3′磷酸基为片段化试剂诸如Mg或RNAseIII的通常产物。磷酸基必须被去除以允许连接酶添加核酸标记化合物。因此，在本发明的这些方面，mRNA和cRNA是优选的。然而，可以理解microRNAS不具有3′磷酸基并且它们很短，小于25个核苷酸。因此，它们不需要片段化或磷酸酶处理。
优选的片段化试剂选自：RNAse III和含有二价金属离子诸如Mg2+以及具有中性到碱性范围的pH的缓冲液。可用碱性磷酸酶由3′羟基除去磷酸基。
X优选地选自具有适量的选自H+，Li+，Na+，NH4 +或K+的相反离子的HO-，PO4 2--，P2O7 3--，P3O10 4--，OP(S)O2 2-以及腺苷酸-(5′)-P2O7＝-。Y优选地为OH。连接酶优选地为T4RNA连接酶。优选地核酸阵列为寡核苷酸阵列。更优选地，寡核苷酸阵列通过光刻法制备。
接头基团优选地选自-CH2-CH(OH)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-和-CH2-CH(OPO3 ＝)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-。更优选地，L为-CH2-CH(OH)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-。
根据本发明的一个方面，X为PO4 2-。B选自嘧啶碱基，嘌呤碱基，天然的碱基类似物以及非天然类似物。更优选地，B选自腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶。更优选地，B选自腺嘌呤和胞嘧啶。最优选地，B为胞嘧啶。
优选的标记试剂为：
Figure A20051012468900321
其中R为H或PO3 2-。优选地R为H。另一种优选的标记试剂为：
其中R为H或PO3 2-。优选地R为H。
另一个优选的标记试剂为下列结构
Figure A20051012468900331
其中B选自腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶；且R为H或PO3 ＝。更优选地，B选自腺嘌呤和胞嘧啶且R为H。更优选地B为腺嘌呤。在另一个优选的实施方案中，B为胞嘧啶且R为H。
一种优选的检测目的RNA存在的方法，具有下列步骤：提供可能具有或可能不具有所述目的RNA的样品；将所述RNA连接于具有下式的标记试剂：
其中B为杂环的部分；且R选自H和PO3 ＝以及n为1到6；提供具有对应于所述目的基因的探针的核酸阵列；将标记的核酸片段杂交于核酸阵列；以及确定所述探针杂交的程度来确定所述目的RNA的存在。上述方法中，microRNAs是优选的。
在优选的实施方案中，方法进一步地包括用片段化试剂处理样品来提供RNA片段的步骤；以及在提供所述样品的步骤之后和所述连接步骤之前除去所述片段的磷酸基来提供具有游离的3’OH基团的片段。对于这些方法而言，优选地mRNAs和cRNAs作为模板。
优选地，片段化试剂选自包含RNAse III和含有二价金属离子诸如Mg2+以及具有中性到碱性范围的pH的A缓冲液。由3′羟基除去磷酸基优选地用碱性磷酸酶进行。
B优选地选自腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶；且n为2到4。更优选地，B选自腺嘌呤和胞嘧啶。最优选地B是胞嘧啶，n优选地为2-4。更优选地，n为3。
优选的标记试剂如下：
Figure A20051012468900341
Figure A20051012468900351
Figure A20051012468900352
以及
其它优选的标记试剂如下：
Figure A20051012468900361
以及
Figure A20051012468900362
本发明也提供了核酸标记化合物。一个优选的化合物如下：
Figure A20051012468900363
其中B是杂环的碱基部分；X是允许核酸标记化合物连接于所述片段的3′OH基团的官能团；Y选自-H，-OH，-OR，-SR，-NHR，或卤素；L是接头基团；且Sig是可检测的部分。
L优选地选自：-CH2-CH(OH)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-和-CH2-CH(OPO3 ＝)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-。
更优选地L为
CH2-CH(OH)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-。
X优选地选自具有适量选自H+，Li+，Na+，NH4+或K+的相反离子的-HO-，pO4 2--，P2O7 3--，P3O10 4--，OP(S)O2 2-和腺苷酸-(5’)-P2O7＝。Y优选地为OH。B选自嘧啶碱基，嘌呤碱基，天然碱基类似物以及非天然类似物。更优选地，B选自腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶。更优选地，B选自腺嘌呤和胞嘧啶。进一步优选地，B为胞嘧啶。
在本发明的优选的核酸标记化合物中，该化合物具有结构：
Figure A20051012468900371
L是接头且Sig是可检测的部分；B1是腺嘌呤且B选自腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶。
根据权利要求44的核酸标记化合物具有下式：
其中B1为腺嘌呤，且B选自腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶；
且R为H或PO3 ＝。
根据上式的优选化合物，具有结构：
Figure A20051012468900381
根据本发明又一个优选的化合物，具有通式：
Figure A20051012468900382
其中B是杂环的碱基部分，L1是第一接头，L2是第二接头，Sig是可检测部分且n是从1到6的整数。
本发明该方面优选的化合物，具有下式结构：
Figure A20051012468900383
其中B为杂环的碱基部分；且R选自H和PO3 ＝。
本发明将通过下列非-限制性的实施例被进一步理解。
实施例1
5′-pCp-3′-接头-生物素和5′-pAp-3′-接头-生物素的合成方法
这些化合物是利用市售的试剂通过固相亚磷酰胺化学法制备的。参见，例如，美国专利4,415,732；McBride，L.和Caruthers，M.Tetrahedron Letters，24：245-248(1983)；和Sinha，N.等，Nuc.AcidsRes.12：4539-4557(1984)，其中两者都引入作为参考。3′-生物素酰化的接头获自市售的BiotinTEG固相支持体(Glenn Research，Sterling，Virginia)。试剂的结构显示如下：生物素-TEG合成支持体：
六乙二醇(HEG)亚磷酰胺
Figure A20051012468900392
生物素-TEG亚磷酰胺
5′-磷酸-ON亚磷酰胺
Figure A20051012468900401
实施例2
3′-AppC-3′-接头-生物素供体分子的合成方法
前-腺苷酸焦磷酸供体，A(5’)pp(5’)Cp(生物素-TEG)-3′通过根据文献方法(7)进行的p(5′)Cp(生物素-TEO)-3′和腺苷酸-5′-单磷酸酰吗啉(Sigma)的溶液-相凝浓缩(图2)来进行制备。通过反相然后离子交换HPLC纯化产物至＞95％纯度，且特征为MALDI-TOF MS。
Figure A20051012468900402
实施例3
对照和样品的制备
根据建议的GeneChip表达方案(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，CA)由总RNA(1μg的人心脏RNA作为在这些数据中的初始物质)制备未标记的cRNA，除了未标记的核糖核苷酸用于体外转录外。在典型的反应中，将10微克的cRNA在标准片段化缓冲液(40mM Tris-乙酸，30mM醋酸镁，100mM醋酸钾)中片段化以及用0.01U/μl终浓度的虾碱性磷酸酶(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)进行去磷酸化。然后在65℃加热虾碱性磷酸酶15分钟灭活，以及通过乙醇沉淀法纯化反应。将片段化的cRNA置入含有100μM 3′生物素-CMP与2U/μl T4RNA连接酶(New England Biolabs，Beverly，MA)和16％PEG的推荐缓冲液的连接反应中37℃2小时。连接反应然后添加至含有0.5mg/ml乙酰化BSA(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)，0.1mg/ml鲱鱼精DNA(Promega，Madison，WI)，50pM Oligo B2(AffymetrixInc.，Santa Clara，CA)和1×真核生物杂交对照(Affymetrix Inc.)的杂交混合物中，使得总体积为220μl。200μl标记的cRNA靶与Affymetrix HuU95Av2阵列在45℃杂交16小时。标准的冲洗和染色方案如基因芯片表达分析技术手册(GeneChip Expression Analysistechnical manual)所建议的。利用Affymetrix Microarray Suite 4.0进行分析。
图1显示了存在呼叫百分比以及末端标记的RNA和内部标记RNA的平均-平均差异。平均-平均差异是微阵列上完全匹配探针强度减去错配探针的强度的除以所有探针集合，并且是所有信号强度的测定。存在呼叫百分比是基于基因探针系列强度的MicroArray Suite(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，CA)软件计算的结果。二者是标记效率和RNA完整性的计量标准。利用连接法比利用内部-标记RNA产生更多数目的基因称作存在。此外，荧光信号(如通过平均平均差异测定的)高于连接法。
为了试验连接标记法的再现性，由总的人心脏RNA开始利用建议的GeneChip(Affymetrix，Inc.，Santa Clara，CA)表达方案进行四个独立反应，除了未标记的核糖核苷酸用于体外转录。产生的45μg cRNA被片段化并且在一式两份51μl反应中用0.01/μl终浓度的虾碱性磷酸酶37℃处理1小时。然后在65℃加热灭活虾碱性磷酸酶15分钟，并且用乙醇沉淀法纯化反应。用2U/μl T4RNA连接酶和16％PEG在一式两份33μl反应中37℃将11μg片段化的，去磷酸cRNA连接于100μM的3’生物素-CMP。然后将每一33μl连接反应物添加至含有0.5mg/ml乙酰化BSA(Invitrogen Life Technologies)，0.1mg/ml鲱鱼精DNA，50pM Oligo B2和1×真核生物杂交对照的杂交混合物中，使总体积为200μl。200μl标记的cRNA靶在45℃杂交于HuU95Av2阵列(Affymetrix，Inc，Santa Clara，CA)16小时。如基因芯片表达分析技术手册(Affymetrix，Inc.Santa Clara，CA)所建议的进行标准的冲洗和染色方案。利用Micmarray Suite Version 4.0(Affymetrix，Inc.SantaClara，CA)进行分析。
定量比较来自重复反应的表达数据产生重复之间0.98-0.99的相关系数(R2)，表明末端标记法的高再现性。末端标记重复与内部-标记RNA的比较产生0.88-0.94之间的R2值。
实施例4
表1概括了本发明的核酸标记试剂(其也更具体的描述在上文中)并且也提供了活当的缩写(PLR＝RNA标记试剂)：
                     表1：RNA标记试剂
  命名RLR-4a/pApBRLR-4b/pA5pBRLR-5/pCpBRLR-6/AppCpBRLR-7/pCpB5RLR-8/pCpB2RLR-9/pCpB3  化合物5′-pAp-TEG-生物素-3′5′-pA5p-TEG-生物素-3′5′-pCp-TEG-生物素-3′A(5′)pp(5′)Cp-TEG-生物素-3′5′-pCp-(HEG-TEG-生物素)5-3′5′-pCp-(HEG-TEG-生物素)2-3′5′-pCp-(HEG-TEG-生物素)3-3′
实施例5
RLR-4a和RLR-4b的连接效率
此实验的目的是证明连接-介导的标记的概念以及测定两个不同RNA标记试剂(RLRs)的标记效率：RLR-4a，(5’pAp-TEG-生物素-3’)和RLR-4b，(5’-pA5p-TEG-生物素-3′)[10]。测定RLR浓度(1μM到250μM)和T4RNA连接酶浓度(1U/μl到4U/μl)以及连接时间(4小时和8小时)。没有T4RNA连接酶的一个反应用作阴性对照。另一个连接反应省略cRNA去磷酸化步骤以便测定去磷酸化作用的要求。所有反应用人心脏RNA(Ambion)进行并且在标准条件(10μg标记的cRNA在1×杂交液[100mM MES，1M Na+，20mM EDTA，0.01％Tween20]45℃，60rpm杂交16小时)下杂交于人U95Av2阵列。冲洗阵列，染色(利用单一染色方案)，并且根据标准的Affymetrix方案扫描。
下列是测定每一RLR化合物的浓度：50μM，10μM和1μM。在30℃用2U/μl T4RNA连接酶(New England Biolabs)进行连接4小时。一个RELA样品没有用虾碱性磷酸酶处理并且没有用RLR-4a在50μM进行连接用于比较。
信号(AvgAvgDifference)和存在呼叫率(％P)通过独立地增加RLR浓度和T4RNA连接酶浓度而提高。通过增加RLR浓度以及酶浓度获得最好的操作。单核苷酸RLR-4a在相同的浓度始终好于五-聚体，五核苷酸RLR-4b。温育4小时和温育8小时之间没有观察到显著的差异。如在50μM RLR-4a非-SAP处理的样品中通过低信号和存在呼叫的数量所证明的cRNA的去磷酸化为有效连接所必需。所有阵列的背景强度是类似的。在此阶段，最佳的反应条件是250μM RLR-4a，4U/μl T4RNA连接酶，30℃，4小时。此实验证明了用于DNA微阵列的末端标记RNA的活力。
实施例6
RLR-5的连接效率
然后测定了在连接反应中RLR-5(5′-pCp-TEG-生物素-3’)浓度的范围。在文献中，5′-[32p]pCp-3′被公认为是大多数放射标记条件下的优选供体分子[5]。我们测定了在20℃下列RLR-5浓度的范围：50μM，100μM，250μM，500μM和1000μM。此外，两个250μM RLR-5反应温育在30℃和37℃用来与20℃反应温度比较。利用人心脏RNA，2U/μl T4RNA连接酶和16％PEG进行连接反应2小时。
所有的RLR-5样品与标准相比产生相同的或更好的信号。100μMRLR-5样品产生最高的信号，但是这些差异可能在实验误差范围内。在250μM RLR-5样品的20℃，30℃和37℃温育温度之间的信号没有显著性差异。然而，250μM RLR-5的37℃温育在所有测定条件中产生最好的总存在呼叫率。50μM-250μM之间的RLR-5浓度与标准相比产生相同的或更好的存在呼叫率；如通过稍微低的存在呼叫所证明的，大于或等于500μM的RLR-5浓度可能是稍微抑制性的，尽管信号强度仍保持很高。这些实验证明RLR-5稍微优于RLR-4a：在50μMRLR浓度，16％PEG和20℃，RLR-5比RLR-4a具有较高的信号和存在呼叫(50μM RLR-4a，16％PEG，20℃：32.0％p，104未测定信号；93测定的信号)。
标准方法和RELA方法之间的R2相关系数为0.93-0.94的范围。不同连接反应之间的R2相关系数为0.97-0.99的范围，其与标准标记法的差异是类似的。
实施例7
RLR-6的连接效率
在本实验中，我们测定了RLR-6(A(5′)pp(5′)Cp-TEG-生物素-3′)腺苷酸化的供体中间体，在连接反应的不同浓度中的特性。我们也测定了反应的动力学，比较连接时间，RLR浓度和酶浓度对阵列特性的影响。下列七个反应是利用人心脏RNA在U95Av2阵列上进行的：
1)标准(内部-标记的cRNA)
2)50μM RLR-6        20min.        2.0U/μl T4RNA连接酶
3)100μM RLR-6       20min.        2.0U/μl T4RNA连接酶
4)200μM RLR-6       20min.        2.0U/μl T4RNA连接酶
5)100μM RLR-6        5min.        2.0U/μl T4RNA连接酶
6)100μM RLR-6        120min.      2.0U/μl T4RNA连接酶
7)100μM RLR-6        20min.       0.5U/μl T4RNA连接酶
仅仅20分钟后，100μM和200μM浓度的RLR-6与2U/μl T4 RNA连接酶与标准相比产生相同的或更好的信号。在100μM RLR-6反应物中信号随反应时间由5分钟增加到20分钟到120分钟而增加。类似地，信号随RLR-6浓度在20分钟连接时间内由50μM增加到100μM到200μM而增加。用100μM RLR-6，2U/μl T4RNA连接酶，120分钟反应获得最好的信号；所述信号与0.93的R2相关系数的标准的信号良好相关。用200μM，20分钟连接获得其次好的信号，其与标准相比具有0.94的R2相关系数。
关于酶浓度，利用0.5U/μl T4RNA连接酶，或四分之一的正常量，降低了一半的信号。存在呼叫结果与所述信号产生相同的倾向。除5分钟反应和0.5U/μl连接酶反应之外，所有反应与标准的相比产生相同的或更好的存在呼叫。产生最好的总结果的条件是100μMRLR-6，2U/μl T4RNA连接酶，2小时反应。次好的结果来自200μM，20分钟反应，其具有类似的存在呼叫但是稍微减慢的信号。
我们也测定了在用RLR-6的连接反应中对ATP的要求。因为RLR6是预-腺苷酸化供体分子，ATP在连接反应中不应该是必需的且可能被抑制[7]。的确，上述反应在没有ATP条件下进行，证明了ATP不是用RLR-6进行有效连接所必需的。我们发现ATP的存在的确具有轻微的抑制作用。
实施例8
连接反应添加剂
在本实验中，我们设法通过添加已知增强涉及核酸的不同的酶促反应的物质来增加连接效率。文献中的报道表明添加剂，诸如BSA，DMSO和PEG可提高对于一些底物的效率[11，12]。由片段化的，去磷酸化的人心脏cRNA开始，我们用下列添加剂测定了连接：1)10μg/ml BSA，2)10％DMSO，3)16％PEG 8000，4)没有添加剂(对照)。四个反应用2U/μl T4RNA连接酶(来自NEB)和50μM RLR 4a(亚最佳的连接条件)进行。利用Promega T4RNA连接酶无添加剂的第五个连接反应用于对比比较。连接反应物在标准条件下杂交于U95Av2阵列。
三个添加剂中，仅仅PEG在阵列特性方面对连接效率有显著的影响。与没有添加剂的对照相比较添加16％PEG显著地增加了总信号强度以及存在呼叫百分比。如通过较低的信号强度和较低的存在呼叫率所证明，BSA似乎是阻碍连接。DMSO对信号或存在呼叫率没有影响。在酶特性方面，NEB T4RNA连接酶比Promega形式更加有效，其在所有测定条件中具有最小的信号和存在呼叫率。
我们开始鉴别连接反应中的最佳PEG浓度。如同上述的优化实验一样，我们测定亚最佳条件下的连接来辨别不同测定条件之间的细微差异。连接反应用2U/μl T4RNA连接酶和50μM RLR-4a 20℃在下列PEG浓度下进行2小时：0％，10％，16％，和25％。我们也测定了较高浓度的RLR-4a，179μM，加上或减去16％PEG。连接反应物在标准条件下杂交于U95Av2阵列。
在连接反应中增加PEG浓度增加了信号和存在呼叫百分比。在50μM RLR-4a子集内，用25％PEG连接反应获得最好的信号。在存在呼叫方面，16％PEG和25％PEG连接产生相同的结果，超过标准的存在呼叫百分比约2％。PEG的添加证明了甚至在最好的RLR-4a测定浓度，179μM处是有益的。与“无PEG”对照相比，16％PEG的添加增加信号1.3倍并且存在呼叫增加了几乎6％。由于PEG溶液的高粘度，我们发现16％PEG的终浓度增强了阵列特性且是易处理的。
实施例9
RNA片段化：测定Mg2+ 水解参数
为了优化阵列特性，我们研究了不同的片段化缓冲液以及片段长度对阵列特性的影响。对于RELA方法我们测定了片段长度，阵列强度以及检测灵敏度之间的关系。
因为下游连接反应受片段化缓冲液的影响，我们研究了具有较低单价离子浓度和替代阳离子组分的缓冲液。按照标准的表达方案由HeLa总RNA制备标记和未标记的cRNA。利用Mg2+和高温加热在下述缓冲液中使标记和未标记的cRNAs片段化：a)5×＝200mM Tris-醋酸，pH 8.1，150mM MgOAc，500mM KOAc(Affymetrix standard)b)5×＝200mM Tris，150mM MgOAc，pH 8.2c)5×＝200mM Tris，150mMMgCl2，pH 8.2。片段化的未标记cRNA利用虾碱性磷酸酶在37℃去磷酸1小时；然后在65℃加热-失活15分钟。在含有2U/μl T4RNA连接酶，16％PEG的反应中用100μM RLR-6在37℃末端标记去磷酸化的，片段化的cRNA两个小时。所有反应中，10微克的标记的cRNA杂交于U133A阵列并且根据标准的抗体扩增方案进行处理。
对于RELA和STD二者而言，MgOAc对于最佳总信号强度和存在呼叫量优于MgCl2。到目前为止，用Affymetrix商用缓冲液进行的标准的cRNA片段化是最好的。用修饰的缓冲液进行的标准tRNA的片段化显著地降低了存在呼叫量和信号强度。对于RELA样品而言，不同的待测片段化缓冲液之间的存在呼叫率没有显著差异。然而，用含有MgOAc的缓冲液片段化的RELA样品比用MgCl2缓冲液片段化的样品具有较高的信号。
实施例10
多生物素进行末端标记：RLR-7，RLR-8和RLR-9
根据本发明的一个方面，Sig部分可具有许多生物素残基。根据本发明，已经发现将具有多生物素残基的核酸标记化合物用于末端标记RNA具有增加靶RNA信号以及检测灵敏度的潜在可能。然而，原始数据表明可掺入到Sig部分中并且用于末端标记RNA用于如本发明描写的检测目的的生物素残基的数目是有限的。
关于对可用于掺入供体分子的生物素部分的数目的可能的限制，合成了称作RLR-7的具有连接于核糖3′位置的五个TEG-生物素(5′-pCp-(TEG-生物素)5-3′)的供体分子。在预试验中，RNA用RLR 7标记并杂交于GeneChip阵列在此实验中产生异常的杂交结果。用RLR-7标记的RNA的总杂交模式有点类似于具有一个生物素的标准的以及RLR-5的模式。然而，在很多情况下，RLR-7杂交未发生在其中信号应该存在的区域并且照亮了在标准中不存在的区域。这些RLR-7的初始数据的重要性目前是未知的。
制备具有少于五个生物素部分的供体分子：RLR-8(2个生物素)，以及RLR-9(3个生物素)。RLR-9产生最好的未测定的信号强度。然而，背景强度随信号增加相应地增加。在进行的预试验中，RLR-9与检测的其它RNA标记试剂特性相当。尽管具有最高的背景，RLR-9与RLR-5和RLR-相比具有最高的存在呼叫总量。
实施例11
PEG优化
在本实验中，我们开始鉴定连接反应中的最佳PEG浓度。如同上述的优化实验一样，我们测定了亚最佳条件下的连接来辨别不同测定条件之间的细微差异。连接反应用2U/μl T4RNA连接酶和50μMRLR-4a 20℃在下列PEG浓度下进行2小时：10％，16％和25％。我们也测定了较高浓度的RLR4a，179μM，加上或减去16％PEG。连接反应物在标准条件下杂交于U95Av2阵列。
在连接反应中增加PEG浓度增加了信号和存在呼叫百分比。在50μM RLR-4a子集内，用25％PEG连接反应获得最好的信号。在存在呼叫方面，16％PEG和25％PEG连接产生相同的结果，超过标准的存在呼叫百分比约2％。PEG的添加证明了甚至在最好的RLR-4a测定浓度，179μM处是有益的。与“无PEG”对照相比，16％PEG的添加使信号增加了1.3倍并且使存在呼叫增加了几乎6％。由于PEG溶液的高粘度，我们发现16％PEG的终浓度增强了阵列特性且是易处理的。
实施例12
核糖核酸酶III片段化cRNA的阵列特性
在此实验中，我们测定了RELA方案内(RNA末端标记分析)RNA片段化的两种不同方法与标准方法的比较。先前，凝胶迁移试验揭示了Mg2+-水解的RNA利用T4RNA连接酶不能有效地连接。因此，我们改用RNase III进行降解的替代片段化方法。我们用每10微克的cRNA，1单位的酶在37℃降解RNA共35分钟；然后在65℃加热灭活RNase III酶20分钟。然后，利用虾碱性磷酸酶对片段化的RNA去磷酸化并且用T4RNA连接酶连接于RLR-5。
对于三个反应而言，我们测定了组合RNase降解和去磷酸化作用步骤来减少试验的持续时间。从现在起，我们将这些反应称为“两步”反应因为RELA方案被基本上减少为两步：1)片段化与去磷酸化作用，2)连接。对于这些反应而言，片段化和去磷酸化作用同时进行35或40分钟，然后在65℃加热失活两种酶20分钟。基于上述这些较高的温度提高了识别力的发现一些靶在50℃杂交。所有的反应进行一式两份并且根据标准方案杂交于U133A阵列。
RNase片段化显著地提高了信号强度。在RELA方案内，RNase降解比Mg2+-水解的cRNA提高了2倍系数的强度。这与表明RNase-降解的RNA是比Mg2+-水解的RNA更有效地连接的凝胶迁移结果一致。与标准方案相比，RNase片段化的信号增加了大约1.2倍。RNase-降解的靶在50℃对比45℃的杂交，45℃时的信号强度降低5-10％，但是这些信号仍然高于在45℃杂交的标准的那些信号强度。两步反应如同利用RELA方案的标准方式制备一样来进行，信号＞＝240。
上述引用的参考文献的部分列举：
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上述的参考文献引入作为参考。
可以理解在这里描述的实施例和实施方案仅仅用于说明性的目的，且本领域的技术人员能够进行不同的修饰或改变并且包括在此申请的精神和范围以及附加权利要求的范围之中。所有在这里引用的公开物、专利和专利申请都引入作为通用的参考。

Claims (60)

1.一种检测目的RNA的存在的方法，所述方法包括下列步骤：
提供包括其可能具有或可能不具有所述目的RNA的RNA的样品；
将所述RNA连接于具有下式的标记试剂：
其中B是杂环部分；X是允许核酸标记化合物连接于所述片段的3′OH基团的官能团；Y选自-H，-OH，-OR，-SR，-NHR，或卤素；L是接头基团；并且Sig是提供标记的RNAs的可检测部分；
提供具有针对所述目的RNA的探针的核酸阵列；
将标记的RNAs杂交于所述核酸阵列；以及
测定所述探针的杂交程度来确定所述目的RNA的存在。
2.根据权利要求1的方法，其中所述RNA包括microRNA。
3.根据权利要求1的方法，进一步地包括用片段化试剂处理所述样品来提供RNA片段的步骤；以及在提供所述样品的步骤之后和所述连接步骤之前除去所述片段的磷酸基来提供具有游离的3′OH基团的片段的步骤。
4.根据权利要求3的方法，其中所述片段化试剂选自RNAse III和含有诸如Mg2+的二价金属离子以及具有中性到碱性范围pH的缓冲液。
5.根据权利要求3的方法，其中所述由3’羟基除去磷酸基的步骤是用碱性磷酸酶进行的。
6.根据权利要求1的方法，其中X选自具有选自H+，Li+，Na+，NH4 +或K+的相反离子的HO-，PO4 2--，P2O7 3--，P3O10 4--，OP(S)O2 2-以及腺苷-(5’)-P2O7=-。
7.根据权利要求1的方法，其中Y为F。
8.根据权利要求3的方法，其中所述RNA包括mRNA。
9.根据权利要求3的方法，其中所述RNA包括cRNA。
10.根据权利要求1的方法，其中所述连接酶为T4RNA连接酶。
11.根据权利要求1的方法，其中Y为-OH。
12.根据权利要求1的方法，其中所述核酸阵列为寡核苷酸阵列。
13.根据权利要求12的方法，其中所述核酸阵列由光刻法制备而来。
14.根据权利要求1的方法，其中所述接头基团选自
-CH2-CH(OH)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-和-CH2-CH(OPO3=)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-。
15.根据权利要求14的方法，其中L为-CH2-CH(OH)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-。
16.根据权利要求1的方法，其中X为PO4 =。
17.根据权利要求1的方法，其中B选自嘧啶碱基，嘌呤碱基，天然碱基类似物以及非天然类似物。
18.根据权利要求17的方法，其中B选自腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶。
19.根据权利要求18的方法，其中B选自腺嘌呤和胞嘧啶。
20.根据权利要求19的方法，其中B为胞嘧啶。
21.根据权利要求1的方法，其中所述标记试剂含有下列结构：
Figure A2005101246890004C1
其中R为H或PO3 2-。
22.根据权利要求21的方法，其中R为H。
23.根据权利要求1的方法，其中所述标记试剂含有下列结构：
其中R为H或PO3 2-。
24.根据权利要求21的方法，其中R为H。
25.根据权利要求1的方法，其中所述标记试剂含有下列结构：
Figure A2005101246890005C2
其中B选自腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶；R为H或PO3 =。
26.根据权利要求25的方法，其中B选自腺嘌呤和胞嘧啶且R为H。
27.根据权利要求26的方法，其中B为腺嘌呤。
28.根据权利要求26的方法，其中B为胞嘧啶。
29.检测目的RNA的存在的方法，所述方法包括下列步骤：
提供包括其可能具有
或可能不具有所述目的RNA的RNA的样品；
将所述RNA连接于具有下式的标记试剂：
Figure A2005101246890006C1
其中B为杂环部分；且R选自H和PO3 =并且n为1到6；
提供具有对应于所述目的基因的探针的核酸阵列；
将标记的核酸片段杂交于核酸阵列；
以及测定所述探针的杂交程度来确定所述目的RNA的存在。
30.根据权利要求29的方法，其中所述RNA包括microRNA。
31.根据权利要求29的方法，进一步地包括用片段化试剂处理
所述样品来提供RNA片段的步骤；以及在提供所述样品的步骤之后和所述连接步骤之前除去所述片段的磷酸基来提供具有游离3′OH基团的片段的步骤。
32.根据权利要求31的方法，其中所述片段化试剂选自RNAse III和含有诸如Mg2+的二价金属离子以及具有中性到碱性范围pH的缓冲液。
33.根据权利要求31的方法，其中所述由3′羟基除去磷酸基的步骤是用碱性磷酸酶进行的。
34.根据权利要求29的方法，其中所述RNA包括microRNA。
35.根据权利要求29的方法，进一步地包括用片段化试剂处理样品来提供RNA片段的步骤；以及在提供所述样品的步骤之后和所述连接步骤之前除去所述片段的磷酸基来提供具有游离的3′OH基团的片段。
36.根据权利要求31的方法，其中所述片段化试剂选自RNAse III和含有诸如Mg2+的二价金属离子以及具有中性到碱性范围pH的缓冲液。
37.根据权利要求31的方法，其中所述由3′羟基除去磷酸基的步骤是用碱性磷酸酶进行的。
38.根据权利要求27的方法，其中B选自腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶，且n为2到4。
39.根据权利要求34的方法，其中B选自腺嘌呤和胞嘧啶。
40.根据权利要求35的方法，其中B为胞嘧啶。
41.根据权利要求34的方法，其中n为3。
42.根据权利要求1的方法，其中所述标记试剂选自：
Figure A2005101246890008C1
和
43.根据权利要求29的方法，其中所述标记试剂为：
或
Figure A2005101246890010C1
且其中R为H或PO3 2-。
44.具有下式的核酸标记化合物：
Figure A2005101246890010C2
其中B是杂环的碱基部分；X是允许核酸标记化合物连接于所述片段的3′OH基团的官能团；Y选自-H，-OH，-OR，-SR，-NHR，或卤素；L是接头基团；且Sig是可检测的部分。
45.根据权利要求44的化合物，其中L选自：
-CH2-CH(OH)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-和-CH2-CH(OPO3=)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-。
46.根据权利要求45的化合物，其中L为
CH2-CH(OH)-CH2-(O-CH2-CH2)3-O-CH2-CH2-CH2-NH-。
47.根据权利要求44的化合物，其中X选自具有选自H+，Li+，Na+，NH4 +或K+的相反离子的HO-，PO4 2--，P2O7 3--，P3O10 4--，OP(S)O2 2-以及腺苷-(5’)-P2O7 =-。
48.根据权利要求44的化合物，其中Y为氟。
49.根据权利要求44的化合物，其中B选自嘧啶碱基，嘌呤碱基，天然碱基类似物以及非天然类似物。
50.根据权利要求45的化合物，其中B选自腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶。
51.根据权利要求50的化合物，其中B选自腺嘌呤和胞嘧啶。
52根据权利要求47的化合物，其中B为胞嘧啶。
53.根据权利要求44的核酸标记化合物，具有下式结构：
其中L是接头且Sig是可检测的部分；B1是腺嘌呤且B选自腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶。
54.根据权利要求44的核酸标记化合物，具有下式结构：
其中B1为腺嘌呤，且B选自腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶；R为H或PO3 =。
55.根据权利要求44的核酸标记化合物，具有下式结构：
56.下式的核酸标记化合物：
Figure A2005101246890012C2
其中B是杂环的碱基部分，L1是第一接头，L2是第二接头，Sig是可检测部分并且n是从1到6的整数。
57.根据权利要求56的核酸标记化合物，具有下式结构：
Figure A2005101246890012C3
其中B为杂环的碱基部分；n是由1到6的整数，并且R选自H和PO3 =。
58.根据权利要求56的核酸标记化合物，具有下式结构：
Figure A2005101246890013C1
59.根据权利要求56的核酸标记化合物，具有下式结构：
60.根据权利要求56的核酸标记化合物，具有下式结构：
Figure A2005101246890013C3
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