CN114958615B

CN114958615B - 一种白肉灵芝菌株l4968及其栽培方法

Info

Publication number: CN114958615B
Application number: CN202210435494.0A
Authority: CN
Inventors: 刘丹; 李娥贤; 何俊; 蔡雄; 叶洋; 万涵; 李树红; 李燕
Original assignee: Yunnan Boyan Agricultural Technology Development Co ltd; Biotechnology and Germplasm Resource Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Yunnan Boyan Agricultural Technology Development Co ltd; Biotechnology and Germplasm Resource Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-04-24
Filing date: 2022-04-24
Publication date: 2023-11-14
Anticipated expiration: 2042-04-24
Also published as: CN114958615A

Abstract

本发明涉及一种白肉灵芝菌株L4968及其栽培方法，属于微生物技术领域。所述的灵芝属菌株L4968，已于2021年12月27日保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No：62105。通过采集分离野生灵芝菌株‑L4968并结合形态及DNA条形码技术确定其分类地位，开展菌种培养、生物学特性及人工驯化栽培，并以袋料覆土驯化栽培后得到成熟子实体。本发明所得白肉灵芝子实体营养成分高，出芝整齐度好，菌盖同心环纹明显，有强烈漆状光泽，肉质厚、菇形及品质好，干重为33.40g/朵，生物学效率为10.26%，属于中低温型菌株，适宜在云南地区1800m以上海拔区域种植，具有高海拔地区栽培推广的潜力。

Description

一种白肉灵芝菌株L4968及其栽培方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种白肉灵芝菌株L4968及其栽培方法。

背景技术

灵芝属在全球温带和热带地区都有分布，是利用最早和文化最厚重的食药用菌之一，在改善人类健康和塑建祥瑞菌文化中产生了深远影响并发挥重要作用。灵芝Ganodermaspp.隶属于灵芝属真菌，又称灵芝草、仙草、瑞草，是一种拥有数千年药用历史的中国传统食用药材，具有很高的食用和药用价值，千百年来被国人视为能治百病的灵丹妙药，列入了中华九大仙草之一。最早在东汉时期的《神农本草经》已把灵芝列为上等药物使用，并根据灵芝类的形态和颜色将其分为赤芝、黑芝、青芝、白芝、黄芝及紫芝6种。后续，明代著名医药学家李时珍在《本草纲目》中对灵芝药性和功效做了详细说明。近现代，科研人员对灵芝属物种进行了广泛而深入的探索，使灵芝的研究已经成为真菌学中的一个研究热点，灵芝潜在的药用价值也得到了进一步的挖掘。灵芝在我国逐步广泛栽培，不但形成了一个重要的产业，而且还形成了灵芝文化

近年来，DNA条形码技术被广泛应用于物种鉴定，是识别和发现新物种的必要手段之一。野生灵芝受市场需求和价格不断上涨的影响，野生灵芝资源遭到过度采集，使得野生灵芝资源急剧减少。对野生灵芝种质资源的收集保护及品种选育应用迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种白肉灵芝菌株L4968及其栽培方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种白肉灵芝菌株L4968，已于2021年12月27日保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No：62105。

本发明同时提供上述白肉灵芝菌株L4968的栽培方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)，母种扩繁：无菌条件下取白肉灵芝菌株L4968接种到母种PDA培养基上，密封放置于20-26℃的培养箱恒温培养至菌落长满培养皿；

所述的母种PDA培养基包括按照重量份数计的如下原料：马铃薯200份、葡萄糖19-21份、蛋白胨1.9-2.1份、三氯化铁0.48-0.52份、琼脂粉16份，水1000份；pH＝5.5；

步骤(2)，原种制备：取步骤(1)培养好的母种接种至原种培养瓶中，暗光培养，所述的暗光光照强度为20-100Lx，控制温度在22-25℃；当培养瓶中的菌丝长满1/3袋时，将培养室的温度降至20-23℃，菌丝长满培养瓶，得到原种；

所述的原种培养瓶中的原种培养基质包括按照重量份数计的如下原料：小麦60-80份、阔叶树木屑10-20份、麦麸10-18份、石膏粉1.0-2.0份、白糖1.0-2.0份；

步骤(3)，栽培种制备：将步骤(2)原种培养基质和菌丝一起接种到栽培料袋中，置于20-26℃培养室中进行暗培养，保持空气湿度60-65％，待菌丝长满菌袋，得到栽培袋；

所述的栽培袋中的栽培基质包括按照干物质重量份数计的如下原料：阔叶树木屑45-60份、棉籽壳25-30份、麦麸15-20份、石膏1.0-2.0份、石灰0.5-1.0份、白糖1.0-1.5份；pH值6-8，含水量55-65％；

步骤(4)，袋料覆土栽培及出芝管理：按畦深20-30cm，宽0.8-1.0m，脱去上部1/3菌袋，并将栽培袋立袋放置，菌袋间距5-10cm进行摆袋，两畦间宽48-52cm、深28-32cm进行作畦理沟；然后进行覆土，覆土高出菌袋表面2-5cm；覆土后进行灵芝出菇管理。

进一步，优选的是，步骤(1)中，于24℃的培养箱恒温培养10-12天。

进一步，优选的是，步骤(1)中，所述的母种PDA培养基包括按照重量份数计的如下原料：马铃薯200份、葡萄糖20份、蛋白胨2份、三氯化铁0.5份、琼脂粉16份，水1000份；pH＝5.5；制备方法为：将马铃薯剁碎加水至煮透之后用纱布过滤去马铃薯残渣，得到马铃薯淀粉液，依次将琼脂、葡萄糖、蛋白胨、三氯化铁放入搅拌煮至沸腾，并调节pH；121℃灭菌25min后倒入平板，冷却待用。

进一步，优选的是，步骤(2)中，步骤(1)母种以1：10扩繁系数进行扩繁；原种培养瓶摆放的瓶间距为5-10cm；原种瓶规则为直径×高为8cm×11cm；每瓶原种培养基质250克。

进一步，优选的是，步骤(2)中，原种培养基质中的小麦、阔叶树木屑和麦麸分别用石灰水浸泡24h后，取出后，加入石膏粉和白糖，混匀后，121℃、0.103MPa灭菌2h，之后装瓶。

进一步，优选的是，步骤(3)中，步骤(2)得到的原种以1：20扩繁系数进行扩繁；每袋栽培料重1.0-1.2kg。

进一步，优选的是，步骤(3)中，栽培袋采用长×高×厚为17cm×35cm×0.05cm聚乙烯袋装袋；装栽培料后110℃灭菌8-10h。

本发明白肉灵芝菌株L4968含有较高含量的灵芝多糖和灵芝三萜类化合物。采用中国药典2020年版一部灵芝，第196页，灵芝多糖测定、灵芝三萜测定(以齐墩果酸计)的检测方法进行检测，多糖含量为1.47％，三萜含量为3.25％，均高于《中华人民共和国药典》药用灵芝标准，灵芝多糖具有广泛的药理活性，能降血糖，降血脂，抗血栓，抗氧化，清除自由基，抗衰老，抗辐射，抗肿瘤，促进血流循环，调节免疫，调节核酸、蛋白质代谢，促进DNA合成，促进人体脐血LAK细胞增殖。灵芝三萜类化合物具有抗炎、镇痛、镇静、抗衰老、毒杀肿瘤细胞、抗缺氧等作用。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明的白肉灵芝菌株L4968是在云南省昆明市石林县圭山镇圭山采集并分离的新菌种，经研究，未见该菌种的相关研究报道。

本发明结合DNA条形码鉴定及菌株培养利用技术，开展野生灵芝的生物学特性，液体发酵培养及驯化栽培实验，L4968在灵芝属***发育树中与已报道的白肉灵芝形成一个单独分支，并获得94％支持率；L4968菌株最适生长温度为24℃，当温度超过26℃时菌丝生长速度急剧下降，属于中低温型菌株。通过分离、纯化、筛选、出菇试验、区域及生产试验等驯化栽培结果显示白肉灵芝菌株L4968农艺性状优良，产量高、稳定，袋均产量80g/袋，折合亩产480kg。而且活性物质含量相较广泛栽培的赤芝高，出菇整齐度和抗逆性好，遗传性状稳定。

本发明所得白肉灵芝子实体营养成分高，多糖含量1.47％，三萜含量3.25％，出芝整齐度好，菌盖同心环纹明显，有强烈漆状光泽，肉质厚、菇形及品质好，干重为33.40g/朵，生物学效率为10.26％，栽培适宜温度为20-26℃，属于中低温型菌株，适宜在云南地区1800m以上海拔区域种植，具有中高海拔地区栽培推广的潜力，为西南地区珍稀野生白肉灵芝新资源的利用提供了一个重要途径。

附图说明

图1为基于ITS+LSU+TEF1-α+RPB2序列最大似然(ML)构建的灵芝属***发育树；注：ML Bootstrap只显示支持值大于75％分枝；

图2为不同碳源中L4968菌丝生长速度；

图3为不同氮源中L4968菌丝生长速度；

图4为不同无机盐中L4968菌丝生长速度；

图5为不同pH中L4968菌丝生长速度；

图6为不同温度中L4968菌丝生长速度；

图7为灵芝覆土栽培子实体；其中，a：原基期；b：现蕾期；c-e：子实体分化期；f-g：子实体半成熟期；h：子实体成熟期；i-j：子实体衰老期；

图8为白肉灵芝形态图；其中，a-c：担子果；d：孔隙表面；e：菌盖切面；f：皮壳细胞；g：菌肉骨架菌丝；h，i：菌管结合菌丝；j：菌管生殖菌丝；k：担孢子；比例尺：20μm(f，g)，10μm(h-j)，5μm(k)。

本发明白肉灵芝菌株(Ganoderma leucocontextum)L4968，已于2022年12月27日保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No：62106，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省科学院微生物研究所。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1

实施例2

白肉灵芝菌株L4968的栽培方法，包括如下步骤：

步骤(1)，母种扩繁：无菌条件下取白肉灵芝菌株L4968接种到母种PDA培养基上，密封放置于24℃的培养箱恒温培养至菌落长满培养皿；

所述的母种PDA培养基包括按照重量份数计的如下原料：马铃薯200份、葡萄糖20份、蛋白胨2份、三氯化铁0.5份、琼脂粉16份，水1000份；pH＝5.5；

步骤(2)，原种制备：取步骤(1)培养好的母种接种至原种培养瓶中，暗光培养，所述的暗光光照强度为20-100Lx，控制温度在24℃；当培养瓶中的菌丝长满1/3袋时，将培养室的温度降至22℃，菌丝长满培养瓶，得到原种；

所述的原种培养瓶中的原种培养基质包括按照重量份数计的如下原料：小麦70份、阔叶树木屑15份、麦麸15份、石膏粉1.5份、白糖1.6份；

步骤(3)，栽培种制备：将步骤(2)原种培养基质和菌丝一起接种到栽培料袋中，置于23℃培养室中进行暗培养，保持空气湿度60-65％，待菌丝长满菌袋，得到栽培袋；

所述的栽培袋中的栽培基质包括按照干物质重量份数计的如下原料：阔叶树木屑55份、棉籽壳28份、麦麸18份、石膏1.5份、石灰0.8份、白糖1.3份；pH值6-8，含水量55-65％；

步骤(4)，袋料覆土栽培及出芝管理：按畦深25cm，宽0.9m，脱去上部1/3菌袋，并将栽培袋立袋放置，菌袋间距7cm进行摆袋，两畦间宽50cm、深30cm进行作畦理沟；然后进行覆土，覆土高出菌袋表面4cm；覆土后进行灵芝出菇管理。

实施例3

白肉灵芝菌株L4968的栽培方法，包括如下步骤：

步骤(1)，母种扩繁：无菌条件下取白肉灵芝菌株L4968接种到母种PDA培养基上，密封放置于20℃的培养箱恒温培养至菌落长满培养皿；

所述的母种PDA培养基包括按照重量份数计的如下原料：马铃薯200份、葡萄糖19份、蛋白胨1.9份、三氯化铁0.48份、琼脂粉16份，水1000份；pH＝5.5；

步骤(2)，原种制备：取步骤(1)培养好的母种接种至原种培养瓶中，暗光培养，所述的暗光光照强度为20-100Lx，控制温度在22℃；当培养瓶中的菌丝长满1/3袋时，将培养室的温度降至20℃，菌丝长满培养瓶，得到原种；

所述的原种培养瓶中的原种培养基质包括按照重量份数计的如下原料：小麦60份、阔叶树木屑10份、麦麸10份、石膏粉1.0份、白糖1.0份；

步骤(3)，栽培种制备：将步骤(2)原种培养基质和菌丝一起接种到栽培料袋中，置于20℃培养室中进行暗培养，保持空气湿度60-65％，待菌丝长满菌袋，得到栽培袋；

所述的栽培袋中的栽培基质包括按照干物质重量份数计的如下原料：阔叶树木屑45份、棉籽壳25份、麦麸15份、石膏1.0份、石灰0.5份、白糖1.0份；pH值6-8，含水量55-65％；

步骤(4)，袋料覆土栽培及出芝管理：按畦深20cm，宽0.8m，脱去上部1/3菌袋，并将栽培袋立袋放置，菌袋间距5cm进行摆袋，两畦间宽48cm、深28cm进行作畦理沟；然后进行覆土，覆土高出菌袋表面2cm；覆土后进行灵芝出菇管理。

步骤(2)中，步骤(1)母种以1：10扩繁系数进行扩繁；原种培养瓶摆放的瓶间距为5cm；原种瓶规则为直径×高为8cm×11cm；每瓶原种培养基质250克。

步骤(2)中，原种培养基质中的小麦、阔叶树木屑和麦麸分别用石灰水浸泡24h后，取出后，加入石膏粉和白糖，混匀后，121℃、0.103MPa灭菌2h，之后装瓶。

步骤(3)中，步骤(2)得到的原种以1：20扩繁系数进行扩繁；每袋栽培料重1.0kg。

步骤(3)中，栽培袋采用长×高×厚为17cm×35cm×0.05cm聚乙烯袋装袋；装栽培料后110℃灭菌8h。

实施例4

白肉灵芝菌株L4968的栽培方法，包括如下步骤：

步骤(1)，母种扩繁：无菌条件下取白肉灵芝菌株L4968接种到母种PDA培养基上，密封放置于26℃的培养箱恒温培养至菌落长满培养皿；

所述的母种PDA培养基包括按照重量份数计的如下原料：马铃薯200份、葡萄糖21份、蛋白胨2.1份、三氯化铁0.52份、琼脂粉16份，水1000份；pH＝5.5；

步骤(2)，原种制备：取步骤(1)培养好的母种接种至原种培养瓶中，暗光培养，所述的暗光光照强度为20-100Lx，控制温度在25℃；当培养瓶中的菌丝长满1/3袋时，将培养室的温度降至23℃，菌丝长满培养瓶，得到原种；

所述的原种培养瓶中的原种培养基质包括按照重量份数计的如下原料：小麦80份、阔叶树木屑20份、麦麸18份、石膏粉2.0份、白糖2.0份；

步骤(3)，栽培种制备：将步骤(2)原种培养基质和菌丝一起接种到栽培料袋中，置于26℃培养室中进行暗培养，保持空气湿度60-65％，待菌丝长满菌袋，得到栽培袋；

所述的栽培袋中的栽培基质包括按照干物质重量份数计的如下原料：阔叶树木屑60份、棉籽壳30份、麦麸120份、石膏2.0份、石灰1.0份、白糖1.5份；pH值6-8，含水量55-65％；

步骤(4)，袋料覆土栽培及出芝管理：按畦深30cm，宽1.0m，脱去上部1/3菌袋，并将栽培袋立袋放置，菌袋间距10cm进行摆袋，两畦间宽52cm、深32cm进行作畦理沟；然后进行覆土，覆土高出菌袋表面5cm；覆土后进行灵芝出菇管理。

步骤(2)中，步骤(1)母种以1：10扩繁系数进行扩繁；原种培养瓶摆放的瓶间距为10cm；原种瓶规则为直径×高为8cm×11cm；每瓶原种培养基质250克。

步骤(3)中，步骤(2)得到的原种以1：20扩繁系数进行扩繁；每袋栽培料重1.2kg。

步骤(3)中，栽培袋采用长×高×厚为17cm×35cm×0.05cm聚乙烯袋装袋；装栽培料后110℃灭菌10h。

实施例5

白肉灵芝菌株L4968的栽培方法，包括如下步骤：

步骤(1)，母种扩繁：无菌条件下取白肉灵芝菌株L4968接种到母种PDA培养基上，密封放置于24℃的培养箱恒温培养10天至菌落长满培养皿；

所述的原种培养瓶中的原种培养基质包括按照重量份数计的如下原料：小麦70份、阔叶树木屑15份、麦麸15份、石膏粉1.5份、白糖1.5份；

步骤(3)，栽培种制备：将步骤(2)原种培养基质和菌丝一起接种到栽培料袋中，置于24℃培养室中进行暗培养，保持空气湿度60-65％，待菌丝长满菌袋，得到栽培袋；

所述的栽培袋中的栽培基质包括按照干物质重量份数计的如下原料：阔叶树木屑50份、棉籽壳28份、麦麸18份、石膏1.5份、石灰0.8份、白糖1.2份；pH值6-8，含水量55-65％；

步骤(4)，袋料覆土栽培及出芝管理：按畦深25cm，宽0.9m，脱去上部1/3菌袋，并将栽培袋立袋放置，菌袋间距8cm进行摆袋，两畦间宽50cm、深30cm进行作畦理沟；然后进行覆土，覆土高出菌袋表面4cm；覆土后进行灵芝出菇管理。

步骤(1)中，所述的母种PDA培养基包括按照重量份数计的如下原料：马铃薯200份、葡萄糖20份、蛋白胨2份、三氯化铁0.5份、琼脂粉16份，水1000份；pH＝5.5；制备方法为：将马铃薯剁碎加水至煮透之后用纱布过滤去马铃薯残渣，得到马铃薯淀粉液，依次将琼脂、葡萄糖、蛋白胨、三氯化铁放入搅拌煮至沸腾，并调节pH；121℃灭菌25min后倒入平板，冷却待用。

步骤(2)中，步骤(1)母种以1：10扩繁系数进行扩繁；原种培养瓶摆放的瓶间距为8cm；原种瓶规则为直径×高为8cm×11cm；每瓶原种培养基质250克。

步骤(3)中，步骤(2)得到的原种以1：20扩繁系数进行扩繁；每袋栽培料重1.1kg。

步骤(3)中，栽培袋采用长×高×厚为17cm×35cm×0.05cm聚乙烯袋装袋；装栽培料后110℃灭菌9h。

应用实例

1材料与方法

1.1供试菌株

白肉灵芝G.leucocontextum(菌株编号：L4968)采自云南省昆明市石林县圭山镇圭山，采用组织分离方法分离纯化。

1.2供试培养基及培养料配方

母种PDA培养基的原料：马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨2g、三氯化铁0.5g、琼脂粉16g，水1000mL；pH＝5.5；优选采用大豆蛋白胨；

培养基制作及灭菌方法，将200g削皮马铃薯剁碎加水至1L煮透之后用纱布过滤去马铃薯残渣得到马铃薯淀粉液1L，依次将琼脂、葡萄糖、蛋白胨、三氯化铁放入搅拌煮至沸腾，倒入2个500ml锥形瓶中，盖上专用石棉网纸，用橡筋扎紧，防止培养基高温扑出。高温高压，121℃灭菌25min，气压降为0时取出，在超净工作台上，酒精灯旁倒入直径5cm平板中，倒入量为平板下层高度的1/3，冷却待用。

原种培养基质配方：按重量份数计，小麦60-80份，阔叶树木屑10-20份，麦麸10-18份，石膏粉1.0-2.0份，白糖1.0-2.0份；原种培养基质中的小麦、阔叶树木屑和麦麸分别用石灰水浸泡24h后，取出后，加入石膏粉和白糖，混匀后，121℃、0.103MPa灭菌2h，之后装瓶。

栽培种基质配方：按干物质重量份数计，阔叶树木屑45-60份、棉籽壳25-30份、麦麸15-20份、石膏1.0-2.0份、石灰0.5-1.0份、白糖1.0-1.5份。pH值6-8，含水量55-65％。阔叶树木屑、棉籽壳和麦麸提前预湿24h以上，然后加入石膏、石灰和白糖边加水边搅拌至均匀，至含水量55-65％；使用常压蒸汽灭菌，温度110℃计时8-10h，自然降温，当灭菌器内部温度降到60℃以下时，可将栽培袋转移到冷却室自然冷却。

1.3分子生物学研究

以野生灵芝子实体标本分离的菌株为提取材料，液氮研磨后用北京擎科新业生物技术有限公司植物基因组试剂盒提取DNA并进行ITS、nrLSU、tef1-α和rpb2序列扩增，送测结果分析处理后进行***发育分析。

PCR反应体系(25μl)包括：2.5μl PCR反应缓冲液、2.5μl 0.2％BSA、2μl dNTP(2.5mmol)、浓度为100pmol/μl的上下游引物各0.5μl、1μl DNA溶液和16μl无菌ddH₂O。

选择的四个基因片段：ITS、LSU、TEF-1a和RBP2，具体引物的碱基组成如下：

ITS引物对：

ITS1-F：5'-cttggtcatttagaggaagtaa-3'；(SEQ ID NO.1)

ITS4：5'-tcctccgcttattgatatgc-3'；(SEQ ID NO.2)

nLSU引物对：

LR0R：5'-acccgctgaacttaagc-3'；(SEQ ID NO.3)

LR5：5'-tcctgagggaaacttcg-3'；(SEQ ID NO.4)

TEF-1α引物对：

983F：5'-gcyccygghcaycgtgayttyat-3'；(SEQ ID NO.5)

1567R：5'-achgtrccrataccaccratctt-3'；(SEQ ID NO.6)

RBP2引物对：

fRrbp2-6F：5'-tggggyatggtntgyccygc-3'；(SEQ ID NO.7)

fRrbp2-7cR：5'-cccatrgcttgyttrcccat-3'。(SEQ ID NO.8)

注：碱基包括a、t、c、g，引物中出现其他字母代表简并碱基。

1.4生物学特性研究

以PDA培养基为活化菌株培养基，转接后待菌落长满至培养皿，用于开展生物学特性研究。采用直径为7mm打孔器将菌块接种至不同条件的液体菌种培养基中培养。除温度实验外其余实验都置于22℃恒温培养箱中培养。每个处理设置8次重复。采用十字划线法每隔24h测量菌落大小，直至其中一个培养基菌落长满停止测量，观察并记录菌丝形态及生长势，数据结果采用Excel2019和PSS20.0统计分析。

1.4.1碳源实验：用蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉代替母种PDA培养基中的葡萄糖，浓度为20g/L。

1.4.2氮源实验：用氯化铵、硫酸铵、尿素、酵母膏、磷酸氢二铵代替母种PDA培养基中的大豆蛋白胨，浓度为2g/L。

1.4.3无机盐实验：用硫酸亚铁、氯化钠、碳酸钙、七水合硫酸锌代替基础培养基中的三氯化铁，浓度为0.5g/L。

1.4.4pH实验：以1.0mol/L的盐酸和1.0mol/L氢氧化钠溶液调节初始pH，分别设置5个初始pH梯度：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0。

1.4.5温度实验：将培养皿分别放置于18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃的恒温培养箱中培养。

1.5驯化栽培

将分离保存的L4968菌株从冰箱取出置于室温条件下放置2-3小时进行活化，并挑取纯化后的菌丝块接种于新的母种PDA培养基上，在22℃恒温培养箱中培养备用。取母种以1：10扩繁系数，将菌丝体接种到原种培养瓶(规格：8cm×11cm)中，将原种瓶整齐放置在发菌架上，在22-25℃条件下恒温培养25-35天，再选用17cm×35cm大小的聚丙烯塑料袋，每袋料重1-1.2kg，经121℃下高压灭菌2h冷却后，将培养好原种以1：20扩繁系数接种到栽培袋中，置于20-26℃培养室中进行暗培养，保持空气湿度60-65％，待菌丝长满菌袋，开展覆土栽培。

按畦深20-30cm，宽0.8-1.0m，畦长依大棚长度而定，两畦间宽50cm、深30cm进行作畦理沟。将菌袋立袋放置，菌袋间距5-10cm进行摆袋，然后覆2-5cm厚的松散土壤。覆土后就进入了灵芝出菇管理。

灵芝出菇管理包括：催蕾及出蕾管理、湿度管理、温度管理和光照及通风管理

催蕾及出蕾管理：温度保持22-26℃，空气相对湿度60％-90％；每天上下午各通风2h，7-10d可形成白色原基。菌蕾分化初期，根据商品需求，可去除部分劣质芝芽。

湿度管理：菌蕾形成至开片时，定时向大棚空间雾化喷水，保持地表土壤湿度，使空间相对湿度保持在80％-95％，子实体开片基本开足，菌盖边缘稍有黄色时，空气湿度保持75％-85％，子实体趋于成熟，空气相对湿度保持60％以上。

温度管理：原基分化和子实体发育的最适温度为22-26℃，菌丝生长阶段，温度控制在20℃，可促使菌蕾形成，子实体趋于成熟时，适宜温度为24-26℃。

光照及通风管理：子实体完全开片后，每天空气对流通风3h以上，以降低二氧化碳浓度。光照一般采取“三分阳七分阴”原则，保持均匀散射光，光线强度1000-5000Lx。

2结果与分析

2.1***发育分析

从GenBank下载相关参考序列，并以Tomophagus colossus作为外类群。L4968在灵芝属***发育树中与已报道的白肉灵芝形成一个单独分支，并获得94％支持率(如图1)。结合宏观及微观形态特征，确定该菌株为白肉灵芝G.leucocontextum(如图8)。

L4968菌株的特征序列如SEQ ID NO.9所示，其中，1-632个碱基为：ITS；633-1516个碱基为：nrLSU；1517-2092个碱基为：tef1α；2093-2822个碱基为：rpb2。

2.2生物学特性研究结果

由图2可知，L4968在葡萄糖作为碳源的条件下菌丝生长速度最快。由图3可知，L4968在大豆蛋白胨作为氮源生长速度最快。由图4可知，L4968在三氯化铁作为无机盐的条件下生长速度最快，由图5可知，L4968最适pH为5.5。由图6可知，L4968最适温度为26℃。

但经后续研究发现，L4968菌株最佳液体培养基条件为：碳源为葡萄糖，氮源为大豆蛋白胨，无机盐为三氯化铁，温度24℃，此条件下菌丝生长速度最优。

2.3驯化栽培结果

通过代料覆土栽培，成功驯化出灵芝子实体，如图7和图8所示。结合生产制种和覆土栽培，共生产栽培袋400袋，从接种到长满栽培袋平均周期为28d，放置出菇场地15d后开始出现少量原基，30天后原基开始分化，17后子实体开始成熟采摘。经统计分析，出菇率97％以上，干重为33.40g/朵，袋均产量鲜重80g，生物学效率为10.26％，折合亩产480kg。

实验菌株不同碳源条件均可生长，葡萄糖和麦芽糖条件长势较快，乳糖长势最慢。不同氮源条件下，L4968菌株在尿素条件长速均最慢。L4968菌株在不同无机盐条件下菌丝生长差异显著，且三氯化铁条件下菌丝长速最快，这可能是由于这株菌株对Fe³⁺的具有较好的适应性。L4968最适温度为24-26℃，当温度超过28℃时菌丝生长速度急剧下降，该菌株属于中低温型菌株。

本发明灵芝属菌株L4968经袋料覆土驯化，结果显示L4968不耐高温环境，高温会导致不出菇或畸形菇，栽培适宜温度为20-26℃，这与菌丝生物学特性实验结果相一致，并且该菌株驯化栽培具有出菇农艺性状优良，产量高、稳定，并且活性物质含量相较广泛栽培的赤芝高，出菇整齐度和抗逆性好，遗传性状稳定。因此研究认为，该菌株具有在中高海拔地区栽培推广的潜力

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南博衍农业科技发展有限公司

云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所

<120> 一种白肉灵芝菌株L4968及其栽培方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 1(人工序列)

<400> 1

cttggtcatt tagaggaagt aa 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 2(人工序列)

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 3(人工序列)

<400> 3

acccgctgaa cttaagc 17

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 4(人工序列)

<400> 4

tcctgaggga aacttcg 17

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 5(人工序列)

<400> 5

gcyccygghc aycgtgaytt yat 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 6(人工序列)

<400> 6

achgtrccra taccaccrat ctt 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 7(人工序列)

<400> 7

tggggyatgg tntgyccygc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 8(人工序列)

<400> 8

cccatrgctt gyttrcccat 20

<210> 9

<211> 2092

<212> DNA

<213> 9(人工序列)

<400> 9

acctgcggaa ggatcattat cgagttctga ctgggttgta gctggccttc cgaggcacgt 60

gcacgccctg ctcatccact ctacacctgt gcacttactg tgggtttcag atctgcgaag 120

cgtgctcctt gcggggcttc gtgaagcgcg tctgtgcctg cgtttatcac aaactctata 180

aagtattaga atgtgtattg cgatgtaacg catctatata caactttcag caacggatct 240

cttggctctc gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa 300

ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac cttgcgctcc ttggtattcc gaggagcatg 360

cctgtttgag tgtcatgaaa tcttcaacct acaagctttt gcggtttgta ggcttggact 420

tggaggcttg tcggccctct gtcggtcggc tcctcttaaa tgcattagct tgattccttg 480

cggatcggct ctcggtgtga taatgtctac gccgcgaccg tgaagcgttt ggcgagcttc 540

taaccgtctt cgcttgaaga cagctttatg acctctgacc tcaaatcagg taggacwacc 600

cgctgaactt aagcatatca aaagcccgga gggttcgatt agtctttcgc ccctataccc 660

aaatttgacg atcgatttgc acgtcagaat cgctacgagc ctccaccaga gtttcctctg 720

gcttcaccct attcaggcat agttcaccat ctttcgggtc ccaacataca tgctctaccg 780

cggatccttc agagaacgtc aggtccgggc gtcgatgccc tccacgacag aggtctcaac 840

tttcactttc attacgcgct cgggttttcc acccaaacac tcgcaggtat gttagactcc 900

ttggtccgtg tttcaagacg ggtcgtttaa agccattatg ccagcatcct aagcgcgaaa 960

gtgggcgaac ccctgccttg cggcgcgctg cgttcctcga tcccaaccgc cgtatgcgac 1020

tagagtctat aacacacccg gaggtgccac attactccag cccttttccg acggtcaaaa 1080

tcgatgctga cccgtcatcc ggaaagtgca ccaagcgaaa gcaaggctga gttccggacg 1140

acgcgactga cttcaagcgt ttccctttca gcaatttcac gtactgttta actctctttc 1200

caaagtgctt ttcatctttc cctcacggta cttgttcgct atcggtctct cgccaatatt 1260

tagctttaga tggaattcac cacccatttt gagctgcatt cccaaacaac tcgactcttt 1320

gagagcgcat cacaaagcac tggtagtccg tgtcaaagac gggattctca ccctctatga 1380

cgctctgttc caagagactt atacacggtc cagcgcggaa agcacttctc cagactacaa 1440

ctcggacggc cgaagaccgc cagattttaa atttgagctt ttcccgcttc actcgcagtt 1500

actaggggaa tccttgcatc aagaacatga tcaccggtac ctcacaggct gactgcgcta 1560

tcctcatcat cgccgctggt accggtgagt tcgaggctgg tatctccaag gatggccaga 1620

cccgcgagca cgcccttctt gccttcaccc tcggtgtcag gcagctcatc gtcgccgtca 1680

acaagatgga cacaaccaag gttcgtcgtc gcgtgaatca acatacgcgc ttgctctgac 1740

tcgagttcgc agtggtccga agaccgtttc aacgaaatca tcaaggagac gtccaccttc 1800

atcaagaagg tcggttacaa cccgaaggcg gttgcgttcg tccccatctc tggctggcac 1860

ggcgacaaca tgttggagga gtccagcaag tgagtgtatg cgctatactg tctgatgact 1920

cgtcaccctg acccttatat tttagcatga cctggtacaa gggttggacg aaggagacca 1980

aggctggtgt tgtcaagggg aagacccttt tggacgctat tgatgctatt gagccccccg 2040

tccgtccctc cgacaagccc ctccgtctcc ctctccagga tgtctacaag at 2092

Claims

1.一种白肉灵芝菌株L4968的栽培方法，其特征在于：

所述的白肉灵芝菌株L4968已于2021年12月27日保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No：62105；

所述的栽培方法包括如下步骤：

步骤（1），母种扩繁：无菌条件下取白肉灵芝菌株L4968接种到母种PDA培养基上，密封放置于20-26℃的培养箱恒温培养至菌落长满培养皿；

所述的母种PDA培养基包括按照重量份数计的如下原料：马铃薯200份、葡萄糖19-21份、蛋白胨1.9-2.1份、三氯化铁0.48-0.52份、琼脂粉16份，水1000份；pH=5.5；

步骤（2），原种制备：取步骤（1）培养好的母种接种至原种培养瓶中，暗光培养，所述的暗光光照强度为20-100Lx，控制温度在22-25℃；当培养瓶中的菌丝长满1/3袋时，将培养室的温度降至20-23℃，菌丝长满培养瓶，得到原种；

步骤（3），栽培种制备：将步骤（2）原种培养基质和菌丝一起接种到栽培料袋中，置于20-26℃培养室中进行暗培养，保持空气湿度60-65%，待菌丝长满菌袋，得到栽培袋；

所述的栽培袋中的栽培基质包括按照干物质重量份数计的如下原料：阔叶树木屑45-60份、棉籽壳25-30份、麦麸15-20份、石膏1.0-2.0份、石灰0.5-1.0份、白糖1.0-1.5份；pH值6-8，含水量55-65%；

步骤（4），袋料覆土栽培及出芝管理：按畦深20-30cm，宽0.8-1.0m，脱去上部1/3菌袋，并将栽培袋立袋放置，菌袋间距5-10cm进行摆袋，两畦间宽48-52cm、深28-32cm进行作畦理沟；然后进行覆土，覆土高出菌袋表面2-5cm；覆土后进行灵芝出菇管理；

原种培养瓶摆放的瓶间距为5-10cm。

2.根据权利要求1所述的白肉灵芝菌株L4968的栽培方法，其特征在于，步骤（1）中，于24℃的培养箱恒温培养10-12天。

3.根据权利要求1所述的白肉灵芝菌株L4968的栽培方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的母种PDA培养基包括按照重量份数计的如下原料：马铃薯200份、葡萄糖20份、蛋白胨2份、三氯化铁0.5份、琼脂粉16份，水1000份；pH=5.5；制备方法为：将马铃薯剁碎加水至煮透之后用纱布过滤去马铃薯残渣，得到马铃薯淀粉液，依次将琼脂、葡萄糖、蛋白胨、三氯化铁放入搅拌煮至沸腾，并调节pH；121℃灭菌25min后倒入平板，冷却待用。

4.根据权利要求1所述的白肉灵芝菌株L4968的栽培方法，其特征在于，步骤（2）中，步骤（1）母种以1：10扩繁系数进行扩繁；原种瓶规则为直径×高为8cm×11cm；每瓶原种培养基质250克。

5.根据权利要求1所述的白肉灵芝菌株L4968的栽培方法，其特征在于，步骤（2）中，原种培养基质中的小麦、阔叶树木屑和麦麸分别用石灰水浸泡24h后，取出后，加入石膏粉和白糖，混匀后，121℃、0.103MPa灭菌2h，之后装瓶。

6.根据权利要求1所述的白肉灵芝菌株L4968的栽培方法，其特征在于，步骤（3）中，步骤（2）得到的原种以1：20扩繁系数进行扩繁；每袋栽培料重1.0-1.2kg。

7.根据权利要求1所述的白肉灵芝菌株L4968的栽培方法，其特征在于，步骤（3）中，栽培袋采用长×高×厚为17cm×35cm×0.05cm聚乙烯袋装袋；装栽培料后110℃灭菌8-10h。