CN1818057A

CN1818057A - 酶解提取梨花粉原生质体的方法

Info

Publication number: CN1818057A
Application number: CN 200510134904
Authority: CN
Inventors: 张绍铃; 屈海泳; 吴俊�
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2005-12-30
Filing date: 2005-12-30
Publication date: 2006-08-16

Abstract

本发明梨花粉和花粉管原生质体的提取方法，涉及植物体细胞壁的破除和原生质体获取的方法，是属于生物化学及食品科学领域；本发明的主要是依据植物花粉细胞壁的特性来获取完整的花粉或花粉管原生质体，而且保持原有的活力。采用两步法获取花粉及花粉管原生质体，步骤主要包括采集成熟花粉，在花粉培养基中培养3～3.5h后，进行酶解反应50min后、离心，就能获得完整的具有活力的花粉粒(管)的原生质体，而且该原生质体仍然保持原有活性，适合于作为花粉及花粉管的生理生化及细胞信号转导特性研究的实验材料。

Description

酶解提取梨花粉原生质体的方法

技术领域

本发明是梨花粉和花粉管原生质体提取的方法，涉及植物细胞破壁和获取具有活力原生质体的方法，属于生物化学及食品科学领域。

背景技术

植物花粉(pollen)不仅在植物繁衍后代、扩大遗传组成与分布范围等方面起极其重要作用，而且其营养极其丰富。近年来研究表面：花粉含有种类繁多的碳水化合物、有机酸、蛋白质、核酸、酶和辅酶、色素、维生素与矿物质等营养成分。其中蛋白质的含量十分丰富，达7％-40％，胜过酪蛋白。花粉中含有18种氨基酸，其中包括人体必需的8种氨基酸，其含量多于牛奶、鸡蛋的5-7倍，尤其是赖氨酸的含量特别丰富，它有利儿童生长发育。花粉还含有维生素A、维生素B群(B₁、B₂、B₆、B₁₂)、维生素C、维生素D、维生素E、维生素P以及泛酸、叶酸、烟酸等10多种维生素，特别是维生素E，C，P，能增强人体免疫功能，促进延年益寿，软化血管，预防动脉硬化和冠心病。花粉还含有90多种酵酸素、酶和辅酶，这些酶类保存着天然活力，是生命活动过程中的重要物质，是一种天然高级营养品，因而，也为国际上誉为“完全营养食品”(perfect foods)。

我国土地辽阔，种子植物有3万余种。花粉虽小，但植物产花粉数量十分惊人，一株玉米可产5000万粒花粉。我国耕地约有1.000 5亿hm²(15亿亩)，所以花粉资源十分丰富，居世界首位。全国养蜜蜂700万群左右，假如每群蜂一年采集10Kg花粉，那么每年就会产7000万Kg，如果再加上人工或机器收集花粉，那将是一种非常可观的潜在的食物资源。但目前开发利用不到1/200，所以研究、开发、应用花粉，对人类的幸福生存，具有深远的意义。

虽然花粉的食用营养及药用价值很大，但是由于花粉壁的构造、组成较为特殊、结构坚硬，如果不去壁，其营养很难被人体有效的吸收利用，特别是花粉口服液饮料等更应选用去壁后的花粉原生质体为原料。为此，在食品科学领域，有许多学者开展相关的开发研究，现有的花粉去壁的方法可以归结为以下三类：1)物理方法：这种方法也比较常见，对花粉进行干燥或冰冻，然后再对花粉进行研磨，该方法多用于食品工业，用于提取花粉的内容物；2)生理方法：用一定渗透压的溶液浸泡花粉，让原生质体膨胀，撑破花粉壁，而获得原生质体或花粉内含物，但该方法应用较少，3)发酵法：直接利用花粉本身所有的酶类和微生物，使花粉达到发酵破壁的目的。虽然已经有这些去壁的方法，但是，这些方法存在很多问题，主要问题有：其一是用这些方法所获得的花粉原生质体不仅失去原有的生物活力，而且对营养成分还会带来一定的破坏性，在很大程度上降低所具有的营养价值；其二是这些获取花粉原生质体的方法不能适合于所有的植物花粉，比如，用这些方法无法获取梨、苹果等蔷薇科果树花粉的原生质体。

发明内容

技术问题本发明的目的是提供梨等蔷薇科植物花粉原生质体的提取方法，有效地分离出具有活力的、保存原有养分和活性的花粉原生质体。该方法可用于分离提纯其他蔷薇科果树(苹果、桃、杏、李等)花粉原生质体，也为其他组织器官的原生质体的分离提供参考。

技术方案本发明提供了新的植物花粉及花粉管的破壁而获取原生质体的方法，是应用花粉培养与酶解的两步法来获取花粉及花粉管原生质体的方法，其过程是将花粉先培养，再酶解而获得花粉粒及花粉管的完整原生质体。

采用花粉培养与酶解结合来获取花粉及花粉管的原生质体的‘两步法’，包括下列步骤：

1)花粉的采集：采集当天开放的花粉，然后让花粉充分干燥；

2)培养基的制备(在BK培养基的基础上进行调整)：

培养基一：蔗糖(sucrose)10％，Ca(NO₃)₂·4H₂O 0.01％，250mM MES/Tris[α-磺基甲脂磺酸钠/三(羟甲基)氨基甲烷；pH6.0-6.2)。

培养基二：蔗糖(sucrose)15％，Ca(NO₃)₂·4H₂O 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，KNO₃0.01％，0.01％H₃BO₃，250mM MES/Tris[α-磺基甲脂磺酸钠/三(羟甲基)氨基甲烷，pH6.0-6.2]；根据目的的不同，培养基一和培养基二可以任选其中之一使用；

3)花粉的培养，取干燥后的花粉，放入花粉培养基(上述两种培养基可以任选一种)中，在黑暗条件下，25～27℃，80rpm，培养3～3.5h。选择第一种培养基来培养花粉时，培养时间可以缩短为2.5h，再酶解花粉，这种方法主要是用于获得花粉粒的原生质体。选择第二种培养基来培养花粉，再经过酶解去壁，主要是获取花粉管的原生质体。

4)培养后的花粉，用离心机离心的方法清洗花粉2-3次，1200rpm，清洗液为酶母液。

5)酶母液的配制：Mannitol(甘露醇)0.6mM，KNO₃ 100mM，KH₂PO₄ 20mM，MgSO₄ 100mM，CaCl₂ 100mM，KI 100mM，CuSO₄ 0.1mM，MES(α-磺基甲脂磺酸钠)250mM，Vc 0.5mM，pH 5.3(Tris-HCI)。

6)酶液的配制：取100ml的酶母加入1.5％Cellulase R-10[纤维素酶R-10，为德国社娃公司产品(German Serva)]，0.7％Pectolyase Y-23[果胶酶Y-23，为日本生新公司产品(Seishin，Japan)]和1％BSA[牛血清蛋白，西克码公司产品(Sigma)]。配制好的酶液最好进行分装，在-20℃冰冻低温下保存。

7)酶解：吸取清洗后的花粉悬浮液100μl，放入900μl的酶液中进行酶解，酶解的条件是：黑暗、29～31℃，100rpm，酶解时间为50min。

8)酶解后，用离心机离心的方法清洗3次，500rpm，清洗液的渗透压要在900mOsM以上。

有益效果

本发明的积极效果：

1)首次从蔷薇科果树梨花粉及花粉管中分离出具有活力的原生质体，可以用于各种相关的科学研究，尤其是梨花粉生理生化特性的基础性研究；比如，花粉原生质体适合于作为研究植物细胞的分子结构的实验材料；

2)应用本发明的方法提取的具有活力的原生质体，在植物的杂交育种领域，有较大的应用前景，通过同一来源或者不同来源的具有活力的原生质体的相互融合，可以重新发育成新的植株，这种方法称为体细胞杂交，是创新种质的重要手段；

3)本发明是基于对梨花粉及花粉管生理生化及细胞信号转导等特性研究的工作基础。花粉原生质体具有单倍性、结构简单、发育同步和群体数量大等优点，被认为是“遗传操作和突变研究的卓越体系”，提供“研究花粉生理学和个体发育的新途径”。另外，在研究植物受精生理学中，许多重要的生理生化反应都是发生在花粉管内，如自交不亲和反应等；因此，获得花粉管原生质体是开展这些科学理论研究的重要前提。总之，本方法具有坚实的理论依据，科学性性强、方法较简便，易于操作和实际应用。

4)用这种花粉培养——酶解的两步法来提取花粉及花粉管的原生质体，通过控制酶解的时间，可以获得完整的花粉管或花粉粒的原生质体；获得的原生质体，仍然保持原有的活力；应用该方法获取的花粉原生质体，非常适合于作为花粉及花粉管的生理生化、细胞信号转导特性等方面研究的实验材料。

附图说明

图1酶法获得原生质体的流程图

图2萌发三个个小时的梨花粉。长度大约在1100μm左右。

图3经酶解作用后，花粉管原生质体从破裂的花粉管尖端出来。在渗透压的作用下，花粉管原生质体很容易形成几个球形部分。此外，越是靠近尖端部位的原生质体，体积越大。

图4花粉管的原生质体。延长酶解作用的时间，花粉管原生质体可以完全从花粉管脱离出来。

图5花粉管原生质体与花粉原生质体的比较。从图内所标的数字可以看出，1-3是花粉原生质体随着酶解时间的延长，逐渐从花粉壁中出来，并最终脱离花粉外壁。4-7是花粉管原生质体，从图中可能看出，花粉粒原生质体，要比花粉管原生质体要大。所以可以从体积上区分这两种原生质体。

图6荧光增白剂鉴定去壁效果

注：箭头所指的即为去壁后的原生质体。荧光增白剂是专一染纤维素物质。经荧光增白剂染色后，在荧光显微镜下几乎看不到细胞，说明，该细胞已成功脱去细胞壁。

图7TTC染色4h的花粉原生质体

注：箭头所指的被TTC染成红色的原生质体即为有活性的原生质体。并且红色颜色越深，说明活性越强。

图8酶解过后获得的花粉管原生质体。有的原生质体还与花粉管连在一起，有的已脱离花粉管。

图9左图为电极与细胞膜封接示意图。右图为封接检验，均超过1吉欧(GΩ)。

图10梨花粉管原生质体全细胞方式记录的Ca²⁺电流。

A步进式方式记录的质膜Ca²⁺电流；B渐进式记录的质膜Ca²⁺电流.

具体实施方式

提取植物花粉(管)原生质体，是研究花粉(管)的生理、生化特性及其功能的必要前提之一。我们应用本发明的方法，获取了具有活力的梨花粉管原生质体，利用膜片钳直接鉴定出花粉管的钙通道及花粉管内的钙梯度及其相关功能，为拓宽和深入研究花粉管的电化学特性奠定基础。众所周知，获取原花粉(管)原生质体是开展膜片钳实验研究的前提，而迄今，在根毛、藻类的假根及菌丝都是采用激光切除细胞壁，这种方法需要较为昂贵的实验设备，其次，目前关于获取花粉有活性且完整的原生质体，都是以幼嫩和新鲜的花粉为材料，而对于一年只能采收一次，而且是成熟的花粉没有报道，如梨、苹果、桃等。更没有关于如何获取花粉管原生质体的报道。

本实例就以梨花粉作为材料，采用本发明方法获取了具有活力的花粉管原生质体，并利用膜片钳成功鉴定出梨花粉管尖端的钙通道。实验过程如下：

1.在4-5月间，大田采集成熟的梨花粉，风干后-20℃冰冻低温下保存。

2.取保存的花粉，先在常温下解冻2h，在上述培养基上培养花粉，温度为25℃，黑暗条件，80rpm，培养3h(图2)。

3.用酶母液离心清洗萌发后的花粉，2-3次，1200rpm。

4.吸取100μL沉淀，加入酶液，立即放入恒温摇床中，100rpm，黑暗条件，30℃，50min。

5.酶解后，先放入低温冰箱，停止酶反应。

6.酶反应停止后，进行离心清洗2-3次，500rpm，清洗液为胞外液，胞外液的渗透压应为900mOsM。清洗后，沉淀即为原生质体，原生质体的外观形状、特征如图3～图8所示。

7.利用膜片钳技术，以全细胞的方式(图9)，成功地记录到了超极化激活的脉冲性内向电流(图10)，为保证记录的内向电流为胞外Ca²⁺的内流，必须做到以下三点：(1)原生质体要有活性，并且细胞膜在去壁的过程中，没有受到影响；(2)电极与膜能形成高阻封接(＞1GΩ)；(3)用于实验的电极液和胞外液各种离子的组合及浓度均在实验前经过了认真设计。胞外液除含有用于调pH值的MES和作为渗透调节物质的适量甘露醇外，只含有10mmol/L的CaCl₂。而电极液的成份尽力摸拟原生质溶液，加入维持细胞正常的生理状态的GTP和ATP，同时电极液加入Cs⁺，用以阻断K⁺通道，便于将Ca²⁺电流单独分离出来进行测定。Ca²⁺电流如图4所示，通过步进式方式(step)和渐进式(slow-ramp)方式，当钳制电位超过-100mV时开始记录到内向电流，在0mV记录不到电流。

Claims

1、花粉原生质体的提取方法，包含下列步骤：

1)花粉的采集：

采集当天开放的花粉，然后让花粉充分干燥；

2)培养基及酶解液的制备：

培养基的制备：可以用下列两种培养基的其中一种：

(1)蔗糖10％，Ca(NO₃)₂·4H₂O 0.01％，250mM α-磺基甲脂磺酸钠/三(羟甲基)氨基甲烷；pH6.0-6.2；

(2)蔗糖15％，Ca(NO₃)₂·4H₂O 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.02％，KNO₃ 0.01％，0.01％H₃BO₃，250mMα-磺基甲脂磺酸钠/三(羟甲基)氨基甲烷；pH6.0-6.2；酶母液的配制：甘露醇0.6mM，KNO₃ 100mM，KH₂PO₄ 20mM，MgSO₄ 100mM，CaCl₂ 100mM，KI 100mM，CuSO₄ 0.1mM，α-磺基甲脂磺酸钠250mM，Vc0.5mM，pH 5.3(Tris-HCI)；

酶液的配制：取100ml的酶母加入1.5％纤维素酶R-10，0.7％果胶酶Y-23，和1％牛血清蛋白，配制好的酶液分装后在-20℃冰冻低温下保存；

3)花粉壁的破除过程：

(1)花粉的培养：取干燥后的花粉，放入花粉培养基中，在黑暗、温度25～27℃的条件下培养，时间为3～3.5h；

(2)培养后的花粉，用离心机清洗花粉2-3次，1200rpm，清洗液为酶母液；

(3)酶解：吸取清洗后的花粉悬浮液100μl，放入900μl的酶液中，开始酶解，温度29～31℃，100rpm，黑暗条件，时间50min；

(4)酶解后，用离心机清洗3次，500rpm，清洗液为胞外液，清洗后，沉淀即为原生质体。