CN114317357B - 一种类球红细菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的好氧光合细菌RD2‑3及其应用；本发明的好氧光合细菌RD2‑3可以在好氧、黑暗、无菌的条件下发酵生产，无需光照，节省能源，不会产生臭气，且获得的发酵产品质量可控，是一种可以适用于产业化发酵生产的优良菌株；本发明的好氧光合细菌RD2‑3，可以作为微生物肥料应用于农作物的培育，也可以作为益生菌应用于改善水质或者用于饲料添加剂等。

Description

一种类球红细菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种类球红细菌，以及其作为益生菌在微生物肥料方面的应用。

背景技术

随着环境保护和农林牧渔业的生态发展，人们尝试开发无污染、无公害的微生物肥料，以满足保持生态平衡、合理改造自然的要求。

尽管微生物的作用机理多样，但基于目前已揭示并达成的基本共识是：微生物的功能不是单一的，往往同时兼具多重功效，例如改善动/植物营养、刺激生长、抑制病菌、防治病虫害、改善水质等等。

因此，本领域希望能够筛选广泛应用于农林牧渔业、具有优良的综合功效的微生物及菌剂。

类球红细菌是地球上最早出现的，具有原始光能合成体系的原核微生物，属于光合细菌，其菌体无毒，营养丰富。类球红细菌一方面能够代谢产生诸如类胡萝卜素、辅酶Q1等多种生物活性物质，有改善动植物营养，促进动植物生长的功效，另一方面还具有固氮、固碳的功能，提高土壤的固氮、固碳能力(增加土壤肥力)，再一方面，类球红细菌在繁殖时还会释放具有抗病力的酵素，抑制病原微生物的生长，促进有益微生物的生长，增加农作物抗病性，提高农作物产品质量。此外，类球红细菌本身是一种高蛋白物质(本身蛋白质含量高达65％以上)，衰老后可以转化成氨基酸，很容易被农作物吸收，也是农作物很好的食粮。因此，现有技术中，类球红细菌常作为益生菌，应用于农用微生物菌剂以及微生物肥料。

此外，类球红细菌还能够大量吸收分解水中的氨、氮、硫化氢等有害物质，具有很高的水质净化能力，因此也常作为益生微生物菌，应用于水环境治理。也因其营养性和抗病原菌的能力，被用作饲料添加剂，应用于养殖水产动物。

因此，本领域希望能够筛选一种新的类球红细菌，具有优良功效，能够广泛应用于农林牧渔业。

发明内容

鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明第一方面提供了一种类球红细菌RD2-3，该类球红细菌RD2-3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M20211528。

本发明第二方面提供了上述的类球红细菌RD2-3，其作为益生菌在微生物肥料方面的应用。

优选的，所述微生物肥料为应用于农作物培育的微生物肥料。

优选的，所述农作物为果树。

本发明第三方面提供了一种微生物菌剂，其中，，所述微生物菌剂为上述的类球红细菌RD2-3的发酵菌液或所述发酵菌液制得的菌液制剂或所述发酵菌液经干燥制得的菌粉制剂。

本发明第四方面提供了一种微生物肥料，其中，所述微生物肥料包含上述的类球红细菌RD2-3或者包含上述的微生物菌剂。

本发明第五方面提供了上述的类球红细菌RD2-3，其作为益生菌在改善水质方面的应用。

本发明第六方面提供了一种水质净化产品，其中，所述水质净化产品包含上述的类球红细菌RD2-3或者包含上述的微生物菌剂。

本发明第七方面提供了上述的类球红细菌RD2-3，其作为益生菌在水产养殖方面的应用。

本发明第八方面提供了一种水产养殖的饲料添加剂，其中，所述饲料添加剂包含上述的类球红细菌RD2-3或者包含上述的微生物菌剂。

本发明第九方面提供了一种水产养殖的饲料，其中，所述饲料包含基础饲料和采用如上述的饲料添加剂。

本发明提供了一种新的好氧光合细菌RD2-3及其应用；本发明的好氧光合细菌RD2-3可以在好氧、黑暗、无菌的条件下发酵生产，无需光照，节省能源，不会产生臭气，且获得的发酵产品质量可控，是一种可以适用于产业化发酵生产的优良菌株；本发明的好氧光合细菌RD2-3，可以作为微生物肥料应用于农作物的培育，也可以作为益生菌应用于改善水质或者用于饲料添加剂等。

附图说明

图1为本发明类球红细菌RD2-3经染色后在100倍光学显微镜(油镜)下的菌体形态图；

图2为本发明类球红细菌RD2-3在营养琼脂平板上形成的菌落形态图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。

下面具体实施方式中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。

一、下面介绍本申请发明人从自然环境中分离筛选获得的本发明的类球红细菌RD2-3(Rhodobacter sphaeroides RD2-3)CCTCC No：M 20211528的操作过程。

1)初筛

称取土壤10g(取自山东省招远市夏店镇曹家洼村某果园)，加入盛有15mL培养基(光合细菌富集培养基，购自上海傲之珊实业发展有限公司)的带螺口的塑料离心管中；置于光照强度1000Lx、30℃的恒温培养箱培养7天后，从变浑浊的塑料离心管中取出1mL液体，采用稀释涂布平板法在分离培养基(光合细菌分离培养基，购自上海傲之珊实业发展有限公司)平板上进行菌株分离；然后，再于光照强度1000Lx、30℃恒温培养7天后，无菌操作挑取生长情况良好的、红色或粉红色光合细菌单菌落，作为候选菌株，在营养琼脂平板上进行划线纯化，于30℃恒温培养3天后保存备用。

2)以类胡萝卜素产生能力作为筛选评价指标进行进一步筛选；无菌操作将上述步骤1)分离获得的候选菌株(菌浓度为8.0×10⁸CFU/mL，培养液5.0mL)接种至光合细菌富集培养基中，于光照强度1000Lx、180r/min、30℃恒温摇床培养36小时后，于4000r·min^-1离心5分钟，用无菌0.85％氯化钠溶液洗涤，再于相同条件下反复离心并洗涤3次后悬浮于60％蔗糖溶液中；最后，采用紫外可见分光光度计在波长476nm和530nm处测定各候选菌株细胞中的类胡萝卜素的吸光度值；

以发明人实验室中已有的类球红细菌作为对照菌株，吸光度值最高(并且远高于对照菌株的吸光度值)的候选菌株，即为本发明筛选获得的具有类胡萝卜素生产作用的优良菌株，命名为RD2-3。

二、关于本发明的类球红细菌RD2-3的鉴定过程如下：

(1)分子生物学鉴定

根据细菌16S rRNA序列，采用***发育分析对筛选获得的菌株RD2-3进行分子生物学的鉴定。

具体的，将筛选获得的菌株RD2-3，在光合细菌富集培养基中，28℃环境下培养至对数期，以12000转/分钟离心5分钟收集菌体；采用天根生化科技(北京)有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒提取所收集菌体的基因组总DNA；以总DNA为模板，对其16S rRNA基因进行PCR扩增,其中正向引物序列为27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID NO.1)，反向引物序列为1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO.2)；PCR反应体系50.0μL：10×Easy taq Buffer(Mg²⁺)5.0μL，High Pured NTP 4.0μL，正向反向引物各0.5μL，Easy Taq酶1.0μL，双蒸水补足至50.0μL；PCR的扩增条件为:95℃预变性3min；95℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 1min，共35个循环。

经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段，并采用上海天根生化科技有限公司的DNA纯化回收试剂盒进行切胶回收；回收样品送至上海迈普生物科技有限公司进行测序。

测定的菌株RD2-3的16S rRNA对应的基因序列(如SEQ ID NO.3所示)。

利用GenBank数据库中的NCBI BLAST，将菌株RD2-3的16S rRNA序列进行同源性比对；从比对结果看，菌株RD2-3与数据库中的类球红细菌菌株自然聚类(97％～99％的序列同源性)。

此外，利用MEGA6.0软件通过邻接法构建***发育树(Replications＝1000，bootstrap值取百分比)，从构建的***发育树结果来看，菌株RD2-3与类球红细菌菌株XR12(GenBank登录号:MK156296)和类球红细菌菌株RSF1(GenBank登录号:KF606891)的亲缘关系最近。

(2)形态学鉴定

菌株RD2-3为革兰氏染色阴性菌，其经染色后在100倍光学显微镜(油镜)下的菌体形态参见图1；其在营养琼脂平板上形成的菌落形态，参见图2，具体特征为：深红色、圆形、边缘整齐；菌株RD2-3在形态上与常见的呈卵球形的类球红细菌类似。

(3)生理生化鉴定

参照东秀珠等编订的《常见细菌***鉴定手册》(第一版)中相应属、种鉴定的有关内容选择生理生化试验性状，采用细菌微量生化鉴定管，对菌株RD2-3进行生理生化鉴定。

从生理生化结果来看，菌株RD2-3呈过氧化氢酶阳性，可发酵葡萄糖、果糖、甘油、甘露糖、甘露醇、乙醇和山梨醇，不能发酵半乳糖醇；能够利用甲酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖酸钠和酒石酸钠，但不能利用丙酸钠、苯甲酸钠、硫代硫酸钠和硫化钠；与《常见细菌***鉴定手册》中类球红细菌的生理生化特征基本一致。

综合第(1)～(3)部分的鉴定结果，最终认定本发明筛选获得的菌株RD2-3为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)。

三、关于菌株的保藏

本发明的菌株RD2-3，属于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年12月03日，其保藏编号为CCTCC No：M20211528。

四、本发明的类球红细菌RD2-3的发酵培养方法

无菌操作刮取本发明的斜面保藏的类球红细菌RD2-3的菌苔接种至20mL类球红细菌发酵培养基(类球红细菌培养基可以采用市售的常规的类球红细菌培养基)，于35℃恒温摇床振荡培养48小时至培养基出现浅红色；然后将其转接至100mL类球红细菌发酵培养基，于35℃恒温摇床振荡培养32小时出现红色，再将其转接至400mL类球红细菌发酵培养基，于35℃恒温摇床振荡培养32小时获得的深红色发酵液为本发明的类球红细菌RD2-3的发酵液。经检测，该发酵液的菌浓度大约为10⁸～10⁹CFU/ml。

本发明的类球红细菌RD2-3，同时也是好氧光合细菌，其生长速度快，并且发酵培养的操作条件较为简单，一方面可以在好氧、黑暗的情况下进行发酵生产，无需光照，节省能源；另一方面，可以在无菌发酵培养基环境下进行发酵生产，能够减少杂菌污染，获得的发酵产品质量可控。此外，不同于现有技术的厌氧光合细菌，本发明的类球红细菌RD2-3的整个发酵生产过程中，不会产生臭气/臭味。综上，本发明的类球红细菌RD2-3是一种可以适用于产业化的发酵生产的优良菌株。

五、本发明的类球红细菌RD2-3对桃子品质及产量的影响分析

按照上述第四部分的内容，本发明的类球红细菌RD2-3接种至类球红细菌发酵培养基32℃发酵培养，制成菌浓度约为2.0×10⁸CFU/mL的发酵液。将该发酵液作为喷施农作物的微生物菌剂。

试验组的具体培育方法：在膨大期至全生育期期间，进行常规施肥；常规施肥用量为：40公斤/亩复合肥(购自山东肥佬大肥料有限公司的齐鲁肥佬大牌)和80公斤/亩商品有机肥(购自山东大化肥业有限责任公司的优稼侬牌)；

分别在膨大期和着色期将上述的微生物菌剂稀释200倍后进行叶面喷施，每次用量1L/亩；全生育期用量改为2L/亩。

阳性对照组的培育方法与试验组的不同之处仅在于：将喷施的微生物菌剂替换为沼泽红假单胞菌菌剂(菌液浓度和喷施用量与试验组相同)；

空白对照组的培育方法与试验组的不同之处仅在于：将喷施的微生物菌剂替换成相同体积量的清水；

试验选取桃子种植果园(山东省蓬莱市)作为试验田，其中，每个桃区面积为60m²(种植10棵桃树)。每组3个平行桃区。

在桃子成熟后分别从各组中取30个桃子进行品质指标(单果重、糖度、果面)分析，统计各组的桃子产量。

统计方法：所有实验数据采用SPSS 19.0软件进行处理分析，以平均值±标准差表示。P<0.05表示差异显著。

结果参见下表1。

表1

注：同一列中，上标字母不同表示差异显著。

从表1的结果可以看出，喷施本发明的类球红细菌RD2-3菌剂显著提升了桃子的品质和产量；具体的，在桃子品质方面，与喷施清水的空白对照组相比，喷施菌株RD2-3菌剂的试验组的单果重和糖度分别提高了11.63％(P<0.05)和5.18％(P<0.05)；与喷施沼泽红假单胞菌菌剂的阳性对照组相比，试验组的单果重和糖度分别提高了4.65％(P<0.05)和3.15％(P<0.05)；并且试验组的果皮更细嫩。最为重要的是，在桃子产量方面，喷施菌株RD2-3菌剂的试验组，相比空白对照组和阳性对照组，分别增加了13.91％(P<0.05)和6.75％(P<0.05)。

六、本发明的类球红细菌RD2-3对杨梅品质及产量的影响分析

按照上述第四部分的内容，本发明的类球红细菌RD2-3接种至类球红细菌发酵培养基32℃发酵培养，制成菌浓度约为2.0×10⁸CFU/mL的发酵液。将该发酵液作为喷施农作物的微生物菌剂。

试验组的具体培育方法：在膨大期至转色期期期间，进行常规施肥；常规施肥用量为：30公斤/株家畜粪肥；

分别在膨大期、转色期将微生物菌剂稀释100倍后叶面喷施，两次间隔15天，每次用量0.2L/株。

空白对照组的培育方法与试验组的不同之处仅在于：将喷施的微生物菌剂替换成相同体积量的清水；

试验选取杨梅种植果园(浙江省仙居县)作为试验田，其中，每个种植区100株杨梅。每组3个平行种植区。

统计方法：所有实验数据采用SPSS 19.0软件进行处理分析，以平均值±标准差表示。P<0.05表示差异显著。

结果参见下表2。

表2

注：同一列中，上标字母不同表示差异显著。

结果表明，喷施本发明的类球红细菌RD2-3菌剂显著提升了杨梅的品质和产量；具体的，在杨梅品质方面，与喷施清水的空白对照组相比，喷施菌株RD2-3菌剂的试验组的糖度提高了27.83％(P<0.05)，且单果大，果型更均匀；在杨梅产量方面，喷施菌株RD2-3菌剂的试验组，较空白对照组增加了30.17％(P<0.05)。

关于本发明的类球红细菌RD2-3的菌剂，可以将发酵生产获得的发酵液直接应用或将发酵液处理制成菌液制剂来应用，也可以将获得的发酵液进行干燥处理，例如微囊包埋处理或冷冻干燥处理，制成菌粉制剂来应用。

基于类球红细菌本身的特性，以及上述第二部分第(3)小节的生理生化鉴定结果，本领域技术人员在获知上述第五和六部分的试验结果后，可以想到将本发明的类球红细菌RD2-3的菌剂作为微生物肥料，应用于农作物的培育，具体的，本发明的类球红细菌RD2-3的菌剂可以采用叶面喷施的方式，也可以采用地下冲施的方式，也可以是地下冲施与叶面喷施相结合的方式；具体的，本发明的类球红细菌RD2-3的菌剂，也可以与其他肥料组合应用于农作物的培育；具体的，也可以将本发明的类球红细菌RD2-3的菌剂与其他微生物菌剂的复合制剂，作为微生物肥料，应用于农作物的培育。

基于现有技术理论和常识，以及上述第二部分第(3)小节的生理生化鉴定结果，本发明的类球红细菌RD2-3的菌剂也具有常规类球红细菌的固氮、固碳的功能，能够提高土壤的固氮、固碳能力(增加土壤肥力)，此外，本发明的类球红细菌RD2-3能够代谢产生类胡萝卜素(对于农作物来说，类胡萝卜素是光合成与光保护必需色素，还能够充当光保护剂、抗氧化剂、颜色引诱剂和植物激素合成的前体，参与农作物的正常生命活动)，具有促进农作物的生长的作用；并且，本发明的类球红细菌RD2-3与常规的类球红细菌一样，本身是一种高蛋白物质，衰老后可以转化成氨基酸，很容易被农作物吸收，也是农作物很好的食粮。因此，本领域技术人员可以推测到，本发明的类球红细菌RD2-3的菌剂除了可以作为微生物肥料应用于桃子和杨梅的培育以外，也可以应用于其他果树，或者其他的农作物。

此外，基于类球红细菌本身的特性，以及上述第二部分第(3)小节的生理生化鉴定结果，本领域技术人员还可以将其作为益生菌应用于改善水质；具体的，可以应用于水环境治理中改善水质，或者，应用于改善水产养殖水体的水质。

此外，基于类球红细菌本身的特性，以及上述第二部分第(3)小节的生理生化鉴定结果，本领域技术人员还可以将其用作饲料添加剂，例如水产养殖的饲料添加剂。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种类球红细菌RD2-3，该类球红细菌RD2-3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 20211528。

2.如权利要求1所述的类球红细菌RD2-3作为益生菌在微生物肥料方面的应用。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于：所述类球红细菌RD2-3作为微生物肥料，在桃树或杨梅树结出果实的膨大期和着色期，进行叶面喷施。

4.一种微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂为权利要求1所述的类球红细菌RD2-3的发酵菌液或所述发酵菌液制得的菌液制剂或所述发酵菌液经干燥制得的菌粉制剂。

5.一种微生物肥料，其特征在于：所述微生物肥料包含如权利要求1所述的类球红细菌RD2-3或者包含如权利要求4所述的微生物菌剂。